JPH03503534A - トロンボプラスチン試薬を製造するための改良された抽出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トロンボプラスチン試薬を製造するための改良された抽出方法発明の分野 本発明は改良されたトロンボプラスチン試薬の抽出および製造方法に関するもの である。

ありそしてプロトロンビン時間（ＰＴ）試験の基礎である。ＦＴ試験は血液凝固 因子不足を予検するためおよび経口的抗凝固因子療法（例えばクマツン（ｃｏｕ ｍａｄｉｎ））を監視するために使用される。ＰＴ試験用の試薬は、組織因子と も称されている組織トロンボプラスチン並びに適当な緩衝液および安定剤で希釈 されている活性成分としてのカルシウムイオンを含んでいる。トロンボプラスチ ンは凝固因子■と複合体を形成してそれの蛋白質分解活性を大きく強化させる。

トロンボプラスチンは種々の動物性原料の多種類の組織から誘導することができ る。各組織は凝固酵素（すなわち因子）に特有な活性および感度を示し、これら の性質は試薬の他の成分類により調節される。

トロンボプラスチン感度は、凝塊因子■、ｖ１■、およびＸ中で不足しているク マジン処理された血漿および血漿の両者の凝塊時間の長さとして定義されている 。クマジン処理された血漿に対する感度は、異常血漿試料対正常血漿試料の比を 採用することにより評価される。

最近では、最大感度のトロンボプラスチン試薬は人間の脳および胎盤から誘導さ れている。これらの原料の限られる入手性、それらの価格およびＩ（Ｉ　Ｖウィ ルス汚染可能性のためにそれらの普遍的な利用が限定されている。最も一般的な 原料である兎の脳から誘導されるトロンボプラスチンは典型的には人間組織から 誘導されるトロンボプラスチンと比べて相対的に低い感度を有する。トロンボプ ラスチンの原料、トロンボプラスチンの抽出方法および試薬の組成の全てが試薬 感度を決める際の重要な要素である。ＦＴ試薬の組織の変動によっても安定性が 改良され、そして正常人間からの血漿試料の凝塊時間が調節される。

歴史的には、トロンボプラスチンは組織を水または食塩水溶液中で加熱すること により組織から抽出されてきている。バクスター−ヘルスケア・コーポレーショ ン、ダート（Ｄａｄｅ）部門製のトロンボプラスチン試薬は、食塩水−酒石酸塩 溶液中で抽出されたトロンボプラスチンを含有している（米国特許番号３．５２ ２．１４８−１９７０年７月２５日）。こスチン抽出物は、活性トロンボプラス チンを抽出溶液からの塩化ナトリウムおよび酒石酸ナトリウムと共に含有してい る。トロンボプラスチンＣでは、トロンボプラスチン抽出物を乳酸カルシラ！・ 、塩化ナトリウム、酒石酸ナトリウム、グリシンおよびカルボキシメチルセル１ コースを含有している溶液に加える。抽出物の最終的濃度は最終的な再構成容量 の２５％である。

トロンボプラスチンＦＳでは、トロンボプラスチン抽出物をイミダゾール、乳酸 カルシウム、塩化ナトリウム、酒石酸ナトリウム、グリシンおよびカルボキシメ チルセルロースを含有している溶液に加える。

抽出物の最終的濃度は最終的な再構成容量の５０％である。バクスター・ヘルス ケア・コーポレーション、ダート部門製のトロンボプラスチンＦＳ　（ＴＰＥＳ ）は、相対的に高濃度の兎の脳抽出物を含有している。他の兎の脳トロンボプラ スチンより高感度であるが、正常範囲のＰＴ値は希望するものより長く、Ｕ濁度 が高く、そして安定性が最適値より小さい。

ベリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｓ＋）社は、 兎の脳トロンボプラスチンをさらに高感度にさせる方法を開発した（西ドイツ特 許番号３１５０５９４　Ａｌ＞。それらの工程では、兎の脳粉末を算出のセルロ ース粉末と混合しそしてｐＨ６，５−８の酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄して例え ばヘモグロビンの如き不純物を除去する。脳残渣を次にカルシウムイオンの存在 下で例えばデオキシコリン酸ナトリウムの如き表面活性剤を用いて抽出する。ベ リンガー・マンハイム方法で開示されている基本成分はカルシウムイオンであり 、そして必要に応じて表面活性剤が使用される。硫酸バリウムの使用はベリンガ ー・マンハイム特許で論議されているが、不評であった：「我々自身の実験によ ると、トロンボプラスチンは硫酸バリウムと共に大部公共沈澱する」。従来工程 では、トロンボプラスチンの相対的不感度はトロンボプラスチンと密に結合され ている凝固因子■の存在に一部分よるものである。硫酸バリウムは一般的には吸 着剤として使用されて、例えば因子■、■、■およびＸの如きビタミンに一存在 性凝固剤蛋白質を除去する。

