DK160511B - Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af antithrombin-bm - Google Patents
Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af antithrombin-bm Download PDFInfo
- Publication number
- DK160511B DK160511B DK237282A DK237282A DK160511B DK 160511 B DK160511 B DK 160511B DK 237282 A DK237282 A DK 237282A DK 237282 A DK237282 A DK 237282A DK 160511 B DK160511 B DK 160511B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- thrombin
- heparin
- substrate
- antithrombin
- nacl
- Prior art date
Links
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 title claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 13
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 54
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 49
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 39
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 39
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 37
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 21
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 16
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims description 13
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims description 13
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims description 13
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 8
- VYLJFJGMPYBPMN-VXKWHMMOSA-N (2s)-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]-1-[2-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)NCC(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)CCC1 VYLJFJGMPYBPMN-VXKWHMMOSA-N 0.000 claims description 6
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 claims description 6
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 claims description 6
- 108010018472 chromozym TH Proteins 0.000 claims description 6
- -1 dextran sulfate Polymers 0.000 claims description 6
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 claims description 6
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 claims description 6
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 claims description 5
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 claims description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000002628 heparin derivative Substances 0.000 claims description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 3
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 claims 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 6
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 4
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 4
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940043138 pentosan polysulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N Sulphur dioxide Chemical compound O=S=O RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000011037 discontinuous sequential dilution Methods 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- DQDAYGNAKTZFIW-UHFFFAOYSA-N phenprocoumon Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC)C1=CC=CC=C1 DQDAYGNAKTZFIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
- G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- G01N2333/8121—Serpins
- G01N2333/8128—Antithrombin III
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/974—Thrombin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- G01N2400/38—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence, e.g. gluco- or galactomannans, Konjac gum, Locust bean gum or Guar gum
- G01N2400/40—Glycosaminoglycans, i.e. GAG or mucopolysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparin, heparan sulfate, and related sulfated polysaccharides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
i
DK 16051 1 B
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til bestemmelse af en ny thrombin-inhibitor, der betegnes som antithrombin-BM, samt et reagens til udførelse af fremgangsmåden.
Det proteolytiske enzym thrombin spiller en vigtig rolle i 5 blodstørkningssystemet. Det er kendt, at der i blodkoagule ringssystemet endvidere forekommer en specifik inaktivator for thrombin, som i nærværelse af heparin kan hæmme thrombin, og som betegnes som antithrombin III. Anvendelsen af heparin som antikoagulans spiller derfor en vigtig rolle i terapien 10 og forskningen. Ligeledes er AT III, der også betegnes som heparin-cofaktor, en vigtig bestanddel af prøvesystemer for plasmaens størkningsegenskaber. AT III hæmmer dog også thrombin i fravær af heparin ved en tidsafhængig reaktion og hæmmer foruden thrombin f.eks. også trypsin, plasmin og faktor Xa 15 og er altså relativt uspecifik.
Nu er der overraskende fundet en hidtil ukendt specifik thrombin-inhibitor, der i flere henseender adskiller sig fra AT III. Den er nærmere beskrevet i tysk patent (ansøgning) 30 38 163.
Den nye thrombin-inhibitor hæmmer thrombin i nærværelse af 20 dextransulfat mindst dobbelt så stærkt som i nærværelse af heparin, men derimod praktisk taget ikke plasmin og trypsin, og adskiller sig immunologisk fra antithrombin III.
Da den nye thrombin-inhibitor binder sig mindre stærkt til heparin end AT III, betegnes den som AT-BM (Antithrombin 25 Binding Moderately to Heparin).
Medens AT III for at give optimal thrombinhæmning kun kræver en heparinkoncentration af størrelsesordenen 0,02 USP/ml, er for AT-BM den nødvendige heparinkoncentration til optimal thrombinhæmning over 1,0 USP/ml. [Her står USP for de en-30 heder ifølge den amerikanske farmakopé, hvormed heparin-koncentrationen er defineret].
2
DK 16051 1 B
Medens human-'-AT-III bl.a. også hæmmer faktor Xa, plasmin og trypsin og reagerer med .humanthrombin uvæsentligt stærkere end med oksethrombin, er den nye human-AT-BM næsten fuldstændigt thrombinspecifik og hæmmer humanthrombin tydeligt 5 stærkere end oksethrombin. Endvidere fremmes thrombinhæmnin-gen med AT III stærkere af heparin end af andre aktivatorer/ såsom dextransulfat. Derimod opnås der med AT-BM med dextran= sulfat en 2 til 3 gange så stærk thrombinhæmning som i nærværelse af heparin.
