JP3157844B2 - ヘパリン含有量の測定方法 - Google Patents

ヘパリン含有量の測定方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヘパリン含有量、特に血漿中のヘパリン含
有量の測定方法に関する。
凝固因子ＸおよびIIは、血漿凝固メカニズムにおいて
重要な役割を演じる。血液凝固メカニズムの内在素と外
在素とは、凝固因子Ｘで出会う。活性化した因子Ｘ（FX
a）の影響下に、因子II（プロトロンビン）は、活性化
され、IIa（FIIaまたはトロンビン）を形成する。トロ
ンビンは次いで、フィブリノーゲンのフィブリンへの変
換を触媒し、その結果として、血漿凝固が実際に生じ
る。
FXaおよびFIIaの両方の重要なインヒビターは、抗ト
ロンビンIII（AT）であり、この蛋白質は、血漿で生
じ、また不可逆的様相で複合体の形成を伴い、FXaおよ
びFIIaを不活性する。すなわち、ATは、血液凝固を抑制
する。ATがFXaまたはFIIaと不可逆性複合体を形成する
反応速度を増大させることによって、ヘパリンはATの不
活性化作用を強化することが知られている。
ヘパリンは、2000から40,000以上まで変化する分子量
を有する多糖類の混合物である。活性ヘパリンは、２種
の相違するタイプの活性分子、すなわち5400ダルトン以
上の分子量を有するヘパリン分子（ACLM）および5400ダ
ルトンまたはそれ以下の分子量を有するヘパリン分子
（BCLM）から構成されていることが知られている。ACLM
分子は、抗−FXaおよび抗−FIIa活性の両方を有し、他
方、BCLM分子は、抗−FXa活性のみを有する。この理由
で、抗−FIIa活性と抗−FXa活性との間の比は、ヘパリ
ン混合物中の多糖類鎖の分布に依存する。
従って、本発明の目的は、中でも、ACLM分子およびBC
LM分子の総合ヘパリン含有量および個別の含有量を測定
することができる方法を提供することにある。
試料のヘパリン含有量の測定方法は、公知である。一
例として、抗−トロンビン試験、抗−FXa試験、活性化
した部分的トロンボプラスチン時間（APTT）を測定する
試験、およびFXaまたはFIIaの分解を測定する各種試験
がある。上記諸試験の結果は、多くの場合、血漿試料に
おける無作為の変化により影響される。この理由で、採
取された各血漿試料について、ヘパリン標準量に対する
計算が必要である。これらの方法において、標準値を用
いる試験の結果は、被験試料毎に、同一方法で変化する
ものと見做される。しかしながら、これは常時、実際に
は起きない。この重要な原因は、ヘパリンが２つの相違
するタイプの活性分子からなるという、上記の事実にあ
る。抗−FIIa活性と抗−FXa活性との間の比は、ヘパリ
ン中の多糖類鎖の分布に依存する。抗凝固作用は、存在
する抗−FIIa活性の量に依存する。抗−FIIa活性抵抗−
FXa活性比は、各試料毎に、および各試料標本毎に変化
し、またヘパリンのタイプおよび測定が行われた後の時
間に依存することから、ACLMとBCLMとを区別しない試験
の結果は、試験結果の不正確な解釈を導く。各種試験
は、抗−FIIa活性と抗−FXa活性との間の比の変化にほ
とんど反応せず、患者の血栓形成挙動（thrombotic be
haviour）について、結論を引き出すことが困難であ
る。
従って、本発明の目的はまた、上記２種のタイプのヘ
パリン分子を区分することができる、試料中のヘパリン
含有量の測定方法にある。
さらにまた、US5,308,755には、未知ヘパリン濃度を
有する試料を、ATおよび因子Xaまたはトロンビン用の基
質と混合する、ヘパリン濃度の測定方法が記載されてい
る。次いで、この試料に、当該酵素がATによって不活性
化され、また基質の一部が、その濃度を測定することが
できる生成物に変換される方法で、因子Xaまたはトロン
ビンを添加する。
上記刊行物によると、酵素に対して高い親和性を有す
る基質、例えばS2238およびS2222が使用される。この結
果として、測定値が最終レベルに達する前に、比較的長
い時間を要する。さらに、この方法では、ATによる酵素
阻害速度定数を測定することはできず、従ってヘパリン
の活性にかかわる結論を引き出すことはできない。
従って、本発明の目的はさらにまた、比較的迅速に、
また簡単に実施することができ、また絶対的結果を提供
する、試料中のヘパリン活性の測定方法を提供すること
