JPH11235197A - アンチトロンビンｉｉｉの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 改良されたトロンビン系アンチトロンビンII
Iアッセイであって、ヒト血漿試料および特にアンチト
ロンビンIII欠損患者の血漿試料からアンチトロンビンI
IIを検出するためのアッセイを提供する。 【解決手段】 血漿試料、異種トロンビン、およびトロ
ンビン−アンチトロンビンIII複合体の形成を促進する
のに有効であり、トロンビンに対するヘパリンコファク
タII活性を増進する効果が未処理ヘパリンよりも低いヘ
パリン誘導体を含むアッセイ混合物を調製し、アッセイ
混合物をインキュベーションし、インキュベーションし
たアッセイ混合物中の未複合化トロンビンを測定し、測
定した未複合化トロンビンを血漿試料中のアンチトロン
ビンIIIに相関させることを含んでなる、血漿試料中の
アンチトロンビンIIIの測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、血栓症発
症のおそれがある患者のうっ血状態を評価するプロトコ
ル、および具体的には患者から採取した血漿試料中に存
在するアンチトロンビンIIIのレベルを測定する診断的
アッセイに関するものである。特に本発明は、好ましい
態様において、色素原トロンビン（すなわち、IIａ型）
に基づいてアンチトロンビンIIIを測定するアッセイに
関するものである。本発明はまた、ヘパリン誘導体、試
薬組成物および上記アッセイに有用な高較正物質血漿参
照およびこれを用いたキットに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】創傷治癒中においては好都合な血餅形成
および血栓症に伴う望ましくない血栓発生については、
両方ともフィブリンーゲンに対するセリンプロテアーゼ
トロンビンのタンパク質分解作用が関与している。イン
ビボで存在するトロンビンのレベルは、主としてヘパリ
ン触媒トロンビン阻止物質であるアンチトロンビンIII
（ＡＴIII）により調節される。このため、インビボで
存在するＡＴIIIのレベルは、ＡＴIIIレベルが異常に高
いために出血過多の危険があるか、またはＡＴIIIレベ
ルが異常に低いために血栓発生のおそれがある患者を診
断および監視する場合に顕著な臨床的重要性を有する。

【０００３】あるタイプのアンチトロンビンIIIアッセ
イは、血漿試料中に存在するＡＴIIIがヘパリンの存在
下で外から加えられたトロンビンのタンパク質分解活性
を阻止する能力に基づいている。次いで、阻止されなか
った残留トロンビンを、典型的には例えばトロンビン特
異的色素生成基質および分光光度計分析を含む方法また
は別法としてフィブリンーゲンおよび血餅形成分析によ
り測定する。

【０００４】しかしながら、上記のトロンビン系ＡＴII
Iアッセイ（因子IIａＡＴIIIアッセイとも称す）は、第
２のヘパリン触媒トロンビン阻害物質、ヘパリンコファ
クターII（ＨＣII）の活性が存在するため不正確であ
る。トレフソンら、『ヘパリンコファクターII』、「ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２
５７：５、２１６２−２１６９頁（１９８２）参照。す
なわち、当業界で知られているトロンビン系アッセイで
は、トロンビンがＡＴIIIとだけではなく、ＡＴIIIおよ
びＨＣIIの両方と反応した後に残る外生トロンビンのレ
ベルが測定される。上記アッセイの不正確さは、ＡＴII
I欠損患者にとっては特別な臨床的重要性を有する。Ｈ
ＣIIが高度正常範囲にあって、ＡＴIIIが当業界公知の
トロンビン系アッセイを用いて測定される場合、ＡＴII
I欠損は、ＨＣII抗トロンビン活性により隠ぺいされ得
る。

【０００５】ＨＣIIの隠ぺい作用を回避するために幾つ
かの方法が開発されてきた。因子IIａアッセイに関して
提案された一法では、比較的低濃度のヘパリンの存在下
でウシトロンビンを使用する。フライバーガーら、『ア
ンチトロンビン・アッセイ−ヒトまたはウシトロンビン
の使用および「第２」ヘパリンコファクターの観察』、
「トロンボシス・リサーチ」２５、４３３−４３６頁
（１９８２）参照。しかしながら、この方法では、上記
問題に対して商業的に容認される解答は与えられなかっ
た。

【０００６】別の方法がエノモトらによるアメリカ合衆
国特許第５６４６００７号に記載されており、その場
合、色素原トロンビン系ＡＴIIIアッセイは約０.２モル
〜約０.９モルの範囲の濃度、および好ましくは約０.３
より高い濃度での塩の存在下で行われる。この方法の場
合トロンビンに対するＨＣII活性の作用を制限するとい
う点ではある程度の利点はあるが、高い塩濃度の存在下
ではトロンビンに対するアロステリック作用が生じるた
め、塩濃度が高くなると、トロンビンに関する色素原ア
ッセイの感度は低下する。感度が低下するということ
は、自動分析装置を用いて行われるＡＴIIIアッセイに
とって特別な商業的重要性がある。

【０００７】さらに別の方法によると、ＡＴIIIアッセ
イは、トロンビンに代わる指標として外から加えられた
因子Ｘａを用いて行われる。デマースら、『因子Ｘａ阻
止に基づいたアンチトロンビンIIIアッセイは、先天性
（Congential）アンチトロンビンIII欠損症を同定する
のにトロンビン阻止に基づいたアッセイよりも信頼性の
高い試験結果を提供する』、「トロンボシス・アンド・
ヘモスタシス」６９：３、２３１−２３５頁（１９９
３）参照。トロンビンとは違って、因子ＸａはＨＣIIに
より阻止されない。しかしながら、因子Ｘａ型ＡＴIII
アッセイは、因子IIａ型アッセイよりも費用が高くつ
く。さらに、因子Ｘａはある種の条件下ではトロンビン
よりも安定性の劣る場合があり得、因子Ｘａベースのア
ッセイはかなり高度の希釈を必要とし得る。そのことで
も、因子ＸａＡＴIIIアッセイは、自動分析装置による
使用に関する適性が劣る。

【０００８】構成成分濃度が既知の参照血漿試料から得
られた標準曲線を用いることによる測定量の相関関係が
アッセイプロトコルに含まれるとき、ＡＴIII測定アッ
セイ、および事実、他の血漿構成成分測定アッセイには
他の共通した問題が伴う。当業界公知の参照血漿は典型
的には標準の約１０５％未満の高末端成分濃度を有する
ため、その成分の標準濃度範囲を実質的に越える（例、
約１１０％またはそれ以上）血漿成分を直接測定するの
は不可能である。上記のように直接測定するのではな
く、現在では患者血漿試料を希釈し（例、食塩水中１：
１）、測定を再実行し、次いで測定量に希釈係数（例、
１：１希釈では２）を掛けることが必要である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従って、改良されたト
ロンビン系ＡＴIIIアッセイであって、ヒト血漿試料お
よび特にＡＴIII欠損患者の血漿試料からＡＴIIIを検出
するためのアッセイを提供することが本発明の一目的で
ある。また、トロンビン系ＡＴIIIアッセイであって、
ＨＣIIの抗トロンビン活性による影響を受けず、自動分
析装置により好適に行われ得、実施がより簡単で、かつ
感度良好であり、正確で、再生可能であり、比較的費用
も安いアッセイを提供することも本発明の一目的であ
る。

【００１０】標準より高濃度で存在するＡＴIIIおよび
他の血漿成分を測定するためのより簡単なプロトコルを
提供することも、本発明のさらに別の目的である。

【００１１】

【課題を解決するための手段】従って、簡単に述べる
と、本発明は、血漿試料からアンチトロンビンIIIを検
出する方法に関するものである。この方法の一態様によ
ると、血漿試料をトロンビンおよびヘパリン誘導体と合
わせることにより、アッセイ混合物が形成される。この
アッセイ混合物においてアンチトロンビンIIIおよびト
ロンビン間で複合体が形成される。次いで、アッセイ混
合物中で複合体を形成していないトロンビンを測定し、
測定された非複合体形成トロンビンと血漿試料中におけ
るアンチトロンビンIIIとの相関関係を調べる。

【００１２】別の態様では、血漿試料、外生トロンビン
およびヘパリン誘導体を含むアッセイ混合物を製造する
ことにより、血漿試料中のＡＴIIIを測定する。ヘパリ
ン誘導体は、トロンビン−アンチトロンビンIII複合体
の形成を高めるのには有効であるが、トロンビンに対す
るヘパリンコファクターII活性を高めることについては
未処理ヘパリンよりも実質的に有効性が劣る。次に、ア
ッセイ混合物をインキュベーションし、インキュベーシ
ョンしたアッセイ混合物中における非複合体形成トロン
ビンを測定する。測定された非複合体形成トロンビン
と、血漿試料中のアンチトロンビンIIIとの相関関係を
調べる。

【００１３】血漿試料中におけるアンチトロンビンIII
を測定するためのさらに別の方法では、血漿試料、外生
トロンビンおよびヘパリン誘導体を含むアッセイ混合物
を製造する。アッセイ混合物をインキュベーションし、
次いでインキュベーションしたアッセイ混合物中の非複
合体形成トロンビンを測定する。測定された非複合体形
成トロンビンと、血漿試料中のアンチトロンビンIIIと
の相関関係を調べる。ヘパリンコファクターIIは、アン
チトロンビンIIIの測定された抗トロンビン活性に対し
て約１５％またはそれ未満の割合で関与している。

【００１４】血漿試料中のアンチトロンビンIIIを測定
するさらに別の方法によると、ヘパリンを酵素消化する
ことにより製造される処理ヘパリン組成物を得、血漿試
料、外生トロンビンおよび処理ヘパリン組成物を含むア
ッセイ混合物を製造する。次いで、アッセイ混合物をイ
ンキュベーションし、インキュベーションしたアッセイ
混合物中の非複合体形成トロンビンを測定する。測定さ
れた非複合体形成トロンビンと、血漿試料中のアンチト
ロンビンIIIとの相関関係を調べる。

【００１５】本発明はまた、処理ヘパリン化合物に関す
るものである。処理化合物は、トロンビンに対するアン
チトロンビンIII活性を高めるのに有効ではあるが、ト
ロンビンに対するヘパリンコファクターII活性を高める
ことについては未処理ヘパリンほど有効ではないヘパリ
ン誘導体を含む。

【００１６】ヘパリン誘導体は、ヘパリンを酵素と反応
させてヘパリン誘導体および１種またはそれ以上のジサ
ッカリドを形成させることにより製造されるものであり
得る。ヘパリン誘導体はまた、ヘパリンをコンドロイチ
ナーゼと反応させることにより製造されるものであり得
る。

【００１７】さらに本発明は、ヘパリンを酵素消化する
ことにより製造される処理ヘパリン組成物に関するもの
である。

【００１８】本発明の別の態様は、ヘパリン誘導体の製
造方法に関するものである。この方法は、ヘパリン含有
溶液を形成し、ヘパリン溶液に酵素を加え、酵素をヘパ
リンと反応させてヘパリン誘導体および不飽和ジサッカ
リドを形成させることを含む。別のアプローチによる
と、ヘパリン誘導体の製造方法は、ヘパリンをコンドロ
イチナーゼと反応させることを含む。

【００１９】本発明はまた、トロンビン系アンチトロン
ビンIIIアッセイにおいて有用な試薬に関するものであ
る。試薬は、（１）トロンビンおよび（２）ヘパリンま
たはヘパリン誘導体を含む凍結乾燥組成物である。

