JPH02261399A - 血漿中の総繊維素溶解活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 西ドイツ特許公開公報第３．５０２．８７８号には、血
漿の繊維素溶解状態を測定する方法が開示されている。

この方法は、 ａ）　混濁形成に十分な量の＃ａ維素を自然のままの血
漿試料に添加するか又はこの繊維素をその場で生じさせ
、その混濁を測定するか又は形成された繊維素分解生成
物を測定するか、或いは、ｂ）　発色性プラスミン基質
及び混濁形成に十分でない量の繊維素、＃ａ維素原分解
生成物又はその場で繊維素を生じる酵素を自然のままの
血漿試料に添加し、形成された色を測定することを特徴
とする。

前記特徴を有する方法は、血漿の過繊維素溶解活性を比
較的短時間で測定することを可能にすることを意図する
ものであり、繊維素溶解治療をモニターする場合に特に
有用なものである。一定量のプラスミノゲン賦活体を、
検査する血漿に便宜的に加え、また好ましくはプラスミ
ノゲン賦活体を治療許容濃度で使用する。したがって、
この実施態様においては、規定量のプラスミノゲン賦活
体の存在下において、血漿の反応性が測定される。

この方法により、繊維素溶解治療のために与えられる、
ｔ−ＰＡ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプ
トキナーゼ又はそれらの誘導体のような治療薬を与えた
結果、血漿の繊維素溶解状態がどのように変化するかを
確認することができる。

しかし、実際において前記測定方法は、測定に極めて長
い時間を要し、かつ溶解治療の短時間モニターのために
は不十分な感度であり、このことは特に例えば、２〜１
０００ｎｇ／ｍｉ、好ましくは２〜１１００ｎ／ｍｌ！
のｒｔ−ＰＡ成分を有するｔ−ＰＡのような低濃度のプ
ラスミノゲン賦活体を使用した場合顕著であることがわ
かった。したがって、本発明の目的は前記方法の不利益
を避け、自動化することができ、かつ測光法により評価
することができ、特に生体内の状態を確実に反映させる
結果が迅速に得られる包括的な繊維素溶解試験法を提供
することである。

本発明は、この目的を自然のままの血漿に代えて希釈し
た血小板希薄血３！　（ＰＰＰ）を使用することにより
達成する。

本発明の方法は、血漿中の総繊維素溶解活性の測定方法
であって、 ａ）　混濁を形成するのに十分な量の繊維素を、希釈し
た血小板希薄血漿に加え、又はこの繊維素をその場で生
成させ、混濁の経時的変化又は繊維素分解生成物の経時
的形成を測定し、或いは、ｂ）　発色性プラスミン基質
及び混濁の形成に不十分な量の繊維素、繊維素分解生成
物又はその場で繊維素を生じる酵素を加え、色の経時的
形成を測定することを特徴としている。

本発明において「混濁の測定」とは、単位時間当たりの
混濁の減少及び／又は増大を測定すること、混濁最大が
達成されるまでの時間を測定すること、又は混濁最大に
対して一定の混濁の減少又は増大が達成されるまでの時
間を測定することを意味する。また、これらの測定法を
組み合わせて使用することもできる。

色は、色形成を動的に追跡することによって測定するこ
とができ、この場合には、単位時間当たりの吸光度の変
化が測定される。同様に、所定の時間後に達成される吸
光度を測定することができ、あるいは色形成反応を所定
時間後に停止させ、形成された色をその後、いつでも任
意の時に測定することができる。

形成された繊維素分解生成物の測定は、市販の標準試験
試薬及び試験方法を用いて行うことができる。例えば、
ブドウ球菌−凝集試験（製造元：ベーリンガーマンハイ
ム社（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｕ＋＋Ｇｍｂ
Ｈ）　）又は例えば、抗体被覆されたラテックス粒子に
よる免疫法（製造元：ウエルカム社（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ
Ｃａｒｐ、）　）がある。

