JPH07134129A - 組織因子の活性測定用試薬 - Google Patents
組織因子の活性測定用試薬Info
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- JPH07134129A JPH07134129A JP27944493A JP27944493A JPH07134129A JP H07134129 A JPH07134129 A JP H07134129A JP 27944493 A JP27944493 A JP 27944493A JP 27944493 A JP27944493 A JP 27944493A JP H07134129 A JPH07134129 A JP H07134129A
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- factor
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 発色性合成基質、リン脂質、カルシウム塩、
血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含有製剤と、必要に応じて
界面活性剤とを含む組織因子の活性測定用試薬である。 【効果】 汎用の測定機器でもって組織因子の活性を簡
便にかつ高感度に測定することができる。界面活性剤を
共存させることにより測定感度を一層高めることができ
る。
血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含有製剤と、必要に応じて
界面活性剤とを含む組織因子の活性測定用試薬である。 【効果】 汎用の測定機器でもって組織因子の活性を簡
便にかつ高感度に測定することができる。界面活性剤を
共存させることにより測定感度を一層高めることができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、光学測定装置を使用し
て組織因子の活性を測定する試薬に関するものである。
本発明による試薬は、これを用いることにより、汎用の
測定機器でもって組織因子の活性を簡便にかつ高感度に
測定することが可能であり、医薬品、臨床検査などの分
野において有用なものである。
て組織因子の活性を測定する試薬に関するものである。
本発明による試薬は、これを用いることにより、汎用の
測定機器でもって組織因子の活性を簡便にかつ高感度に
測定することが可能であり、医薬品、臨床検査などの分
野において有用なものである。
【０００２】
【従来技術および解決すべき課題】血液凝固反応には組
織因子により反応が開始される外因系と、第VII 因子、
高分子キニノーゲンなどにより反応が開始される内因系
との２種類の反応系がある。
織因子により反応が開始される外因系と、第VII 因子、
高分子キニノーゲンなどにより反応が開始される内因系
との２種類の反応系がある。
【０００３】組織因子（Tissue Fector ）は、組織トロ
ンボプラスチンとも呼ばれ、上記外因系血液凝固反応の
開始物質として重要な働きを示すことが知られている。
すなわち、組織因子は第VII 因子と複合体を形成し、そ
の複合体が第Ｘ因子を活性化する。活性化された第Ｘ因
子は第Ｖ因子を補酵素とし、リン脂質存在下プロトロン
ビンをトロンビンに変換する。以上の反応は、すべてカ
ルシウムイオンの存在を必要とする。
ンボプラスチンとも呼ばれ、上記外因系血液凝固反応の
開始物質として重要な働きを示すことが知られている。
すなわち、組織因子は第VII 因子と複合体を形成し、そ
の複合体が第Ｘ因子を活性化する。活性化された第Ｘ因
子は第Ｖ因子を補酵素とし、リン脂質存在下プロトロン
ビンをトロンビンに変換する。以上の反応は、すべてカ
ルシウムイオンの存在を必要とする。
【０００４】組織因子は脂質部分と蛋白部分よりなる糖
脂質蛋白であり、インタクトな細胞では細胞膜中に表面
を覆われた状態で存在すると考えられ、特にガンなどに
おける組織・血管の損傷によって、細胞表面に組織因子
が露呈し、血管内凝固が起こりやすくなる。またＴＮＦ
（Tumor Necrosis Factor ）やＩＬ（Interleukin ）、
サイトカイン類がリンパ細胞や白血病由来マクロファー
ジ系細胞を刺激して細胞表面の組織因子活性が発現する
と報告されている。
脂質蛋白であり、インタクトな細胞では細胞膜中に表面
を覆われた状態で存在すると考えられ、特にガンなどに
おける組織・血管の損傷によって、細胞表面に組織因子
が露呈し、血管内凝固が起こりやすくなる。またＴＮＦ
（Tumor Necrosis Factor ）やＩＬ（Interleukin ）、
サイトカイン類がリンパ細胞や白血病由来マクロファー
ジ系細胞を刺激して細胞表面の組織因子活性が発現する
と報告されている。
【０００５】組織因子は全身臓器に存在するが、特に
肺、脳、胎盤に多いことが知られている。
肺、脳、胎盤に多いことが知られている。
【０００６】これまで組織因子の測定方法としては、
「クイック試験」と呼ばれる外因系血液凝固反応系の活
性を生物学的に測定する方法やその改良法、また、近年
においては免疫学的に測定する方法が利用されてきた。
「クイック試験」と呼ばれる外因系血液凝固反応系の活
性を生物学的に測定する方法やその改良法、また、近年
