DK160511B

DK160511B - Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af antithrombin-bm

Info

Publication number: DK160511B
Application number: DK237282A
Authority: DK
Inventors: Helmut Lill; Juergen Schrenk; Peter Wunderwald
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1980-10-09
Filing date: 1982-05-26
Publication date: 1991-03-18
Also published as: DE3163764D1; US4496653A; WO1982001377A1; DK160511C; JPS57501510A; EP0049877B1; JPH0258920B2; EP0049877A1; DK237282A

Description

i

DK 16051 1 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til bestemmelse af en ny thrombin-inhibitor, der betegnes som antithrombin-BM, samt et reagens til udførelse af fremgangsmåden.

Det proteolytiske enzym thrombin spiller en vigtig rolle i 5 blodstørkningssystemet. Det er kendt, at der i blodkoagule ringssystemet endvidere forekommer en specifik inaktivator for thrombin, som i nærværelse af heparin kan hæmme thrombin, og som betegnes som antithrombin III. Anvendelsen af heparin som antikoagulans spiller derfor en vigtig rolle i terapien 10 og forskningen. Ligeledes er AT III, der også betegnes som heparin-cofaktor, en vigtig bestanddel af prøvesystemer for plasmaens størkningsegenskaber. AT III hæmmer dog også thrombin i fravær af heparin ved en tidsafhængig reaktion og hæmmer foruden thrombin f.eks. også trypsin, plasmin og faktor Xa 15 og er altså relativt uspecifik.

Nu er der overraskende fundet en hidtil ukendt specifik thrombin-inhibitor, der i flere henseender adskiller sig fra AT III. Den er nærmere beskrevet i tysk patent (ansøgning) 30 38 163.

Den nye thrombin-inhibitor hæmmer thrombin i nærværelse af 20 dextransulfat mindst dobbelt så stærkt som i nærværelse af heparin, men derimod praktisk taget ikke plasmin og trypsin, og adskiller sig immunologisk fra antithrombin III.

Da den nye thrombin-inhibitor binder sig mindre stærkt til heparin end AT III, betegnes den som AT-BM (Antithrombin 25 Binding Moderately to Heparin).

Medens AT III for at give optimal thrombinhæmning kun kræver en heparinkoncentration af størrelsesordenen 0,02 USP/ml, er for AT-BM den nødvendige heparinkoncentration til optimal thrombinhæmning over 1,0 USP/ml. [Her står USP for de en-30 heder ifølge den amerikanske farmakopé, hvormed heparin-koncentrationen er defineret].

2

DK 16051 1 B

Medens human-'-AT-III bl.a. også hæmmer faktor Xa, plasmin og trypsin og reagerer med .humanthrombin uvæsentligt stærkere end med oksethrombin, er den nye human-AT-BM næsten fuldstændigt thrombinspecifik og hæmmer humanthrombin tydeligt 5 stærkere end oksethrombin. Endvidere fremmes thrombinhæmnin-gen med AT III stærkere af heparin end af andre aktivatorer/ såsom dextransulfat. Derimod opnås der med AT-BM med dextran= sulfat en 2 til 3 gange så stærk thrombinhæmning som i nærværelse af heparin.

10 Medens AT III hæmmer thrombin i en tidsafhængig reaktion/ også i fuldstændigt fravær af cofaktorer, såsom heparin, viser AT-BM under disse omstændigheder ingen hæmningsvirkning.

På grund af de ovennævnte egenskaber kan den nye thrombin-inhibitor AT-BM ikke blot anvendes på lignende måde som 15 AT III ved terapeutiske og diagnostiske metoder og er et interessant forskningskemikalium, men det kan også bestemmes analytisk i nærværelse af AT III.

EP offentliggørelsesskrift: nr. 4271 beskriver en fremgangsmåde til bestemmelse af den biologiske aktivitet af heparin, 20 ved hvilken der ved tilsætning af thrombin eller faktor Xa og et kromogent substrat måles det af det kromogene substrat frigjorte farvestof i fravær af antithrombin III. Her drejer det sig altså om bestemmelse af et helt andet stof end ved den foreliggende opfindelse, og af skriftet kan man end ikke 25 slutte sig til eksistensen af antithrombin-BM.

