JPH0258920B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 抗トロンビン−BMを測定するために、試料
溶液に抗トロンビン−BM−コフアクター、トロ
ンビン及び測定可能なトロンビン基質を添加し、
抗トロンビン−BM−活性の尺度としてのトロン
ビン基質の分解を測定し、この際 ａ） コフアクタ−としてのヘパリン、キシラン
又はλ−カラゲーナン１〜20USP／mlの存在
下で抗トロンビン−BMと抗トロンビン−の
合計量を測定し、平行バツチ中で、ヘパリン、
キシラン又はλ−カラゲーナン0.01〜
0.03USP／mlの低いコフアクター濃度で抗トロ
ンビン−のみを測定し、双方の抗トロンビン
量測定の差から抗トロンビン−BMの含量を確
認することを特徴とする、抗トロンビン−BM
の測定法。 ２ トロンビン0.01〜0.1U／ml、トロンビン基質
0.165〜1000μモル／ml、NaCl0〜200mモル／、
アプロチニン０〜50IU／ml及び緩衝液（PH7.5〜
8.5）10〜250mモル／を使用する、請求の範囲
第１項に記載の方法。 ３ 溶液にポリエチレングリコール及び重金属に
対する錯形成剤を添加する、請求の範囲第２項記
載の方法。 ４ トロンビン基質としてTos−Gly−Pro−Arg
−pNAを使用する、請求の範囲第１項から第３
項までのいずれか１項に記載の方法。 ５ トロンビン0.012U／ml、アプロチニン
6.5IU／ml及びポリエチレングリコール１％を含
有し、EDTA0.01モル、NaCl0.15モル、緩衝液
0.1モル及び基質0.19mモルを含有する溶液を使用
する、請求の範囲第３項記載の方法。 ６ 抗トロンビン−BMを測定するために、試料
溶液に抗トロンビン−BM−コフアクター、トロ
ンビン及び測定可能なトロンビン基質を添加し、
抗トロンビン−BM−活性の尺度としてのトロン
ビン基質の分解を測定し、この際 ｂ） コフアクターとしてのデキストランスルフ
エート、ムコ多糖−ポリ硫酸エステル、ペント
サンポリスルフエート又はヘパリンの化学的又
は酵素的分解により製造した短鎖状ヘパリン誘
導体を2.5〜25μｇ／mlの濃度を用いて、直接、
抗トロンビン−BM−活性を測定することを特
徴とする、抗トロンビン−BMの測定法。 ７ トロンビン0.01〜0.1U／ml、トロンビン基質
0.165〜1000μモル／ml、NaCl0〜200mモル／、
アプロチニン０〜50IU／ml及び緩衝液（PH7.5〜
8.5）10〜250mモル／を使用する、請求の範囲
第６項に記載の方法。 ８ トロンビン基質としてTos−Gly−Pro−Arg
−pNAを使用する、請求の範囲第６項に記載の
方法。 ９ トロンビン、測定可能なトロンビン基質、緩
衝液（PH7.5〜8.5）、場合によりNaCl及び／又は
アプロチニン並びにコフアクターとしてのヘパリ
ン、キシラン、λ−カラゲーナン、デキストラン
スルフエート、ムコ多糖−ホリ硫酸エステル、ペ
ントサンポリスルフエート又はヘパリンの化学的
又は酵素的分解により製造した短鎖状ヘパリン誘
導体を含有することを特徴とする、抗トロンビン
−BM測定用試薬。 １０ トロンビン、ヘパリン、アプロチニン、ポ
リエチレングリコール、重金属に対する鎖形成
剤、NaCl、トロンビン基質及び緩衝液を含有す
る、請求の範囲第９項記載の試薬。 １１ トロンビン、デキストランスルフエート、
アプロチニン、NaCl、緩衝液及びトロンビン基
質を含有する、請求の範囲第９項記載の試薬。 １２ トロンビン基質としてTos−Gly−Pro−
Arg−pNAよりなる、請求の範囲第９項又は第
１０項の試薬。 １３ トロンビン0.01〜0.1U／ml、トロンビン基