発明の簡潔な要旨 本発明は、例えばトリトン＠（Ｔｒ　１ｔｏｎ■）Ｘ−１００の如き非イオン性 洗剤、例えばチオシアン酸塩、ヨウ化物、グアニジンおよび過塩素酸塩の如きカ オトロピックイオン（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　１ｏｎ）　、並びに硫酸ナトリウ トの種々の組成物を使用しで、ｍ＆ｉ＆原料からトロンボプラスチンを抽出する ものである。非イオン性洗剤は、トロンボプラスチンと結合した凝固因子を除去 する効力を大きく強化させる。ここに記載されている方法は、比較的小さい正常 範囲ＰＴを保ちながら因子不足およびクマジン療法に対して強化された感度とい う利点を与える。１９７８年にＣＡＰ血液学方式委員会により行われた検査は、 報告された研究の９６％に対して正常範囲ＰＴが９−１５秒であったことを示し ていた（トリブレット（Ｔｒｉｐｌｃｔｔ）、　　Ｄ、　　Ａ、　、ｒどのよう に１．てプロトロンビン時間が実際に作用するか（Ｈｏｗ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｈ ｒｎｗｂｉｎ　Ｔｉｍｅ　ＡｃｔｕａｌｌｙｉｓＰｅｒ４ｏｒｍｅｄ）　Ｊ　、 スタンダリゼーション・オブ・コーポレーションジ・オブ・ｒメリカン・バトロ ジスト、スコキイ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ八へｅｒ−ｉｃａｎ　Ｆ’ａｔｈｏ ｌｏｇｉｓｔｓ、　５ｋｏｋｉｅ）、１９８２．１１３−１１９頁）。正常供給 体に対する好適なＰＴ範囲は１Ｏ−１４秒である。ここに記載されている方法を 用いて製造される試薬は、トロンボプラスチンＦＳより強化された再構成安定性 を有し７ており、より少ない脳抽出物を使用し、そしてより少ない光学的密度で ある。本発明は不感性トロンボプラスチン試薬を用いる因子■不足血漿に対する 感度をいずれのＰＴにおいても設定できるようにし、ここで因子■不足血漿に関 する好適なＰＴ時間は６０秒より長い。本発明のトロンボプラスチン試薬は１． ８より大きい異常対照用（ＣＯＬ２）対正常対照用（ＣＯＬＩ）の比を有するが 、好適にはその比は１．８−３．０の範囲である。

また、抽出流体中で単独で使用される例えばチオシアン酸塩、グアニジンまたは ヨウ化物の如きカオトロピックイオンが感度を大きく強化させる。カオトロピッ クイオンは、非共有力の破壊により膜および酵素複合体を破壊する際に使用され る試薬である。（Ｗ。ハンステイＸ　Ｘ　Ｘ　Ｉ　＜１９７４＞）。カオトロピ ックイオンは典型的には低い電荷密度および大きい半径を有する。一般的に使用 されるイオンには、トリブロモ酊酸塩、トリクロロ酢酸塩、グアニジニウム、チ オシアン酸塩、ヨウ化物、過塩素酸塩、ジクロロ酢酸塩、硝酸塩、臭化物、トリ フルオロ酢酸塩およびクロロ酢酸塩が包含される。

発明の詳細な説明および最良の形態 本発明では、例えばアセトン−脱水された兎の脳粉末の如き組織を硫酸バリウム 、非イオン性洗剤および例えばチオシアン酸塩、ヨウ化物、グアニジンまたは過 塩素酸塩の如きカオトロピックイオンの組成物を用いて抽出して試薬の性質を調 節する。本発明は全てのトロンボプラスチンに対して有用であるはずであり、そ して全てのＰＴを基にした試験および特定検定に関する感度を改良するであろう 。

Ｐ′ｒ値は、例えばＭＬＡエレクトラ８００の如き自動化凝固分析機、例えばフ ィブロメーターの如き機械的装置、または手動技術を用いて測定することができ る。これらの研究用の異常血漿は、例えば、バクスター・ヘルスケア・コーポレ ーション、ダート部門、Ｃ１−トロール＠（Ｔｒｏｔ■）レベルＩｆ　（ＣＯＬ ２）または抗凝固剤対照用の親液性化されたクマジン処理血漿（Ｌ、ＡＣ）の如 き異常対照物である。正常ＰＴ値を測定するためには、Ｃ１−）ロール■レベル Ｉ　　（ＣＯＬＩ）または新鮮な正常なりエン酸処理血１ｔ（ＦＮＰ）が使用さ れている。

因子不足に対する感度は因子■−不足血漿（ＣＦ？）のＰＴを測定することによ り評価される。米国で入手可能な兎の脳トロンボプラスチン（ダート・トロンボ プラスチンＣ）は、Ｃｏｔ、２／Ｃ０ＬＩに関する１、５の比およびＭＬＡエレ クトラ８００上での因子■−不足血漿に対する２８−３０秒のＰＴを生じる。

実施例Ｉニトロンボブラスチンを製造するために使用される一般的方法 トロンボブラステン試薬を製造するため、兎の脳粉末（５０ｇｏ＋）を塩化＋　 ）　’Ｊ　’７　ム（３０−１８０ｍＭ）、例えば）！ｊ）ン＠Ｘ−１００の如 き比イオン性洗剤（０，Ｏｌ−０，２５％）および例えばチオシアン酸ナトリウ ムの如きカオトロピックイオン（５−１００ａ＋Ｍ）を含有している抽出流体（ １０００ｍＬ）中で抽出する。一方、抽出流体は塩化ナトリウム（３０−１８０ ａ＋Ｍ）およびカオトロピックイオン（５−１００ａ＋Ｍ）だけを含有していて もよい。

硫酸バリウム粉末を抽出流体に０．１−１．０ｇｍ　／　ｇｍｍ鉛粉末割合で加 える。抽出を４３−４７℃で１５分間行い、抽出混合物を次に２５０ＯＲＰ　Ｍ において１０分間遠心して硫酸バリウムおよび大粒子を除去する。抽出物をカル シウムイオン＜　７−１４ｃＭ）　、塩化ナトリウム＜ＴＯ−１５０ａ＋Ｍ）、 緩衝液および安定剤を含有している基剤に加える。生成物を次に凍結乾爆する。

実施例■ニトロンボブラスチン感度に対する抽出中のトリトンＸ−１００および 硫酸バリウムの影テ アセトン−脱水された兎の脳粉末（１帥）を０．６３ｇ＋の硫酸バリウム（Ｂａ Ｓ０４）およびＯ−０，２５％トリトン＠Ｘ−１００（ｔ）−ム・アンド・ハー ス　（Ｒｏｈｍ　＆　ｆｌａａｓ）、ペンシルバニア州、フィアデルフイア）を 含有している２（１ｍｌ、の０．６３％塩化ナトリウム（ＮａＣ１）中で４５℃ において１５分間にわたり抽出した。抽出混合物を次に２５０ＯＲＰＭにおいて １０分間遠心して硫酸バリウムおよび大粒子を除去した。抽出物を、３０ｍＭ　 （ＴＡ　Ｐ　Ｓ　Ｏ）　（Ｄ緩衝液、５％のグ＋）シフ、０．６％の分子量が８ ０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　、１３゜？＋ｏＭの塩化カルシウ ム（Ｃａ　Ｃ１２）、１００　ｍＭのＮａＣ１からなるｐ　Ｈ７，０の基剤に３ ２％の最終的濃度で加えた。プロトロンビン時間（ＰＴ）Ｃ秒〕をＭＬＡエレク トラ（Ｅｌｅｃｔｒａ）８００　　（メディカル・ラボラトリ−・オートメーシ ョン、ニューヨーク州、プレサントヴイル）を用いて記録した。

洗剤の量が増加するにつれて、Ｃ０Ｌ２／Ｃ０Ｌ１の比および因子■−不足血漿 のＰＴ　（ＣＦ７）が実質的に増加する（表１）。

トロンボプラスチン−塊（ＭＬＡ−８００）に対する抽出中のトリトンＸ−１０ ０および硫酸バリウムの影響：２回繰り返しの平均％）す）ンＸ−１００Ｃ０Ｌ Ｉ　　　　　Ｃ０ＬＺ　　　　　比　Ｃ０Ｌ２／［：ＯＬＩ　　　　　　　ＣＦ ７０％対照用　　　１１．８　　２０．６　　　　１．７５　　　　　９５．９ ０．０５％　　　　　１２．１　　２２．１　　　　１８３　　　　１０７．４ ０．１％　　　　　１３．０　　２５．１　　　　１．９３　　　　１２０．４ ０．２５％　　　　　１４．３　　３４．４　　　　２．４１　　　　１９３． ４基剤調合物： ３０＋ｎＭのＴＡＰＳｏ、５％のグリシン、０．６％のＰＥＧ。

１３、７ｍＭのＣａＣ１５，１００ｍＭのＮａＣｌ、３２％の抽出物、ｐＨ７， ０゜２００１Ｌの抽出流体中で０．６３％ＮａＣ１および洗剤中で硫酸ナトリウ ムを０、６ｇｏ／　ｇｍ脳の割合で用いて抽出された脳。

実施例■ニトロンボブラステン感度に対する抽出中のチオシアン酸ナトリウム（ ＮａＳＣＮ）の影響 アセトン−脱水された兎の脳粉末（１ｇｇ）を０（対照用）、１０．５０、およ び１００ｍＭのＮａ５ＣＮを含有している（断り書きのない限り）２０１１ＩＬ の０．６３％塩化ナトリウム（ＮａＣ１）中で４５℃において１５分間にわたり 抽出し、ここではＮ　ａ　Ｃ１を含まない１００ａ＋ＭのＮａ５ＣＮを含有して いる試料も評価した。硫酸バリウムはこの実験では使用しなかった。抽出混合物 を実施例１中に記されている如くして遠心した。プロトロピン時間（ＰＴ）Ｃ秒 〕をＭＬＡエレクトラ８００を用いて記録した。

Ｎａ５ＣＮの量が増加するにつれて、Ｃ０Ｌ２／Ｃ０ＬＩの比および因子■−不 足血漿のＦＴ　（ＣＦ７）の両者が実質的に増加する（表■）。チオシアン酸ナ トリウムだけがトロンボプラスチン感度を増加させた。

表■ トロンボプラスチン−塊（ＭＬＡ−８００＞に対する抽出中のチオシアン酸ナト リウム（ＮａＳＣＮ）の影響Ｃ０ＬＬ　　　　　Ｃ０Ｌ２　　　　　比　Ｃ口Ｌ ２／Ｃ０ＬＩ　　　　　　　ＣＦ７対照用　　　　　　　１１．９　　２１．５ 　　　　１．８１　　　　　３７．３１０ｍＭ　Ｎａ５ＣＮ　　　　　　１２． ５　　２４．１　　　　１．９３　　　　　６７、４５０ｍＭ　Ｎａ５ＣＮ　　 　　　　１３．７　　３０．９　　　　２．２６　　　　１５９．３１００ｍＭ 　Ｎａ５ＣＮ　　　　　１４．７　　３５．６　　　　２．４２　　　　１７７ 、７１００ｍＭ　　Ｎａ５ＣＮ−ＮａＣＬ　　なＬｉ２．ｌ　　　　　３１．６ 　　　　　　　２．２４　　　　　　　　１３１．６基剤調合物： ３０ｍＭのＴＡＰＳＯ１５％のグリシン、０．６％のＰＥＧ。

１３、７ａ＋ＭのＣａＣ１ｇ、１００ｍＭのＮａＣ１，３２％の抽出物、ｐＨ７ ，０゜実施例ＩＶＹ）ロンボブラステン感度に対する抽出流体の種々の組成およ び抽出物の百分率の比較 兎の脳粉末（１ｇｍ）をＮａＣ１、トリトンＸ　−１００ＳＮａ　ＳＣＮおよび 硫酸バリウムを含有している２種類の組成の抽出流体中で抽出した。表■におい て、抽出物Ｅは１３０＋ｏＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ５ＣＮ、０．０５％の トリトンＸ−１００および０．３ｇ＋ｓの硫酸バリウム／ｇｓ脳粉末を含有して おり、抽出物Ｎは５０ａ＋ＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＮａ５ＣＮ。

０．０２％のトリトンＸ−１００および０．４ｇｍの硫酸バリウム／ｇ＋ｓ脳粉 末を含有していた。脳粉末を抽出し、遠心し、そして抽出物を基剤に実施例１に 記されている如＜３２％または５０％の最終的濃度で加えた。プロトロンビン時 間（ＰＴ）Ｃ秒〕をＭＬＡエレクトラ８００を用いて記録した。

表■は、抽出流体の成分および抽出物の量が変わると、例えばダート・プロトロ ンビンＣ（比Ｃ０Ｌ２／Ｃ０Ｌ１＝１．５＞の如き兎の脳トロンボプラスチンと 比べて相当強化された感度を有するトロンボプラスチンを生成することを示して いる。

