SU1767425A1

SU1767425A1 - Способ определени функциональной полноценности фибриногена

Info

Publication number: SU1767425A1
Application number: SU904848014A
Authority: SU
Inventors: Николай Константинович Зимин; Татьяна Ивановна Таранова; Галина Николаевна Будякова; Елена Константиновна Гинтер; Марина Николаевна Петухова
Original assignee: Научно-Исследовательский Институт Трансплантологии И Искусственных Органов
Priority date: 1990-07-31
Filing date: 1990-07-31
Publication date: 1992-10-07

Abstract

Изобретение относитс к медицине, а именно к гематологии, и касаетс способа определени функциональной полноценности фибриногена. Целью изобретени вл етс повышение специфичности способа. Способ осуществл ют посредством забора крови со стабилизирующей смесью, центрифугировани , добавлени в полученную плазму смеси 0,1 - 0,6 мг/мл протаминсуль- фата и 0,1 мл тромбина с активностью 10с и 0,1 мл 3%-ного раствора хлористого кальци , в контрольную плазму ту же смесь без протаминсульфата, взвешивани образовавшегос сгустка и в случае увеличени его веса по сравнению с контролем делают заключение об обратимом нарушении его фун- кциональной полноценности в случае уменьшени его веса - о частичном нарушении , а в случае образовани хлопьев - о полном нарушении функциональной полноценности фибриногена. Положительный эффект заключаетс в возможности количественного измерени , в то врем как в прототипе проводилась качественна оценка. 3 табл. СО с

Description

Изобретение относитс к области медицины , а именно к гематологии, и касаетс способов диагностики нарушений свертывающей системы крови в клинике и эксперименте .

Известен способ определени функциональной полноценности фибриногена методом количественного его определени в сгустке плазмы, путем инкубации стабилизированной плазмы при добавлении CaCIa и тромбина (Рутберг Р.А., Лабораторное дело, 1961, №5, с.6). Однако, этот способ недостаточно специфичен, т.к. при наличии эндо- или экзогенного гепарина в плазме, а также при патологических состо ни х, св занных с развитием ДВС-синдрома (например, активаци фибринолиза) дает искаженные результаты, либо вообще не дает фиксированного результата.

Известен также способ определени типе рфи бри ногенолитичес кой активности крови, путем количественного определени фибриногена в цитратной плазме в присутствии ингибитора фибринолиза - раствора ЭАКК который при сравнении с контрольной пробой дает возможность определить степень диссоциации фибриногена в услови х резкой активации фибриногенолиза (А.С. № 1469468, 1988) Однако, указанный способ не дает возможности количественного определени функциональной полноценности фибриногена в услови х гепаринизации плазмы крови различной этиологии, что вл етс непременным условием проведени экспериментов по имплантации искусственного сердца с применением аппарата искусственного кровообращени , а также при лечении больных

XI

QS

ч

4 Ю (Л

с различной патологией, наход щихс в клиническом состо нии.

Из известных, наиболее близким вл етс способ определени функциональной полноценности фибриногена, путем определени фибриногена В с использованием протаминсульфатного теста (Lipinski В., Worowski К,, Thrombos. Diathes. Haemorrh., 1968, № 20, p. 44-49).

Принцип: По вление в плазме сгустка при добавлении к ней протаминсульфата говорит о наличии в этой плазме непол ризующихс (заблокированных) фибрин- мономерных комплексов. Возможность образовани этих комплексов после забора крови предупреждаетс добавлением к цитрату натри ЭАКК.

Способ прин т нами в качестве прототипа . Однако этот способ недостаточно специфичен , т.к. позвол ет лишь качественно определить наличие деградированного фибриногена при развитии ДВС-синдрома средней степени т жести, крайние про влени (легкие и т желые) этого синдрома, в частности обратимые и необратимые нарушени функциональной полноценности фибриногена тест не улавливает, а также не работает в услови х гепаринизации.

Целью изобретени вл етс повышение специфичности способа.

