NO159292B - Fremgangsmaate for bestemmelse av antitrombin-bm og et reagens til bruk ved utfoerelse av fremgangsmaaten. - Google Patents

Abstract

For bestemmelse av antitrombin-BM tilsettes en antitrombin-BM-kofaktor, trombin og et bestembart trombinsubstrat til prøveløsningen, og spaltningen av trombinsubstratet beregnes som mål på antitrombin-BM-aktiviteten, hvorved det som kofaktor anvendes heparin, xylan, X-karragen, dextransulfat, mukopolysakkarid-polysvovelsyreester, pentosanpolysulfater eller kort-kjedede heparinderivater, som er oppnådd ved kjemisk eller enzymatisk spaltning av heparin.

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for bestemmelse

av en ny trombin-inhibitor, som betegnes som antitrombin—

BM, og et reagens for utførelse av fremgangsmåten.

Det proteolytiske enzym trombin spiller en viktig rolle i blodlevringssystemet. Det er kjent at det i blodlevringssystemet videre forekommer en spesifikk inaktivator for trombinet, som har evnen til å hemme trombin i nærvær av heparin og som betegnes som antitrombin III. Anvendelse av heparin som antikoagulant spiller derfor en viktig rolle i terapien og forskningen. Likeså er AT III, som også betegnes som heparin-kofaktor, en viktig bestanddel i testsystemer for plasmaets levringsegenskaper. AT III inhiberer imidlertid også trombin i fravær av heparin i en tidsavhengig reaksjon og hemmer foruten trombin f.eks. også trypsin, plasmin og faktor Xa, og er altså relativt uspesifikk»

Det er nu overraskende funnet en ny spesifikk trombin-inhibitor, som på mange måter skiller seg fra AT III. Den er nærmere beskrevet i DE off. skrift 3 0 38 16 3.

Den nye trombininhibitor hemmer trombin i nærvær av dekstransulfat minst dobbelt så sterkt som i nærvær av heparin, derimot praktisk talt ikke i nærvær av plasmin og trypsin, og den skiller seg immunologisk fra antitrombin III.

Da den nye trombininhibitor bindes mindre sterkt til heparin enn AT III, betegnes den som AT-BM (Antitrombin Binding Moderately to Heparin).

Mens AT III bare trenger en heparinkonsentrasjon av størrelsesorden 0,02 USP/ml for optimal trombinhemming, ligger den nødvendige heparinkonsentrasjon for optimal trombinhemming med AT-BM på over 1,0 USP/ml.

Mens human-AT-III blant andre også hemmer faktor Xa, plasmin og trypsin og reagerer uvesentlig sterkere med humantrombin enn med oksetrombin, er den nye human-AT-BM nesten fullstendig trombinspesifikk og inhiberer humantrombin tydelig sterkere enn oksetrombin. Videre fremmes trombinhemmingen med AT III sterkere med heparin enn med andre aktivatorer, som f.eks. dextransulfat. Derimot oppnåes det en 2 til 3 ganger så sterk trombinhemming for AT-BM med dextransulfat enn i nærvær av heparin.

Mens AT III hemmer trombin i en tidsavhengig reaksjon også i fullstendig fravær av kofaktor, som f.eks. heparin, oppviser AT-BM under slike omstendigheter ingen hemmevirkning.

På grunn av de ovennevnte egenskaper kan den nye trombininhibitor AT-BM ikke bare anvendes på samme måte som AT III ved terapeutiske og diagnostiske fremgangsmåter og således utgjøre et interessant forskningskjemikalium, men den lar seg ifølge oppfinnelsen også bestemme analytisk i nærvær av AT III.

Ifølge oppfinnelsen foregår derfor bestemmelse av AT-BM ved utnyttelse av spesifisitetsforskjeller overfor AT III med de forskjellige kofaktorer. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for bestemmelse av AT-BM er derfor karakterisert ved at det til prøveløsningen tilsettes en antitrombin-BM-kofaktor, trombin og et bestembart trombinsubstrat og spaltningen av trombinsubstratet beregnes som mål på antitrombin-BM-aktivitet, hvorved

a) spesifisitetsforskjeller mellom antitrombin-BM og antitrombin-III i nærvær av forskjellige mengder av kofaktorene

heparin eller ^ -karragen utnyttes og forskjellen mellom de aktiviteter som oppnåes med høye og lave kofaktorkon-sentrasjoner beregnes, eller b) antitrombin-BM-aktiviteten måles direkte med dextransulfat, mukopolysakkarid-polysvovelsyreester eller pentosanpolysulfater som kofaktor.

