DE69913426T2

DE69913426T2 - Methode zum Nachweis einer APC-Resistenz und dazu geeignete Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69913426T2
Application number: DE69913426T
Authority: DE
Inventors: Patrick Van Dreden; Jean-Luc Martinoli
Original assignee: Diagnostica Stago SAS
Current assignee: Diagnostica Stago SAS
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-20
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2019-05-21
Also published as: EP0959356A1; EP0959356B1; ES2211002T3; DE69913426D1; FR2778923B1; FR2778923A1; US6114136A

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines an Faktor Va reichen Rinderserums zur Herstellung von Zusammensetzungen, die als pathologische oder zur Kalibrierung dienende Kontrollen in Verfahren zum Nachweis der Resistenz gegen das aktivierte Protein C (PCa) nützlich sind, wie auch die genannten Zusammensetzungen, deren Herstellungsverfahren und ein Verfahren zum Nachweis der Resistenz gegen das aktivierte Protein C.
Die Untersuchung von vererbten Thrombophilien hat es erlaubt, zu zeigen, dass die Resistenz gegen PCa (welche häufiger mit der englischen Abkürzung APC-R bezeichnet wird) hauptsächlich mit Mutationen auf dem Gen, welches den Faktor V kodiert, verbunden ist. Die bekannteste sogenannte "Leiden-Mutation", "Mutation R506Q" oder "Mutation ⁵⁰⁶R →⁵⁰⁶Q" bedingt auf der Ebene der Aminosäuresequenz des humanen Faktors V den Austausch eines Arg-Rests an Position 506 durch ein Gln und prädisponiert für zumeist venöse Thrombosen. Zu diesem Thema existiert heute eine bedeutende Bibliographie. Man kann sich insbesondere auf die Veröffentlichungen von Dahlbäck, B., et al. (1993), Bertina, R. M., et al. (1994), Kalafatis, M., et al. (1994), De Ronde, H., et al. (1994), Svensson, P. J., et al. (1994) und Dahlbäck et al. (1994) beziehen.
Am Ursprung von APC-R können andere Anomalien des Faktors V stehen. Es ist insbesondere möglich, dass Mutationen an Position 306 (d. h. ³⁰⁶Arg) der Aminosäuresequenz des Faktors V und/oder Va (aktivierter Faktor V) eine der möglichen anderen Ursachen von APC-R sind.
Die ersten Annäherungsversuche an APC-R sind ausgeführt worden (insbesondere gemäß einem APTT-, KCCT- oder analogen Test), um die Existenz eines Risikofaktors für Thrombosen zu ermitteln, indem die aktivierte Cephalinzeit in Gegenwart und in Abwesenheit von exogenem PCa eines Vergleichsplasmas mit jener einer zu testenden Probe verglichen wurde. Die Zugabe von PCa induziert normalerweise eine Verlängerung der Gerinnungszeit. Tatsächlich bildet PC in seiner aktivierten Form einen Komplex mit dem Protein S und nimmt so insbesondere den proteolytischen Abbau des Faktors Va vor. Dies hat zur Wirkung, dass die thrombotische Aktivität des Thrombins gebremst wird. Aus diesem Grunde wird die Gerinnung verzögert. Im Falle einer Anomalie erweist sich diese Verlängerung der Gerinnungszeit als stärker verringert als jene, die bei der gesunden Vergleichsprobe beobachtet wird (Mitchell, C. A., et al. (1987), Amer, L., et al. (1990) und Dahlbäck, B., et al. (1991).
Ein Kit zur quantitativen Bestimmung ist gegenwärtig am Markt erhältlich, welcher unter der Bezeichnung "COATEST APC-RESISTANCE" durch die Firma CHROMOGENIX (I. L.) vertrieben wird. Dieser Kit führt das in der vorerwähnten Veröffentlichung von DAHLBÄCK et al. (1991) beschriebene und in WO-A-9310261 und in der vorerwähnten Veröffentlichung von DAHLBÄCK et al. (1993), Seiten 1004–1008, veranschaulichte Verfahren aus. Dieses Verfahren umfasst das Mischen eines Volumens von zu testendem Plasma oder von Vergleichsplasma mit einem Volumen von APTT-Reagens (welches Phospholipide + einen Aktivator, wie Siliciumdioxid, Kaolin oder Glas umfasst), die Inkubation während 4 min bei 37°C, dann das Starten der Gerinnung mittels eines Volumens einer CaCl₂-Lösung einerseits oder eines gleichen Volumens einer Lösung von CaCl₂, welcher PCa zugesetzt worden ist, andererseits.
Es wurden mehrere Perfektionierungen oder Alternativen zu diesem Verfahren beschrieben, insbesondere in WO-A-9615457, WO-A-9604560 und EP-A-0711838.
In allen beschriebenen Verfahren wird die Reaktion auf PCa ausgewertet, indem die Gerinnungszeiten, die in Gegenwart und in Abwesenheit von exogenem PCa durch klassische Gerinnungsmethoden (APTT, PT oder RVVT Xa) ermittelt werden, verglichen werden. Die Ergebnisse werden im allgemeinen in Form von zwei Verhältnissen ausgedrückt:

– dem Standardverhältnis oder APC-SR mit:
– dem normalisierten Verhältnis oder nAPC-SR mit:

Gleichwohl können die erhaltenen Ergebnisse beträchtlich je nach den eingesetzten Reagenzien und Messapparaten variieren und jedes Labor muss seine eigenen Normen definieren. Aus diesem Grunde zeigen die Normalitätsbereiche und die Werte der Ausschlusswerte ("cut-off") gleichfalls eine Heterogenität. Es ist folglich wichtig, über standardisierte Kontrollen und/oder Kalibrierungsreagenzien verfügen zu können, um die Interpretation der erhaltenen Ergebnisse abhängig von den eingesetzten Methoden zu vereinfachen.
Im Falle der Gerinnungsstörungen, welche mit einer Resistenz gegen PCa verbunden sind, müssen die eingesetzten pathologischen Kontrollen oder Kalibrierungsreagenzien ähnliche Ergebnisse liefern zu jenen, die ausgehend von dem Plasma von kranken Patienten erhalten werden, d. h. Gerinnungszeiten in Gegenwart von PCa, welche geringer sind als die normale. Gleichwohl können in dem Maße, wo diese Verkürzung der Gerinnungszeit aus einer Mutation des Faktors V und nicht aus einem Fehlen oder einer fehlenden Funktionalität von diesem resultiert, die klassischen Verfahren zur Herstellung von Kontrollplasmas (wie die Adsorption oder die Verdünnung) ausgehend von normalen Plasmas nicht angewendet werden, um Plasmas, die diese Anomalie wiederspiegeln, herzustellen.
Da der Einsatz von Plasmas, die Kranken abgenommen worden sind, in einem industriellen Maßstab offensichtlich nicht denkbar ist, hat es sich folglich als nötig erwiesen, Ersatzmittel zu finden.
Eine Lösung ist beispielsweise in EP 0711839 vorgeschlagen worden, welche Plasmas beschreibt, die als Kalibrierungsreagenzien in Gerinnungstests, welche die Aktivität des Protein C/Protein S-Systems oder die APC-R auswerten, dienen können.
Diese Plasmas werden erhalten, indem zu einem normalen menschlichen Plasma Plasma zugesetzt wird, welches von Tieren stammt, insbesondere Citratplasma vom Hund oder vorzugsweise vom Kaninchen. Die Zugabe dieser Tierplasmas erzeugt eine Verkürzung der Gerinnungszeit in einem von PCa abhängigen Test proportional zu der Menge von zugesetztem nicht-menschlichem Plasma, wodurch ermöglicht wird, ein Defizit in den funktionalen Tests, welche die Aktivität des Faktors V und/oder des Protein C/Protein S-Systems untersuchen, zu simulieren. EP-0711839 gibt gleichfalls an, dass die Plasmas je nach der untersuchten Tierspezies mehr oder weniger gut geeignet sein können, ohne gleichwohl eine genaue Erklärung für diese Beobachtung zu liefern.
Die Verwendung von Plasmas von Tieren, wie sie in dieser Anmeldung empfohlen wird, bietet folglich die Möglichkeit, leicht Vergleichsproben zu erhalten, welche die Auswertung von Ergebnissen, welche ausgehend von unterschiedlichen Tests erhalten werden, vereinfachen. Gleichwohl kann sie bestimmte Nachteile je nach den Bedingungen der ausgeführten Gerinnungstests aufweisen.
So erfordert die Simulation einer APC-R die Zugabe von wenigstens 5% Plasma, wenn es sich um solches vom Kaninchen handelt, ja sogar von zwei- bis dreimal mehr in dem Falle eines anderen Tiers. Diese Zugabe zu normalem menschlichem Plasma kann einen Verdünnungseffekt erzeugen, welcher bei der Interpretation der Ergebnisse interferieren kann. Andererseits enthalten die eingesetzten tierischen Plasmas bedeutende Gehalte an den Faktoren II und VII, welche dafür bekannt sind, Faktoren von Instabilität zu sein (LEWIS, J. H., 1996). Es können folglich Probleme während der Aufbewahrung dieser Art von Reagens auftreten. Außerdem können sich für die empfohlenen Plasmas gleichfalls Liefer- oder Nachschubprobleme stellen, welche beispielsweise mit Schwierigkeiten bei der Abnahme und dem geringen Blutvolumen des Tiers (im Falle von beispielsweise Kaninchen) verbunden sind.