にある。
この目的およびその他の目的は、本発明に従い達成さ
れる。
従って、本発明は、ヘパリン含有量の測定方法に関
し、この方法は、下記工程を包含する： （ａ）既知濃度の発色源性基質（Ｓ）、既知濃度の抗ト
ロンビン（AT）および未知ヘパリン濃度を有する試料を
含有する混合物に、既知量のトロンビン（FIIa）または
活性化した凝固因子Ｘ（FXa）を添加する工程、ここでF
IIaまたはFXaの量は、存在するＳの多くて20％、好まし
くは多くて10％を、存在するFIIaまたはFXaの全部を不
活性化するのにATが要する時間中に、反応させるように
選択されている； （ｂ）生じる反応を進行させ、次いで反応終了後に、反
応した発色源性基質の最終濃度（［pNA］final）を測定
する工程、 （ｃ）見出された［pNA］finalを用いて、下記関係式を
使用し、FIIaまたはFXaとATとの反応の速度定数
（Kdec）を決定する工程： （式中、 Km＝ミカエリス定数＝（Kcat＋K-1）/K1 （２） Kcat＝中間複合体FIIa−ＳまたはFXa−Ｓからの生成
物pNAの生成にかかわる速度定数、 K1＝FIIaまたはFXaおよびＳからの中間複合体FIIa−
ＳまたはFXa−Ｓの生成にかかわる速度定数、 K-1＝中間複合体FXa−ＳまたはFIIa−ＳのFXaまたはF
IIaおよびＳへの分解にかかわる速度定数、 ［Ｓ］＝基質の初期濃度、 ［AT］＝ATの初期濃度、および ［Ｅ］＝FXaまたはFIIaの初期濃度）、 および （ｄ）ヘパリン濃度に対するKdecの予め作成された計
算曲線から、このようにして見出されたKdec値を用い
て、試料中のヘパリン濃度を決定する工程。
上記方法は、全体を通して温度をほぼ一定にする。
本発明による方法の格別の利点は、終点測定法である
こと、従って時間−独立性であることにある。これに対
して、現在まで知られている方法の多くは、進行中の反
応からの一時的記録または一連の一時的記録に基づいて
いる。もう一つの格別の利点は、多くの試料中のヘパリ
ン濃度を、複数個の凹部（一般に、96個）を有する微量
滴定（microtitre）プレートを用いることによって、同
時的に測定することができることにある。さらにまた、
本発明による方法は、測定を血漿に対して直接行うこと
ができるという格別の利点を有する。この目的のために
は、血漿を適当な緩衝液で稀釈するだけでよい。
本発明による方法の工程（ａ）において、Ｓ、ATおよ
び未知ヘパリン濃度を有する試料の混合物に、既知量の
FIIaまたはFXaを添加する。FIIaまたはFXaを添加した結
果として、２つの反応が生じる： ＳのpNAへの変換は、ミカエリス−メンテン速度論に
従って進行するものと推測される。このことは、ＳがFI
Ia/FXaに対して大過剰に存在しなければならないこと、
すなわち［Ｓ］＋［（ES）］［Ｓ］であることを意味
する。また、ATとFIIaまたはFXaとの反応は、二次元（s
econd order）プロセスであると推定される。ミカエリ
ス定数Kmは、反応式（４）のために測定される（関係式
（２）参照）。「一定」の「Ｓ」を保証するために、存
在するＳの多くて20％のみを、好ましくは多くて10％の
みを変換しなければならない。
すでに上記したように、ヘパリンが、一方でFXaまた
はFIIaと、他方で、ATと、不可逆性複合体を形成する反
応速度を実質的に増大させることは知られている。正し
い条件が造り出された場合、速度定数Kdecの増大は、ヘ
パリン濃度の増加に直接比例する。この結果として、K
decを測定することによって、試料中のヘパリン濃度を
測定することができる。
正しい速度論的性質を有するかぎり、既知の全部の発
色源性基質を、発色源性基質として使用することができ
る。適当な基質の加水分解中に、ｐ−ニトロアニリド
（pNA）が通常、遊離される。遊離したpNAの量は、405n
mの波長で、分光光度測定法により測定することができ
る。しかしながら、実際に、あまり適当ではない或る種
の基質を有する実施例もある。酵素（すなわち、FIIaま
たはFXa）に対する基質の親和性は、ヘパリン測定に影
響する。実際に、この親和性が大きいほど、不可逆性複
合体の形成の結果として、ATにより不活性化させる酵素
の全部の取り込みに、より長い時間を要する。換言すれ
ば、FIIaまたはFXaに対して大きい親和性を有する発色
源性基質を使用することは、反応を完了させるために、