色形成反応の停止は、適当な阻害剤、好ましくはプラス
ミン阻害剤又は例えば酢酸もしくはクエン酸のような酸
を添加することによって行うことができる。好ましくは
、一定の吸光度が達成されるまでの時間が測定される。

上述の本発明の方法により、血漿中の過繊維素溶解活性
を測定できる。この場合、既に血漿中に存在するか又は
生成されたプラスミノゲン賦活体は反応を開始する。本
発明の方法のこの実施態様は、繊維素溶解治療をモニタ
ーするのに特に好適である。したがって、自然のままの
血漿のＩＩｌ維素溶解状態が治療の過程においてどのよ
うに変化を測定するのに使用することができる。

さらに、本発明方法のもう一つの実施態様によれば、プ
ラスミノゲン賦活体の一定量が、好ましくは治療上許容
され得る濃度で、血液又は血漿に加えられる。この方法
の実施態様において、血漿゛の反応性は、一定量のプラ
スミノゲン賦活体の存在下で測定される。このことは、
検量線を作成し、＃ａ維毒素溶解治療開始するのに特に
重要である。

Ｓｌｉ！素溶解の治療のために提供される治療薬、例え
ば、ｔ−ｐ＾、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、スト
レプトキナーゼ又はその誘導体を加えたときに、血漿の
繊維素溶解状態がどのように変化するかを確認すること
ができる。一つの好ましい実施態様によれば、繊維素は
その場でトロンビン又はバトロキソビンもしくはアルビ
ンのようなトロンビン様酵素を加えることによって生じ
る。

使用される繊維素置分解生成物としては、繊維素置をブ
ロムシアンで処理することによって得られるようなもの
が好ましい（ベルハイエン（１，Ｈ。

Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ）、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓ
ｔａｓ　　第４８巻　第２６６〜２６９頁（１９８２）
）。１０〜１５０μｇ／ｗｌの濃度のものが使用される
のが好ましい。

繊維素単量体は、繊維素置をバトロキソビンで処理シ、
バ′トロキソビンをジイソプロピルフルオロホスフェー
トで失活させ、除去し、次いで繊維素凝塊を１〜３モル
の尿素溶液中に溶解することによって得られる。繊維素
単量体の濃度は１〜１００μｇ／ｄが使用されるのが好
ましい。

発色性プラスミン基質としては、プラスミンの作用下で
色形成に適した基が分解される、いかなるプラスミン基
質も使用することができる。この場合、色形成する基と
しては、例えばニトロアニリン、ジニトロアニリン及び
その誘導体のように直接に測光法により測定することが
できるようなものと、もう一つの成分との反応によって
色形成を起こすような化合物とがある。

プラスミノゲン賦活体を加える本発明方法の実施態様の
場合、プラスミノゲン賦活体としては、例えば、ｔ−ｐ
＾、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ、ストレプトキナ
ーゼ又はその誘導体を使用することができる。一つの好
ましい発色性プラスミン基質はＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ｌｙｓ−ｐ−二）　ｏ　７ｓ　！Ｊ　ンテある。

本発明の方法は、約２０〜４０℃の間のいかなる恒温に
おいても実施することができるが、特に、生理的条件、
すなわち３７℃が好ましい。

本発明の方法は、便宜上次のように行われる。

本発明の測定方法は希釈ＰＰＰを使うのが好ましく、便
宜上その希釈範囲はｌ；５〜ｌ：２５であるが、好まし
くは１：８〜１：１５である。

検査される血小板希薄血漿は、公知の方法、例えば、採
取したクエン酸添加血液又はＢＤＴＡ添加血液を、便宜
上３０００〜４０００Ｘｇ、好ましくは３０００〜３５
００ｘｇで１０分間遠心分離することにより調製される
。