質0.165〜1000μモル／ml、NaCl0〜200mモル／
、アプロチニン０〜50IU／ml及び緩衝液10〜
250mモル／を含有する、請求の範囲第１０項
又は第１１項記載の試薬。 明細書 本発明は、抗トロンビンBMと称される新規ト
ロンビン阻害物質の測定法及びそれを実施する試
薬に関する。 蛋白分解酵素トロンビンは、血液凝固系中で、
重要な役割をはたしている。凝固系で、ヘパリン
の存在下にトロンビンを抑制することができ、ア
ンチトロンビンと称される、トロンビンに対す
るもう１種の特異的な不活性化剤が認められるこ
とは公知である。従つて、抗凝血物質としてのヘ
パリンの使用は、治療及び研究において重要な役
割をしている。同様に、ヘパリン−コフアクター
とも称されるAT−は、血漿の凝固特性に関す
る試薬系の重要な成分である。しかしながらAT
は、時間に関連する反応でヘパリンの不存在下
にもトロンビンを阻害し、トロンビン以外に例え
ばトリプシン、プラスミン及びフアクターXaを
も阻害し、従つて相対的に非特異的である。 ところで、意外にも、多くの点でATとは異
なる新規の特異的トロンビン阻害物質を見つけ
た。これは西ドイツ国特許出願第3038163号に詳
述されている。 この新規トロンビン阻害物質は、デキストラン
スルフエートの存在で、ヘパリン、プラスミン及
びトリプシンの存在の場合の少なくとも２倍も強
くトロンビンを抑制するが、実際には免疫学的に
アンチトロンビンではなく、これとは区別され
る。 この新規トロンビン阻害物質はATよりも弱
くヘパリンに結合するから、これはAT−BM
（Antithro−mbin Bindung Moderately to
Heparin：ヘパリンに温和に結合する抗トロンビ
ン）と称される。 ATは最適トロンビン抑制のために
0.02USP／mlのみのヘパリン濃度を必要とする
が、AT−BMでは、最適トロンビン抑制のため
に必要なヘパリン濃度は1.0USP／mlより高い。 ヒト−AT−は特にフアクターXa、プラス
ミン及びトリプシンも抑制し、牛トロンビンとよ
りもヒトトロンビンと強く反応し、この新規ヒト
−AT−BMは完全にトロンビン特異的であり、
牛トロンビンよりもヒトトロンビンを明白に強く
阻害する。更にATによるトロンビン抑制はヘ
パリンにより、他の活性化剤例えばデキストラン
スルフエートによりも強力に促進される。これに
反して、AT−BMでは、ヘパリン存在の場合よ
りもデキストランスルフエートより２〜３倍も強
いトロンビン抑制が達成される。 ATは、トロンビンを時間と関連する反応
で、コフアクター例えばヘパリンの完全不存在下
でも抑制するが、AT−BMはこの条件下では抑
制作用を示さない。 前記特性に基づき、本発明による新規トロンビ
ン阻害物質AT−BMはATと同様に治療法及
び診断法に使用でき、重要な研究用化学品である
ばかりでなく、ATの存在で分析測定すること
もできる。 従つて、本発明によれば、種々異なるコフアク
ターの場合のATに対する特異性のちがいを利
用することによりAT−BMの測定を行なう。従
つて、AT−BMを測定するための本発明の方法
は、試料溶液に、抗トロンビン−BM−コフアク
ター、トロンビン及び測定可能なトロンビン基質
を添加し、トロンビン基質の分解を抗トロンビン
−BM−活性に関する尺度として測定することを
特徴とし、この際 ａ） コフアクターとしてのヘパリン、キシラン
又はλ−カラゲーナント１〜20USP／mlの存
在下ではAT−BMとAT−の合計量を測定
し、平行バツチ中で、ヘパリン、キシラン又は
λ−カラゲーナン0.01〜0.03USP／mlの存在下