10 Medens AT III hæmmer thrombin i en tidsafhængig reaktion/ også i fuldstændigt fravær af cofaktorer, såsom heparin, viser AT-BM under disse omstændigheder ingen hæmningsvirkning.
På grund af de ovennævnte egenskaber kan den nye thrombin-inhibitor AT-BM ikke blot anvendes på lignende måde som 15 AT III ved terapeutiske og diagnostiske metoder og er et interessant forskningskemikalium, men det kan også bestemmes analytisk i nærværelse af AT III.
EP offentliggørelsesskrift: nr. 4271 beskriver en fremgangsmåde til bestemmelse af den biologiske aktivitet af heparin, 20 ved hvilken der ved tilsætning af thrombin eller faktor Xa og et kromogent substrat måles det af det kromogene substrat frigjorte farvestof i fravær af antithrombin III. Her drejer det sig altså om bestemmelse af et helt andet stof end ved den foreliggende opfindelse, og af skriftet kan man end ikke 25 slutte sig til eksistensen af antithrombin-BM.
Ifølge opfindelsen sker bestemmelsen af AT-BM derfor ved udnyttelse af specificitetsforskellene i forhold til AT III med de forskellige cofaktorer. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af AT-BM er derfor ejendommelig ved, at man til 30 prøveopløsningen sætter en antithrombin-BM-cofaktor, thrombin og et substrat, der spaltes af thrombin og herved frigiver en detekterbar substans, og måler spaltningen af thrombinsubstra-tet som mål for antithrombin-BM-aktivitet, idet man
3 DK 160511B
a) udnytter specificitetsforskellene mellem antithrombin-BM og antithrombin III i nærværelse af forskellige mængder af cofaktorerne heparin, xylan eller λ-karrageenan og måler forskellen mellem de ved høje og ved lave cofaktor- ^ koncentrationer fremkomne aktiviteter, eller b) direkte måler antithrombin-BM-aktiviteten med dextran-sulfat, mucopolysaccharid-polysvovlsyreester, pentosan= polysulfater eller ved kemisk eller enzymatisk spaltning af heparin fremstillede kortkædede heparinderivater som 10 cofaktor.
Nedenstående tabel 1 viser specificitetsforskellene mellem AT-BM og AT III i nærværelse af forskellige mængder heparin.
TABEL 1.
Specificitetssammenligning AT-BM/AT III.
15 Protease ÆT III (U/ml) med AT-BM (U/ml) med 0,02 1,75 0,02 1,75 _USP heparin/ml prøverumfang USP heparin/ml prøverumfang
Oksethrcnbin
Samlet 22,5 24,4 6,6 29,0 "a-thrcnbin” 25,9 25,6 3,7 40,3 20 "Ø-thrcnbin” 20,0 23,5 0,4 4,5
Humanthrorbin
Samlet 29,4 30,8 8,4 74,0 "a-thrcnbin" 23,0 31,7 6,2 101,1 "Ø-thrcnbin" 29,0 37,7 0,1 18,9 25 Faktor Xa 5,6 29,5 0 0
Plasmin 0 14,5 0 0,4
Trypsin 23,5 16,5 0 0
En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i, at man ved en koncentration på 1 - 20 USP 30 heparin pr. ml bestemmer den samlede mængde af AT-BM og 4
DK 16051 1 B
AT III og i et parallelforsøg ved en lav cofaktorkoncentration på 0f01 - 0r03 USP heparin pr. ml bestemmer AT III alene og af forskellen mellem de to antithrombinmængdebestemmelser beregner indholdet af AT-BM.
5 I stedet for heparin kan der som cofaktor også anvendes xylan eller λ-karrageenan i analoge mængder.
Ved den anden udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvender man som cofaktorer dextransulfat, mucopoly= saccharid-polysvovlsyreester, pentosanpolysulfater eller et 10 ved kemisk eller enzymatisk spaltning af heparin fremstillet kortkædet hepårinderivat. Sådanne heparinderivater eller heparinanaloge er kendt og findes i handelen f.eks. under betegnelsen Arteparon ® eller SP 54. Ved koncentrationer mellem ca. 2,5 og 25 pg/ml af disse cofaktorer er kun AT-BM aktiv, 15 således at indholdet af AT-BM herved bestemmes selektivt, også i nærværelse af AT III.