Поставленна цель достигаетс тем, что стабилизацию крови при заборе осуществл ют 3,8%-ным раствором цитрата натри , в опытную пробу с протаминсульфатом добавл ют смесь тромбина и CaCIa, а в контрольную - ту же смесь без протаминсульфата , определение функциональной полноценности фибриногена осуществл ют путем взвешивани сгустка фибриногена и в случае увеличени его веса по сравнению с контролем делают заключение об обрати- -мом нарушении его функциональной полноценности , св занной с гепаринизацией, в случае уменьшени веса сгустка - о частичном его нарушении, а в случае полного распада его на хлопь - о полном нарушении его функциональной полноценности.

Способ осуществл етс следующим образом: кровь у экспериментального животного или больного забирают из вены, не сдавлива м гких тканей, силиконирован- ной иглой в силиконированную пробирку в 3,8%-ный раствор цитрата натри в соотношении 9:1. Центрифугируют при 1500 об/мин, в течение 7 мин дл получени плазмы, Плазму отсасывают и через 10 мин от момента вз ти крови из сосудистого русла провод т определение количества фибриногена в двух параллельных пробах, Фибриноген определ ют следующим образом: в контрольную пробирку к 0,5 мл цит- ратной плазмы добавл ют 0,1 мл 3%-ного хлористого кальци и 0,1 мл раствора тромбина , активностью 10 с. В опытную пробу к

5 такой же смеси добавл ют 0,1 - 0,6 мг протаминсульфата (количество добавл емого протаминсульфата зависит от активности гепарина в плазме крови и колеблетс от О, I до 0,6 мг на мл, из расчета 0,1 мг протамин10 сульфата на 1 ЕД активности гепарина). Обе пробирки став т на вод ную баню 37°С на 5-10 мин дл свертывани фибриногена.

Получаемые сгустки фибрина пропорциональны исходному количеству фибрино15 гена. Следовательно, дл получени количества фибриногена и выражени его в г/л получаемые сгустки фибрина быстро высушивают на фильтровальной бумаге, взвешивают на торсионных весах. Вес сгустка

0 умножаетс на 2, на коэффициент 22,2 и дел т на 100. Провод т сравнение концентрации фибриногена в контрольной и в опытной пробе с добавлением протаминсульфата .

5При нормальной функциональной полноценности фибриногена концентрации фибриногена в контрольной и опытной пробах одинаковы. При увеличении концентрации фибриногена в опытной пробе с

0 добавлением протаминсульфата от 0 до 7,1 г/л делает вывод о частичной или полной блокаде фибриногена гепарином, т.е. обратимом нарушении его функциональной полноценности. При уменьшении концен5 трации фибриногена в опытной пробе с протаминсульфатом от 10,2 г/л до 0 по сравнению с контролем - о частичном нарушении функциональной полноценности фибриногена, а при рассыпании сгустка

0 фибриногена на хлопь , соответственно, о необратимом нарушении его функциональной полноценности.

Осуществление способа занимает 20 мин от момента вз ти крови. По

5 предлагаемому способу и способу-прототипу проведено 33 исследовани в услови х эксперимента. Сравнительна диагностическа информативность и прогностическа ценность предлагаемого способа по сравне0 нию со способом-прототипом значительно выше. Способ-прототип не позвол ет дать оценки функциональной полноценности фибриногена в случа х крайних нарушений, а также при условии гепаринизации живо5 тного.