使用される希釈液は血漿中の活性を測定するために常用
されている希釈液であってよく、特に等張希釈液、例え
ば、生理食塩水、又はトリス緩衝液、ＮａＣｌ緩衝液又
はＩＩＢＰＥｓ　ａｌｌ液のような緩衝液、例えば、Ｏ
，ｌ　Ｍ　）リス緩衝液ｐＨ７，４，０，２Ｍ　）リス
緩衝液ｐＨ７，４，０，Ｉ　Ｍ　ＨＥＰＰ：Ｓ緩衝液９
Ｈ１，４、又は０．９％ＮａＣ’ｌ緩衝液である。

前記希釈液はさらに他の常用されているアジ二バント、
例えば、０．０２重量％εＯＴ＾のような錯体形成剤、
０．１重量％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　８０のような
界面活性物質及び／又は１重量％血清アルブミンを含む
ことができる。

しかし、本発明の好ましい希釈液は、分子量８０００〜
３５０００、好ましくは９０００〜１２５００のポリエ
チレングリコールを濃度１〜５重量％、好ましくは２重
量％含む上記希釈液の一つである。本発明にふいてポリ
エチレングリコールが使用されることにより、試験され
る試料の不透明度が増加し、一方、同時に凝塊形成速度
が減少せず、そして分子量９０００〜１２５００のポリ
エチレングリコールを使用した場合、凝塊収縮速度が高
くなり過ぎず好ましい。

もちろん、分子量８０００〜３５０００、好ましくは９
０００〜１２５００のポリエチレングリコールの必要量
を濃度１〜５重量％になるまで、既に適切に希釈された
血漿に後から加えることもできる。しかしながら、分子
量９０００〜１２５００のポリエチレングリコールを後
から加える場合、濃度１．５重量％までとすることが好
ましい。

このように、選択された一連の濃度に対応する種々の希
釈度で、希釈され、かつすでにプラスミノゲン賦活体、
好ましくはｒｔ　−ＰＡを含むＰＰＰは、バトロキソビ
ンのようなトロンビン様酵素により凝固される。透明な
未凝固ＰＰＰは、凝固の間に不透明となり、凝固が進行
するにしたがって混濁が増大する。凝固開始前にプラス
ミノゲン賦活体を加えることにより、凝固のピークに到
達した後、凝固物質溶解効果を有する。溶解は混濁の減
少を伴う。この溶解の終点は、初期値への到達によって
決められる。

治療を開始する前に血小板希薄血漿からプロットされる
標準曲線を決定するために、例えば、ＰＰＰｏ、１ｍｌ
をポリエチレングリコールを含む好適な希釈液０．９−
で希釈し、かつ混合した後、その混合物を３７℃で５分
間インキコベートする。次いで、例えば、バトロキソビ
ン５０μｇを加え、混合した後、混濁の変化を３７℃で
波長３４０１ｍで測光法により記録する。標準曲線を使
用することにより、血漿中の繊維素溶解活性に対応する
プラスミノゲン賦活体の濃度を５０％溶解達成に要する
時間から決定することができる。溶解の基礎となる酵素
的反応は温度に依存するものであるから、−連の測定を
とおして恒温を維持することは決定的に重要である。温
度が下がることにより、溶解速度も低下し、異なる時間
及び／又は異なる温度で求められた測定値は相互に相関
がない。

ここにおける評価は、５０％溶解を達成するのに要する
時間が試料中のプラスミノゲン賦活体の濃度と逆比例し
ているという相関関係に基づいている。繊維素溶解活性
の測定値は、凝固開始から最大凝固に対して５０％の溶
解が達成されるまでの時間である（第１図参照）。

５０％溶解の達成に基づく計算から得られる総活性に関
する値は溶解の終点を基準とする値と大変に良く相関す
る。したがって、５０％溶解が達成されたときに試験を
終了させるのが実用的である。というのは、こうするこ
とによって、各個別の測定ならびに、実施すべき測定法
全体に要する時間が著しく短縮されるからである。ｒｔ
−ＰＡの繊維素溶解活性（５０％溶解）の標準曲線の例
を第２及び３図に示す。