反応（３）でより長い時間を要することを意味する。こ
れは、ヘパリン測定がより長い時間を要することを意味
する。従って、好ましくは、FIIaまたはFXaに対してあ
まり大きくない親和性を有する基質が使用される。非常
に好適な基質の例には、（メチルスルホニルエチル）オ
キシカルボニルバリルアルギニン ｐ−ニトロアニリド
（Msc−Val−Arg−pNA）およびマロニル−α−アミノイ
ソブチリルアルギニン ｐ−ニトロアニリドメチルエス
テル モノクロライド（SQ68）がある。
従って、好適態様に従う場合、未知ヘパリン濃度を有
する試料として、稀釈した血漿を、本発明による方法で
使用する。この場合、ヘパリン濃度が計算曲線の中央部
分に適応するように、この血漿を稀釈すると好ましい。
実施上で、これは、血漿を20〜100倍、好ましくは30〜7
5倍に稀釈すべきことを意味する。この結果として、最
終試料（すなわち、稀釈した試料）中のヘパリン濃度は
通常、0.05U/mlよりも多くない。この単位U/ml（1mlあ
たりの単位）は、ヘパリン濃度を表わすための標準単位
であり、一般に使用されている。上記単位の意味および
測定方法は、Merton R.E.,Curtis A.D.およびThomas
D.P.による、「活性化した部分的トロンボプラスチン
時間および英国薬局方試験により得られるヘパリン価推
定の比較」（Ａ comparison of heparin potency
estimates obtained by activated partial throm
boplastin time and British pharmacopoeial ass
ays）、Thromb.Haemost.,1985;53:116〜117に記載され
ている。
本方法の工程（ｂ）において、上記反応（３）を優先
して進行させる。この反応が完了した時点で、反応
（４）はまた、もはや進行しない。通常、反応剤の量
は、反応（３）が30分間以内に完了するように選択する
が、より長い反応時間を用いても、均等に良好な結果を
得ることもできる。何故に反応時間があまり長くない方
が好ましいかの理由は、実用上で許容される時間間隔内
に、完全なヘパリン測定を行うことができるべきである
という事実にある。反応（３）を完了まで進行させ、従
ってまた、反応（４）を停止させた後に、反応した発色
源性基質の最終濃度を測定する。この反応した基質は通
常、元の基質の加水分解によって得られ、分光光度測定
によって決定することができる。すでに上記したよう
に、発色源性基質は、FIIaまたはFXaにより加水分解さ
れ、このプロセスで、ｐ−ニトロアニリド（pNA）が遊
離される。実際に、pNAの最終濃度［pNA］finalは、405
nmの波長における分光光度測定によって、容易に測定す
ることができる。
次に、工程（ｃ）において、FIIaまたはFXaとATとの
反応の速度定数（Kdec）を、上記関係式（１）を使用
し、このようにして見出された［pNA］finalを用いて決
定する。発色源性基質の酵素による加水分解の速度定数
KcatおよびKmは、いわゆるラインウィーバー−バークの
プロットから決定することができ、これは、基質濃度の
逆数（1/［Ｓ］、横軸）を、pNaが形成される速度の逆
数（1/v、縦軸）に対してプロットされたものである。
この直線は、1/Kmで横軸を横切り、従ってKmは容易に決
定することができる。この直線は、1/Vmaxで縦軸を横切
る。ここで、Vmax＝Kcat＊［Ｅ］であり、［Ｅ］はFIIa
またはFXaの初期濃度である。この図面からVmaxを読み
取り、次いで既知［FIIa］または［FXa］で割り算する
ことによって、Kcat値が得られる。これは全て既知であ
る。［Ｓ］、［AT］および［Ｅ］は既知であるから、1n
［AT］／（［AT］−［Ｅ］）を計算することができる。
上記したように、［pNA］finalは、分光光度測定によっ
て決定することができる。
工程（ｄ）において、試料中のヘパリン濃度は、Kdec
について見出された数値を用いて、ヘパリン濃度に対す
る予め作成されたKdecの計算曲線から決定することがで
きる。この計算曲線（すなわち、検量線）は、それ自体
公知の方法でプロットすることができる。この計算曲線
をプロットする際、試験それ自体に使用される反応剤と
同一の反応剤を使用すべきである。この方法で、試験の
精度は実際に、最適になる。この計算曲線を、測定され