WO91/01497 beschreibt stabile verbesserte Gerinnungskontrollen, welche den Faktor V einsetzen. Diese Kontrollen setzen Plasmas ein, die erhöhte Konzentrationen von Faktor V und Faktor VIII sowie wenigstens ungefähr 2 Gew.-% Kohlenhydrat aufweisen. Indessen sind die beschriebenen Plasmas keine APC-R-Plasmas.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben danach gestrebt, Zusammensetzungen zu entwickeln, welche für ein Leiden-Faktor V enthaltendes Plasma und genauer ein Plasma mit einer Gerinnungszeit in Gegenwart von PCa, welche in dem für ein APC-R-Plasma definierten Bereich liegt, repräsentativ sind. Das Ziel dieser Maßnahme besteht darin, über Plasmas zu verfügen, welche das Verhalten von APC-R-Plasmas simulieren, und diese als pathologische Kontrollen dienen zu lassen, wenn das zu testen de Plasma ein APC-R-Plasma ist oder hochgradig verdächtig ist, ein solches zu sein.
Für die Herstellung eines solchen "APC-R-artigen" Plasmas sind theoretisch zwei Ansätze möglich.
Der erste besteht darin, eine Hemmung des PCa mit Hilfe von spezifischen Verbindungen zu induzieren, wodurch eine Situation erzeugt wird, in welcher der Faktor Va nicht mehr gehemmt wird.
Der zweite Ansatz besteht darin, eine Sättigung des PCa zu induzieren, d. h. eine Situation, in welcher der Faktor Va in solchen Mengen vorliegt, dass das PCa lediglich in der Lage ist, einen Teil zu spalten. Der Überschuss von Faktor Va, welcher aktiv bleibt, kann dann eine identische Gerinnungszeit zu jener eines APC-R-Plasmas induzieren.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben sich des zweiten Ansatzes angenommen. Sie haben sich folglich bemüht, eine nicht-menschliche Quelle für Faktor Va auszuwählen, die einem normalen Plasma zugesetzt werden kann, um ein APC-R-Plasma zu simulieren, ohne dass dies eine zu große Verdünnung oder eine Instabilität dieses Plasmas ebensowenig wie Interferenzen, die mit der gleichzeitigen Zufuhr von anderen Faktoren verbunden sind, bewirkt.
Die Autoren der Erfindung konnten beobachten, dass die Zugabe von sehr geringen Mengen Rinderserum, welches reich an Faktor Va ist, zu normalem menschlichem Plasma eine Verkürzung der Gerinnungszeit in Gegenwart von PCa induziert. Sie haben so pathologische Kontrollplasmas erhalten, indem sie ausgehend von Verdünnungsreihen von an Faktor Va reichem Rinderserum in normalen menschlichen Plasmas die Proben auswählten, welche eine Gerinnungszeit aufwiesen, welche in dem Bereich von jener eines APC-R-Plasmas lag. Da außerdem die Verkürzung der Gerinnungszeit des Plasmas abhängig von der zugesetzten Serummenge bis zu einer vollständigen Hemmung der Wirkung von PCa ist (Schwellenwert, welcher der minimalen Gerinnungszeit entspricht), erlauben die Arbeiten der Erfinder gleichfalls, Zusammensetzungen herzustellen, die als Kalibrierungsreagenzien für diese Art von Tests einsetzbar sind.
Außer den oben aufgeführten Vorteilen (geringe Verdünnung des Plasmas, vernachlässigbare Zufuhr von anderen Gerinnungsfaktoren und von Faktoren, die bei den Reaktionen interferieren) weist die Verwendung von an Faktor Va reichen tierischen Seren einen anderen Vorteil in Hinblick auf die Spezifität auf. Es ist tatsächlich gezeigt worden, dass der Faktor V den proteolytischen Abbau des Faktors VIII durch das PCa erhöht, sogar in Abwesenheit von Protein S, wohingegen der Faktor Va diese Cofaktor-Wirkung nicht aufweist (VARADI, K., et al., 1995). Nun liegt der Faktor V im Serum in seiner aktivierten Form vor, wohingegen er im Plasma in seiner nicht-aktivierten Form vorliegt. Die Zugabe eines Serums weist folglich bezogen auf jene eines Plasmas eine viel größere Spezifität für die Wirkung des PCa auf den Faktor Va auf und ist aus diesem Grunde für APC-R-Nachweistests besonders vorteilhaft.
Die Erfindung hat folglich die Verwendung eines an Faktor Va reichen Rinderserums zur Herstellung von Zusammensetzungen, die als pathologische oder zur Kalibrierung dienende Kontrollen in einem Verfahren zum Nachweis einer Resistenz gegen das aktivierte Protein C nützlich sind, zum Gegenstand.
Sie zielt gleichfalls auf Zusammensetzungen ab, die als pathologische oder zur Kalibrierung dienende Kontrollen für ein Verfahren zum Nachweis einer Resistenz gegen das PCa nützlich sind, welche an Faktor Va reiches Rinderserum und normales Plasma umfassen.