第２図はＥＤＴ＾添加血液から調製し１：１０希釈ＰＰ
Ｐにおける標準曲線を示す。

第３図はクエン酸添加血液から調製した１：１０希釈Ｐ
ＰＰにおける標準曲線を示す。

これらの標準曲線は２〜１０００ｎｇ／−の総測定範囲
にわたって直線ではないことがわかる。

“深部静脈血栓症“に使用されるようなより低濃度のｒ
ｔ−ＰＡ投与では、わずかに２〜４０ｎｇ／−の血漿レ
ベルが予想される。この狭い範囲における曲線は直線と
考えるべきである。

したがって、全試験の特に好ましい実施態様は、次のよ
うに個別的工程に分割される。

ａ）　標準曲線をプロットするために繊維素溶解治療を
開始する前にクエン酸又はεＤＴＡを加えた血液を採取
する。

ｂ）　血小板希薄血漿（ＰＰＰ）を得、ＰＰＰを適切な
希釈液によって１＝１０に希釈する。

Ｃ）濃度２〜１０００ｎｇ／＋７１１！、好ましくは２
〜１００ｎｇ／ｍｌ！でブラスミノタン賦活体を加える
ことにより、この希釈ＰＰＰについて標準曲線をプロッ
トする。

ｄ）　　！！ｌ維素溶解治療中ａ）及びｂ）の工程を繰
り返す。

ｅ）　標準曲線を用いて、患者血漿中の最新の繊維素溶
解全活性を測定する。

患者の血液中の望ましい全繊維素溶解活性を得るために
必要ならば、得られた結果を利用して、プラスミノゲン
賦活体の注入量を補正することができる。

個別的な工程は次のように行われるのが好ましい。

ａ）　血液試料を通常の条件下で採取する。

ＥＯＴ＾添加血液： ２％εＤＴ＾１部十血液９部 クエン酸添加血゛液： ３．８％クエン酸ナトリウム１部十血液９部ｂ）　採取
した後すぐに、血液を２０℃、３３００Ｘｇで１５分間
遠心分離する。遠心分離後、上清ＰＰＰを取り出し、１
：１０に希釈する。

ＥＤＴ＾添加血液から得られたＰＰＰ溶液の希釈液：分
子量９０００〜１２５００のポリエチレングリコール１
００００　２％とトウィーン８００．１％を溶かした生
理食塩水。

クエン酸添加血液から得られたＰＰＰ溶液の希釈液： 分子量９０００〜１２５００のポリエチレングリコール
２％、トウィーン８００．１％及びＥＤＴ＾　０．０２
％を溶かした生理食塩水。

Ｃ）　プラスミノゲン賦活体の例として、ｒｔ−ＰＡを
使用した（アクチリス（Ａｃ辷１１ｙｓｅ））　。一方
、ｒｔ−ＰＡを希釈するために次の緩衝液を使用した。

０．５ＭＬ−アルギニン、０．１％トウイーン８０及び
０．０５　Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯａ　（ｐＨ７，４）。

標準曲線をプロットするために、個別的な試験の組成物
について、ＨＯＴ八又はクエン酸添加血液から調製され
たＰＰＰ中のｒｔ−ＰＡの２２−１Ｏ００ｎ／艷の濃度
範囲における溶解活性を次のプランに従って測定した（
標準曲線をプロブトするためのＰＰＰ中にふけるｒｔ−
ＦＡ最終濃度）。