【００２０】本発明の別の態様は、血漿試料中のアンチ
トロンビンIIIを測定するのに有用なトロンビン系アン
チトロンビンIIIアッセイ用キットに関するものであ
る。このキットは、（１）コンドロイチナーゼＡＣＩ処
理ヘパリンおよびハロゲン化アルカリ金属を含む希釈組
成物、（２）コンドロイチナーゼＡＣＩ処理ヘパリン、
ハロゲン化アルカリ金属およびトロンビンを含む試薬組
成物および（３）色素生成トロンビン基質を含む。

【００２１】本発明は、別の態様において、血漿成分の
測定用標準としての使用に適した高較正物質参照血漿の
製造方法に関するものである。標準の参照血漿を得、容
量Ｖ₁の正常参照血漿を凍結乾燥する。凍結乾燥正常参
照血漿を復元することにより、容量Ｖ₂（ただし、Ｖ₂：
Ｖ₁の比は、約７：８〜約１：８の範囲である）の復元
血漿が形成される。

【００２２】血漿成分の測定用標準としての使用に適し
た高較正物質参照血漿の別の製造方法では、正常の約９
０％〜約１１０％の範囲の濃度で血漿成分を含む標準の
参照血漿が得られる。容量Ｖ₁の正常参照血漿を凍結乾
燥し、次いで凍結乾燥した正常参照血漿を復元すること
により、容量Ｖ₂の復元血漿が形成される。Ｖ2はＶ1よ
りも小さく、復元血漿は、標準の約１２０％またはそれ
より高い濃度で血漿成分を含む。血漿成分は好ましくは
ＡＴIIIである。

【００２３】さらに本発明は、（１）標準の約９０％〜
標準の約１１０％の範囲の濃度で血漿成分を含む凍結乾
燥参照血漿、および（２）標準の約１２０％またはそれ
より高い濃度で血漿構成成分を含む復元血漿を形成する
のに十分な体積を有する凍結乾燥参照血漿を復元するた
めの使用説明書を含むキットに関するものである。

【００２４】本発明は、この明細書で記載され、請求の
範囲で請求されているとおり、先行技術によるＡＴIII
測定方法よりも有利であり、上記公知方法に伴う幾つか
の問題を解決する。特に、本発明は、トロンビンに対す
るＨＣII活性が本質的に除去されている化合物、試薬お
よび方法を提供する。さらに、これは、ＡＴIIIアッセ
イの感度を犠牲にしなくても、また高価で潜在的に不安
定な試薬を使用しなくても達成される。本発明の試薬を
使用すると、簡易化されたプロトコルに従いＡＴIIIが
測定され得る。本発明の高較正物質血漿試料を用いるこ
とにより、標準の約１１０％を越える構成値を有する患
者血漿試料に関してＡＴIIIおよび／または他の血漿構
成成分を測定するためのプロトコルは単純化され得る。
本発明の他の特徴および目的は、当業界の熟練者には明
白なものもあれば、以下に示されているものもある。

【００２５】

【発明の実施の形態】本発明は、ヘパリンと同様、ＡＴ
IIIの抗トロンビン活性を効率的に高めるが、ヘパリン
とは異なり、ＨＣIIの抗トロンビン活性を実質的に高め
ることはない処理ヘパリン化合物を含む。より具体的に
は、本発明の処理ヘパリン化合物は、未処理ヘパリンが
トロンビンに対するＨＣII活性を高めるほどには実質的
にトロンビンに対するＨＣII活性を高めはしないヘパリ
ン誘導体である。ヘパリン誘導体がＨＣII抗トロンビン
活性を高める度合いを未処理ヘパリンの場合に基づいて
比較すると、好ましくは未処理ヘパリンの方が少なくと
も約２倍、さらに好ましくは未処理ヘパリンの方が少な
くとも約４倍、および最も好ましくは未処理ヘパリンの
方が少なくとも約５倍高い関係になる。

【００２６】本発明の処理ヘパリン化合物は、好ましい
態様によると、ヘパリンを酵素消化してヘパリン誘導体
および１種またはそれ以上の不飽和ジサッカリドを形成
させることにより製造される（実施例１参照）。ヘパリ
ン誘導体製造用の出発物質として使用されるヘパリンの
タイプは、あまり厳密に重大なものではない。ヘパリン
は、異種ヘパリンまたは低分子量ヘパリンであり得る。
さらに、ヘパリンは、例えばヒト、ウシおよび／または
ブタヘパリンを含む動物供給源に由来し得る。ヘパリン
は、好ましくは異種ヘパリンであり、好ましくはウシま
たはブタから得られる。異種ブタヘパリンが最も好まし
く、ミズーリ、セントルイスのシグマ・ケミカルにより
市販されている（カタログ番号Ｈ３３９３）。

【００２７】未処理ヘパリンを含む緩衝溶液は、好まし
くはヘパリンを緩衝液と合わせ、ｐＨを約４〜約１０お
よび最も好ましくは約７.２に調節することにより形成
される。適当なものであればいずれの緩衝液でも使用さ
れ得るが、リン酸ナトリウム緩衝液が好ましい。溶液中
のヘパリンの濃度は、好ましくは約０.０１Ｕ／ｍｌ〜
約１０００００Ｕ／ｍｌ、さらに好ましくは約１Ｕ／ｍ
ｌ〜約２００００Ｕ／ｍｌであり、最も好ましくは約１
００００Ｕ／ｍｌである。ヘパリン活性の１単位、Ｕ
は、米国薬局方（ＵＳＰ）により定義されている。

【００２８】ヘパリンから１個またはそれ以上のジッサ
カリドを開裂することにより、ヘパリン誘導体を形成さ
せる活性を有する酵素を、ヘパリン含有緩衝溶液に加え
ると、反応溶液が形成される。この酵素は好ましくはコ
ンドロイチナーゼ酵素であり、さらに好ましくはフラボ
バクテリウム・ヘパリニウムに由来するコンドロイチナ
ーゼ酵素である。コンドロイチナーゼＡＣＩは最も好ま
しい酵素であり、ミズーリ、セントルイスのシグマ・ケ
ミカルによりコンドロイチナーゼＡＣ（カタログ番号Ｃ
２７８０）として市販されている。他の酵素、例えばコ
ンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＢ、コン
ドロイチナーゼＣおよびコンドロイチナーゼＡＣIIもま
た、本発明の実践に好適であり得る。

【００２９】好ましいコンドロイチナーゼＡＣＩを使用
するとき、反応溶液中の酵素濃度は、好ましくは約０.
０１単位／ｍｌ〜約１００単位／ｍｌ、さらに好ましく
は約０.１単位／ｍｌ〜約１０単位／ｍｌの範囲であ
り、最も好ましくは約１単位／ｍｌである。１単位のコ
ンドロイチナーゼＡＣＩ活性は、ここでは３７℃、ｐＨ
７.３でコンドロイチン硫酸Ａに作用する１.０／分のデ
ルタＯＤ２３２を誘発する量として定義される。濃度お
よび／または体積を調節することにより、ヘパリンに対
するコンドロイチナーゼＡＣＩの割合が好ましくは約
１：１０〜約１：１０００００、さらに好ましくは約
１：１０００〜約１：２００００の範囲であり、最も好
ましくは約１：１００００単位である反応溶液が形成さ
れ得る。

【００３０】酵素消化は、好ましくは反応溶液を混合
し、次いで好ましくは約１２℃〜約５６℃、さらに好ま
しくは約３０℃〜約４５℃の範囲の温度、および好まし
くは約３７℃の温度で約１２時間〜約６０時間、好まし
くは約２４時間から約４８時間、および最も好ましくは
約４０時間の期間反応溶液をインキュベーションするこ
とにより行われる。上記で具体的に示した期間消化後、
酵素を好ましくは当業界公知の適当な方法により不活化
する。好ましい不活化段階は、酵素不活化に十分な期間
反応溶液を高温に加熱することを含む。コンドロイチナ
ーゼＡＣＩは、例えば約５分間沸騰水浴中に反応溶液を
入れた容器またはガラス瓶を沈めることにより不活化さ
れ得る。

【００３１】生成した処理ヘパリン組成物は、ヘパリン
誘導体および１種またはそれ以上のジサッカリドを含
み、ＯＤ２３２でのその分光光度計吸光度に基づいて特
性確認され得る。処理ヘパリン組成物は、好ましくは酵
素消化前の反応溶液に対してＯＤ２３２での増加した吸
光度を有する。処理ヘパリン組成物のＯＤ２３２吸光度
（すなわち、消化後に測定）は、好ましくはその元の値
の約０.０５％〜約５０％、さらに好ましくはその元の
値の約０.１％〜約２５％の範囲であり、最も好ましく
は約その元の値の１０％の量で増加する。所望ならば、
ヘパリン誘導体は、当業界公知の分離プロトコルを用い
て処理ヘパリン組成物から単離され得る。例えば、ヘパ
リン誘導体は、クロマトグラフィープロトコルを用いた
サイズおよび／または硫酸含有率により分離され得る。
しかしながら、好ましくは、ヘパリン誘導体を含む処理
ヘパリン組成物は、下記要領に従いアッセイ混合物中で
直接使用される。

【００３２】ヘパリン誘導体をヘパリンの接触蒸解（消
化）により調製する場合、ＨＣII増進活性についてヘパ
リン誘導体を比較する未処理ヘパリンは、好ましくは、
ヘパリン誘導体を調製するのに用いたヘパリンと類似の
未処理ヘパリンである。すなわち、ヘパリン誘導体を比
較する未処理ヘパリンは、好ましくはヘパリン誘導体を
調製するための出発物質として用いられたヘパリンと同
じ分子量異質性（heterogenicity）を有し（例えば、異
種（heterogeneous）ヘパリン対低分子量ヘパリン）、
好ましくはヘパリン誘導体を調製するための出発物質と
して用いられたヘパリンと種−同質性（homogolous）ま
たは種−自己性（autogolous）である。例えば、ヘパリ
ン誘導体を異種ブタヘパリンから誘導する場合、ヘパリ
ン誘導体のＨＣII増進活性は、好ましくは、未処理の異
種ブタヘパリンのＨＣII増進活性と比較する。

【００３３】本発明のヘパリン誘導体は、上記のよう
に、好ましくは未処理ヘパリンから誘導されるが、この
技術分野で既知の他の方法によっても調製できる。例え
ば、上記のように、ヘパリン誘導体を単離し、次いで合
成的に調製することができる。合成方法は、この技術分
野で既知の有機合成手法を含み得、適当なら、（限定さ
れるものではないが）遺伝子操作されたプラスミドまた
は他のベクターの使用を含み、ホストセル系に対応する
組換えＤＮＡ技術を包含することもできる。出発物質と
して未処理ヘパリンを用いることを含まない方法により
ヘパリン誘導体を調製する場合、ＨＣII増進活性につい
てヘパリン誘導体を比較する未処理ヘパリンは、好まし
くは、未処理異種ウシヘパリンまたは未処理異種ブタヘ
パリンであり、より好ましくは未処理異種ブタヘパリン
である。

【００３４】ヘパリン誘導体は、有利には、改良された
トロンビン系ＡＴIIIアッセイに使用できる。（実施例
２および実施例３参照）。一般的には、ＡＴIIIアッセ
イは、血漿試料を採取し、アッセイ混合物を形成するた
めに血漿試料をヘパリン誘導体およびトロンビンと合わ
せ、診断的に重大な程度のＨＣIIとトロンビンとの間の
複合体を形成することなくＡＴIIIとトロンビンとの間
で複合体を形成し、アッセイ混合物中に存在する未複合
化トロンビンを測定し、測定された未複合化トロンビン
を、血漿試料中に存在するアンチトロンビンIIIと相関
させる。

