CN101680905B - 蛋白质分析 - Google Patents
蛋白质分析 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101680905B CN101680905B CN2008800001990A CN200880000199A CN101680905B CN 101680905 B CN101680905 B CN 101680905B CN 2008800001990 A CN2008800001990 A CN 2008800001990A CN 200880000199 A CN200880000199 A CN 200880000199A CN 101680905 B CN101680905 B CN 101680905B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- reactive component
- potpourri
- fibrin ferment
- inhibition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 title 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims abstract description 38
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims abstract description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 107
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 93
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 93
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 93
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 93
- 230000001723 fibrinogenic effect Effects 0.000 claims description 33
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 28
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 10
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 claims description 9
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 claims description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010027612 Batroxobin Proteins 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims description 7
- 229960002210 batroxobin Drugs 0.000 claims description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 7
- INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CNC1CCCCC1 INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims description 6
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 6
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010055460 bivalirudin Proteins 0.000 claims description 6
- OIRCOABEOLEUMC-GEJPAHFPSA-N bivalirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 OIRCOABEOLEUMC-GEJPAHFPSA-N 0.000 claims description 6
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 claims description 6
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 claims description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- BISKEOIROPAOGY-RXQQAGQTSA-N (2s)-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]-1-[(2r)-2-(methylamino)-3-phenylpropanoyl]pyrrolidine-2-carboxamide;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C([C@@H](NC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C=O)C1=CC=CC=C1 BISKEOIROPAOGY-RXQQAGQTSA-N 0.000 claims description 4
- CDPROXZBMHOBTQ-SJORKVTESA-N 2-[[(2r)-3-cyclohexyl-1-[(2s)-2-[3-(diaminomethylideneamino)propylcarbamoyl]piperidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]acetic acid Chemical compound NC(N)=NCCCNC(=O)[C@@H]1CCCCN1C(=O)[C@H](NCC(O)=O)CC1CCCCC1 CDPROXZBMHOBTQ-SJORKVTESA-N 0.000 claims description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 229960003856 argatroban Drugs 0.000 claims description 4
- KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N argatroban Chemical compound OC(=O)[C@H]1C[C@H](C)CCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NS(=O)(=O)C1=CC=CC2=C1NC[C@H](C)C2 KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N 0.000 claims description 4
- 229960001500 bivalirudin Drugs 0.000 claims description 4