Spesifisitetsforskjeller mellom AT-BM og AT III i nærvær av forskjellige mengder heparin fremgår av den etter-følgende tabell 1.

En foretrukken utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er derfor at totalmengden av AT-BM og AT III bestemmes ved en konsentrasjon på 1 til 20 USP heparin pr. ml, og AT III alene bestemmes i et parallellforsøk med en lavere kofaktor,* konsentrasjon på 0,01 til 0,03 USP heparin pr. ml, og innholdet av AT-BM bestemmes fra differansen mellom begge antitrombinbestemmelser. I stedet for heparin kan det som kofaktor også anvendes Å. -karragen i analoge mengder.

Ved den andre utførelsesformen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes dextransulfat, mukopolysakkarid-polysvovelsyreester eller pentosansulfater som kofaktor. Slike heparinanaloger er kjente og kan fåes i handelen under betegnelsen f.eks. "Arteparon" henholdsvis "SP 54". Ved konsentrasjoner mellom ca. 2,5 og 25 pm/ml av disse kofaktorer er utelukkende AT-BM aktiv, slik at innholdet av AT-BM kan bestemmes selektivt også i nærvær av

AT III.

Likegyldig om differansemetoden eller den direkte spesifikke AT-BM-bestemmelse anvendes tilsettes for bestemmelsen hensiktsmessig 0,01 til 0,1 U/ml trombin, 0,5 til 1000 umol/ml trombinsubstrat og 10 til 250 mmol/1 bufferired pH 7,5 til 8,5, hvorved det i tillegg ytterligere kan tilsettes opp til 2 00 mmol/1 NaCl og opp til 50 IU/ml aprotinin. Disse to sistnevnte substanser er dog ikke essensielle og kan også utelates.

Dessuten har en tilsetning av polyethylenglycol og/ eller en kompleksdanner for tungmetaller, som f.eks. ethylen-diamin-tetraeddiksyre og lignende polyaminacetater vist seg som gunstig.

Som trombinsubstrat kan det anvendes ethvert substrat som er kjent for trombinbestemmelse. Foretrukket er de handelsvanlige, optisk bestembare substratene. Når det gjelder de sistnevnte handler det om lavmolekylære peptider med en avspaltbar rest som lett kan bestemmes optisk. Særlig foretrukket som substrat er tos-gly-pro-arg-pNA.

Som buffersubstanser kan alle som er virksomme i området 7,5 til 8,5 anvendes. Foretrukket er trisbuffer, triethanolamin-buffer og tris-imidazol-buffer.

I normale humanplasma foreligger AT-BM ved siden av AT III og står for gjennomsnittlig ca. 20% av den totale antitrombinaktivitet, hvorved resten på ca. 80% kommer fra AT III. Forholdet mellom AT-BM og AT III kan under bestemte omstendigheter forandres. Dette viser de sammenfattede for-søksresultater som er angitt i tabell 2.

Som nevnt er også kofaktor-spesifisiteten til den nYe AT~ BM forskjellig fra den til AT III. Særlig oppnåes den største hemmekapasitet for AT III i nærvær av heparin, mens det oppnåes ennå større hemmeverdier for AT-BM med dextransulfat. De oppnådde verdier fremgår av tabell 3.

Egenskapene til AT-BM skiller seg også vesentlig fra egenskapene til andre kjente proteaseinhibitorer i plasma. Dette fremgår tydelig av den etterfølgende tabell 4.

Ytterligere en oppfinnelsesgjenstand er et reagens for bestemmelse av AT-BM. Reagenset ifølge oppfinnelsen er karakterisert ved at det inneholder trombin, et trombinsubstrat som kan bestemmes, buffer av pH 7,5 til 8,5, eventuelt NaCl eller/og aprotinin såvel som en av kofaktorene heparin, \-karragen, dextransulfat, mukopolysakkarid-polysvovelsyreester eller pentosanpolysulfater.

I en foretrukken utførelsesform er reagenset ifølge oppfinnelsen karakterisert ved at det inneholder trombin, heparin, aprotinin, polyethylenglycol, kompleksdanner, NaCl, trombinsubstrat og buffer. Særlig foretrukne utførelses-former er karakterisert ved at de inneholder trombin, dextransulf at, aprotinin, NaCl, buffer og trombinsubstrat, at trombinsubstratet består av tos-gly-pro-arg-pNA, og at de inneholder 0,01 til 0,1 U/ml trombin, 0,5 til 1000yumol/ml trombinsubstrat, 0 til 200 ramol/1 NaCl, 0 til 50 IU/ml aprotinin og 10 til 250 mmol/1 buffer.