るpNA濃度がヘパリン濃度に強く依存するようなヘパリ
ン濃度領域でプロットしておくと好ましい。実際に、AT
によるFIIa不活性化のKdecの測定は、Kdecが200,000（M
s）-1よりも小さい、好ましくは100,000（Ms）-1よりも
小さい場合に、良好な信頼度を有する。ATによるFXa不
活性化のKdecの測定は、Kdecが100,000（Ms）-1よりも
小さい、好ましくは50,000（Ms）-1よりも小さい場合
に、充分な信頼度をもって見出されている。これらの限
界は、ヘパリン測定が良好な結果をもたらす濃度範囲を
決定する。標準ヘパリンの場合、抗−FIIa試験は、ヘパ
リン濃度範囲が０〜0.04U/ml、好ましくは０〜0.02U/ml
である場合に、非常に良好な結果をもたらすものと見做
される。抗−FXa測定の場合には、計算曲線の作成にお
いて、０〜0.8U/ml、好ましくは０〜0.04U/mlの濃度範
囲を、申し分なく使用することができる。いうまでもな
く、試料はまた、そのヘパリン濃度を計算曲線が作成さ
れた範囲と同一範囲にあるように、稀釈されることが好
ましい。従って、ヘパリン濃度が０〜0.04U/mlであるよ
うに試料を稀釈した場合に、最良の結果が得られる。
種々の反応速度および速度定数は、温度に依存するこ
とから、この方法の工程全部にわたり、温度をほぼ一定
にすることは重要である。
ヘパリンのACLM分子およびBCLM分子のそれぞれの濃度
値を得るためには、本発明による方法を、FXaおよびFII
aを別々に用い工程（ａ）〜（ｄ）を包括的に行う方法
で、行う。この場合、抗−FIIa活性は、5400ダルトンよ
りも多い分子量を有するヘパリン区分（ACLM分子）に存
在する。抗−FXa活性は、2800ダルトンまたはそれ以上
の分子量を有するヘパリン区分に存在する。抗−FIIa活
性および抗−FXa活性は両方ともに、その活性はヘパリ
ン分子の大きさに強く依存する。ヘパリンは種々の大き
さの分子の混合物であるから、ACLM分子の量およびBCLM
分子の量は、試料中の抗−FIIa活性および抗FXa活性の
みを測定することによっては、容易に決定することはで
きない。しかしながら、抗−FIIa活性／抗−FXa活性比
は、ヘパリン分子の分子量が小さくなるほど減少する。
5400ダルトン未満で、この比はゼロであり（すなわち、
抗−FIIa活性は存在しない）、他方、8000ダルトンより
大きいと、この比は約３であることが見出された。
本発明を、下記例を引用して説明する。
例 発色源性基質Msc−Val−Arg−pNAのヒトFIIaによる加
水分解の速度論定数KcatおよびKmを、37℃で測定した。
このために、Msc−Val−Arg−pNAの加水分解の速度を、
上記温度で、FIIaの濃度の関数として測定した。これら
の結果を表１および図１に示す。
使用溶液は、Msc−Val−Arg−pNA（＝Ｓ）の5mM溶
液、NaCl 175mM、トリスHCl（pH7.9）50mMおよびオヴ
ァルブミン2mg/mlを含有する緩衝溶液（BOA）、並びに
精製ヒトFIIa4.30μＭ溶液であった。基質濃度［Ｓ］
は、この反応混合物の光学密度を316nmで測定し、次い
でＳの固有定数（＝12900）で割り算することによって
決定した。FIIa、FXaおよびATの濃度はまた、この方法
で決定することができるが、この場合の測定は、280nm
で行い、また割り算を各蛋白質にかかわる定数（公知）
により行う。各加水分解速度は、405nmで60秒間、pNA濃
度を分光光度測定により測定することによって、２回、
測定した。
図１から、37℃におけるMsc−Val−Arg−pNAのFIIaに
よる加水分解の速度論定数は、 Vmax＝28.38μM/分、すなわちKcat＝1.117/秒、 および Km＝1.011mM であると推定することができる。
同様の方法で、Msc−Val−Arg−pNAのFXaによる加水
分解にかかわる速度論定数を測定し、下記の数値を得
た： Kcat＝1.87/秒 および Km＝5.50mM。
抗−FIIa活性及び抗−FXa活性の両方を測定するため
に、計算曲線を作成した。この結果を図2aおよび2bに示
す。
この目的には、ヘパリンの抗−FIIa活性及び抗−FXa
活性の測定を、２列キュベットで行った。反応混合物
（600μｌ）は、AT 1.0μＭ、Msc−Val−Arg−pNA 2m