【００３５】血漿試料は、好ましくはヒト血漿試料であ
り、この技術分野で既知の常套の方法で採取した血液か
ら得ることができる。好ましくは、血漿試料は、ＮＣＣ
ＬＳ（National Committee for Clinical Laborato
ry Standards，Inc.，Wayne，ＰＡ，アメリカ）ガイド
ラインＨ２１−Ａ２に従って、採取され、保存される。
好ましい方法によれば、静脈血は、鬱血または組織液に
よる汚染を避けながら、プラスチックまたはシリコーン
処理注射器により採血される。血液（９容量部）は、直
ちに、３.２％または３.８％クエン酸ナトリウム溶液
（１容量部）を含む容器に移される。あるいは、血液
は、クエン酸塩溶液を含んでいる市販真空チューブに採
血され得る。クエン酸塩処理血液は、混合され、次いで
２５００×ｇで１５分間遠心分離され、クエン酸塩処理
血漿を得る。血漿は、試験管に移され、約２℃〜８℃の
温度で、採血後４時間まで保存され、あるいは、−２０
℃で採血後１ヶ月まで保存されて、使用前に３７℃で３
０分間解凍される。

【００３６】ヒト血漿試料は、ＡＴIIIおよびＨＣIIア
ンチトロンビン活性の両方を含むので、本発明の方法
は、血栓症の危険があることが判っているまたは可能性
がある患者、特に、アンチトロンビン欠乏症を有してい
るまたは疑いがある患者について採用するのが最も有利
である。既知のアンチトロンビンIII欠乏症は、例え
ば、遺伝性欠乏症（例えば、Ｔype ＩおよびＴype I
I）、および消費性凝固障害（例えば、ＤＶＴ、ＤＩ
Ｃ、肺閉塞）において発生するような後天性欠乏症、他
の症状（例えば、重度肝臓病、ネフローゼ症候群）、手
術、妊娠、外傷、およびある種の治療（例えば、Ｌ−ア
スパラギナーゼ）を包含する。ＡＴIIIレベルは、６ヶ
月までの幼児および女性では低いであろう。また、ＡＴ
IIIレベルは、年齢と共に低下する。

【００３７】血漿試料は、未希釈血漿試料として直接
に、または希釈後に希釈血漿試料として、アッセイ混合
物を形成するのに使用することができる。血漿試料は、
典型的には、診断またはモニターのためにＡＴIIIを測
定する必要がある患者から採取された試料であり、血漿
試料は、後で詳細に説明するように、相関標準を作成す
るための既知濃度のＡＴIIIを含む標準血漿試料であっ
てもよい。

【００３８】血漿試料は、ヘパリン誘導体および外生ト
ロンビンと合わされて、アッセイ混合物を形成する。ヘ
パリン誘導体は、上記のように、好ましくはアッセイ混
合物中に、血漿試料中に存在するＡＴIIIの量に対し
て、非制限的な過剰量で存在する。ヘパリン誘導体は、
より特定的には、アッセイ混合物中に、好ましくは約
０.１Ｕ〜約１０Ｕの範囲、より好ましくは約０.２Ｕ〜
約１.２Ｕの範囲、最も好ましくは約０.３〜約０.７Ｕ
の範囲の濃度で存在する。ここで、単位Ｕは、ヘパリン
の場合と同様に定義される。好ましいヘパリン誘導体で
あるコンドロイチナーゼＡＣＩ−処理ヘパリンを用いた
場合、コンドロイチナーゼＡＣＩ−処理ヘパリンの濃度
は、好ましくは、約０.５Ｕである。トロンビンは、ど
のようなトロンビンであってもよく、ヒト、ウシ、ブ
タ、ウマまたはヤギトロンビンを包含する。ウシトロン
ビンが好ましく、Sigma Chemical（アメリカミズーリ
州セントルイス）から市販されている（カタログ番号Ｔ
４６４８など）。トロンビンは、アッセイ混合物中に、
ＡＴIIIと複合化するのに必要な量よりも化学量論的に
モル過剰量で存在し、未複合化トロンビンは、ＡＴIII
−トロンビン反応が完了したのち、アッセイ混合物中に
残るであろう。好ましい態様では、アッセイ混合物中に
存在するトロンビンの濃度は、好ましくは約１ＩＵ／ｍ
ｌ〜約２５ＩＵ／ｍｌ、より好ましくは約５ＩＵ／ｍｌ
〜約１５ＩＵ／ｍｌである。最も好ましくは、トロンビ
ンは、約８ＩＵ／ｍｌの濃度で、反応混合物中に存在す
る。血漿試料、ヘパリン誘導体およびトロンビンを合わ
せる順序は、特に限定されない。例えば、最初にヘパリ
ン誘導体を血漿試料に添加し、インキュベーション（培
養）してヘパリン化血漿試料を形成し、次いでトロンビ
ンをヘパリン化血漿試料に添加することにより、血漿試
料をヘパリン誘導体およびトロンビンに合わせることが
できる。あるいは、ヘパリン誘導体およびトロンビンを
ほぼ同時に血漿試料に添加することができる。別の好ま
しい方法では、ヘパリン誘導体を血漿試料に添加し、イ
ンキュベーションを行いまたは行わずに、ヘパリン化血
漿試料を形成し、次いでトロンビンおよび追加のヘパリ
ン誘導体をヘパリン化血漿試料に添加することにより、
アッセイ混合物を形成することができる。

【００３９】アッセイ混合物は、好ましくは、塩も含
む。塩は、クエン酸塩のような有機塩であってよい。有
機塩に加えてまたは代えて、無機塩を用いてもよい。好
ましい無機塩は、ハロゲン化アルカリ金属（例えば、ハ
ロゲン化ナトリウムまたはハロゲン化カリウム）を包含
し、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または塩化カリウム
（ＫＣｌ）がより好ましい。ＡＴIII−トロンビン複合
体の形成中にアッセイ混合物中に存在する塩の濃度は、
好ましくは、トロンビンに対するＨＣII活性を実質的に
増進することなくトロンビンに対するＡＴIII活性をヘ
パリン誘導体が増進するのに十分な濃度である。塩の最
適濃度は、（１）ヘパリン誘導体がＡＴIIIと複合化す
るが、（２）ＨＣIIとは診断的に重大な程度では複合化
せず、なおかつ（３）トロンビンにアロステリックな悪
影響を及ぼさない程度の濃度である。診断的に重大な程
度の複合化とは、後でより詳細に説明するように、一般
にＨＣIIが、測定されるＡＴIII／ＨＣIIアンチトロン
ビン活性の１５％またはそれ以下、より好ましくは測定
されるアンチトロンビン活性の１０％またはそれ以下、
さらに好ましくは測定されるアンチトロンビン活性の５
％またはそれ以下、最も好ましくは複合化されたアンチ
トロンビン活性の２％またはそれ以下である。（未処理
ヘパリンおよびヘパリン誘導体を用いたＡＴIIIアッセ
イに対する塩濃度の影響をそれぞれ示している実施例４
および実施例５参照）。ヘパリン誘導体がコンドロイチ
ナーゼ処理ヘパリン（例えば、コンドロイチナーゼＡＣ
Ｉ−処理ヘパリンであり、塩がハロゲン化アルカリ金属
（例えば、ＮａＣｌ）である好ましい態様では、塩の濃
度は、好ましくは約０.１７５Ｍ〜約０.３Ｍ、より好ま
しくは約０.２Ｍ〜約０.２５Ｍ、最も好ましくは約０.
２２Ｍである。記載した範囲は、現在のところ好ましい
態様における好ましい範囲であるが、一般に反応混合物
中の塩濃度は、本明細書に記載した指針に従って、当業
者なら最適化することができる。

【００４０】アッセイ混合物は、この技術分野で既知の
他の化合物および／または試薬を含むこともできる。例
えば、アッセイ混合物は、そのｐＨを約６〜約１０、最
も好ましくは約８.２に調節するような、緩衝剤を含む
ことができる。適当な緩衝剤は、例えば、トリス、ホス
フェート、バルビタール、グリシルグリシン、ＢＥＳ、
ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳＯおよびＴＡ
ＰＳである。中でも、ＴＡＰＳが好ましい。分析混合物
は、界面活性剤（例えば、Ｔween８０またはＴritonＸ
−１００（ポリオキシエチレン(１０)イソオクチルフェ
ニルエーテル））、キレート化剤（例えば、ＥＤＴ
Ａ）、保存剤（例えば、アジ化ナトリウム）、および希
釈剤として血漿アッセイにおいて通常使用されている他
の剤並びに他の理由でこの技術分野において知られてい
る剤、例えばウシ血清アルブミン、ゼラチン、デキスト
ランおよび／またはポリエチレングリコールなども含む
ことができる。これら付加的な化合物および／試薬の濃
度は、当業者により決定され得る。

【００４１】好ましいアッセイ混合物は、上記の通り、
血漿試料、コンドロイチナーゼＡＣＩ処理ヘパリン、ト
ロンビンおよびＮａＣｌ、更に適当な量のＴＡＰＳ、Ｅ
ＤＴＡ、Ｔween８０、ゼラチン、アジ化ナトリウム、デ
キストランおよびウシ血清アルブミンを含んでいる（実
施例３参照）。

【００４２】便利には、分析混合物は好ましくは、ヘパ
リン誘導体および場合によりトロンビンを、血漿試料に
添加される他の化合物のそれぞれと組み合わせて含む好
適な調製済組成物から形成される。例えば、ヘパリン誘
導体希釈組成物は、適当な緩衝剤中にヘパリン誘導体お
よび塩を含み、更に、界面活性剤、キレート化剤、保存
剤および他の通常使用される化合物を含むように調製で
きる。希釈組成物中のヘパリン誘導体の濃度は、好まし
くは約０.０５Ｕ／ｍｌ〜約１０Ｕ／ｍｌ、より好まし
くは約０.２Ｕ／ｍｌ〜約１.２Ｕ／ｍｌ、最も好ましく
は約０.５Ｕ／ｍｌである。好ましいヘパリン誘導体希
釈組成物は、コンドロイチナーゼＡＣＩ処理ヘパリン、
ＮａＣｌ、ＴＡＰＳ、ＥＤＴＡ、Ｔween８０、ゼラチ
ン、アジ化ナトリウム、デキストランおよびウシ血清ア
ルブミンを含んでいる（実施例２参照）。

【００４３】ヘパリン誘導体−トロンビン試薬組成物
は、希釈組成物の成分それぞれに加えてトロンビンを含
むことができる。試薬組成物中のトロンビンの濃度は、
好ましくは約１ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌ、より
好ましくは約４ＩＵ／ｍｌ〜約２５ＩＵ／ｍｌ、最も好
ましくは約８ＩＵ／ｍｌである。従って、好ましいヘパ
リン誘導体−トロンビン試薬組成物は、トロンビン、コ
ンドロイチナーゼＡＣＩ処理ヘパリン、ＮａＣｌ、ＴＡ
ＰＳ、ＥＤＴＡ、Ｔween８０、ゼラチン、アジ化ナトリ
ウム、デキストランおよびウシ血清アルブミンを含んで
いる（実施例２参照）。希釈組成物または試薬組成物中
のヘパリン誘導体は、上記のように、ヘパリン誘導体の
調製から生じる処理ヘパリン組成物としてヘパリン誘導
体を単離せずに、これらの組成物に供給される。所望な
らば、血漿試料は、アッセイ混合物を形成する前に、希
釈組成物により希釈することができる。アッセイ混合物
は、希釈されたまたはされない血漿試料を試薬組成物と
組み合わせることにより形成することができる。