Die Erfindung hat außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, welche als pathologische oder zur Kalibrierung dienende Kontrollen in einem Verfahren zum Nachweis einer Resistenz gegen das PCa nützlich sind, welche mit Faktor Va vom Rind angereichtertes normales Plasma umfassen, zum Gegenstand.
Unter "normalem Plasma" versteht man ein normales Plasma oder einen Pool von normalen Plasmas.
Die Erfindung umfasst schließlich ein in vitro-Verfahren zum Nachweis einer Resistenz gegen das PCa und die Kits für deren Ausführung, welche als pathologische oder zur Kalibrierung dienende Kontrollen eine Zusammensetzung, wie oben definiert, umfassen.
Gemäß einem ersten Aspekt hat die Erfindung die Verwendung eines an Faktor Va reichen Rinderserums für die oben in Betracht gezogenen Anwendungen zum Gegenstand.
So versteht man im Rahmen der Erfindung unter "Rinderserum" ein Serum oder einen Pool von Seren, welches) vom Rind stammt oder stammen.
Tatsächlich misst man beim Rind bezogen auf das menschliche Plasma, von dem man annimmt, dass es 100% Faktor V enthält, 500% von diesem Faktor im Plasma und bis zu 2000 bis 3500% von Faktor V in seiner aktivierten Form (Faktor Va) im Serum (diese Mengen sind ausgedrückt bezogen auf eine Referenz, welche durch einen Pool von menschlichen Plasmas von gesunden Spendern gebildet wird, bei welchem der Gehalt von Faktor V zu 100% oder 1 U/ml angenommen wird, Karges, H. E., et al., (1994)).
Ein Rinderserum mit einer hohen Konzentration an Faktor Va kann so in viel geringeren Mengen eingesetzt werden, als diese bei den Plasmas nötig wären, was es erlaubt, Verdünnungsprobleme des normalen Plasmas bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu vermeiden.
Man setzt bevorzugt einen Pool von Seren ein, welcher mehr als 20 U/ml (2000%) Faktor Va und mehr bevorzugt mehr als 22 U/ml (2200%) enthält.
Solche Mengen von Faktor Va im Serum erlauben es, dieses in endgültigen Verdünnungsbereichen zwischen 1/300 und 1/1200 und bevorzugt zwischen 1/400 und 1/1000 einzusetzen.
Das eingesetzte Rinderserum wird vorteilhafterweise derart behandelt, dass die Wirkungen der Faktoren, welche die Ursache für eine Instabilität oder eine Interferenz sein können, eliminiert oder vermieden werden. Diese Faktoren sind insbesondere von Vitamin K abhängige Faktoren, wie die Faktoren II, VII, IX, X, Protein S, Protein C, Protein Z. Man eliminiert gleichfalls die Spuren von Fibrin.
Diese Faktoren können eliminiert werden, indem eine Adsorption des Serums an Bariumsulfat ausgeführt wird, wie von SOULIER, J. P., (1975) beschrieben.
Gemäß einem anderen Aspekt zielt die Erfindung auf Zusammensetzungen ab, welche als pathologische oder zur Kalibrierung dienende Kontrollen in einem Verfahren zum Nachweis einer Resistenz gegen das PCa nützlich sind, welche normales Plasma und an Faktor Va reiches Rinsderserum umfassen. Das normale Plasma ist vorzugsweise menschliches Plasma und mehr bevorzugt menschliches Citratplasma.
In einer vorteilhaften Variante umfassen die Zusammensetzungen Rinderserum, welches mehr als 20 U/ml (2000%) Faktor Va und vorzugsweise mehr als 22 U/ml (2200%) enthält. Das Serum liegt in den Zusammensetzungen in Verdünnungen vor, die von 1/300 bis 1/1200 und vorzugsweise von 1/400 bis 1/1000 gehen.
Der Serumpool wird vorzugsweise, wie oben beschrieben, durch Adsorption an Bariumsulfat und Bentonit oder ein anderes Absorptionsmittel behandelt.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können vorteilhafterweise in lyophilisierter Form vorliegen.
Die Erfindung umfasst gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung der genannten Zusammensetzungen. Diese bestehen darin, dass man eine Reihe von Verdünnungen eines Pools von an Faktor Va reichem Rinderserum, vorzugsweise von Rinderserum, welches mehr als 20 U/ml (2000%) Faktor Va und mehr bevorzugt mehr als 22 U/ml (2200%) enthält, in einem normalen Plasma oder einem Pool von normalen Plasmas, vorzugsweise menschlichen, erzeugt und man die Proben auswählt, bei denen die Gerinnungszeit in Gegenwart von PCa in dem für die Gerinnungszeit eines APC-R-Plasmas in Gegenwart von PCa definierten Intervall liegt. Nachfolgend wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen beschrieben.
1. Ausgangsmaterialien:

– Menschliches Plasma
– Salzsäure R. P.
– Natriumhydroxid R. P.
– Eingefrorenes adsorbiertes Rinderserum

2. Herstellung:
2.1 Herstellung des Serums:
Das Serum wird ausgehend von durch eine Mischung von Thrombin, Phospholipiden, Ca²⁺ geronnenem Rinderplasma hergestellt.

– das eingefrorene und vorab bei 37°C 30 min an Bariumsulfat, 10% (Gew./Vol.), (2-mal) adsorbierte Rinderserum wird aufgetaut,
– das Serum wird an Bentonit (5%/∞) 20 min adsorbiert und
– der nach einer Zentrifugation erhaltene Überstand wird filtriert.

2.2. Auswahl der Zusammensetzungen:

– es wird eine Reihe von Verdünnungen des Serums in einem Pool von normalen menschlichen Plasmas hergestellt, um endgültige Verdünnungen des Serums zwischen 1/300 und 1/1200 zu erhalten,
– es wird eine Bewegung für 5 min bei Umgebungstemperatur ausgeführt,
– die hergestellten Proben werden gemäß der Methode "STA-Staclot APC-R", wie in "A New Chronometric Assay based on the Va Dependent procoagulant activity of a snake venom for the detection of Factor V Leiden", XVI^th Congress of the ISTH – Florenz (Italien), 6.–12. Juni 1997, oder in "Automated detection of the Factor V Leiden using a new screening test: STA Staclot-APC-R", 15^th International Congress on Thrombosis-Antalya (Türkei), 15.–21. Oktober 1998, beschrieben, bezogen auf einen Pool von Referenzen (mittels STA) getestet,
– es wird die Probe, bei welcher die Gerinnungszeit in Gegenwart von PCa zwischen 60 und 90 Sekunden beträgt, was dem normalisierten Verhältnis eines APC-R-Plasmas zwischen 0,40 und 0,65 entspricht, ausgewählt.