Utvinning av trombininhibitoren AT-BM er beskrevet i

DE off.skrift 3 038 163. Den beror på dens avvikende egenskaper fra AT III, eksempelvis overfor heparin.

Når serum, plasma eller en derav oppnådd fraksjon be-handles med bærerbundet, uløselig heparin, det sistnevnte etter fjerning ved eluering av ikke bundet materiale med en ionestyrke på 0,12 til 0,36 og en pH-verdi i området 6,5 til 8,3, oppnås AT-BM. Under disse betingelser elueres ikke

AT III.

For innstilling av pH-verdiområdet kan det anvendes buffersubstanser som bufrer innen dette pH-område. Buffer-konsentrasjonen ligger hensiktsmessig mellom ca. 0,005 til 0,1 M. De beste resultater oppnås ved pH-verdier mellom 7,5 og 8,0. Fosfat- og tris-buffer foretrekkes.

Hensiktsmessig arbeides i nærvær av et sekvestrerings-middel som f.eks. EDTA. Konsentrasjonen av dette ligger hensiktsmessig mellom 5 og 20 mM.

Følgende eksempler forklarer oppfinnelsen nærmere.

Eksempel 1

9 deler nytappet blod blandes med 1 del 0,11 mol/l natriumcitrat og sentrifugeres ved ca. 3000 omdr./min. Av det således oppnådde citratplasma fortynnes 20^,ul med 1,0 ml 0,9%-ig NaCl-løsning.

5 ml av en løsning som inneholder 0,1 M tris/HCl,

pH 8,1, 0,15 M NaCl, 0,01 M EDTA, 1% polyethylenglycol,

6,5 IU aprotinin/ml og 1,75 USP heparin/ml, blandes med 0,25 ml av en trombinløsning med 0,5 U/ml og får stå i 30 minutter (= AT-reaksjonsblanding). Deretter følger bestemmelsen ifølge det etterfølgende skjema ved en måletemperatur på 25°C, med en kyvette med 1 cm skikt-tykkelse og en bølgelengde på Hg 405 nm. Ekstinksjonsøkning måles mot luft.

Pipettering i plastkyvetter

Fra ekstinksjonsforskjellene pr. 30 sekunder

teE/30 sekunder) dannes middelverdien, og denne innføres i be-regningen.

1) = tos-gly-pro-arg-pNA

På denne måte oppnås den totale antitrombinaktivitet. Ved gjentagelse av forsøket med en heparinkonsentrasjon som er senket til 0,02 USP/ml, oppnås AT III-konsentrasjonen. Mengden AT-BM fås som differanse mellom totalantitrombin-aktivitet og AT III.

Eksempel 2

Fremstilling av reaksjonsblandingen ( blanding av 1 og 2)

Blandes i et plastkar og får stå i ca. 30 min. ved 25°C: 10 ml buffer (løsning 1) og 1 ml trombin (løsning 2).

Prøveforberedelse

For bestemmelsen fortynnes en del citratplasma med

200 deler NaCl (0,9%-ig) (f.eks. 50^ul plasma + 10 ml 0,9%-ig NaCl-løsning).

Bestemmelsesbetingelser

Bølgelengde: Hg 405 nm

Kyvette: plastkyvette, 1 cm skikttykkelse

Måletemperatur: 25°C

Måling mot luft (ekstinksjonsøkning)

Til hver måleserie er det nødvendig med minst 1 trombin-null-verdi (TL)

® o Inhibitorenheter (trypsin, Chromozym TH, 25 C)

Det pipetteres i plastkyvetter

Beregning:

For bestemmelsene ble løsninger av AT-BM og AT III fremstilt med følgende innhold:

AT III: 12,5 IU/ml 25°C

AT-BM: 12,1 IU/ml 25°C

Denne konsentrasjon tilsvarer det normale humanplasma-innhold av AT III.

For å vise spesifisiteten for bestemmelsen også i nærvær a<y> AT III, ble bestemmelsen gjennomført såvel med AT-BM-løsningen som med en blanding av begge løsningene. Det ble herved arbeidet som følger:

1. Måling ay AT- BM

AT-BM-løsningen ble fortynnet 1 + 100 med fysiologisk koksaltløsning (0,05 ml prøve + 5,0 ml NaCl-løsning).

For oppnåelse av måleområdet ble det fra denne prøve-fortynning fremstilt ytterligere fortynninger med fysiologisk koksaltløsning (9 deler AT-BM + 1 del NaCl, 8+2,

7+3, osv.) til en sluttfortynning på 1:1000.