Ligegyldigt om man anvender differensmetoden eller den direkte specifikke AT-BM-bestemmelse, anvender man hensigtsmæssigt til bestemmelsen 0,01 - 0,1 U/ml thrombin, 0,5 - 1.000 •pmol/ml 20 thrombinsubstrat og 10 - 250 mmol/1 stødpude, pH 7,5 - 8,5, idet man yderligere kan tilsætte indtil 200 mraol/1 NaCl og indtil 50 IU/ml aprotinin. De to sidstnævnte stoffer er dog ikke væsentlige og kan også udelades.
Desuden har det vist sig gunstigt at tilsætte polyethylen= 25 glycol og/eller en kompleksdanner for tunge metaller, såsom f.eks. ethylendiamintetraeddikesyre og lignende polyaminaceta= ter.
Som thrombinsubstrat kan anvendes ethvert af de til thrombin-bestemmelse kendte substrater. Der foretrækkes de i handelen 30 værende optisk bestemmelige substrater. Disse er lavmolekylære peptider med en optisk let bestemmelig fraspaltelig rest.
5
DK 16051 1 B
Især foretrækkes som substrat Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (hvor pNA er p-nitroanilid).
Som stødpudestoffer kan anvendes alle, der er virksomme i området fra 7,5 til 8,5. Der foretrækkes trisstødpude, tri= ethanolaminstødpude og trisimidazolstødpude.
5 I normal humanplasma foreligger AT-BM ved siden af AT III og giver i gennemsnit ca. 20% af den samlede antithrombin-aktivitet, idet de resterende ca. 80% skyldes AT III. Forholdet mellem AT-BM og AT III kan under visse omstændigheder været ændret. Dette viser de i tabel 2 sammenfattede for-10 søgsresultater.
TABEL 2.
Antithrombinbestemmelse med oksethrombin og 1,75 USP U/ml heparin ved 25°C.
Plasma n Samlet AT % samlet AT
15 _U/ml__AT-BM AT III
Normal 5 8,4 ± 0,3 20,8 - 5,4 79,2 ± 5,4
Svangre 3 7,5 ± 2,5 14,0 - 2,4 86,0 - 2,4 Børn 6 6,1 ± 0,4 15,5 - 0,5 84,5 ± 0,5
Marcumar 8 5,7 - 1,4 11,4 - 4,5 88,5 - 3,9
Hepatitis- , , 20 mistanke 3 4,6 - 1,9 10,0 - 5,6 90,0 - 5,6
Serum 3 3,9 - 0,7 32,0 - 4,4 68,0 - 4,4
Som nævnt er også cofaktorspecificiteten af den nye AT-BM forskellig fra AT III. Især opnås med AT III den højeste hæmningskapacitet i nærværelse af heparin, medens der med AT-BM 25 kan opnås væsentligt højere hæmningsværdier med dextransulfat. De konstaterede værdier er vist i tabel 3.
6
DK 16051 1 B
TABEL 3.
Sammenligning af cofaktorspecificitet af AT III/AT~BM ved hæmning af oksethrombin.
Cofaktor Antithrombinaktivitet U/ml af
(25 g/ml)_AT III_AT-BM
5 Heparin (15 jjg/ml = 1,75 USP/ml) 27,5 13,2 λ-karrageenan 5,4 9,3
Xylan 6,3 1,2
Na-dextransulfat (MS = 500.000) 4,1 33,0 10 Polystyrolsulfanat 0 0 AT-BM adskiller sig også betydeligt i sine egenskaber fra andre kendte protease-inhibitorer i plasma. Dette fremgår af følgende tabel 4.
7
DK 16051 1 B
TABEL 4.
„ G IL ή
Q CQ
• I B D. + + +1 + g i & ?r gi 6 jj ω i ^ (O i
Η 1 G
ft 1 m »i 1 + +' + + +,..