においては免疫学的に測定する方法が利用されてきた。
【０００７】凝固活性試験は、組織因子とリン脂質及び
カルシウムイオンを含有する試薬液を３７℃にインキュ
ベートし、組織因子の働きにより生成されたトロンビン
が試薬液中のフィブリノーゲンをフィブリンに転ずるこ
とより成る凝固物が確認されるまでの時間を測定する試
験法である。外因系血液凝固活性測定用試薬は、バクス
ター・デイド社、オルガノン・テクニカ社などから市販
されている。しかしながら、この方法は、凝固反応の目
視確認に熟練を要し、また、測定法に従ったそれ独自の
測定機器を必要とし、操作が煩雑であるため大量測定に
不向きであるという欠点を有する。
カルシウムイオンを含有する試薬液を３７℃にインキュ
ベートし、組織因子の働きにより生成されたトロンビン
が試薬液中のフィブリノーゲンをフィブリンに転ずるこ
とより成る凝固物が確認されるまでの時間を測定する試
験法である。外因系血液凝固活性測定用試薬は、バクス
ター・デイド社、オルガノン・テクニカ社などから市販
されている。しかしながら、この方法は、凝固反応の目
視確認に熟練を要し、また、測定法に従ったそれ独自の
測定機器を必要とし、操作が煩雑であるため大量測定に
不向きであるという欠点を有する。
【０００８】免疫学的測定法には、組織因子を特異的に
認識・結合するモノクロナール抗体を用いるサンドイッ
チ法による酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）がある。ＥＬ
ＩＳＡ法は検出感度が低く、試薬分注やプレート洗浄な
ど煩雑な操作を要し、判定までに長い時間がかかるとい
う難点を有する。さらにＥＬＩＳＡ法では脂質部分の欠
落した凝固能不活性な組織因子も測定されるという欠点
がある。このほか、レディオイムノアッセィ（ＲＩＡ）
による検出法も知られているが、煩雑な操作を要する
上、特殊な設備・装置が必要である。
認識・結合するモノクロナール抗体を用いるサンドイッ
チ法による酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）がある。ＥＬ
ＩＳＡ法は検出感度が低く、試薬分注やプレート洗浄な
ど煩雑な操作を要し、判定までに長い時間がかかるとい
う難点を有する。さらにＥＬＩＳＡ法では脂質部分の欠
落した凝固能不活性な組織因子も測定されるという欠点
がある。このほか、レディオイムノアッセィ（ＲＩＡ）
による検出法も知られているが、煩雑な操作を要する
上、特殊な設備・装置が必要である。
【０００９】近年、多数の研究者により、合成基質を用
いて組織因子活性を直接的に測定する方法が試みられて
いるが、低値の組織因子を検出することは困難であり、
十分な検出感度が得られていない（C.Fukuda et al,Cli
n. Chem.,35/9, 1897-1900,1989 ）。また、第Ｘ因子お
よび第IX因子の活性化におけるリン脂質の影響が研究さ
れているが（小宮山豊、臨床病理、７，７３−８０，１
９９２）、リン脂質を組織因子の測定に用いたという報
告はされていない。
いて組織因子活性を直接的に測定する方法が試みられて
いるが、低値の組織因子を検出することは困難であり、
十分な検出感度が得られていない（C.Fukuda et al,Cli
n. Chem.,35/9, 1897-1900,1989 ）。また、第Ｘ因子お
よび第IX因子の活性化におけるリン脂質の影響が研究さ
れているが（小宮山豊、臨床病理、７，７３−８０，１
９９２）、リン脂質を組織因子の測定に用いたという報
告はされていない。
【００１０】本発明の目的は、上記の実情に鑑み、汎用
の測定機器でもって組織因子の活性を簡便にかつ高感度
に測定することが可能な組織因子活性測定用試薬を提供
することである。
の測定機器でもって組織因子の活性を簡便にかつ高感度
に測定することが可能な組織因子活性測定用試薬を提供
することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明による組織因子の
活性測定用試薬は、上記目的を達成すべく工夫されたも
のであり、発色性合成基質、リン脂質、カルシウム塩、
血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含有製剤を主成分として含
む試薬である。
活性測定用試薬は、上記目的を達成すべく工夫されたも
のであり、発色性合成基質、リン脂質、カルシウム塩、
血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含有製剤を主成分として含
む試薬である。
【００１２】本発明の好適な実施モードにおいては、上
記組織因子活性測定用試薬は、さらに界面活性剤を含
む。
記組織因子活性測定用試薬は、さらに界面活性剤を含
む。
【００１３】以下、本発明による組織因子の活性測定用
試薬を構成する各成分について詳しく説明する。
試薬を構成する各成分について詳しく説明する。
【００１４】本発明において用いられる発色性合成基質
としては、活性化第Ｘ因子測定用基質としてテストチー
ム発色基質Ｓ−２２２２（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イソロ
イシル−Ｌ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アレルギニル