2.3 Eine Standard-Lyophilisation wird während 48 h ausgeführt.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einem Verfahren zum Nachweis einer Resistenz gegen PCa in vitro erlaubt es, die Qualität der ausgeführten quantitativen Bestimmung zu verifizieren.
Die Erfindung hat folglich gleichfalls ein Verfahren zum Nachweis einer Resistenz gegen PCa in einem zu testenden Plasma zum Gegenstand, welches darin besteht, die bei diesem Plasma gemessene Gerinnungszeit mit der Gerinnungszeit, welche gemessen wird für erfindungsgemäße Kontrollzusammensetzungen, welche jeweils unterschiedliche Verdünnungen des an Faktor Va reichen Rinderserums aufweisen, zu vergleichen. Die bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung gemessene Gerinnungszeit, welche jener, welche bei dem zu testenden Plasma gemessen wird, am nächsten kommt, ja sogar identisch mit jener ist, wird das Niveau der Resistenz dieses Plasmas gegen PCa enthüllen, denn man kennt die Menge von Faktor Va, welche zu der Kontrollzusammensetzung hinzugesetzt worden ist, genau.
Das eingesetzte Gerinnungsverfahren kann zeitmessend bzw. chronometrisch oder chromogen sein. Es handelt sich vorzugsweise um eine chronometrische Methode, welche auf der Messung der Gerinnungszeit der zu untersuchenden Probe, zu welcher ein an Faktor V armes Plasma, ein tierisches (Faktor V-abhängiges) Gift und CaCl₂ mit oder ohne PCa hinzugesetzt worden sind, beruht. Die Ergebnisse können in Form des normalisierten Verhältnisses oder vorzugsweise als Zeit oder OD ausgedrückt werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können folglich vorteilhafterweise in die Zusammensetzung eines Kits zur Diagnose einer Resistenz gegen das aktivierte Protein C als pathologische Kontrolle Eingang finden. Sie werden vorzugsweise in lyophilisierter Form für deren Haltbarmachung vorliegen und werden im Zeitpunkt des Einsatzes mit destilliertem Wasser rekonstituiert werden.
Die Erfindung hat gleichfalls einen solchen diagnostischen Kit zum Gegenstand.
Die Erfindung wird im Lichte der nachfolgenden Beispiele, die lediglich rein zur Veranschaulichung angegeben werden, besser verstanden.
BEISPIELE:
In allen nachfolgenden Tabellen bezeichnet "–PCa", dass keinerlei Zugabe von PCa in dem Test vorgenommen worden ist, bezeichnet "+PCa", dass exogenes PCa zu dem Test hinzugefügt worden ist.
Beispiel 1: Herstellung eines Kalibrierungsreagens oder einer zur Kalibrierung dienenden Kontrolle
Die Bestimmung der Gerinnungszeit erfolgt an einem STA^®-Automaten durch eine chronometrische quantitative Bestimmung gemäß der zuvor zitierten STA-STACLOT^®-APC^®-R-Methode.
Das normale menschliche Plasma ist Citratplasma, welches ausgehend von einem Pool von 30 normalen Plasmas erhalten worden ist.
Der eingesetzte Pool von tierischem Serum ist Rinderserum, welches mehr als 22 U/ml (2200%) Faktor Va enthält.
Die Gerinnungszeiten abhängig von der Verdünnung des Serums in dem Plasma sind in der nachfolgenden Tabelle I angegeben.
Die Gerinnungszeiten (ausgedrückt in Sekunden) nehmen mit den endgültigen Verdünnungen des Serums in dem Plasma ab.
Die Verwendung eines erfindungsgemäßen Serums erlaubt folglich, Zusammensetzungen zu erhalten, welche als Kalibrierungsreagenzien oder zur Kalibrierung dienende Kontrollen nützlich sind.
Tabelle I:
Beispiel 2: Vergleich der mit der "Coatest APC-resistance"-Methode (CHROMOGENIX) und der STA-STACLOT-APC-R-Methode erhaltenen Ergebnisse
In der Tabelle II sind die Ergebnisse angegeben, welche mit einem Beispiel einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, welche als pathologische Kontrolle in der "COATEST APC-Resistance"-Methode und in der zuvor zitierten STA^®-STACLOT^®-APC-R-Methode eingesetzt worden ist, erhalten werden.
Die Tabelle II gibt an, dass die Zusammensetzungen der Erfindung mit Vorteil in einem Test zum Nachweis der Resistenz gegen das PCa eingesetzt werden können.
Tabelle II:
Beispiel 3: Intra-Assay-Reproduzierbarkeit.
Um die Intra-Assay-Reproduzierbarkeit der pathologischen Kontrollen mittels STA abzuschätzen, wurden ausgehend von drei pathologischen Kontrollzusammensetzungen 21 Bestimmungen mit dem gleichen Kit von Reagenzien, STA^® STACLOT^® APC-R, ausgeführt. Die Ergebnisse bezüglich des Variationskoeffizienten (CV) sind in der nachfolgenden Tabelle III angegeben. Sie geben an, dass der CV des normalisierten Verhältnisses nSR-APC-R oder der Zeit in Gegenwart von PCa unter 5% liegt.
Beispiel 4: Reproduzierbarkeit pro Charge
Hier werden mittels STA mit ein und derselben Charge von Reagenzien (STA^® STACLOT^® APC-R: 010) 3 Chargen von pathologischen Kontrollzusammensetzungen getestet. Jedes Plasma wird in ein und derselben Reihe (mittels 1 Flasche) zweimal getestet. Es wurden 15 unabhängige Reihen (15 Flaschen der gleichen Charge) hergestellt.
Die nachfolgende Tabelle IV zeigt, dass der Variationskoeffizient (CV) der Zeit mit PCa unter 5% liegt.
Tabelle IV:
Tabelle IV (Fortsetzung):
Beispiel 5: Reproduzierbarkeit von Tag zu Tag
Mit dem Ziel, die Reproduzierbarkeit von Tag zu Tag abzuschätzen, wurde ein und dieselbe Charge einer pathologischen Kontrolle an 10 Tagen mit der gleichen Charge von Reagenzien (STA^® STACLOT^® APC-R 010) mittels der gleichen STA getestet. Die nor malisierten Verhältnisse ergeben sich aus einer täglichen quantitativen Bestimmung des gleichen aliquotierten Pools.
Die nachfolgende Tabelle V zeigt, dass der CV der Verhältnisse oder der Zeiten in Gegenwart von PCa von Tag zu Tag unter 5% liegt.
Tabelle V:
Beispiel 6: Überlappung von Charge zu Charge
3 pathologische Kontrollen wurden mittels 1 identischen Charge von Reagenzien (STA^® STACLOT^® APC-R 010) bestimmt. Jede Probe war Gegenstand von 5 Messungen. Parallel dazu wurde der entsprechende Pool quantitativ bestimmt, um das nSR-APC-R zu bestimmen.
Die nachfolgende Tabelle VI gibt an, dass eine gute Überlappung der Chargen existiert, wobei der Zielwert 0,40–0,55 für eine pathologische Kontrolle beträgt.
Tabelle VI:
Die Analyse der mit verschiedenen Chargen von STA^® Staclot^® APC-R-Reagenzien erhaltenen Ergebnisse, welche in der folgenden Tabelle VII zusammengestellt sind, zeigt gleichfalls eine gute Überlappung zwischen den einzelnen Chargen von Reagenzien.
Die maximale Abweichung von einer Charge zur anderen liegt unter 0,04 (absoluter Wert) des nSR-RPC-R für die pathologische Kontrolle.
Tabelle VII:
Beispiel 7: Untersuchung der Stabilität
I. Aufbewahrung