•Η I ί
Η I B
Φ I
X I rj to i .g
Cl + + + + + + +I
ci m ro li s,« h i I a u i I u + φ ! go + i o i -¾ •Η I h
A I
H I d Λ I -S , + •Si I + + + ί ^ Q) I 2
ω i Ξ J
tf i P g
tu I u -Q
-p I g 8 g O I . rj a 3 2 u i h o T 3 5 ft I 8 i 33 g i i i 1,1 $ 2 0 1 1¾¾¾ Ϊ « g ' CD $
Μ I tp 'ti g + I
ro ! £ I § ’ 1 + I I i +1 + g ω I -8 3 I g ®ilija g
CQ I I OO O LO O r—- LD LO O) W
1 i 3L._i m lo ro cn ld q σ,νρ ό p'^1 H_ ^ 3 <h &
< j Jjft N c? S M
Ϊ!å ign g S3
"I .g “ e c U
C j .m $3 •hi Si g h «32 g,! s S -S 3 s a hS3| c i Ilt -* 4» ^ffÉjjjjjji af i ! B i i SjI -ass 2 -S· § Bg BS I "s “ ' 1 i Λ Bl B«i f ? i Ai ti 3 Si a SS SM s1»"! oS oS S h « 8
DK 16051 1 B
Opfindelsen angår endvidere et reagens til bestemmelse af AT-BM. Reagenset ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder thrombin, et bestemmeligt thrombins itbstr at, stødepude; pH 7,5 - 8,5, eventuelt NaCl og/eller aprotinin samt 5 en af cofaktorerne heparin, xylan, λ-karrageenan, dextran= sulfat, mucopolysaccharid-polysvovlsyreester, pentosanpoly= sulfater eller ved kemisk eller enzymatisk spaltning af hepa>= rin fremstillet kortkædet heparinderivat.
I en foretrukken udførelsesform er reagenset ifølge opfindel-10 sen ejendommeligt ved, at det indeholder thrombin, heparin, aprotinin, polyethylenglycol, kompleksdanner, NaCl, thrombin-substrat og stødepude. Særligt foretrukne udføreIsesformer er ejendommelige ved, at de indeholder thrombin, dextransul= fat, aprotinin, NaCl, stødpude og thrombinsubstrat, at throm= 15 binsubstratet består af Tos-Gly-Pro-Arg-pNA, at det indeholder 0,01 - 0,1 U/ml thrombin, 0,5 - 1.000 ymol/ml thrombinsubstrat, 0 - 200 mmol/1 NaCl, 0-50 IU/ml aprotinin og 10 - 250 mmol/1 stødpude.
Udvindingen af thrombin-inhibitoren AT-BM er beskrevet i tysk 20 patent 30 38 163. Den beror på dens forskellige egenskaber sammenlignet med AT III, f.eks. over for heparin.
Når man behandler serum, plasma eller en deraf udvunden fraktion med uopløseligt bærerbundet heparin og eluerer sidstnævnte efter fjernelse af ikke-bundet materiale med en ion-25 styrke på 0,12 - 0,36 og en pH-værdi i området fra 6,5 til 8,3, udvinder man AT-BM. Under disse betingelser elueres AT III ikke.
Til indstilling af pH-intervallet kan anvendes de inden for dette område pufrende stødepudestoffer. Koncentrationen af 30 stødpuden ligger hensigtsmæssigt mellem ca. 0,005 og 0,1 M.
9
DK 16051 1 B
De bedste resultater fås ved pH-værdier mellem 7,5 og 8,0.
Der foretrækkes phosphat- og tris-stødpuder.
Hensigtsmæssigt arbejdes i nærværelse af et kompleksbindings-middel, såsom EDTA. Koncentrationen af dette ligger hensigts-5 mæssigt mellem 5 og 20 mM.
De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere.
EKSEMPEL 1, 9 dele frisk udtaget blod blandes med 1 del 0,11 mol/1 na= triumcitrat og centrifugeres ved ca. 3.000 omdrejninger pr.
10 minut. 20 yl af den således fremkomne citratplasma fortyndes med 1,0 ml 0,9% NaCl.
5 ml af en opløsning, som indeholder 0,1 M tris/HCl, pH 8,1, 0,15 M NaCl, 0,01 M EDTA, 1% polyethylenglycol, 6,5 IU apro= tinin/ml og 1,75 USP heparin/ml blandes med 0,25 ml af en 15 thrombinopløsning med 0,5 U/ml, og man lader den henstå i 30 minutter (= AT-reaktionsblanding). Derefter sker bestemmelsen efter følgende skema ved en måletemperatur på 25°C, en cuvette med en lagtykkelse på 1 cm og en bølgelængde på 405 nm. Der måles ekstinktionstilvæksten over for luft.