- YBSJFWOBGCMAKL-UHFFFAOYSA-N dabigatran Chemical compound N=1C2=CC(C(=O)N(CCC(O)=O)C=3N=CC=CC=3)=CC=C2N(C)C=1CNC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 YBSJFWOBGCMAKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960003850 dabigatran Drugs 0.000 claims description 4
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 4
- 108010073652 desirudin Proteins 0.000 claims description 4
- XYWBJDRHGNULKG-OUMQNGNKSA-N desirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 XYWBJDRHGNULKG-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000296 desirudin Drugs 0.000 claims description 4
- 229950009814 efegatran Drugs 0.000 claims description 4
- 108010078659 efegatran Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 4
- 229950003291 inogatran Drugs 0.000 claims description 4
- OTQCKZUSUGYWBD-BRHMIFOHSA-N lepirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 OTQCKZUSUGYWBD-BRHMIFOHSA-N 0.000 claims description 4
- 229960004408 lepirudin Drugs 0.000 claims description 4
- DKWNMCUOEDMMIN-PKOBYXMFSA-N melagatran Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1CNC(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H](NCC(O)=O)C2CCCCC2)CC1 DKWNMCUOEDMMIN-PKOBYXMFSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002137 melagatran Drugs 0.000 claims description 4
- DSXZIKVKQAFHAN-UHFFFAOYSA-N 1-morpholin-4-ylpropane-1-sulfonic acid Chemical compound CCC(S(O)(=O)=O)N1CCOCC1 DSXZIKVKQAFHAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 claims description 3
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 claims description 3
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid Chemical class CCS(O)(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid;2-piperazin-1-ylethanol Chemical compound CCS(O)(=O)=O.OCCN1CCNCC1 DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 claims description 3
- 229960005141 piperazine Drugs 0.000 claims description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010001779 Ancrod Proteins 0.000 claims description 2
- 229960004233 ancrod Drugs 0.000 claims description 2
- 230000006965 reversible inhibition Effects 0.000 claims description 2
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims 2
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 claims 2
- KANJSNBRCNMZMV-ABRZTLGGSA-N fondaparinux Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NS(O)(=O)=O)[C@@H](OC)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O4)NS(O)(=O)=O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O2)NS(O)(=O)=O)[C@H](C(O)=O)O1 KANJSNBRCNMZMV-ABRZTLGGSA-N 0.000 claims 2
- 229960001318 fondaparinux Drugs 0.000 claims 2
- 238000007711 solidification Methods 0.000 claims 2
- 230000008023 solidification Effects 0.000 claims 2
- FBPFZTCFMRRESA-ZXXMMSQZSA-N D-iditol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-ZXXMMSQZSA-N 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 claims 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 8
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 241000271511 Bothrops atrox Species 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 2
- 229940003354 angiomax Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N coumarin 120 Chemical compound C1=C(N)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 2
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 2