– Eine beschleunigte Stabilitätsuntersuchung wurde an den pathologischen Kontrollzusammensetzungen bei 30°C während 3 + 2 Wochen ausgeführt im Vergleich zu eben diesen Kontrollen, die bei 2–8°C aufbewahrt wurden. Die Überprüfung der in der Tabelle VIII zusammengestellten Ergebnisse zeigt eine gute Haltbarmachung der Kontrollen in lyophilisierter Form (relatives Δ der Zeit + PCa über 3 Wochen < 5%).

2. Stabilität der Reagenzien:

– Es wurde die Stabilität der Kontrollen nach ihrer ersten Rekonstitution bei 4 Temperaturen untersucht:
– 2–8°C, mit einem Stöpsel verschlossene Flaschen (Untersuchung von 3 Chargen),
– 25°C, mit einem Stöpsel verschlossene Flaschen (Untersuchung von 3 Chargen), welche in den Ofen gestellt wurden,
– 15–19°C in einem STA-Gerät, offene Flaschen (Untersuchung von 3 Chargen),
– –20°C, mit einem Stöpsel verschlossene Flaschen.
– Alle Bestimmungen der Gerinnungszeiten wurden mittels STA an doppelten Proben mittels ein und derselben Charge von Reagenzien (Staclot APC-R (010)) und bezogen auf den gleichen aliquotierten Pool ausgeführt. Die Analyse der in den Tabellen IX, X, XI und XII zusammengestellten Daten erlaubt es, als Stabilität vorzuschlagen:
– Stabilität in dem Apparat: 8 h
– Stabilität bei 2–8°C: 8 h
– Stabilität bei 25°C: 6 h
– Stabilität bei –20°C: > 24 h.

Beispiel eines Kits, welcher als pathologische Kontrolle erfindungsgemäße Zusammensetzungen enthält. Zusammensetzung:

– Jeder Kasten enthält 8 Flaschen (4 normale und 4 pathologische) mit lyophilisiertem Citratplasma (1 ml nach Rekonstitution).

Beispiel für den Wert:
Jeder Kasten mit normalen Kontrollen und pathologischen APC-R-Kontrollen enthält einen Handzettel, der die folgenden Angaben umfasst: Nr. der Charge, Referenz des Kastens, Referenz des Reagens, Verfallsdatum, mittels STA^® bestimmter Wert der Gerinnungszeit dieser Reagenzien in dem System STA^® Staclot^® APC-R.
Diese Zeiten können von einer Charge zur anderen variieren, werden aber für jede Charge genau angegeben (siehe in dem Kasten enthaltener Handzettel).
Herstellung des Reagens:
Sehr genau 1 ml destilliertes Wasser in jeder Flasche bewegen. Kräftig bewegen. Die Lösung sich 1 h bei Umgebungstemperatur (18–25°C) stabilisieren lassen. Vor dem Einsatz zur Homogenisierung sanft bewegen.
Stabilität der Reagenzien:

– Lyophilisation bei 2–8°C für eine mögliche Haltbarmachung bis zu dem auf dem Kasten angegebenen Verfallsdatum.
– Rekonstitution mit destilliertem Wasser, wissend, dass die Stabilität der Chargen die folgende ist:
– 8 h im STA^® (15–19°C)
– 8 h bei 2–8°C
- 6 h bei 25°C.