Der pipetteres i kunststofcuvetter: 20 Thrombin- udgangsværdi_Prøve værdi 0,9% NaCl 0,10 ml
Fortyndet plasma - 0,10 ml AT-reaktiOnsblanding 2,00 ml 2,00 ml 25 Der blandes og inkuberes i 5 minutter ved 25°C: 1,9 mM chromozym TH ^ 0,20 ml 0,20 ml
DK 16051 1 B
ίο
Bland, aflæs inden for 30 sekunder begyndelsesekstinktionen og start samtidig stopuret. Gentag aflæsning efter nøjagtigt 30, 60 og 90 sekunder.
Af ekstinktionsforskellene pr. 30 sekunder (ΛΕ/30 sekunder) 5 dannes middelværdien, og denne indsættes i beregningen (jfr. nedenfor) .
1) = Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.
Man får derved den samlede antithroxnbinaktivitet. Ved gentagelse af forsøget med en heparinkoncentration nedsat til 0,02 USP/ml får man AT IIl-koncentrationen. Af forskellen 10 samlet antithrombinaktivitet minus AT III fås mængden af AT-BM.
EKSEMPEL 2.
Koncentration af
Reagenser brugsfærdig opløsning 15 1. Puffer:
Tris/HCl 100 mmol/1, pH 8,1
Dextransulfat (molekylvægt 500.000) 1 mg/100 ml
Aprotinin 6,5 IU/ml x)
NaCl 150 mmol/1 2. Thrombin 0,5 U/ml
20 3. Chromozym ® TH
(Tos-Gly-Pro-Arg-pNA) 1,9 mmol/1 4. Blanding af 1 og 2:
Tris/HCl 90 mmol/1, pH 8,1
Dextransulfat 0,9 mg/100 ml
Aprotinin 5,9 IU/ml
NaCl 136 mmol/1 25 Thrombin 0,045 U/ml x) Inhibitor-enheder (trypsin, chromozym TH, 25°C).
Fremstilling af reagensblandingen (blanding af 1 og 2).
Der blandes i en kunststofbeholder, og man lader henstå ca.
30 minutter ved 25°C: 10 ml stødpude (opløsning 1) og 1 ml 11
DK 16051 1 B
thrombin (opløsning 2).
Tilberedelse af prøve:
Til bestemmelsen fortyndes 1 del citratplasma med 200 dele NaCl (0,9%-ig) (f.eks. 50 pi plasma + 10 ml 0,9%-ig NaCl-5 opløsning).
Bestemmelsesopstilling: Bølgelængde: 405 nm.
Cuvette: Kunststofcuvette, 1 cm lagtykkelse.
Måletemperatur: 25°C.
10 Måling over for luft (ekstinktionstilvækst).
Til hver måleserie kræves mindst 1 thrombin-tomværdi (TL).
Der pipetteres i kunststofcuvetter:
Thrombin- toteVærdi_Prøveværdi
NaCl 0,9% 0,05 ml 15 Fortyndet plasma - 0,05 ml
Reagensblanding (4) 1,0 ml 1,0 ml
Der blandes og inkuberes i 5 minutter ved 25°C:
Opløsning 3 0,1 ml 0,1 ml 20 Der blandes og beregnes ΔΕ/30 sekunder.
Beregning: ΔΕ/ΤΙ/30 sekunder - ^pj-øye/30 sekunder = sekunder IDAT-BM/ml = fiEAT -BM^^ sekunder -x 951,1.
Til bestemmelsen blev fremstillet opløsninger af ihenholdsvis 25 AT-BM og AT III, der har følgende indhold:
DK 160511 B
12 AT III: 12,5 IU/ml 25°C.
AT-BM: 12,1 IU/ml 25°C.
Denne koncentration svarer til humanplasmas normale indhold af AT III.
5 For at vise specificiteten af bestemmelsen også i nærværelse af AT III blev bestemmelsen udført både med AT-BM-opløsningen og med en blanding af de to opløsninger. Herunder gik man frem som følger: 1. Måling af AT-BM: 10 AT-BM-opløsningen blev fortyndet 1+100 med fysiologisk kog-saltopløsning (0,05 ml prøve + 5,0 ml NaCl-opløsning).
For at fastlægge måleområdet blev der af denne prøvefortynding fremstillet yderligere fortyndinger med fysiologisk kogsaltopløsning (9 dele AT-BM (fortynding 1+100) +1 del NaCl, 15 8 +2, 7 + 3 o.s.v.) indtil en endelig fortynding på 1:1.000,
Konstante rumfang (0,05 ml) af de fremstillede AT-BM-fortyndin-ger blev så anvendt til prøven.