M、図中に特定されているとおりのヘパリンおよび上記
の緩衝溶液BOAを含有していた。この反応は、37℃で行
い、FIIa 500nM（キュベットの上列）またはFXa 500n
M（キュベットの下列）を加えることによりｔ＝０で開
始した。25分間にわたり、各秒毎に、405nMで光学密度
を測定した。この反応定数Kdecは、曲線に合わせて（−
○−）、または25分後の光学密度から計算して（−■
−）、決定した。
血漿試料中のヘパリンの測定は、同様の方法で行うこ
とができる。ヘパリン（０〜1.5U/ml）を含有する血漿
試料を、BOAで33×に稀釈した。次いで、稀釈した血漿1
00μｌ、AT ３μＭ＋Msc−Val−Arg−pNA 6mMの100μ
ｌおよびFIIaまたはFXa 1.5μＭの100μｌを混合する
ことによって、反応混合物を調製した。25分後に、pNA
濃度を、分光光度測定により測定し（405nmにおいて測
定）、Kdecを関係式（１）に従い計算した。この稀釈し
た試料の血漿のヘパリン濃度を次いで、図2aおよび2bか
らの計算曲線を用いて決定し、その後、未稀釈試料のヘ
パリン濃度を計算した。
Kdec値および未稀釈試料のヘパリン濃度の結果を、表
２に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 米国特許5308755（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/56 G01N 33/86

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記工程： （ａ）既知濃度の発色源性基質（Ｓ）、既知濃度の抗ト
    ロンビン（AT）および未知ヘパリン濃度を有する試料を
    含有する混合物に、既知量のトロンビン（FIIa）または
    活性化した凝固因子Ｘ（FXa）を添加する工程、ここでF
    IIaまたはFXaの量は、存在するＳの多くて20％を、存在
    するFIIaまたはFXaの全部を不活性化するのにATが要す
    る時間中に反応させるように選択されている； （ｂ）生じる反応を進行させ、次いで反応完了後に、反
    応した発色源性基質の最終濃度（［pNA］final）を測定
    する工程、 （ｃ）見出された［pNA］finalを用いて、下記関係式を
    使用し、FIIaまたはFXaとATとの反応の速度定数
    （Kdec）を決定する工程： （式中、 Km＝ミカエリス定数＝（Kcat＋K-1）/K1 （２） Kcat＝中間複合体FIIa−ＳまたはFXa−Ｓからの生成物p
    NAの生成にかかわる速度定数、 K1＝FIIaまたはFXaおよびＳからの中間複合体FIIa−Ｓ
    またはFXa−Ｓの生成にかかわる速度定数、 K-1＝中間複合体FXa−ＳまたはFIIa−ＳのFXaまたはFII
    a及びＳへの分解にかかわる速度定数、 ［Ｓ］＝基質の初期濃度、 ［AT］＝ATの初期濃度、および ［Ｅ］＝FXaまたはFIIaの初期濃度）、 および （ｄ）ヘパリン濃度に対するKdecの予め作成された計算
    曲線から、このようにして見出されたKdec値を用いて、
    試料中のヘパリン濃度を決定する工程、 を包含し、上記工程の全体を通して、温度はほぼ一定で
    ある、ヘパリン含有量の測定方法。
  2. 【請求項２】FIIaまたはFXaの量は、存在するＳの多く
    て10％を、存在するFIIaまたはFXaの全部を不活性化す
    るのにATが要する時間中に反応させるように選択されて
    いる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】未知ヘパリン濃度を有する試料が稀釈した
    血漿である、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】ヘパリン濃度が０〜0.04U/mlであるように
    血漿を稀釈する、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】発色源性基質として、Msc−Val−Arg−pNA
    またはSQ68を使用する、請求項１〜４のいずれか１項に
    記載の方法。
  6. 【請求項６】［pNA］finalを、405nmの波長で分光光度
    測定法により測定する、請求項１〜５のいずれか１項に