Ifølge opfindelsen sker bestemmelsen af AT-BM derfor ved udnyttelse af specificitetsforskellene i forhold til AT III med de forskellige cofaktorer. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af AT-BM er derfor ejendommelig ved, at man til 30 prøveopløsningen sætter en antithrombin-BM-cofaktor, thrombin og et substrat, der spaltes af thrombin og herved frigiver en detekterbar substans, og måler spaltningen af thrombinsubstra-tet som mål for antithrombin-BM-aktivitet, idet man

3 DK 160511B

a) udnytter specificitetsforskellene mellem antithrombin-BM og antithrombin III i nærværelse af forskellige mængder af cofaktorerne heparin, xylan eller λ-karrageenan og måler forskellen mellem de ved høje og ved lave cofaktor- ^ koncentrationer fremkomne aktiviteter, eller b) direkte måler antithrombin-BM-aktiviteten med dextran-sulfat, mucopolysaccharid-polysvovlsyreester, pentosan= polysulfater eller ved kemisk eller enzymatisk spaltning af heparin fremstillede kortkædede heparinderivater som 10 cofaktor.

Nedenstående tabel 1 viser specificitetsforskellene mellem AT-BM og AT III i nærværelse af forskellige mængder heparin.

TABEL 1.

Specificitetssammenligning AT-BM/AT III.

15 Protease ÆT III (U/ml) med AT-BM (U/ml) med 0,02 1,75 0,02 1,75 _USP heparin/ml prøverumfang USP heparin/ml prøverumfang

Oksethrcnbin

Samlet 22,5 24,4 6,6 29,0 "a-thrcnbin” 25,9 25,6 3,7 40,3 20 "Ø-thrcnbin” 20,0 23,5 0,4 4,5

Humanthrorbin

Samlet 29,4 30,8 8,4 74,0 "a-thrcnbin" 23,0 31,7 6,2 101,1 "Ø-thrcnbin" 29,0 37,7 0,1 18,9 25 Faktor Xa 5,6 29,5 0 0

Plasmin 0 14,5 0 0,4

Trypsin 23,5 16,5 0 0

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i, at man ved en koncentration på 1 - 20 USP 30 heparin pr. ml bestemmer den samlede mængde af AT-BM og 4

DK 16051 1 B

AT III og i et parallelforsøg ved en lav cofaktorkoncentration på 0f01 - 0r03 USP heparin pr. ml bestemmer AT III alene og af forskellen mellem de to antithrombinmængdebestemmelser beregner indholdet af AT-BM.

5 I stedet for heparin kan der som cofaktor også anvendes xylan eller λ-karrageenan i analoge mængder.

Ved den anden udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvender man som cofaktorer dextransulfat, mucopoly= saccharid-polysvovlsyreester, pentosanpolysulfater eller et 10 ved kemisk eller enzymatisk spaltning af heparin fremstillet kortkædet hepårinderivat. Sådanne heparinderivater eller heparinanaloge er kendt og findes i handelen f.eks. under betegnelsen Arteparon ® eller SP 54. Ved koncentrationer mellem ca. 2,5 og 25 pg/ml af disse cofaktorer er kun AT-BM aktiv, 15 således at indholdet af AT-BM herved bestemmes selektivt, også i nærværelse af AT III.

Ligegyldigt om man anvender differensmetoden eller den direkte specifikke AT-BM-bestemmelse, anvender man hensigtsmæssigt til bestemmelsen 0,01 - 0,1 U/ml thrombin, 0,5 - 1.000 •pmol/ml 20 thrombinsubstrat og 10 - 250 mmol/1 stødpude, pH 7,5 - 8,5, idet man yderligere kan tilsætte indtil 200 mraol/1 NaCl og indtil 50 IU/ml aprotinin. De to sidstnævnte stoffer er dog ikke væsentlige og kan også udelades.

Desuden har det vist sig gunstigt at tilsætte polyethylen= 25 glycol og/eller en kompleksdanner for tunge metaller, såsom f.eks. ethylendiamintetraeddikesyre og lignende polyaminaceta= ter.