Konstante volumer (0,05 ml) av de fremstilte AT-BM-fortynninger ble deretter anvendt i testen.

Resultatet er vist i fig. 1 på tegningen (••••). Testen måler proporsjonale hemmeverdier innen de valgte grenser (AEAT_BM)<.>

2. Måling av AT- BM i nærvær av AT- III

0,05 ml AT-BM-løsning ble fortynnet med 0,O5 ml AT-III-løsning og 4,95 ml fysiologisk koksaltløsning (til-svarende en 1 + 100 fortynning av begge bestanddeler).

Av denne prøveløsning ble det fremstilt etterfølgende fortynninger som beskrevet under 1.

Konstante volumer (0,05 ml) av disse fremstilte fortynninger ble så anvendt i testen.

Resultatet er vist i fig. 1 (000000). Innenfor test-nøyaktigheten ble oppnådd samme resultat som med AT-BM alene. Testresultatet ble ikke påvirket av AT-III. Bare AT-BM ble målt.

Analoge resultater ble oppnådd når dextransulfat ble erstattet med mukopolysakkarid-polysvovelsyreester eller pentosanpolysulfater.

3. Forskjellige kofaktorers reaktivitet med AT III og AT- BM

Målingene ble gjennomført analogt med eksempel 2, idet det

i stedet for plasma ble tilsatt henholdsvis 12,1 enheter AT III og 11,3 enheter AT-BM. I stedet for dextransulfat

(1 mg/100 ml) ble de i tabellen angitte kofaktorer tilsatt ved en konsentrasjon på 2,5 mg/100 ml reagens.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av antitrombin-BM, karakterisert ved at prøveløsningen tilsettes en antitrombin-BM-kofaktor, trombin og et trombinsubstrat som kan bestemmes, og spaltningen av trombinsubstratet beregnes som mål for antitrombin-BM-aktiviteten, hvorved . a) spesifisitetsforskjellene mellom antitrombin-BM og antitrombin-III i nærvær av forskjellige mengder av kofaktorene heparin eller X-karragen utnyttes, og forskjellen mellom de ved høye og lave konsentrasjoner av kofaktorer oppnådde aktiviteter beregnes,eller b) antitrombin-BM-aktiviteten måles direkte med dextransulf at, mukopolysakkarid-polysvovelsyreester eller pentosanpolysulfater som kofaktor.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som høy konsentrasjon anvendes 1 til 20 USP/ml og som lav konsentrasjon 0,01 til 0,03 USP heparin pr. ml.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes 2,5 til 25^,ug/ml dextransulf at.

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1, 2 eller 3, karakterisert ved at det anvendes 0,01 til 0,1 U/ml trombin, 0,5 til 1000^umol/ml trombinsubstrat, 0 til 200 mmol/1 NaCl, 0 til 50 IU/ml aprotinin og 10 til 250 mmol/1 buffer av pH 7,5 til 8,5.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at løsningen tilsettes polyethylenglycol og en kompleksdanner for tungmetaller.

6. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at det som trombinsubstrat anvendes tos-gly-pro-arg-pNA.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det anvendes en løs-ning som inneholder 0,012 U/ml trombin, 6,5 IU aprotinin pr. ml og 1% polyethylenglycol, og som er 0,01 molar på EDTA, 0,15 molar på NaCl, 0,1 molar på buffer og 0,19 mmolar på substrat.

8. Reagens for bestemmelse av antitrombin-BM, karakterisert ved at det inneholder trombin, et bestembart trombinsubstrat, buffer med pH 7,5 til 8,5, eventuelt NaCl eller/og aprotinin såvel som en av kofaktorene heparin, \-karragen, dextransulfat, mukopolysakkarid-polysvovelsyreester eller pentosanpolysulfater.

9. Reagens ifølge krav 8, karakterisert ved at det inneholder trombin, heparin, aprotinin, polyethylenglycol, kompleksdanner, NaCl, trombinsubstrat og buffer.

10. Reagens ifølge krav 8, karakterisert ved at det inneholder trombin, dextransulfat, aprotinin, NaCl, buffer og trombinsubstrat.

11. Reagens ifølge krav 8 eller 9, karakterisert ved at trombinsubstratet består av tos-gly-pro-arg-pNA.

12. Reagens ifølge krav 9 eller 10, karakterisert ved at det inneholder 0,01 til 0,1 U/ml trombin, 0,5 til 1000^,umol/ml trombinsubstrat,

0 til 200 mmol/1 NaCl, 0 til 50 IU/ml aprotinin og 10 til 250 mmol/1 buffer.