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOPJRYAFUXTDLX-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,2,2,3,3-heptafluoro-3-methoxypropane Chemical compound COC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F NOPJRYAFUXTDLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKAGYSDHEJITFV-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-decafluoro-3-methoxy-4-(trifluoromethyl)pentane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(OC)C(F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F QKAGYSDHEJITFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 241000271532 Crotalus Species 0.000 description 1
- -1 HFE-7000 Chemical class 0.000 description 1
- 241001474977 Palla Species 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000271897 Viperidae Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- NFIKTSWJXJTUBZ-ZEQRLZLVSA-N benzyl n-[2-[(2s)-2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-[(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)amino]-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]carbamate Chemical group C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC2=CC=3OC(=O)C=C(C=3C=C2)C)CCN1C(=O)CNC(=O)OCC1=CC=CC=C1 NFIKTSWJXJTUBZ-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002344 fibroplastic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
描述了用于在存在纤维蛋白原的情况下测量凝血酶活性的方法或在存在凝血酶的情况下测量纤维蛋白原功能的方法。
Description
发明领域
描述了用于在存在纤维蛋白原的情况下测量凝血酶活性的方法或在存在凝血酶的情况下测量纤维蛋白原功能的方法。
发明背景：
纤维蛋白原和凝血酶是参与血管损伤后止血的关键蛋白，并且对于血凝块的形成非常重要。纤维蛋白原和凝血酶可以以粉末形式或以非水性悬浮液混合，而不会引起典型的凝块反应，从而阻止纤维蛋白凝块的形成，直到蛋白在水性介质或其它在其中蛋白是可溶的液体环境中形成水化合物。这些呈粉末形式的蛋白的混合物具有各种潜在的生物医学应用，包括局部止血、组织修复、药物递送等。此外，可以将这些蛋白的混合物以粉末形式装载至载体或基质或其它医学装置中，以形成可以例如用作止血装置的产品。
凝血酶的凝块活性通常通过将溶液中的凝血酶与溶液中已知的纤维蛋白原量混合来测量。在合适的条件下，在两种蛋白混合后凝块形成的速率取决于凝血酶的活性。将具有未知量凝血酶的样本的凝块形成的速率与凝血酶参照或凝血酶标准品的凝块形成的速率相比较以确定样本的活性。
凝血酶的活性是任何凝血酶/纤维蛋白原产品的重要属性，并且将决定其官能度。尽管游离凝血酶的测量是简单的，但当凝血酶和纤维蛋白原在未反应的混合物中时测量凝血酶的活性是具有挑战性的，因为其测量一般需要将蛋白质混合物进行水合及溶解，而溶解的凝血酶和纤维蛋白原之间的纤维蛋白凝块形成在水合后即马上开始。此外，由于已知凝血酶与立即形成的纤维蛋白凝块特异性地结合并相互作用，凝血酶变得结合在纤维蛋白凝块上且不再是游离地可溶解于水合溶液中并且使得无法用于随后的凝血酶测量。因此，通过水合和凝块形成的任何凝血酶/纤维蛋白原产品凝血酶活性的任何结果测量都仅仅是部分的，因此是不精确的。
此外，当蛋白质在未反应的混合物中被装载至载体、基质或医学装置中时，需要将蛋白质从基质中移出来以精确地测量凝血酶活性，例如，如果载体、基 质或医学装置由于物理化学或光学干扰测量检测系统而对蛋白质活性或功能测量产生不利影响的话。为了克服来自载体、基质或医学装置的干扰，蛋白质的移出或提取需要在不将混合物暴露于水性条件的情况下进行，水性条件会导致妨碍随后测量的凝块的形成。
纤维蛋白原最常通过最初由Clauss描述的方法测量，其基于凝块形成的速率测量纤维蛋白原的官能度。在典型的Clauss分析中，将未知量的可溶解的纤维蛋白原与过量凝血酶混合。这样的纤维蛋白原和凝血酶比例使得纤维蛋白原成为限制速率的反应物，并且凝块形成速率是纤维蛋白原浓度的函数。快的凝固时间是高纤维蛋白原浓度的指标。反之，更长的凝固时间是低浓度的功能纤维蛋白原的指标。功能纤维蛋白原的量可以通过将样本的凝固时间与用来建立标准曲线的标准品系列的凝固时间相比较而量化。样本中纤维蛋白原的浓度可以基于衍生自标准品凝固时间的方程式以数学方式计算而确定。
尽管溶液例如人类血浆中的纤维蛋白原的测量可以通过已建立的方法进行，然而当纤维蛋白原与凝血酶一起存在时评估纤维蛋白原的官能度则是一个难题。混合物的水合将导致凝血酶介导的纤维蛋白原至不可溶纤维蛋白凝块的转变。一旦产生纤维蛋白，任何随后的纤维蛋白原的测量不再是可能的，因为导致纤维形成的纤维蛋白肽从纤维蛋白原的释放实质上是不可逆的。
因此，仍然有这样的需求，即在存在纤维素原的情况下精确测量凝血酶活性以及在存在凝血酶的情况下测量纤维蛋白原的官能度。
附图详述：
图1显示了失活溶液中pH对恢复凝血酶活性的影响。
发明简述：
本文描述了用于确定第一反应组分和第二反应组分的混合物中第一反应组分或第二反应组分的活性或官能度的方法，其包括步骤：(a)可逆地抑制第一反应组分以产生具有失活的第一反应组分和第二反应组分的混合物；(b)当评估第一反应组分活性时，往混合物中加入过量的第二反应组分，或当评估第二反应组分的活性时，加入过量的第一反应组分；(c)可逆地活化第一反应组分；(d)允许第一反应组分与混合物中的第二反应组分和过量的第二反应组分反应，或允许第一反应组分与混合物中的第二反应组分和过量的第一反应组分反应；以及(e)确定最初存在于干混合物中的第一或第二反应组分的活性或官能度。
发明详述：
如在上面讨论的那样，为了确定凝血酶和纤维蛋白原的未反应混合物(例如以粉末形式或非水性悬浮液，诸如乙醇悬浮液的形式)中凝血酶的活性，需要使蛋白质再水合化并且对于凝血酶和纤维蛋白原来说需要溶解于水化介质中，以得到凝血酶活性的精确测量。然而，一旦混合物与水化介质接触，任何溶解的凝血酶和纤维蛋白原将反应而形成即刻的凝块，并且任何可利用的凝血酶将结合至凝块并不再游离地供其测量利用。
在一个实施方案中，暂时抑制性的溶液或可逆地抑制未反应混合物中凝血酶活性，从而避免纤维蛋白凝块的形成，直到凝血酶和纤维蛋白原完全溶解。通过抑制凝血酶活性，避免了即刻的凝块形成并且凝血酶可以游离地溶解于水性水合介质中并保持供测量利用。