【００４４】アッセイ混合物を調製する厳密な種類に拘
わらず、（アッセイ混合物の一部となっている）血漿試
料中に存在するアンチトロンビンと、血漿試料に加えら
れたトロンビンとの間で複合体が形成される。形成され
る複合体の性質は、特に重要ではない。いかなる理論に
も拘束されるものではないが、複合体は、ＡＴIIIとト
ロンビンとの間のイオン的および／または共有結合的相
互作用に基づいていると考えられる。ヘパリン誘導体
は、ＡＴIII中に構造変化を引き起こしている、および
／またはトロンビンとＡＴIIIとの間で多糖類架橋とし
て機能しているものと考えられる。複合体は、好ましく
はアッセイ混合物を複合体の形成を可能にするのに十分
な温度と時間の組み合わせにおいてインキュベーション
（培養）することにより、形成される。典型的にかつ好
ましくは、複合体は、アッセイ混合物を、約１８℃〜約
４５℃、より好ましくは約３４℃〜約４０℃の温度、最
も好ましくは約３７℃において、約１５秒間から約３０
分間、より好ましくは約１分間〜約３分間、最も好まし
くは約２分間、インキュベーションすることにより形成
される。

【００４５】特徴的に、ヘパリン誘導体はトロンビンに
対するＡＴIII活性を効果的に増進するが、トロンビン
に対するＨＣII活性を実質的に増進しない。すなわち、
ＨＣIIとトロンビンとの間で、検出できるような複合体
は形成されないか、せいぜい極小量の複合体が検出され
るだけである（図１、実施例２参照）。ＨＣII−トロン
ビン複合化の程度は、好ましくは診断的に重大であるよ
りも低い。ＡＴIII欠乏症であることが知られているま
たは疑われている患者の血漿試料については、ＨＣII−
トロンビン複合体形成の診断的に重大である程度は、
（実施例２に示されているような）トロンビン使用ＡＴ
IIIアッセイを用いて測定した場合、ＨＣIIが測定され
たＡＴIII／ＨＣIIアンチトロンビン活性の約１５％を
越える部分を占めるような程度である。従って、ＨＣII
の寄与を約１５％またはそれ以下に低減すると、ＨＣII
が測定されたＡＴIII活性の約２５％〜３０％を占めて
いる現在知られているトロンビン使用アッセイに比べて
有利になる。好ましくは、ＨＣIIは、測定されたアンチ
トロンビン活性の約１０％またはそれ以下、より好まし
くは約５％またはそれ以下、最も好ましくは約２％また
はそれ以下を占める。ヘパリン誘導体の有利な効果は、
好ましい態様では、ヘパリン誘導体を高めた塩濃度と組
み合わせて用いることにより増大される（実施例５〜８
参照）。

【００４６】一旦、添加されたトロンビンが複合化され
ると、アッセイ混合物中に残っている残留未複合化トロ
ンビンを測定することができる。未複合化トロンビン
は、この技術分野において既知のいかなる方法によって
も測定でき、そのような方法には、クロット（血餅）形
成アッセイ、色素産生アッセイなどが含まれる。クロッ
ト形成アッセイでは、残留未複合化トロンビンは、フィ
ブリノゲンを添加し、フィブロメータによりクロット形
成時間を計測することにより、測定される。好ましく
は、色素生成トロンビン基質をインキュベーションした
アッセイ混合物に添加し、未複合化トロンビンの量を分
光光度計により測定する色素産生アッセイを用いる。ト
ロンビンと反応した時に発色するいくつかの適当な色素
生成基質が、この技術分野で知られており、ＳＡＲ−Ｐ
ＲＯ−ＡＲＧｐ−ニトロアニリド、Ｓ−２２３８（Ｈ−
Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）、スペクトロザ
イム（Ｓpectrozyme）−ＴＨ（Ｈ−Ｄ−ＣＨＴ−Ａｌａ
−Ａｒｇ−ｐＮＡ）、ＣＢＳ−３４−４７（Ｈ−Ｄ−Ｃ
ＨＧ−Ｂｕｔ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）および２ＡｃＯＨ−Ｈ
−Ｄ−ＨＨＴ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡを包含し、とり
わけ、ＳＡＲ−ＰＲＯ−ＡＲＧｐ−ニトロアニリド（Si
gma Chemical，ミズーリ州セントルイス。カタログ番
号Ｔ１５５３）が好ましいトロンビン基質である。色素
生成トロンビン基質をインキュベーションしたアッセイ
混合物に添加した後、好ましくは約３７℃で混合物を更
にインキュベーションして、色素生成トロンビン基質を
未複合化トロンビンと反応させ、発色させる。分光光度
計（好ましいトロンビン基質については４０５nm）によ
り速度測定または終点測定のいずれかを行う。速度測定
により、単位時間あたりの吸光度変化が得られ、典型的
には自動化分析計と連動されている。終点測定により、
ある時間（例えば約２分）後の混合物の吸光度が得られ
る。トロンビン反応は、停止剤を添加することにより、
適当な時間で停止される。適当な停止剤には、氷酢酸
（Sigma Chemical。カタログ番号Ａ６２８３）、およ
びクエン酸一水和物（Sigma Chemical。カタログ番号
Ｃ１９０９）を水１００ｍｌに溶解して得られる２％ク
エン酸溶液が含まれる。他の停止剤は、この技術分野で
既知である。

【００４７】未複合化トロンビンの測定された量は、次
いで、分析される血漿試料中に最初に存在していたアン
チトロンビンIIIの量と相関させる。一般に、試料中の
ＡＴIII含有量は、測定された未複合化トロンビンと逆
比例する。測定された未複合化トロンビンは、好ましく
は、標準曲線（検量線）を用いてＡＴIIIと相関され
る。標準曲線は、患者の血漿試料のＡＴIII測定に用い
たのと同じ実験機器および方法を用いて作成されなけれ
ばならない。簡単に説明すると、標準曲線は、既知のＡ
ＴIIIレベルを有する血漿試料を分析し、次いで、典型
的にはＸ軸上の既知ＡＴIII濃度に対して、吸光度測定
結果（例えば、吸光度の値または変化速度）を典型的に
はｙ軸にプロットする。標準曲線が得られると、患者の
血漿試料について吸光度測定値を得、それを曲線に当て
はめて対応するＡＴIIIレベルを決定することにより、
患者の血漿試料中の未知ＡＴIIIレベルを決定するのに
使用することができる。

【００４８】好ましい標準曲線は、以下のようにして作
成することができる。１００％基準と仮定する値を有す
る正常参照血漿（ＮＲＰ：Ｎormal Ｒeference Ｐlas
ma）、例えばＡＣＣＵＣＬＯＴ(登録商標）（Sigma Ch
emical。カタログ番号Ａ７４３２）またはクエン酸塩処
理標準血漿プール（ＮＰＰ）を、上述の好ましい希釈組
成物を用いて希釈する。１００％−ＡＴIII標準血漿試
料を、ＮＲＰまたはＮＰＰ（２５μｌ）を希釈組成物
（９７５μｌ）と組み合わせて調製する。５０％−ＡＴ
III標準血漿試料を、１００％−ＡＴIII標準血漿試料
（５００μｌ）を更に希釈組成物（５００μｌ）により
希釈することにより調製する。０％−ＡＴIII標準血漿
試料は、希釈組成物（１０００μｌ）そのものであって
よい。同等の方法では、好ましい標準試料は、ＮＲＰを
生理食塩水により逐次希釈し、次いで各希釈試料２５μ
ｌを希釈組成物（９７５μｌ）に合わせることにより調
製することができる。

【００４９】別の好ましい標準曲線は、より広いＡＴII
I濃度に及ぶように、高較正物質参照血漿（high‐calib
rator reference plasma）から作成することができる
（実施例９および実施例１０参照）。高較正物質参照血
漿は、ＡＴIIIアッセイに関連して本明細書に記載され
るが、その使用は、ＡＴIII較正に限定されない。高較
正物質参照血漿は、ＡＴIIIの外、他の血漿蛋白質（例
えば、蛋白質Ｃ、蛋白質Ｓ、ファクタII、ファクタＶ、
ファクタVIII、ファクタIＸ、ファクタＸ、ファクタＸ
I、ファクタＸII、カリクレイン、プレカリクレイン、
ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、フィブリノーゲン、およびプラス
ミノーゲン）を含むあらゆる血漿成分について、標準と
して使用することができる。高較正物質参照血漿の使用
により、予備希釈形の試料を２回目の分析により再分析
する必要がなく、成分の正常量より高い（正常値の１１
０％を越える）患者の血漿試料中の血漿成分（例えば、
ＡＴIII）を測定することが可能になる。

【００５０】高較正物質参照血漿は、正常参照血漿を
得、容量Ｖ₁の正常参照血漿を凍結乾燥し、脱イオン水
により凍結乾燥正常参照血漿を復元して、容量Ｖ₂（Ｖ₂
はＶ₁より少ない）の復元血漿を形成することにより作
成することができる。Ｖ₂は、好ましくは、正常の約１
２０％またはそれ以上、より好ましくは正常の約１２０
％〜約１７５％、最も好ましくは正常の約１３０％〜約
１５０％の濃度で血漿成分を有する復元血漿を形成する
ような量である。第２容量の第１容量に対する比
（Ｖ₂：Ｖ₁）は、好ましくは約７：８〜約１：８、より
好ましくは約３：４〜約１：４、更に好ましくは約３：
４〜約１：４、最も好ましくは約２：３である。得られ
る復元血漿は、正常の約１２０％またはそれ以上の濃度
で血漿成分を含む高較正物質参照血漿である。参照血漿
は、好ましくは、正常の約１２０％〜約１７５％、最も
好ましくは正常の約１３０％〜約１５０％の濃度で、血
漿成分（実際、血漿成分それぞれ）を含む。

【００５１】高較正物質参照血漿を調製するのに使用さ
れる正常標準血漿は、好ましくはヒト血漿である。正常
標準血漿は、市販原料から得ることができ、または健康
なヒトからの血漿試料をプールすることにより得ること
ができる。そのような正常血漿プールは、典型的にはク
エン酸塩処理され、１００％基準の仮定値を有する。好
ましくは、少なくとも７単位のヒト血漿がプールされ
る。プールは、所望により、ＡＴIII含有量、または参
照血漿が較正標準として用いられる対象である他の血漿
成分のいずれかの含有量について、試験される。一般
に、プールは、ＡＴIIIについて正常の９０％〜１１０
％の値を有すると考えられる。他の血漿成分について
は、正常値の範囲は、８０％（例えばファクタVIII）か
ら１３０％（例えばファクタＸII）まで広がり得る。Ａ
ＴIII以外の特定の血漿成分についての固有の正常範囲
は、この技術分野において知られており、かつ／また
は、本明細書に記載しているように正常プールを形成
し、特定成分を測定することにより当業者なら容易に決
定することができる。プール血漿は、約６〜約８.５の
範囲のｐＨ、好ましくは約７.３のｐＨを得るために、
適当な緩衝剤と混合することができる。プール血漿に、
グリシンを添加することもできる。血漿は、混合後、粒
子を除去するために濾過することができる。

【００５２】調製方法に拘わらず、正常参照血漿は、バ
イアルまたは他の適当な容器に容量Ｖ₁で分配され、次
いでこの技術分野で既知の方法により凍結乾燥される。
一般に、血漿は、凍結血漿を形成するのに十分な温度に
おいて十分な時間、真空下に凍結される。温度、真空度
および時間は、限定されないが、凍結乾燥は一般に以下
のようにして行うことができる。血漿は、真空を適用せ
ずに典型的には約−６０℃〜約−２０℃の凍結温度にお
いて約２時間〜約２４時間の期間で凍結される。次い
で、好ましくは約１０ｍＴｏｒｒ〜約２００ｍＴｏｒｒ
の範囲で真空を適用する。次いで、シェルフ温度をわず
かに、典型的には約０℃〜約２５℃の温度へ、血漿の凍
結乾燥に十分な時間、上昇させる。凍結乾燥は、より好
ましくは、最初に真空を適用せずに約−４０℃の温度で
約４時間、チャンバ内の試料を凍結し、次いで、チャン
バを脱気して約２００ｍＴｏｒ以下の真空にし、続い
て、温度を、好ましくは約２５℃に、製品が約２５℃で
に達するのに十分な時間、例えば４時間で上昇させる。
好ましい態様では、正常参照血漿１.５ｍｌをバイアル
に供給し、真空を適用せずに−４０℃で約４時間凍結す
る。続いて、約２００ｍＴｏｒｒより低い真空を適用
し、シェルフ温度を約２５℃に、血漿試料を凍結乾燥す
るのに十分な時間、上昇させる。凍結乾燥血漿は、復元
するまで、約２℃〜約８℃の温度で、約２年間貯蔵する
ことができる。

【００５３】使用するには、上述のように、凍結乾燥血
漿試料を適当な溶媒により元に戻して、容量Ｖ₂の復元
血漿を得る。水が好ましい復元用溶媒であり、脱イオン
水が最も好ましい。しかしながら、凍結乾燥血漿試料の
復元には、他の溶媒および／または溶液、例えば上記の
ヘパリン誘導体希釈組成物またはヘパリン誘導体−トロ
ンビン試薬組成物も使用することができる。高較正物質
参照血漿は、上記の好ましい態様については、Ｖ₂：Ｖ₁
比が３：２となるように、脱イオン水により１.０ｍｌ
に復元される。これにより、ＡＴIIIを含めて全ての血
漿成分の濃度が最初の濃度の約１.４倍まで、すなわち
正常の約１３０％〜１４０％の血漿成分量に、効果的に
高められる。高較正物質参照血漿は、復元形で、ＡＴII
Iについては、約２℃〜約８℃の温度において約９６時
間保存することができる。保存時間は、他の血漿成分に
ついては異なることがある。

【００５４】標準試料の形成に使用する前に、復元血漿
を、承認された出所の明らかな一次または二次標準に対
して較正するのが好ましい。例えば、ＡＴIIIアッセイ
において使用する場合、高較正物質参照血漿は、ＷＨＯ
２nd Ｉnternational Ｓtandard for Ａntithrom
bin，Ｐlasma ９３／７６８（１９９４年設立）を用い
て照合され得る。（Ｉnternational Ｉnsititute for
Ｂiological Ｓtandarad and Ｃontrols，Ｐotter
s Ｂar，Ｕ．Ｋ．）。照合は、復元高較正物質参照血
漿を食塩水により（例えば１：１に）希釈し、関心のあ
る血漿成分（例えばＡＴIII）の値を承認済標準に対し
て決定し、次いで、決定された値に希釈倍率（例えば、
１：１希釈なら２）を掛けることにより、行うことがで
きる。上記のように調製され照合された高較正物質参照
血漿は、典型的な分析仕様範囲内（代表的には５〜８
％）に回復していなければならない。

【００５５】照合された高較正物質参照血漿は、この技
術分野において一般に知られており、本明細書ではＡＴ
IIIについて記載しているように、あらゆる血漿成分に
ついての標準較正曲線を作成するのに使用できる。照合
済高較正物質参照血漿は、復元血漿溶液として、凍結乾
燥高較正物質参照血漿として、キットの形で供給するこ
とができる。あるいは、キットは、（１）正常の約９０
％〜約１１０％の範囲の濃度で血漿成分を含む凍結乾燥
正常参照血漿、および（２）正常の約１２０％またはそ
れ以上の濃度、もしくは上述の高較正物質参照血漿の好
ましい範囲および濃度で血漿成分を含む復元血漿を形成
するのに十分な量で凍結乾燥参照血漿を復元することを
指示する使用説明書を含み得る。

【００５６】上記のように、ＡＴIIIアッセイは、用い
る参照血漿に拘わらず、手動または自動化方法を用いて
実施することができる。好ましい手動分析方法では、血
漿試料を、上記のように患者から採取する。血漿試料
（２５ｍｌ）を、上記の好ましいヘパリン誘導体希釈組
成物（１０００μｌ）により希釈する。この組成物は、
好ましいヘパリン誘導体を含んでいる。希釈された血漿
試料（２００μｌ）を、ガラスまたはプラスチック試験
管中で、３７℃において２〜４分間インキュベーション
する。次いで、上記のように血漿試料を好ましいヘパリ
ン誘導体−トロンビン試薬組成物（２００μｌ）と合わ
せて、アッセイ混合物を形成する。この試薬組成物は、
好ましいヘパリン誘導体とトロンビンを含んでいる。次
に、アッセイ混合物を、３７℃で２分間インキュベーシ
ョンし、停止剤により停止する。上記の好ましい色素生
成トロンビン基質（２００μｌ）を、インキュベーショ
ンしたアッセイ混合物に添加し、混合し、２分間インキ
ュベーションして発色したアッセイ混合物を得る。その
後、反応を停止する。場合によりこの時点で、水（２０
０μｌ）を発色したアッセイ混合物に加えてもよい。次
に、以下の組成で調製した試薬ブランクに対して４０５
ｎｍで吸光度を読み取る：停止剤（２００μｌ）、希釈
組成物（２００μｌ）、試薬組成物（２００μｌ）、色
素生成トロンビン基質（２００μｌ）、および（発色し
たアッセイ混合物に水が加えられた場合には）水（２０
０μｌ）。その後、測定された吸光度を、上記のように
既知のＡＴIII含有量を有する試料について同じ手順に
より作成した標準曲線に対して相関させる。

【００５７】好ましい自動化分析では、ＡＭＥＬＵＮＧ
ＡＭＡＸ ＣＳ−１９０（登録商標）凝析分析機（Co
agulation Analyzer）を、その操作指示書に従って使
用することができる。１つの方法では、未希釈血漿試料
５μｌを採取し、上記ヘパリン誘導体−トロンビン試薬
組成物２７５μｌを加えてアッセイ混合物を形成し、ア
ッセイ混合物を３７℃で３分間インキュベーションし、
次いで、色素生成トロンビン基質５０μｌを添加するよ
うに、分析機をプログラムする。分析機は、２０秒後、
４０秒後および６０秒後の反応速度（ｍＥ／ｍｉｎ）を
測定し、機器により行われた参照較正によって得られた
較正曲線から、自動的にＡＴIII活性を計算し、その値
は、正常に対するパーセント（％）として報告される。
別の自動化分析方法では、希釈を計算に入れる分析計の
適切なプログラムを用いて、希釈した血漿試料を使用す
ることができる。

【００５８】記載したＡＴIIIアッセイを実施するため
のキットは、上記のようなヘパリン誘導体希釈組成物、
上記のようなヘパリン誘導体−トロンビン試薬組成物、
および色素生成基質を含む。キットは、本明細書に記載
した方法に従ってアッセイ混合物を形成するための使用
説明書も含む。好ましいキットのための希釈組成物は、
ヘパリン誘導体、好ましくはコンドロイチナーゼＡＣＩ
−処理ヘパリン、および塩、好ましくはハロゲン化アル
カリ金属を含む。好ましいキットのための試薬組成物
は、ヘパリン誘導体、好ましくはコンドロイチナーゼＡ
ＣＩ−処理ヘパリン、塩、好ましくはハロゲン化アルカ
リ金属、およびトロンビンを含む。キットの使用説明書
に従ってこれら組成物から調製されるアッセイ混合物中
の塩の濃度は、好ましくは約０.１７５Ｍ〜約０.３Ｍの
範囲である。

【００５９】好ましい態様において、ヘパリン誘導体希
釈組成物およびヘパリン−トロンビン誘導体試薬組成物
は、凍結乾燥組成物として、キットに含まれる。凍結乾
燥希釈組成物は、ヘパリン誘導体を含む。凍結乾燥試薬
組成物は、トロンビンおよびヘパリン誘導体を含む。凍
結乾燥組成物は、適当な緩衝剤、無機塩、並びに付加的
に界面活性剤、キレート化剤、保存剤および他の通常使
用される化合物を含む。好ましい凍結乾燥試薬組成物
は、好ましくはコンドロイチナーゼＡＣＩ−処理ヘパリ
ン、トロンビン、ＮａＣｌ、ＴＡＰＳ、ＥＤＴＡ、Ｔwe
en８０、ゼラチン、アジ化ナトリウム、デキストラン、
およびウシ血清アルブミンを含む。好ましい凍結乾燥希
釈組成物は、トロンビンを除いて、好ましい試薬組成物
と同じ成分を含む。

【００６０】凍結乾燥試薬組成物は、ヘパリン誘導体の
濃度は好ましくは約０.５Ｕ／ｍｌ〜約６Ｕ／ｍｌ、よ
り好ましくは約１.０Ｕ／ｍｌ〜約２.５Ｕ／ｍｌ、最も
好ましくは約１.５Ｕ／ｍｌであり、トロンビンの濃度
は好ましくは約８ＩＵ／ｍｌ〜約９６ＩＵ／ｍｌ、より
好ましくは約１６ＩＵ／ｍｌ〜約４０ＩＵ／ｍｌ、最も
好ましくは約２４ＩＵ／ｍｌである、ヘパリン誘導体−
トロンビン試薬溶液から凍結乾燥により調製される。試
薬溶液（凍結乾燥用に調製された溶液）中のヘパリン誘
導体およびトロンビンのこれらの濃度は、ヘパリン誘導
体−トロンビン試薬組成物（それから上記のアッセイ混
合物を好ましく形成する）中の好ましい濃度の１倍から
１２倍の好ましい範囲を表している。より好ましい範囲
は、２倍から５倍であり、最も好ましい濃度は３倍であ
る。

【００６１】組成物は、凍結乾燥血漿を形成するのに十
分な温度および時間、十分な真空下で凍結することによ
り凍結乾燥される。温度、真空度および時間は、特に臨
界的ではないが、凍結乾燥は、一般に次のように行われ
る。組成物を、典型的には約−６０℃〜約−２０℃の凍
結温度において、約２時間〜約２４時間の間凍結する。
次いで、好ましくは約１０ｍＴｏｒｒ〜約２００ｍＴｏ
ｒｒの範囲で真空を適用する。その後、シェルフ温度
を、凍結乾燥するのに十分な時間、少し高め、典型的に
は約０℃〜約２５℃に高める。より好ましくは、凍結乾
燥は、チャンバー内で、真空を適用することなく約−４
０℃に約４時間凍結し、チャンバー内の真空度が約２０
０ｍＴｏｒｒ以下になるように脱気し、続いて、製品の
温度が約４時間で約２５℃に到達するのに十分な時間、
好ましくは２５℃に昇温する。好ましい態様において
は、試薬溶液４ｍｌをバイアルに供給し、真空を適用せ
ずに−４０℃で約４時間凍結して凍結乾燥する。次に、
約２００ｍＴｏｒｒ以下の真空を適用し、シェルフ温度
を、溶液を凍結乾燥するのに十分な時間、約２５℃に上
げる。凍結乾燥された組成物は、好ましくは真空化でシ
ールされる。凍結乾燥組成物は、復元されるまで、約２
℃〜約８℃の温度で、約２年間保存することができる。

【００６２】重要なことに、凍結乾燥試薬組成物は、単
一の凍結乾燥組成物中にヘパリン誘導体およびトロンビ
ンの両方を含む。ヘパリンまたはトロンビンの一方のみ
が凍結乾燥され、あるいはヘパリンおよびトロンビンが
別の組成物として凍結乾燥されていた従来技術のアプロ
ーチとは異なり、本発明の凍結乾燥試薬組成物は、簡単
化されたトロンビン使用ＡＴIIIアッセイ方法を可能に
する。ＡＴIIIアッセイに使用するのに適した試薬組成
物は、凍結乾燥試薬組成物を水のみで戻すことにより、
得ることができる。他の復元用溶媒または溶液も使用で
きるが、水、好ましくは脱イオン水が最も使用者にとっ
て使いやすい分析方法を提供する。

【００６３】本発明において使用する上記の凍結乾燥試
薬組成物は、ヘパリン誘導体およびトロンビンを含んで
いるが、未処理ヘパリンおよびトロンビンの両者を含む
凍結乾燥試薬組成物も、他の分析方法において未処理ヘ
パリンおよびトロンビンを用いる場合に同じ利点を得る
ように、調製することができる。凍結乾燥ヘパリン−ト
ロンビン試薬組成物の形成に使用するために調製される
ヘパリン−トロンビン試薬組成物溶液中の未処理ヘパリ
ンの濃度は、ヘパリン誘導体について記載した上記濃度
と同じであってよい。

【００６４】以下の実施例により、本発明の原理および
利点を説明する。

【実施例】

【００６５】実施例１：ヘパリン誘導体の調製 一塩基性リン酸ナトリウムで５０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液を調製し、ｐＨ７．２に調節した。ヘパリンのナ
トリウム塩（グレードＡ−１、Porcine Intestinal M
ucosa、活性１７０ＵＳＰ単位／ｍｇ、Sigma Cat N
o．Ｈ３３９３）を用いて、上記のように調製したリン
酸ナトリウム緩衝液中、ヘパリン１００００Ｕ／ｍｌ溶
液とした。コンドロイチナーゼＡＣ（Sigma Catalog
Ｃ２７８０、Flavobacterium heparinum由来、０．５
〜１．５Ｕ／ｍｇ、１単位は、ｐＨ７．３、３７℃で、
コンドロイチン硫酸Ａからの不飽和二糖の遊離により、
１．０／分のデルタＯＤ２３２をもたらす）を、使用直
前に脱イオン水中で再構成して、１０Ｕ／ｍｌとした。
コンドロイチナーゼＡＣをヘパリン原液に加えて、終濃
度１Ｕ／ｍｌとした。コンドロイチナーゼＡＣとヘパリ
ンとの比が１Ｕ／１００００Ｕとなるように、濃度およ
び／または体積を調節した。液をよく混合し、ＯＤ２３
２を測定した。前記リン酸緩衝液をブランク液として用
いた。次いで、混合物を密閉し、３７℃で２４〜４８時
間インキュベートした。インキュベーション時間の終了
時に、ＯＤ２３２を再度測定した。ＯＤは最初の測定値
と比較して約１０％上昇していたが、これにより、酵素
的分解が起こったこと、およびヘパリンから二糖が分解
してヘパリン誘導体が生成したことがわかった。バイア
ルを再密閉し、沸騰水浴に５分間浸した。

【００６６】実施例２：ヘパリン誘導体−トロンビン試
薬組成物、ヘパリン誘導体希釈組成物、および色素生成
トロンビン基質の調製 ヘパリン誘導体−トロンビン試薬組成物を、次のように
して調製した。Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル
−３−アミノ−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ−３８ｍ
Ｍ）、０．１７５Ｍ ＮａＣｌ、エチレンジアミン四酸
酸（ＥＤＴＡ−３．７５ｍＭ）、tween８０(ポリオキシ
エチレンソルビタンモノオレエート−０．０１５％)、
アジ化ナトリウム(０．００３％)、ゼラチン(ウシ、オ
ートクレーブ処理済−３３μｇ／ｍｌ)、デキストラン
(１．５％)、ウシ血清アルブミン（０．１％)、ポリエ
チレングリコール(８０００ＭＷ−０〜１％)、およびコ
ンドロイチナーゼＡＣ処理したヘテロブタヘパリン
(０．５Ｕ／ｍｌ)を含有する緩衝液(ｐＨ８．２)に、ト
ロンビン(２〜１２ＩＵ／ｍｌ)を加えた。ヘパリン誘導
体希釈組成物は、トロンビンを用いないことを除いて
は、上述のようにして調製した。色素生成トロンビン基
質組成物は、サルコシル−プロリン−アルギニンｐ−ニ
トロアニリド・ジヒドロクロリドを、１％マンニトール
に２〜３ｍＭとなるように溶解することによって調製し
た。

【００６７】実施例３：コンドロイチナーゼＡＣＩ処理
ヘパリンを用いるＡＴIIIアッセイ ＡＴIIIレベル既知の標準血漿サンプル２セットに対
し、ＡＴIIIアッセイを行って、二標準曲線(参照曲線お
よびＨＣＩＩ−正常曲線)を得た。標準血漿サンプルの
第一のセット(参照サンプルと称する)を用いて、参照曲
線を得た。参照サンプルは、１００％−ＡＴIII正常参
照血漿(ＮＲＰ)(Sigma CatNo．Ａ７４３２)を塩溶液で
希釈して、７５％−ＡＴIII、５０％−ＡＴIIIおよび０
％−ＡＴIII参照サンプル(ＡＴIIIおよびＨＣＩＩの両
方を包含するすべての血漿成分を順次低いレベルとし
た)とすることによって調製した。標準血漿サンプルの
第二のセット(ＨＣＩＩ−正常サンプルと称する)を用い
て、ＨＣＩＩ−正常曲線を得た。このサンプルは、１０
０％−ＡＴIII正常参照血漿(ＮＲＰ)を、ＡＴIIIレベル
は１％正常未満であるがヘパリン補因子ＩＩ(ＨＣＩＩ)
レベルは正常なＡＴIII−免疫除去血漿(Affinity Biol
ogicals)で希釈することによって調製した。ＨＣＩＩ−
正常サンプルのＡＴIIIレベルは順次低下したが(７５％
−ＡＴIII、５０％−ＡＴIIIおよび０％−ＡＴIII)、他
のすべての阻害物質(ＨＣＩＩを包含する)はその正常レ
ベル(１００％−ＨＣＩＩ)で一定に保った。

【００６８】実施例１に従って調製したヘパリン誘導体
を用いるプロトコルによって、ＨＣＩＩ−正常サンプル
それぞれに対するＡＴIIIアッセイを行った。ＨＣＩＩ
−正常サンプルを、実施例２に従って調製したヘパリン
誘導体希釈組成物中で希釈し(１／４０)(２５μｌ血漿
サンプル＋９７５μｌ希釈組成物)、３７℃で平衡化し
た。この混合物２００μｌを、実施例２に従って調製し
たヘパリン誘導体−トロンビン試薬組成物２００μｌと
混合し、やはり３７℃で平衡化して、アッセイ混合物を
調製した。このアッセイ混合物（１７５ｍＭ塩化ナトリ
ウム含有)を、３７℃で２分間インキュベートした。イ
ンキュベートしたアッセイ混合物に、実施例２に従って
調製した色素生成トロンビン基質２００μｌを加え、複
合体形成していないトロンビンと、正１分間または正２
分間(トロンビンと基質との相対濃度に応じて)反応させ
て、発色アッセイ混合物とした。氷酢酸または２％クエ
ン酸２００μｌで反応を停止した。発色アッセイ混合物
の吸光度を、分光光度計を用いてＯＤ４０５で測定し
た。そのＨＣＩＩ−正常サンプルについて、既知ＡＴ−
IIIレベル(Ｘ軸)に対し、測定吸光値(ｙ軸)をプロット
することによって、標準曲線(「ＨＣＩＩ−正常／処
理」と称する)を作製した。これを図１に示す(▲)。

【００６９】未処理ブタヘパリンを用いて、各参照サン
プル、および各ＨＣＩＩ−正常サンプルに対して、対照
アッセイを行った。コンドロイチナーゼＡＣ処理ヘパリ
ンの代わりに未処理ヘパリンを使用したことを除いて
は、実施例２に記載のようにして、ヘパリン希釈組成物
およびヘパリン−トロンビン試薬組成物を調製した。次
いで、このような未処理ヘパリン含有組成物を用いて、
ＡＴIIIアッセイを上述のように行った。ＨＣＩＩ−正
常サンプルの標準曲線(「ＨＣＩＩ−正常／未処理」と
称する)(□)、および参照サンプルの標準曲線(「対照／
未処理」と称する)(■)を図１に示す。

【００７０】図１に関して、ＨＣＩＩ−正常／未処理曲
線(□)および参照／未処理(■)曲線の二曲線を比較する
と、未処理ヘパリンを用いるトロンビン系アッセイにお
ける測定抗トロンビン活性に対するＨＣＩＩの影響がわ
かる。５％−ＡＴIII(参照／未処理血漿サンプルは５％
−ＡＴIIIおよび５％−ＨＣＩＩを含有し、ＨＣＩＩ−
正常／未処理血漿サンプルは５％−ＡＴIIIおよび１０
０％−ＨＣＩＩを含有することがわかっている)におけ
る上記曲線の測定ＡＴIII値の差は、非ＡＴIII阻害物質
(主にＨＣＩＩ)の測定活性に対する影響を表す。すなわ
ち、未処理ヘパリンを用いるアッセイにおいて、測定Ａ
ＴIII活性に対するＨＣＩＩの影響は、約２５％であ
る。

【００７１】一方、図１の、ＨＣＩＩ−正常／処理(▲)
およびＨＣＩＩ−正常／未処理の標準曲線の測定ＡＴII
I値を、既知５％−ＡＴIII値で比較することによって、
好ましいヘパリン誘導体を用いるトロンビン系アッセイ
における測定抗トロンビン活性に対するＨＣＩＩの影響
がわかる。アッセイに付したＨＣＩＩ−正常サンプルは
１００％−ＨＣＩＩを含有していたが、アッセイにおい
て未処理ヘパリンを用いた場合にしか、ＨＣＩＩは測定
ＡＴIIIに影響しなかった。上記サンプル中のＨＣＩＩ
は明らかに、アッセイにヘパリン誘導体を使用した場合
には測定ＡＴIIIレベルに影響しなかった。 希釈血漿サンプル：ヘパリン誘導体−トロンビン試薬：
色素生成トロンビン基質(１：１：１)のアッセイ混合物
を用いた自動化プロトコルを用いても、同様の結果が得
られた。別の自動化プロトコルにおいては、血漿サンプ
ルを、ヘパリン誘導体−トロンビン組成物と、１：５５
の比で総体積２８０μｌで混合し、３０〜１８０秒間イ
ンキュベートした。次いで、トロンビン基質４０〜７０
μｌを加え、反応速度を装置で計算し、％正常として表
した。