Resultatet er vist på tegningen (®Q©e). Med prøven fås inden for de valgte grænser proportionale hæmningsværdier 20 ίΔΕΑΤ-ΒΜ} * 2. Måling af AT-BM i nærværelse af AT-III: 0,05 ml ufortyndet AT-BM-opløsning blev fortyndet med 0,05 ml AT III-opløsning (12,5 IU/ml, 25°C) og 4,95 ml fysiologisk kogsaltopløsning (svarende til en 1 + 100 fortynding af begge 25 komponenter).
Af denne prøveopløsning blev der fremstillet følgefortyndinger som beskrevet under 1, afsnit 2.
Claims (12)
1. Fremgangsmåde til bestemmelse af antithrombin-BM, kendetegnet ved, at man til prøveopløsningen sætter en antithrombin-BM-cofaktor, thrombin og et substrat, der spaltes af thrombin og herved frigiver en detekterbar substans, 15 og måler spaltningen af thrombinsubstratet som mål for anti-thrombin-BM-aktiviteten, idet man a) udnytter specificitetsforskellene mellem antithrombin-BM og antithrombin III i nærværelse af forskellige mængder af cofaktorerne heparin, xylan eller λ-karragee- 20 nan og måler forskellen mellem de ved høj og ved lav cofaktorkoncentration fremkomne aktiviteter eller b) direkte måler antithrombin-BM-aktiviteten med sdextransul= fat, mucopolysaccharid-polysvovlsyreester, pentosanpoly= sulfater eller ved kemisk eller enzymatisk spaltning af 25 heparin fremstillede kortkædede heparinderivater som cofaktor. DK 160511 B
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man som høj koncentration anvender 1-20 USP/ml og som lav koncentration 0,01 - 0,03 USP heparin pr. ml.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 5 at man anvender 2,5 - 25 ug/ml dextransulfat eller heparin- spaltningsprodukt.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at man anvender 0,01 - 0,1 U/ml thrombin, 0,5 - 1.000 ymol/ml thrombinsubstrat, 0 - 200 mmol/1 NaCl, 0-50
5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man til opløsningen sætter polYethylenglycol og en kompleksdanner for tunge metaller.
6. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, k e n -15 detegnet ved, at man som thrombinsubstrat anyender Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at man anvender en opløsning, der indeholder 0,012 U/ml throm= bin, 6,5 IU aprotinin pr. ml og 1% polyethylenglycol, og som 20 er 0,01 molær med hensyn til EDTA, 0,15 molær med hensyn til NaCl, 0,1 molær med hensyn til stødpude og 0,19 mmolær med hensyn til substrat.
8. Reagens til bestemmelse af antithrombin-BM, kendetegnet ved, at det indeholder thrombin, et substrat, 25 som thrombin kan spalte, og hvorved der fremkommer en detek-terbar rest, stødpude pH 7,5 - 8,5, eventuelt NaCl og/el-ler aprotinin samt en af cofaktorerne heparin, xylan, X-karra= geenan, dextransulfat, mucopolysaccharid-polysvovlsyreester, pentosanpolysulfater eller ved kemisk eller enzymatisk spalt-30 ning af heparin fremstillet kortkædet heparinderivat. DK 16051 1 B
9. Reagens ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det indeholder thrombin, heparin, aprotinin, polyethylenglycol, kompleksdanner, NaCl, thrombinsubstrat og stødpude.
10. Reagens ifølge krav 8/ kendetegnet ved, at 5 det indeholder thrombin, dektransulfat, aprotinin, NaCl, stødpude og thrombinsubstrat.
10 IU/ml aprotinin og 10 - 250 mmol/1 stødpude pH 7,5 - 8,5.
10 Patentkrav.
11. Reagens ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at thrombinsubstratet består af Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.