例如可以通过调节凝血酶的碱性环境来达到对凝血酶活性的暂时或可逆的抑制。例如，这可以通过在抑制性的溶液或失活溶液，即具有约8.5至11.5、优选约9.5至10.5、以及更优选约10的pH范围的碱性溶液中重构或水合未反应的凝血酶和纤维蛋白原以形成第一溶液来完成。图1显示了pH对恢复的凝血酶活性的影响。当失活溶液的碱性是pH 10时，观察到最大的经恢复的凝血酶活性。在9.5至10.5的pH范围内，达到了最大恢复的凝血酶活性的至少80％。在低于9.5和大于10.5的pH水平时，最大恢复的凝血酶活性随着pH水平更偏离10而降低。在9.25的pH水平或更低时，在水合过程中观察到了凝块形成的证据并且可以解释在接近中性条件的更低pH值时观测到降低的最大恢复凝血酶活性。在酸性条件下，例如pH 4或5时，最大恢复的凝血酶活性显著地低于在碱性条件下所观察到的，这可能是凝血酶不可逆失活的指示。
抑制性的溶液或失活溶液可以是碱性溶液或缓冲的碱性溶液，包括但不限于碳酸盐、TRIS碱、硼酸盐、甘氨酸、磷酸盐、甲胺、2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)或3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)溶液。
一旦凝血酶和纤维蛋白原完全地溶解于抑制性的溶液或失活的溶液中，可将第一溶液或其部分与含有已知量纤维蛋白原(优选具有过量纤维蛋白原)的第二溶液混合以形成第三溶液，同时使pH保持在约8.5至11.5、优选约9.5至10.5、以及更优选约10。由于利用了过量的纤维蛋白原，因此混合物中凝血酶 的量是纤维蛋白凝块形成的限制速率的反应物，从而确保凝血酶的活性与凝块形成速率强相关。如果纤维蛋白原不是过量的，凝固速率会取决于凝血酶和纤维蛋白原两者。
此后，例如可以通过将第三溶液的pH调节至其中凝血酶活性不再受到抑制的范围，即约6.0至小于8.5、优选约7.0至小于8.5、以及更优选约7.5来逆转凝血酶活性。或者，可将具有溶解蛋白或其部分的失活溶液即第一溶液与在第二溶液中的已知量的纤维蛋白原、优选过量的纤维蛋白原混合，以形成第三溶液，由此同时逆转凝血酶活性的抑制。第二溶液的实例包括但不限于TRIS-HCl、咪唑、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、磷酸盐、巴比妥、4-吗啉基丙磺酸(MOPS)、3-吗啉-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、柠檬酸盐或碳酸盐的缓冲溶液。
第二溶液的体积和缓冲能力应该是当加入到第一溶液时足以得到具有约6.0至小于8.5、优选从7.0至小于8.5、以及更优选约7.5的pH的第三溶液的。例如，当第二溶液的摩尔浓度是约25mM至500mM TRIS-HCl缓冲液以及优选约100mM至150mM TRIS-HCl缓冲液时，例如，第一和第二溶液的体积比典型地是约1：1至1：20、以及优选在约1：4至1：10的范围。
可以应用具有机械端点检测系统的凝结物分析仪诸如Diagnostica StagoST4凝结物分析仪来检测凝块的形成，或检测由于纤维蛋白凝块形成而致的混浊度变化的装置来确定凝血酶活性。在失活溶液中的溶解蛋白可以在这些装置之一中与第二溶液混合，并且测量凝固的时间，然后将其与已知凝血酶活性的凝固时间相关联。
另一种可以测量凝血酶活性的方法是应用凝血酶的发色或发荧光的蛋白底物。在这一方法中，将溶解的凝血酶与过量的发色或发荧光的底物混合。凝血酶将切割底物，从而释放可在分光光度计或荧光光度计中监测的发色团或荧光团。发色或发荧光的底物的实例分别包括β-Ala-Gly-Arg-p-硝基苯胺双醋酸酯和Z-Gly-Pro-Arg-AMC[Z＝苄氧羰基、AMC＝7-氨基-4-甲基香豆素。可将释放发色团或荧光团的速率与凝血酶的活性相关联。
在另一个实施方案中，可以通过调节凝血酶的碱性环境抑制凝血酶活性来测量未反应混合物中纤维蛋白原的官能度。例如，这可以通过在抑制性的溶液或失活溶液，即具有约8.5至11.5、优选约9.5至10.5、以及更优选约10的pH范围的碱性溶液中重构或水化凝血酶和纤维蛋白原的混合物以形成第一溶液来完成。抑制性的溶液或失活溶液可以是碱性溶液或缓冲碱性溶液，包括但不限于碳酸盐、TRIS(3(羟甲基)氨基甲烷)碱、硼酸盐、甘氨酸、磷酸盐、甲胺、2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)或3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)溶液。此外或任选地，可将凝血酶抑制剂，诸如比伐卢定(Angiomax)加入到抑制性的溶液或失活溶液或第一溶液中以达到最大的凝血酶活性抑制，从而允许大多数纤维蛋白原溶解，以用于随后的测试。凝血酶抑制剂的其它实例包括：抗凝血酶、肝素、低分子量肝素、低分子量肝素类似物、阿戈托班、美拉加群、依非加群、伊诺加群、达比加群、水蛭素(hirudan)及水蛭素(hirudan)衍生物，诸如来匹卢定和地西卢定。
一旦凝血酶的活性受到抑制，纤维蛋白原的活性可以通过如下确定：将第一溶液或其部分与具有已知量凝血酶、优选过量的凝血酶的第二溶液混合，以形成第三溶液，同时使pH保持在约8.5至11.5、优选约9.5至10.5、以及更优选约10。利用了过量的凝血酶，因此混合物中纤维蛋白原的量是纤维蛋白凝块形成的限制速率的反应物，从而确保纤维蛋白原的浓度与凝块形成速率强相关。如果凝血酶不是过量的，则凝固速率会取决于凝血酶和纤维蛋白原两者。
此后，例如可以通过将第三溶液的pH调节至其中凝血酶活性不再受到抑制的范围，即约6.0至小于8.5、优选约7.0至小于8.5、以及更优选约7.5而逆转凝血酶活性。或者，可将具有溶解蛋白的失活溶液或其部分即第一溶液与具有已知量凝血酶、优选过量的凝血酶的第二溶液混合，以形成第三溶液，由此同时逆转凝血酶活性的抑制。第二溶液的实例包括但不限于pH约为7.5的TRIS-HCl、咪唑、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、磷酸盐、巴比妥、4-吗啉基丙磺酸(MOPS)、3-吗啉-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、柠檬酸盐或碳酸盐的缓冲溶液。
可以应用具有机械端点检测系统的凝结物分析仪诸如Diagnostica StagoST4凝结物分析仪来检测凝块形成，或检测由于纤维蛋白凝块形成而致的混浊度变化的装置来确定纤维蛋白原的官能度。在失活溶液中的溶解蛋白可以在这些装置之一中与第二溶液混合，并且测量凝固的时间，然后将其与已知纤维蛋白原官能度的凝固时间相关联。
或者，可以通过应用凝血酶抑制剂诸如比伐卢定(Angiomax)抑制凝血酶活 性而确定纤维蛋白原的官能度。任选地，可以结合使用凝血酶的抑制剂来调节凝血酶的碱性环境。凝血酶抑制剂的其它实例包括：抗凝血酶、肝素、低分子量肝素、低分子量肝素类似物、阿戈托班、美拉加群、依非加群、伊诺加群、达比加群、水蛭素(hirudan)及水蛭素(hirudan)衍生物，诸如来匹卢定和地西卢定。一旦凝血酶的活性受到抑制，可以通过能够作用于纤维蛋白原形成凝块但不受到凝血酶抑制剂影响的类凝血酶来确定纤维蛋白原的官能度。类凝血酶的实例包括但不限于巴曲酶(得自南美响尾蛇大具窍蝮蛇(Bothrops atrox)的毒液)和安克洛酶(得自红口蝮蛇的毒液)。
当蛋白质是以未反应混合物形式被加载至载体、基质或医学装置时，例如混合物可以呈粉末形式，其中蛋白质是干燥的或经干燥的，可以通过用非水性液体提取蛋白来完成水合及溶解之前的蛋白的移出，所述非水性液体包括但不限于全氟化的碳氢化合物，诸如HFE-7000、HFE7001、HFE7003、HFE-7300和PF-5060(可从Minnesota的3M商购得到)，以及可以利用蛋白质不会溶解于其中的任何其它载体液体，诸如乙醇、乙醚或其它有机液体。一旦用非水性溶剂提取了蛋白质，就可以如上面描述的那样测量凝血酶的活性或纤维蛋白原的官能度。