−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イ
ソロイシル−Ｌ−γ−メトキシグルタミル−グリシル−
Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩；Chromoge
nic 社製）、スペクトロザイムＦＸａ（メトキシカルボ
ニル−Ｄ−シクロヘキシルグリシル−グリシル−アルギ
ニル−ｐ−ニトロアニリド−アセテート；American Dia
gnostica社製）、ペファクロムFactor Xa （アセチル−
Ｄ−シクロヘキシルアラニル−グリシル−アルギニル−
ｐ−ニトロアニリド−アセテート；Pentapharm社製）、
またトロンビン測定用基質としてテストチーム発色基質
Ｓ−２２３８（Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコ
ニル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩；Ch
romogenic 社製）、ペファクロムＴＨ（Ｈ−Ｄ−シクロ
ヘキシルグリシル−アラニル−アルギニル−ｐ−ニトロ
アニリド−アセテート；Pentapharm社製）などが例示さ
れるが、発色性合成基質はこれらに限られるものではな
い。上記の発色性合成基質は、いずれも末端にｐ−ニト
ロアニリド基を有しており、組織因子によって活性化さ
れた活性化第Ｘ因子あるいはトロンビンにより分解さ
れ、ｐ−ニトロアニリンを遊離する。遊離したｐ−ニト
ロアニリンを波長４０５ｎｍで比色定量することにより
組織因子の活性を求める。本発明試薬中の合成基質濃度
は好ましくは０．１μＭ〜２０ｍＭの範囲である。
としては、活性化第Ｘ因子測定用基質としてテストチー
ム発色基質Ｓ−２２２２（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イソロ
イシル−Ｌ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アレルギニル
−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イ
ソロイシル−Ｌ−γ−メトキシグルタミル−グリシル−
Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩；Chromoge
nic 社製）、スペクトロザイムＦＸａ（メトキシカルボ
ニル−Ｄ−シクロヘキシルグリシル−グリシル−アルギ
ニル−ｐ−ニトロアニリド−アセテート；American Dia
gnostica社製）、ペファクロムFactor Xa （アセチル−
Ｄ−シクロヘキシルアラニル−グリシル−アルギニル−
ｐ−ニトロアニリド−アセテート；Pentapharm社製）、
またトロンビン測定用基質としてテストチーム発色基質
Ｓ−２２３８（Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコ
ニル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩；Ch
romogenic 社製）、ペファクロムＴＨ（Ｈ−Ｄ−シクロ
ヘキシルグリシル−アラニル−アルギニル−ｐ−ニトロ
アニリド−アセテート；Pentapharm社製）などが例示さ
れるが、発色性合成基質はこれらに限られるものではな
い。上記の発色性合成基質は、いずれも末端にｐ−ニト
ロアニリド基を有しており、組織因子によって活性化さ
れた活性化第Ｘ因子あるいはトロンビンにより分解さ
れ、ｐ−ニトロアニリンを遊離する。遊離したｐ−ニト
ロアニリンを波長４０５ｎｍで比色定量することにより
組織因子の活性を求める。本発明試薬中の合成基質濃度
は好ましくは０．１μＭ〜２０ｍＭの範囲である。
【００１５】本試薬中のカルシウム塩としては、ハロゲ
ン化塩、ギ酸塩、酢酸塩などの易溶性塩が使用可能であ
り、とりわけ好ましい塩は塩化カルシウムである。本発
明試薬中のカルシウム塩の使用濃度範囲は好ましくは
０．１〜５０ｍＭであり、特に好ましくは２．０〜５．
０ｍＭである。
ン化塩、ギ酸塩、酢酸塩などの易溶性塩が使用可能であ
り、とりわけ好ましい塩は塩化カルシウムである。本発
明試薬中のカルシウム塩の使用濃度範囲は好ましくは
０．１〜５０ｍＭであり、特に好ましくは２．０〜５．
０ｍＭである。
【００１６】本発明の試薬のｐＨを安定させるために用
いる緩衝剤としては、トリス、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−
ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ' −２−エタンス
ルホン酸）、イミダゾール、バルビタール酸などが使用
可能である。本発明の試薬のｐＨは普通にはｐＨ７．０
〜８．５の範囲であり、好ましくはｐＨ７．５〜８．２
に設定される。その際の緩衝剤の濃度は、トリスの場合
２０〜５００ｍＭが適当である。
いる緩衝剤としては、トリス、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−
ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ' −２−エタンス