12. Reagens ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet ved, 10 at det indeholder 0,01 - 0,1 U/ml thrombin, 0,5 - 1.000 umol/ml thrombinsubstrat, 0 - 200 mmol/1 NaCl, 0-50 IU/ml aprotinin og 10 - 250 mmol/1 stødpude.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3038163 | 1980-10-09 | ||
| DE19803038163 DE3038163A1 (de) | 1980-10-09 | 1980-10-09 | Thrombininhibitor, seine herstellung und verwendung |
| DE3050268 | 1981-08-04 | ||
| DE3050268 | 1981-08-04 | ||
| PCT/DE1981/000170 WO1982001377A1 (en) | 1980-10-09 | 1981-10-08 | Method for determining a bm-antithrombin |
| DE8100170 | 1981-10-08 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK237282A DK237282A (da) | 1982-05-26 |
| DK160511B true DK160511B (da) | 1991-03-18 |
| DK160511C DK160511C (da) | 1991-09-30 |
Family
ID=25788386
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK237282A DK160511C (da) | 1980-10-09 | 1982-05-26 | Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af antithrombin-bm |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4496653A (da) |
| EP (1) | EP0049877B1 (da) |
| JP (1) | JPH0258920B2 (da) |
| DE (1) | DE3163764D1 (da) |
| DK (1) | DK160511C (da) |
| WO (1) | WO1982001377A1 (da) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3407280A1 (de) * | 1984-02-28 | 1985-09-19 | Gödecke AG, 1000 Berlin | Testsatz zur bestimmung der aktivierten partiellen thromboplastinzeit (ptt) mit erhoehter heparinempfindlichkeit |
| DE3512909A1 (de) * | 1985-04-11 | 1986-10-23 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur bestimmung von plasminogenaktivatoren (pa) |
| NL8902406A (nl) * | 1989-09-27 | 1991-04-16 | Hendrik Coenraad Hemker Prof D | Werkwijze voor het bepalen van de endogene trombinepotentiaal van plasma, en bloed alsmede een bij deze werkwijze te gebruiken kit. |
| US5595735A (en) * | 1990-05-23 | 1997-01-21 | Johnson & Johnson Medical, Inc. | Hemostatic thrombin paste composition |
| DE69108896T2 (de) * | 1990-11-05 | 1995-08-24 | Baxter Diagnostics Inc | Verfahren zur bestimmung der konzentration von antikoagulantien. |
| DE4203980A1 (de) * | 1992-02-11 | 1993-08-12 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur bestimmung von hirudin und synthetischen thrombininhibitoren |
| AT397391B (de) * | 1992-05-15 | 1994-03-25 | Immuno Ag | Verwendung von prothrombinfragmenten |
| US5476771A (en) * | 1993-02-22 | 1995-12-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Test for quantitative thrombin time |
| WO1993025220A1 (en) * | 1992-06-05 | 1993-12-23 | Reid Thomas J Iii | Test for quantitative thrombin time |
| US5308755A (en) * | 1992-06-08 | 1994-05-03 | Research Corporation Technologies, Inc. | Method for measuring heparin |
| US5985582A (en) * | 1997-12-09 | 1999-11-16 | Sigma-Aldrich Co. | Thrombin-based assay for antithrombin III |
| CN107107057B (zh) | 2014-09-26 | 2020-12-15 | 雅培医护站股份有限公司 | 用于流体样本中的凝结测定的盒设备识别 |
| EP3198270A1 (en) | 2014-09-26 | 2017-08-02 | Abbott Point Of Care, Inc. | Cartridge device with fluidic junctions for coagulation assays in fluid samples |
| ES2911898T3 (es) | 2014-09-26 | 2022-05-23 | Abbott Point Of Care Inc | Dispositivo de cartucho de canal único para ensayos de coagulación de sangre en muestras de fluidos |
| ES2881861T3 (es) | 2014-09-26 | 2021-11-30 | Abbott Point Of Care Inc | Sensores para evaluar la coagulación en muestras de fluidos |
| CN107110875A (zh) | 2014-09-26 | 2017-08-29 | 雅培医护站股份有限公司 | 用在凝固测定中的鞣花酸制剂 |
| US10048281B2 (en) | 2014-09-26 | 2018-08-14 | Abbott Point Of Care Inc. | Cartridge device with segmented fluidics for assaying coagulation in fluid samples |
| EP3197602B1 (en) | 2014-09-26 | 2021-09-01 | Abbott Point Of Care, Inc. | Microfabricated device with micro-environment sensors for assaying coagulation in fluid samples |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH622286A5 (da) * | 1975-06-23 | 1981-03-31 | Pentapharm Ag | |
| SE419871B (sv) * | 1975-12-01 | 1981-08-31 | Pharmacia Ab | Sett att bestemma aktiviteten hos faktor xa-inhibitor i blod |
| DE2601372C3 (de) * | 1976-01-15 | 1980-03-27 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur Bestimmung von Antithrombin III |