或者，当蛋白质被装载至载体、基质或医学装置时，可以不用移出蛋白质而如上面所描述的那样测量凝血酶的活性或纤维蛋白原的官能度。例如，可通过将在其上具有蛋白质的载体、基质或医学装置直接置于抑制性的溶液或失活溶液中而将蛋白质水合化，所述溶液可以用于作为如上面所描述那样测量凝血酶活性或纤维蛋白原功能的样本。
Claims (35)
1.用于确定在第一反应组分和第二反应组分的未反应混合物中第一反应组分或第二反应组分的活性或官能度的方法，其包括以下步骤：
(a) 可逆地抑制第一反应组分以产生具有失活的第一反应组分和第二反应组分的混合物；
(b) 当评估第一反应组分的活性时，往混合物中加入已知量的第二反应组分，或当评估第二反应组分的活性时，加入已知量的第一反应组分；
(c) 可逆地活化第一反应组分；
(d) 允许第一反应组分与最初存在于混合物中的第二反应组分和已知量的第二反应组分反应，或允许第一反应组分与最初存在于混合物中的第二反应组分和已知量的第一反应组分反应；以及
(e) 确定最初存在于混合物中的第一或第二反应组分的活性或官能度。
2.权利要求1的方法，其中第一反应组分是凝血酶并且第二反应组分是纤维蛋白原。
3.权利要求2的方法，其中凝血酶是重组体或从动物或人类来源得到，并且纤维蛋白原是重组体或从动物或人类来源得到。
4.权利要求2的方法，其中同时进行步骤(b)和(c)。
5.权利要求4的方法，其中所述混合物呈粉末形式，并且可逆抑制第一反应组分的步骤包括在具有8.5至11.5的 pH范围的抑制性的溶液或第一溶液中重构第一反应组分和第二反应组分的混合物。
6.权利要求5的方法，其中所述抑制性的溶液或第一溶液具有9.5至10.5的pH。
7.权利要求6的方法，其中所述抑制性的溶液或第一溶液具有约10的pH。
8.权利要求5的方法，其中所述抑制性的溶液或第一溶液包含选自碳酸盐、TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)碱、硼酸盐、甘氨酸、磷酸盐、甲胺、2-(环己基氨基) 乙磺酸(CHES)、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)或3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)中的至少一种组分的碱性溶液。
9.权利要求8的方法，其中已知量的第二反应组分在第二溶液中，所述第二溶液能够使具有失活的第一反应组分和第二反应组分的抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至约6.0至小于8.5。
10.权利要求9的方法，其中已知量的第二反应组分在第二溶液中，所述第二溶液能够使具有失活的第一反应组分和第二反应组分的抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至约7.0至小于8.5。
11.权利要求10的方法，其中已知量的第二反应组分在第二溶液中，所述第二溶液能够使具有失活的第一反应组分和第二反应组分的抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至约7.5。
12.权利要求9的方法，其中能够降低抑制性的溶液或第一溶液pH 的第二溶液是选自TRIS-HCl、咪唑、4-(2-羟乙基) 哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、磷酸盐、巴比妥、4-吗啉基丙磺酸(MOPS)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、柠檬酸盐或碳酸盐中的至少一种组分的溶液。
13.权利要求12的方法，其中能够降低抑制性的溶液或第一溶液pH 的第二溶液包含25mM至500mM的TRIS-HCl缓冲液。
14.权利要求13的方法，其中能够降低抑制性的溶液或第一溶液pH 的第二溶液包含100mM至150mM的TRIS-HCl缓冲液。
15.权利要求9的方法，其中在步骤(b)中将已知过量的第二反应组分加入到具有失活的第一反应组分和第二反应组分的抑制性的溶液或第一溶液中。
16.权利要求2的方法，其中步骤(b)包括将具有已知量的第二反应组分的第二溶液加入到具有失活的第一反应组分和第二反应组分的抑制性的溶液或第一溶液中，以形成具有8.5至11.5的pH范围的第三溶液。
17.权利要求16的方法，其中可逆地活化第一反应组分的步骤(c)包括将第三溶液的pH调节至约6.0至8.5。
18.权利要求9的方法，其中通过动力学凝固分析确定最初存在于混合物中的第一或第二反应组分的活性或官能度，所述动力学凝固分析测量凝结时间，该凝结时间与第一或第二活性组分的已知活性或官能度相关联。
19.权利要求18的方法，其中将第一或第二活性组分的活性或官能度转换为活性单位或官能团数量。
20.权利要求9的方法，其中应用比浊法、散射测浑法或粘度法或机械端点分析方法确定最初存在于混合物中的第一或第二反应组分的活性或官能度。
21.权利要求2的方法，其中第一反应组分和第二反应组分的混合物以粉末形式位于基质上，并且通过将具有失活的第一反应组分和第二反应组分混合物的基质置于具有已知量第二反应组分的第二溶液中来实施步骤(b)。
22.权利要求2的方法，其中第一反应组分和第二反应组分的混合物是非水性的悬浮液。
23.权利要求22的方法，其中所述非水性的悬浮液包含醇、凝血酶和纤维蛋白原。
24.权利要求23的方法，其中所述醇是乙醇。
25.用于确定凝血酶和纤维蛋白原的未反应混合物中纤维蛋白原的官能度的方法，其包括以下步骤：
(a) 通过在具有8.5至11.5的pH范围的抑制性的溶液或第一溶液中重构凝血酶和纤维蛋白原的混合物来抑制凝血酶而产生具有失活的凝血酶和纤维蛋白原的混合物；
(b) 往混合物中加入含有已知量凝血酶的第二溶液，所述第二溶液能够使具有纤维蛋白原和失活的凝血酶的抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至约6.0至小于8.5；
(c) 允许所述凝血酶与所述纤维蛋白原反应；以及
(d) 确定最初存在于混合物中的纤维蛋白原的官能度。
26.权利要求25的方法，其中抑制凝血酶的步骤还包括添加凝血酶抑制剂。
27.权利要求26的方法，其中所述的凝血酶抑制剂选自：抗凝血酶、肝素、低分子量的肝素、低分子量的肝素类似物、磺达肝素、阿戈托班、美拉加群、依非加群、伊诺加群、达比加群、比伐卢定、水蛭素及水蛭素衍生物。
28.权利要求27的方法，其中所述的水蛭素衍生物为来匹卢定和地西卢定。
29.用于确定凝血酶和纤维蛋白原的未反应混合物中纤维蛋白原官能度的方法，其包括以下步骤：
(a) 通过在具有8.5至11.5的pH范围的抑制性的溶液或第一溶液中重构凝血酶和纤维蛋白原的混合物来抑制凝血酶而产生具有失活的凝血酶和纤维蛋白原的混合物；
(b)往混合物中加入已知量的类凝血酶，以及任选地将具有纤维蛋白原和失活的凝血酶的抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至约6.0至小于8.5；
(c) 允许类凝血酶与纤维蛋白原反应；以及
(d) 确定最初存在于混合物中的纤维蛋白原的官能度。
30.权利要求29的方法，其中抑制凝血酶的步骤还包括添加凝血酶抑制剂。
31.权利要求29的方法，其中所述凝血酶抑制剂选自：抗凝血酶、肝素、低分子量的肝素、低分子量的肝素类似物、磺达肝素、阿戈托班、美拉加群、依非加群、伊诺加群、达比加群、比伐卢定、水蛭素及水蛭素衍生物。