ルホン酸）、イミダゾール、バルビタール酸などが使用
可能である。本発明の試薬のｐＨは普通にはｐＨ７．０
〜８．５の範囲であり、好ましくはｐＨ７．５〜８．２
に設定される。その際の緩衝剤の濃度は、トリスの場合
２０〜５００ｍＭが適当である。
【００１７】本試薬中のリン酸脂質としては各種のグリ
セロリン脂質、スフィンゴリン脂質が用いられ、代表例
としてフォスファチジルエタノールアミン、フォスファ
チジルグリセロール、フォスファチジルコリンなどが挙
げられる。また、コレステロールを含むことも可能であ
る。好ましくは０〜４０モル％のフォスファチジルセリ
ン、０〜５０モル％のコレステロール、１０〜９０％モ
ルのフォスファチジルコリンよりなるものが使用され
る。ＡＰＴＴ試薬またはＰＴＴ試薬（血液凝固活性を総
合的に測定する試薬）としてベーリング社、バクスター
・デイド社などから販売されているものも使用できる。
セロリン脂質、スフィンゴリン脂質が用いられ、代表例
としてフォスファチジルエタノールアミン、フォスファ
チジルグリセロール、フォスファチジルコリンなどが挙
げられる。また、コレステロールを含むことも可能であ
る。好ましくは０〜４０モル％のフォスファチジルセリ
ン、０〜５０モル％のコレステロール、１０〜９０％モ
ルのフォスファチジルコリンよりなるものが使用され
る。ＡＰＴＴ試薬またはＰＴＴ試薬（血液凝固活性を総
合的に測定する試薬）としてベーリング社、バクスター
・デイド社などから販売されているものも使用できる。
【００１８】血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含有製剤はヒ
ト血漿をバリウム吸着処理などで精製したものであり、
市販の血漿分画製剤を使用できる。たとえば、乾燥ヒト
血液凝固第IX因子複合体ＰＰＳＢ−ＨＴ（日本製薬社
製）、Plasma Barium CitrateEluate (Sigma 社製）な
どが挙げられる。
ト血漿をバリウム吸着処理などで精製したものであり、
市販の血漿分画製剤を使用できる。たとえば、乾燥ヒト
血液凝固第IX因子複合体ＰＰＳＢ−ＨＴ（日本製薬社
製）、Plasma Barium CitrateEluate (Sigma 社製）な
どが挙げられる。
【００１９】本発明の試薬において、測定感度を向上さ
せるために界面活性剤が適宜加えられる。界面活性剤と
しては、蛋白質に対する作用が温和であるものが好まし
く用いられる。このうち、非イオン性界面活性剤として
はＣＨＡＰＳ（３−［（コールアミドプロピル）ジメチ
ルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、TritonＸ
−100 （ポリオキシエチレングリコールモノ−ｐ−イソ
オクチルフェニルエーテル）、Tween 80（ポリオキシエ
チレンソルビタンモノオレエート）が例示され、また、
アニオン性界面活性剤としてはデオキシコール酸ナトリ
ウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどが挙
げられる。例えば１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グル
コピラノシドを添加する場合、その濃度は５×１０-4〜
２．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、５×１０-3〜０．１
％（ｗ／ｖ）の範囲である。
せるために界面活性剤が適宜加えられる。界面活性剤と
しては、蛋白質に対する作用が温和であるものが好まし
く用いられる。このうち、非イオン性界面活性剤として
はＣＨＡＰＳ（３−［（コールアミドプロピル）ジメチ
ルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、TritonＸ
−100 （ポリオキシエチレングリコールモノ−ｐ−イソ
オクチルフェニルエーテル）、Tween 80（ポリオキシエ
チレンソルビタンモノオレエート）が例示され、また、
アニオン性界面活性剤としてはデオキシコール酸ナトリ
ウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどが挙
げられる。例えば１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グル
コピラノシドを添加する場合、その濃度は５×１０-4〜
２．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、５×１０-3〜０．１
％（ｗ／ｖ）の範囲である。
【００２０】このほか、イオン強度調節のため塩化ナト
リウムを加えることも可能である。本発明の試薬によ
り、光学測定装置を使用して組織因子活性を測定するに
は、Endpoint Assay法あるいはRate Assay法のいずれで
も適用できる。但し、Endpoint Assay法の場合、反応停
止剤を添加する。
リウムを加えることも可能である。本発明の試薬によ
り、光学測定装置を使用して組織因子活性を測定するに
は、Endpoint Assay法あるいはRate Assay法のいずれで
も適用できる。但し、Endpoint Assay法の場合、反応停
止剤を添加する。
【００２１】本発明の試薬により、生理食塩水や水に溶
解した組織因子の他、組織因子産生細胞の破砕液および