【００７２】実施例４：未処理ヘパリンおよび種々の濃
度の塩化ナトリウムを用いるＡＴIIIアッセイ 本実施例においては、塩化ナトリウム濃度を１７５〜６
００ｍＭの範囲で変化したアッセイ混合物中、未処理ヘ
パリンを用いて、参照サンプルおよびＨＣＩＩ−正常サ
ンプルに対して本質的に実施例３と同様にＡＴIIIアッ
セイを行った。１７５ｍＭおよび３１０ｍＭのサンプル
の標準曲線を作製した。これら曲線は、本明細書および
図２中で、「参照／未処理／０．１７５Ｍ」(■)、「Ｈ
ＣＩＩ−正常／未処理／０．１７５Ｍ」(◇)、「参照／
未処理／０．３１０Ｍ」(▲)、および「ＨＣＩＩ−正常
／未処理／０．３１０Ｍ」(□)と称する。

【００７３】図２に関して、参照／未処理／０．１７５
Ｍ曲線(■)と、ＨＣＩＩ−正常／未処理／０．１７５Ｍ
曲線(◇)との、既知５％−ＡＴIIIレベルでの測定ＡＴI
II値の差は、１７５ｍＭ塩化ナトリウムを用いた場合の
測定抗トロンビン活性に対するＨＣＩＩの影響を示す
(約２５％)。参照／未処理／０．３１０Ｍ曲線(▲)と、
ＨＣＩＩ−正常／未処理／０．３１０Ｍ曲線(□)との、
既知５％−ＡＴIIIレベルでの測定ＡＴIII値の差は、３
１０ｍＭ塩化ナトリウム濃度とした場合の測定抗トロン
ビン活性に対するＨＣＩＩの影響を示す(５％)。すなわ
ち、塩濃度の上昇は、測定抗トロンビン活性に対するＨ
ＣＩＩの影響を少なくすることによって、トロンビン系
ＡＴIIIアッセイを改善し得る。

【００７４】実施例５：コンドロイチナーゼＡＣＩ処理
ヘパリンを用い、塩化ナトリウム濃度を上昇したＡＴII
Iアッセイ ヘパリン誘導体と高濃度の塩を含有するアッセイ混合物
を用いることによる組み合わせ効果を評価するために、
ＡＴIIIアッセイを行った。コンドロイチナーゼＡＣ処
理ヘパリンおよび３１０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する
アッセイ混合物、並びに未処理ヘパリンおよび１７５ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含有するアッセイ混合物を用いたこ
とを除いては、本質的に実施例３に記載のように、参照
サンプルおよびＨＣＩＩ−正常サンプルのアッセイを行
った。作製した標準曲線は、本明細書および図３中で、
「参照／未処理／０．１７５Ｍ」(■)、「ＨＣＩＩ−正
常／未処理／０１７５Ｍ」(◇)、「参照／処理／０．３
１０Ｍ」(▲)、および「ＨＣＩＩ−正常／処理／０．３
１０Ｍ」(□)と称する。

【００７５】図３に関して、参照／未処理／０．１７５
Ｍ曲線(■)と、ＨＣＩＩ−正常／未処理／０．１７５Ｍ
曲線(◇)との、既知５％−ＡＴIIIレベルでの測定ＡＴI
II値の差は、１７５ｍＭ塩化ナトリウムアッセイ混合物
中で未処理ヘパリンを用いた場合の測定抗トロンビン活
性に対するＨＣＩＩの影響を示す(約２５％)。参照／処
理／０．３１０Ｍ曲線(▲)と、ＨＣＩＩ−正常／処理／
０．３１０Ｍ曲線との、既知５％−ＡＴIIIレベルでの
測定ＡＴIII値の差は、ヘパリン誘導体および３１０ｍ
Ｍ塩化ナトリウムアッセイ混合物を用いた場合の測定抗
トロンビン活性に対するＨＣＩＩ−の影響を示す(約６
％)。

【００７６】実施例６：ＡＴIII除去血漿のＡＴIIIアッ
セイ ＡＴIIIレベルが１％正常未満であるが、ヘパリン補因
子ＩＩ(ＨＣＩＩ)および他の血漿成分は正常レベルで含
有するＡＴIII免疫除去血漿(Affinity Biologicals)
を、塩溶液で希釈することによって、標準血漿サンプル
(ＡＴIII除去サンプルと称する)を調製した。このＡＴI
II除去サンプルのＨＣＩＩレベルを順次低下し(７５％
−ＨＣＩＩ、５０％−ＨＣＩＩ、２５％−ＨＣＩＩおよ
び０％−ＨＣＩＩ)、各サンプルのＡＴIIIレベルは１％
未満とした。コンドロイチナーゼＡＣ処理ヘパリンおよ
び３１０ｍＭ塩化ナトリウムを含有するアッセイ混合
物、並びに対照として、未処理ヘパリンおよび１７５ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含有するアッセイ混合物を用いたこ
とを除いては、本質的に実施例３に記載のように、ＡＴ
III除去サンプルのアッセイを行った。作製した標準曲
線は、本明細書および図４中で、「ＡＴIII除去／未処
理／０．１７５Ｍ」(■)、および「ＡＴIII除去／処理
／０．３１０Ｍ」(◇)と称する。

【００７７】図４に関して、塩濃度１７５ｍＭで未処理
ヘパリンを用いて測定したＡＴIII(■)は、ＨＣＩＩ濃
度を低下するに従って変化した。これにより、ＨＣＩＩ
が、測定抗トロンビン活性に用量依存的に影響すること
がわかる。一方、ヘパリン誘導体および３１０ｍＭ塩を
用いて測定したＡＴIIIは、ＨＣＩＩ濃度に依存せず、
各ＡＴIII依存サンプルについて実際のＡＴIIIが正確に
測定された。本発明のＡＴIIIアッセイの利点は、ＡＴI
II除去／未処理／０．１７５Ｍ曲線(■)と、ＡＴIII除
去／処理／０．３１０Ｍ曲線(◇)とを、ＨＣＩＩ−１０
０％の点で比較することによっても示される。このデー
タによると、既知プロトコル(未処理ヘパリンおよび１
７５ｍＭ塩使用)を用いて血漿サンプルのＡＴIIIを測定
すると、ＨＣＩＩが測定抗トロンビン活性に２０％以上
影響する。しかし、本発明のプロトコル(ヘパリン誘導
体および３１０ｍＭ塩使用)を用いてＡＴIIIを測定する
と、ＨＣＩＩは測定抗トロンビン活性に約２％しか影響
しない。

【００７８】実施例７：コンドロイチナーゼＡＣＩ処理
ヘパリンを用いるＡＴIIIアッセイと、他のＡＴIIIアッ
セイとの相関 本発明のＡＴIIIアッセイ(ヘパリン誘導体使用)と、既
知のトロンビン系ＡＴIIIアッセイ(未処理ヘパリン使
用)および既知Ｘａ因子系ＡＴIIIアッセイとを比較する
研究を行った。この研究に、全部で１１６の血漿サンプ
ルを使用した。このような血漿サンプルは、正常で健康
なドナーからと、肝疾患、汎発性血管内凝固(ＤＩＣ)並
びにＩ型およびＩＩ型遺伝的ＡＴIII欠損症の患者とか
ら採取した。ＡＴIII除去、ＨＣＩＩ除去および正常血
漿の混合物から、少数のサンプルを調製した。対照サン
プルの分析は、自動化装置でＦＤＡ承認法に従って、市
販Ｘa因子系ＡＴIIIアッセイおよび市販ＩＩａ因子(ト
ロンビン)系アッセイを用い、未処理ヘパリンおよび１
７５ｍＭ塩化ナトリウムを用いて行った。本発明のＡＴ
IIIアッセイによって、コンドロイトナーゼＡＣ処理ヘ
パリンおよび２２０ｍＭ塩化ナトリウムを含有するアッ
セイ混合物を用いて、上記と同じサンプルのＡＴIIIレ
ベルを実施例３に記載の方法で測定した。

【００７９】方法間の相関レベルを調べるために、アッ
セイ結果を回帰分析に付した。図５および表１は、本発
明のＡＴIIIアッセイ結果と、既知トロンビン系アッセ
イ(未処理ヘパリン使用)結果とを比較するものである。
図６および表２は、本発明のＡＴIIIアッセイ結果を、
Ｘａ因子系アッセイ結果と比較するものである。相関係
数ｒによると、本発明のＡＴIIIアッセイは、既知トロ
ンビン系アッセイとよりも(ｒ＝０．９３)、Ｘａ因子系
アッセイとの相関性が高い(ｒ＝０．９８)。更に、Ｘａ
因子系アッセイと、既知トロンビン系アッセイ(未処理
ヘパリン使用)との相関性は、より低かった(ｒ＝０．８
９、ｙ＝１．０７Ｘ−６．２６)。このデータからわか
るように、本発明のＡＴIIIアッセイは、既知ＩＩａ因
子系ＡＴIIIアッセイ(未処理ヘパリン使用)とよりも、
ＨＣＩＩ非依存性Ｘａ系アッセイとの相関性が高い。

【００８０】

【表１】 ＡＴIIIアッセイ−自動化（Amelung-AMAＸ）新規トロンビン系ＡＴIIIアッセイ 対 既知トロンビン系ＡＴIIIアッセイ 回帰アウトプット： 定数 −２．８７４８２２３ Ｙの標準誤差（算出） ９．１２９９８０４４ Ｒの２乗 ０．８５７５１８２５ Ｒ ０．９２６０２２８１ 観察数 １１６ 自由度 １１４ Ｘ係数 １．０３６２９４４４ 係数の標準誤差 ０．０３９５６２９５ Ｙ＝１．０３Ｘ−２．８８

【００８１】

【表２】 ＡＴIIIアッセイ−自動化（Amelung-AMAＸ）既知Ｘａアッセイ 対 新規トロンビン系ＡＴIIIアッセイ 回帰アウトプット： 定数 ７．８５７２９７７８ Ｙの標準誤差（算出） ５．０６４５３９５９ Ｒの２乗 ０．９５６１５７０８ Ｒ ０．９７７８３２８５ 観察数 １１６ 自由度 １１４ Ｘ係数 ０．９１３０７８８９ 係数の標準誤差 ０．０１８３１２２２ Ｙ＝１．９１Ｘ＋７．８５

【００８２】実施例８：種々のＡＴIIIアッセイを用い
る臨床試験における、正常および異常患者分別 Ｘａ因子系アッセイ、既知トロンビン系アッセイ(未処
理ヘパリンおよび１７５ｍＭ塩使用)、および本発明の
トロンビン系アッセイ(コンドロイチナーゼＡＣによっ
て調製したヘパリン誘導体と、２２０ｍＭ塩化ナトリウ
ムを使用)によって、複数の健康な志願者のＡＴIIIレベ
ルを測定した。Ｘａ因子系アッセイによって異常(ＡＴI
II＜７５％正常)と判定された３０の患者サンプルを選
択し、同じサンプルの既知トロンビン系アッセイおよび
本発明トロンビン系アッセイによって得た値と比較し
た。正常および異常の測定範囲を、未処理データに基づ
いて求め、また、平均値に平均値の二標準偏差を加減す
ることによって算出した。未処理データに基づく測定範
囲を図７に示す。その範囲によると、Ｘａ因子系アッセ
イも、本発明のトロンビン系アッセイも、正常と異常の
サンプルを区別することができる。すなわち、それらプ
ロトコルに従ってＡＴIIIを測定すると、正常サンプル
の下限値が、異常サンプルの上限値よりも明らかに高
い。しかし、既知のトロンビン系アッセイでは、一部の
正常および異常血漿サンプルを区別することができな
い。すなわち、正常サンプルの下限値と異常サンプルの
上限値が重複していることがわかる。平均値±２ＳＤデ
ータ(データを示さず)によっても、同様の区別と重複と
が見られる。