１０００ｉｇ／ｒｎＩ７！、８００ｉｇ／−１６００ｉ
ｇ／ｍｆ、４００ｎｇ／＋ｙ＋４！、２００ｉｇ／ｍｉ
、　　ｌ　００ｉｇ／ｌｎｌ。

８０ｉｇ／ｍｌ、　６０ｉｇ／ｍｉ’、４０ｎｇ／Ｗｄ
！、２０ｎｇ／−１１０ｉｇ／ｄ、　８ｉｇ／ｍ！、６
ｉｇ／−１４ｎｇ／−及び２ｉｇ／ｒｎ！。

必要ならば、濃度の範囲を狭く又は広くすることができ
、又はより少ない測定点で測定することができる。

ｄ）及びｅ）治療を行っている患者の繊維素溶解状態を
測定するために、患者の血液から得られたＰＰＰｏ、１
ｍｌを前記の適切な希釈液のいずれか０．９ｉで希釈し
、混合した後、該混合液を３７℃で５分間インキュベー
トする。次いで、バトロキソビン５０μｌを加え、混合
した後、混濁の変化を波長３４０ｎｍで測光法により記
録する。標準曲線を使用することにより、血漿中の繊維
素溶解活性に対応するプラスミノゲン賦活体の濃度を、
５０％溶解の達成に要する時間から決定することができ
る。

繊維素溶解活性が意図したレベルに対応しないならば、
これをプラスミノゲン賦活体の注入割合を適合させるこ
とにより補正することができる。

本発明の方法のさらに有利な点は、ヘパリンの存在下に
おいてプラスミノゲン賦活体の低濃度の測定に関しても
好適なことである。なお、この低濃度測定は通常ヘパリ
ンを使用して行われることから、前記利点は繊維素溶解
治療においてより重要度が大きい。

この利点を明らかにするため、分解時間に対するヘパリ
ンの影響を次のように試験した。

本発明の試験において、ヘパリンを次のプランに従って
クエン酸又はＥＤＴ＾を添加した血漿に加えた。

血液試料を採取した後、直ちに調製し測定できない場合
、室温（ＲＴ）では測定される繊維素溶解活性が急速に
低下するため、血漿を約４℃で保存しなければならない
（第４及び５図）。４℃においては、この活性低下は１
時間以内では約２０％に制限され、続く５時間の間はそ
れ以上の低下は起こらない（第６及び７図）ので、得ら
れる測定値は補正することができ、この活性低下は許容
することができる。一方、これよりも遅い段階での測定
値は使用することはできない。というのは、適切な時間
内における繊維素溶解活性を調整するために、これらの
値を用いて注入量を補正することができないからである
。

さらに、第８及び９図は、ｒｔ−ＰＡの濃度が極めて低
い場合であっても、１１．Ｕ、／ｍｊ！までのヘパリン
添加の効果は比較的小さく、すなわち、５０％溶解又は
溶解終了に要する時間それほど長くも短くもならない（
５１０％）ことを示している。

本発明の測定法の優越性は第３表から明らかである。

すなわち、希釈しない状態において極めて長い溶解時間
を有しく５０％溶解又は溶解縫子）、シたがって、西ド
イツ特許公開公報第３．５０２．８７８号に開示された
方法（５０％溶解に３時間以上必要）では測定すること
のできない試料も、本発明の方法を使用することにより
簡単に測定することができる。これは、特に低濃度のプ
ラスミノゲン賦活体について、必要とされる測定時間を
実質的に著しく短縮することができるからである。

このことは、例えば、深部静脈血栓症、肺閉塞症等の処
置におけるように、低濃度のプラスミノゲン賦活体を使
用して行われるような治療の際に測定を行うことができ
るという点で特に重要である。

さらに、本発明の方法を、希釈液として生理食塩水を用
い、平均分子量９０００〜１２５００の市販されている
ポリエチレングリコール１００００を２重量％添加して
実施した場合、試料中に望ましくない収縮は生じない。