でAT−のみ測定し、双方の抗トロンビン量
測定の差からAT−BMの活性を確認するか又
は ｂ） デキストランスルフエート、ムコ多糖類−
ポリ硫酸エステル、ペントサンポリスルフエー
トを用いるか又はヘパリンの化学的又は酵素分
解により製造した短鎖状ヘパリン誘導体2.5〜
25μｇ／mlをコフアクターとして用いて直接、
抗トロンビン−BM−活性を測定する。 種々異なる量のヘパリンの存在下におけるAT
に比べたAT−BMの特異性のちがいを次の第
１表に示す。

【表】 従つて、本発明方法の有利な実施形は、次のと
おりである：１ml当りヘパリン１〜20USPの濃
度でAT−BMとATの合計量を測定し、１ml
当りヘパリン0.01〜0.03USPのコフアクター濃度
での並行バツチ中で、ATのみを測定し、双方
の抗トロンビン量測定の差から、AT−BM含量
を確認する。 ヘパリンの代りに、コフアクターとしてキシラ
ン又はλ−カラゲーナンを類似の量で使用するこ
ともできる。 本発明方法の第２の実施形では、コフアクター
としてデキストランスルフエート、ムコ多糖−ポ
リ硫酸エステル、ペントサンポリスルフエート又
はヘパリンの化学的又は酵素的分解により製造し
た短鎖状のヘパリン誘導体を使用する。この種の
ヘパリン誘導体もしくはヘパリン類縁体は公知で
あり、例えばアルテパロン（Arteparon）もしく
はSP54なる名称で市場で入手される。このコフ
アクターの約2.5〜25μｇ／mlの濃度では、AT−
BMのみが活性であるから、この場合に、AT
の存在でも選択的にAT−BMの含分が把握され
る。 示差法又は直接的特異性AT−BM−測定を使
用するかには係りなく、同様に、測定のために、
トロンビン0.01〜0.1U／ml、トロンビン基質
0.165〜1000μモル／ml及び緩衝液（PH7.5〜8.5）
10〜250mモル／を使用するのが有利であり、
この際、付加的になおNaCl200mモル／及びア
プロチニン50IU／mlを添加することができる。
しかしながら、最後に記載の２種の物質は必須で
はなく、省略してもよい。 更に、ポリエチレングリコール及び／又は貴金
属に対する錯形成剤例えばエチレンジアミン四酢
酸及び類似の酢酸ポリアミンの添加が好適である
ことが判明した。 アプロチニン、場合により存在する他のプロテ
アーゼ例えばプラスミン又はカリクレインの活性
を阻止し、これにより異種ブロテアーゼの障害を
除き、試験時にトロンビンが有効に作用すること
も確保する。重金属に対する錯形成剤は、トロン
ビンを安定化させ、試験バツチ中でのフイブリン
凝塊の形成を遅らせる作用をする。 更に、例えばキユベツト壁面上へのトロンビン
の吸着を低下させるためにポリエチレングリコー
ルを添加することもできる。 トロンビン基質としては、トロンビン測定に公
知の任意の基質を使用することができる。市販の
光学的に測定可能な基質が有利である。後者は、
光学的に容易に測定できる離脱可能な基を有する
低分子量ペプチドである。特に基質としてTos−
Gly−Pro−Arg−pNAが有利である。 緩衝液物質としては、7.5〜8.5で作用するすべ
てのものを使用することができる。トリス緩衝
液、トリエタノールアミン緩衝液及びトリス−イ
ミダゾール緩衝液が有利である。 正常の人血漿中にはAT−BMがATと共に
存在し、平均して、合計抗トロンビン−活性の約
20％を示し、この際残りの約80％はATに帰因
する。このことは、第２表に記載の実験結果から
明らかである。

【表】 前記のように、新規AT−BMのコフアクター
特異性はATのそれとは異なる。殊に、AT
においてはヘパリンの存在下に最高の抑制活性が
得られ、AT−BMでは硫酸デキストランスルフ
エートを用いてなお著るしく高い抑制値が得られ
る。測定値を第３表に示す。

【表】

【表】 血漿中の他の公知のプロテアーゼを阻害物質と
も、その特性においてAT−BMは著るしく異な
る。このことは次の第４表から明らかである。

【表】 本発明のもう１つの目的はAT−BM測定用の
試薬である。本発明の試薬は、トロンビン、測定
可能なトロンビン基質、緩衝液（PH7.5〜8.5）、
場合によつてはNaCl及び／又はアプロチニン並
びにコフアクターであるヘパリン、キシラン、λ
−カラゲーナン、デキストランスルフエート、ム
コ多糖−ポリ硫酸エステル、ペントサンポリスル
フエート又はヘパリンの化学的又は酵素的分解に
より製造した短鎖状のヘパリン誘導体を含有する
ことを特徴とする。 有利な実施形では、本発明の試薬は、トロンビ
ン、ヘパリン、アプロチニン、ポリエチレングリ
コール、錯形成体、NaCl、トロンビン基質及び
緩衝液を含有することを特徴とする。特に有利な
実施形は、トロンビン、デキストランスルフエー
ト、アプロチニン、NaCl、緩衝液及びトロンビ
ン基質を含有することを特徴とし、このトロンビ
ン基質はTos−Gly−Pro−Arg−pNAより成つ
ていて、トロンビン0.01〜0.1U／ml、トロンビン
0.165〜1000μモル／ml、CaCl0〜200mモル／ｂ、
アプロチニン０〜50IU／ml及び緩衝液10〜250m
モル／を含有する。 トロンビン阻害物質AT−BMの取得は、西ド
イツ特許第3038163号明細書に記載されている。
これは、ATと比べた例えばヘパリンに対する
その異なる特性に基づく。 血清、血漿又はこれから得られるフラクシヨン
を不溶性で担体結合されたヘパリンで処理する
と、後者は、結合しなかつた物質の除去の後に、
0.12〜0.36のイオン濃度及び6.5〜8.3の範囲のPH
値で溶離させると、AT−BMが得られる。この
条件下でATは溶離されない。 PH値範囲の調節するために、この範囲で緩衝作
用をする緩衝物質を使用することができる。緩衝
液の濃度は約0.05〜0.1Mの間であるのが有利で
ある。最良の結果は、7.5〜8.0の間のPH値の際に
得られる。燐酸塩−及びトリス−緩衝液が有利で
ある。 金属封鎖剤例えばEDTAの存在で操作するの
が有利である。その濃度は、５〜20mMであるの
が有利である。 次に実施例につき本発明を説明する。 例 １ 新しく採取した血液９部に0.11モル／クエン
酸ナトリウム１部を混合し、約3000U／mmで遠心
する。こうして得たクエン酸塩血漿20μを0.9％
NaCl1.0mlで稀釈する。 トリス／HCl（PH8.1）0.1M、NaCl0.15M、
EDTA0.01M、ポリエチレングリコール１％、ア
プロチニン6.5IU／ml及びヘパリン1.75USP／ml
を含有する溶液５mlを0.5U／mlを有するトロン
ビン溶液0.25mlと混合し、30分間放置する（＝
AT−反応混合物）。次に、次式による測定を、
25℃の測定温度、層厚１cmのキユベツト及び
Hg405nmの波長で行なう。空気に対する吸光度
増加を測定する。 プラスチツクキユベツト中にピペツト採取す
る。 当初値 試 料 0.9％NACl 0.10ml − 稀釈された血漿 − 0.10mlAT−反応混合物 2.00ml 2.00ml 混合し、25℃で５分間インキユベートする 1.9mMクロモチームTH¹⁾ 0.20ml 0.20ml 混合し、30秒内に当初吸光度を読み取り、同時
にストツプウオツチを始動させる。正確に30秒、
60秒及び90秒の後に読み取りを繰り返す。 30秒当りの吸光度差（△Ｅ／30秒）から、平均
値を得、これを計算に使用する。 １）＝Tos−Gly−Pro−Arg−pNA こうして、合計した抗トロンビン活性が得られ
る。0.02USP／mlまで低めたヘパリン濃度でこの
評価を繰り返すことによりAT−濃度が得られ
る。合計抗トロンビン活性マイナスAT−の差
から、AT−BMの量が得られる。 例 ２ 試薬 使用準備された溶液の濃度 １ 緩衝液 トリス／HCl 100mモル／（PH8.1） デキストランスルフエート（分子量500000）
１mg／100ml アプロチニン 6.5IU／ml^* NaCl 150mモル／ ＊阻害物質単位（トリプシン、クロモチーム
TH、25℃） ２ トロンビン 0.5U／ml ３ クロモチーム TH（Tos−Gly−Pro−Arg
−pNA） 1.9mモル／ ４ １と２との混合物 トリス／HCl 90mモル／（PH8.1） デキストランスルフエート 0.9モル／100ml アプロチニン 5.9IU／mm NaCl 136mモル／ トロンビン 0.045U／ml 試薬混合物（１と２とからの混合物）の製造 プラスチツク容器内で、混合し、25℃で約30分
放置する：緩衝液（溶液１）10ml及びトロンビン
（溶液２）１ml。 試料調製 測定のためにクエン酸塩血漿１部をNaCl（0.9
％）200部で稀釈する（例えば血漿50μ＋0.9％
NaCl−溶液10ml）。 測定項目 波長：Hg 450nm キユベツト：プラスチツクキユベツト、層厚１
cm 測定温度：25℃ 空気に対する測定（吸光度増加） 各測定系当り少なくとも１個のトロンビン−空
値（TL）が必要である。プラスチツクキユベツト中にピペツト採取する TL 試 料 NaCl（0.9％） 0.05ml − 稀釈された血漿 − 0.05ml 試薬混合物(4) 1.0 ml 1.0ml 混合し、25℃で５分間インキユベートする 溶液３ 0.1 ml 0.1ml 混合し△Ｅ／30秒を計算する 計算： △E_TL／30秒−△Ｅ試料／30秒＝△E_AT-BM／30秒 IU_AT-BM／ml＝△E_AT-BM／30秒×951.1 この測定のために、次の含分を有するAT−
BMもしくはATの溶液を製造した： AT：12.5IU／ml（25℃） AT−BM：12.1IU／ml（25℃） この濃度は正常人血漿中のATの含分に相当
する。ATの存在下における測定の特異性を示
すためにこの測定はAT−BM−溶液を用いても
又は双方の溶液の混合物を用いても実施した。こ
の場合次のように実施した： １ AT−BMの測定 AT−BM溶液を、生理学的食塩水溶液で１
＋100で稀釈した（試料0.05ml＋NaCl−溶液5.0
ml） この測定幅を決めるために、この試料稀釈物
から更に生理食塩水溶液で稀釈し（AT−BM9
部＋NaCl1部；８＋２：７＋３……） 最終稀釈度１：1000までの稀釈物を製造した。 次に、製造したAT−BM−稀釈の一定量
（0.05ml）を試験に使用した。 結果を第１図に黒点（……）で示す。この試
験は選択した範囲内で比例する抑制値（△
E_AT-BM）を測定する。 ２ AT−の存在におけるAT−BMの測定 AT−BM溶液0.05mlをAT−−溶液0.05ml
及び生理食塩水溶液4.95mlで稀釈した（双成分
の１＋100の稀釈度に相当）。 この試料溶液から１の記載と同様にして順次
稀釈物を製造した。 この製造した稀釈物の一定量（0.05ml）を試
験に使用した。 結果を第１図に白丸点（○○）で示す。試験
精度内でAT−BM単独によると同様な結果が
得られる。この試験結果はAT−により影響
されず、AT−BMのみが測定される。 デキストランスルフートをムコ多糖−ポリ硫
酸エステル、ペントサンポリスルフエート又は
前記のヘパリン誘導体に代える際に、同様な結
果が得られた。