| DE2812943C3 (de) * | 1978-03-23 | 1981-05-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Reagens zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Heparin im Plasma |
| US4216142A (en) * | 1978-12-18 | 1980-08-05 | Abbott Laboratories | Chromogenic substrates for the proteolytic enzymes |
| CA1136620A (en) * | 1979-01-08 | 1982-11-30 | Ulf P.F. Lindahl | Heparin fragments having selective anticoagulation activity |
| DE3061860D1 (en) * | 1979-04-24 | 1983-03-17 | Marcel Jozefonvicz | Process for the determination of proteases and antiproteases |
| CA1171375A (en) * | 1980-09-15 | 1984-07-24 | Ulf P.F. Lindahl | Oligosaccharides having selective anticoagulation activity |
-
1981
- 1981-10-08 WO PCT/DE1981/000170 patent/WO1982001377A1/en unknown
- 1981-10-08 EP EP81108116A patent/EP0049877B1/de not_active Expired
- 1981-10-08 US US06/394,998 patent/US4496653A/en not_active Expired - Fee Related
- 1981-10-08 JP JP56503268A patent/JPH0258920B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1981-10-08 DE DE8181108116T patent/DE3163764D1/de not_active Expired
-
1982
- 1982-05-26 DK DK237282A patent/DK160511C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1982001377A1 (en) | 1982-04-29 |
| JPH0258920B2 (da) | 1990-12-11 |
| EP0049877A1 (de) | 1982-04-21 |
| DK237282A (da) | 1982-05-26 |
| JPS57501510A (da) | 1982-08-26 |
| DE3163764D1 (en) | 1984-06-28 |
| US4496653A (en) | 1985-01-29 |
| DK160511C (da) | 1991-09-30 |
| EP0049877B1 (de) | 1984-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK160511B (da) | Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af antithrombin-bm | |
| Eitzman et al. | Peptide-mediated inactivation of recombinant and platelet plasminogen activator inhibitor-1 in vitro. | |
| EP0509086B1 (en) | A method to determine the concentration of anticoagulants | |
| US4234682A (en) | Method and reagent for determining biologically active heparin in plasma | |
| Abildgaard et al. | A simple amidolytic method for the determination of functionally active antithrombin III | |
| EP0016800A1 (en) | Determination of proteolytic enzymes in biological fluids and fluorogenic substrates. | |
| AU730231B2 (en) | Improved thrombin-based assay for antithrombin-III | |
| Tanaka et al. | A sensitive and specific assay for granulocyte elastase in inflammatory tissue fluid using L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-valine-p-nitroanilide | |
| US4379142A (en) | Thrombin inhibitor and preparation and use thereof | |
| CA1060324A (en) | Method for determination of factor xal in blood | |
| CA1079166A (en) | Process for the quantitative determination of antithrombin iii | |
| JP3157844B2 (ja) | ヘパリン含有量の測定方法 | |
| Alwakeel et al. | Coagulation inhibitors and fibrinolytic parameters in patients on peritoneal dialysis and haemodialysis | |
| Handeland et al. | Assay of unfractionated and LMW heparin with chromogenic substrates: twin methods with factor Xa and thrombin | |
| EP0324027A1 (en) | IMPROVED ASSAYS FOR t-PLASMINOGEN ACTIVATOR AND PLASMINOGEN ACTIVATOR INHIBITOR | |
| Schoen et al. | Ratios of anti‐factor Xa to antithrombin activities of heparins as determined in recalcified human plasma | |
| CA2137342A1 (en) | Test for quantitative thrombin time | |
| NO159292B (no) | Fremgangsmaate for bestemmelse av antitrombin-bm og et reagens til bruk ved utfoerelse av fremgangsmaaten. | |
| US5529905A (en) | Method of assaying plasma proteins with prothrombin fragments | |
| Van Aswegen et al. | The effect of calcium and magnesium ions on urinary urokinase and sialidase activity | |
| Scott et al. | A new assay for high molecular weight kininogen in human plasma using a chromogenic substrate | |
| Ødegård et al. | On use of chromogenic substrates for studies of coagulation inhibitors | |
| AU744025B2 (en) | Plasma reference | |
| Kilroe-Smith et al. | Elastase binding capacity of α2-macroglobulin in plasma of patients with asthma or chronic obstructive pulmonary disease, without α1-protease inhibitor deficiency | |
| Ulutin et al. | Looking for our ten years results for coronary heart disease and ischemic stroke group for the standpoint of haemostasis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |