JPH03503534A

JPH03503534A - トロンボプラスチン試薬を製造するための改良された抽出方法

Info

Publication number: JPH03503534A
Application number: JP2500744A
Authority: JP
Inventors: ハウキンズ、パメラ、エル．、エイッチ．; メイナード、ジェームズ、アール．
Original assignee: デイド　インターナショナル　インコーポレーテッド
Priority date: 1988-11-23
Filing date: 1989-11-03
Publication date: 1991-08-08
Anticipated expiration: 2017-11-20
Also published as: DK173090D0; NO903261L; DE68912115D1; CA2002208C; ATE99697T1; DE68912115T2; US5426031A; JP3348228B2; WO1990005740A1; NO178578C; NO903261D0; CA2002208A1; EP0396733B1; EP0396733A1; DK173090A; NO178578B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】トロンボプラスチン試薬を製造するための改良された抽出方法発明の分野本発明は改良されたトロンボプラスチン試薬の抽出および製造方法に関するものである。

ありそしてプロトロンビン時間（ＰＴ）試験の基礎である。ＦＴ試験は血液凝固因子不足を予検するためおよび経口的抗凝固因子療法（例えばクマツン（ｃｏｕｍａｄｉｎ））を監視するために使用される。ＰＴ試験用の試薬は、組織因子とも称されている組織トロンボプラスチン並びに適当な緩衝液および安定剤で希釈されている活性成分としてのカルシウムイオンを含んでいる。トロンボプラスチンは凝固因子■と複合体を形成してそれの蛋白質分解活性を大きく強化させる。

トロンボプラスチンは種々の動物性原料の多種類の組織から誘導することができる。各組織は凝固酵素（すなわち因子）に特有な活性および感度を示し、これらの性質は試薬の他の成分類により調節される。

トロンボプラスチン感度は、凝塊因子■、ｖ１■、およびＸ中で不足しているクマジン処理された血漿および血漿の両者の凝塊時間の長さとして定義されている。クマジン処理された血漿に対する感度は、異常血漿試料対正常血漿試料の比を採用することにより評価される。

最近では、最大感度のトロンボプラスチン試薬は人間の脳および胎盤から誘導されている。これらの原料の限られる入手性、それらの価格およびＩ（Ｉ　Ｖウィルス汚染可能性のためにそれらの普遍的な利用が限定されている。最も一般的な原料である兎の脳から誘導されるトロンボプラスチンは典型的には人間組織から誘導されるトロンボプラスチンと比べて相対的に低い感度を有する。トロンボプラスチンの原料、トロンボプラスチンの抽出方法および試薬の組成の全てが試薬感度を決める際の重要な要素である。ＦＴ試薬の組織の変動によっても安定性が改良され、そして正常人間からの血漿試料の凝塊時間が調節される。

歴史的には、トロンボプラスチンは組織を水または食塩水溶液中で加熱することにより組織から抽出されてきている。バクスター−ヘルスケア・コーポレーション、ダート（Ｄａｄｅ）部門製のトロンボプラスチン試薬は、食塩水−酒石酸塩溶液中で抽出されたトロンボプラスチンを含有している（米国特許番号３．５２２．１４８−１９７０年７月２５日）。こスチン抽出物は、活性トロンボプラスチンを抽出溶液からの塩化ナトリウムおよび酒石酸ナトリウムと共に含有している。トロンボプラスチンＣでは、トロンボプラスチン抽出物を乳酸カルシラ！・、塩化ナトリウム、酒石酸ナトリウム、グリシンおよびカルボキシメチルセル１コースを含有している溶液に加える。抽出物の最終的濃度は最終的な再構成容量の２５％である。

トロンボプラスチンＦＳでは、トロンボプラスチン抽出物をイミダゾール、乳酸カルシウム、塩化ナトリウム、酒石酸ナトリウム、グリシンおよびカルボキシメチルセルロースを含有している溶液に加える。

抽出物の最終的濃度は最終的な再構成容量の５０％である。バクスター・ヘルスケア・コーポレーション、ダート部門製のトロンボプラスチンＦＳ　（ＴＰＥＳ）は、相対的に高濃度の兎の脳抽出物を含有している。他の兎の脳トロンボプラスチンより高感度であるが、正常範囲のＰＴ値は希望するものより長く、Ｕ濁度が高く、そして安定性が最適値より小さい。

ベリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｓ＋）社は、兎の脳トロンボプラスチンをさらに高感度にさせる方法を開発した（西ドイツ特許番号３１５０５９４　Ａｌ＞。それらの工程では、兎の脳粉末を算出のセルロース粉末と混合しそしてｐＨ６，５−８の酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄して例えばヘモグロビンの如き不純物を除去する。脳残渣を次にカルシウムイオンの存在下で例えばデオキシコリン酸ナトリウムの如き表面活性剤を用いて抽出する。ベリンガー・マンハイム方法で開示されている基本成分はカルシウムイオンであり、そして必要に応じて表面活性剤が使用される。硫酸バリウムの使用はベリンガー・マンハイム特許で論議されているが、不評であった：「我々自身の実験によると、トロンボプラスチンは硫酸バリウムと共に大部公共沈澱する」。従来工程では、トロンボプラスチンの相対的不感度はトロンボプラスチンと密に結合されている凝固因子■の存在に一部分よるものである。硫酸バリウムは一般的には吸着剤として使用されて、例えば因子■、■、■およびＸの如きビタミンに一存在性凝固剤蛋白質を除去する。

発明の簡潔な要旨本発明は、例えばトリトン＠（Ｔｒ　１ｔｏｎ■）Ｘ−１００の如き非イオン性洗剤、例えばチオシアン酸塩、ヨウ化物、グアニジンおよび過塩素酸塩の如きカオトロピックイオン（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　１ｏｎ）　、並びに硫酸ナトリウトの種々の組成物を使用しで、ｍ＆ｉ＆原料からトロンボプラスチンを抽出するものである。非イオン性洗剤は、トロンボプラスチンと結合した凝固因子を除去する効力を大きく強化させる。ここに記載されている方法は、比較的小さい正常範囲ＰＴを保ちながら因子不足およびクマジン療法に対して強化された感度という利点を与える。１９７８年にＣＡＰ血液学方式委員会により行われた検査は、報告された研究の９６％に対して正常範囲ＰＴが９−１５秒であったことを示していた（トリブレット（Ｔｒｉｐｌｃｔｔ）、　　Ｄ、　　Ａ、　、ｒどのように１．てプロトロンビン時間が実際に作用するか（Ｈｏｗ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｈｒｎｗｂｉｎ　Ｔｉｍｅ　ＡｃｔｕａｌｌｙｉｓＰｅｒ４ｏｒｍｅｄ）　Ｊ　、スタンダリゼーション・オブ・コーポレーションジ・オブ・ｒメリカン・バトロジスト、スコキイ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ八へｅｒ−ｉｃａｎ　Ｆ’ａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ、　５ｋｏｋｉｅ）、１９８２．１１３−１１９頁）。正常供給体に対する好適なＰＴ範囲は１Ｏ−１４秒である。ここに記載されている方法を用いて製造される試薬は、トロンボプラスチンＦＳより強化された再構成安定性を有し７ており、より少ない脳抽出物を使用し、そしてより少ない光学的密度である。本発明は不感性トロンボプラスチン試薬を用いる因子■不足血漿に対する感度をいずれのＰＴにおいても設定できるようにし、ここで因子■不足血漿に関する好適なＰＴ時間は６０秒より長い。本発明のトロンボプラスチン試薬は１．８より大きい異常対照用（ＣＯＬ２）対正常対照用（ＣＯＬＩ）の比を有するが、好適にはその比は１．８−３．０の範囲である。

また、抽出流体中で単独で使用される例えばチオシアン酸塩、グアニジンまたはヨウ化物の如きカオトロピックイオンが感度を大きく強化させる。カオトロピックイオンは、非共有力の破壊により膜および酵素複合体を破壊する際に使用される試薬である。（Ｗ。ハンステイＸ　Ｘ　Ｘ　Ｉ　＜１９７４＞）。カオトロピックイオンは典型的には低い電荷密度および大きい半径を有する。一般的に使用されるイオンには、トリブロモ酊酸塩、トリクロロ酢酸塩、グアニジニウム、チオシアン酸塩、ヨウ化物、過塩素酸塩、ジクロロ酢酸塩、硝酸塩、臭化物、トリフルオロ酢酸塩およびクロロ酢酸塩が包含される。

発明の詳細な説明および最良の形態本発明では、例えばアセトン−脱水された兎の脳粉末の如き組織を硫酸バリウム、非イオン性洗剤および例えばチオシアン酸塩、ヨウ化物、グアニジンまたは過塩素酸塩の如きカオトロピックイオンの組成物を用いて抽出して試薬の性質を調節する。本発明は全てのトロンボプラスチンに対して有用であるはずであり、そして全てのＰＴを基にした試験および特定検定に関する感度を改良するであろう。

Ｐ′ｒ値は、例えばＭＬＡエレクトラ８００の如き自動化凝固分析機、例えばフィブロメーターの如き機械的装置、または手動技術を用いて測定することができる。これらの研究用の異常血漿は、例えば、バクスター・ヘルスケア・コーポレーション、ダート部門、Ｃ１−トロール＠（Ｔｒｏｔ■）レベルＩｆ　（ＣＯＬ２）または抗凝固剤対照用の親液性化されたクマジン処理血漿（Ｌ、ＡＣ）の如き異常対照物である。正常ＰＴ値を測定するためには、Ｃ１−）ロール■レベルＩ　　（ＣＯＬＩ）または新鮮な正常なりエン酸処理血１ｔ（ＦＮＰ）が使用されている。

因子不足に対する感度は因子■−不足血漿（ＣＦ？）のＰＴを測定することにより評価される。米国で入手可能な兎の脳トロンボプラスチン（ダート・トロンボプラスチンＣ）は、Ｃｏｔ、２／Ｃ０ＬＩに関する１、５の比およびＭＬＡエレクトラ８００上での因子■−不足血漿に対する２８−３０秒のＰＴを生じる。

実施例Ｉニトロンボブラスチンを製造するために使用される一般的方法トロンボブラステン試薬を製造するため、兎の脳粉末（５０ｇｏ＋）を塩化＋　）　’Ｊ　’７　ム（３０−１８０ｍＭ）、例えば）！ｊ）ン＠Ｘ−１００の如き比イオン性洗剤（０，Ｏｌ−０，２５％）および例えばチオシアン酸ナトリウムの如きカオトロピックイオン（５−１００ａ＋Ｍ）を含有している抽出流体（１０００ｍＬ）中で抽出する。一方、抽出流体は塩化ナトリウム（３０−１８０ａ＋Ｍ）およびカオトロピックイオン（５−１００ａ＋Ｍ）だけを含有していてもよい。

硫酸バリウム粉末を抽出流体に０．１−１．０ｇｍ　／　ｇｍｍ鉛粉末割合で加える。抽出を４３−４７℃で１５分間行い、抽出混合物を次に２５０ＯＲＰ　Ｍにおいて１０分間遠心して硫酸バリウムおよび大粒子を除去する。抽出物をカルシウムイオン＜　７−１４ｃＭ）　、塩化ナトリウム＜ＴＯ−１５０ａ＋Ｍ）、緩衝液および安定剤を含有している基剤に加える。生成物を次に凍結乾爆する。

実施例■ニトロンボブラスチン感度に対する抽出中のトリトンＸ−１００および硫酸バリウムの影テアセトン−脱水された兎の脳粉末（１帥）を０．６３ｇ＋の硫酸バリウム（ＢａＳ０４）およびＯ−０，２５％トリトン＠Ｘ−１００（ｔ）−ム・アンド・ハース　（Ｒｏｈｍ　＆　ｆｌａａｓ）、ペンシルバニア州、フィアデルフイア）を含有している２（１ｍｌ、の０．６３％塩化ナトリウム（ＮａＣ１）中で４５℃ において１５分間にわたり抽出した。抽出混合物を次に２５０ＯＲＰＭにおいて１０分間遠心して硫酸バリウムおよび大粒子を除去した。抽出物を、３０ｍＭ　（ＴＡ　Ｐ　Ｓ　Ｏ）　（Ｄ緩衝液、５％のグ＋）シフ、０．６％の分子量が８０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　、１３゜？＋ｏＭの塩化カルシウム（Ｃａ　Ｃ１２）、１００　ｍＭのＮａＣ１からなるｐ　Ｈ７，０の基剤に３２％の最終的濃度で加えた。プロトロンビン時間（ＰＴ）Ｃ秒〕をＭＬＡエレクトラ（Ｅｌｅｃｔｒａ）８００　　（メディカル・ラボラトリ−・オートメーション、ニューヨーク州、プレサントヴイル）を用いて記録した。

洗剤の量が増加するにつれて、Ｃ０Ｌ２／Ｃ０Ｌ１の比および因子■−不足血漿のＰＴ　（ＣＦ７）が実質的に増加する（表１）。

トロンボプラスチン−塊（ＭＬＡ−８００）に対する抽出中のトリトンＸ−１００および硫酸バリウムの影響：２回繰り返しの平均％）す）ンＸ−１００Ｃ０ＬＩ　　　　　Ｃ０ＬＺ　　　　　比　Ｃ０Ｌ２／［：ＯＬＩ　　　　　　　ＣＦ７０％対照用　　　１１．８　　２０．６　　　　１．７５　　　　　９５．９０．０５％　　　　　１２．１　　２２．１　　　　１８３　　　　１０７．４０．１％　　　　　１３．０　　２５．１　　　　１．９３　　　　１２０．４０．２５％　　　　　１４．３　　３４．４　　　　２．４１　　　　１９３．４基剤調合物：３０＋ｎＭのＴＡＰＳｏ、５％のグリシン、０．６％のＰＥＧ。

１３、７ｍＭのＣａＣ１５，１００ｍＭのＮａＣｌ、３２％の抽出物、ｐＨ７，０゜２００１Ｌの抽出流体中で０．６３％ＮａＣ１および洗剤中で硫酸ナトリウムを０、６ｇｏ／　ｇｍ脳の割合で用いて抽出された脳。

実施例■ニトロンボブラステン感度に対する抽出中のチオシアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）の影響アセトン−脱水された兎の脳粉末（１ｇｇ）を０（対照用）、１０．５０、および１００ｍＭのＮａ５ＣＮを含有している（断り書きのない限り）２０１１ＩＬの０．６３％塩化ナトリウム（ＮａＣ１）中で４５℃において１５分間にわたり抽出し、ここではＮ　ａ　Ｃ１を含まない１００ａ＋ＭのＮａ５ＣＮを含有している試料も評価した。硫酸バリウムはこの実験では使用しなかった。抽出混合物を実施例１中に記されている如くして遠心した。プロトロピン時間（ＰＴ）Ｃ秒〕をＭＬＡエレクトラ８００を用いて記録した。

Ｎａ５ＣＮの量が増加するにつれて、Ｃ０Ｌ２／Ｃ０ＬＩの比および因子■−不足血漿のＦＴ　（ＣＦ７）の両者が実質的に増加する（表■）。チオシアン酸ナトリウムだけがトロンボプラスチン感度を増加させた。

表■ トロンボプラスチン−塊（ＭＬＡ−８００＞に対する抽出中のチオシアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）の影響Ｃ０ＬＬ　　　　　Ｃ０Ｌ２　　　　　比　Ｃ口Ｌ２／Ｃ０ＬＩ　　　　　　　ＣＦ７対照用　　　　　　　１１．９　　２１．５　　　　１．８１　　　　　３７．３１０ｍＭ　Ｎａ５ＣＮ　　　　　　１２．５　　２４．１　　　　１．９３　　　　　６７、４５０ｍＭ　Ｎａ５ＣＮ　　　　　　１３．７　　３０．９　　　　２．２６　　　　１５９．３１００ｍＭ　Ｎａ５ＣＮ　　　　　１４．７　　３５．６　　　　２．４２　　　　１７７、７１００ｍＭ　　Ｎａ５ＣＮ−ＮａＣＬ　　なＬｉ２．ｌ　　　　　３１．６　　　　　　　２．２４　　　　　　　　１３１．６基剤調合物：３０ｍＭのＴＡＰＳＯ１５％のグリシン、０．６％のＰＥＧ。

１３、７ａ＋ＭのＣａＣ１ｇ、１００ｍＭのＮａＣ１，３２％の抽出物、ｐＨ７，０゜実施例ＩＶＹ）ロンボブラステン感度に対する抽出流体の種々の組成および抽出物の百分率の比較兎の脳粉末（１ｇｍ）をＮａＣ１、トリトンＸ　−１００ＳＮａ　ＳＣＮおよび硫酸バリウムを含有している２種類の組成の抽出流体中で抽出した。表■において、抽出物Ｅは１３０＋ｏＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ５ＣＮ、０．０５％のトリトンＸ−１００および０．３ｇ＋ｓの硫酸バリウム／ｇｓ脳粉末を含有しており、抽出物Ｎは５０ａ＋ＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＮａ５ＣＮ。

０．０２％のトリトンＸ−１００および０．４ｇｍの硫酸バリウム／ｇ＋ｓ脳粉末を含有していた。脳粉末を抽出し、遠心し、そして抽出物を基剤に実施例１に記されている如＜３２％または５０％の最終的濃度で加えた。プロトロンビン時間（ＰＴ）Ｃ秒〕をＭＬＡエレクトラ８００を用いて記録した。

表■は、抽出流体の成分および抽出物の量が変わると、例えばダート・プロトロンビンＣ（比Ｃ０Ｌ２／Ｃ０Ｌ１＝１．５＞の如き兎の脳トロンボプラスチンと比べて相当強化された感度を有するトロンボプラスチンを生成することを示している。

表■ トロンボプラスチン−塊（ＭＬＡ−８００）に対する抽出流体の種々の組成および抽出物の百分率の比較３２％抽出物Ｅ　　１４，６　３２．８　２．２５　　　１４．２　３５．５　２．５０　　８１．１５０％抽出物Ｅ　　１６．９　４５．５　２．６９　　　１５．８　５０．４　３．１９　１５５．１３２％抽出物Ｎ　　１２．８　２４．１　１．８８　　　１２．４　２７．４　２．２３　１０６．９５０％抽出物Ｎ　　１３．９　３２，３　２，３２　　　１３．４　３９．０　２．９１　１７６．６トロンボブラスチン　ＰＳ　　　１３．３　　２４．５　　１．８４　　　　　　　１３．０　　３１．４　　２．４２　　　　６４．６基剤調合物：３０ｍＭのＴＡＰＳＯ１５％のグリシン、０．６％のＰＥＧ。

１３、７１１ＩＩＭの（ａ　ＣＩ　２、１０抛ＭのＮａＣＩ、ｐＨ７，０゜抽出物Ｅ：１３０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ５ｃＮ、０．０５％のトリトンＸ−１００，０、３ｇｍの硫酸バリウム／ｇｔｓ脳粉末中で抽出された脳粉末。

抽出物Ｎ：５０＋ｏＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＮ　ａ　Ｓ　ＣＮ　ｓ　ｏ、　０２％のトリトンＸ−１００゜０、４ｇｔａの硫酸バリウム／ｇａ＋脳粉末中で抽出された脳粉末。

アセトン−脱水された兎の脳粉末を、５０ａ＋ＭのＮａＣ１，１０ａ＋ＭのＮａ５ＣＮ、０．０２％のトリトンＸ−１００および０．４ｇｏ＋の硫酸バリウム／ｇｍ脳粉末を含有している溶液中で抽出した。脳粉末を実施例１に記されている如くして抽出した。抽出物を下記の２種類の調合物用基剤に加えた：調合物りは、ｐＨ７，１の、４ｈＭのとシン緩衝液、５．２５％のグリシン、０．６％のＰＥＧ、１０ａ＋ＭのＣａ　Ｃ１＊、１３４ａ＋ＭのＮａＣｌ中に３５％の抽出物を含有しており、調合物Ｔは、ｐＨ７，４の、８０ａ＋ＭのＴＡＰＳｏ、５．２５％のグリシン、０．６％のＰＥ０％１０ｍＭの（：、　ａ　ＣＩ　ｚ、１１８ｍＭのＮａＣ１中に３６％の抽出物を含有していた。両方の調合物を親液性化した。再構成後に、ＰＴ［秒〕をＭＬＡエレクトラ８００を用いて記録した。

表ＩＶは、調合物の組成を変えると、強化された感度およびトロンボプラスチンＦＳすなわち比較的有感性である兎の脳トロンボプラスチンより優れた他の性質を有するトロンボプラスチンを生成できることを示している。

表■ 有感性トロンボプラスチン−塊（ＭＬＡ−８００）の種々の調合の比較Ｄ　　　　　　　１３．４　３１．１　２．３２　　　１２．４　３３．５　２．７０　　　ｇ６．３Ｔ　　　　　　　１４．０　３５．０　２．５０　　　１３．０　３３．９　２．６１　　９３．０トロンボプラスチン　ＦＳ　　　１４．２　　２６．７　　１．８８　　　　　　　１３．４　　３０．５　　２．２８　　　　５８．９抽出混合物：５０ｍＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＮａ５ＣＮ、０．２０％のトリトンＸ−１００，０、４ｙ、ｒａの硫酸バリウム／ｇ＋＋＋脳粉末中で抽出された脳粉末。

調合物Ｄ＝４０ｍＭのビシン緩衝液、５．２５％のグリシン、０．６％のＰＥＧ。

１０ａ＋ＭのＣａＣｌ１、１３４ｍＭのＮａＣ１、ｐＨ７，１ｚ調合物Ｔ：８０ｍ１４のＴＡＰＳＯ１５，２５％のグリシン、０．６％のＰＥＧ。

１０ｍｔＪのＣａ　Ｃ］　ｍ、　１１釦ＭのＮａＣ１％ｐＨ７，４゜実施例■：米国で販売されている典型的感度を有するトロンボプラスチンの製造アセトン−脱水された兎の脳粉末を、５ｈＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＮａ５ＣＮ、０．０２％（７））’Ｊ　）：／Ｘ−１０（ｌヨび０．４ｇｍ（Ｄ硫酸バリウム／ｇＩＩ＋脳粉末を含有している溶液中で抽出した。脳粉末を実施例１に記されている如くして抽出した。抽出物を下記の３種の調合物用基剤に加えた：調合物Ｅは、ｐＨ７，４の、５３ａ＋ＭのＴＡＰＳｏ、４．００％のグリシン、０．３％のＰＥＧ、１１ａ＋ＭのＣａＣ１ｚ、５０ａ＋ＭのＮａＣ１中に１０％の抽出物を含有しており、調合物Ｆｉｔ、ｐＨ７，４の、５０ａ＋Ｍ（Ｄ　Ｔ　Ａ　Ｐ　Ｓ　０　。

４．００％のグリシン、０．３％のＰＥＧｌｌｌｏＭのＣａＣｌｘ　、５０ｍＭのＮａＣ１中に１２％の抽出物を含有しており、調合物Ｇは、ｐＨ７，４，５３ｏＭのＴＡ　Ｐ　Ｓ　０．４．００％のグリシン１．０．３％のＰＥＧ、１１ｍＭのＣａＣ１３，６５ｍＭのＮ　ａ　ＣＩ中に１０％の抽出物を含有していた。

調合物を親液性化した。再構成後に、ＰＴ〔秒〕をＭＬＡエレクトラ８００を用いて記録した。

表■は、ここに記載されている抽出流体がトロンボプラスチンＣと同様な米国で市販されている従来の兎の脳トロンボプラスチンを製造するために使用できることを示している。比較的低いＣ０Ｌ２／Ｃ０Ｌｌ比およびＬＡＣ／ＦＮＰ比を有するトロンボプラスチンを製造するためには相対的に少量の抽出物＜１０−１２％対トロンボプラスチンＣの２５％）を必要とする。それでも、因子■の感度は強化される。

表■ 米国で販売されている典型的感度を有する１τ１ンボブラスチンの種々の調合物の比較Ｅ　　　　　　　ｉｌ、８　２０．４　１．７３　　　１１．６　２１．７　１８７　　４２．１Ｆ　　　　　　　１１．７　２０．４　１．７４　　　１！、３　２１．３　１，８８　　４０゜６Ｇ　　　　　　　１１．．４　１９．７　１．７３　　　１１１　２１．０　１．８９　　４０．４トロンボプラスチン　ＦＳ　　　１１．９　　２０．２　　１゜７０　　　　　　１１．５　２０．２　　１．７６　　　　２７．７抽出混合物：５０ｍＭのＮａＣ１、］、Ｏｔｎ　ＭのＮ　ａ　Ｓ　ＣＮ％０，２０％のトリトンｘ−ｉｏｏ、０、４ｇｍの硫酸バリウム／ｇｍの脳粉末中で抽出された脳粉末。

調合物Ｅ：１０％抽出物、５３ｍＭのＴＡＰＳｏ、４．００％のグリシン、０．３％のＰＥＧ。

１１ｆｆＩＭのＣａＣｌ２．５０ｍＭのＮａＣ１，ｐＨ７，４調合物Ｆ：１２％抽出物、５０ｎ＋ＭのＴＡ　Ｐ　Ｓ　Ｏ，、４，００％のグリシン、０１．３％のＰＥＧ。

１１ｍＭのＣａＣｌ　、　、５０ｍ１４のＮａＣｌ、　ｐｉ（７，４調合物Ｇ：］２％抽出物、５３ｏ＋ＭのＴ　Ａ　Ｐ　Ｓ　Ｏ１４，００％のグリシン、０．３％のＰ　Ｅ　Ｇ　。

１　］ｍＭのＣａＣｌ　２．６５ｍ！ＪのＮａＣ１，ｐ）（７−４発明の変法および均等物ＰＴ試薬の性能および感度は、試薬の全成分間の相互作用の結果である。一般的に１、感度を増加させるような調合物中の変化は正常Ｉ’Ｔの値も増加させる。

本発明では、抽出流体の成分類は最良の正常１１Ｔおよび感度にするように注意深く均衡が保たれている。さらに、抽出混合物の個４の成分類は特定方法における試薬性能にも影曾を与える。

種々の成分類の濃度を変化させると製造される抽出物の性質が変わり、従って、抽出流体組成によ１．て種々の性質を有する抽出物を製造できる。

硫酸バリウムおよびノドイオン性洗剤、例えばトリトン＠Ｘ−１００、ブ↑Ｉ　（ｔ３ｒｉｊ）　−３５、ノニデット＠　（Ｎｏｎｉｄｅｔ　＠）　Ｐ４０、ＦＳＮ＠およびテルギトール＠（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ＠）　、が特に例えば因子■の和き特定の凝固因子不足に対する感度を非常に強化する。カオトロピックイオン（チオシアン酸塩、グアニジン、ヨウ化物、過塩素酸塩）は抽出において単独でクマジン処理された患者試料および例えば因子■の如き特定の凝固因子不足の雨音に対する感度を強化する。プロトロンビン試芽を製造４″るためには、組織を塩化ナトリウム（３０−１８０ｄ）、非イオン性洗剤＜０．０１−０．２５％）および例えばチオシアン酸塩、グアニジン、ヨウ化物および過塩素酸塩の如きカオトロピックイオン（５−１００ｄ＞を含有している抽出流体で抽出する。硫酸バリウム粉末を抽出流体に０．１−１．０ｇｍ　、／　ｇｍ脳粉末の割合で加える。一方１、抽出流体は塩化ナトリウム（０−１５０ｍＭ）およびチオシアノ酸ナトリウ”　（５−１００ｍＭ）だけを含有していてもよい。抽出は４３−４７ ℃において１５分間にわたり行われ、抽出混合物を次に２５０ＯＲＰ　Ｍにおいて１０分間遠心して硫、酸バリウムおよび大粒子を除去する。抽出物をカルシウムイオン（７−１４ｍＭ）　、塩化ナトリウム（７０−１５０ｄ）、緩衝液および安定剤を含有している基剤に加える。緩衝液ふよび安定剤を変えて、生成１物の安定性を良好に改良できる。

トロンボプラスチンを含有しているならどの組ゆ原料５、例えば兎の脳および肺、牛の脳および肺８、羊の脳および肺、並びに人間の脳、肺および胎盤、を用いても、この抽出方法および成分類を使用できる。

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Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）トロンボプラスチンを含有している組織を、トロンボプラスチンの抽出を生じるような条件下で、硫酸バリウム、非イオン性洗剤、カオトロピックイオン、および塩を含んでいる有効量の抽出流体と接触させ、そして（ｂ）該抽出されたトロンボプラスチンをそれが除去された組織および硫酸バリウムから分離することからなる、トロンボプラスチンの抽出方法。２．該抽出流体の有効量が５グラムの組織当たり約１００ｍｌである、請求項１記載の方法。３．該非イオン性洗剤が約０．０１−０．２５％であり、該カオトロピックイオンが５−１００ｍＭであり、そして塩が約３０−１８０ｍＭである、請求項１記載の方法。４．硫酸バリウムの有効量が約０．１−１．０ｇｍ／ｇｍトロンボプラスチン含有組織である、請求項１記載の方法。５．抽出が４３−４７℃の間で約１５分間にわたり行われる、請求項１記載の方法。６．該組織が兎の脳粉末である、請求項１記載の方法。７．（ａ）トロンボプラスチンを含有している組織を、トロンボプラスチンの抽出を生じるような条件下で、カオトロピックイオンを含んでいる有効量の抽出流体と接触させ、そして（ｂ）該抽出されたトロンボプラスチンをそれが除去された組織から分離することからなる、トロンボプラスチンの抽出方法。８．該抽出流体の有効量が５グラムの組織当たり約１００ｍＬである、請求項７記載の方法。９．カオトロピックイオンの濃度が５−１００ｍＭである、請求項７記載の方法。１０．抽出が４３−４７℃の間で約１５分間にわたり行われる、請求項７記載の方法。１１．該組織が兎の脳粉末である、請求項７記載の方法。１２．（ａ）トロンボプラスチンを含有している組織を、トロンボプラスチンの抽出を生じるような条件下で、カオトロピックイオンおよび塩を含んでいる有効量の抽出流体と接触させ、そして（ｂ）該抽出されたトロンボプラスチンをそれが除去された組織から分離することからなる、トロンボプラスチンの抽出方法。１３．該抽出流体の有効量が５グラムの組織当たり約１００ｍＬである、請求項１２記載の方法。１４．カオトロピックイオンが５−１００ｍＭであり、そして塩の濃度が約３０ −１８０ｍＭの範囲である、請求項１２記載の方法。１５．カオトロピックイオンの濃度が約１０−１００ｍＭである、請求項１２記載の方法。１６．抽出が４３−４７℃の間で約１５分間にわたり行われる、請求項１２記載の方法。１７．該組織が兎の脳粉末である、請求項１２記載の方法。１８（ａ）トロンボプラスチンを含有している組織を、トロンボプラスチンの抽出を生じるような条件下で、硫酸バリウム、非イオン性洗剤、および塩を含んでいる有効量の抽出流体と接触させ、そして（ｂ）該抽出されたトロンボプラスチンをそれが除去された組織から分離することからなる、トロンボプラスチンの抽出方法。１９．該抽出流体の有効量が５グラムの組織当たり約１００ｍＬである、請求項１８記載の方法。２０．硫酸バリウムの有効量が約０．１−１．０ｇｍ／ｇｍトロンボプラスチン含有組織であり、そして非イオン性洗剤が約０．０１−０．２５％である、請求項１８記載の方法。２１．抽出が４３−４７℃の間で約１５分間にわたり行われる、請求項１８記載の方法。２２．該組織が兎の脳粉末である、請求項１８記載の方法。２３．（ａ）トロンボプラスチンを含有している組織を、トロンボプラスチンの抽出を生じるような条件下で、塩、カオトロピックイオン、および硫酸バリウムを含んでいる有効量の抽出流体と接触させ、そして（ｂ）該抽出されたトロンボプラスチンをそれが除去された組織から分離することからなる、トロンボプラスチンの抽出方法。２４．該抽出流体の有効量が５グラムの組織当たり約１００ｍＬである、請求項２３記載の方法。２５．該力オトロピックイオンが５−１００ｍＭであり、そして塩が約３０−１８０ｍＭである、請求項２３記載の方法。２６．硫酸バリウムの有効量か約０．１−１．０ｇｍ／８ｍトロンボプラスチン含有組織である、請求項２３記載の方法。２７．抽出が４３−４７℃の間で約１５分間にわたり行われる、請求項２３記載の方法。２８．該組織が兎の脳粉末である、請求項２３記載の方法。２９．請求項１記載の方法により製造された、因子不足およびクマジン治療法に対するほぼ正常なプロトロンビン時間および強化された感度を有する抽出されたトロンボプラスチン組成物。３０．正常なプロトロンビン時間が約９−１５秒である、請求項２９記載の組成物。３１．ＣＯＬ２／ＣＯＬ１より示されるクマジン療法に対する該強化された感度が約１．８−３．０の範囲である、請求項２９記載の組成物。３２．請求項７記載の方法により製造された、因子不足およびクマジン療法に対するほぼ正常なプロトロンビン時間および強化された感度を有する抽出されたトロンボプラスチン組成物。３３．正常なプロトロンビン時間が約９−１５秒である、請求項３２記載の組成物。３４．ＣＯＬ２／ＣＯＬ１より示されるクマジン療法に対する該強化された感度が約１．８−３．０の範囲である、請求項３２記載の組成物。３５．請求項１２記載の方法により製造された、因子不足およびクマジン療法に対するほぼ正常なプロトロンビン時間および強化された感度を有する抽出されたトロンボプラスチン組成物。３６．正常なプロトロンビン時間が約９−１５秒である、請求項３５記載の組成物。３７．ＣＯＬ２／ＣＯＬ１より示されるクマジン療法に対する該強化された感度が約１．８−３．０の範囲である、請求項３５記載の組成物。３８．請求項３５記載の方法により製造された、因子不定およびクマジン療法に対するほぼ正常なプロトロンビン時間および強化された感度を有する抽出されたトロンボプラスチン組成物。３９．正常なプロトロンビン時間が約９−１５秒である、請求項３８記載の組成物。４０．ＣＯＬ２／ＣＯＬ１より示されるクマジン療法に対する該強化された感度が約１．８−３．０の範囲である、請求項３８記載の組成物。