32.权利要求31的方法，其中所述的水蛭素衍生物为来匹卢定和地西卢定。
33.权利要求29的方法，其中所述类凝血酶是巴曲酶或安克洛酶。
34.用于确定凝血酶和纤维蛋白原的未反应混合物中凝血酶活性的方法，其包括以下步骤：
(a) 通过在具有8.5至11.5的pH范围内的抑制性的溶液或第一溶液中重构凝血酶和纤维蛋白原的混合物来可逆地抑制凝血酶而产生具有失活凝血酶和纤维蛋白原的混合物；
(b) 加入能够使所述抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至约6.0至小于8.5的第二溶液；
(c) 允许纤维蛋白原与凝血酶反应；以及
(d) 评估凝块的形成。
35.用于确定凝血酶和纤维蛋白原的未反应混合物中凝血酶活性的方法，其包括以下步骤：
(a) 可逆地抑制凝血酶而产生具有失活的凝血酶和纤维蛋白原的混合物；
(b) 往混合物中加入已知量的发色或发荧光的凝血酶底物；
(c) 可逆地活化凝血酶；
(d) 允许凝血酶与所述发色或发荧光的凝血酶底物反应；
(e) 确定最初存在于混合物中的凝血酶的活性。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/US2008/064514 WO2009142638A1 (en) | 2008-05-22 | 2008-05-22 | Protein assay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101680905A CN101680905A (zh) | 2010-03-24 |
| CN101680905B true CN101680905B (zh) | 2013-11-27 |
Family
ID=40329388
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2008800001990A Expired - Fee Related CN101680905B (zh) | 2008-05-22 | 2008-05-22 | 蛋白质分析 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9213035B2 (zh) |
| EP (1) | EP2124063B1 (zh) |
| JP (1) | JP5539332B2 (zh) |
| KR (1) | KR101511071B1 (zh) |
| CN (1) | CN101680905B (zh) |
| AU (1) | AU2008252014B2 (zh) |
| BR (1) | BRPI0803089A2 (zh) |
| CA (1) | CA2645937C (zh) |
| IL (1) | IL194940A (zh) |
| TW (1) | TWI443193B (zh) |
| WO (1) | WO2009142638A1 (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2645937C (en) | 2008-05-22 | 2019-08-27 | Ethicon, Inc. | Thrombin and fibrinogen assay |
| US20120294767A1 (en) * | 2011-05-19 | 2012-11-22 | Hemosonics Llc | Portable hemostasis analyzer |
| US8900822B2 (en) * | 2011-11-21 | 2014-12-02 | Ethicon, Inc. | Fibrinogen assay |
| CN103604766A (zh) * | 2013-11-25 | 2014-02-26 | 牡丹江友搏药业股份有限公司 | 一种疏血通注射液的生物学质控方法 |
| CN104965017B (zh) * | 2015-06-17 | 2017-06-16 | 广西师范学院 | 水蛭素抗凝血酶活性的测定方法 |
| EP3743523A1 (en) * | 2018-01-25 | 2020-12-02 | DSM IP Assets B.V. | Fibrinogen test |
| JP7191613B2 (ja) * | 2018-09-26 | 2022-12-19 | キヤノンメディカルシステムズ株式会社 | 血液凝固分析装置 |
| IL263679A (en) * | 2018-12-12 | 2019-03-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Kits, methods, and ingredients for preventing tissue adhesion |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5110727A (en) * | 1987-04-03 | 1992-05-05 | Cardiovascular Diagnostics, Inc. | Method for performing coagulation assays accurately, rapidly and simply, using dry chemical reagents and paramagnetic particles |
| US5292664A (en) * | 1991-10-14 | 1994-03-08 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Functional test and reagent for determining fibrinogen |
| EP0587398A1 (en) * | 1992-09-09 | 1994-03-16 | Tokuyama Corporation | Method of assaying fibrinogen, dry reagent therefor, and process for the preparation thereof |
| US6448024B1 (en) * | 2000-10-03 | 2002-09-10 | Roche Diagnostics Corporation | Method, reagent, cartridge, and device for determining fibrinogen |
| EP1559438A1 (en) * | 2004-01-30 | 2005-08-03 | Ethicon, Inc. | Hemostatic compositions and devices |
| CN1763219A (zh) * | 2005-10-11 | 2006-04-26 | 广西医科大学 | 检测凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂的纤维蛋白原平板法 |
| CN101059521A (zh) * | 2007-05-30 | 2007-10-24 | 保定天岳生物工程有限公司 | 一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的试剂及其测定方法 |
| WO2007127834A2 (en) * | 2006-04-26 | 2007-11-08 | Medtronic, Inc. | Compositions and methods of preparation thereof |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1161878A1 (ru) | 1982-07-21 | 1985-06-15 | Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови | Способ определени активности тромбина |