Som thrombinsubstrat kan anvendes ethvert af de til thrombin-bestemmelse kendte substrater. Der foretrækkes de i handelen 30 værende optisk bestemmelige substrater. Disse er lavmolekylære peptider med en optisk let bestemmelig fraspaltelig rest.

5

DK 16051 1 B

Især foretrækkes som substrat Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (hvor pNA er p-nitroanilid).

Som stødpudestoffer kan anvendes alle, der er virksomme i området fra 7,5 til 8,5. Der foretrækkes trisstødpude, tri= ethanolaminstødpude og trisimidazolstødpude.

5 I normal humanplasma foreligger AT-BM ved siden af AT III og giver i gennemsnit ca. 20% af den samlede antithrombin-aktivitet, idet de resterende ca. 80% skyldes AT III. Forholdet mellem AT-BM og AT III kan under visse omstændigheder været ændret. Dette viser de i tabel 2 sammenfattede for-10 søgsresultater.

TABEL 2.

Antithrombinbestemmelse med oksethrombin og 1,75 USP U/ml heparin ved 25°C.

Plasma n Samlet AT % samlet AT

15 _U/ml__AT-BM AT III

Normal 5 8,4 ± 0,3 20,8 - 5,4 79,2 ± 5,4

Svangre 3 7,5 ± 2,5 14,0 - 2,4 86,0 - 2,4 Børn 6 6,1 ± 0,4 15,5 - 0,5 84,5 ± 0,5

Marcumar 8 5,7 - 1,4 11,4 - 4,5 88,5 - 3,9

Hepatitis- , , 20 mistanke 3 4,6 - 1,9 10,0 - 5,6 90,0 - 5,6

Serum 3 3,9 - 0,7 32,0 - 4,4 68,0 - 4,4

Som nævnt er også cofaktorspecificiteten af den nye AT-BM forskellig fra AT III. Især opnås med AT III den højeste hæmningskapacitet i nærværelse af heparin, medens der med AT-BM 25 kan opnås væsentligt højere hæmningsværdier med dextransulfat. De konstaterede værdier er vist i tabel 3.

6

DK 16051 1 B

TABEL 3.

Sammenligning af cofaktorspecificitet af AT III/AT~BM ved hæmning af oksethrombin.

Cofaktor Antithrombinaktivitet U/ml af

(25 g/ml)_AT III_AT-BM

5 Heparin (15 jjg/ml = 1,75 USP/ml) 27,5 13,2 λ-karrageenan 5,4 9,3

Xylan 6,3 1,2

Na-dextransulfat (MS = 500.000) 4,1 33,0 10 Polystyrolsulfanat 0 0 AT-BM adskiller sig også betydeligt i sine egenskaber fra andre kendte protease-inhibitorer i plasma. Dette fremgår af følgende tabel 4.

7

DK 16051 1 B

TABEL 4.

„ G IL ή

Q CQ

• I B D. + + +1 + g i & ?r gi 6 jj ω i ^ (O i

Η 1 G

ft 1 m »i 1 + +' + + +,..

•Η I ί

Η I B

Φ I

X I rj to i .g

Cl + + + + + + +I

ci m ro li s,« h i I a u i I u + φ ! go + i o i -¾ •Η I h

A I

H I d Λ I -S , + •Si I + + + ί ^ Q) I 2

ω i Ξ J

tf i P g

tu I u -Q

-p I g 8 g O I . rj a 3 2 u i h o T 3 5 ft I 8 i 33 g i i i 1,1 $ 2 0 1 1¾¾¾ Ϊ « g ' CD $

Μ I tp 'ti g + I

ro ! £ I § ’ 1 + I I i +1 + g ω I -8 3 I g ®ilija g

CQ I I OO O LO O r—- LD LO O) W

1 i 3L._i m lo ro cn ld q σ,νρ ό p'^1 H_ ^ 3 <h &

< j Jjft N c? S M

Ϊ!å ign g S3

"I .g “ e c U

C j .m $3 •hi Si g h «32 g,! s S -S 3 s a hS3| c i Ilt -* 4» ^ffÉjjjjjji af i ! B i i SjI -ass 2 -S· § Bg BS I "s “ ' 1 i Λ Bl B«i f ? i Ai ti 3 Si a SS SM s1»"! oS oS S h « 8

DK 16051 1 B

Opfindelsen angår endvidere et reagens til bestemmelse af AT-BM. Reagenset ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder thrombin, et bestemmeligt thrombins itbstr at, stødepude; pH 7,5 - 8,5, eventuelt NaCl og/eller aprotinin samt 5 en af cofaktorerne heparin, xylan, λ-karrageenan, dextran= sulfat, mucopolysaccharid-polysvovlsyreester, pentosanpoly= sulfater eller ved kemisk eller enzymatisk spaltning af hepa>= rin fremstillet kortkædet heparinderivat.

I en foretrukken udførelsesform er reagenset ifølge opfindel-10 sen ejendommeligt ved, at det indeholder thrombin, heparin, aprotinin, polyethylenglycol, kompleksdanner, NaCl, thrombin-substrat og stødepude. Særligt foretrukne udføreIsesformer er ejendommelige ved, at de indeholder thrombin, dextransul= fat, aprotinin, NaCl, stødpude og thrombinsubstrat, at throm= 15 binsubstratet består af Tos-Gly-Pro-Arg-pNA, at det indeholder 0,01 - 0,1 U/ml thrombin, 0,5 - 1.000 ymol/ml thrombinsubstrat, 0 - 200 mmol/1 NaCl, 0-50 IU/ml aprotinin og 10 - 250 mmol/1 stødpude.

Udvindingen af thrombin-inhibitoren AT-BM er beskrevet i tysk 20 patent 30 38 163. Den beror på dens forskellige egenskaber sammenlignet med AT III, f.eks. over for heparin.

Når man behandler serum, plasma eller en deraf udvunden fraktion med uopløseligt bærerbundet heparin og eluerer sidstnævnte efter fjernelse af ikke-bundet materiale med en ion-25 styrke på 0,12 - 0,36 og en pH-værdi i området fra 6,5 til 8,3, udvinder man AT-BM. Under disse betingelser elueres AT III ikke.

Til indstilling af pH-intervallet kan anvendes de inden for dette område pufrende stødepudestoffer. Koncentrationen af 30 stødpuden ligger hensigtsmæssigt mellem ca. 0,005 og 0,1 M.

9

DK 16051 1 B

De bedste resultater fås ved pH-værdier mellem 7,5 og 8,0.

Der foretrækkes phosphat- og tris-stødpuder.

Hensigtsmæssigt arbejdes i nærværelse af et kompleksbindings-middel, såsom EDTA. Koncentrationen af dette ligger hensigts-5 mæssigt mellem 5 og 20 mM.

De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere.

EKSEMPEL 1, 9 dele frisk udtaget blod blandes med 1 del 0,11 mol/1 na= triumcitrat og centrifugeres ved ca. 3.000 omdrejninger pr.

10 minut. 20 yl af den således fremkomne citratplasma fortyndes med 1,0 ml 0,9% NaCl.

5 ml af en opløsning, som indeholder 0,1 M tris/HCl, pH 8,1, 0,15 M NaCl, 0,01 M EDTA, 1% polyethylenglycol, 6,5 IU apro= tinin/ml og 1,75 USP heparin/ml blandes med 0,25 ml af en 15 thrombinopløsning med 0,5 U/ml, og man lader den henstå i 30 minutter (= AT-reaktionsblanding). Derefter sker bestemmelsen efter følgende skema ved en måletemperatur på 25°C, en cuvette med en lagtykkelse på 1 cm og en bølgelængde på 405 nm. Der måles ekstinktionstilvæksten over for luft.

Der pipetteres i kunststofcuvetter: 20 Thrombin- udgangsværdi_Prøve værdi 0,9% NaCl 0,10 ml

Fortyndet plasma - 0,10 ml AT-reaktiOnsblanding 2,00 ml 2,00 ml 25 Der blandes og inkuberes i 5 minutter ved 25°C: 1,9 mM chromozym TH ^ 0,20 ml 0,20 ml

DK 16051 1 B

ίο

Bland, aflæs inden for 30 sekunder begyndelsesekstinktionen og start samtidig stopuret. Gentag aflæsning efter nøjagtigt 30, 60 og 90 sekunder.