【００８３】実施例９：高度較正参照血漿の調製 正常ヒト血漿７単位の貯留から、正常参照血漿を調製し
た。貯留血漿を、Hepes／プロピオン酸緩衝濃厚液(２Ｍ
Hepes／４０ｇ／ｌプロピオン酸)およびグリシン(Sig
ma catalog Ｇ７１２６、１０ｇ／ｌ)と混合した。こ
の緩衝血漿を混合し、濾過して微粒分を除去した後、
１．５ｍｌ量をバイアルに入れた。ゴム栓を緩くはめ
た。バイアルを凍結乾燥器(フリーズドライヤー)に移
し、減圧することなく−４０℃で２〜４時間冷凍した。
次いで、減圧し(＜２００ミリトル)、貯蔵温度を２５℃
に設定した。血漿が４時間で２５℃に達したら、減圧下
にバイアルをキャップで密閉した。

【００８４】凍結乾燥した正常参照血漿を、脱イオン水
で再構成して１．０ｍｌとし、高度較正血漿参照を形成
した。これにより、すべての血漿タンパク質(ＡＴIIIを
包含する)の濃度を、元の濃度の約１．４倍に有効に高
めた。この高度較正参照血漿を、ＷＨＯ ２nd Intern
ational Standard for Antithrombin，Plasma９３／
７６３(１９９４年確立)に対して証明した。(Internati
onal Institute for Biological Standards and
Controls， PottersBar， Ｕ．Ｋ．)。すなわち、こ
の高度較正参照材料１６〜２４バイアルを塩溶液で１：
１希釈し、次いで、確証標準から作製した標準曲線を用
いて、２セットの実験において、本発明の方法によるＡ
ＴIIIのアッセイに付した。測定ＡＴIII値に希釈ファク
ター２を掛けた。高度較正参照血漿は、１３０〜１４０
％正常の上昇した高末端範囲を有することがわかった。

【００８５】実施例１０：高度較正参照血漿を標準とし
て用いるＡＴIIIアッセイ 実施例９に記載のように調製した高度較正参照血漿を用
いて、実施例３に記載のように標準曲線を作製した。こ
の標準曲線は、約１４０％正常までの高末端ＡＴIII値
を含んでいた。高度較正参照血漿から作製した標準曲線
を用いて、約１２０％正常を超えるＡＴIIIレベルを有
する患者血漿サンプルを、直接アッセイに付した。この
ような直接高末端ＡＴIIIアッセイのデータは、図５お
よび図６(実施例７参照)、並びに図７(実施例８参照)に
含まれている。

【００８６】実施例１１：凍結乾燥ヘパリン誘導体−ト
ロンビン試薬組成物の調製 ヘパリン誘導体濃度を約１．５Ｕ／ｍｌとし、トロンビ
ン濃度を約２４ＩＵ／ｍｌとしたことを除いては、実施
例２に記載のように、ヘパリン誘導体−トロンビン試薬
液を調製した。この試薬液を、４ｍｌの量でバイアルに
入れた。ゴム栓を緩くはめた。バイアルを凍結乾燥器
(フリーズドライヤー)に移し、−４０℃で２〜４時間冷
凍した。次いで、減圧(＜２００ミリトル)し、貯蔵温度
を２５℃に設定した。組成物が４時間で２５℃に達した
ら、減圧下にバイアルをキャップで密閉した。別の実験
では、ヘパリン濃度を約０．５〜６Ｕ／ｍｌの範囲、ト
ロンビン濃度を約８〜９６ＩＵ／ｍｌの範囲で変化した
試薬液を調製した。これらの液も、本質的に前記と同様
に凍結乾燥した。

【００８７】上記の本発明の詳細な説明および実施例に
照らして、本発明の複数の目的が達成されると理解され
る。本明細書中の記述および説明は、当業者に、本発
明、その原理、およびその実際の適用を教示することを
意図するものである。当業者は、本発明を、特定の適用
条件に最適となるように、種々の形態に応用および適用
し得る。すなわち、前記の本発明の特定の態様は、本発
明の制限を意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、様々な既知ＡＴIII濃度を有する血
漿サンプルについて測定されたＡＴIII値を示す。参照
サンプルは正常参照血漿を塩溶液で希釈することにより
製造され、ＨＣII−正常サンプルは、正常参照血漿を、
１％正常未満ＡＴIIIレベルを有するが、正常レベルの
ヘパリン補因子II（ＨＣII）および他の血漿成分を含む
ＡＴIII除去血漿（Affinity Biologicals）で希釈する
ことにより製造された。未処理ヘパリンを用いるトロン
ビン系アッセイによって参照サンプルを検定した（「参
照／未処理」と示された標準曲線--■）。ＨＣII−正常
サンプルを、未処理ヘパリンを用いたトロンビン系アッ
セイにより検定し（「ＨＣII-正常／未処理」と示され
た標準曲線--□）および独立して、コンドロイチナーゼ
ＡＣを用いて製造されたヘパリン誘導体を用いるこの発
明のトロンビン系アッセイにより検定した（「ＨＣII−
正常／処理」と示された標準曲線--▲）。値は％正常値
で記録されている。

【図２】 図２は、様々な既知ＡＴIII濃度を有する血
漿サンプルについて測定されたＡＴIII値を示す。参照
サンプルは正常参照血漿を塩溶液で希釈することにより
製造され、ＨＣII−正常サンプルは、正常参照血漿を、
１％正常未満ＡＴIIIレベルを有するが、正常レベルの
ヘパリン補因子II（ＨＣII）および他の血漿成分を含む
ＡＴIII除去血漿（Affinity Biologicals）で希釈する
ことにより製造された。塩化ナトリウム濃度が１７５ミ
リモルまたは３１０ミリモルであるアッセイ混合物中、
未処理ヘパリンを用いて参照サンプルおよびＨＣII−正
常サンプルを検定し、結果は「参照／未処理／０.１７
５Ｍ」（■）、「ＨＣII−正常／未処理／０.１７５
Ｍ」（◇）、「参照／未処理／０.３１０Ｍ」（▲）お
よび「ＨＣII−正常／未処理／０.３１０Ｍ」（□）と
示されている。値は％正常値で記録されている。

【図３】 図３は、様々な既知ＡＴIII濃度を有する血
漿サンプルについて測定されたＡＴIII値を示す。参照
サンプルは正常参照血漿を塩溶液で希釈することにより
製造され、ＨＣII−正常サンプルは、正常参照血漿を、
１％正常未満ＡＴIIIレベルを有するが、正常レベルの
ヘパリン補因子II（ＨＣII）および他の血漿成分を含む
ＡＴIII除去血漿（Affinity Biologicals）で希釈する
ことにより製造された。コンドロイチナーゼＡＣ−処理
ヘパリンおよび３１０ミリモルの塩化ナトリウムを含む
アッセイ混合物を用いて、および独立して、未処理ヘパ
リンおよび１７５ミリモルの塩化ナトリウムを含むアッ
セイ混合物を用いて、参照サンプルおよびＨＣII−正常
サンプルを検定した。作製した標準曲線は、「参照／未
処理／０.１７５Ｍ」（■）、「ＨＣII−正常／未処理
／０.１７５Ｍ」（◇）、「参照／処理／０.３１０Ｍ」
（▲）および「ＨＣII−正常／処理／０.３１０Ｍ」
（□）と示されている。

【図４】 図４は、様々な既知ＨＣII濃度を有するＡＴ
III除去血漿サンプルについて測定されたＡＴIII値を示
す。ＡＴIII除去サンプルは、１％正常未満ＡＴIIIレベ
ルを有するが、正常レベルのヘパリン補因子II（ＨＣI
I）および他の血漿成分を含むＡＴIII免疫除去血漿（Af
finity Biologicals）を希釈することにより製造され
た。コンドロイチナーゼＡＣ−処理ヘパリンおよび３１
０ミリモルの塩化ナトリウムを含むアッセイ混合物を用
いて、および独立対照として、未処理ヘパリンおよび１
７５ミリモルの塩化ナトリウムを含むアッセイ混合物を
用いて、ＡＴIII除去サンプルを検定した。標準曲線
は、「ＡＴIII−除去／未処理／０.１７５Ｍ」（■）お
よび「ＡＴIII−除去／処理／０.３１０Ｍ」（◇）とし
て示されている。

【図５】 図５は、この発明のＡＴIIIアッセイ（２２
０ミリモルのＮａＣｌ濃度でコンドロイチナーゼ−ＡＣ
処理ヘパリンを用いる）をトロンビン系既知アッセイ
（１７５ミリモルのＮａＣｌ濃度で未処理ヘパリンを用
いる）と比較する相関関係試験の結果を示す。データの
回帰分析は、本発明ＡＴIIIアッセイおよびトロンビン
系既知アッセイ間の相関係数ｒを示し、ｒ＝０.９３で
ある。

【図６】 図６は、この発明のＡＴIIIアッセイ（２２
０ミリモルのＮａＣｌ濃度でコンドロイチナーゼＡＣ処
理ヘパリンを用いる）を既知Ｘａ因子系アッセイと比較
する相関関係試験の結果を示す。データの回帰分析は、
本発明ＡＴIIIアッセイおよびＸａ因子系既知アッセイ
間の相関係数ｒを示し、ｒ＝０.９８である。

【図７】 図７は、Ｘａ因子系アッセイ、トロンビン系
既知アッセイ（未処理ヘパリンを使用）、およびこの発
明のトロンビン系アッセイ（コンドロイチナーゼＡＣに
より製造されたヘパリン誘導体を使用）を用いて検定さ
れた健康な志願者集団について測定された正常および異
常ＡＴIII範囲を比較する。異常試料は、Ｘａ因子アッ
セイに基づき＜７５％正常として選択された。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血漿試料、異種トロンビン、およびトロ
   ンビン−アンチトロンビンIII複合体の形成を促進する
   のに有効であり、トロンビンに対するヘパリンコファク
   タII活性を増進する効果が未処理ヘパリンよりも低いヘ
   パリン誘導体を含むアッセイ混合物を調製し、 アッセイ混合物をインキュベーションし、 インキュベーションしたアッセイ混合物中の未複合化ト
   ロンビンを測定し、 測定した未複合化トロンビンを血漿試料中のアンチトロ
   ンビンIIIに相関させることを含んでなる、血漿試料中
   のアンチトロンビンIIIの測定方法。
2. 【請求項２】 トロンビンに対するアンチトロンビンII
   I活性を増進するのに有効であり、トロンビンに対する
   ヘパリンコファクタII活性を増進する効果が未処理ヘパ
   リンよりも低いヘパリン誘導体を含んでなる処理ヘパリ
   ン。
3. 【請求項３】 正常の約１２０％またはそれ以上の濃度
   でアンチトロンビンIIIを含む、血漿成分の測定の為の
   基準として用いるのに適した参照血漿。