| DE3330699A1 (de) | 1983-08-25 | 1985-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur gleichzeitigen bestimmung von fibrinogen und fibrinogen-spaltprodukten im plasma |
| JP2811799B2 (ja) | 1989-09-11 | 1998-10-15 | 三菱化学株式会社 | プロトロンビンの測定方法 |
| US6060451A (en) | 1990-06-15 | 2000-05-09 | The National Research Council Of Canada | Thrombin inhibitors based on the amino acid sequence of hirudin |
| SU1767425A1 (ru) | 1990-07-31 | 1992-10-07 | Научно-Исследовательский Институт Трансплантологии И Искусственных Органов | Способ определени функциональной полноценности фибриногена |
| AT399055B (de) | 1992-05-15 | 1995-03-27 | Immuno Ag | Verfahren zur bestimmung von fibrinogen |
| JPH06209794A (ja) | 1993-01-19 | 1994-08-02 | Tokuyama Soda Co Ltd | フィブリノゲンの定量方法 |
| JP2994557B2 (ja) | 1994-09-02 | 1999-12-27 | 株式会社アズウェル | フィブリノゲン測定方法およびその測定試薬 |
| US5589571A (en) | 1994-10-28 | 1996-12-31 | Cor Therapeutics, Inc. | Process for production of inhibited forms of activated blood factors |
| JPH09266798A (ja) | 1996-03-29 | 1997-10-14 | Tokuyama Corp | トロンビン活性の測定法および凝集試薬 |
| JPH11160321A (ja) | 1997-12-02 | 1999-06-18 | A & T:Kk | 血液凝固検査試薬および血液凝固能の測定方法 |
| DE102005008066A1 (de) | 2005-02-22 | 2006-08-24 | Haemosys Gmbh | Verfahren zur Bestimmung der Gesamtgerinnungsaktivität einer Blut- oder Plasmaprobe |
| CN101512011A (zh) * | 2006-06-06 | 2009-08-19 | 凝血酶测量有限公司 | 在生物介质中测定酶活性的方法 |
| CA2645937C (en) | 2008-05-22 | 2019-08-27 | Ethicon, Inc. | Thrombin and fibrinogen assay |
-
2008
- 2008-05-22 CA CA2645937A patent/CA2645937C/en active Active
- 2008-05-22 AU AU2008252014A patent/AU2008252014B2/en not_active Ceased
- 2008-05-22 JP JP2011510473A patent/JP5539332B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-05-22 BR BRPI0803089-8A patent/BRPI0803089A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2008-05-22 WO PCT/US2008/064514 patent/WO2009142638A1/en active Application Filing
- 2008-05-22 US US12/298,814 patent/US9213035B2/en active Active
- 2008-05-22 KR KR1020087029100A patent/KR101511071B1/ko active IP Right Grant
- 2008-05-22 CN CN2008800001990A patent/CN101680905B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-10-27 IL IL194940A patent/IL194940A/en active IP Right Grant
- 2008-10-31 TW TW97141904A patent/TWI443193B/zh not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-05-21 EP EP20090251374 patent/EP2124063B1/en not_active Not-in-force
-
2015
- 2015-11-03 US US14/930,799 patent/US9896716B2/en active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5110727A (en) * | 1987-04-03 | 1992-05-05 | Cardiovascular Diagnostics, Inc. | Method for performing coagulation assays accurately, rapidly and simply, using dry chemical reagents and paramagnetic particles |
| US5292664A (en) * | 1991-10-14 | 1994-03-08 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Functional test and reagent for determining fibrinogen |
| EP0587398A1 (en) * | 1992-09-09 | 1994-03-16 | Tokuyama Corporation | Method of assaying fibrinogen, dry reagent therefor, and process for the preparation thereof |
| US6448024B1 (en) * | 2000-10-03 | 2002-09-10 | Roche Diagnostics Corporation | Method, reagent, cartridge, and device for determining fibrinogen |