以下の実施例は、前記の内容及び添付された図面との関
連において本発明の詳細な説明するものである。

実施例 試薬 レブテイラーゼ（Ｒｅｐｔｉｌａｓｅ＞　　２０ＰＵ／
ｍＩ！ｔ−ＰＡ （２〜１１０００ｎ／＋ｎｌコニ／トロールとして単独
）クエン酸添加　ＰＰＰ用希釈緩衝液 ０．９％食塩水 ポリエチレンクリコール１００００　　２％トウィーン
８０　　　　　　　　　　０．１％εＯＴ八　　　　　
　　　　　　　　０．０２％ＥＤＴＡ添加ＰＰＰ用希釈
液 ０．９％食塩水 ポリエチレングリコール１００００　　２％トウィーン
８００．１％ 試験用組成物 ｒｔ−ＰＡ　　１０μｍ （２〜１１０００ｎ／ｍｌコントロールとして単独）Ｐ
ＰＰ　　　　１００μｌ 希釈液　３００μｍ （０，９％食食塩水車ポリエチレングリコール１０００
０２．０％） 試料を十分に混合し、３７℃で５分間インキユベートシ
、次いでレプティラーゼ５０μｌと合わせ、再度十分に
混合する。

凝固開始後、直ちに吸光度の増減を測定温度３７℃、波
長３４０ｎｍでモニターした。

１：１０及びｌ：２０に希釈されたクエン酸添加及びε
ＤＴＡ添加ＰＰＰにおけるｒｔ−ＰＡの投与量と活性の
関連を示すグラフの作成。

試薬 レプティラーゼ （ベーリンガーマンハイム　オータ一番号各バイアルの
内容物を１−の蒸留水に溶かした。

クエン酸添加血液： ３．８％クエン酸ナトリウム１部十血液９部ＥＤＴ＾添
加血液： ２％εＤＴＡ　　１部十血液９部 ｒｔ−ＰＡ積標準１＋ｎｇ／ｒｎｉ！ ０．５Ｍアルギニン緩衝液（ｐ）Ｉ　７．４　’）０．
５Ｍ　　Ｌ−アルギニン トウィーン８０　　　　　　　０．１％リン酸酸水素ナ
ナトリウム０．０５Ｍ クエン酸添加血液用希釈緩衝液 生理食塩水 ポリエチレングリコール１００００　２　　　％トウシ
ーン８０　　　　　　　　　　０．１　　％εＤＴＡ　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０２％ＥＤＴＡ添
加血液用希釈緩衝液 生理食塩水 ポリエチレングリコール１００００　　２　　％トウシ
ーン８００゜１％ 手順 血漿の調製 採血はベナキ二−ビタリス（Ｖｅｎａ　Ｃｕｂｉｔａｌ
ｉｓ）から通常の方法で行った。直ちに２０℃、３３０
０ｘｇ　（４０００ｒｐｍ）で遠心分離を１５分間行っ
た。次いで、ＰＰＰを分別した。

ｒｔ−ＰＡ標準曲線の調製（第１図参照）クエン酸添加
ＰＰＰ及びＥＤＴ＾添加Ｐ添加上ＰＰれ個別に次のｒｔ
−ＰＡ濃度の溶解活性を測定した：１０００．８００．
６００．４００．２００．１００．８０．６０．４０．
２０．８．６．４及び２ｎｇ／ｍｌ。