Пример 1. Теленок, 3-х мес чного возраста, весом 86 кг. Эксперимент по имплантации искусственного сердца с использованием аппарата искусственного кровообращени . Исследовани проводились на наркотизированном животном каждые 30 мин на фоне работы аппарата искусственного кровообращени , и через каждый час после отключени аппарата и нейтрализации гепарина протаминсульфатом. Способ осуществл етс путем забора крови из вены, не сдавлива м гких тканей, силико- нированной иглой в пластмассовую пробирку: 4,5 мл крови и 0,5 мл 3,8%-ного цитрата натри . Точно фиксируетс врем вз ти крови: тот час пробирку центрифугируют при 1500 об/мин в течение 7 мин дл получени плазмы. Затем в две пробирки помещают по 0,5 мл плазмы, в контрольную пробу добавл ют 0,1 мл 3%-ного раствора хлористого кальци и 0,1 мл тромбина 10 с активности; в опытную пробу - ту же смесь и 0,01 мл 1%-ного раствора протамин- сульфата (0,1 мг). Обе пробирки став т в вод ную баню при 37°С на 5 - 10 мин. дл свертывани фибриногена. После визуальной оценки полученные сгустки фибрина быстро высушивают на фильтровальной бумаге и взвешивают на торсионных весах. Вес сгустка умножают на 2, на коэффициент 22,2, согласно способу Рутберг, и дел т на 100. Провод т сравнительную оценку концентрации фибриногена в контрольной и опытной пробах, Параллельно проводитс определение растворимых фибрин мономеров по способу-прототипу. Дополнительно провод т определение спонтанного времени свертывани крови, определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) дл вы влени активности гепарина. При осуществлении за вл емого способа на фоне гепаринизации использовались различные концентрации протаминсульфата от 0,1 до 0,6 мг на 1 мл плазмы, в зависимости от активности гепарина из расчета 0,1 мг протаминсульфата на 1 ЕД активности гепарина в 1 мл плазмы.

Результаты эксперимента представлены в табл.1.

Заключение: Таким образом, использование за вл емого способа позволило на прот жении всего эксперимента проследить за количественным содержанием, сохранность функциональной полноценности фибриногена на фоне гепаринизации, а также за адекватной нейтрализацией гепарина протаминсульфатом.

П р и м е р 2. Теленок 3,5 мес цев, весом 83 кг. Клинически здоров. Эксперимент по имплантации искусственного желудочка сердца с использованием АИКа. Исследовани в процессе эксперимента проводились на тех же этапах и с использованием способа-прототипа и за вл емого способа по методике , описанной в предыдущем примере. Результаты исследований приведены в табл.2.

Животное погибло через 2 ч после от5 ключени АИКа и нейтрализации гепарина протаминсульфатом от кровотечени , св занного с резким нарушением свертывающей системы крови. Эти нарушени не представл лось возможным скорригиро0 вать.

В этом случае использование за вл емого способа дало возможность вы вить нарушени функциональной полноценности фибриногена у интактного животного, а

5 именно резко выраженную диссоциацию фибриногена с 6,6 г/л до 2,2 г/л при добавлении протаминсульфата. Никакой клинически выраженной патологии у теленка не вы вилось.

0 В процессе эксперимента про вилось полное нарушение функциональной полноценности фибриногена, которое вы вилось за вл емым способом при добавлении протаминсульфата ин витро, а затем было

5 спровоцировано ин витро при введении протаминсульфата дл нейтрализации гепарина в организме теленка после отключени аппарата искусственного кровообращени . При проведении исследований спосо0 бом-прототипом были получены отрицательные результаты.

Заключение: Таким образом, за вл емый способ может служить прогностическим тестом при серьезных оперативных

5 вмешательствах, в частностей, операци х по трансплантации сердца и имплантации искусственного сердца, которые требуют использовани аппаратов искусственного кровообращени , гепаринизации с

0 последующей нейтрализацией протаминсульфатом .

Нарушени функциональной полноценности фибриногена, вы вленные по за вл емому способу следует использовать как

5 прогностический тест при отборе животных на эксперименты, включающие использование аппарата искусственного кровообращени .

П р и м е р 3. Предлагаемый способ

0 определени функциональной полноценности фибриногена был использован акже в клинике у больных реанимационного профил .

Больна Е., 37 лет, истори болезни

5 № 3378, поступила в реанимационное отделение с диагнозом сахарный диабет I типа. Гиперосмол рный некротический гипергли- кемический синдром, сепсис.

Состо ние больной крайне т желое,

требующее интенсивной терапии. Дл определени функциональной полноценности фибриногена плазмы крови у больной не реже одного раза в сутки проводили исследование плазмы крови в соответствии с вышеописанным способом, параллельно - по способу-прототипу Наиболее информативные показатели в данном клиническом примере вы влены на 3, 10, 15 и 20 сутки наблюдений.