表■ トロンボプラスチン−塊（ＭＬＡ−８００）に対する抽出流体の種々の組成およ び抽出物の百分率の比較 ３２％抽出物Ｅ　　１４，６　３２．８　２．２５　　　１４．２　３５．５　 ２．５０　　８１．１５０％抽出物Ｅ　　１６．９　４５．５　２．６９　　　 １５．８　５０．４　３．１９　１５５．１３２％抽出物Ｎ　　１２．８　２４ ．１　１．８８　　　１２．４　２７．４　２．２３　１０６．９５０％抽出物 Ｎ　　１３．９　３２，３　２，３２　　　１３．４　３９．０　２．９１　１ ７６．６トロンボブラスチン　ＰＳ　　　１３．３　　２４．５　　１．８４　 　　　　　　１３．０　　３１．４　　２．４２　　　　６４．６基剤調合物： ３０ｍＭのＴＡＰＳＯ１５％のグリシン、０．６％のＰＥＧ。

１３、７１１ＩＩＭの（ａ　ＣＩ　２、１０抛ＭのＮａＣＩ、ｐＨ７，０゜抽出 物Ｅ： １３０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ５ｃＮ、０．０５％のトリトンＸ−１０ ０，０、３ｇｍの硫酸バリウム／ｇｔｓ脳粉末中で抽出された脳粉末。

抽出物Ｎ： ５０＋ｏＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＮ　ａ　Ｓ　ＣＮ　ｓ　ｏ、　０２％のトリ トンＸ−１００゜０、４ｇｔａの硫酸バリウム／ｇａ＋脳粉末中で抽出された脳 粉末。

アセトン−脱水された兎の脳粉末を、５０ａ＋ＭのＮａＣ１，１０ａ＋ＭのＮａ ５ＣＮ、０．０２％のトリトンＸ−１００および０．４ｇｏ＋の硫酸バリウム／ ｇｍ脳粉末を含有している溶液中で抽出した。脳粉末を実施例１に記されている 如くして抽出した。抽出物を下記の２種類の調合物用基剤に加えた：調合物りは 、ｐＨ７，１の、４ｈＭのとシン緩衝液、５．２５％のグリシン、０．６％のＰ ＥＧ、１０ａ＋ＭのＣａ　Ｃ１＊、１３４ａ＋ＭのＮａＣｌ中に３５％の抽出物 を含有しており、調合物Ｔは、ｐＨ７，４の、８０ａ＋ＭのＴＡＰＳｏ、５．２ ５％のグリシン、０．６％のＰＥ０％１０ｍＭの（：、　ａ　ＣＩ　ｚ、１１８ ｍＭのＮａＣ１中に３６％の抽出物を含有していた。両方の調合物を親液性化し た。再構成後に、ＰＴ［秒〕をＭＬＡエレクトラ８００を用いて記録した。

表ＩＶは、調合物の組成を変えると、強化された感度およびトロンボプラスチン ＦＳすなわち比較的有感性である兎の脳トロンボプラスチンより優れた他の性質 を有するトロンボプラスチンを生成できることを示している。

表■ 有感性トロンボプラスチン−塊（ＭＬＡ−８００）の種々の調合の比較 Ｄ　　　　　　　１３．４　３１．１　２．３２　　　１２．４　３３．５　２ ．７０　　　ｇ６．３Ｔ　　　　　　　１４．０　３５．０　２．５０　　　１ ３．０　３３．９　２．６１　　９３．０トロンボプラスチン　ＦＳ　　　１４ ．２　　２６．７　　１．８８　　　　　　　１３．４　　３０．５　　２．２ ８　　　　５８．９抽出混合物： ５０ｍＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＮａ５ＣＮ、０．２０％のトリトンＸ−１００ ，０、４ｙ、ｒａの硫酸バリウム／ｇ＋＋＋脳粉末中で抽出された脳粉末。