ｒｔ　−ＰＡ希釈液は下記の第４表に従ってアルギニン
緩衝液を用いることにより得られた。

人血漿試料中の繊維素溶解活性を測定するためのキット ａ）クエン酸添加血漿における３×２０回測定用（３，
８％クエン酸ナトリウム１部十血液９部）試薬 希釈緩衝液６０ｉ： ０．９％ＮａＣ１溶液 ポリエチレングリコール１００００　２％トウィーン８
０　　　　　　　　０．１％ＥＤＴＡ　　　　　　　　
　　　　　０．０２％３Ｘ２０Ｐｔｌ／バイアル　レブ
テイラーゼ（各バイアルの内容物を蒸留水１ｍ！！に溶
かす）　　（ＰＵ＝プラウ単位、Ｐｌｏｕｇｈ　ｕｎｉ
ｔｓ）ｒｔ−ＰＡ標準１ｍｇ／ｍｊ！ アルギニン緩衝液５（ｌｔｆ！ （ｒｔ　−ＰＡ積標準希釈用） ０．５ＭＬ−アルギニン（ｐＨ７，４）トウィーン８０
　　　　　　０．１％ リン酸酸水素ナナトリウム０．０５１４ｂ）ＥＤＴＡｉ
加血漿における３×２０回測定用（２％εＤＴＡ　１部
＋血液９部） 試薬 希釈緩衝液５Ｑｍｊ？： ０．９％ＮａＣＩ溶液 ポリエチレンクリコール１００００　２％トウィーン８
０　　　　　　　　０．１％３　ｘ　２ＱＰＵ／バイア
ル　レプティラーゼ（各バイアルの内容物を蒸留水１ｍ
ｌに溶かす）ｒｔ−ＰＡ標準１　ｍｇ　／　− アルギニン緩衝液５０ｍ１ （ｒｔ　−ＰＡ積標準希釈用） ０．５ＭＬ−アルギニン（ｐＨ７，４）トウィーン８０
０．１％ リン酸水素二ナトリウム　０．０５Ｍ

【図面の簡単な説明】

第１図は、凝固の開始から５０％溶解、溶解終了までの
時間と吸光度との関係を示す。 第２図は、εＯＴ＾添加血液から得られ、１：１０に希
釈したＰＰＰにおけるｒｔ　−ＰＡの繊維素溶解活性（
５０％溶解）の標準曲線を示す。 第３図は、クエン酸添加血液から得られ、１：１０に希
釈したＰＰＰにおけるｒｔ−ＰＡの繊維素溶解活性（５
０％溶解）の標準曲線を示す。 第４図は、室温における繊維素溶解活性の低下を示す。 第５図は、室温における繊維素溶解活性の低下を示す。 第６図は、４℃における繊維素溶解活性の低下を示す。 第７図は、４℃における繊維素溶解活性の低下を示す。 第８図は、ＢＤＴＡ添加ＰＰＰにおけるｒｔ−ＰＡ濃度
が非常に低い場合の添加されたヘパリンの効果を示す。 第９図は、クエン酸添加ＰＰＰにおけるｒｅ−ＰＡ濃度
が非常に低い場合の添加されたヘパリンの効果を示す。 を 巨　（圭） Ｆ　（ネ） 票 ｎｇ／ｍｌ　ｒｔ−ＰＡ （Ｘ１００Ｑ） ； 可 脚 ｎｇ／ｍｌ　　ｒｔ−ＰＡ ｎｇ／ｍｌ ｒｔ−ＰＡ 判 ０％溶解までの時間（ 分 手 続 補 正 書（方式） ％式％ ■、事件の表示 平成２年特許願第２３９７号 ２、発明の名称 血漿中の総繊維素溶解活性の測定方法 ３、補正をする者 事件との関係

