DE69801806T2 - Verwendung von crotalus viridis helleri venom zur bestimmung von aktiviertem protein c reaktivität - Google Patents
Verwendung von crotalus viridis helleri venom zur bestimmung von aktiviertem protein c reaktivitätInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Verwendung eines speziellen Schlangengifts, des Gifts von Crotalus viridis helleri (dieses Gift wird nachfolgend als CVH bezeichnet), auf dem Gebiet der Bestimmung der Reaktivität von aktiviertem Protein C, wobei die Bestimmung die der Aktivität von funktionellem Protein C und die der Resistenz gegen aktiviertes Protein C einschließt (das aktivierte Protein C wird hier mit APC bezeichnet und die Resistenz gegen APC wird mit APC-R bezeichnet; die anderen verwendeten Abkürzungen werden nachstehend definiert). Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Bestimmung von APC-R unter Verwendung von CVH und eines Kits zur Durchführung dieses Verfahrens.
- Durch die Untersuchung der erblichen Thrombophilie konnte gezeigt werden, dass APC- R hauptsächlich mit einer Mutation des Gens, das den Faktor V codiert, verbunden ist. Diese Mutation, genannt "Leiden-Mutation", "Mutation R506Q" oder "Mutation &sup5;&sup0;&sup6;R →&sup5;&sup0;&sup6;Q", kommt auf der Aminosäuresequenzebene des menschlichen Faktors V durch das Ersetzen der Position 506 von Arg durch Gln zum Ausdruck und begünstigt das häufigere Entstehen von venösen Thrombosen (der unteren Gliedmassen, gegebenenfalls mit Lungenembolie). Siehe insbesondere für diese Wirkung die Veröffentlichungen von R.M. BERTINA et al., Nature; 1994, 369 Seiten 64-68, von M. KALAFATIS et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, Seiten 31869-31880, von H. DE RONDE et al., Thromb. Haemost., 1994, 72 Seiten 880-886, von P.J. SVENSSON et al., N. Engl. J. Med., 1994, 330, Seiten 517-522, von B. DAHLBÄCK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90 Seiten 1004-1008 und von DAHLBÄCK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91 Seiten 1396-1400.
- Andere Anomalien des Faktors V können die Ursache für APC-R sein. Es kann insbesondere sein, dass eine Spaltung zu einem ungünstigen Zeitpunkt an Position 306 (d. h. ³&sup0;&sup6;Arg) der Aminosäuresequenz des Faktors V und/oder Va eine der anderen möglichen Ursachen für APC-R darstellt.
- Die Bestimmung der APC-R wurde anfänglich durchgeführt (insbesondere nach einem Test APTT, KCCT oder Analog), um das Vorhandensein einer thrombotischen Störung zu bestimmen, indem man die Koagulationszeit eines Nachweisplasmas, die durch die Zugabe von APC verlängert ist, mit der einer zu testenden menschlichen Plasmaprobe, der APC zugegeben wurde, vergleicht, die im Fall einer Anomalie im Vergleich zur vorhergehenden verkürzt ist.
- Siehe zu dieser Wirkung: C.A. MITCHELL et al., N. Engl. J. Med., 1987, 317. Seiten 1638-1642, L. AMER et al., Thromb. Res., 1990, 57 Seiten 247-258 und B. DAHLBÄCK et al., Thromb. Haemost., 1991, 65 Zusammenfassung 39, Seite 658.
- Der einzige zur Zeit auf dem Markt verfügbare Kit (er wird unter der Bezeichnung "COATEST APC-RESISTANCE" von der Firma CHROMOGENIX vertrieben) führt das in der Offenbahrung von B. DAHLBÄCK et al., Thromb. Haemost., 1991, 65 Zusammenfassung 39, Seite 658, beschriebene Verfahren durch, schon erwähnt und veranschaulicht in WO-A-9310261 und schon erwähnt in dem Artikel von B. DAHLBÄCK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90 Seiten 1004-1008. Dieses Verfahren umfasst die Mischung eines Volumens des zu testenden Plasmas oder des Nachweisplasmas mit einem Volumen des Reagens APTT [PL + Oberflächenaktivator (Silicium, Kaolin oder Glas)], die Inkubation für 4 Minuten bei 37ºC, anschließend die Initiation der Koagulation mittels einerseits eines Volumens einer Lösung von CaCl&sub2;, andererseits eines Volumens einer Lösung von CaCl&sub2; und APC.
- Dieses Verfahren ist unbefriedigend in dem Sinn, dass es aufgrund der Empfindlichkeit insbesondere gegen die Anwesenheit des Faktors VTII, von Heparin, PS CAC und VKA zu viele falsch-negative und falsch-positive Ergebnisse liefert. Verbesserungen wurden daher in WO-A- 9615457, WO-A-9604560 und EP-A-0711838 vorgeschlagen.
- WO-A-9615457 schlägt ein Verfahren zur Bestimmung von APC-R vor, indem man das zu testende Plasma, ein prokoagulierendes Reagens [hier der Gewebefaktor (das bevorzugte Produkt) oder RVV] und ein VdfP in Kontakt bringt, anschließend nach Inkubation die Koagulation mittels CaCl&sub2; oder CaCl&sub2; + APC initiiert, wobei die Variation der Koagulationszeit anschließend im Vergleich mit einem Nachweisplasma bestimmt wird.
- WO-A-9604560 beschreibt ein verbessertes Verfahren zum Nachweis von APC-R. Dieses Verfahren basiert auf der Verwendung eines exogenen Reagens, das den Faktor V spezifisch zu Va aktiviert, als Komplement: einer Aktivierung der Koagulation, entweder durch die Umwandlung X→Xa oder durch die Umwandlung Prothrombin→Thrombin nach einem vom Faktor V abhängigen Mechanismus.
- WO-A-9604560 empfiehlt insbesondere
- - als exogenes Reagens ein Schlangengift wie das Gift von Naja nivea zur Aktivierung von V zu. Va, und
- zur Komplementaktivierung: entweder RVV-X zur Aktivierung von X zu Xa oder ein Schlangengift (oder -giftextrakt), wie die Gifte von Pseudonaja textilis, Notechis scutatus oder Oxyuranus scutellatus, zur Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin nach einem vom Faktor V abhängigen Mechanismus.
- EP-A-0711838 empfiehlt zur Bestimmung von APC-R ein Verfahren, umfassend:
- (a) die Mischung eines zu testenden Plasmas mit einem Reagens A mit geringerem Gehalt an Faktor V, insbesondere VdfP,
- (b) die Zugabe eines Reagens B, das die Umwandlung von Faktor V zu Va direkt oder indirekt aktiviert, vor allem ein Schlangengift wie RVV (das durch seine Fraktion RVV-V die Aktivierung von V zu Va induziert und das durch seine Fraktion RVV-X die Aktivierung von X zu Xa induziert) oder das Gift von Echis carinatus (das die Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin induziert und infolgedessen auf indirekte Weise V zu Va aktiviert),
- (c) die Zugabe eines Reagens C, das den Abbau von Faktor Va erlaubt, nämlich APC [oder das Gemisch PC + Aktivator (insbesondere ACC)], und
- (d) die Zugabe von Reagenzien, die die Bestimmung der Restaktivität des Faktors Va erlauben,
- mit der Bedingung, dass das Verhältnis des Volumens der zu testenden Plasmaprobe zum Gesamtvolumen höchstens 20%, vorteilhafterweise weniger oder gleich 10%, beträgt ("wobei der Anteil des Probenvolumens am gesamten Testvolumen maximal 20%, vorzugsweise jedoch weniger oder gleich 10% beträgt", nach Patentanspruch 1, Seite 13 Zeilen 39-40 von EP-A- 0711838).