Einsatzweise:
Die Kontrollplasmas werden auf identische Weise zu jener der zu testenden Plasmas eingesetzt.
REFERENZEN

– AMER, L., et al., Thromb. Res., 1990, 57, Seiten 247–258,
– BERTINA, R. M., et al., Nature, 1994, 369, Seiten 64–68,
– DAHLBÄCK, B., et al., Thromb. Haemost., 1991, 65, Zusammenfassung 39, Seite 658.
– DAHLBÄCH, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, Seiten 1004–1008
– DAHLBÄCK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, Seiten 1396–1400.
– DE RONDE, H., et al., Thromb. Haemost., 1994, 72, Seiten 880–886,
– KALAFATIS, M., et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, Seiten 31869–31880,
– KARGES, H. E., et al., Arzneim.-Forsch. (Drug Res. 44 (I), Nr. 6 (1994), S. 793–797).
– LEWIS, J. H.: Comparative Hemostasis in vertebrates, 1996, Seite 339
– MITCHELL, C. A., et al., N. Engl. J. Med., 1987, 317, Seiten 1638–1642,
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– SVENSSON, P. J., et al., N. Engl. J. Med., 1994, 330, Seiten 517–522,
– VARADI, K., et al., Thromb. Haemost., 1995, 73, Seiten 730– 731

Claims

Verwendung eines an Faktor Va reichen Rinderserums zur Herstellung von Zusammensetzungen, die als pathologische oder zur Kalibrierung dienende Kontrollen in einem Verfahren zum Nachweis einer Resistenz gegen das aktivierte Protein C (PC-a) beim Menschen nützlich sind.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum vorab derart behandelt wird, dass die Wirkungen von von Vitamin K abhängigen Faktoren beseitigt werden.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum vorab derart behandelt wird, dass die Faktoren II, VII, IX, X, Protein S, Protein C und Protein Z sowie die Spuren von Fibrin beseitigt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum vorab an Bariumsulfat und Bentonit adsorbiert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum eine Menge von Faktor Va über 20 U/ml (2000) enthält.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum eine Menge von Faktor Va über 22 U/ml (2200%) enthält.
Zusammensetzung, welche als pathologische Kontrolle in einem Verfahren zum Nachweis einer Resistenz gegen das aktivier te Protein C nützlich ist, welche normales menschliches Plasma und an Faktor Va reiches Rinderserum umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das normale menschliche Plasma menschliches Citratplasma ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum vorab derart behandelt wird, dass die Wirkungen von von Vitamin K abhängigen Faktoren beseitigt werden.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum vorab derart behandelt wird, dass die Faktoren II, VII, IX, X, Protein S, Protein C und Protein Z sowie die Spuren von Fibrin beseitigt werden.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum vorab an Bariumsulfat und Bentonit adsorbiert wird.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum eine Menge an Faktor Va über 20 U/ml (2000%) enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum eine Menge an Faktor Va über 22 U/ml (2200%) enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die endgültige Verdünnung des Serums in dem normalen menschlichen Plasma in einem Bereich zwischen 1/300 und 1/1200 liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die endgültige Verdünnung des Serums in dem normalen menschlichen Plasma zwischen 1/400 und 1/1000 liegt.
Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Reihe von Verdünnungen eines an Faktor Va reichen Rinderserums in einem normalen menschlichen Plasma erzeugt und man die Zusammensetzungen auswählt, bei denen die Gerinnungszeit in Gegenwart von PCa in dem für die Gerinnungszeit eines Plasmas, welches eine APC-R/eine Resistenz gegen PCa zeigt, in Gegenwart von PCa definierten Intervall liegt.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das normale menschliche Plasma menschliches Citratplasma ist.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Rinderserum mehr als 20 U/ml Faktor Va (2000%) enthält.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Rinderserum mehr als 22 U/ml Faktor Va (2200%) enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum vorab an Bariumsulfat und Bentonit adsorbiert wird.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 7 in einem in vitro erfolgenden Verfahren zum Nachweis einer Resistenz gegen das aktivierte Protein C beim Menschen.
Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine zeitmessende Methode handelt, bei welcher die Ergebnisse bevorzugt in Form eines normalisierten Verhältnisses oder vorzugsweise als Zeit oder OD ausgedrückt werden.
Verfahren zum Nachweis einer Resistenz gegen PCa, welches darin besteht, die Gerinnungszeit eines zu untersuchenden Plasmas mit jener von Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 7 bis 15 zu vergleichen und das Niveau der PCa-Resistenz, die von dem Plasma gezeigt wird, auszuwerten.
Kit zur Diagnose einer Resistenz gegen das aktivierte Protein C, welcher als pathologische Kontrolle wenigstens eine Zusammensetzung nach Anspruch 7 umfasst.