培養液、血漿や尿中の組織因子を検出することが可能で
ある。
解した組織因子の他、組織因子産生細胞の破砕液および
培養液、血漿や尿中の組織因子を検出することが可能で
ある。
【００２２】
【作用】本発明による試薬は試料中の組織因子によって
活性化され、生じた活性化第Ｘ因子と該試薬中の発色性
合成基質との酵素反応による生成物量を測定することに
より、組織因子の活性を測定する。こうして、汎用の測
定機器でもって組織因子の活性を簡便にかつ高感度に測
定することができる。
活性化され、生じた活性化第Ｘ因子と該試薬中の発色性
合成基質との酵素反応による生成物量を測定することに
より、組織因子の活性を測定する。こうして、汎用の測
定機器でもって組織因子の活性を簡便にかつ高感度に測
定することができる。
【００２３】また、界面活性剤を共存させることにより
測定感度は一層高めるられる。
測定感度は一層高めるられる。
【００２４】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれによって限定されるものではな
い。
するが、本発明はこれによって限定されるものではな
い。
【００２５】各実施例で吸光度を測定する際用いた分光
光度計は日立分光光度計Ｕ−３２１０であり、生化学用
自動測定装置はＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡII（バクスター社
製）である。
光度計は日立分光光度計Ｕ−３２１０であり、生化学用
自動測定装置はＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡII（バクスター社
製）である。
【００２６】実施例１ 試薬の調製（用手法） Ａ）試料 ヒト胎盤抽出トロンボプラスチン・トロンボレルＳ（ベ
ーリングベルケ社製）を精製水４ｍｌに溶解し、生理食
塩水で希釈した。
ーリングベルケ社製）を精製水４ｍｌに溶解し、生理食
塩水で希釈した。
【００２７】本品に含まれる組織因子の抗原量はＩＭＵ
ＢＩＭＤ Tissue Factor ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ＡＤＩ
社製）を使用して測定した。
ＢＩＭＤ Tissue Factor ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ＡＤＩ
社製）を使用して測定した。
【００２８】Ｂ）緩衝液 ・トリス塩化カルシウム緩衝液；１Ｍ トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（１２１．１４ｇ／ｌ）２０
０ｍｌと１Ｍ ＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ（１４７．０２ｇ／
ｌ）１５ｍｌを混合し、混合液を１Ｎ ＨＣｌ（和光純
薬社製、容量分析用）でｐＨ８．０に調整した後、精製
水で１０００ｍｌにメスアップした。
キシメチル）アミノメタン（１２１．１４ｇ／ｌ）２０
０ｍｌと１Ｍ ＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ（１４７．０２ｇ／
ｌ）１５ｍｌを混合し、混合液を１Ｎ ＨＣｌ（和光純
薬社製、容量分析用）でｐＨ８．０に調整した後、精製
水で１０００ｍｌにメスアップした。
【００２９】・トリスＥＤＴＡ緩衝液；１．４Ｍ トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１６９．６ｇ／
ｌ）５００ｍｌを１ＮＨＣｌ（和光純薬社製、容量分析
用）でｐＨ８．０に調整した後、精製水で１０００ｍｌ
にメスアップした。この溶液にエチレンジアミン四酢酸
・二ナトリウム二水和物（ナカライテスク社製、試薬特
級）を加え、濃度を２．５ｍＭに調整した。
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１６９．６ｇ／
ｌ）５００ｍｌを１ＮＨＣｌ（和光純薬社製、容量分析
用）でｐＨ８．０に調整した後、精製水で１０００ｍｌ
にメスアップした。この溶液にエチレンジアミン四酢酸
・二ナトリウム二水和物（ナカライテスク社製、試薬特
級）を加え、濃度を２．５ｍＭに調整した。
【００３０】・酢酸溶液：２０％ＣＨ3 ＣＯＯＨ ・生理食塩水：日本薬局方生理食塩液９ｇ／ｌ（大塚製
薬社製） Ｃ）発色性合成基質 テストチームＳ−２２２２（kabi社製）を精製水に溶解
し濃度を４．０ｍＭに調整した。
薬社製） Ｃ）発色性合成基質 テストチームＳ−２２２２（kabi社製）を精製水に溶解
し濃度を４．０ｍＭに調整した。
【００３１】Ｄ）血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含有製剤 Plasma Barium Citrate Eluate（シグマ社製）を精製水
に溶解し、濃度を２．２５ｍｇ／ｍｌに調整した。
に溶解し、濃度を２．２５ｍｇ／ｍｌに調整した。
【００３２】Ｅ）リン脂質 ウサギ脳抽出リン脂質・プラテリン（オルガノン・テク
ニカ社製、１．８ｍｇ／vial）１バイアルを精製水１．
２５ｍｌに溶解した。
ニカ社製、１．８ｍｇ／vial）１バイアルを精製水１．
２５ｍｌに溶解した。
【００３３】実施例２ 測定方法（用手法） 実施例１で調製した試薬を使用して、下記の手法で組織
因子活性を測定した。試料２５μｌと同量（ｖ／ｖ）の
リン脂質を混合し、トリス塩化カルシウム緩衝液１００
μｌ、血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含有製剤１００μｌ
および生理食塩水２５０μｌを添加した。３７℃５分間
のインキュベーションの後、トリスＥＤＴＡ緩衝液３０
０μｌを加え、第１次反応（活性化第Ｘ因子の生成）を
停止し、発色性合成基質Ｓ−２２２２ １００μｌを添
加した。３７℃２０分間のインキュベーションの後、２
０％酢酸３００μｌで第２次反応（Ｐ−ニトロアニリン
の生成）を停止し、解離したｐ−ニトロアニリンの吸光
度を波長４０５ｎｍで測定した。
因子活性を測定した。試料２５μｌと同量（ｖ／ｖ）の
リン脂質を混合し、トリス塩化カルシウム緩衝液１００
μｌ、血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含有製剤１００μｌ
および生理食塩水２５０μｌを添加した。３７℃５分間
のインキュベーションの後、トリスＥＤＴＡ緩衝液３０
０μｌを加え、第１次反応（活性化第Ｘ因子の生成）を
停止し、発色性合成基質Ｓ−２２２２ １００μｌを添
加した。３７℃２０分間のインキュベーションの後、２
０％酢酸３００μｌで第２次反応（Ｐ−ニトロアニリン
の生成）を停止し、解離したｐ−ニトロアニリンの吸光
度を波長４０５ｎｍで測定した。
【００３４】結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】 実施例３ 試薬の調製（用手法） Ａ）試料 実施例１と同様の手法で調製した。
【００３６】Ｂ）緩衝液 ・トリス塩化カルシウム緩衝液；１Ｍ トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（１２１．１４ｇ／ｌ）２０
０ｍｌと１Ｍ ＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ（１４７．０２ｇ／
ｌ）１５ｍｌを混合し、混合液を１Ｎ ＨＣｌ（和光純
薬社製、容量分析用）でｐＨ８．０に調整した後、精製
水で１０００ｍｌにメスアップした。この溶液に１−Ｏ
−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ナカライ
テスク社製、試薬特級）１．０ｇを添加し、濃度を０．
１％（ｗ／ｖ）に調整した。
キシメチル）アミノメタン（１２１．１４ｇ／ｌ）２０
０ｍｌと１Ｍ ＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ（１４７．０２ｇ／
ｌ）１５ｍｌを混合し、混合液を１Ｎ ＨＣｌ（和光純
薬社製、容量分析用）でｐＨ８．０に調整した後、精製
水で１０００ｍｌにメスアップした。この溶液に１−Ｏ
−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ナカライ
テスク社製、試薬特級）１．０ｇを添加し、濃度を０．
１％（ｗ／ｖ）に調整した。
【００３７】・トリスＥＤＴＡ緩衝液；実施例１と同様
の方法で調製した。
の方法で調製した。
【００３８】・酢酸溶液：２０％ＣＨ3 ＣＯＯＨ ・生理食塩水：日本薬局方生理食塩液９ｇ／ｌ（大塚製
薬社製） Ｃ）発色性合成基質 実施例１と同様の方法で調製した。
薬社製） Ｃ）発色性合成基質 実施例１と同様の方法で調製した。
【００３９】Ｄ）血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含有製剤 実施例１と同様の方法で調製した。
【００４０】Ｅ）リン脂質 実施例１と同様の方法で調製した。
【００４１】実施例４ 測定方法（用手法） 実施例２と同様の方法で測定した。
【００４２】結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】 比較例１ 試薬の調製（従来法） 実施例１と同様の方法でＡ）試料、Ｂ）緩衝液、Ｃ）発
色性合成基質およびＤ）血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含
有製剤を調製した。
色性合成基質およびＤ）血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含
有製剤を調製した。
【００４４】比較例２ 測定方法（従来法） 比較例１で調製した試料２５μｌに、トリス塩化カルシ
ウム緩衝液１００μｌ、血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含
有製剤１００μｌおよび生理食塩水２５０μｌを添加し
た。３７℃５分間のインキュベーションの後、トリスＥ
ＤＴＡ緩衝液３００μｌを加え、第１次反応（活性化第
Ｘ因子の生成）を停止し、発色性合成基質Ｓ−２２２２
１００μｌを添加した。３７℃２０分間のインキュベ
ーションの後、２０％酢酸３００μｌで第２次反応（Ｐ
−ニトロアニリンの生成）を停止し、解離したｐ−ニト
ロアニリンの吸光度を波長４０５ｎｍで測定した。
ウム緩衝液１００μｌ、血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含
有製剤１００μｌおよび生理食塩水２５０μｌを添加し
た。３７℃５分間のインキュベーションの後、トリスＥ