- Dieses Verfahren zeigt den Nachteil der Verwendung von Volumina von (zu testendem oder Nachweis-) Plasma, von Reagens A und von Reagens B, die alle drei verschieden sind.
- Dieser Umstand erleichtert die Messungen der Koagulationszeiten mittels vollständig automatischer Vorrichtungen nicht.
- Andererseits ist das Ziel der US-A-5342830, Thrombosen vorzubeugen, die durch die Fixierung des von Willebrand (vWF)-Faktors auf den Plättchen induziert wurden. Dabei empfiehlt es Gift von 40 Schlangen und besser gereinigte und isolierte Peptide von diesen Giften, die (i) die Fixierung von vWF auf den Plättchenrezeptoren hemmen, aber (ii) die Fixierung des Fibrinogens auf anderen Plättchenrezeptoren nicht hemmen.
- Unter diesen Giften zitiert US-A-5342830 RVV und CVH, jedoch beschreibt die Schrift weder die Verwendung von CVH zur Initiierung der Koagulation durch die Aktivierung von Faktor X zu Xa, noch legt sie dies nahe.
- Durch die schon erwähnten Verfahren von WO-A-9604560 und EP-A-0711838 können die Mehrzahl der Nachteile des Tests "COATEST APC-RESISTANCE" behoben werden. Jedoch beschreiben diese zwei Dokumente weder die Verwendung von speziellem erfindungsgemäßem Schlangengift, nämlich CVH, nahe, um die Koagulation auf der Stufe des Faktors X durch die Umwandlung X→Xa zu initiieren, noch legen sie dies nahe.
- Das einzige wirksame Verfahren zur Zeit zur Bestimmung von APC-R basiert auf der Molekularbiologie (MB). Es ist lang, beschwerlich und kostspielig und erfordert ausgearbeitetes Material und ein hoch qualifiziertes Personal. Außerdem muss seine Durchführung dem Artikel L. 145-15 des französischen Rechts Nr. 94-653 vom 29. Juli 1994 Genüge leisten, der vorschreibt, dass die schriftliche Einwilligung der Personen eingeholt, werden muss, für die eine genetische Studie unternommen wird.
- Ziel ist es, eine neue technische Lösung für die Bestimmung von APC-R zu liefern, die (i) einfach in der Durchführung, (ii) mindestens so wirksam wie die in den bereits erwähnten Dokumenten WO-A-9604560 und EP-A-0711838 betrachteten, und (iii) die auf der Initiation der Koagulation auf der Stufe des Faktor X beruht (d. h. Umwandlung X→Xa), das Interesse daran ist in WO-A-9604560 erkannt worden (siehe Seite 5 Zeilen 1-12).
- Das untersuchte Ziel liegt darin, die Empfindlichkeit zu verbessern, indem die Zahl der falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnisse verringert wird. Unter diesem Gesichtspunkt beabsichtigt man, ein Verfahren zur Bestimmung von APC-R nach klassischen Mechanismen durchzuführen, aber mit der Besonderheit, dass man ein Mittel oder neues Reagens verwendet, um die Koagulation durch Umwandlung X→Xa zu initiieren, wobei dieses Mittel oder Reagens die Empfindlichkeit verbessert.
- Die neue technische Lösung gemäß der Erfindung beruht auf der Wahl eines speziellen Aktivators, um die Koagulation auf der Stufe des Faktor X (d. h. X→Xa) zu initiieren. Dieser spezielle Aktivator ist ein Schlangengift, nämlich CVH.
- Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung empfiehlt man eine neue Verwendung von Schlangengift zur Auslösung der Koagulation durch Aktivierung des Faktor X zu Xa zur Bestimmung der Reaktivität von aktiviertem Protein C, insbesondere der funktionellen Aktivität von Protein C (PC), eines zu testenden menschlichen Plasmas, wobei die Verwendung dadurch gekennzeichnet ist, dass Crotalus viridis helleri-Gift in Gegenwart von Ca²&spplus; als die die Koagulation initiierende Substanz auf der Stufe des Faktors X verwendet wird, wobei das Gift selektiv X zu Xa aktiviert, unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit anderer Koagulationsfaktoren.
- Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung empfiehlt man ein neues Verfahren zur Bestimmung der APC-R einer zu testenden menschlichen Plasmaprobe, wobei das Verfahren die Koagulation auf der Stufe des Faktors X mittels eines Schlangengifts in der Gegenwart (i) von Ca²&spplus; oder (ii) einem Gemisch aus Ca²&spplus; und exogenem APC initiiert, und anschließend die Bestimmung der Koagulationszeit (i) in Abwesenheit von APC bzw. (ii) in Anwesenheit von APC in Bezug auf normales Plasma, umfassend die Schritte bestehend aus
- (1.) Inkontaktbringen
- (a) einer zu testenden menschlichen Plasmaprobe,
- (b) eines Reagens mit Faktor V-Mangel (VdfR) als Produkt, das die Mehrzahl der (bevorzugt alle) Koagulationsfaktoren außer dem Faktor V zur Verfügung stellt,
- und
- (c) CVH als spezifisch X zu Xa aktivierendes Produkt,
- und Inkubieren des erhaltenen Gemisches für mindestens 1 Minute bei einer Temperatur zwischen 10 und 45ºC, bevorzugt für 3 bis 5 Minuten bei einer Temperatur von 35 bis 40ºC und stärker bevorzugt für 4 Minuten bei 37ºC;
- (2.) Einbringen von (i) Ca²&spplus; oder, bzw., (ii) Ca²&spplus; + exogenem APC in das Gemisch;
- (3.) Bestimmen der Koagulationszeit (i) in Abwesenheit von APC bzw. (ii) in Anwesenheit von APC;
- (4.) Wiederholen der Schritte (1.) bis (3.), wobei in Schritt (1.) die zu testende menschliche Plasmaprobe durch normales Plasma als Nachweis ersetzt wird; und
- (5.) Bestimmen der APC-R durch Vergleich der in den Schritten (3.) und (4.) erhaltenen Werte.
- Gemäß einem dritten Gesichtspunkt der Erfindung empfiehlt man eine Variante dieses Verfahrens, die direkt durchgeführt werden kann, ohne dass es einerseits notwendig ist, einen Vergleich mit einem Nachweisplasma (normales Plasma oder Pool normalen Plasmas) aufzustellen und andererseits eine Bestimmung in Abwesenheit der Zugabe von APC durchzuführen. Diese Variante umfasst einerseits die Schritte (1.), (2., ii) und (3., ii) des Hauptverfahrens, anschließend andererseits die Berechnung der APC-R durch Vergleich mit der in Schritt (3., ii) erhaltenen Koagulationszeit (T) mit einer Referenzkoagulationszeit (To), die experimentell bestimmt wurde (und die einen statistischen Wert von etwa 110 s besitzt), wobei T < To im Allgemeinen anzeigt, dass die zu testende menschliche Plasmaprobe eine Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C aufweist, und
- T > To im Allgemeinen anzeigt, dass die zu testende menschliche Plasmaprobe keine Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C aufweist.
- Diese Variante ist vorteilhaft in dem Sinn, dass die Bestimmung der APC-R viel einfacher, weniger kostspielig und einfacher zu automatisieren ist als das vorstehend beschriebene Hauptverfahren.
- Gemäß einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung empfiehlt man einen Kit, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst:
- - ein erstes Reagens, das ein Plasma mit Faktor V-Mangel ist,
- - ein zweites Reagens, das CVH ist, und
- - ein drittes Reagens, das APC in calciumhaltigem Medium ist.
- Der Einfachheit halber verwendet man in der vorliegenden Beschreibung die folgenden Abkürzungen und Akronyme.
- ACC Gift von Agkistrodon contortrix, wobei dieses Gift ein Produkt ist, das selektiv PC zu APC aktiviert,
- APC aktiviertes Protein C
- APC-R Resistenz gegen aktiviertes Protein C (wenn von "Plasma APC-R" die Rede ist, ist gemeint, dass das Plasma resistent gegen APC ist)
- APTT Zeit teilweise aktivierten Thromboplastins (im Englischen: "activated partial thromboplastin time")
- CAC zirkulierendes Antikoagulans
- CVH Gift von Crotalus viridis helleri
- KCCT Cephalin-Kaolin-Zeit (im Englischen: "kaolin-cephalin clotting time")
- MB Test mittels der Molekularbiologie, der eine Nucleinsäuresonde ("probe") verwendet, die für ein Peptidfragment von etwa zehn Aminosäuren, umfassend &sup5;&sup0;&sup6;Q, codiert, und der Nachweis der Mutation durch Hybridisierung der Sonde nach Amplifikation (durch PCR) des Bereiches der entsprechenden DNA
- MB+ bezeichnet ein Plasma, in dem der Faktor V die Mutation R506Q enthält (d. h. "positives" Plasma nach dem MB-Test)
- MB- bezeichnet ein Plasma, in dem der Faktor V nicht die Mutation R506Q enthält (d. h. "negatives" Plasma nach dem MB-Test)
- OKB Puffer Owren-Koller, es handelt sich um einen Veronalpuffer
- PB Puffer Prionex (Puffer, enthaltend die polypeptidische Fraktion, die aus Schweinekollagen gereinigt wurde)
- PC Protein C
- PCR Polymerasekettenreaktion (im Englischen: "polymerase chain reaction")
- PL Phospholipide
- PS Protein S
- RVV Gift der Russelviper (Vipera russeli), wobei dieses Gift den Faktor V zu Va und den Faktor X zu Xa aktiviert
- RVV-V gereinigte Fraktion von RVV, die den Faktor V zu Va aktiviert
- RVV-X gereinigte Fraktion von RVV, die den Faktor X zu Xa aktiviert
- VdfP Plasma mit Faktor V-Mangel
- VdfR Reagens mit Faktor V-Mangel
- VKA Vitamin K-Antagonist
- In der Figur im Anhang:
- - zeigt die Fig. 1 die Variation des normalisierten Verhältnisses n-APC-R-RS, das nachstehend definiert und auf der Ordinate dargestellt ist, als Funktion der Konzentration (% v/v) des Plasmas (Pool des Nachweisplasmas oder Plasma APC-R) in einem Gemisch Plasma + VdfP, wobei die Konzentration auf der Abszisse dargestellt ist; und
- - die Fig. 2 zeigt die Variation dieses normalisierten Verhältnisses n-APC-R-RS (auf der Ordinate) als Funktion der Konzentration (% v/v) eines Plasmas APC-R in einem Gemisch Plasma APC-R + Pool des Nachweisplasmas (auf der Abszisse).
- Die erfindungsgemäße Verwendung des speziellen Gifts, nämlich CVH, erlaubt die Bestimmung der Reaktivität von APC, insbesondere der funktionellen Aktivität von PC einerseits und APC-R andererseits. Selbstverständlich ist die Bestimmung von APC-R wichtiger in diagnostischer Hinsicht als die der funktionellen Aktivität von PC. Infolgedessen ist die funktionelle Aktivität von PC kein Ersatz im Vergleich zur Bestimmung von APC-R, die es erlaubt, das Thromboserisiko des getesteten Patienten zu bestimmen.
- CVH ist ein auf dem Markt kommerziell verfügbares Produkt. Man kann es in gereinigter und lyophilisierter Form bei der Firma SIGMA erhalten. Vor der Erfindung wurde dieses Gift im Wesentlichen zur Herstellung von Antiserum gegen Bisse von Crotalus viridis helleri verwendet. In der Praxis wird lyophilisiertes CVH vor der Verwendung mit PB bis zu einer Konzentration von 0,10 bis 0,15 ug/ml verdünnt (bevorzugt bis zu einer Konzentration von 0,12 ug/ml, die bei der Durchführung des Verfahrens einer Endkonzentration von 0,03 ug/ml entspricht).
- Das Reagens VdfR ist im Wesentlichen ein Plasma VdfP. Unter dem Ausdruck "Faktor V-Mangel" versteht man ein Reagens (VdfR) oder ein Plasma (VdfP), das entweder sehr arm an Faktor V ist oder keinen Faktor V besitzt. Erfindungsgemäß fungieren VdfR oder VdfP als Plasmasubstrat, das synthetischen, tierischen oder menschlichen Ursprungs sein kann. Vorteilhafterweise verwendet man VdfP, das arm an Faktor V ist und durch Immundepletion erhalten wurde. Um jegliche Wechselwirkung mit den Antiphospholipiden zu vermeiden, insbesondere denen von Lupus, wird empfohlen VdfR oder VdfP mit PL anzureichern.
- Gemäß einer speziellen Ausführungsform verwendet man in Schritt (1.) eine zu testende menschliche Plasmaprobe, die durch Behandlung mit Trinatriumcitrat (bei der Entnahme), Zentrifugation bei 3500 g für etwa 15 Minuten und Verdünnung mit OKB erhalten wird. Das als Nachweis in Schritt (4.) verwendete normale Plasma wird unter den gleichen Bedingungen erhalten.
- Praktischerweise bestimmt man die Empfindlichkeit gegen APC unter Berücksichtigung der Formeln von APC-R-RS und n-APC-R-RS, die in dem bereits erwähnten Artikel von H. DE RONDE et al. vorgeschlagen werden, in Schritt (3.) und in Schritt (4.) für das zu testende menschliche Plasma einerseits und für das Nachweisplasma andererseits, wobei die Empfindlichkeit das Verhältnis (genannt APC-R-SR) der Koagulationszeit in Anwesenheit von APC zu der Koagulationszeit in Abwesenheit von APC ist:
- APC-R-SR = Koagulationszeit in Anwesenheit von APC/Koagulationszeit in Abwesenheit von APC
- und in Schritt (5.) bestimmt man APC-R als das normalisierte Verhältnis (genannt n-APC-R-SR) der Empfindlichkeit gegen APC der zu testenden menschlichen Plasmaprobe zur Empfindlichkeit gegen APC des normalen Nachweisplasmas:
- n-APC-R-SR = (APC-R-SR)Probe/(APC-R-SR)Nachweisplasma
- Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zeigt ein Wert dieses normalisierten Verhältnisses n-APC-R-SR > 0,80 an, dass die zu testende menschliche Plasmaprobe im Allgemeinen keine Resistenz gegen aktiviertes Protein C aufweist, und ein Wert dieses normalisierten Verhältnisses n-APC-R-SR < 0,80 zeigt, dass die zu testende Plasmaprobe im Allgemeinen eine Resistenz gegen aktiviertes Protein C aufweist. Das als Nachweis verwendete normale Plasma ist vorteilhafterweise ein Pool normalen menschlichen Plasmas.
- Wenn man einen Wert des normalisierten Verhältnisses im unbestimmten Bereich (0,72 ≤ n-APC-R-RS ≤ 0,90) für eine Konzentration x (% v/v) einer Plasmaprobe in einem Gemisch von x (Plasma) + y (VdfP) oder x + y = = 100% hat, wird empfohlen, die Konzentration des Plasmas zu erhöhen, das heißt umgekehrt die Konzentration von VdfP im Gemisch x + y zu verringern. Man erhält so einen Wert n-AIPC-R-RS, der außerhalb des unbestimmten Bereiches liegt (siehe nachstehend Fig. 1).
- Vorteilhafterweise verwendet man erfindungsgemäß die gleichen Volumina für jedes verwendete Reagens, nämlich: das zu testende menschliche Plasma (bevorzugt in einer Verdünnung von 1/10 in OKB), VdfR (oder VdfP), die Lösung von CaCl&sub2;, die Lösung von CaCl&sub2; + APC, das Nachweisplasma (oder Pool von Nachweisplasmas) und die Lösung (oder Verdünnung) von CVH (bevorzugt CVH in Wasser enthaltend 1 Vol.-% PB).
- Die Bestimmung von APC-R in den Schritten (3.), (4.) und (5.) ist im Stand der Technik bekannt und entspricht einer Umwandlungsrate eines "Substrats". Die Koagulationszeit wird entweder direkt (insbesondere mittels eines Koagulometers) durch Kennzeichnung des Anfangsmomentes der Koagulation, wobei das Substrat dann VdfP ist, oder indirekt gemessen (insbesondere mittels eines Spektrometers) durch Kennzeichnung des Momentes, der der Bildung von im Reaktionssystem erzeugten Thrombins entspricht, wobei das Substrat dann Prothrombin ist. Das bevorzugte erfindungsgemäße Substrat der Erfindung ist VdfP.
- Der erfindungsgemäße Kit oder die erfindungsgemäße Dosierungsvorrichtung enthält vorteilhafterweise ein mit PL angereichertes VdfP. Dieser Kit kann CaCl&sub2; zur Herstellung der wässrigen Lösung von CaCl&sub2; in der erforderlichen Konzentration, um die die Koagulation induzierenden Ca²&spplus;-Ionen zu liefern, enthalten. Das Chronometer wird beim Einbringen der Ca²&spplus;-Ionen gestartet.
- Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens:
- - in Schritt (1.) In Kontakt bringen
- (A) der zu testenden menschlichen Plasmaprobe, verdünnt, insbesondere mittels OKB, in einer Konzentration höher oder gleich 1/20 v/v, bevorzugt in einer Konzentration von 1/10 v/v,
- (B) eines menschlichen Plasmas mit Faktor V-Mangel und mit PL angereichert als Reagens VdfR und
- (C) des Giftes von Crotalus viridis helleri,
- und Inkubieren für 4 Minuten bei 37ºC;
- - in Schritt (2.) Einbringen von (i) Ca²&spplus; oder, bzw., (ii) des Gemisches Ca²&spplus; exogenes APC in das so inkubierte Gemisch;
- - in Schritt (3.) Bestimmen der Empfindlichkeit gegen APC des zu testenden menschlichen Plasmas;
- - in Schritt (4.) Wiederholen aller Schritte (1.) bis (3.), wobei in Schritt (1.) das zu testende menschliche Plasma durch ein normales menschliches Plasma ersetzt wird, um die Empfindlichkeit des normalen menschlichen Plasmas gegen APC zu bestimmen; und
- - in Schritt (5.) Berechnen der APC-R mittels des normalisierten Verhältnisses n-APC-R-SR, wobei ein Wert dieses normalisierten Verhältnisses n-APC-R-SR > 0,80 (bevorzugt n-APC-R- SR > 0,90) anzeigt, dass die zu testende menschliche Plasmaprobe keine Resistenz gegen aktiviertes Protein C aufweist, und ein Wert dieses normalisierten Verhältnisses n-APC-R-SR < 0,80 (bevorzugt n-APC-R-SR < 0,72) anzeigt, dass die zu testende menschliche Plasmaprobe eine Resistenz gegen aktiviertes Protein C aufweist, und wobei das als Nachweis verwendete normale Plasma vorteilhafterweise ein Pool normalen menschlichen Plasmas ist.
- Wie nachstehend gezeigt, ist das erfindungsgemäße Verfahren spezifisch und wirkungsvoll. Es liefert Variationen "innerhalb des Tests", die niedriger als 3% sind, und Variationen "zwischen den Tests", die niedriger als 5% sind. Außerdem ist es unempfindlich gegen intrinsische Faktoren, gegen normales Heparin (Molekulargewicht: 12000 Dalton), gegen fraktionierte Heparine von geringem Molekulargewicht, gegen PS, gegen Faktor VIII, gegen CAC, gegen VKA und gegen die Mutation 20210A des Prothrombins.
- Die Variante dieses Verfahrens, die in Anbetracht ihrer Einfachheit der Durchführung, ihrer geringeren Kosten und ihrer Eignung leichter automatisierbar mit den aktuellen Geräten zu sein, empfohlen wird, stellt ein verbessertes Verfahren dar.
- Gemäß dieser Variante wird also ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung der APC-R einer zu testenden menschlichen Plasmaprobe empfohlen, wobei das Verfahren die Initiierung der Koagulation mittels eines Schlangengiftes auf der Stufe des Faktors X in Gegenwart eines Gemisches aus Ca²&spplus; und exogenem APC und nachfolgend das Messen der Koagulationszeit (T) umfasst, umfassend die Schritte bestehend aus
- (1a) Inkontaktbringen
- (a) einer zu testenden menschlichen Plasmaprobe,
- (b) eines Reagens mit Faktor V-Mangel (VdfR) als Produkt, das die Mehrzahl der (vorzugsweise alle) Koagulationsfaktoren außer dem Faktor V zur Verfügung stellt, und
- (c) CVH als spezifisch X zu Xa aktivierendes Produkt,
- und Inkubieren des erhaltenen Gemisches für mindestens 1 Minute bei einer Temperatur zwischen 10 und 45ºC, vorzugsweise für 3 bis 5 Minuten bei einer Temperatur von 35 bis 40ºC, und stärker bevorzugt für 4 Minuten bei 37ºC;
- (2a) Einbringen von Ca²&spplus; und exogenem APC in das inkubierte Gemisch;
- (3a) Messen der Koagulationszeit (T); und
- (4a) Bestimmen der APC-R durch Vergleich der gemessenen Koagulationszeit (T) mit einer experimentell bestimmten Referenzkoagulationszeit (To) mit einem statistischen Wert von ungefähr 110 s,
- wobei T < To anzeigt, dass die zu testende menschliche Plasmaprobe eine Resistenz gegen aktiviertes Protein C aufweist, und
- T > To anzeigt, dass die zu testende menschliche Plasmaprobe keine Resistenz gegen aktiviertes Protein C aufweist.
- Die obenstehend für die Schritte (1.), (2., ii) und (3., ii) angegebenen Durchführungsarten gelten selbstverständlich auch für die Schritte (1a), (2a) und (3a) der Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens.
- Von einem praktischen Gesichtspunkt aus liegt To in einem Intervall von 20 s (110 ± 10 s). So ist das getestete Plasma normal, wenn T größer als 120 s ist, und wenn T kleiner als 100 s ist, ist das getestete Plasma ganz sicher APC-R.
- Es gibt in der Tat eine unbestimmte Zeitspanne [(im Englischen: "grey zone"), die deutlich der bereits erwähnten Zeitspanne 0,72 ≤ n-APC-R-RS ≤ 0,90 des Hauptverfahrens entspricht], wenn 100 s ≤ T ≤ 120 s. Wenn die gemessene Koagulationszeit in dieser unbestimmten Zeitspanne (100 s ≤ T ≤ 120 s) liegt, wird empfohlen, (i) das Hauptverfahren mit einer höheren Plasmakonzentration (wie vorstehend angezeigt) durchzuführen, oder (ii) eine MB-Studie durchzuführen, die ein eindeutiges Ergebnis liefert.
- Der Wert To = 110 s und vor allem die unbestimmte Zeitspanne 100 s ≤ T ≤ 120 s wurden experimentell mit mehreren bekannten menschlichen Plasmaproben [normale Plasmas (MB-) und APC-R-Plasmas (MB+)] durch Inkontaktbringen mit 1 Volumen von jedem zu untersuchenden Plasma (vorher auf 1/10 in OKB verdünnt), 1 Volumen von mit PL angereichertem VdfP und 1 Volumen CVH bei 37ºC für 4 Minuten, Einbringen von 1 Volumen einer Lösung von APC enthaltend Ca²&spplus; in das resultierende Gemisch und nachfolgend Messen von T bestimmt. Für mehr Details siehe die Beispiele 13 und 14 nachstehend.
- Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden durch die Erläuterungen in den folgenden Durchführungsbeispielen und Versuchen deutlich. Die Gesamtheit dieser Bestandteile ist nicht einschränkend, sondern sie dient der Veranschaulichung. Zur Information, die Beispiele 1-3 betreffen den Erhalt verschiedener Produkte und Reagenzien, die gemäß der Erfindung eingesetzt werden, die Beispiele 4-12 behandeln die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und die Beispiele 13-14 beziehen sich auf die Variante dieses Verfahrens.
- Die Entnahme wird mit einer Lösung von Trinatriumcitrat 0,109 M, mit 1 Volumen Citrat für 9 Volumen Blut durchgeführt. Die Probe wird anschließend bei 3500 g für 15 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Es wird empfohlen, eine doppelte Zentrifugation bei 4ºC durchzuführen, um mögliche Plättchen in der Probe zu entfernen. Die Trennung und die Sammlung des Plasmas müssen so schnell wie möglich nach der Entnahme durchgeführt werden.
- Nach Abgießen kann das Plasma aufbewahrt werden bei:
- 2-8ºC für 8 h,
- 15-19ºC für 8 h, und
- -20ºC für 1 Monat.
- Beim Auftauen muss das Plasma bei 37ºC im Thermostat-Wasserbad für mindestens 10 Minuten aufgetaut werden und anschließend vor dem Gebrauch homogenisiert werden. Das Wiedereinfrieren eines Plasmas sollte nicht erfolgen.
- Man geht wie in Beispiel 1 beschrieben vor.
- R1 ist ein menschliches lyophilisiertes Plasma, immundepletiert an Faktor V und angereichert mit PL. Das lyophilisierte Produkt wird in eine wässrige Zusammensetzung mit 2 ml destilliertem Wasser umgewandelt. Man homogenisiert die resultierende Lösung vor Gebrauch bei Umgebungstemperatur (18-25ºC).
- Diese Lösung ist stabil bei:
- 18-250C für 6 h,
- 15-19ºC im Gerät, das unter dem kommerziellen Namen "STA" von der Firma DIAGNOSTICA STAGO verkauft wird, für 38 h
- 2-8ºC für 26 h, und
- -20ºC für 1 Monat.
- R2 ist das Lyophilisat von CVH. Dieses lyophilisierte Produkt wird in eine wässrige Zusammensetzung mit 2 ml destilliertem Wasser (das vorteilhafterweise 1 Vol.-% PB enthalten kann) umgewandelt. Man homogenisiert die resultierende Zusammensetzung vor Gebrauch bei Umgebungstemperatur (18-25ºC).
- Diese Zusammensetzung ist stabil bei:
- 18-25ºC für 6 h,
- 15-19ºC im Gerät "STA" für 38 h,
- 2-8ºC für 26 h, und
- -20ºC für 1 Monat.
- R3 ist das lyophilisierte menschliche aktivierte Protein C in calciumhaltigem Milieu. Das Lyophilisat wird in 1 ml destilliertes Wasser gegeben. Man homogenisiert die resultierende Lösung vor Gebrauch bei Umgebungstemperatur (18-25ºC).
- Diese Lösung ist stabil bei:
- 18-25ºC für 6 h,
- 15-19ºC im Gerät "STA" für 38 h,
- 2-8ºC für 26 h, und
- -20ºC für 1 Monat.
- Man verwendet (außer bei gegensätzlicher Anweisung) gleiche Volumina der verschiedenen Produkte und Reagenzien (erhalten gemäß den Beispielen 1-3 vorstehend), die im Verfahren zur erfindungsgemäßen Bestimmung eingesetzt werden. Die Volumina liegen zwischen 5 ul und 50 ul. Die folgenden Durchführungsarten betreffen die Durchführung mit dem bereits erwähnten Gerät "STA"; man verwendet folglich:
- 50 ul zu testende menschliche Plasmaprobe (oder ein Pool normalen menschlichen Plasmas), verdünnt auf 1/10 in OKB,
- 50 ul R1 (d. h. VdfP angereichert mit PL),
- 50 ul R2 (d. h. CVH), und
- 50 ul CaCl&sub2; in wässriger Lösung oder R3 (d. h. APC + Ca²&spplus;).
- Das zu testende menschliche Plasma oder der Pool normalen Plasmas, VdfP angereichert mit PL und CVH werden mittels des Gerätes "STA" in Kontakt gebracht. Das resultierende Gemisch wird für 4 Minuten bei 37ºC inkubiert.
- Die CaCl&sub2;-Lösung oder das Gemisch CaCl&sub2; + APC (d. h. R3) werden in das Gemisch eingebracht, nachdem sie bei 37ºC vorgewärmt wurden. Das "STA" bestimmt die Koagulationszeit der zu testenden Probe und des Nachweispools in Anwesenheit und Abwesenheit von APC.
- Die erhaltenen Ergebnisse werden direkt von dem Gerät in Form des bereits erwähnten normalisierten Vergleichs ausgedrückt: n-APC-R-RS.
- Ausgehend von 30 Beuteln Plasma, geliefert vom Bluttransfusionszentrum, bestimmt man (drei Bestimmungen pro Test) den Normalwert des in der Funktion normalisierten Verhältnisses eines normalen Pools von 25 Männern und 25 Frauen sowie den pathologischen Bereich von Proben von 15 Plasmas MB+ (APC-R der Plasmas Homozygoter und Heterozygoter). Der Normalwert für die Plasmas MB- liegt so, dass n-APC-R-RS ≥ 0,80 mit dem Gerät "STA" beträgt.
- Ausgehend von 2 APC-R von Plasmas Homozygoter (MB+), genannt APC-R 1 und APC-R 2, und einem normalen Pool als Nachweis (MB-), wurden 21 Bestimmungen dreifach durchgeführt. Die den Variationskoeffizienten betreffenden Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I dargestellt. Sie zeigen, dass der Variationskoeffizient des normalisierten Verhältnisses n-APC-R-RS kleiner als 3% ist. TABELLE I
- Um die Reproduzierbarkeit von Tag zu Tag zu bestimmen, wurden ein normales eingefrorenes Plasma (MB-) und 2 pathologische Plasmas (MB+) - eines gefroren und das andere lyophilisiert - aliquotiert; und anschließend wurden für 10 Tage mit den gleichen Proben Reagenzien im gleichen Gerät "STA" getestet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II niedergelegt. Sie zeigen, dass der Variationskoeffizient von n-APC-R-RS von Tag zu Tag kleiner als 5% ist. TABELLE II
- M: Mittelwert von 10 Tests pro Plasma
- SD: Standardabweichung in Bezug auf den Mittelwert
- CV%: Variationskoeffizient
- Ein aliquotiertes und gefrorenes normales Plasma MB- und ein aliquotiertes und gefrorenes pathologisches Plasma MB+ (APC-R eines Plasmas Heterozygoter) wurden mit dem Gerät "STA" getestet. Sofort nach dem Auftauen wurde jedes Plasma fünfmal in einer gleichen Reihe (ein Fläschchen) getestet, 15 unabhängige Reihen (15 Fläschchen der gleichen Probe) wurden durchgeführt. Die in Tabelle III dargestellten Ergebnisse zeigen, dass der Variationskoeffizient kleiner als 5% ist. TABELLE III
- T: Koagulationszeit (in Sekunden)
- M: Mittelwert der Tests
- SD: Standardabweichung in Bezug auf den Mittelwert
- CV: Variationskoeffizient (ausgedrückt in %)
- 2 pathologische Plasmas, mit der Bezeichnung MB+ 1 und MB+ 2 (homozygote Plasmas), und ein normales Plasma MB- wurden aufgetaut und mit 3 verschiedenen Proben der gleichen Reagenzien (Mittelwert von 5 Messungen pro Test) untersucht. Ein zweites zum vorhergehenden identisches normales Plasma wurde auf gleiche Weise parallel getestet, um das Verhältnis n-APC-R-RS zu bestimmen. Die in Tabelle IV dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren Probe für Probe reproduzierbar ist. TABELLE IV
- Δ max: maximale Variation
- Nach Tabelle IV ist Δ max (als absoluter Wert) kleiner oder gleich 0,05 für die Plasmas MB+ und kleiner oder gleich 0,10 für das Plasma MB-.
- Um die Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens bezüglich Faktor V zu beweisen, wurde eine Verdünnungsreihe eines normalen Pools oder einer Plasma-APC-R in einem VdfP einerseits und eine Verdünnungsreihe der gleichen Plasma-APC-R in dem normalen Pool andererseits durchgeführt.
- Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt.
- Die Kurve A der Fig. 1 zeigt die Variation des normalisierten Verhältnisses n-APC-R- SR als Funktion der Konzentration (in Vol.-%) des Pools normalen Plasmas im Gemisch (Pool normalen Plasmas) + (VdfP).
- Die Kurve B der Fig. 1 zeigt die Variation des normalisierten Verhältnisses n-APC-R- SR als Funktion der Konzentration (in Vol.-%) der Plasma-APC-R im Gemisch (Plasma-APC-R) + (VdfP).
- Die Kurve C der Fig. 2 zeigt die Variation des normalisierten Verhältnisses n-APC-R- SR als Funktion der Konzentration (in Vol.-%) der gleichen Plasma-APC-R im Gemisch (Plasma-APC-R) + (Pool normalen Plasmas).
- Die Kurven A und B beweisen, dass:
- - was die Verdünnung der Plasma-APC-R in einem VdfP betrifft, ein "positives" Ergebnis erhalten wird (n-APC-R-SR ≤ 0,71), wenn die Plasma-APC-R eine Konzentration von 10 bis 100 Vol.-% besitzt; und,
- - was die Verdünnung des Pools normalen Plasmas in einem VdfP betrifft, ein "negatives" Ergebnis erhalten wird (n-APC-R-SR ≥ 0,98), wenn der Pool normalen Plasmas eine Konzentration von 10 bis 100 VoL-% besitzt.
- Folglich zeigen die Kurven A und B der Fig. 1 klar die Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens, was die Leiden-Mutation des Faktor V betrifft.
- Diese Spezifität wird durch die Kurve C der Fig. 2 bestätigt, die zeigt, dass die Verdünnung der Plasma-APC-R im Pool normalen Plasmas ab einer Konzentration von 20 Vol.-% der Plasma-APC-R im Gemisch (APC-R) + (Pool normalen Plasmas) zu einem "positiven" Ergebnis (n-APC-R-SR < 0,80) führt.
- Zum Vergleich wurden im Gerät "STA" 180 Plasmas getestet, nämlich 60 MB- und 120 MB+ (60 Homozygote und 60 Heterozygote, genannt MB+ A beziehungsweise MB+ B), indem als Initiator der Koagulation entweder RVV-X gemäß dem Inhalt von EP-A-0711838 [mit einem Volumenverhältnis VdfP/(VdfP + zu testendes Plasma) = 75%] oder CVH gemäß der Erfindung [mit einem Volumenverhältnis VdfP/(VdfP + zu testendes Plasma) = 50%] verwendet wird. Die in der Tabelle V dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine bessere Empfindlichkeit liefert. In diesem vergleichenden Test wurde ein zweiter Pool von 50 normalen Plasmas MB- als Nachweis verwendet. TABELLE V Zahl getesteter Plasmas
- Geleitet von der Lehre der WO-A-96004560 [nämlich ein einziges Gift (RVV-X) zur Aktivierung X→Xa] wurde RVV-X mit CVH in der Bestimmung der APC-R verglichen. Dazu wurden im bereits erwähnten Gerät "STA" zwei pathologische Plasmas (genannt APC-R 1 beziehungsweise APC-R 2), verdünnt auf 1/10 in OKB, gegen einen Pool normalen Plasmas getestet, unter anderem mit zwei Kontrollen: ein Plasma MB- und ein Plasma MB+. Die erhaltenen Ergebnisse, dargestellt in der nachstehenden Tabelle VI, legen offen, dass CVH besser als RVV-X differenziert. Denn für die Plasmas APC-R 1 und APC-R 2 liefert RVV-X ein normalisiertes Verhältnis n-APC-R-SR innerhalb der unbestimmten Zeitspanne 0,72 n-APC-R- SR ≤ 0,90 (0,72 für APC-R 1; 0,77 für AIPC-R 2), während CVH ein normalisiertes Verhältnis (0,57 für APC-R 1; 0,58 für APC-R 2) Liefert, das klar kleiner als der minimale Wert (0,72) dieser unbestimmten Zeitspanne ist. TABELLE VI
- T: Koagulationszeit (in Sekunden) ohne APC/mit APC
- AT: Variation der Koagulationszeit T (mit A. PC) - T (ohne APC)
- rs: APC-R-SR
- rn: n-APC-R-SR
- Identische Volumina an zu untersuchendem Plasma und an gemäß den vorstehenden Beispielen 1 und 3 jeweils erhaltenen Reagenzien R1, R2 und R3 wurden verwendet. Diese Volumina liegen zwischen 5 ul und 50 ul. Die folgenden Durchführungarten betreffen durchgeführte Bestimmungen im bereits erwähnten Gerät "STA"; so wurden verwendet:
- 50 ul zu testende menschliche Plasmaprobe, verdünnt auf 1/10 in OKB,
- 50 ul R1 (d. h. VdfP angereichert mit PL),
- 50 ul R2 (d. h. CVH), und
- 50 ul R3 (d. h. APC + Ca²&spplus;).
- Das zu testende menschliche Plasma, VdfP angereichert mit PL, und CVH wurden im Gerät "STA" in Kontakt gebracht. Das resultierende Gemisch wurde für 4 Minuten bei 37ºC inkubiert.
- In das so erhaltene Gemisch (d. h. CaCl&sub2; + APC) wurde nach Vorwärmung auf 37ºC R3 eingeführt. Das "STA" bestimmt die Koagulationszeit (T) der zu testenden Plasmaprobe.
- Als erhaltenes Ergebnis stellen sich drei Fälle dar:
- - wenn T > 120 s, ist das getestete Plasma nicht APC-R [es handelt sich um ein normales Plasma (MB-)],
- - wenn 120 s ≤ T ≤ 100 s, ist es unbestimmt (um diese Unbestimmtheit zu beseitigen, wird wie vorstehend beschrieben vorgegangen: entweder gemäß dem Hauptverfahren oder mittels MB), und
- - wenn T < 100 s, ist das getestete Plasma ein APC-R-Plasma (Plasma MB+).
- Die vorstehende Tabelle III veranschaulicht ein solches Ergebnis, bei dem die Koagulationszeit (mit APC) des Plasmas MB- 138,86 s und die des Plasmas MB+ 59,42 s beträgt. Für die Tabelle VI gilt das gleiche wie für die Tests mit CVH.
- 582 menschliche Plasmas, aufgeteilt in zwei Proben und jede mittels MB analysiert, wurden nach den Durchführungsarten von Beispiel 13 untersucht, wobei die Probe 1 398 Plasmas (14 Plasmas MB+ und 384 Plasmas MB-) und die Probe 2 184 Plasmas (93 Plasmas MB+ und 91 Plasmas MB-) umfasste. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle VII nachstehend dargestellt, in der jede Koagulationszeit (T) in Zeitspannen von 10 s (von 60 bis 160 s) und mehr als 160 s bestimmt wird. TABELLE VII
- A: Zahl und Art der koagulierten Plasmas der Probe 1
- B: Zahl und Art der koagulierten Plasmas der Probe 2
- Die Ergebnisse der Tabelle VII beweisen, dass die verwendete Technik der Bestimmung (i) weder Falschpositive noch Falschnegative in den Proben 1 und 2 ergibt (d. h. kein Plasma MB- ist unter den Plasmas MB+ klassifiziert und umgekehrt ist kein Plasma MB+ unter den Plasmas MB- klassifiziert), und (ii) nur eine beschränkte Zahl (< 0,6%) unbestimmter Werte liefert [unter 582 getesteten Plasmas befinden sich nur 3 Plasmas in der unbestimmten Zeitspanne (100 s ≤ T ≤ 120 s), nämlich: 2 Plasmas MB- für die Probe 1 und 1 Plasma MB+ für die Probe 2].
Claims (14)
1. Verwendung von Schlangengift zur Auslösung der Koagulation eines zu
testenden menschlichen Plasmas durch Aktivierung des Faktors X zu Xa zum
Bestimmen der Reaktivität von aktiviertem Protein C, insbesondere der
funktionellen Aktivität von Protein C, wobei die Verwendung dadurch
gekennzeichnet ist, daß Crotalus viridis helleri-Gift in Gegenwart von Ca²&spplus; auf
der Stufe des Faktors X als die Koagulation initiierende Substanz verwendet
wird, wobei das Gift selektiv X zu Xa aktiviert, unabhängig von der Gegenwart
oder Abwesenheit anderer Koagulationsfaktoren.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Crotalus viridis
helleri-Gift zum Bestimmen der Resistenz (APC-R) eines zu testenden
menschlichen Plasmas gegenüber aktiviertem Protein C (APC) verwendet
wird.
3. Verfahren zum Bestimmen der APC-R einer zu testenden menschlichen
Plasmaprobe, wobei das Verfahren die Koagulation auf der Stufe des Faktors
X mittels eines Schlangengifts in der Gegenwart (i) von Ca²&spplus; oder (ii) einem
Gemisch aus Ca²&spplus; und exogenem APC initiiert, und anschließend das
Bestimmen der Koagulationszeit in Bezug auf normales Plasma (i) in
Abwesenheit von APC bzw. (ii) in Gegenwart von APC, umfassend die
Schritte bestehend aus
(1.) Inkontaktbringen
(a) einer zu testenden menschlichen Plasmaprobe,
(b) eines Reagens mit Faktor V-Mangel (VdfR) als Produkt, das die
Mehrzahl der Koagulationsfaktoren außer dem Faktor V zur
Verfügung stellt, und
(c) Crotalus viridis helleri-Gift als spezifisch X zu Xa aktivierendes
Produkt,
und Inkubieren des erhaltenen Gemisches für mindestens 1 Minute bei
einer Temperatur zwischen 10º und 45ºC;
(2.) Einbringen von (1) Ca²&spplus; oder, bzw., (ii) Ca²&spplus; + exogenem APC in das
inkubierte Gemisch;
(3.) Bestimmen der Koagulationszeit (i) in Abwesenheit von APC bzw. (ii) in
Gegenwart von APC;
(4.) Wiederholen der Schrille (1.) bis (3.), wobei in Schritt (1.) die zu
testende menschliche Plasmaprobe durch normales Plasma als
Nachweis ersetzt wird; und
(5.) Bestimmen der APC-R durch Vergleich der in den Schritten (3.) und (4.)
erhaltenen Werte.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens VdfR
ein menschliches oder tierisches Plasma mit Faktor V-Mangel (VdfP) ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (1.)
Phospholipide (PL) eingebracht werden.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (1.) und
Schritt (4.) einerseits eine Probe von zu testendem menschlichen Plasma
verwendet wird, erhalten durch Behandlung mit Trinatriumcitrat, Zentrifugation
bei 3500 g für 15 Minuten und Lösung mittels Owren-Koller-Puffer (OKB),
andererseits ein Nachweisplasma, erhalten ausgehend von normalem
menschlichen Blut und gelöst unter denselben Bedingungen wie die der zu
testenden menschlichen Plasmaprobe, verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (3.) und
Schritt (4.) für die zu testende menschliche Plasmaprobe einerseits und für
das Nachweisplasma andererseits die Sensibilität gegenüber APC bestimmt
wird, wobei die Sensibilität das Verhältnis (genannt APC-R-SR) zwischen der
Koagulationszeit in Gegenwart von APC und der Koagulationszeit in
Abwesenheit von APC ist:
APC-R-SR = Koagulationszeit in Gegenwart von APC/Koagulationszeit in Abwesenheit von APC
und dadurch, daß in Schritt (5.) der APC-R bestimmt wird durch das
normalisierte Verhältnis (genannt n-APC-R-SR) zwischen der Sensibilität der
zu testenden menschlichen Plasmaprobe gegenüber APC und der Sensibilität
gegenüber dem normalen Nachweisplasma:
n-APC-R-SR = (APC-R-SR)Muster/(APC-R-SR)Nachweisplasma
wobei das als Nachweis verwendete normale Plasma vorzugsweise ein Pool
normalen menschlichen Plasmas ist.
8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß:
- in Schritt (1.)
(A) die gelöste, zu testende menschliche Plasmaprobe,
insbesondere mittels OKB, in einer Konzentration von größer
oder gleich 1/20 Volumen-%,
(B) menschliches mit PL angereichertes Plasma mit Faktor V-
Mangel (VdfP) als Reagens VdfR und
(C) Crotalus viridis helleri-Gift
in Kontakt gebracht und für 4 Minuten bei 37ºC inkubiert werden;
- in Schritt (2.) (i) Ca²&spplus; oder, bzw., (ii) das Ca²&spplus; + exogenes APC-
Gemisch in das inkubierte Gemisch eingebracht werden;
- in Schritt (3.) die Sensibilität der zu testenden menschlichen
Plasmaprobe gegenüber APC bestimmt wird;
- in Schritt (4.) die Gesamtheit der Schritte (1.) bis (3.) wiederholt werden,
wobei in Schritt (1.) die zu testende menschliche Plasmaprobe durch
normales menschliches Plasma zum Bestimmen der Sensibilität des
normalen menschlichen Plasmas gegenüber APC ersetzt wird; und
- in Schritt (5.) der APC-R durch das normalisierte Verhältnis n-APC-R-
SR bestimmt wird, wobei ein Wert des normalisierten Verhältnisses n-
APC-R-SR von > 0,80 um allgemeinen anzeigt, daß die zu testende
menschliche Plasmaprobe keinen Widerstand gegenüber aktiviertem
Protein C aufweist, und ein Wert des normalisierten Verhältnisses n-
APC-R-SR von < 0,80 im allgemeinen anzeigt, daß die zu testende
menschliche Plasmaprobe einen Widerstand gegenüber aktiviertem
Protein C aufweist, und wobei das als Nachweis verwendete normale
Plasma vorzugsweise ein Pool normalen menschlichen Plasmas ist.
9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es das Umsetzen
der Schritte (1.), (2., ii) und (3., ii) und nachfolgend das Bestimmen der APC-R
durch Vergleich der in Schritt (3., ii) erhaltenen Koagulationszeit (T) mit einer
experimentell bestimmten Referenzkoagulationszeit (To) umfaßt,
wobei T < To im allgemeinen anzeigt, daß die zu testende menschliche
Plasmaprobe einen Widerstand gegenüber aktiviertem Protein C aufweist, und
T > To im allgemeinen anzeigt, daß die zu testende menschliche Plasmaprobe
keinen Widerstand gegenüber aktiviertem Protein C aufweist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß To einen
statistischen Wert von ungefähr 110 s hat.
11. Verfahren nach Anspruch 9 zum Bestimmen der APC-R einer zu testenden
menschlichen Plasmaprobe, wobei das Verfahren die Initiierung der
Koagulation mittels eines Schlangengifts auf der Stufe des Faktors X in
Gegenwart eines Gemisches aus Ca²&spplus; und exogenem APC und nachfolgend
das Messen der Koagulationszeit (T) umfaßt, umfassend die Schritte
bestehend aus
(1a) Inkontaktbringen
(a) einer zu testenden menschlichen Plasmaprobe,
(b) eines Reagens mit Faktor V-Mangel (VdfR) als Produkt, das die
Mehrzahl der (vorzugsweise alle) Koagulationsfaktoren außer
dem Faktor V zur Verfügung stellt, und
(c) Crotalus viridis helleri-Gift als spezifisch X zu Xa aktivierendes
Produkt,
und Inkubieren des erhaltenen Gemisches für mindestens 1 Minute bei
einer Temperatur zwischen 10º und 45ºC, vorzugsweise zwischen 3
und 5 Minuten bei einer Temperatur von 35º bis 40ºC, und mehr
bevorzugt für 4 Minuten bei 37ºC;
(2a) Einbringen von Ca²&spplus; + exogenem APC in das inkubierte Gemisch;
(3a) Messen der Koagulationszeit (T); und
(4a) Bestimmen der APC-R durch Vergleich der gemessenen
Koagulationszeit (T) mit einer experimentell bestimmten
Referenzkoagulationszeit (To) mit einem statistischen Wert von
ungefähr 110s,
wobei T < To anzeigt, daß die zu testende menschliche Plasmaprobe
einen Widerstand gegenüber aktiviertem Protein C aufweist, und
T > To anzeigt, daß die zu testende menschliche Plasmaprobe keinen
Widerstand gegenüber aktiviertem Protein C aufweist.
12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß To eine
Zeitspanne von 20 s ist (110 ± 10 s), wobei:
- wenn T > 120 s, das getestete Plasma keinen Widerstand gegenüber
aktiviertem Protein C aufweist, und
- wenn T < 100 s, das getestete Plasma einen Widerstand gegenüber
aktiviertem Protein C aufweist,
- wobei die Zeitspanne von 100 s ≤ T ≤ 120 s unbestimmt ist.
13. Kit zur Verwendung bei der Umsetzung des Verfahrens nach einem der
Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:
- ein erstes Reagens, das ein VdfP ist,
- ein zweites Reagens, das Crotalus viridis helleri-Gift ist, und
- ein drittes Reagens, das APC in calciumhaltigem Medium ist.
14. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens mit PL
angereichert ist.
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