Af ekstinktionsforskellene pr. 30 sekunder (ΛΕ/30 sekunder) 5 dannes middelværdien, og denne indsættes i beregningen (jfr. nedenfor) .

1) = Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.

Man får derved den samlede antithroxnbinaktivitet. Ved gentagelse af forsøget med en heparinkoncentration nedsat til 0,02 USP/ml får man AT IIl-koncentrationen. Af forskellen 10 samlet antithrombinaktivitet minus AT III fås mængden af AT-BM.

EKSEMPEL 2.

Koncentration af

Reagenser brugsfærdig opløsning 15 1. Puffer:

Tris/HCl 100 mmol/1, pH 8,1

Dextransulfat (molekylvægt 500.000) 1 mg/100 ml

Aprotinin 6,5 IU/ml x)

NaCl 150 mmol/1 2. Thrombin 0,5 U/ml

20 3. Chromozym ® TH

(Tos-Gly-Pro-Arg-pNA) 1,9 mmol/1 4. Blanding af 1 og 2:

Tris/HCl 90 mmol/1, pH 8,1

Dextransulfat 0,9 mg/100 ml

Aprotinin 5,9 IU/ml

NaCl 136 mmol/1 25 Thrombin 0,045 U/ml x) Inhibitor-enheder (trypsin, chromozym TH, 25°C).

Fremstilling af reagensblandingen (blanding af 1 og 2).

Der blandes i en kunststofbeholder, og man lader henstå ca.

30 minutter ved 25°C: 10 ml stødpude (opløsning 1) og 1 ml 11

DK 16051 1 B

thrombin (opløsning 2).

Tilberedelse af prøve:

Til bestemmelsen fortyndes 1 del citratplasma med 200 dele NaCl (0,9%-ig) (f.eks. 50 pi plasma + 10 ml 0,9%-ig NaCl-5 opløsning).

Bestemmelsesopstilling: Bølgelængde: 405 nm.

Cuvette: Kunststofcuvette, 1 cm lagtykkelse.

Måletemperatur: 25°C.

10 Måling over for luft (ekstinktionstilvækst).

Til hver måleserie kræves mindst 1 thrombin-tomværdi (TL).

Der pipetteres i kunststofcuvetter:

Thrombin- toteVærdi_Prøveværdi

NaCl 0,9% 0,05 ml 15 Fortyndet plasma - 0,05 ml

Reagensblanding (4) 1,0 ml 1,0 ml

Der blandes og inkuberes i 5 minutter ved 25°C:

Opløsning 3 0,1 ml 0,1 ml 20 Der blandes og beregnes ΔΕ/30 sekunder.

Beregning: ΔΕ/ΤΙ/30 sekunder - ^pj-øye/30 sekunder = sekunder IDAT-BM/ml = fiEAT -BM^^ sekunder -x 951,1.

Til bestemmelsen blev fremstillet opløsninger af ihenholdsvis 25 AT-BM og AT III, der har følgende indhold:

DK 160511 B

12 AT III: 12,5 IU/ml 25°C.

AT-BM: 12,1 IU/ml 25°C.

Denne koncentration svarer til humanplasmas normale indhold af AT III.

5 For at vise specificiteten af bestemmelsen også i nærværelse af AT III blev bestemmelsen udført både med AT-BM-opløsningen og med en blanding af de to opløsninger. Herunder gik man frem som følger: 1. Måling af AT-BM: 10 AT-BM-opløsningen blev fortyndet 1+100 med fysiologisk kog-saltopløsning (0,05 ml prøve + 5,0 ml NaCl-opløsning).

For at fastlægge måleområdet blev der af denne prøvefortynding fremstillet yderligere fortyndinger med fysiologisk kogsaltopløsning (9 dele AT-BM (fortynding 1+100) +1 del NaCl, 15 8 +2, 7 + 3 o.s.v.) indtil en endelig fortynding på 1:1.000,

Konstante rumfang (0,05 ml) af de fremstillede AT-BM-fortyndin-ger blev så anvendt til prøven.