ＤＴＡ緩衝液３００μｌを加え、第１次反応（活性化第
Ｘ因子の生成）を停止し、発色性合成基質Ｓ−２２２２
１００μｌを添加した。３７℃２０分間のインキュベ
ーションの後、２０％酢酸３００μｌで第２次反応（Ｐ
−ニトロアニリンの生成）を停止し、解離したｐ−ニト
ロアニリンの吸光度を波長４０５ｎｍで測定した。
【００４５】結果を表３に示す。
【００４６】
【表３】 実施例５ 試薬の調製（生化学用自動分析装置用） Ａ）リン脂質 ウサギ脳抽出リン脂質・プラテリン（オルガノン・テク
ニカ社製、１．８ｍｇ／vial）１バイアルを精製水１．
２５ｍｌに溶解した。
ニカ社製、１．８ｍｇ／vial）１バイアルを精製水１．
２５ｍｌに溶解した。
【００４７】Ｂ）試料 実施例１のＡ）と同様に溶解・希釈したトロンボレルＳ
を、上記Ａ）で調製したリン脂質と等量（ｖ／ｖ）混
ぜ、得られた混合物を試料とした。
を、上記Ａ）で調製したリン脂質と等量（ｖ／ｖ）混
ぜ、得られた混合物を試料とした。
【００４８】Ｃ）血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含有製剤 乾燥ヒト血液凝固第IX因子複合体ＰＰＳＢ−ＨＴ（２０
０倍製剤、日本製薬社製）を精製水１０ｍｌに溶解し、
この溶液を原液とした。
０倍製剤、日本製薬社製）を精製水１０ｍｌに溶解し、
この溶液を原液とした。
【００４９】Ｄ）第１試液 １Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１２
１．１４ｇ／ｌ）５０ｍｌ、１Ｍ ＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ
（１４７．０２ｇ／ｌ）５ｍｌ、および１ＮＮａＣｌ
（５８．４４ｇ／ｌ）５０ｍｌの混合液を１Ｎ ＨＣｌ
（和光純薬社製、容量分析用）でｐＨ８．０に調整し、
１０００ｍｌにメスアップした。この溶液に１−Ｏ−ｎ
−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ナカライテス
ク社製）１．０ｇを添加し、濃度を０．１％（ｗ／ｖ）
に調整した。
１．１４ｇ／ｌ）５０ｍｌ、１Ｍ ＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ
（１４７．０２ｇ／ｌ）５ｍｌ、および１ＮＮａＣｌ
（５８．４４ｇ／ｌ）５０ｍｌの混合液を１Ｎ ＨＣｌ
（和光純薬社製、容量分析用）でｐＨ８．０に調整し、
１０００ｍｌにメスアップした。この溶液に１−Ｏ−ｎ
−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ナカライテス
ク社製）１．０ｇを添加し、濃度を０．１％（ｗ／ｖ）
に調整した。
【００５０】Ｅ）第２試液 発色性合成基質スペクトロザイムＦＸａ（ＡＤ社製）を
精製水で溶解し、濃度を４．０ｍＭに調整した。
精製水で溶解し、濃度を４．０ｍＭに調整した。
【００５１】実施例６ 測定方法（生化学用自動分析装置） 実施例５で調製した試料１５μｌと第１試液１７０μｌ
を混合し、混合液を３７℃１０分間インキュベートし
た。次に第２試液を４０μｌ添加した後、生成したｐ−
ニトロアニリンの量を波長４０５ｎｍでの吸光度で測定
した。第２試液添加直後から２０秒間隔で１０分間測定
を行い、１〜３分における１分間当りの吸光度変化量を
求めた。
を混合し、混合液を３７℃１０分間インキュベートし
た。次に第２試液を４０μｌ添加した後、生成したｐ−
ニトロアニリンの量を波長４０５ｎｍでの吸光度で測定
した。第２試液添加直後から２０秒間隔で１０分間測定
を行い、１〜３分における１分間当りの吸光度変化量を
求めた。
【００５２】結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】 実施例７ 試薬の調製（生化学用自動分析装置） Ａ）リン脂質 実施例５と同様に調製した。
【００５４】Ｂ）試料 実施例５と同様に調製した。
【００５５】Ｃ）血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含有製剤 実施例５と同様に調製した。
【００５６】Ｄ）第１試液 １Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１２
１．１４ｇ／ｌ）５０ｍｌ、１Ｍ ＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ
（１４７．０２ｇ／ｌ）５ｍｌ、および１ＮＮａＣｌ
（５８．４４ｇ／ｌ）５０ｍｌの混合液を１Ｎ ＨＣｌ
（和光純薬社製、容量分析用）でｐＨ８．０に調整し、
１０００ｍｌにメスアップした。この溶液にＣＨＡＰＳ
（同人化学研社製、試薬特級）１．０ｇを添加し、濃度
を０．１％（ｗ／ｖ）に調整した。
１．１４ｇ／ｌ）５０ｍｌ、１Ｍ ＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ
（１４７．０２ｇ／ｌ）５ｍｌ、および１ＮＮａＣｌ
（５８．４４ｇ／ｌ）５０ｍｌの混合液を１Ｎ ＨＣｌ
（和光純薬社製、容量分析用）でｐＨ８．０に調整し、
１０００ｍｌにメスアップした。この溶液にＣＨＡＰＳ
（同人化学研社製、試薬特級）１．０ｇを添加し、濃度
を０．１％（ｗ／ｖ）に調整した。
【００５７】Ｅ）第２試液 実施例５と同様に調製した。