| EP1559438A1 (en) * | 2004-01-30 | 2005-08-03 | Ethicon, Inc. | Hemostatic compositions and devices |
| CN1763219A (zh) * | 2005-10-11 | 2006-04-26 | 广西医科大学 | 检测凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂的纤维蛋白原平板法 |
| WO2007127834A2 (en) * | 2006-04-26 | 2007-11-08 | Medtronic, Inc. | Compositions and methods of preparation thereof |
| CN101059521A (zh) * | 2007-05-30 | 2007-10-24 | 保定天岳生物工程有限公司 | 一种无需稀释血浆样本测定纤维蛋白原含量的试剂及其测定方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| A rapid enzymatic method for assay of fibrinogen fibrin polymerization time (FPT test);VERMYLEN C ET AL;《CLINICA CHIMICA ACTA》;19630501;第8卷(第3期);418-424 * |
| SCHERAGA H A.The thrombin-fibrinogen interaction.《BIOPHYSICAL CHEMISTRY, NORTH-HOLLAND》.2004,第112卷(第2-3期),117-130. |
| The thrombin-fibrinogen interaction;SCHERAGA H A;《BIOPHYSICAL CHEMISTRY, NORTH-HOLLAND》;20041220;第112卷(第2-3期);117-130 * |
| VERMYLEN C ET AL.A rapid enzymatic method for assay of fibrinogen fibrin polymerization time (FPT test).《CLINICA CHIMICA ACTA》.1963,第8卷(第3期),418-424. |
| 凝血酶活性的检测及临床意义;张莹;《微循环学杂志》;20050615;第15卷(第2期);具体参见2.1.6 Rayleigh光散射法测凝血酶活性 * |
| 张莹.凝血酶活性的检测及临床意义.《微循环学杂志》.2005,第15卷(第2期),具体参见2.1.6 Rayleigh光散射法测凝血酶活性. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL194940A0 (en) | 2009-12-24 |
| IL194940A (en) | 2014-08-31 |
| US9213035B2 (en) | 2015-12-15 |
| KR101511071B1 (ko) | 2015-04-10 |
| TW200948968A (en) | 2009-12-01 |
| WO2009142638A1 (en) | 2009-11-26 |
| TWI443193B (zh) | 2014-07-01 |
| AU2008252014A1 (en) | 2009-12-10 |
| JP5539332B2 (ja) | 2014-07-02 |
| US20160053299A1 (en) | 2016-02-25 |
| AU2008252014B2 (en) | 2014-06-05 |
| KR20110010842A (ko) | 2011-02-08 |
| JP2011523461A (ja) | 2011-08-11 |
| CN101680905A (zh) | 2010-03-24 |
| CA2645937A1 (en) | 2009-11-22 |
| US20110053193A1 (en) | 2011-03-03 |
| US9896716B2 (en) | 2018-02-20 |
| CA2645937C (en) | 2019-08-27 |
| BRPI0803089A2 (pt) | 2011-08-30 |
| EP2124063A1 (en) | 2009-11-25 |
| EP2124063B1 (en) | 2012-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101680905B (zh) | 蛋白质分析 | |
| CA2484554A1 (en) | Diagnostic test for determining the concentration of transient proteolytic activity in composite biological media | |
| CN102798632A (zh) | 一种检测巴曲酶活性的方法 | |
| JP7393006B2 (ja) | フィブリノーゲン検査 | |
| EP2529221A1 (en) | Thrombin generation determination method | |
| JP2010508036A (ja) | 細胞を含む複合性の生物学的媒体において一過性のプロテイン分解活性の濃度を測定するための方法 | |
| US8551722B2 (en) | Time-course measurement of enzymatic activity corrected for impacts of disturbances relating to the reaction of the enzyme with a substrate | |
| CN102798598A (zh) | 一种检测磷脂依赖性凝血因子x激活物酶活性的方法 | |
| RU2462721C2 (ru) | Способ определения активности и функциональности тромбина и фибриногена | |
| CN106350500B (zh) | 凝血酶溶液 | |
| CN106350499A (zh) | 凝血酶溶液的稳定剂 | |
| CN109709292A (zh) | 一种肝素检测试剂盒及其应用 | |
| EP3363912B1 (en) | Self-calibrated assay for determining proteolytic enzyme generation, dedicated means and uses thereof | |
| CN106337044A (zh) | 凝血酶溶液 | |
| CN106350501B (zh) | 凝血酶溶液的稳定剂 | |
| Castañeda-Agulló et al. | Simultaneous hydrolyses of esters and proteins at saturation levels | |
| CN115216519A (zh) | 一种纳豆激酶活性测定的方法 | |
| Heylen et al. | Development of a sensitive and selective assay for the determination of proCPU in plasma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20131127 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |