JP2014209115A - 生体試料中の直接トロンビン阻害薬の測定試薬及び測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前記測定試薬は、低濃度トロンビン及びフィブリノゲンを含有する。前記測定方法は、前記測定試薬を使用することにより、生体試料、トロンビン、フィブリノゲンを溶液中で接触させ、その接触開始から凝固までの時間を測定する工程を含む。
【選択図】なし
Description
本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
[1]低濃度トロンビン及びフィブリノゲンを含有することを特徴とする、直接トロンビン阻害薬の測定試薬。
[2]凝固時間測定時の測定溶液中の最終濃度として、0.1NIHU/mL以上0.83NIHU/mL未満となる濃度でトロンビンを含有する、[1]の直接トロンビン阻害薬の測定試薬。
[3]直接トロンビン阻害薬の測定が、対照試料の凝固時間に対する、直接トロンビン阻害薬含有試料の凝固時間の比を求めるものである、[1]又は[2]の直接トロンビン阻害薬の測定試薬。
[4][1]〜[3]のいずれかの直接トロンビン阻害薬の測定試薬を使用することにより、生体試料、トロンビン、フィブリノゲンを溶液中で接触させ、その接触開始から凝固までの時間を測定する工程を含むことを特徴とする、直接トロンビン阻害薬の測定方法。
[5]直接トロンビン阻害薬の測定が、対照試料の凝固時間に対する、直接トロンビン阻害薬含有試料の凝固時間の比を求めるものである、[4]の直接トロンビン阻害薬の測定方法。
[6][1]〜[3]のいずれかの直接トロンビン阻害薬の測定試薬を使用することにより、生体試料中の直接トロンビン阻害薬の存在量をモニタリングする方法において、
(a)対照試料、トロンビン、フィブリノゲンを溶液中で接触させ、その接触開始から凝固までの時間を測定する工程
(b)直接トロンビン阻害薬含有試料、トロンビン、フィブリノゲンを溶液中で接触させ、その接触開始から凝固までの時間を測定する工程
(c)工程(a)及び(b)で得られた時間の比を求める工程
を含む方法。
トロンビン溶液として構成する場合には、カルシウム塩(好ましくは、塩化カルシウム)を共存させることにより、トロンビンを安定化できるので好ましい。
また、含有されるトロンビンの凝固時間測定時の測定溶液中の最終濃度としては、通常の患者に投与された直接トロンビン阻害薬の血中濃度において、低濃度である方が、凝固時間の検出感度が高いので好ましい。特に、0.1NIHU/mL以上0.83NIHU/mL未満、好ましくは0.15NIHU/mL以上0.75NIHU/mL以下、より好ましくは0.25NIHU/mL以上0.65NIHU/mL以下であることが好ましい。
投与された該直接トロンビン阻害薬の血漿中濃度は、医薬品インタビューフォーム等で報告されている。例えば、アルガトロバンは約0〜500μg/mL、ダビガトランは約0〜200μg/mLで推移することが知られている。
生体試料は、適宜、緩衝液等で希釈して使用することができる。例えば、血漿1に対して緩衝液1〜10容量から選択することができるが、多くのトロンビン時間測定試薬で設定されている血漿1に対して緩衝液9容量が好ましい。利用者が容易に使用することができる。
また、該緩衝液は、フィブリノゲンを含有していることが好ましい。
前記希釈された生体試料は、トロンビン溶液と、1:5〜1:1で混合されると良い。
本発明のDTI測定試薬として、トロンビン含有緩衝液と、フィブリノゲン含有緩衝液の2種類から構成される測定試薬を調製した。
トロンビン(トロンビン液モチダ、持田製薬)を各濃度(0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10NIHU/mL)となるように、30mmol/L BisTris、200mmol/L塩化ナトリウム、20mmol/L塩化カルシウムからなる緩衝液に溶解させ調製した。
オーレンベロナール緩衝液(SYSMEX社)にフィブリノゲン(Enzyme Reseach Laboratories社)を200mg/dLとなるよう溶解させ調製した。
(3−1)ダビガトラン
各濃度のダビガトラン(Tront Research Chemicals)をキャリブレーションコントロール(Calibration Control、IL社)に添加して調製した。
各濃度のアルガトロバン(ノバスタンHI、田辺三菱製薬)をキャリブレーションコントロール(Calibration Control、IL社)に添加して調製した。
(3)に示す方法で調製した試料8μLにフィブリノゲン含有緩衝液72μLを添加し、さらに、トロンビン含有緩衝液80μLを添加した。添加後の反応液の濁度変化を吸光度λ=660nmにて測定した。得られた濁度変化量より凝固時間(秒)を決定した。また、直接トロンビン阻害剤を添加していない血漿の凝固時間に対する、直接トロンビン阻害剤を添加した血漿の凝固時間の比(Ratio)を算出した。上記の手順を、全臨床検査システムSTACIA(三菱化学メディエンス)を用いて実施した。
図1、図2に、それぞれ、ダビガトランとアルガトロバンにおける凝固時間の比に対するトロンビン濃度の影響を示した。なお、図1、図2に示すトロンビン濃度は、凝固時間測定時の測定溶液中の最終濃度である。例えば、トロンビン濃度が2.5NIHU/mLであるトロンビン含有緩衝液(80μL)を用いた場合、凝固時間測定時の測定溶液(160μL)中の最終濃度は1.25NIHU/mLとなる。
図1、図2に示すように、トロンビン濃度の低下に従い、ダビガトラン、アルガトロバンにおける凝固時間の比は上昇することが解った。凝固時間の比が高い方が、特に低値の感度の上昇につながり好ましい。ダビガトラン、アルガトロバンのいずれも、凝固時間測定時の測定溶液中の最終濃度が1.25NIHU/mL以上では、直線性が悪く、特に低値の測定精度が低かった。よって、測定液中の最終濃度としてトロンビン濃度が1.25NIHU/mL未満が適していることがわかった。