調合物Ｄ＝ ４０ｍＭのビシン緩衝液、５．２５％のグリシン、０．６％のＰＥＧ。

１０ａ＋ＭのＣａＣｌ１、１３４ｍＭのＮａＣ１、ｐＨ７，１ｚ調合物Ｔ： ８０ｍ１４のＴＡＰＳＯ１５，２５％のグリシン、０．６％のＰＥＧ。

１０ｍｔＪのＣａ　Ｃ］　ｍ、　１１釦ＭのＮａＣ１％ｐＨ７，４゜実施例■： 米国で販売されている典型的感度を有するトロンボプラスチンの製造 アセトン−脱水された兎の脳粉末を、５ｈＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＮａ５ＣＮ 、０．０２％（７））’Ｊ　）：／Ｘ−１０（ｌヨび０．４ｇｍ（Ｄ硫酸バリウ ム／ｇＩＩ＋脳粉末を含有している溶液中で抽出した。脳粉末を実施例１に記さ れている如くして抽出した。抽出物を下記の３種の調合物用基剤に加えた：調合 物Ｅは、ｐＨ７，４の、５３ａ＋ＭのＴＡＰＳｏ、４．００％のグリシン、０． ３％のＰＥＧ、１１ａ＋ＭのＣａＣ１ｚ、５０ａ＋ＭのＮａＣ１中に１０％の抽 出物を含有しており、調合物Ｆｉｔ、ｐＨ７，４の、５０ａ＋Ｍ（Ｄ　Ｔ　Ａ　 Ｐ　Ｓ　０　。

４．００％のグリシン、０．３％のＰＥＧｌｌｌｏＭのＣａＣｌｘ　、５０ｍＭ のＮａＣ１中に１２％の抽出物を含有しており、調合物Ｇは、ｐＨ７，４，５３ ｏＭのＴＡ　Ｐ　Ｓ　０．４．００％のグリシン１．０．３％のＰＥＧ、１１ｍ ＭのＣａＣ１３，６５ｍＭのＮ　ａ　ＣＩ中に１０％の抽出物を含有していた。

調合物を親液性化した。再構成後に、ＰＴ〔秒〕をＭＬＡエレクトラ８００を用 いて記録した。

表■は、ここに記載されている抽出流体がトロンボプラスチンＣと同様な米国で 市販されている従来の兎の脳トロンボプラスチンを製造するために使用できるこ とを示している。比較的低いＣ０Ｌ２／Ｃ０Ｌｌ比およびＬＡＣ／ＦＮＰ比を有 するトロンボプラスチンを製造するためには相対的に少量の抽出物＜１０−１２ ％対トロンボプラスチンＣの２５％）を必要とする。それでも、因子■の感度は 強化される。

表■ 米国で販売されている典型的感度を有する１τ１ンボブラスチンの種々の調合物 の比較 Ｅ　　　　　　　ｉｌ、８　２０．４　１．７３　　　１１．６　２１．７　１ ８７　　４２．１Ｆ　　　　　　　１１．７　２０．４　１．７４　　　１！、 ３　２１．３　１，８８　　４０゜６Ｇ　　　　　　　１１．．４　１９．７　 １．７３　　　１１１　２１．０　１．８９　　４０．４トロンボプラスチン　 ＦＳ　　　１１．９　　２０．２　　１゜７０　　　　　　１１．５　２０．２ 　　１．７６　　　　２７．７抽出混合物： ５０ｍＭのＮａＣ１、］、Ｏｔｎ　ＭのＮ　ａ　Ｓ　ＣＮ％０，２０％のトリト ンｘ−ｉｏｏ、０、４ｇｍの硫酸バリウム／ｇｍの脳粉末中で抽出された脳粉末 。

調合物Ｅ： １０％抽出物、５３ｍＭのＴＡＰＳｏ、４．００％のグリシン、０．３％のＰＥ Ｇ。

１１ｆｆＩＭのＣａＣｌ２．５０ｍＭのＮａＣ１，ｐＨ７，４調合物Ｆ： １２％抽出物、５０ｎ＋ＭのＴＡ　Ｐ　Ｓ　Ｏ，、４，００％のグリシン、０１ ．３％のＰＥＧ。

１１ｍＭのＣａＣｌ　、　、５０ｍ１４のＮａＣｌ、　ｐｉ（７，４調合物Ｇ： ］２％抽出物、５３ｏ＋ＭのＴ　Ａ　Ｐ　Ｓ　Ｏ１４，００％のグリシン、０． ３％のＰ　Ｅ　Ｇ　。

１　］ｍＭのＣａＣｌ　２．６５ｍ！ＪのＮａＣ１，ｐ）（７−４発明の変法お よび均等物 ＰＴ試薬の性能および感度は、試薬の全成分間の相互作用の結果である。一般的 に１、感度を増加させるような調合物中の変化は正常Ｉ’Ｔの値も増加させる。

本発明では、抽出流体の成分類は最良の正常１１Ｔおよび感度にするように注意 深く均衡が保たれている。さらに、抽出混合物の個４の成分類は特定方法におけ る試薬性能にも影曾を与える。

種々の成分類の濃度を変化させると製造される抽出物の性質が変わり、従って、 抽出流体組成によ１．て種々の性質を有する抽出物を製造できる。

硫酸バリウムおよびノドイオン性洗剤、例えばトリトン＠Ｘ−１００、ブ↑Ｉ　 （ｔ３ｒｉｊ）　−３５、ノニデット＠　（Ｎｏｎｉｄｅｔ　＠）　Ｐ４０、Ｆ ＳＮ＠およびテルギトール＠（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ＠）　、が特に例えば因子■の 和き特定の凝固因子不足に対する感度を非常に強化する。カオトロピックイオン （チオシアン酸塩、グアニジン、ヨウ化物、過塩素酸塩）は抽出において単独で クマジン処理された患者試料および例えば因子■の如き特定の凝固因子不足の雨 音に対する感度を強化する。プロトロンビン試芽を製造４″るためには、組織を 塩化ナトリウム（３０−１８０ｄ）、非イオン性洗剤＜０．０１−０．２５％） および例えばチオシアン酸塩、グアニジン、ヨウ化物および過塩素酸塩の如きカ オトロピックイオン（５−１００ｄ＞を含有している抽出流体で抽出する。硫酸 バリウム粉末を抽出流体に０．１−１．０ｇｍ　、／　ｇｍ脳粉末の割合で加え る。一方１、抽出流体は塩化ナトリウム（０−１５０ｍＭ）およびチオシアノ酸 ナトリウ”　（５−１００ｍＭ）だけを含有していてもよい。抽出は４３−４７ ℃において１５分間にわたり行われ、抽出混合物を次に２５０ＯＲＰ　Ｍにおい て１０分間遠心して硫、酸バリウムおよび大粒子を除去する。抽出物をカルシウ ムイオン（７−１４ｍＭ）　、塩化ナトリウム（７０−１５０ｄ）、緩衝液およ び安定剤を含有している基剤に加える。緩衝液ふよび安定剤を変えて、生成１物 の安定性を良好に改良できる。