    記載の方法。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2566411A1 (en) * 2004-05-11 2005-11-24 Heptest Laboratories, Inc. Compositions, kit and one-step method for monitoring compounds having anti-factor xa and/or anti factor iia activities
GB2433592A (en) * 2005-12-23 2007-06-27 Pentapharm Ag Assay for thrombin inhibitors
EP1918718A1 (de) * 2006-10-31 2008-05-07 Roche Diagnostics GmbH Verfahren und Vorrichtungen zur elektrochemischen Bestimmung von Faktor Xa-Inhibitoren in Blutproben
EP2333555A1 (de) * 2009-12-09 2011-06-15 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Heterogener Gerinnungstest
EP2712423A4 (en) 2011-02-25 2015-06-10 Wellstat Diagnostics Llc ANALYZES FOR DETECTING ENZYMATIC ACTIVITY
CN103063593B (zh) * 2012-12-31 2014-06-04 中国医学科学院输血研究所 一种人抗凝血酶-ⅲ浓缩物中肝素含量的测定方法
CN104062243A (zh) * 2014-04-21 2014-09-24 上海贞元诊断用品科技有限公司 一种FXa活性检测试剂及其制备方法和应用
CN107727872A (zh) * 2017-09-01 2018-02-23 上海太阳生物技术有限公司 一种肝素测定的试剂盒
CN114755427B (zh) * 2022-06-13 2022-11-08 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH622286A5 (ja) * 1975-06-23 1981-03-31 Pentapharm Ag
US4169015A (en) * 1975-07-11 1979-09-25 Ab Kabi Novel chromogenic thrombin substrates
US4067777A (en) * 1976-05-13 1978-01-10 Innerfield Irving Determination of heparin in the blood
US4216142A (en) * 1978-12-18 1980-08-05 Abbott Laboratories Chromogenic substrates for the proteolytic enzymes
US4221706A (en) * 1979-06-14 1980-09-09 Abbott Laboratories Chromogenic substrates
JPS5856695A (ja) * 1981-09-28 1983-04-04 Nitto Boseki Co Ltd 新規なトロンビン測定用基質
US4543335A (en) * 1982-12-20 1985-09-24 Miles Laboratories, Inc. Device and method for the quantitative determination of heparin in mammalian blood plasma
JPS60241900A (ja) * 1984-05-16 1985-11-30 Nitto Boseki Co Ltd 新規な第Ｘａ因子活性測定用基質
US5308755A (en) * 1992-06-08 1994-05-03 Research Corporation Technologies, Inc. Method for measuring heparin

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