また、測定したい、ダビガトラン、アルガトロバン投与後の血中濃度に合わせて、適宜、測定液中の最終濃度としてのトロンビン濃度を設定することができるが、0.156NIHU/mLより大きく、0.625NIHU/mL以下が好ましいことがわかった。
表1に、実施例1に従って調製したDTI測定試薬を用いて、(1)〜(6)の各血漿にダビガトランを250ng/mLとなるように添加したサンプルを測定した結果を示した。トロンビン含有緩衝液は、1.25NIHU/mLとなるように調製した(凝固時間測定時の測定溶液中の最終濃度として0.625NIHU/mL)。
ダビガトランの比は血漿の種類に依らず一定であることがわかった。各血漿は含有する凝固因子にバラツキがあると考えられるが、それにも関わらず、一定の比を得ることができることから効果が高いと言える。
(1)Calibration Plasma(IL社)
(2)Normal Control(IL社)
(3)SHP(シスメックス社)
(4)Ci−Trol Lv1(シスメックス社)
(5)Ci−Trol Lv2(シスメックス社)
(6)Ci−Trol Lv3(シスメックス社)
実施例1に従って調製した試薬を、全臨床検査システムSTACIA(三菱化学メディエンス)、コアプレスタ2000(積水メディカル)を用いて測定した。
サンプルには、ダビガトラン125ng/mLを添加した血漿を用いた。トロンビン含有緩衝液は、1.25NIHU/mLとなるように調製した(凝固時間測定時の測定溶液中の最終濃度として0.625NIHU/mL)。
表2に示すように凝固時間は装置によって大きく異なるが、比は変わらないことがわかった。この結果から、比は、測定装置に依らずDTI濃度を評価できる指標であるといえる。
(1)トロンビン含有緩衝液
トロンビン(トロンビン液モチダ、持田製薬)を1.5NIHU/mLとなるように、30mmol/L BisTris、200mmol/L塩化ナトリウム、20mmol/L塩化カルシウムからなる緩衝液に溶解させ調製した。
オーレンベロナール緩衝液(SYSMEX社)にフィブリノゲン(Enzyme Reseach Laboratories社)を400mg/dLとなるよう溶解させ調製した。
(3−1)臨床検体
抗凝固薬を投薬されている患者血漿検体、及び血友病の患者血漿検体(1例:検体番号67)を使用した。投薬されている抗凝固薬は、DTIとしてダビガトラン(42例:検体番号1〜42)、アルガトロバン(2例:検体番号43〜44)、抗Xa薬としてリバロキサバン(15例:検体番号45〜59)、エドキサバン(1例:検体番号60)、さらに従来からよく使用されている抗凝固薬(ビタミンK拮抗薬)であるワルファリン(6例:検体番号61〜66)である。
対照試料として、シスメックス社のCi−Trol Lv1を用いた。
(3)に示した検体8μLにフィブリノゲン含有緩衝液72μLを添加し、さらに、トロンビン含有緩衝液80μLを添加した。添加後の反応液の濁度変化を吸光度λ=660nmにて測定した。得られた濁度変化量より凝固時間(秒)を決定した。また、対照試料に対する、抗凝固薬を投薬されている患者検体、及び血友病の患者検体の凝固時間の比(Ratio)を算出した。上記の手順を、全臨床検査システムSTACIA(三菱化学メディエンス)を用いて実施した。
なお、Ci−Trol Lv1の凝固時間は、13.5秒であった。
図3に、各抗凝固薬を投薬されている患者検体、及び血友病の患者検体における凝固時間の比を示した。図3より、DTIを投薬されている患者検体でのみ比が延長していることが解った。この結果から、本DTI測定試薬は、検体中のDTI存在の影響を精度良く反映をすることが可能であり、DTIの投薬の有無や検体中のDTI濃度を簡便に高精度で評価できることが示された。
Claims (6)
- 低濃度トロンビン及びフィブリノゲンを含有することを特徴とする、直接トロンビン阻害薬の測定試薬。
- 凝固時間測定時の測定溶液中の最終濃度として、0.1NIHU/mL以上0.83NIHU/mL未満となる濃度でトロンビンを含有する、請求項1に記載の直接トロンビン阻害薬の測定試薬。
- 直接トロンビン阻害薬の測定が、対照試料の凝固時間に対する、直接トロンビン阻害薬含有試料の凝固時間の比を求めるものである、請求項1又は2に記載の直接トロンビン阻害薬の測定試薬。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の直接トロンビン阻害薬の測定試薬を使用することにより、生体試料、トロンビン、フィブリノゲンを溶液中で接触させ、その接触開始から凝固までの時間を測定する工程を含むことを特徴とする、直接トロンビン阻害薬の測定方法。
- 直接トロンビン阻害薬の測定が、対照試料の凝固時間に対する、直接トロンビン阻害薬含有試料の凝固時間の比を求めるものである、請求項4に記載の直接トロンビン阻害薬の測定方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の直接トロンビン阻害薬の測定試薬を使用することにより、生体試料中の直接トロンビン阻害薬の存在量をモニタリングする方法において、
(a)対照試料、トロンビン、フィブリノゲンを溶液中で接触させ、その接触開始から凝固までの時間を測定する工程
(b)直接トロンビン阻害薬含有試料、トロンビン、フィブリノゲンを溶液中で接触させ、その接触開始から凝固までの時間を測定する工程
(c)工程(a)及び(b)で得られた時間の比を求める工程
を含む方法。
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