トロンボプラスチンを含有しているならどの組ゆ原料５、例えば兎の脳および肺 、牛の脳および肺８、羊の脳および肺、並びに人間の脳、肺および胎盤、を用い ても、この抽出方法および成分類を使用できる。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）トロンボプラスチンを含有している組織を、トロンボプラスチンの抽 出を生じるような条件下で、硫酸バリウム、非イオン性洗剤、カオトロピックイ オン、および塩を含んでいる有効量の抽出流体と接触させ、そして （ｂ）該抽出されたトロンボプラスチンをそれが除去された組織および硫酸バリ ウムから分離する ことからなる、トロンボプラスチンの抽出方法。 ２．該抽出流体の有効量が５グラムの組織当たり約１００ｍｌである、請求項１ 記載の方法。 ３．該非イオン性洗剤が約０．０１−０．２５％であり、該カオトロピックイオ ンが５−１００ｍＭであり、そして塩が約３０−１８０ｍＭである、請求項１記 載の方法。 ４．硫酸バリウムの有効量が約０．１−１．０ｇｍ／ｇｍトロンボプラスチン含 有組織である、請求項１記載の方法。 ５．抽出が４３−４７℃の間で約１５分間にわたり行われる、請求項１記載の方 法。 ６．該組織が兎の脳粉末である、請求項１記載の方法。 ７．（ａ）トロンボプラスチンを含有している組織を、トロンボプラスチンの抽 出を生じるような条件下で、カオトロピックイオンを含んでいる有効量の抽出流 体と接触させ、そして（ｂ）該抽出されたトロンボプラスチンをそれが除去され た組織から分離する ことからなる、トロンボプラスチンの抽出方法。 ８．該抽出流体の有効量が５グラムの組織当たり約１００ｍＬである、請求項７ 記載の方法。 ９．カオトロピックイオンの濃度が５−１００ｍＭである、請求項７記載の方法 。 １０．抽出が４３−４７℃の間で約１５分間にわたり行われる、請求項７記載の 方法。 １１．該組織が兎の脳粉末である、請求項７記載の方法。 １２．（ａ）トロンボプラスチンを含有している組織を、トロンボプラスチンの 抽出を生じるような条件下で、カオトロピックイオンおよび塩を含んでいる有効 量の抽出流体と接触させ、そして（ｂ）該抽出されたトロンボプラスチンをそれ が除去された組織から分離する ことからなる、トロンボプラスチンの抽出方法。 １３．該抽出流体の有効量が５グラムの組織当たり約１００ｍＬである、請求項 １２記載の方法。 １４．カオトロピックイオンが５−１００ｍＭであり、そして塩の濃度が約３０ −１８０ｍＭの範囲である、請求項１２記載の方法。 １５．カオトロピックイオンの濃度が約１０−１００ｍＭである、請求項１２記 載の方法。 １６．抽出が４３−４７℃の間で約１５分間にわたり行われる、請求項１２記載 の方法。 １７．該組織が兎の脳粉末である、請求項１２記載の方法。 １８（ａ）トロンボプラスチンを含有している組織を、トロンボプラスチンの抽 出を生じるような条件下で、硫酸バリウム、非イオン性洗剤、および塩を含んで いる有効量の抽出流体と接触させ、そして（ｂ）該抽出されたトロンボプラスチ ンをそれが除去された組織から分離する ことからなる、トロンボプラスチンの抽出方法。 １９．該抽出流体の有効量が５グラムの組織当たり約１００ｍＬである、請求項 １８記載の方法。 ２０．硫酸バリウムの有効量が約０．１−１．０ｇｍ／ｇｍトロンボプラスチン 含有組織であり、そして非イオン性洗剤が約０．０１−０．２５％である、請求 項１８記載の方法。 ２１．抽出が４３−４７℃の間で約１５分間にわたり行われる、請求項１８記載 の方法。 ２２．該組織が兎の脳粉末である、請求項１８記載の方法。 ２３．（ａ）トロンボプラスチンを含有している組織を、トロンボプラスチンの 抽出を生じるような条件下で、塩、カオトロピックイオン、および硫酸バリウム を含んでいる有効量の抽出流体と接触させ、そして （ｂ）該抽出されたトロンボプラスチンをそれが除去された組織から分離する ことからなる、トロンボプラスチンの抽出方法。 ２４．該抽出流体の有効量が５グラムの組織当たり約１００ｍＬである、請求項 ２３記載の方法。 ２５．該力オトロピックイオンが５−１００ｍＭであり、そして塩が約３０−１ ８０ｍＭである、請求項２３記載の方法。 ２６．硫酸バリウムの有効量か約０．１−１．０ｇｍ／８ｍトロンボプラスチン 含有組織である、請求項２３記載の方法。 ２７．抽出が４３−４７℃の間で約１５分間にわたり行われる、請求項２３記載 の方法。 ２８．該組織が兎の脳粉末である、請求項２３記載の方法。 ２９．請求項１記載の方法により製造された、因子不足およびクマジン治療法に 対するほぼ正常なプロトロンビン時間および強化された感度を有する抽出された トロンボプラスチン組成物。 ３０．正常なプロトロンビン時間が約９−１５秒である、請求項２９記載の組成 物。 ３１．ＣＯＬ２／ＣＯＬ１より示されるクマジン療法に対する該強化された感度 が約１．８−３．０の範囲である、請求項２９記載の組成物。 ３２．請求項７記載の方法により製造された、因子不足およびクマジン療法に対 するほぼ正常なプロトロンビン時間および強化された感度を有する抽出されたト ロンボプラスチン組成物。 ３３．正常なプロトロンビン時間が約９−１５秒である、請求項３２記載の組成 物。 ３４．ＣＯＬ２／ＣＯＬ１より示されるクマジン療法に対する該強化された感度 が約１．８−３．０の範囲である、請求項３２記載の組成物。 ３５．請求項１２記載の方法により製造された、因子不足およびクマジン療法に 対するほぼ正常なプロトロンビン時間および強化された感度を有する抽出された トロンボプラスチン組成物。 ３６．正常なプロトロンビン時間が約９−１５秒である、請求項３５記載の組成 物。 ３７．ＣＯＬ２／ＣＯＬ１より示されるクマジン療法に対する該強化された感度 が約１．８−３．０の範囲である、請求項３５記載の組成物。 ３８．請求項３５記載の方法により製造された、因子不定およびクマジン療法に 対するほぼ正常なプロトロンビン時間および強化された感度を有する抽出された トロンボプラスチン組成物。 ３９．正常なプロトロンビン時間が約９−１５秒である、請求項３８記載の組成 物。 ４０．ＣＯＬ２／ＣＯＬ１より示されるクマジン療法に対する該強化された感度 が約１．８−３．０の範囲である、請求項３８記載の組成物。