Resultatet er vist på tegningen (®Q©e). Med prøven fås inden for de valgte grænser proportionale hæmningsværdier 20 ίΔΕΑΤ-ΒΜ} * 2. Måling af AT-BM i nærværelse af AT-III: 0,05 ml ufortyndet AT-BM-opløsning blev fortyndet med 0,05 ml AT III-opløsning (12,5 IU/ml, 25°C) og 4,95 ml fysiologisk kogsaltopløsning (svarende til en 1 + 100 fortynding af begge 25 komponenter).

Af denne prøveopløsning blev der fremstillet følgefortyndinger som beskrevet under 1, afsnit 2.

Claims

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af antithrombin-BM, kendetegnet ved, at man til prøveopløsningen sætter en antithrombin-BM-cofaktor, thrombin og et substrat, der spaltes af thrombin og herved frigiver en detekterbar substans, 15 og måler spaltningen af thrombinsubstratet som mål for anti-thrombin-BM-aktiviteten, idet man a) udnytter specificitetsforskellene mellem antithrombin-BM og antithrombin III i nærværelse af forskellige mængder af cofaktorerne heparin, xylan eller λ-karragee- 20 nan og måler forskellen mellem de ved høj og ved lav cofaktorkoncentration fremkomne aktiviteter eller b) direkte måler antithrombin-BM-aktiviteten med sdextransul= fat, mucopolysaccharid-polysvovlsyreester, pentosanpoly= sulfater eller ved kemisk eller enzymatisk spaltning af 25 heparin fremstillede kortkædede heparinderivater som cofaktor. DK 160511 B

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man som høj koncentration anvender 1-20 USP/ml og som lav koncentration 0,01 - 0,03 USP heparin pr. ml.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 5 at man anvender 2,5 - 25 ug/ml dextransulfat eller heparin- spaltningsprodukt.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at man anvender 0,01 - 0,1 U/ml thrombin, 0,5 - 1.000 ymol/ml thrombinsubstrat, 0 - 200 mmol/1 NaCl, 0-50

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man til opløsningen sætter polYethylenglycol og en kompleksdanner for tunge metaller.

6. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, k e n -15 detegnet ved, at man som thrombinsubstrat anyender Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at man anvender en opløsning, der indeholder 0,012 U/ml throm= bin, 6,5 IU aprotinin pr. ml og 1% polyethylenglycol, og som 20 er 0,01 molær med hensyn til EDTA, 0,15 molær med hensyn til NaCl, 0,1 molær med hensyn til stødpude og 0,19 mmolær med hensyn til substrat.

8. Reagens til bestemmelse af antithrombin-BM, kendetegnet ved, at det indeholder thrombin, et substrat, 25 som thrombin kan spalte, og hvorved der fremkommer en detek-terbar rest, stødpude pH 7,5 - 8,5, eventuelt NaCl og/el-ler aprotinin samt en af cofaktorerne heparin, xylan, X-karra= geenan, dextransulfat, mucopolysaccharid-polysvovlsyreester, pentosanpolysulfater eller ved kemisk eller enzymatisk spalt-30 ning af heparin fremstillet kortkædet heparinderivat. DK 16051 1 B

9. Reagens ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det indeholder thrombin, heparin, aprotinin, polyethylenglycol, kompleksdanner, NaCl, thrombinsubstrat og stødpude.

10. Reagens ifølge krav 8/ kendetegnet ved, at 5 det indeholder thrombin, dektransulfat, aprotinin, NaCl, stødpude og thrombinsubstrat.

10 IU/ml aprotinin og 10 - 250 mmol/1 stødpude pH 7,5 - 8,5.

10 Patentkrav.

11. Reagens ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at thrombinsubstratet består af Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.

12. Reagens ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet ved, 10 at det indeholder 0,01 - 0,1 U/ml thrombin, 0,5 - 1.000 umol/ml thrombinsubstrat, 0 - 200 mmol/1 NaCl, 0-50 IU/ml aprotinin og 10 - 250 mmol/1 stødpude.