【００５８】実施例８ 測定方法（生化学用自動分析装置） 実施例５で調製した試料１５μｌと第１試液１７０μｌ
を混合し、混合液を３７℃１０分間インキュベートし
た。次に第２試液を４０μｌ添加した後、生成したｐ−
ニトロアニリンの量を波長４０５ｎｍでの吸光度で測定
した。第２試液添加直後から２０秒間隔で１０分間測定
を行い、１〜３分における１分間当りの吸光度変化量を
求めた。
を混合し、混合液を３７℃１０分間インキュベートし
た。次に第２試液を４０μｌ添加した後、生成したｐ−
ニトロアニリンの量を波長４０５ｎｍでの吸光度で測定
した。第２試液添加直後から２０秒間隔で１０分間測定
を行い、１〜３分における１分間当りの吸光度変化量を
求めた。
【００５９】結果を表５に示す。
【００６０】
【表５】 表１〜５の結果から明らかなように、従来法では２ｎｇ
／ｍｌ以下の組織因子を検出することは不可能であった
が、本発明による試薬を用いることにより１０ｐｇ／ｍ
ｌ以上の組織因子を検出することが可能となる。また、
本発明の試薬を汎用の生化学用自動測定装置に適用する
ことにより、簡便な操作で短時間に組織因子活性を測定
することが可能である。
／ｍｌ以下の組織因子を検出することは不可能であった
が、本発明による試薬を用いることにより１０ｐｇ／ｍ
ｌ以上の組織因子を検出することが可能となる。また、
本発明の試薬を汎用の生化学用自動測定装置に適用する
ことにより、簡便な操作で短時間に組織因子活性を測定
することが可能である。
【００６１】
【発明の効果】本発明による試薬は試料中の組織因子に
よって活性化され、生じた活性化第Ｘ因子と該試薬中の
発色性合成基質との酵素反応による生成物量を測定する
ことにより、組織因子の活性を測定する。こうして、汎
用の測定機器でもって組織因子の活性を簡便にかつ高感
度に測定することができる。
よって活性化され、生じた活性化第Ｘ因子と該試薬中の
発色性合成基質との酵素反応による生成物量を測定する
ことにより、組織因子の活性を測定する。こうして、汎
用の測定機器でもって組織因子の活性を簡便にかつ高感
度に測定することができる。
【００６２】また、界面活性剤を共存させることにより
測定感度を一層高めることができる。
測定感度を一層高めることができる。
Claims (2)
- 【請求項１】 発色性合成基質、リン脂質、カルシウム
塩、血液凝固第II、VII 、Ｘ因子含有製剤を主成分とし
て含む組織因子活性測定用試薬。 - 【請求項２】 請求項１の記載において、界面活性剤を
含む組織因子の活性測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27944493A JPH07134129A (ja) | 1993-11-09 | 1993-11-09 | 組織因子の活性測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27944493A JPH07134129A (ja) | 1993-11-09 | 1993-11-09 | 組織因子の活性測定用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07134129A true JPH07134129A (ja) | 1995-05-23 |
Family
ID=17611158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27944493A Pending JPH07134129A (ja) | 1993-11-09 | 1993-11-09 | 組織因子の活性測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07134129A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009046274A1 (en) * | 2007-10-03 | 2009-04-09 | The University Of Vermont And State Agriculture College | Methods of detection of factor xia and tissue factor |
-
1993
- 1993-11-09 JP JP27944493A patent/JPH07134129A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009046274A1 (en) * | 2007-10-03 | 2009-04-09 | The University Of Vermont And State Agriculture College | Methods of detection of factor xia and tissue factor |
| US8574849B2 (en) | 2007-10-03 | 2013-11-05 | The University Of Vermont And State Agriculture College | Methods of detection of factor XIa and tissue factor |
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