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）血漿中の総繊維素溶解活性の測定方法であって、 ａ）混濁を形成するのに十分な量の繊維素を、希釈した
   血小板希薄血漿試料に加え、又はこの繊維素をその場で
   生成させ、混濁の経時的変化又は繊維素分解生成物の経
   時的形成を測定し、或いは、 ｂ）発色性プラスミン基質と、混濁の形成に不十分な量
   の繊維素、繊維素分解生成物又はその場で繊維素を生じ
   させる酵素とを希釈した血小板希薄血漿試料に加え、経
   時的色形成を測定することを特徴とする測定方法。
2. （２）繊維素を、バトロキソビンのようなトロンビン様
   酵素の添加によって、希釈血漿試料中、その場で生成さ
   せ、経時的色形成を測定する請求項（１）記載の方法。
3. （３）分子量８０００〜３５０００、好ましくは９００
   ０〜１２５００のポリエチレングリコールを最終濃度が
   １〜５重量％、好ましくは２重量％になるまで、希釈血
   小板希薄血漿試料に加える、請求項（１）又は（２）記
   載の方法。
4. （４）希釈範囲が１：５〜１：２５の間であり、好まし
   くは１：８〜１：１５の間である請求項（１）又は（２
   ）記載の方法。
5. （５）使用される希釈液が分子量８０００〜３５０００
   、好ましくは９０００〜１２５００のポリエチレングリ
   コールを含む、請求項（１）、（２）又は（４）のいず
   れか１項に記載の方法。
6. （６）使用される希釈液がポリエチレングリコールを１
   〜５重量％、好ましくは２重量％含む請求項（５）記載
   の方法。
7. （７）使用される希釈液が、分子量９０００〜１２５０
   ０めポリエチレングリコール１００００を２重量％含む
   生理食塩水よりなる請求項（１）、（２）又は（４）の
   いずれか１項に記載の方法。
8. （８）使用される希釈液がさらに、ＥＤＴＡ０．０２重
   量％のような錯体形成剤及び／又はトウィーン８０　０
   ．１重量％のような界面活性物質を含む請求項（１）〜
   （７）のいずれか１項に記載の方法。
9. （９）血小板希薄試料を、ＥＤＴＡ又はクエン酸を添加
   した被検血液から遠心分離によって調製する請求項（１
   ）又は（２）記載の方法。
10. （１０）５０％溶解達成後、評価を行う請求項（１）又
    は（２）記載の方法。
11. （１１）ｒｔ−ＰＡの測定範囲が、２ｎｇ／ｍｌ〜１０
    ００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ
    ／ｍｌの範囲である請求項（１）〜（１０）のいずれか
    １項に記載の方法。
12. （１２）一定量のプラスミノゲン賦活体をも加える、請
    求項（１）又は（２）記載の方法。
13. （１３）ｒｔ−ＰＡをプラスミノゲン賦活体として加え
    る請求項（１２）記載の方法。
14. （１４）希釈血小板希薄血漿を使用することを特徴とす
    る血漿中の総繊維素溶解活性の測定方法。
15. （１５）分子量８０００〜３５０００、好ましくは９０
    ００〜１２５００のポリエチレングリコールを最終濃度
    が１〜５重量％、好ましくは２重量％となるように、希
    釈血小板希薄血漿に加える、請求項（１４）記載の方法
    。
16. （１６）希釈液が分子量８０００〜３５０００、好まし
    くは９０００〜１２５００のポリエチレングリコールを
    含む請求項（１５）記載の方法。
17. （１７）希釈液が１〜５重量％、好ましくは２重量％の
    ポリエチレングリコールを含む請求項（１６）記載の方
    法。
18. （１８）希釈液が分子量９０００〜１２５００のポリエ
    チレングリコール１００００を２重量％からなる請求項
    （１７）記載の方法。
19. （１９）希釈液がさらに、ＥＤＴＡ０．０２重量％のよ
    うな錯体形成剤及び／又はトウィーン８０　０．１重量
    ％のような界面活性物質を含む請求項（１５）〜（１７
    ）のいずれか１項に記載の方法。
20. （２０）分子量８０００〜３５０００、好ましくは９０
    ００〜１２５００のポリエチレングリコールを１〜５重
    量％、好ましくは２重量％含むことを特徴とする希釈血
    小板希薄血漿。
21. （２１）請求項（１）〜（１３）のいずれか１項に記載
    の方法により、希釈血小板希薄血漿中の総繊維素溶解活
    性を測定するために使用するキットであって、ａ）所定
    量の、好ましくは凍結乾燥した形態のｒｔ−ＰＡ、 ｂ）所定量のトロンビン様酵素、 ｃ）所定量のｒｔ−ＰＡ希釈用緩衝液及び、ｄ）分子量
    ８０００〜３５０００、好ましくは９０００〜１２５０
    ０のポリエチレングリコールを含む血漿試料用希釈緩衝
    液、を含むキット。