Сравнение результатов, полученных при использовании описываемого способа и способа-прототипа, представлены в табл.3.

Определение функциональной полноценности фибриногена по предложенному способу соответствовало клинической кар- тмне заболевани . Резкое нарушение функциональной полноценности фибриногена (3 сутки) соответствовало крайне т желому состо нию больной частичное нарушение функциональной полноценности ф| 0рино- гена (10 сутки) и/или вы вление фибриногена , заблокированного гепарином (15 сутки), демонстрируют тенденцию к восстановлению функциональной полноценности фибриногена, как прогностически положительный признак в течении заболевани . При восстановлении функциональной полноценности фибриногена (20 сутки) состо ние больной оценивалось как средней степени т жести при отсутствии рефрактерности к проводимой корригирующей терапии.

Определение комплексов растворимых фибрин-мономеров по способу-прототипу в случае грубых нарушений функциональной полноценности фибриногена (3 сутки) дало отрицательный результат Аналогична картина наблюдалась на фоне гепаринизации больной.

Заключение1 Таким образом, предлага- емый Способ позволил вы вить функциональную полноценность фибриногена в

услови х ее грубых нарушений, а также в случае проведени гепаринизации у больной . Повышение специфичности определени функциональной полноцёйнбсти

фибриногена с помощью предлагаемого способа позволили подобрать адекватную корргирующую терапию и определить прогноз заболевани как перспективный

Использование предлагаемого способа

определени функциональной полноценности фибриногена позвол ет оптимизировать услови эксперимента, проводимого с использованием искусственного кровообращени , а в услови х клинического применени вы вить наличие ДВС-синдрома на ранних стади х его развити , провести адекватную коррекцию, котора позволит предотвратить грубую полиорганную недостаточность и сократить врем пребывани

больного в реанимационном отделении

Claims

Формула изобретени Способ определени функциональной полноценности фибриногена путем вз ти

крови со стабилизирующей смесью, центрифугировани , добавлени в полученную плазму протаминсульфата, инкубации и регистрации образовавшегос сгустка, отличающийс тем, что, с целью повышени

специфичности, в плазму добавл ют смесь 0,1 - 0,6 мг/мл протаминсульфата и 0,1 мл тромбина с активностью 10 с и 0,1 мл 3 %-но- го раствора хлористого кальци , в контрольную - ту же смесь без протаминсульфата,

после инкубации взвешивают образовавшийс сгусток и в случае увеличени его веса по сравнению с контрольной пробой делают заключение об обратимом нарушении его функциональной полноценности, в

случае уменьшении его веса - о частичном нарушении, а в случае образовани хлопьев - о полном нарушении функциональной полноценности фибриногена

Таблица 1

Продолжение табл. 1

АКИ - аппарат искусственного кровообращени ; П.С. - протаминсульфат.

По способу - прототипу результаты всех параллельных исследований были отрицательными .

1На фоне наркоза

2Подключение АИКа

330 мин работы АИКа k1 ч работы АИКа

51,5ч работы АИКа

6Отключение от АИКа, введение П.С.

7Через 1 ч после отключени АИКа

8Через 2 ч после отключени АИКа

Таблица2

Отсутствие крмплек- 6,2 хлопь

сов растворимых

фибрин-мономеров

10

Вы вл етс наличие 4,0 2,2 растворимых комплексов фибрин-мономеров

Отсутствие комплексов 1,78 растворимых фибрин- мономеров

Отсутствие комплексов k,k Ц,Ь растворимых фибрин- мономеров

ТаблицаЗ

Резкое нарушение функциональной полноценности фибриногена , требуетс корригирующа терапи

Частичное нарушение Функциональной полноценности фибриногена, необходимо продолжать специальную корригирующую терапию.

Вы вл етс фибриноген , частично заблокированный гепарином (гепаринотерапи )

Функциональна полноценность фибриногена восстановлена