BR112016007960B1

BR112016007960B1 - Método para obter uma proporção de aldosterona para angiotensina ii (aa2r)

Info

Publication number: BR112016007960B1
Application number: BR112016007960-4A
Authority: BR
Inventors: Marko Poglitsch; Cornelia Schwager; Dunja Van Oyen; Martin Leitner
Original assignee: Attoquant Diagnostics Gmbh
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2023-03-07
Also published as: US20160266151A1; EA035289B1; CN105683760A; EP3058374A1; CA2926382A1; US9829496B2; CA2926382C; NZ717888A; HUE045337T2; AU2014336122A1; EP3058374B1; JP6397907B2; ES2745099T3; WO2015055825A1; DK3058374T3; AU2014336122B2; US10295552B2; JP2017500538A; PL3058374T3; BR112016007960B8

Abstract

MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE HIPERALDOSTERONISMO PRIMÁRIO. A presente invenção refere-se aos métodos e kits para o diagnóstico de hiperaldosteronismo primário (PHA). Em particular, a presente invenção refere-se ao uso de um novo parâmetro de diagnóstico, que é composto da proporção entre o nível de Ang II, em particular o nível de equilíbrio de estado firme de Ang II, e o nível de aldosterona em uma amostra biológica, tal como, por exemplo, plasma. A proporção dos dois parâmetros medidos é usada para diagnosticar o PHA em pacientes, e tem vantagens evidentes sobre os métodos de diagnóstico atualmente usados.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere aos métodos e kits para o diagnóstico de hiperaldosteronismo primário (PHA). Em particular, a presente invenção se refere ao uso de um novo parâmetro de diagnóstico que é composto da proporção entre o nível de angiotensina II (Ang II ou Ang 1-8), em particular o nível de Ang II de equilíbrio de estado constante, e o nível de aldosterona em uma amostra biológica, tal como, por exemplo, plasma. A proporção dos dois parâmetros medidos é usada para diagnosticar o PHA em pacientes, e tem vantagens evidentes sobre os métodos de diagnóstico usados atualmente.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] PHA, também conhecido como aldosteronismo primário, é caracterizado pela superprodução do hormônio de aldosterona de mineralocorticóide não sendo um resultado de secreção excessiva de renina. A aldosterona causa aumento em sódio e retenção de água e excreção de potássio nos rins, levando depois à hipertensão arterial. O diagnóstico de PHA em pacientes com hipertensão arterial é um desafio analítico significativo devido à interferência de testes atualmente disponíveis, com tratamentos anti-hipertensivos, e o poder de diagnóstico insuficiente dos ensaios empregados. O PHA tem muitas causas, incluindo hiperplasia adrenal e carcinoma adrenal. Quando ele ocorre devido a uma aldosterona solitária secretando adenoma adrenal, que é um tipo de tumor benigno, e é a causa mais frequente de PHA (66% dos casos), ele é conhecido como síndrome de Conn. Outras causas de PHA incluem hiperplasia adrenal idiopática bilateral (30% dos casos), hiperplasia adrenal primária (unilateral) (2% dos casos), aldosterona produzindo carcinoma adrenocortical (<1% dos casos), hiperaldosteronismo familiar (FH), aldosteronismo glucocorticóide remediável (FH tipo I, <1% dos casos), FH tipo II (<2% dos casos) e aldosterona ectopicaproduzindo adenoma ou carcinoma (< 0,1% dos casos) (Williams livro didático de endocrinologia. (11a edição). Filadelfia: Saunders/Elsevier. 2008. ISBN 978-1-4160-29113.). Entretanto, devido às capacidades de diagnóstico limitadas, dados sobre a predominância de subformas de PHA são divergentes. Estudos recentes indicam que o predomínio de aldosteronismo, devido à hiperplasia adrenal idiopática bilateral (IAH) ser mais alta do que tinha anteriormente sido acreditado, para tanto quanto 75% de casos de PHA. Uma vez diagnosticado, o PHA pode ser normalmente curado por uma intervenção cirúrgica.

[003] Medir a aldosterona só não é considerado adequado para disgnosticar hiperaldosteronismo primário. Sabe-se que, ao contrário de medir só o nível de aldosterona, a especificação e a sensibilidade do diagnóstico para detectar PHA podem ser melhoradas medindo a atividade de renina ou concentração de aldosterona e combinando os dois parâmetros a uma proporção aritmética, a proporção de aldosterona-para-renina (ARR), que é atualmente usada para diagnóstico de PHA (Tiu S, Choi C, Shek C, Ng Y, Chan F, Ng C, Kong A (2005). "O uso da proporção de aldosterona-renina como um teste de diagnóstico para hiperaldosteronismo primário e suas características de teste sob condições diferentes de amostragem de sangue". J Clin Endocrinol Metab 90 (1): 8. doi:10.1210/jc.2004-1149. PMID 15483077). A proporção de aldosterona para renina (ARR) é a concentração de massa de aldosterona dividida pela atividade de renina e/ou a concentração de renina no plasma do sangue. A proporção de aldosterona para renina pode ser dada em ng/dL por ng/(mL^h), isto é, nanograma por decilitro de aldosterona por nanograma por (mililitro x hora) de renina. Também, ela pode ser dadas em pmol/litro por μgZ(litro^h), caracterizado pelo fato de que a aldosterona é dada em concentração molar. O anterior pode ser convertido para o último multiplicando por 27,6. Também, o valor inverso é esporadicamente dado, isto é, a proporção de renina-para- aldosterona, o valor da qual é o multiplicativo inverso da proporção de aldosterona-para-renina. Proporções entre aldosterona e renina podem também ser calculadas usando outras unidades de concentração (unidade de massa por ml e/ou uma unidade de quantidade por ml) para qualquer um dos dois parâmetros, resultando em valores absolutos diferentes para a proporção, enquanto contendo as informações similares. A concentração de renina usada para o cálculo do ARR poderá também ser dada em μg UIE/ml, que é uma unidade frequentemente usada em diagnósticos clínicos, que também reflete a concentração de renina.

[004] A interrupção (ou limite) de indivíduos normais daqueles com hiperaldosteronismo primário, com base no ARR, é significativamente afetada pelas condições de teste, tais como a posição do corpo e a hora do dia. Em média, uma inteerupão de AAR de 23,6 ng/dL por ng/(mL^hora), expressa em unidades alternativas, como 650 pmol/litro por μg/(litro-hora), foi estimada ter uma sensibilidade de 97% e especificidade de 94% (Tiu et al, citado acima). Um valor de ARR em um indivíduo, que é mais alto do que a suspensão, é usado na técnica anterior para indicar hiperaldosteronismo primário.

[005] Se a proporção inversa (isto é, renina-para-aldosterona) é usada, um valor mais baixo do que a suspensão é considerado para indicar hiperaldosteronismo primário.

[006] No entanto, a ampla variedade de ARR, exibida pelos pacientes que sofrem de PHA, não permite definição nem descriminação confiável entre hipertensão essencial e PHA, desse modo levando aos resultados de diagnóstico e decisões de tratamento falso positivo e/ou falso negativo. Medicação especial e requisitos dietéticos, junto com um protocolo de teste sofisticado, envolvendo a infusão salina, são requeridos para melhorar a força do diagnóstico de ARR em um procedimento de teste confirmador subsequente à varredura de ARR.

[007] É sugerido pelas sociedades endócrinas fazer a varredura para PHA em grupos de pacientes de risco, incluindo pacientes com estágoi 2 do Comitê da Junta Nacional (Joint National Commission) (>160 -179/100 -109 mm Hg), estágio 3 (>180/110 mm Hg), ou hipertensão resistente a fármaco; hipertensão e hipocaliemia espontânea ou induzida por diurético; hipertensão com incidentaloma adrenal (lesão expansiva); ou hipertensão e um histórico de família de hipertensão de início precoce, ou acidente cerebrovascular em uma idade jovem (<40 yr). Parentes hipertensos de primeiro grau de pacientes com PHA, mostram também um maior risco de PHA. De acordo com as orientações clínicas, o meio padrão para o diagnóstico de PHA, até a decisão da cirurgia de cura, é considerado como sendo laborioso e representa diversos riscos para os pacientes.

[008] O racional por trás da medição de ARR, para diagnóstico de PHA, fica atrás das vias fisiológicas responsáveis pela secreção de aldosterona no córtex adrenal. Renina é uma enzima fundamental do sistema renina-angiotensina (RAS), produzindo angiotensina I de angiotensinogênio, que é convertida para Ang II através de outras peptidases. Ang II é conhecido para ligar para Receptores de AT1 (AT1R) levando à secreção de aldosterona, que resulta nos seus efeitos fisiológicos no rim e em outros tecidos. Sob condições saudáveis, o RAS regula o nível de plasma de aldosterona. Sob a condição de PHA, a produção de aldosterona se torna parcialmente independente do RAS, significando que a renina não é mais adicionalmente necessária para manter a produção de aldosterona. A medição do ARR tenta fazer uso dessa desregulamentação de renina e aldosterona. Pacientes de PHA normalmente têm nível de plasma de aldosterona aumentado. Desta maneira, alguns investigadores precisam de nível de aldosterona elevado em adição ao ARR elevado para um teste de varredura positivo para PHA (normalmente aldosterona >15 ng/dl).

[009] O processo de diagnóstico para PHA é iniciado com um teste de detecção de caso de ARR, em grupos de pacientes especificados acima (John W. Funder et al.; J Clin Endocrinol Metab. Setembro de 2008, 93(9):3266 -3281). No caso este primeiro valor de ARR medido excede um certo limite, o paciente é submetido a um teste adicional a fim de garantir a validade dos resultados obtidos. De importância, o valor exato para o limite de ARR é ainda discutido na literatura, devido à ocorrência frequente de falsos negativos e positivos.

[0010] Enquanto são poucos os fármacos anti-hipertensivos, que se considera ter somente efeitos limitados sobre o valor de ARR medido, muitos fármacos anti-hipertensivos são conhecidos por interferir fortemente nos testes de ARR. A causa principal da interferência é representada pelo forte impacto desses fármacos na concentração de renina e na atividade de renina, levando a resultados de ARR alterados. Em consequência, uma fase de limpeza dos fármacos anti-hipertensivos é normalmente necessária antes da confirmação dos testes, que é um risco considerável para os pacientes hipertensos. A própria confirmação do teste consiste em um consumo de tempo e procedimento clínico intensivo dispendioso, que é destinado a reduzir os níveis de renina dos pacientes em resposta aos desafios de fármacos ou osmóticos em combinação com o teste de ARR, antes e depois do procedimento.

[0011] Um teste de confirmação de PHA muito comum é um teste de infusão salina, caracterizado pelo fato de que dois litros de solução salina a 0,9% são administrados ao paciente no decorrer de 4 horas. O aumento do volume deverá resultar em uma diminuição na atividade e concentração de renina. Os níveis de aldosterona pós teste abaixo de 50 pg/ml são considerados como indicando a ausência de PHA, enquanto os níveis de aldosterona pós teste acima de 100 pg/ml são interpretados como um sinal provável de PHA. Valores entre 50 pg/ml e 100 pg/ml são vistos como sendo indeterminados (John W. Funder et al.; J Clin Endocrinol Metab. Setembro de 2008, 93(9):3266 -3281).

[0012] O teste de confirmação positivo dispara ainda testes clínicos incluindo técnicas de formação de imagem adrenal, tais como, por exemplo, tomografia computadorizada (CT) e amostragem de veia adrenal (AVS), para determinar a fonte de produção de aldosterona independente excessiva, e renina. Uma vez que o subtipo é classificado, pode ser realizada a adrenalectomia unilateral ou tratamento com antagonistas receptores de mineralocorticoide.

[0013] A etapa fundamental no processo de diagnóstico é a detecção do caso em pacientes hipertensos de alto risco. O ARR como um teste de detecção do caso, pode facilmente mostrar os resultados positivos e negativos falsos, como entre os pacientes hipertensos a distribuição do valor de ARR em pacientes de PHA, foi mostrado para sobrepor com a distribuição de valores de ARR em pacientes não PHA (Gary L. Schwartz e Etapahen T. Turner; Clinical Chemistry 51 (Química Clínica 51), No. 2, 2005), que poderá facilmente levar a um tratamento incorreto desnecessário dos pacientes. No caso de positivos falsos, esses tratamentos incorretos podem resultar em graves complicações, pois a fase de purificação do fármaco de diversas semanas, em um paciente que é hipertenso a despeito de tomar pelo menos três fármacos anti-hipertensivos, coloca um risco significativo de eventos cardiovasculares fatais, durante este período de pressão sanguínea não controlada. Em adição a isso, o teste de confirmação normalmente requer hospitalização e monitoração constante por médicos, sendo de consumo de tempo e dinheiro para o paciente e o sistema de cuidados de saúde. No caso de um resultado falso negativo, o paciente de PHA continuará a viver com hipertensão resistente, que tem um prognóstico fatal, devido a um risco severamente crescente para eventos cardiovasculares ameaçadores da vida como acidentes vasculares ou ataques do coração.

[0014] A presente invenção provê um método para o diagnóstico de hiperaldosteronismo primário em um sujeito, compreendendo obter uma amostra biológica do sujeito, medindo o nível de aldosterona e o nível de Ang II, e calculando a proporção dos mesmos (proporção de aldosterona-para-angiotensina II proporção, AA2R). O dito método tem vantagens substanciais sobre os métodos de diagnóstico baseados em ARR usados atualmente descritos acima.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0015] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para o diagnóstico de hiperaldosteronismo primário em um sujeito, compreendendo obter uma amostra biológica do sujeito, medindo o nível de aldosterona e o nível de Ang II, e calculando a proporção dos mesmos (proporção de aldosterona-para-angiotensina II, AA2R). Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um kit para diagnosticar PHA, compreendendo um Ang II padrão, uma aldosterona padrão, e opcionalmente ainda compreendendo um manual e/ou componentes adicionais.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0016] Figura 1: Painel de esquerda: Ang II para Proporção de PRA em 14 voluntários saudáveis. Painel da direita: Ang II para a Proporção de PRC em plasma saudável não tratado e Iniciador de ACE- voluntários saudáveis tratados.

[0017] Figura 2: Painel da esquerda: Ang II para a Proporção de PRA em voluntários saudáveis não tratados e tratados com Inibidor de ACE (n=14). Painel do Meio: PRA em voluntários saudáveis não tratados e tratados com inibidor de ACE (n=14). Painel da Direita: Ang II para a Proporção de PRC em voluntários saudáveis não tratados e tratados com Inibidor de ACE (n=4).

[0018] Figura 3: Comparação de ARR e AA2R para um paciente não PHA e um paciente de PHA confirmado pré e pós 4 horas de teste de confirmação de infusão salina. Painel da esquerda: Valores são dados como percentagens de sinal de pré-infusão para paciente não pHA. Painel da Direita: Comparação de fatores de ARR e AA2R de descriminação específica entre paciente de PHA e não PHA são mostrados para cada ponto do tempo.

[0019] Figura 4: Impacto dos tratamentos anti-hipertensivos sobre a concentração de renina. Amostras de plasma foram coletadas de voluntários saudáveis, antes (Pré-dose) e 4 horas pós-administração de uma dose única de um inibidor ACE (esquerda), inibidor de renina (meio) ou bloqueador receptor de angiotensina (ARB, à direita). Valores médios de 5 voluntários saudáveis +/- SEM são mostrados nos gráficos.

[0020] Figura 5: Comparação do impacto da administração do bloqueador de RAS no ARR (painel de cima) e o AA2R (painel de baixo). Amostras de plasma foram coletadas de voluntários saudáveis antes (Pré-dose) e 4 horas pós-administração de uma dose única do inibidor de ACE (esquerda), inibidor de renina (meio) ou bloqueador receptor de angiotensina (ARB, à direita). Concentração de aldosterona de plasma, concentração de angiotensina II de equilíbrio e concentração de renina ativa foram medidas e o ARR e o AA2R foram calculados para cada amostra. Para o cálculo de ARR, concentrações de aldosterona em ng/L foram divididas pela concentração de renina ativa de plasma ng/L. Para o cálculo de AA2R, concentrações de aldosterona em pmol/L foram divididas pelas concentrações de Ang II em pmol/L. Os valores médios de 5 voluntários saudáveis +/- SEM são mostrados nos gráficos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0021] Atualmente, os métodos disponíveis para o diagnóstico de PHA em pacientes fazem uso da correlação entre atividade de renina de plasma, ou concentração de renina em plasma e a concentração de aldosterona no plasma. O cálculo da proporção de aldosterona para renina (ARR) foi mostrado para possibilitar uma discriminação parcial entre pacientes de PHA e de não PHA. No entanto, os resultados de falso positivo como também de falso negativo são frequentes. Renina é conhecida por ser responsável pela produção de Angiotensina I (Ang I), que serve como um substrato para a formação de Ang II por outras enzimas proteolíticas como quimase, ou enzima convertida em angiotensina (ACE). Ang II é o principal hormônio efetor do RAS e é sobretudo responsável pelas funções fisiológicas mediadas por RAS, incluindo a regulagem o equilíbrio do fluido e pressão sanguínea. É amplamente aceito que a atividade de renina e a concentração servem como marcadores substitutos para a atividade do RAS (Swales JD and Thurston HJ; Clin Endocrinol Metab. Julho de 1977; 45(1):159-63), que é usado para suportar o uso do ARR como um marcador de diagnóstico para PHA.

[0022] Surpreendentemente resultou que os níveis de Ang II, medidos em amostras de plasma equilibradas (isto é, níveis de Ang II medidos de acordo com o método de equilíbrio de estado constante (SSE), como descrito abaixo, também chamado níveis de equilíbrio de Ang II), mostram uma fraca correlação com a atividade de renina de plasma (PRA) e a concentração de renina de plasma (PRC), indicada por uma grande variabilidade das proporções de Ang II para PRA e Ang II para PRC, quando sujeitos individuais são comparados (Figura 1, painel de esquerda e direita). Foi coletado o sangue de 14 voluntários saudáveis sem tratamento anti-hipertensivo. O plasma foi isolado por centrifugação e os níveis de equilíbrio de Ang II foram medidos em amostras estabilizadas, 60 minutos depois do equilíbrio de plasma a 37°C. Os métodos de mensuração dos níve is de RAS em estado de níveis de equilíbrio constantes são ainda descritos em WO 2013/182237. Para a medição de PRA, amostras similares foram submetidas a um ensaio de formação de Angiotensina I como descrito (Bystrom et al., Clin. Chem. 56 (2010), 1561-1569]). Angiotensina I foi quantificada por espectrometria de massa, e a atividade de renina de plasma foi calculada em (ng Ang I/ml)/h. O gráfico mostra o equilíbrio de Ang II para a proporção de atividade de renina. As proporções dos 14 doadores foram em uma faixa entre 48 e 1022 [pg Ang II/ml]/[(ng Ang I/ml)/h], que é 11% e 232% da média de todos os 14 doadores.

[0023] Em uma segunda abordagem, a concentração de renina de plasma (PRC) foi determinada em 4 voluntários não tratados e 4 voluntários tratados com o inibidor de ACE, usando um anticorpo comercialmente disponível e clinicamente aplicado baseado em ensaio de renina (Diasorin). Os níveis de equilíbrio de Ang II foram medidos por espectrometria de massa, 60 minutos depois da concentração de plasma a 37°C e estabilização da amostra. O equilíb rio deAng II para a proporção de PRC foi calculado e mostrado no gráfico de pacientes tratados pelo inibidor de ACE e não tratados. A unidade da proporção mostrada é [pg Ang II/ml]/[μgUIE/ml Renina]. Em todas as subfamílias de pacientes investigados, as proporções de Ang II para PRA e de Ang II para PRC foram descobertas ser altamente variáveis. Além do mais, o tratamento de inibidor de ACE- resultou em uma redução significativa de ambas as proporções de Ang II para PRC (Figura 2, painel da direita) e Ang II para PRA (Figura 2, painel da esquerda).

[0024] Concluindo, uma concentração similar de renina e/ou atividade, resulta(m) em concentrações diferentes de Ang II em doadores individuais indicando que a atividade de renina e/ou concentração é um marcador fraco para atividade fisiológica de RAS. Em consequência, o ARR insuficientemente exibe a atividade de RAS relacionada ao nível de aldosterona, colocando um ponto de interrogação sobre a adequabilidade de ARR como uma ferramenta de varredura para PHA. Essas considerações ainda explicam as limitações na detecção do caso de PHA através de medições de ARR, que é inclinada aos resultados de falso positivo e falso negativo e altamente dependente dos antecedentes terapêuticos dos pacientes (John W. Funder et al.; J Clin Endocrinol Metab. setembro 2008, 93(9):3266-3281;, e Gary L. Schwartz and Etapahen T. Turner; Clinical Chemistry 51, No. 2, 2005).

[0025] Além do mais, as proporções de Ang II para PRA e Ang II para PRC são significativamente afetadas pelo tratamento com o Inibidor-ACE (Figura 1, painel da direita; Figura 2, painéis da esquerda e direita). Surpreendentemente, enquanto o tratamento com o Inibidor ACE aumenta a atividade e a concentração de renina, e a proporção de Ang II para renina foi significativamente reduzida (Figura 2, painel do meio).

[0026] Desta maneira, nós concluímos que a fraca correlação de atividade e concentração de renina com os níveis de Ang II, na ausência e presença de um fármaco anti-hipertensivo, como um Inibidor de ACE, provoca limitado poder de previsão de ARR para o diagnóstico de PHA.

[0027] Ao contrário, a presente invenção refere-se a um método para o diagnóstico de hiperaldosteronismo primário em um sujeito, compreendendo medir o nível de aldosterona e o nível de angiotensina II (Ang II) em uma amostra biológica do sujeito, e calculando a proporção entre o nível de aldosterona e o nível de Ang II (proporção de aldosterona-para-angiotensina II, AA2R). Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para o diagnósco de hiperaldosteronismo primário em um sujeito, compreendendo obter uma amostra biológica do sujeito, medindo o nível de aldosterona e o nível de angiotensina II, e as combinando somente a uma proporção aritmética (proporção de aldosterona para angiotensina II, AA2R).

[0028] O termo "nível", como usado aqui, se refere à concentração de uma substância (por exemplo um componente de RAS, tal como renina, Ang II, aldosterona etc.) em uma amostra biológica, tal como por exemplo, sangue, plasma ou soro. A dita concentração pode ser dada em mol/L, mmol/ml, μg UIE/ml, ng/ml, pg/ml ou qualquer outra unidade de concentração.

[0029] Em uma modalidade, um AA2R alto indica hiperaldosteronismo primário, e um AA2R baixo indica sem hiperaldosteronismo primário. Em uma modalidade, um AA2R alto, quando comparado ao AA2R de um ou mais sujeitos não PHA confirmado, indica hiperaldosteronismo primário e/ou um AA2R baixo, quando comparado ao AA2R de um ou mais sujeitos de PHA confirmado, indica sem hiperaldosteronismo primário. Em uma modalidade, um AA2R similar ao AA2R de um ou mais pacientes não PHA confirmados, indica sem hiperaldosteronismo primáiro e/ou um AA2R similar ao AA2R de um ou mais pacientes PHA confirmados, indica hiperaldosteronismo primário. Em uma modalidade, o termo "similar", como usado acima, significará que a diferença entre as respectivas proporções (isto é, os AA2Rs) é menos do que 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, ou 5%.

[0030] O AA2R resultou para mostrar uma proporção positiva para negativa melhorada, como mostrado pela comparação de um paciente hipertenso não PHA com um paciente PHA hipertenso, pré e pós um teste de infusão salina (SIT) (Exemplo 1, Figura 3). No painel da esquerda, para cada teste individual (ARR e AA2R), os resultados dos testes foram relacionados ao valor de pré-SIT e expresso em percentual. O paciente de PHA foi claramente positivo, de acordo com os critérios de teste de ARR, com teste de pré e pós-infusão salina (SIT) níveis de aldosterona de plasma de 471 pg/ml e 548 pg/ml respectivamente, e um ARR resultante pré e pós (proporção de Aldosterona para PRC) de 588.8 e 421.5 respectivamente (PRC pré SIT: 0,8 μg UIE/ml; PRC pós SIT: 1,3 μg UIE/ml). O paciente não PHA mostrou uma concentração de plasma de aldosterona pré e pós SIT de 190 pg/ml e 64 pg/ml, respectivamente, com um pré e pós SIT de ARR de 19,2 e 16,4 respectivamente, que é claramente negativo, de acordo com os critérios de teste (John W. Funder et al.; J Clin Endocrinol Metab. Setembro de 2008, 93(9):3266 -3281). Além do mais, fatores do ensaio de discriminação específico foram calculados como uma medida de desempenho de diagnóstico (ou poder do diagnóstico) e comparado para ARR e AA2R (Figura 3, painel da direita). O fator de discriminação é útil para comparar testes diferentes medindo duas amostras idênticas com ambos os testes, dos quais um é uma amostra negativa verdadeira e um é uma amostra positiva verdadeira. O fator de discriminação representa a proporção entre o sinal positivo verdadeiro e o sinal negativo verdadeiro. Um alto fator de discriminação significa que a diferença entre uma amostra negativa verdadeira e uma amostra positiva verdadeira é alta, o que implica um melhor desempenho de diagnóstico comparado com um teste com fator de discriminação mais baixo obtido para amostras similares. Quando relacionando o valor de pré-SIT de ARR do paciente de PHA confirmado, ao valor de pré-SIT de ARR do paciente não PHA confirmado, um fator de discriminação de 30,7 entre o paciente de não PHA confirmado (negativo verdadeiro) e o paciente de PHA confirmado (positivo verdadeiro) é obtido. O fator de discriminação de pós-SIT entre pacientes não PHA e o de PHA, foi 25,5 quando analisado por ARR.

[0031] Surpreendentemente, a análise das amostras idênticas dos mesmos dois pacientes por AA2R revelou um fator de discriminação de 150.8 para amostras de pré-SIT e um fator de discriminação entre os pacientes de não PHA e o de PHA de 325.0 para as amostras de pós-SIT (Figura 3, painel da direita). Nós concluímos que usando AA2R em vez de ARR aumenta firmemente o fator entre sinais negativos e positivos, levando a um desempenho de diagnóstico aumentado de maneira marcante.

[0032] Em uma modalidade da presente invenção, a proporção de valores entre um ou mais sujeitos de PHA positivo confirmado e um ou mais sujeitos de PHA negativo confirmado (isto é, o fator de discriminação) baseada no AA2R é mais alta do que entre os mesmos conjuntos de dados baseados no ARR. Desta maneira, em uma modalidade, a proporção entre o AA2R de um ou mais sujeitos de PHA positivo confirmado e o AA2R de um ou mais sujeitos de PHA negativo confirmado, é maior do que a proporção do mesmo conjunto de dados baseados no ARR. Em outras palavras, a proporção entre o AA2R de um ou mais sujeitos de PHA positivo confirmado e o AA2R de um ou mais sujeitos de PHA negativo confirmado, é mais alto do que a proporção entre o ARR do mesmo um ou mais sujeitos de PHA positivo confirmado, e o ARR o mesmo de um ou mais sujeitos de PHA negativo confirmado.

[0033] O termo "fator de discriminação" como usado aqui, pode se referir à proporção do parâmetro de diagnóstico (por exemplo, ARR ou AA2R) de um ou mais sujeitos de PHA confirmado (ou sujeitos de PHA positivo confirmado) para o parâmetro de diagnóstico (por exemplo ARR ou AA2R) de um ou mais sujeitos de não PHA confirmado (ou sujeitos de PHA negativo confirmado), ou ao um ou mais valores médios de tais parâmetros, por exemplo, um valor médio de ARR ou AA2R de uma subfamília de sujeitos de PHA sujeitos confirmado, e um valor médio de ARR ou AA2R de uma subfamília de sujeitos de não PHA confirmado. Desta maneira, o fator de discriminação é a proporção do ARR de um ou mais sujeitos de PHA confirmado para o ARR de um ou mais sujeitos de não PHA confirmado, ou o AA2R de um ou mais sujeitos de PHA confirmado para o AA2R de um ou mais sujeitos de não PHA confirmado. O fator de discriminação é uma medida para o desempenho do diagnóstico (ou pode do diagnóstico) do respectivo parâmetro ou teste de diagnóstico. Quando maior a proporção, maior é o poder de diagnóstico, e menor o risco de resultados positivos falsos e/ou negativos falsos. O termo "sujeito de PHA confirmado" refere-se à um sujeito que sofre de PHA e foi diagnosticado como positivo pelos métodos convencionais (por exemplo um primeiro teste de varreduras medindo o ARR, e pelo menos um teste de confirmação, medindo o ARR uma segunda ou terceira ou mais vezes, opcionalmente antes ou depois de um SIT), ou tendo sido diagnosticado como positivo pelos métodos, de acordo com a presente invenção (por exemplo a medição de AA2R não requerendo qualquer teste de confirmação), e/ou pode ainda ter sido confirmado por cirurgia e/ou técnicas de formação de imagem (por exemplo CT e/ou amostra de veia adrenal.) O termo "sujeito de não PHA confirmado" refere-se à um sujeito que não sofre de PHA e que foi diagnosticado como negativo, pelos métodos convencionais (por exemplo, um primeiro teste de varredura medindo o ARR, e opcionalmente um ou mais testes de confirmação medindo o ARR uma segunda ou terceira ou mais vezes, opcionalmente antes e depois de um SIT), ou tendo sido diagnosticado como negativo pelos métodos de acordo com a presente invenção (por exemplo a medição de AA2R não requerendo nenhum teste de confirmação ou outras medidas de confirmação, tal como, por exemplo, técnicas de formação de imagem). Uma ou mais amostras de um ou mais "sujeitos de não PHA confirmado" ou de um ou mais "sujeitos de PHA confirmado" podem ser usadas como controles normais nos métodos da invenção para comparação com a amostra sob investigação, isto é, uma ou mais amostras de um ou mais "sujeitos de não PHA confirmado" podem ser usadas como controle negativo, e/ou uma ou mais amostras de um ou mais "sujeitos de PHA confirmado" podem ser usadas como controle positivo. Por exemplo, um AA2R alto, quando comparado ao AA2R de um ou mais sujeitos de não PHA confirmado, indica hiperaldosteronismo primário, e/ou um AA2R baixo, quando comparado ao AA2R de um ou mais sujeitos de PHA confirmado, indica não hiperaldosteronismo primário. Se duas ou mais amostras são usadas como controle negativo e/ou positivo, o valor médio (isto é, a média aritmética) ou a média das amostras correspondentes pode ser determinada. Com base em tais amostras ou valores de controle dos mesmos, um limite de discriminação (ou suspensão) pode ser determinado, acima do qual o sujeito é diagnosticado como sendo PHA positivo, e abaixo do qual o sujeito é diagnosticado como sendo PHA negativo. Tal limite pode também ser determinado com base na distribuição de valores de AA2R em uma subfamília de pacientes compreendendo sujeitos de PHA positivo e PHA negativo. O limite pode ser determinado separadamente para subfamílias de pacientes diferentes (por exemplo, limites diferentes podem ser determinados para grupos de pacientes tratados com fármacos anti-hipertensivos diferentes). Qualquer um dos parâmetros descritos acima, que podem ser usados para determinar um limite (ou nível de comparação) pode ser usado só ou em combinação com um ou mais dos outros parâmetros, a fim de resultar em um limite final.

[0034] Embora os métodos da presente invenção podem não requerer qualquer teste de confirmação, como já estabelecido acima, testes de confirmação podem no entanto ser feitos (por exemplo, se desejado por um médico ou paciente). Além disso, os métodos da própria invenção podem ser usados como testes de confirmação, isto é, aplicados depois de um primeiro teste de varredura que tenha sido feito com métodos clássicos baseados no ARR.

[0035] Em uma modalidade, o fator de discriminação para um ou mais pares de dados ou conjuntos de dados mencionados (por exemplo, um ou mais sujeitos suspeitos ou de PHA confirmado, comparados a um ou mais sujeitos suspeitos, ou de não PHA confirmado, ou o valor médio de uma subfamília de sujeitos suspeitos, ou de PHA confirmado, comparados ao valor médio de uma subfamília suspeita de, ou de sujeitos de não PHA confirmado) como determinado, baseado no AA2R mais alto do que o fator de discriminação para os mesmos pares de dados ou conjuntos de dados, como determinado com base no ARR, em particular com base no ARR de um teste de varredura (isto é, a primeira medição de ARR, e/ou o ARR anterior a qualquer teste de confirmação), e/ou baseado no ARR de um teste de confirmação (isto é, a segunda ou adicional medição do ARR, e/ou o ARR em seguida a qualquer teste de varredura). Em uma modalidade, o fator de discriminação para um ou mais determinados pares de dados ou conjuntos de dados (por exemplo, um ou mais sujeitos suspeitos ou de PHA confirmado, comparados a um ou mais sujeitos de ou suspeitos de não PHA confirmado, ou o valor médio de uma de sujeitos suspeitos ou de PHA confirmado, comparados ao valor médio de uma subfamília de suspeitos ou sujeitos de não PHA confirmado), como determinado com base no AA2R é maior do que, em particular significativamente maior do que, o fator de discriminação para os mesmos pares de dados ou conjuntos de dados como determinado com base no ARR, em particular com base no ARR de um teste de varredura (isto é, a primeira medição do ARR, e/ou o ARR antes de qualquer teste de confirmação), e/ou com base no ARR de um teste de confirmação (isto é, uma segunda ou adicional medição do ARR, e/ou o ARR em seguida a qualquer teste de varredura). Em uma modalidade, o fator de discriminação para um ou mais pares de determinados dados ou conjuntos de dados (por exemplo um ou mais suspeitos ou sujeitos de PHA confirmado, comparados a um ou mais suspeitos ou sujeitos de não PHA confirmado, ou o valor médio de uma subfamília de suspeitos, ou sujeitos de PHA confirmado, em comparação ao valor médio de uma subfamília de suspeitos ou sujeitos de não PHA confirmado), como determinado com base no AA2R, é pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, ou 500% maior do que o fator de discriminação para os mesmos pares de dados ou conjuntos de dados, como determinado com base no ARR, em particular com base no ARR de um teste de varredura (isto é, a primeira medição do ARR, e/ou o ARR antes de qualquer teste de confirmação), e/ou com base no ARR de um teste de confirmação (isto é, a segunda ou adicional medição do ARR, e/ou o ARR em seguida a qualquer teste de varredura). Em uma modalidade, o fator de discriminação para um ou mais determinados pares de dados ou conjuntos de dados (por exemplo, um ou mais suspeitos ou sujeitos de PHA confirmado comparados a um ou mais suspeitos ou sujeitos de não PHA confirmado, ou o valor médio de uma subfamília de suspeitos ou sujeitos de PHA confirmado, comparado ao valor médio de uma subfamília de suspeitos ou sujeitos de não PHA confirmado) como determinado com base no AA2R é pelo menos 50 por cento, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes, ou dez vezes maior do que o fator de discriminação para os mesmos pares de dados ou conjuntos de dados, como determinado com base no ARR, em particular com base no ARR de um teste de varredura (isto é, a primeira medição do ARR, e/ou o ARR antes de qualquer teste de confirmação), e/ou com base no ARR de um teste de confirmação (isto é, a segunda ou adicional medição do ARR, e/ou o ARR em seguida a qualquer teste de varredura).

[0036] O termo "sujeito com suspeita de PHA" se refere a um sujeito suspeito de sofrer de PHA, e não tendo ainda sido diagnosticado como positivo pelos métodos convencionais (por exemplo, um primeiro teste de varredura medindo o ARR, e pelo menos um teste de confirmação medindo o ARR uma segunda ou terceira ou mais vezes, opcionalmente antes ou depois de um SIT), ou não tendo sido diagnosticado como positivo pelos métodos de acordo com a presente invenção (por exemplo, a medição de AA2R não requerendo nenhum teste de confirmação), ou tendo sido diagnosticado anteriormente, mas com resultado não claro, e/ou o prévio diagnóstico requerendo ainda confirmação. O termo "sujeito suspeito de não PHA" se refere a um sujeito suspeito de não sofrer de PHA e não tendo ainda sido diagnosticado como negativo, pelos métodos convencionais (por exemplo um primeiro teste de varredura medindo o ARR, e opcionalmente um ou mais testes de confirmação medindo o ARR, uma segunda ou terceira ou mais vezes, opcionalmente antes de depois de um SIT), ou ainda não tendo sido diagnosticado como negativo, pelos métodos de acordo com a presente invenção (por exemplo, a medição de AA2R não requer qualquer teste de confirmação), ou tendo sido diagnosticado anteriormente, mas resultado não claro, e/ou o diagnóstico anterior requerendo confirmação adicional.

[0037] Uma subfamília de pacientes deve ser submetida aos critérios de pré-seleção (por exemplo: pressão sanguínea mínima, nível de aldosterona mínimo, certos tratamentos com fármaco), comparação anterior de seletividade e/ou sensibilidade entre AA2R e ARR. Por exemplo, alguns pesquisadores conduzindo ARR com base nos testes de varredura requerem um nível mínimo de aldosterona de 15 ng/dl para um resultado do teste de varredura positivo, que poderá resultar em uma sensibilidade alterada e/ou especificidade comparada a uma subfamília de pacientes não pré-selecionada.

[0038] Em uma modalidade, a especificidade do método da invenção, definida em uma subfamília de pacientes, é igual ou maior do que a especificidade dos métodos clássicos de ARR na mesma subfamília de pacientes, em particular com base no ARR de um teste de varredura (isto é, a primeira medição de ARR, e/ou o ARR antes de qualquer teste de confirmação). A especificidade pode ser dada em percentual, caracterizado pelo fato de que

[0039] Em uma modalidade, a especificidade do método da invenção é maior do que a especificidade dos métodos clássicos de ARR, em particular significativamente maior do que os métodos clássicos de ARR. Em uma modalidade, a especificidade é maior do que 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%. Em uma modalidade, a especificidade do método é pelo menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%. Em uma modalidade, a especificidade do método é 100%.

[0040] Em uma modalidade, a sensibilidade do método da invenção, definida em uma subfamília de pacientes, é igual ou maior do que a sensibilidade dos métodos clássicos de ARR, na mesma subfamília de pacientes, em particular com base no ARR de um teste de varredura (isto é, a primeira medição do ARR, e/ou o ARR antes de qualquer teste de confirmação).

[0041] A sensibilidade pode ser dada em percentagem, caracterizado pelo fato de que

[0042] Em uma modalidade, a sensibilidade do método da invenção é maior do que a sensibilidade dos métodos clássicos de ARR, em particular significativamente maiores do que os métodos clássicos de ARR. Em uma modalidade, a sensibilidade do método é pelo menos 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%. Em uma modalidade, a sensibilidade do método é maior do que 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%. Em uma modalidade, a sensibilidade do método é 100%.

[0043] Em uma modalidade, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de todos sujeitos de PHA confirmados,de têm um AA2R maior do que pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de todos os sujeitos de não PHA confirmado. Com os métodos e kits da presente invenção, é possível claramente diferenciar sujeitos entre PHA e não PHA, uma vez que o grau de sobreposição da distribuição do valor de AA2R de sujeitos PHA e de não PHA, é substancialmente menor do que a sobreposição dos valores de ARR de sujeitos de PHA e não PHA. Em uma modalidade, a sobre- posição é 10% ou menos, 9% ou menos, 8% ou menos, 7% ou menos, 6% ou menos, 5% ou menos, 4% ou menos, 3% ou menos, 2% ou menos, 1% ou menos.

[0044] Sujeitos que são suspeitos de sofrer de PHA estão normalmente sob tratamento anti-hipertensivo. Por exemplo, o sujeito recebeu e/ou recebe uma ou mais composições farmacêuticas (aqui referidas também como fármacos) ou tratamentos, em particular composições farmacêuticas e/ou tratamentos anti-hipertensivos, no tempo em que o diagnóstico de PHA é feito. A interferência do teste de ARR com os tratamentos anti-hipertensivos representa um obstáculo bem conhecido para os diagnósticos de PHA em pacientes hipertensos. Pacientes hipertensos resistentes representam um grupo de alto risco para PHA, e são por definição tratados com pelo menos três fármacos anti-hipertensivos, simultaneamente, enquanto ainda sofrem de pressão sanguínea patologicamente elevada. Muitos dos fármacos anti-hipertensivos clinicamente usados são conhecidos ter um impacto sobre os níveis de renina e de aldosteronas, enquanto a renina é normalmente afetada de maneira mais forte do que a aldosterona, que resulta em desvios imprevisíveis nos resultados dos testes de ARR, levando a decisões de diagnóstico falso negativo e falso positivo (John W. Funder et al.; J Clin Endocrinol Metab. Setembro de 2008, 93(9):3266 -3281).

[0045] Um grupo de agentes anti-hipertensivos amplamente usado no uso clínico, é o grupo de bloqueadores de RAS. Bloqueadores de RAS interferem com o RAS, a fim de reduzir o nível de Ang II (por exemplo, Inibidores de Renina, Inibidores de ACE) ou bloquear a ação de Ang II no Receptor de AT1- (por exemplo, Bloqueadores Receptores de Angiotensina, ARBs). Em adição aos bloqueadores de RAS, ativadores de RAS podem ser usados como agentes anti- hipertensivos. Por exemplo, ACE2 pode ser administrado para tratar hipertensão, como descrito, por exemplo, em WO2004/000367 e WO2008/151347.

[0046] Fármacos e/ou tratamentos que afetam, especialmente aumentam, a atividade de renina e/ou concentração de renina afetam, especialmente diminuem, o ARR. O poder do diagnóstico do ARR é diminuído por tais fármacos e/ou tratamentos. Tratamento de 5 voluntários saudáveis, com doses únicas de diferentes agentes anti- hipertensivos (Exemplo 2), resultou em um altamente significativo aumento de 3 a 10- vezes na concentração da renina de plasma ativo (Figura 4). Essas mudanças na concentração de renina ativa, induzidas por fármacos, afetou profundamente o ARR nesses indivíduos.

[0047] A administração de uma dose única de um inibidor de ACE (10 mg de Enalapril), um inibidor de renina (150 mg de Aliskiren) ou um ARB (50 mg de Losartan) resultou em uma diminuição altamente significativa e profunda no ARR (Figura 5, painel superior), que resulta em um poder de diagnóstico firmemente reduzido do ARR na presença desses fármacos anti-hipertensivos. Valores baixos de ARR, que são causados pelos tratamentos anti-hipertensivos, são levados a resultados negativos falsos. Ao contrário para o ARR, a maioria dos fármacos anti-hipertensivos não afetaram significativamente o AA2R, exceto para ARBs (Figura 5, painel inferior). A comparação do AA2R antes e depois da administração do fármaco, revelou que a administração de um inibidor de ACE, nem a administração de um inibidor de renina, resultou em mudanças significativas no AA2R, enquanto o ARR foi significativamente diminuído em resposta ao tratamento de fármaco. O ARB, que evita a ligação de Ang II para receptores de AT1, desta maneira resultando em acumulação de Ang II junto com um aumento na concentração de renina ativa, foi o único fármaco que resultou em uma significativa diminuição do AA2R, enquanto o ARR é significativamente afetado por cada teste de fármaco anti-hipertensivo.

[0048] A atividade de renina e/ou concentração de renina é controlada através de múltiplos mecanismos reguladores fisiológicos. Qualquer fármaco que interfere em tal mecanismo regulador pode afetar a atividade e/ou concentração de renina. Por exemplo, diuréticos são uma classe comum de fármacos anti-hipertensivos, que reduz a pressão sanguínea por intensificar a diurese. A diurese intensificada resulta em aumento na atividade e/ou concentração de renina. Desta maneira, o tratamento de sujeitos com diuréticos diminui o ARR. Exemplos de diuréticos em uso clínico são furosemida, torsemida, hidroclorotiazida, azetazolamida, metazolamida, eplerenona, espironolactona, amilorida, e triantereno. Os efeitos sobre a atividade e/ou concentração de renina podem também ser mediados indiretamente por bloqueio de uma ou mais etapas na cascata de RAS, que é a jusante de renina.

[0049] Por exemplo, o bloqueio da conversão de Ang I para Ang II por inibidores de ACE é relevante para o ARR pois ele resulta em atividade de renina aumentada e/ou concentração através de um mecanismo de compensação fisiológico. Este efeito sobre a renina e, desse modo, o ARR pode ser também o caso de outros fármacos interferindo com reações enzimáticas do RAS, tal como a conversão de Ang I para Ang 2-10 por aminopeptidase, e/ou a conversão de Ang I para Ang 1-9 por ACE2. Dessa maneira, um ou mais fármacos ou tratamentos afetando uma ou mais destas etapas de RAS prejudica(m) o diagnóstico baseado em ARR e leva(m) a resultados de falso positivo e/ou falso negativo. Desse modo, um sujeito para ser diagnosticado com métodos baseados em ARR pode não ser tratado com um ou mais de tais fármacos ou tratamentos.

[0050] Ao contrário dos métodos baseados em ARR, os métodos da invenção podem também ser aplicados para sujeitos que são tratados com um ou mais de tais fármacos que afetam RAS e/ou tratamentos como descrito acima, por exemplo, com um ou mais fármacos ou tratamentos que resultam em um poder de diagnóstico do ARR diminuído (tal como, por exemplo, inibidores de ACE, ACE2, inibidores de Renina etc.). Em particular, os métodos da invenção podem ser aplicados também em sujeitos que são tratados com agentes afetando (especialmente aumentando) a atividade e/ou concentração de renina, isto é, os métodos da invenção são independentes de tais tratamentos que afetam (especialmente aumentam) a atividade de renina e/ou concentração. Em uma modalidade, o sujeito é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que diminuem o poder de diagnóstico do ARR. Em uma modalidade, o sujeito é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que diminuem o poder de diagnóstico da ARR, e o dito tratamento não diminui o poder de diagnóstico do AA2R ou diminui o poder de diagnóstico do AA2R em uma extensão menor.

[0051] Em uma modalidade, o sujeito está sob tratamento, por exemplo, recebeu e/ou recebe uma ou mais composições farmacêuticas ou tratamentos. Em uma modalidade, o sujeito está sob o dito tratamento no tempo do diagnóstico, por exemplo, no tempo caracterizado pelo fato de que o AA2R é medido e/ou a amostra é tirada do sujeito. Em uma modalidade, o dito tratamento é um tratamento interferindo no RAS, por exemplo, a administração de um ou mais RAS interferindo, ou RAS afetando as composições farmacêuticas. Em uma modalidade, o sujeito está sob tratamento anti- hipertensivo.

[0052] No entanto, em uma modalidade, o sujeito não é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas e/ou tratamentos que afetam a ligação fisiológica entre Ang II e secreção de aldosterona (em particular, a sinalização através de receptores de AT1), tal como por exemplo ARBs. Desta maneira, em uma modalidade da invenção, o sujeito não é tratado com bloqueadores de receptor de angiotensina (ARBs). Em uma modalidade, o método é independente de um ou mais tratamentos anti-hipertensivos do sujeito, exceto para tratamento com bloqueadores de receptores de angiotensina (ARBs).

[0053] Em uma modalidade, o sujeito está sob tratamento anti- hipertensivo, exceto para ARBs. Em uma modalidade, o sujeito está sob tratamento anti-hipertensivo, exceto para composições farmacêuticas que afetam o nível de aldosterona, mas não excluindo Ang II e/ou efeitos de renina mediada sobre o nível de aldosterona. Em uma modalidade, o sujeito é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que aumentam a concentração de renina e/ou atividade. Em uma modalidade, o sujeito está sob tratamento anti-hipertensivo, exceto por ARBs e exceto por composições farmacêuticas que afetam o nível de aldosterona, mas não excluindo composições que causam efeitos mediados por Ang II sobre o nível de aldosterona.

[0054] Em uma modalidade, os termos "é/são tratado(s) com" (ou "não é/não são tratado(s) com") ou "está sob tratamento com", como usados aqui, se referem à sujeitos (ou pacientes) que são tratados com (ou não são tratados com) o(s) respectivo(s) um ou mais fármacos e/ou tratamentos na ocasião do diagnóstico, por exemplo, na ocasião caracterizado pelo fato de que o AA2R é medido e/ou a amostra é colhida do sujeito. O dito diagnóstico pode ser um diagnóstico de uma etapa, tal como, por exemplo, a medição do AA2R em um ponto do tempo, ou o primeiro diagnóstico, ou qualquer diagnóstico adicional, incluindo teste de confirmação. Em uma modalidade adicional, o sujeito é tratado (ou não é tratado) com os ditos fármacos ou tratamentos na ocasião do diagnóstico, e por um certo período de tempo antes do diagnóstico. Em uma modalidade, o dito período de tempo é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, e/ou 14 dias.

[0055] O termo "afeta", como usado aqui, significará que um parâmetro, tal como por exemplo uma atividade, nível, ou proporção, é (ou não é) afetado, alterado ou trocado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Em particular, o parâmetro é (ou não é) substancialmente afetado. Em uma modalidade, o parâmetro é (ou não é) afetado mais do que 10%, 20%, 30% 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%. Em uma modalidade, se um parâmetro é afetado (ou não afetado) mais ou menos do que outro, o parâmetro é (ou não é) pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% mais afetado do que o outro. Em uma modalidade, o parâmetro é (ou não é) aumentado mais do que 10%, 20%, 30% 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%. Em uma modalidade, o parâmetro é (ou não é) diminuído mais do que 10%, 20%, 30% 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%.

[0056] Outra classe de fármacos ou tratamentos anti-hipertensivos que afetam o ARR e/ou o AA2R, é representada pelas composições farmacêuticas ou tratamentos que afetam (em particular substancialmente e/ou afetam diretamente) o nível de aldosterona, por exemplo, composições farmacêuticas que afetam a biossíntese, média de vida, e/ou degradação de aldosterona, levando ao nível de plasma de aldosteronas alterado. Desse modo, tais fármacos ou tratamentos que alteram a via de ARR e/ou de AA2R, afetando o nível de plasma de aldosterona, podem também ser excluídos do tratamento do sujeito a ser diagnosticado com os métodos da invenção. Em particular, fármacos ou tratamentos que afetam o AA2R de uma maneira que o poder de diagnóstico do AA2R sob tal tratamento é mais baixo em comparação ao poder de diagnóstico do ARR sob o mesmo tratamento, devem ser excluídos dos métodos de acordo com a invenção. Desta maneira, em uma modalidade, o sujeito pode ser tratado com um ou mais fármacos ou tratamentos anti-hipertensivos, como descrito acima, com a exceção de ARBs e/ou fármacos que afetam a biossíntese, média de vida, e/ou degradação de aldosterona.

[0057] Desde que fármacos ou tratamentos afetam Ang II (por exemplo, inibidores de ACE) podem afetar o nível de aldosterona, para evitar dúvidas, deverá ser esclarecido que tais fármacos ou tratamentos diminuem aldosterona através da diminuição de Ang II e, desta maneira, diminuindo sua ação sobre receptores de AT1 e resultando em secreção de aldosterona diminuída, não necessitam ser excluídos.

[0058] Por exemplo, a administração terapêutica do Captopril, inibidor de ACE, leva a uma diminuição nos níveis de Ang II, enquanto os níveis de renina aumentam. Desse modo, tratamento inibidor de ACE resulta em níveis de aldosterona diminuídos e atividade de renina e/ou concentração aumentada. Tais tratamentos não devem substancialmente diminuir ou devem até aumentar o poder de diagnóstico do AA2R, mas devem diminuir o poder de diagnóstico do ARR, e desse modo, não necessitam ser excluídos dos métodos da invenção e são atualmente modalidades preferidas da invenção.

[0059] Somente aquelas composições farmacêuticas e/ou tratamentos podem ser excluídos dos métodos, de acordo com a invenção, que afetam ou alteram o AA2R de uma maneira que o poder de diagnóstico do AA2R é inferior, comparado ao poder de diagnóstico do ARR sob condições de tratamento similares (ou de uma maneira que o fator de discriminação para um determinado par de dados testado por AA2R é mais baixo do que o fator de discriminação para os pares de dados similares testados por ARR).

[0060] Desta maneira, em uma modalidade, o sujeito é tratado com um ou mais composições farmacêuticas, que diminuem o poder de diagnóstico do ARR, mas não o poder de diagnóstico do AA2R, ou o sujeito é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que diminuem o poder de diagnóstico do ARR e/ou do AA2R, mas de uma maneira que o poder de diagnóstico do AA2R é ainda mais alto do que o poder de diagnóstico do ARR, que pode ser indicado por um fator de discriminação, especificidade e/ou seletividade mais alto.

[0061] O sujeito pode ou não pode submeter-se a um ou mais tratamentos, incluindo tratamentos anti-hipertensivos (isto é, o sujeito pode estar sob tratamento, por exemplo, tratamento anti-hipertensivo) na ocasião do diagnóstico e/ou antes do diagnóstico. No caso, o poder de diagnóstico sob tal tratamento é mais baixo para o AA2R comparado ao ARR, o sujeito poderia não se submeter a um ou mais de tais tratamentos, ou tais tratamentos necessitam ser descontinuados e seguidos por uma fase de exclusão de tal tratamento, antes do diagnóstico baseado no AA2R, como ainda descrito aqui. Em uma modalidade, o sujeito para ser diagnosticado com os métodos da invenção pode ser tratado com um ou mais composições farmacêuticas e/ou tratamentos, exceto para aqueles tratamentos que diminuem o poder de diagnóstico do AA2R, de modo que ele é mais baixo comparado ao poder de diagnóstico do ARR sob o tratamento similar. Em uma modalidade, o método é independente de um ou mais tratamentos (especialmente independente de um ou mais tratamentos anti-hipertensivos) do sujeito, exceto para tratamento com bloqueadores de receptor de angiotensina (ARBs) e/ou fármacos afetando a biossíntese, média de vida, e/ou degradação de aldosterona.

[0062] Em uma modalidade, o sujeito para ser diagnosticado com os métodos da invenção, pode ser tratado com uma ou mais composições farmacêuticas e/ou tratamentos que não afetam a aldosterona e/ou Ang II. Em uma modalidade, o sujeito pode ser tratado com uma ou mais composições farmacêuticas e/ou tratamentos que não afetam significativamente a aldosterona e/ou Ang II. Em uma modalidade, o sujeito pode ser tratado com uma ou mais composições farmacêuticas e/ou tratamentos que não afetam o AA2R. Em uma modalidade, o sujeito pode ser tratado com uma ou mais composições farmacêuticas e/ou tratamentos que não afetam significativamente o AA2R. Em uma modalidade, o sujeito pode ser tratado com uma ou mais composições farmacêuticas e/ou tratamentos que afetam um ou mais do(s) parâmetro(s) dado(s) de AA2R (isto é, o Ang II e/ou nível de aldosterona) e/ou a proporção do mesmo (isto é, o AA2R) não mais do que 5%, 10%, 15%, ou 20%. Por exemplo, o sujeito a ser diagnosticado com os métodos da invenção pode ser tratado com um ou mais tratamentos anti-hipertensivos (por exemplo, com um ou mais inibidores de RAS) que só e/ou em combinação, resultam em um fator baseado em AA2R de discriminação que é (ainda) mais alto do que o fator de discriminação baseado no ARR.

[0063] Tratamento com fármacos anti-hipertensivos podem ainda aumentar o AA2R, que poderá resultar em um desvio no limite de discriminação. Em outra modalidade da presente invenção, o sujeito é tratado com um ou mais fármacos ou tratamentos aumentando o AA2R.

[0064] Como descrito aqui, uma vantagem importante do método da invenção é que o AA2R é muito menos inclinado a interferência por tratamento anti-hipertensivo que o ARR. Em outras palavras, o ARR é afetado (e mesmo significativamente alterado) por fármacos e/ou tratamentos muito mais anti-hipertensivos do que o AA2R. Ainda se o AA2R pode ser afetado por um tratamento anti-hipertensivo, os métodos da invenção provêm um poder de diagnóstico melhorado do AA2R sobre o ARR sob tratamento anti-hipertensivo, como indicado por um fator de discriminação mais alto. Somente aquelas composições farmacêuticas e/ou tratamentos definidos, que podem ser excluídos de um diagnóstico baseado em AA2R (como descrito nas modalidades especificadas acima) podem ser excluídos do sistema sanguíneo do sujeito antes do diagnóstico. Dessa maneira, o sujeito poderá descontinuar tal medicação e/ou tratamentos, ou o um ou mais composições farmacêuticas e/ou tratamentos podem ser substituídos por outras composições farmacêuticas e/ou tratamentos apropriados, em particular outras composições farmacêuticas e/ou tratamentos anti-hipertensivos que não (ou não significativamente) afetam o AA2R.

[0065] Para evitar dúvida, se for referido um efeito de uma ou mais composições farmacêuticas e/ou tratamentos, ou para uma ou mais composições farmacêuticas e/ou tratamentos que afetam (ou não afetam) um parâmetro e/ou proporção, significa que o efeito é causado (ou não é causado) por uma composição farmacêutica ou tratamento somente, ou pela combinação de duas ou mais composições farmacêuticas e/ou tratamentos, isto é, a uma ou mais composições farmacêuticas e/ou tratamentos causam (ou não causam) o dito efeito só, ou em combinação.

[0066] Em uma modalidade, o sujeito é tratado com um ou mais fármacos ou tratamentos que alteram o ARR. Em uma modalidade, o sujeito é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que diminuem o poder de diagnóstico do ARR. Em uma modalidade, o sujeito é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que diminuem o poder de diagnóstico do ARR, mas não diminuem o poder de diagnóstico do AA2R, ou diminuem o poder de diagnóstico do AA2R para uma extensão menor do que ARR. Em uma modalidade, o sujeito é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que aumentam o poder de diagnóstico do ARR, mas aumenta o poder de diagnóstico do AA2R para uma maior extensão. Em uma modalidade, o sujeito é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que aumentam o poder de diagnóstico do AA2R. Em uma modalidade, o sujeito é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que resulta em um poder de diagnóstico mais alto do AA2R comparado ao poder de diagnóstico do ARR. Em uma modalidade, o sujeito é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas selecionadas dos inibidores de renina, inibidores de ACE, ACE2, diuréticos e/ou bloqueadores de canal de cálcio, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, o sujeito é tratado com um ou mais inibidores de ACE. Em outra modalidade, o sujeito é tratado com um ou mais inibidores de renina.

[0067] Em uma modalidade, o tratamentos e/ou composições farmacêuticas afetam um ou mais parâmetro(s) do ARR (isto é, a concentração e/ou atividade de renina e/ou o nível de aldosterona) e/ou a proporção das mesmas (isto é, o ARR) mais do que 5%, 10%, 15%, ou 20%. Em uma modalidade, os tratamentos e/ou composições farmacêuticas afetam um ou mais parâmetro(s) dos ARR (isto é, a concentração de renina e/ou atividade e/ou o nível de aldosterona) e/ou a proporção dos mesmos (isto é, o ARR) mais do que 5%, 10%, 15%, ou 20%, mas afetam o(s) parâmetro(s) dado(s) do AA2R (isto é, o Ang II e/ou o nível de aldosterona) e/ou a proporção dos mesmos (isto é, o AA2R) não mais do que 5%, 10%, 15%, ou 20%. Em uma modalidade, o sujeito não é tratado com um ou mais fármacos ou tratamentos que diminuem o fator de discriminação do AA2R, quando comparado ao ARR. Em uma modalidade, o sujeito é tratado com um ou mais fármacos ou tratamentos que alteram o ARR, mas não o AA2R.

[0068] Uma pessoa versada na técnica pode facilmente determinar, se ou não um tratamento afeta um ou ambos os parâmetros usados para diagnóstico (por exemplo, nível de renina e/ou atividade de renina, e/ou nível de aldosterona para o diagnóstico baseado em ARR, e Ang II e/ou o nível de aldosterona para o diagnóstico baseado em AA2R, de acordo com a invenção). Por exemplo, para muitos tratamentos anti-hipertensivos e tratamentos no mercado, o(s) efeito(s) sobre o RAS e/ou um ou mais de seus componentes é descrito na literatura (ver, por exemplo, a Tabela 4 em Funder et al., citado acima). Além disso, o(s) efeito(s) pode(m) ser determinado(s) com métodos padrão, por exemplo, medindo os níveis de um ou mais parâmetros em amostras biológicas, antes de, durante, ou depois do tratamento, ou comparando grupos de pacientes diferentemente tratados usando métodos estatísticos. Alternativamente ou em adição, tal (tais) efeito(s) de um tratamento pode(m) ser determinado(s) por uma análise de impressão digital de RAS, isto é, uma medição de nível(eis) de um ou mais componentes de RAS, especialmente em um estado de equilíbrio constante, como descrito acima e em WO 2013/182237.

[0069] O poder de diagnóstico pode ser determinado como descrito aqui ou na técnica anterior. Desse modo, uma pessoa versada na técnica pode facilmente determinar o poder de diagnóstico de ARR e o AA2R, e comparar ambos.

[0070] Em uma modalidade, o tratamento compreende a administração de pelo menos uma composição farmacêutica afetando o sistema de renina-angiotensina (RAS), exceto para ARBs. Em uma modalidade, o tratamento compreende a administração de pelo menos uma composição farmacêutica afetando o sistema de renina- angiotensina (RAS), exceto para composições farmacêuticas afetando o nível de aldosterona, mas não excluindo efeitos mediados por Ang II no nível de aldosterona. Em uma modalidade, o tratamento compreende a administração de, pelo menos, uma composição farmacêutica afetando o sistema de renina-angiotensina (RAS), exceto para ARBs e exceto para composições farmacêuticas que afetam o nível de aldosterona, mas não excluindo efeitos mediados por Ang II sobre o nível de aldosterona. Em uma modalidade, a composição farmacêutica afetando o sistema de renina-angiotensina (RAS) não afeta diretamente ou indiretamente (ou interfere com) o RAS. Em uma modalidade, a composição farmacêutica afetando (ou interferindo com) o sistema de renina-angiotensina (RAS) é uma composição que afeta (ou interfere com a) expressão e/ou atividade de renina, diretamente ou indiretamente. Tais fármacos interferindo em RAS podem compreender um ou mais inibidores de ACE de terminal N- ou C-, inibidores de renina, inibidores de aminopeptidase, e/ou outros compostos que afetam a expressão e/ou secreção endógena de enzimas de RAS na circulação. Em uma modalidade, os fármacos que afetam o RAS podem compreender lisinoprila, caproprila, alisquireno, amastatina, angiotensina convertendo enzima 2 (ACE2), endopeptidase neutra, também chamada neprilisina (NEP), e/ou outros compostos que afetam a expressão e/ou secreção de enzimas RAS endógenas, e/ou combinações das mesmas. Em uma modalidade, o tratamento pode também compreender uma dieta específica, por exemplo, uma dieta de sal reduzido, e/ou uma dieta DASH (Abordagens Dietéticas para Interromper Hipertensão). No entanto, pelo menos um dos parâmetros usados para o atual diagnóstico de PHA baseado em ARR, é muitas vezes influenciado por um ou mais de tais tratamentos.

[0071] Ao contrário do ARR, o AA2R não é afetado pela maioria dos tratamentos anti-hipertensivos, especialmente tratamento bloqueador de RAS. Durante o tratamento com bloqueadores de RAS, a renina aumenta por causa de um mecanismo de realimentação regulador bem conhecido, induzido por uma falta de Ang II e levando à secreção de renina. A supressão de Ang II ainda leva à secreção de aldosterona dependente de angiotensina diminuída, que faz o AA2R permanecer estável, enquanto o ARR cai devido ao aumento de renina.

[0072] Por exemplo, o tratamento inibidor de ACE é associado com um aumento na atividade e concentração de renina, que podemos confirmar quando comparando PRA entre pacientes não tratados e pacientes sob inibidor de ACE (Figura 2, painel do meio). Devido a um aumento da atividade e concentração de renina, em resposta ao tratamento do inibidor de ACE, o ARR não é apropriado para varredura de pacientes submetidos a tal tratamento, pois o ARR é firmemente diminuído, enquanto a renina é aumentada, levando a um número mais alto de resultados de testes negativos falsos e, desta maneira, uma diminuição na sensibilidade do ensaio. Como as varreduras de PHA são principalmente realizadas em pacientes hipertensos, a interferência com fármacos anti-hipertensivos é muito frequente e bem conhecida (John W. Funder et al.; J Clin Endocrinol Metab. Setembro de 2008, 93(9):3266 -3281). As interferências de fármacos anteriormente explicadas levantam a necessidade de testes de confirmação que são projetados para aumentar o desempenho do teste, mas obviamente impõem riscos cardiovasculares significativos para os pacientes, como medicação anti-hipertensiva caracterizado pelo fato de ser interrompida por diversas semanas antes do teste de confirmação, que leva à uma grave hipertensão que poderá causar eventos cardiovasculares fatais como acidente vascular cerebral e enfarte.

[0073] Um teste de confirmação de PHA muito comum é o teste de infusão salina descrito acima. O teste de ARR é usado para confirmar o PHA sob essas condições definidas, que são destinadas a aumentar o desempenho do ensaio de ARR e o poder de diagnóstico (John W. Funder et al.; J Clin Endocrinol Metab. Setembro de 2008, 93(9):3266 -3281).

[0074] Por exemplo, tratamentos comuns de sujeitos e fatores ou tratamentos que afetam o ARR, isto é, o parâmetro de diagnóstico atual, são descritos nas instruções da prática clínica em Funder et al. 2008, citado acima. Além do mais, ambos, o nível de aldosterona como também o nível de renina, podem ser afetados por tal(tais) tratamento(s). Desse modo, o teste de ARR leva para os resultados de falso positivo e/ou falso negativo, resultando em tratamentos não apropriados. Em muitos casos, os dois parâmetros, isto é, o nível de renina e o nível de aldosterona, são ainda afetados inversamente, o que extremamente falsificaria a proporção e, desse modo, o resultado do diagnóstico. No entanto, o método da presente invenção é independente de tais tratamentos, exceto para composições farmacêuticas que afetam o nível de aldosterona, mas não excluindo efeitos mediados por Ang II no nível de aldosterona, e exceto para o tratamento com bloqueadores de receptores de angiotensina (ARBs). Esta classe de fármacos anti-hipertensivos (ARBs) diretamente se ligam ao Receptor AT1, desta maneira prevenindo a sinalização de Ang II. O mecanismo de realimentação explicado anteriormente leva à concentração de renina e atividade aumentadas, que resulta em acumulação de Ang II. Isto artificialmente diminuiria o AA2R, que deve ser considerado no futuro teste de PHA usando o AA2R. No entanto, um paciente em ARB poderá ser facilmente retirado para outro bloqueador RAS, como um inibidor de ACE medindo antes o AA2R. Alternativamente, o um ou mais ARBs e/ou uma ou mais composições farmacêuticas que afetam o nível de aldosterona, mas não excluindo os efeitos mediados por Ang II no nível de aldosterona (como ainda descrito acima), podem ser excluídos antes de aplicar o método de diagnóstico da invenção.

[0075] Em uma modalidade, o nível de equilíbrio de estado firme de angiotensina II é medido. O termo "equilíbrio de estado firme" (SSE) ou "método de SSE" ou "nível de equilíbrio" ou "concentração de equilíbrio", como usados aqui, significa uma medição de pelo menos um produto de degradação peptídica (por exemplo Ang II) de uma cascata proteolítica (por exemplo, o RAS) em uma amostra biológica, especialmente uma amostra de sangue ou uma amostra derivada de sangue, caracterizado pelo fato de que a amostra é incubada até um estado de equilíbrio firme ser alcançado para o dito pelo menos um produto de degradação peptídica, envolvido na dita cascata proteolítica, e caracterizado pelo fato de que a dita cascata é caracterizada pelo fato de que o pelo menos um produto de degradação peptídica, em uma concentração de equilíbrio de estado firme (ou concentração de equilíbrio) é quantificado na amostra. Em particular, o termo "equilíbrio de estado firme" (SSE) como usado aqui, significa que a proporção de degradação total atual, de pelo menos um produto de degradação peptídica, envolvido na cascata proteolítica é igual à proporção de formação total do dito produto de degradação do dito produto de degradação pepetídica, desse modo levando a uma concentração estável do dito produto de degradação peptídica, isto é, uma concentração de peptídeo de equilíbrio de estado firme, que substancialmente não varia durante um certo período de tempo, como ainda explicado abaixo. No dito equilíbrio de estado firme, a atual proporção de formação total de um produto de degradação peptídica é definida pela soma das proporções de volume atuais, de todas as enzimas envolvidas na formação do dito produto de degradação peptídica, isto é, o dito produto de degradação peptídica é um produto direto da(s) dita(s) enzima(s). A proporção de degradação total atual de um produto de degradação peptídica, é definida pela soma das proporções de negócios atuais de todas as enzimas envolvidas na degradação do dito produto de degradação peptídica, isto é, o dito produto de degradação peptídica é um substrato direto da(s) dita(s) enzima(s). O equilíbrio de estado firme é ainda descrito em WO 2013/182237.

[0076] O termo "real" como usado aqui significa a real (ou efetiva) proporção de formação ou degradação de um peptídeo, tal como Ang II, ou o real ou efetiva proporção de negócios de uma enzima, tal como ACE, ACE2, e/ou amino-epeptidase, sob as condições como presentes na amostra.

[0077] O termo "igual a", como usado aqui, significa que a concentração de peptídeo resultante de qualquer uma de tal(tais) proporção (ões) de formação ou degradação igual(ais) do dito peptídeo (a "concentração do peptídeo de equilíbrio de estado firme" ou "o nível de peptídeo de equilíbrio de estado firme"), ou resultando de quaisquer tais proporções de negócios iguais de, pelo menos, duas enzimas envolvidas na formação ou degradação do dito peptídeo (a "proporção de negócio de enzima de equilíbrio de estado firme"), não varia mais do que 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% durante um período de tempo de pelo menos 30 minutos (min), 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou 300 minutos. Desta maneira, as atuais proporções totais de negócios das enzimas envolvidas na degradação do dito peptídeo são determinadas pelas atuais proporções de formação total do(s) seu(s) peptídeo(s) de substrato, de modo que qualquer substrato formado recentemente ou adicionalmente é degradado. No entanto, isto não necessariamente significa que a concentração líquida do dito peptídeo é zero, mas a concentração líquida, como presente na amostra no equilíbrio de estado firme, não varia significativamente como ainda descrito acima.

[0078] Dessa maneira, em uma modalidade da invenção, a concentração do dito pelo menos um produto de degradação peptídica (por exemplo Ang II) da cascata proteolítica (por exemplo o RAS) permanece dentro de uma proporção firme durante o período de tempo do equilíbrio de estado firme, a despeito de um fluxo contínuo de formação e degradação. Em um a modalidade da invenção, a concentração do dito pelo menos um produto de degradação peptídica, em equilíbrio de estado firme, não varia mais do que 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1%, durante um período de tempo de pelo menos 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou 300 minutos. Em uma modalidade, a concentração do dito pelo menos um produto de degradação peptídica em equilíbrio de estado firme, não varia mais do que 15%, ou não mais do que 10%, dentro de 60 minutos. Desta maneira, o dito peptídeo não se acumula significativamente nem significativamente diminui durante os períodos de tempo especificados.

[0079] Em uma modalidade, a amostra é incubada por até 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou até 300 minutos, antes de pelo menos um produto de degradação peptídica (em particular Ang II) em concentração de equilíbrio de estado firme ser quantificado na amostra. Em outra modalidade, a amostra pode ser incubada por mais de 6 horas (h), especialmente por até 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas ou até 48 horas. Períodos de tempo de incubação apropriados, dependem principalmente da cascata proteolítica dada, dos analitos peptídicos a ser quantificados, na natureza da amostra e nos parâmetros de incubação. Tais períodos de tempo de incubação podem ser facilmente determinados por uma pessoa versada na técnica. Em uma modalidade, o equilíbrio de estado firme é conservado (ou estabelecido ou congelado ou temperado) depois da incubação. Os termos "conservado", "estabilizado", "congelado", e "temperado", como usados aqui, significarão a conservação do estado bioquímico, por exemplo, a conservação de níveis de peptídeo, por exemplo, pela inibição de degradação proteolítica. A estabilização do equilíbrio dos níveis de peptídeo de estado firme (ou os níveis de peptídeo in vivo) pode ser feita pela adição de um ou mais inibidores de protease, especialmente pela adição de um coquetel de inibidores de protease. Desta maneira, um ou mais inibidores de protease podem ser adicionados depois da incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado para pelo menos um produto de degradação peptídica (em particular Ang II). Inibidores de protease apropriados, ou combinações dos mesmos, podem ser selecionados por uma pessoa versada na técnica, e pode por exemplo compreender uma combinação de inibidores de enzima específicos ou não específicos, ou uma combinação dos mesmos. Os um ou mais inibidores de protease, ou coquetel de inibidores de protease, garantem que especialmente as etapas proteolíticas da cascata, que são de interesse (isto é, as enzimas formando e degradando o peptídeo para ser medido, isto é, Ang II), ou cada enzima da cascata proteolítica é completamente inibida.

[0080] Em uma modalidade, cada etapa da cascata proteolítica é inibida, isto é, cada enzima envolvida na cascata proteolítica é inibida por, pelo menos, um componente do coquetel de inibidores de protease. Em outra modalidade, o coquetel de inibidores de protease compreende pelo menos um inibidor específico ou um inibidor não específico de cada classe de proteases envolvida na cascata proteolítica. O coquetel de inibidores de protease pode compreender um ou mais inibidores inibindo uma ou mais enzimas envolvidas na cascata proteolítica. Exemplos para tais inibidores do RAS são lisinopril (inibidor de ACE) e alisquireno (inibidor de renina). O coquetel de inibidores de protease pode também compreender um ou mais inibidores inibindo um ou mais grupos de enzimas envolvidos na cascata proteolítica, tal como por exemplo ácido Etilenodiaminatetracético (EDTA, inibe metaloproteases). Além disso, o coquetel de inibidores de protease pode compreender um ou mais inibidores não específicos. Em uma modalidade, o coquetel de inibidores de protease compreende uma combinação de pelo menos duas das classes de inibidores mencionadas acima. Em outra modalidade, o coquetel de inibidores de protease compreende um ou mais inibidores de enzima de alimentação, especialmente inibidores específicos da enzima de alimentação.

[0081] Por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três, ou pelo menos quatro inibidores de protease são adicionados à amostra. Em uma modalidade, o coquetel de inibidores de protease compreende Pepstatina A, 1,10-Fenantrolina, EDTA, ácido p-Hidroximercuri- benzóico e o peptídeo inibidor de renina Z-Arg-Arg-Pro-Phe-His-Sta- Ile-His-Lys (Z-Arg).

[0082] Alternativamente, ou em adição ao uso de um ou mais inibidores de proteases, ou um coquetel de inibidores de protease, o equilíbrio de estado firme pode ser conservado pela adição de um ou mais agentes caotrópicos, tais como iodeto de sódio, perclorato de sódio, perclorato de lítio, cloreto de magnésio, tiocianato de guanidina (GTC), cloreto de guanidinio, fenol, propanol, butanol, etanol, sulfato de dodecil de sódio, tiouréia, uréia ou outros.

[0083] Alternativamente, ou em adição ao uso de um ou mais inibidor de protease, ou um coquetel de inibidores de protease, o equilíbrio de estado firme pode ser conservado por outros meios de inativação física das enzimas na amostra, por exemplo, desnaturação da enzima induzida por calor, sal, pH, ou detergente; ou por refrigeração, por exemplo, colocando as amostras no gelo diretamente depois da incubação. Por uma ou mais das etapas adicionais de processamento das amostras, por exemplo, a separação de plasma ou soro e a separação pela extração da fase sólida (SPE; por exemplo, por depleção da matriz e/ou enriquecimento de peptídeo), uma temperatura de acordo com o ambiente pode ser selecionada, como também para garantir que todas as enzimas na amostra estão inativas. Por exemplo, qualquer pré-tratamento de amostra ou processamento de amostra, antes da análise da amostra, pode ser feito a temperatura ambiente de 4°C (ou mais baixa), pelo menos até a completa desnaturação ou inativação das enzimas envolvidas na cascata proteolítica (por exemplo, até a depuração da coluna ou cartucho de SPE).

[0084] Ao contrário, ensaios clássicos de renina de plasma (PRA) são destinados à inibição completa das vias de degradação de angiotensina I (Ang I) imediatamente depois da amostra ter sido colhida, e a atividade da enzima é calculada com base na proporção de acumulação dos peptídeos formados pela dita enzima. Mesmo se a inibição das vias de degradação de Ang I pode estar incompleta, em tais ensaios de PRA, eles ainda estão longe de qualquer equilíbrio de estado firme, de acordo com a invenção, uma vez que a concentração líquida de Ang I significativamente muda com o passar do tempo. No ensaio de PRA, como descrito por exemplo em Bystrom et al. (Clin. Chem. 56(2010), 1561-1569), a concentração de Ang I significativamente aumenta com o passar do tempo. Além do mais, ensaios do estado da arte estão buscando assessar a atividade toda do RAS, medindo a forma ativada conformacional de renina, em amostras de plasma pelo ensaio imuno-absorvente ligado a enzima (ELISA) e ensaio radio-imuno (RIA) baseado em métodos (Diagnósticos de DRG, http://www.drg-diagnostics.de/49-1- DRG+Renina+ativa+ELISA.html). Ao contrário, para as medições de SSE como descrito acima, esses ensaios dependem criticamente da especificidade do anticorpo usado e não permitem conclusões sobre a concentração do efeito ou dos peptídeos nas amostras, que são responsáveis pelos efeitos fisiológicos do RAS. A razão para isto é que existem múltiplas enzimas afetando o nível de efeito ou peptídeos. Todos esses peptídeos podem ser simultaneamente analisados pelas medições de SSE, enquanto os ensaios do estado da arte focalizam justamente em uma atividade da enzima, atividade ou concentração por amostra.

[0085] Em uma modalidade da invenção, no equilíbrio de estado firme, a proporção atual de produção da enzima de alimentação é máxima, isto é, o substrato de alimentação está presente em grande excesso molar, em comparação à enzima de alimentação, e na adição do substrato de alimentação externo não deverá ainda aumentar a proporção de produção atual da enzima de alimentação. Desta maneira, a enzima de alimentação de uma cascata proteolítica é a enzima, que é responsável pela reação de conversão de alimentação, isto é, a etapa de limite da proporção da subsequente cascata proteolítica (ou o gargalo da cascata proteolítica). Para a cascata proteolítica de RAS, sob condições fisiológicas, a enzima de alimentação é renina, que é responsável pela conversão de angiotensinogênio em angiotensina I. Em sistemas fisiológicos (por exemplo no corpo, no sangue, plasma ou amostras de soro), angiotensinogênio, como o substrato para renina está presente em grande excesso molar de renina. No entanto, em uma modalidade da invenção, um ou mais, ou todas as outras enzimas da cascata proteolítica, tal como por exemplo aminopeptidases (AP), especialmente aminopeptidase A (APA) e/ou aminopeptidase N (APN), dipeptidil aminopeptidases (DAP), carboxipeptidases (especialmente ACE2), dipeptidil carboxipeptidases (especialmente ACE), e/ou endopeptidases (especialmente endopeptidase neutra, também chamada neprilisina), estão presentes na amostra em concentrações suficientes para degradar qualquer substrato de novo ou adicionalmente formado e, desse modo, permite o estabelecimento de um equilíbrio de estado firme para as ditas enzimas e peptídeo(s) durante a incubação, isto é, suas reais proporções de produção atual, são determinadas pelas proporções de formação atual total de seu(s) peptídeo(s) de substrato.

[0086] De acordo com a presente invenção, o termo "enzima de alimentação" significará uma enzima com uma proporção de produção real máxima, isto é, com uma proporção de produção real, que é a proporção máxima de produção realizável para a dita enzima na amostra. O termo "proporção máxima de produção realizável" significará a proporção de produção de uma enzima contida na amostra, que pode ser realizada sob as condições dadas na amostra, se o peptídeo do substrato está (ou estaria) presente no vasto excesso molar em comparação à enzima (ou uma quantidade virtualmente não exaurível) pelo menos até o equilíbrio de estado firme ser alcançado. Desta maneira, a atual proporção de produção da enzima de alimentação não pode ser ainda aumentada pela adição de substrato externo, uma vez que o substrato de alimentação já está presente em vasto excesso molar, em comparação à enzima de alimentação. Se, por exemplo, qualquer peptídeo externo ao substrato (isto é, um peptídeo envolvido na cascata proteolítica), ou um análogo de tal substrato é adicionado a uma amostra antes ou durante a incubação, até um equilíbrio de estado firme ser alcançado, isto pode -de acordo com a presente definição- resultar em uma troca da(s) etapa(s) limitando a proporção para a cascata proteolítica, e desse modo, também da(s) enzima(s) de alimentação da cascata proteolítica, se a quantidade do peptídeo do substrato adicionado é suficiente para resultar em uma proporção máxima de produção realizável de, pelo menos, uma enzima envolvida na degradação do dito peptídeo do substrato (isto é, uma enzima que não seja a enzima de alimentação, sob condições fisiológicas). Por exemplo, se a cascata proteolítica sob investigação é o RAS, e se um vasto excesso molar de um Ang II (ou um análogo do mesmo, por exemplo, um Ang II carregando um rótulo de massa ou qualquer uma modificação covalente, incluindo trocas de aminoácidos) comparado a uma ou mais ou todas as enzimas envolvidas na degradação de Ang II, é adicionada à amostra antes ou durante a incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado, pelo menos uma ou mesmo todas as enzimas envolvidas na degradação de Ang Ang II (por exemplo, ACE2, AP, e/ou DAP) alcançaria as máximas proporções de produção realizáveis e, desse modo, se tornaria a(s) etapa(s) de alimentação limitando a proporção para a subsequente(s) reação(ões) proteolítica(s) da cascata.

[0087] Em uma modalidade da invenção, a enzima de alimentação pode ser adicionada à amostra. A adição da enzima de alimentação aumenta o fluxo passante da cascata de enzima e, desse modo, leva ao aumento absoluto de níveis de peptídeos, enquanto os níveis relativos (proporções de peptídeo) permanecem não trocados. Desta maneira, o equilíbrio dos níveis de estado firme de um ou mais peptídeos, ainda reflete uma situação fisiológica, isto é, as atividades da enzima, no entanto, os níveis totais de peptídeo são proporcionalmente aumentados. Isto seria útil, por exemplo, se os níveis de peptídeo medidos, sem a adição da enzima de alimentação, estivessem abaixo do limite de detecção do método usado para quantificar o(s) peptídeo(s). Opcionalmente, o substrato de alimentação pode ser também adicionado. Isto pode garantir que o substrato de alimentação está e permanece em excesso molar, em comparação à enzima de alimentação e que o substrato de alimentação está ainda presente em virtualmente quantidades inesgotáveis, levando a uma proporção de produção da enzima de alimentação, que é estável por um certo tempo, definindo o equilíbrio de estado firme, mesmo se a enzima de alimentação é adicionada.

[0088] Em uma modalidade, a cascata proteolítica é o RAS, e o peptídeo a ser analisado é Ang II. Na dita modalidade, a atual proporção de produção da dita enzima de degradação Ang II, no equilíbrio de estado firme, é igual à atual proporção de produção atual de ACE, que é o Ang II formando enzima, se somente uma via de degradação de Ang II enzimática é "aberta" na amostra, isto é, somente uma enzima degradante de Ang II está ativa. Se mais de uma enzima de degradação de Ang II está ativa na amostra, a soma atual das proporções de produção do dito Ang II ativo (isto é, a atual proporção de degradação toda de Ang II) é igual à proporção de produção atual de ACE (isto é, a atual proporção de formação de Ang II total) na dita modalidade.

[0089] Desta maneira, um equilíbrio de estado firme é alcançado para o peptídeo, por exemplo Ang II, e a(s) enzima(s) relacionada(s), isto é, a(s) enzima(s) formando ou degradando o dito peptídeo (por exemplo Ang II). Como descrito acima, o equilíbrio de estado firme é alcançado, se a concentração líquida do pelo menos um peptídeo (em particular Ang II), dois ou mais peptídeos, ou todos os peptídeos envolvidos na cascata proteolítica, não varia mais do que 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% durante um período de tempo de pelo menos 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou 300 minutos. O dito equilíbrio de estado firme é alcançado depois da incubação da amostra por 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou 300 minutos, ou por 8, 12, 18, 24, ou 48 horas. O equilíbrio de estado firme continua por pelo menos 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou 300 minutos.

[0090] Em uma modalidade da invenção, no equilíbrio de estado firme, a proporção total de degradação máxima realizável de pelo menos um peptídeo envolvido na cascata proteolítica (por exemplo Ang II), é igual a ou maior do que sua atual proporção de formação total. De acordo com a invenção, a proporção de degradação máxima realizável de um peptídeo é a proporção de degradação total que poderá ser realizada sob as condições dadas, na presença de um vasto excesso molar do dito peptídeo, em comparação a cada enzima degradando o dito peptídeo (ou uma quantidade virtualmente inextinguível do dito peptídeo), isto é, pela adição do peptídeo externo. Desta maneira, a proporção de degradação máxima realizável de um peptídeo é a soma de proporções de produção máximas realizáveis de todas as enzimas envolvidas na degradação do dito peptídeo.

[0091] Em uma modalidade, no início do tempo de incubação, a quantidade de todas as enzimas envolvidas na cascata proteolítica é em excesso da quantidade de seus respectivos substratos, exceto para a enzima de alimentação da cascata proteolítica. Em outra modalidade, a quantidade das ditas uma ou mais enzimas, ou de todas as enzimas envolvidas na cascata proteolítica, é em excesso da quantidade de seu/seus respectivo(s) substrato(s), durante o período de tempo de incubação inteiro, exceto para a enzima de alimentação da cascata proteolítica.

[0092] Em outra modalidade, as condições como especificado acima (isto é, que a quantidade de enzima é em excesso da quantidade do respectivo substrato, e/ou que a proporção de formação de um peptídeo é igual à proporção de degradação em equilíbrio de estado firme) se aplica a pelo menos um ou mais peptídeos a ser analisados (por exemplo Ang II), e/ou a(s) respectiva(s) enzima(s) que formam ou degradam o(s) dito(s) peptídeo(s) a ser analisado(s) (por exemplo, Ang II).

[0093] Por exemplo, se o método de SSE da presente invenção é usado para examinar um componente da cascata proteolítica de RAS, e um peptídeo para ser analisado é Ang II, isto significa que até um equilíbrio de estado firme ser alcançado, a atual proporção de formação de Ang II por ACE é maior do que a soma das atuais proporções de degradação de todas as enzimas envolvidas na degradação de Ang II, incluindo, mas não limitado a ACE2, AP, e/ou DAP. Desta maneira, a concentração de Ang II aumenta, isto é, Ang II acumula até um equilíbrio de estado firme ser alcançado. Quando o equilíbrio de estado firme é alcançado, a atual proporção de formação de Ang II é igual à soma das atuais proporções de produção de todas as enzimas envolvidas na degradação de Ang II (a atual proporção de degrada total de Ang II).

[0094] Desta maneira, em uma modalidade do equilíbrio de estado firme da presente invenção, pelo menos uma reação de degradação proteolítica caracterizada pelo fato de que estar ativa ou "aberta" para o peptídeo a ser analisado, por exemplo Ang II, até um ponto que permite que a atual proporção de degradação total seja igual à atual proporção de formação total do dito peptídeo, isto é, não é inibido nem "fechado", por exemplo, pelo uso de um ou mais inibidores de protease, até um ponto caracterizado pelo fato de que a atual proporção de overall formação total excede a atual ou máxima proporção de degradação total realizável do dito peptídeo.

[0095] Em uma modalidade, agentes quelantes, tais como por exemplo EDTA, ácido tetracético de etileno glicol (EGTA), 8- hidroxiquinolina, fenantrolina e dimercaprol (também chamado British- anti-Lewisite ou BAL), não são adicionados antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado, especialmente não para a cascata de RAS, ou outras cascatas proteolíticas, caracterizado pelo fato de que metaloproteases são envolvidas, uma vez que agentes quelantes têm um efeito inibidor em metaloproteases através de quelantes de íons bivalentes.

[0096] Em uma modalidade, agentes caotrópicos, tal como por exemplo iodeto de sódio, perclorato de sódio, sódio de lítio, cloreto de magnésio, tiocianato de guanidina (GTC), cloreto de guanidinio, fenol, propanol, butanol, etanol, sulfato de dodecila de sódio, tiouréia, uréia, e/ou outros, não são adicionados antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado.

[0097] Em uma modalidade, o equilíbrio de estado firme é alcançado sob as condições fisiológicas para a dita cascata proteolítica, que significa que os componentes da cascata proteolítica (enzimas e substrato ou peptídeos de produtos), suas quantidades totais e/ou relativas como presentes na amostra biológica como colhida do corpo, como também a matriz em relação à composição e/ou ao pH da amostra, não são substancialmente modificadas antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado. Em uma modalidade, as concentrações das enzimas e/ou peptídeos envolvidos na cascata proteolítica presente na amostra biológica como tirado do corpo, não são modificadas antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado.

[0098] Em outra modalidade, substratos ou análogos de substrato de qualquer enzima(s) envolvidas na cascata proteolítica, tal como, por exemplo, padrões internos ou padrões de degradação, seja em suas formas nativas ou modificadas por rotulação (por exemplo rotulações isotópicas e/ou fluorescentes, e/ou modificações de aminoácido ou trocas de, pelo menos, um aminoácido), não são adicionadas antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado. Em uma modalidade da presente invenção, a cascata proteolítica é o RAS, e nem angiotensinogênio, angiotensina I e/ou Ang II, nem quaisquer análogos dos mesmos, são adicionados antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado.

[0099] Em outra modalidade, substâncias ou reagentes adicionais, tais como por exemplo substâncias de tampão (Tris, PBS, MES, HEPES, citrato, borato, carbonato ou carbonato de hidrogênio (ou bicarbonato) e/ou outaras substâncias de tampão ou respectivas soluções de tampão, não são adicionadas antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado.

[00100] Em ainda outra modalidade, substâncias ou reagentes, tais como por exemplo EDTA, EGTA, PMSF, AEBSF, BSA, ácido maleico, anidrido maleico, ácido fórmico, e/ou água (em qualquer forma, por exemplo, desionizada e/ou destilada etc.) não são adicionadas antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado.

[00101] No entanto, e não resistindo ao anterior, um ou mais de tais inibidores de protease mencionados acima, agentes quelantes, agentes caotrópicos, substratos, padrões, BSA, tampões, e/ou outras substâncias ou reagentes podem ser adicionados desde que o equilíbrio de estado firme seja alcançado e opcionalmente temperado.

[00102] Especialmente um ou mais padrões, por exemplo, padrões internos e/ou padrões de degradação, podem ser adicionados uma vez que um equilíbrio de estado firme seja alcançado e congelado. Padrões são, por exemplo, peptídeos da cascata proteolítica, que são modificados por rotulação de massa e/ou rotulação química (por exemplo, rotulação isotópica e/ou fluorescente, e/ou modificações de aminoácido, e mais o uso de etiquetas de massa, e/ou trocas de pelo menos um aminoácido). Desta maneira, padrões internos são isótopos estáveis rotulados de padrões internos, por exemplo, descritos em WO 03/016861 A. Em uma modalidade, a amostra biológica é incubada como colhida do sujeito (ex vivo), isto é, a matriz da amostra e/ou as concentrações dos componentes da cascata proteolítica para ser analisados não são modificados, mas opcionalmente ainda processados (por exemplo, para obter plasma ou soro), antes ou depois de um equilíbrio de estado firme ser alcançado e estabilizado. Opcionalmente, anticoagulantes, isto é, substâncias que evitam a coagulação (interrompendo o sangue de coagular), pode ser adicionado à amostra biológica antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado. No entanto, tais anticoagulantes não deverão substancialmente afetar as proteases da cascata proteolítica a ser analisada. Um anticoagulante apropriado para uso no método de SSE, de acordo com a presente invenção, é heparina.

[00103] Antes da análise, as amostras podem ser pré-tratadas ou ainda processadas, por exemplo, por separação por plasma ou soro (por exemplo, por centrifugação ou ativação de coagulação seguida por centrifugação), e/ou purificação por extração da fase sólida (SPE), por exemplo, para esgotamento da matriz e/ou enriquecimento do peptídeo. Desta maneira, a extração da fase sólida pode ser realizada com um material de cromatografia da fase reversa, um material de cromatografia de interação hidrofóbica, um material de troca de íon, material de cromatografia de afinidade, por exemplo, um material de cromatografia da fase reversa, especialmente um material C18, C8 ou C6H5 (Fenila).

[00104] Em uma modalidade, o um ou mais analito(s) (por exemplo, Ang II) e/são concentrado(s) para secagem depois da eluição da superfície sólida, e pode ser reconstituído em uma cromatografia líquida de pressão alta (também chamada cromatografia líquida de alto desempenho, HPLC) solvente compatível, significando que a composição do solvente não interfere na ligação do um ou mais analitos à coluna de HPLC acoplada a MS. O solvente de reconstituição é, por exemplo, um solvente aquoso que pode ser suplementado com aditivos incluindo propanol, butanol, 2-butanol, pentanol, 2-propanol, acetona, metil etil cetona, acetonitrila, metanol, etanol, ácidos ou bases, a fim de intensificar a solubilidade de analitos e/ou facilitar a ligação de analitos à coluna de HPLC.

[00105] Em outra modalidade, os métodos de SSE, de acordo com a invenção, compreendem as etapas: prover uma amostra tratada com um anticoagulante; opcionalmente, ainda processando a amostra para obter uma amostra de plasma ou soro; incubando a amostra até um equilíbrio de estado firme ser alcançado para pelo menos um produto de degradação peptídica envolvido na cascata proteolítica; cosservindo o dito equilíbrio de estado firme; opcionalmente, adicionando um ou mais padrão(ões) interno(s) uma vez que o equilíbrio de estado firme é conservado; conduzindo uma extração de fase sólida com a amostra; e analisando a amostra. A separação de plasma ou soro pode ser feita antes ou depois da etapa de incubação, até um equilíbrio de estado firme ser alcançado (e opcionalmente estabelecido), dependendo de se o equilíbrio de estado firme deve ser investigado no plasma, soro, ou no sangue todo.

[00106] A análise do pelo menos um produto de degradação peptídica, opcionalmente em equilíbrio de estado firme concentração, ou o nível de aldosterona pode ser feito, por exemplo, por espectrometria de massa (MS); por cromatografia líquida, tal como cromatografia líquida de pressão alta (também chamada cromatografia líquida de alto desempenho, HPLC); especialmente por cromatografia líquida - ionização por electrospray - espectrometria de massa (LC-MS), e/ou cromatografia de espectrometria de massa de série líquida (LC-MS/MS). Por exemplo, Cui et al. (Anal Biochem. 369 (2007), 27-33) descreve a cromatografia líquida-ionização por electrospray - espectrometria de massa e métodos a série de cromatografia líquida de espectrometria de massa métodos para quantificar peptídeos de angiotensina. Para cada peptídeo ou analito e padrões internos correspondentes, transições de massa diferentes podem ser medidas. O desempenho do método pode ser monitorado usando amostras de controle de qualidade.

[00107] Tais amostras de controle de qualidade podem incluir, por exemplo, amostras biológicas com concentrações de analito pré- definidas, como também amostras sintéticas compreendendo uma mistura de concentrações pré-definidas de peptídeos sintéticos. Por exemplo, a amostra de controle de qualidade pode ser um sangue misturado, plasma, ou amostra de soro ou amostra homogeneizada de tecido agrupado com concentrações pré-definidos de um ou mais peptídeos. Concentrações de peptídeo de angiotensina (por exemplo, a concentração de Ang II) podem ser calculadas relacionando sinais de peptídeo endógeno para sinais de padrão interno, desde que os sinais integrados tenham alcançado uma proporção de sinal-para- barulho acima de 10.

[00108] Além disso, a análise pode ser feita por radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). Opcionalmente, uma etapa de purificação de HPLC pode ser feita antes para a quantificação baseada em RIA ou ELISA do produto de degradação peptídicas da cascata proteolítica. Em uma modalidade, o pré-tratamento de amostra, processamento de amostra, e/ou a análise das amostras pode ser feita em um formato de múltiplos poços, por exemplo, em 96 cavidades de poço.

[00109] Uma concentração de equilíbrio de estado firme de um peptídeo (por exemplo Ang II) caracterizado pelo fato de que o contexto significa que sua proporção de formação é igual à sua proporção de degradação levando a uma concentração de peptídeo (por exemplo Ang II), que substancialmente ou significativamente não muda com o passar do tempo, por um certo período de tempo, e que é firmemente dependente das afinidades das enzimas para seus substratos, sob as dadas condições, em vez proporções de conversão máxima de enzima, como ainda descrito acima. Uma vez que a presente invenção trata de sistemas biológicos, está claro que o termo "equilíbrio de estado firme" não pode ser considerado como um ponto único a ser alcançado, porém mais como uma região de alvo cinético de concentrações de peptídeos, que não mudam significativamente com o passar do tempo, por um certo período de tempo. Períodos de tempo mais acurados até a tal concentração de equilíbrio de estado firme, são alcançados são principalmente dependentes da dada cascata proteolítica, nos analitos peptídicos a ser quantificados, na natureza da amostra e nos parâmetros de incubação. Isto pode ser facilmente determinado para cada cascata. Em geral, a "janela de equilíbrio de estado firme", caracterizado pelo fato de que a quantificação, de acordo com a presente invenção, pode ser realizada é um tanto grande, pelo menos para algumas das cascatas proteolíticas, especialmente aquelas no sangue. Normalmente, o equilíbrio de estado firme é alcançado depois de um certo tempo de incubação, que é empiricamente determinado (por exemplo 30 minutos para o sistema de RAS) e depois permanece estável por um período de tempo prolongado (por exemplo, 6 horas (h) para o sistema de RAS). Depois, o equilíbrio de estado firme é perturbado por efeitos tais como degradação e inativação das enzimas envolvidas por uma falta de substrato de alimentação na amostra. A concentração do substrato de alimentação, baseada no tempo de estabilidade (ts) para uma dada cascata, pode ser calculada dividindo a concentração do substrato de alimentação (ou peptídeo precursor de alimentação) (cf) reduzido por uma enzima- e constante de amostra específica, definindo a mínima concentração de substrato para alcançar a proporção máxima de renovação da enzima de alimentação na amostra (cmin), pela proporção de renovação da enzima de alimentação da cascata, desta maneira definindo a proporção de alimentação (Vf) da cascata. ts = (Cf — Cmin)/Vf tS concentração do substrato de alimentação baseada no tempo de estabilidade [h] cf concentração do substrato de alimentação [mol/L] cmin amostra da concentração de substrato mínima específica para realizar a proporção máxima de renovação da enzima de alimentação na amostra [mol/L] Vf proporção de alimentação da cascata [[mol/L]/[h]] e cmin = f^cE f fator de excesso cE concentração de enzima de alimentação

[00110] Por exemplo, a aplicação dessas fórmulas acima no RAS, caracterizado pelo fato de que a conversão é realizada por renina, rende uma concentração de substrato de alimentação calculada, com base no tempo de estabilidade do equilíbrio de estado firme de RAS de cerca de 60 a 200 horas, baseado nos valores diferentes publicados para PRA (atividade de renina de plasma, PRC (concentração de renina de plasma), ver por exemplo [Nishiyama et al. 2010, e Bystrom et al., Clin. Chem. 56(2010), 1561-1569], e aplicando uma concentração de AGT de, por exemplo, 70 μg/ml de plasma, e um fator de excesso de, por exemplo, 1000. Naturalmente, a dita concentração de substrato de alimentação calculada, baseada no tempo de estabilidade, servirá como um ponto de referência bruto e teórico somente, uma vez que o tempo atual de estabilidade do equilíbrio de estado firme pode diferir significativamente nas amostras.

[00111] Ao contrário dos métodos do estado da arte, caracterizado pelo fato de que inibidores são usados para imediatamente estabilizar os peptídeos produzidos por certas enzimas com sucesso limitado [Bystrom et al., Clin. Chem. 56(2010), 1561-1569], de acordo com a presente invenção, a amostra é possibilitada alcançar uma atividade de enzima definindo o equilíbrio de estado firme por pelo menos um peptídeo envolvido na cascata proteolítica, por exemplo, Ang II. Esta abordagem inovadora permite uma avaliação altamente reprodutora de Ang II na matriz de amostra fisiológica, enquanto integra atividades de enzima envolvidas no metabolismo de Ang II. Outra vantagem sobre tecnologias do estado da arte é que as concentrações de substrato no ensaio, de acordo com a presente invenção, geralmente permanecem abaixo da concentração de metabolismo de enzimas (exceto para a enzima de alimentação), levando em consideração a afinidade da enzima para cada substrato único sob as condições dadas na amostra (por exemplo, condições fisiológicas) ao contrário dos ensaios da atividade de enzima in vitro, caracterizado pelo fato de que esta característica importante é negligenciada por meio de simplificação, usando quantidades de substrato em excesso.

[00112] Especificamente para amostras de sangue, é importante para alcançar o equilíbrio de estado firme para pelo menos um peptídeo envolvido na cascata proteolítica (por exemplo Ang II), que as proteases da cascata proteolítica a ser observadas com o presente método de SSE, não são inibidas pela adição de inibidores de protease para a amostra, pelo menos não até um ponto que não permite, pelo menos, uma enzima envolvida na degradação do dito pelo menos um peptídeo, funcionar até o estado firme ser alcançado para o dito pelo menos um peptídeo, isto é, pelo menos uma enzima de degradação do(s) dito(s) peptídeo(s) caracterizada pelo fato de que ser ativada até um ponto que possibilite o equilíbrio de estado firme para o(s) dito(s) peptídeo(s). Dessa maneira, em uma modalidade, inibidores de protease não são adicionados para a amostra até um ponto caracterizado pelo fato de que as atividades das proteases envolvidas na formação e degradação do pelo menos um peptídeo a ser analisado (por exemplo Ang II) são significativamente inibidas, antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado. De acordo com a dita modalidade, as amostras não são combinadas com tais inibidores de protease ou, se tais inibidores já tiverem sido adicionados, tais inibidores são inibidos (em sua função de inibição de protease), ou removidos antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado. Naturalmente, inibidores que não afetam as proteases da relevante cascata proteolítica, que deverá ser estudada pelo método SSA, de acordo com a presente invenção, mas que inibem outras atividades proteolíticas (por exemplo, inibidores da coagulação sanguínea, se o RAS for estudado), podem ser adicionados à amostra, porque isto não afetará a capacidade da relevante cascata proteolítica (isto é, a cascata a ser analisada, por exemplo, o RAS) para alcançar um equilíbrio de estado firme para pelo menos um peptídeo da cascata.

[00113] É vantajoso quantificar um ou mais produtos de degradação proteolítica (por exemplo Ang II) no equilíbrio de estado firme. Isto é essencialmente diferente das análises da técnica anterior, que normalmente aplicam quantificação de analitos em um estado da cascata proteolítica estabilizada, imediatamente depois das amostras (isto é, amostras de sangue) ser colhidas dos sujeitos, isto é, não é em um equilíbrio de estado firme. Normalmente, tais amostras da técnica foram tratadas com inibidores de protease, imediatamente depois de colhidas as amostras, a fim de inibir trocas dependentes de enzima não desejadas na cascata. O método de SSE, no entanto, usa tais mudanças de enzima dependente na análise do estado fisiológico ou bioquímico do sujeito, a respeito da cascata proteolítica, por especificamente permitir as proteases da dita cascata sob investigação realizar sua unidade de atividade proteolítica até um equilíbrio de estado firme ser alcançado. Isto normalmente levará a uma mudança na quantidade e composição dos produtos de degradação peptídica na cascata proteolítica sob investigação, em comparação à amostra imediatamente estabilizada depois da coleta da amostra do sujeito. A atividade proteolítica específica da amostra leva a um equilíbrio de estado firme, que é muito mais indicativo do status bioquímico do sujeito, no que diz respeito a esta cascata do que a amostra imediatamente estabilizada (sem a etapa de incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado).

[00114] Como já indicado acima, o equilíbrio de estado firme de acordo com a presente invenção não é um único ponto, quantitativamente exatamente determinado e isolado, mas um status caracterizado pelo fato de que as mudanças em proporções relativas foram substancialmente reduzidas na amostra. Normalmente, tal equilíbrio de estado firme pode ser realizado aplicando as condições de incubação normais para as dadas amostras, e a cascata sob investigação. Como especificado acima, a amostra pode ser incubada por até 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou 300 minutos. Para o RAS e/ou o sistema de bradicinina, as amostras podem ser incubadas por pelo menos 30 minutos até 300 minutos, ou por pelo menos 30 minutos até 180 minutos, ou por pelo menos 30 minutos até 120 minutos, ou por pelo menos 30 minutos até 90 minutos, ou por pelo menos 30 minutos até 60 minutos. Temperaturas de incubação apropriadas são aquelas apresentadas no sistema fisiológico, ou aquelas caracterizadas pelo fato de que as proteases da cascata proteolítica sob investigação têm sua temperatura de ação ideal, por exemplo, a uma temperatura de 30 a 50°C, 35 a 40°C, ou especialmente de cerca de 37° C (especificamente para o sangue de ser humano ou amostras derivadas de sangue de ser humano).

[00115] Uma vez que o método de SSE, de acordo com a presente invenção, aplica as atividades proteolíticas contidas na amostra, a uma ou mais amostras, especialmente amostras de sangue, devem estar livres de inibidores de protease adicionados para a cascata proteolítica, antes do equilíbrio de estado firme ser alcançado.

[00116] Tais inibidores de protease podem ser adicionados depois da incubação até um equilíbrio de estado firme ser alcançado e estabilizado. Isto protege a(s) concentração(ões) de peptídeos (em particular a concentração de Ang II) refletindo que o(s) equilíbrio(s) de estado firme é/são ainda presente(s) durante a etapa de quantificação (embora o equilíbrio de estado firme seja normalmente estável durante um certo período de tempo, isto provê certeza de qualidade adicional para o método de SSE).

[00117] O método de SSE é dependente de uma exata e acurada quantificação dos produtos de degradação peptídica. Uma vez que muitas amostras, especialmente amostras de sangue, contêm proteínas, sais, ácidos, bases, lipídeos, fosfoslipídeos ou outros componentes, que podem perturbar a quantificação do peptídeo; métodos para pré-tratamento das amostras antes da quantificação poder ser aplicada.

[00118] Em uma modalidade, o sujeito é um sujeito sofrendo de hipertensão, e/ou é resistente ao tratamento anti-hipertensivo, e/ou é suspeito de sofrer de PHA, e/ou está com necessidade de um diagnóstico de PHA positivo ou negativo. Em uma modalidade, o sujeito é um ser humano. Em uma modalidade, o sujeito é um animal, por exemplo, um gato, cão, cavalo, rato, camundongo, coelho, porco e/ou gado.

[00119] Como descrito acima, os métodos da técnica anterior normalmente compreendem uma fase de varredura, caracterizado pelo fato de que o ARR é determinado uma vez, seguida pelo teste de confirmação, caracterizado pelo fato de que o ARR ou aldosterona só é determinado pelo menos uma segunda vez até o PHA poder ser diagnosticado com suficiente sensibilidade e especificidade. O motivo para esta estratégia é a frequente ocorrência de resultados positivos falsos. O teste de confirmação de infusão salina descrito acima deverá ainda compreender a determinação do ARR três vezes (uma vez na varredura, uma segunda vez no teste de confirmação antes da infusão salina, e uma terceira vez depois da infusão salina). Ao contrário, os métodos da presente invenção permitem um diagnóstico baseado em um teste ou etapa, por exemplo, uma medição do AA2R somente uma vez.

[00120] Desta maneira, em uma modalidade, o método é um diagnóstico de uma etapa. Em uma modalidade, o diagnóstico compreende somente uma medição do AA2R (em um ponto no tempo). Em uma modalidade, o nível de angiotensina II e/ou o nível de aldosterona é medido somente uma vez.

[00121] Em uma modalidade, o dito diagnóstico de uma etapa leva a um diagnóstico confirmado. Em uma modalidade, o dito diagnóstico de uma etapa não requer teste de confirmação, tal como por exemplo qualquer segunda ou adicional medição do AA2R, ou outros parâmetros. Em uma modalidade, nenhum teste de infusão salina é requerido.

[00122] Em uma modalidade, a amostra biológica é uma amostra de sangue ou uma amostra derivada do sangue. Por exemplo, a amostra de sangue ou amostra derivada de sangue é sangue total, soro, plasma de EDTA, plasma de heparina, plasma de citrato, sangue de heparina, sangue de EDTA, ou sangue de citrato. Em uma modalidade, pelo menos um dos níveis é medido por espectrometria de massa. Em uma modalidade, pelo menos um dos níveis é medido por anticorpo baseado em métodos de quantificação, tal como por exemplo, ELISA. Em uma modalidade, ambos os níveis são medidos por espectrometria de massa. Em uma modalidade, ambos os níveis são medidos pelo anticorpo baseado em métodos de quantificação. Isto pode ser facilmente feito, pois os kits para ambos os analitos individuais estão comercialmente disponíveis. No entanto, a espectrometria de massa tem vantagens significativas sobre anticorpo baseado e métodos de quantificação em relação à seletividade e reprodutibilidade.

[00123] Em outra aspecto, a presente invenção refere-se a um kit para diagnosticar PHA, compreendendo um padrão de angiotensina II, e um padrão de aldosterona.

[00124] Em uma modalidade, o kit pode ainda compreender um manual, um ou mais solventes, um ou mais detergentes, e/ou um ou mais cartuchos de extração de fase sólida.

[00125] Em uma modalidade, o manual compreende uma descrição do método de acordo com a invenção, em particular, uma descrição de qualquer uma das modalidades do método descritas acima. Em uma modalidade, o kit compreende um isótopo rotulado de padrão de angiotensina II e/ou um isótopo rotulado de padrão de aldosterona. Em uma modalidade, o kit compreende um anticorpo de angiotensina II e/ou um anticorpo de aldosterona.

[00126] A invenção é ainda exemplificada pelas modalidades a seguir, que podem prontamente ser combinadas com qualquer uma das reivindicações 1 a 15:

[00127] 1. Método para o diagnóstico de hiperaldosteronismo primário em um sujeito, compreendendo medir o nível de aldosterona e o nível de Ang II, e os combinando a uma proporção aritmética (proporção de aldosterona para Ang II, AA2R) ou um método como definido nas reivindicações, especialmente reivindicação 1.

[00128] 2. Método da modalidade 1, caracterizado pelo fato de que um AA2R alto indica hiperaldosteronismo primário, e um AA2R baixo indica sem hiperaldosteronismo primário.

[00129] 3. Método da modalidade 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o fator de discriminação baseado no AA2R de um determinado par de dados ou conjunto de dados é maior do que o fator de discriminação baseado no ARR do mesmo par de dados ou conjunto de dados.

[00130] 4. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a especificidade do método é maior do que 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.

[00131] 5. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que a sensibilidade do método é pelo menos 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%.

[00132] 6. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que pelo menos 95% de todos os sujeitos de PHA confirmado têm um AA2R maior do que pelo menos 95% de todos os sujeitos de não PHA confirmado.

[00133] 7. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito método é independente de qualquer tratamento do sujeito, exceto para ARBs e exceto por composições farmacêuticas afetam o nível de aldosterona, mas não excluindo os efeitos mediados por Ang II no nível de aldosterona.

[00134] 8. Método da modalidade 7, caracterizado pelo fato de que o dito tratamento é um tratamento que interfere no RAS.

[00135] 9. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que o equilíbrio de estado de nível firme de angiotensina II é medido.

[00136] 10. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.

[00137] 11. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que o sujeito está sob tratamento anti- hipertensivo, exceto para ARBs e exceto para composições farmacêuticas que afetam o nível de aldosterona, mas não excluindo os efeitos mediados por Ang II sobre o nível de aldosterona.

[00138] 12. Método da modalidade 11, caracterizado pelo fato de que o dito tratamento compreende a administração de pelo menos uma composição farmacêutica afetando o sistema de renina- angiotensina (RAS).

[00139] 13. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que método é um diagnóstico de uma etapa e não requer qualquer teste de confirmação.

[00140] 14. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que os níveis são medidos só uma vez.

[00141] 15. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que nenhum teste de infusão salina é requerido.

[00142] 16. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de sangue ou uma amostra derivada de sangue.

[00143] 17. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue ou amostra derivada de sangue é sangue total, soro, plasma, sangue de heparina, sangue EDTA, ou sangue de citrato.

[00144] 18. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos níveis é medido pela espectrometria de massa.

[00145] 19. Método de qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos níveis é medido pelo anticorpo baseado em métodos de quantificação.

[00146] 20. Kit para diagnosticar PHA, compreendendo um padrão de angiotensina II, um padrão de aldosterona e um manual.

[00147] 21. Kit da modalidade 20, ainda compreendendo um ou mais solventes, detergentes, e/ou fase de cartuchos de extração sólida.

[00148] 22. Kit da modalidade 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o manual compreende uma descrição do método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 19.

[00149] 23. Kit de qualquer uma das modalidades 20 a 22, caracterizado pelo fato de que o kit é para um método de quantificação de espectrometria de massa de pelo menos um nível, e compreende um padrão de angiotensina II rotulado de isótopo e/ou um padrão de aldosterona rotulado isótopo.

[00150] 24. Kit de qualquer uma das modalidades 20 a 23, caracterizado pelo fato de que o kit é para um anticorpo baseado no método de quantificação de pelo menos um nível e compreende um anticorpo de angiotensina II e/ou um anticorpo de aldosterona.

EXEMPLOS Exemplo 1: Medição de AA2R em plasma de paciente hipertensos. Teste de Infusão Salina (SIT) e Coleta de Amostra

[00151] Um paciente não PHA e um paciente PHA foram submetidos ao SIT. Pacientes se submeteram a SIT, de acordo com orientações da sociedade endócrina (John W. Funder et al.; J Clin Endocrinol Metab. Setembro de 2008, 93(9):3266 -3281). Em suma, dois litros de solução salina a 0,9% foram administrados para o paciente no curso de 4 horas (Teste de infusão salina, SIT). Amostras de sangue EDTA e sangue de heparina foram colhidas antes (pré-SIT) e depois (pós-SIT) a infusão salina de 4 horas. As amostras de sangue foram centrifugadas em uma centrífuga refrigerada a 3000 g por 10 minutos e congeladas a -80°C até a análise por espectrometria de massa.

Medição de níveis de equilíbrio de Ang II

[00152] Níveis de equilíbrio de Ang II foram determinados pela quantificação dos níveis de peptídeos de angiotensina de estado firme em amostras de plasma de heparina equilibradas. Desta maneira, amostras de plasma de heparina descongelada foram incubadas por 30 minutos a 37°C em um banho de água. Em seguida a o equilíbrio, níveis de peptídeo de plasma de angiotensina foram estabilizados através da adição de inibidores de protease e níveis de equilíbrio de peptídeo foram subsequentemente quantificados por espectrometria de massa. Desta maneira, isótopo rotulado de Ang II estável foi adicionado às amostras de plasma estabilizadas a uma concentração de 200 pg/ml para padronização interna. Em seguida a extração de fase sólida baseada em C18, amostras foram submetidas à análise de espectrometria de massa, usado uma coluna analítica de fase reversa (Acquity UPLC® C18, Águas) operando em linha com um espectrômetro de massa quadropol tripla XEVO TQ-S (Águas) em modo MRM. Duas transições de massa diferentes foram medidas por analito e padrão e as concentrações foram calculadas relacionando sinais endógenos a sinais de padrão interno sob consideração dos fatores de resposta correspondentes, determinados por curvas de calibração em plasma branco de ser humano.

Medição de níveis de plasma de aldosterona

[00153] Aldosterona rotulada de isótopo estável foi adicionada às amostras de plasma estabilizadas em uma concentração de 500 pg/ml para padronização interna. Em seguida à extração de fase sólida baseada em C18, as amostras foram submetidas à análise de espectrometria de massa usando uma coluna analítica de fase reversa (Acquity UPLC® C18, Águas) operando em linha com um espectrômetro de massa quadropol tripla de XEVO TQ-S (Águas) em modo de MRM. Duas transições de massa diferentes foram medidas por analito e padrão e a concentração foram calculadas relacionando sinais endógenos aos sinais de padrão interno sob consideração dos fatores de resposta correspondente, determinados pelas curvas de proporção de calibração no plasma vazio de ser humano.

Cálculo

[00154] Concentrações de aldosterona obtidas foram divididas pelas concentrações obtidas para Ang II em cada amostra de plasma. Exemplo 2: Medição do AA2R em voluntários saudáveis recebendo de diferentes tratamentos com anti-hipertensivo.

Tratamentos e Coleta de Amostra

[00155] Doses únicas de três fármacos anti-hipertensivos diferentes foram administrados a 5 voluntários saudáveis em 3 dias de tratamento diferente separados por uma semana. 4 horas seguindo a administração de uma dose única de Enalapril de 10 mg (ACE- Inhibito), Losartan de 50 mg (ARB) ou Aliskiren de 150 mg (Inibidor de Renina), sangue de heparina foi coletado por punção venosa e o plasma foi separado por centrifugação. As amostras foram congeladas a -80°C até a análise.

Medição de níveis de Ang II de equilíbrio

[00156] Os níveis de equilíbrio de Ang II foram determinados pela quantificação dos níveis de peptídeo de angiotensina de estado firme em amostras de plasma e heparina equilibradas. Dessa maneira, amostras de plasma de heparina descongeladas foram incubadas por 60 min a 37°C em um banho de água. Em seguida ao eq uilíbrio, níveis de peptídeo de angiotensina de plasma foram estabilizados pela adição de inibidores de protease, e níveis de peptídeo de equilíbrio foram subsequentemente quantificados pela espectrometria de massa. Dessa maneira, Ang II rotulado de isótopo estável foi adicionado para as amostras de plasma estabilizadas em uma concentração de 200 pg/ml para padronização interna. Em seguida à extração da fase sólida baseada C18, amostras foram submetidas à análise de espectrometria de massa, usando uma coluna analítica de fase reversa (Acquity UPLC® C18, Águas) operando em linha com um espectrômetro de massa de quadropol triplo de XEVO TQ-S (Águas) em modo MRM. Duas transições de massa diferentes foram medidas por analito e padrão, e as concentrações foram calculadas relacionando sinais endógenos aos sinais de padrão interno sob consideração dos fatores de resposta correspondentes determinados pelas curvas de calibração em plasma de ser humano em branco.

Medição dos níveis de plasma de aldosterona

[00157] Aldosterona rotulada de isótopo estável foi adicionada às amostras de plasma estabilizadas, em uma concentração de 500 pg/ml para padronização interna. Em seguida à extração de fase sólida baseada em C18, as amostras foram submetidas à análise de espectrometria de massa usando uma coluna analítica de fase reversa (Acquity UPLC® C18, Águas) operando em linha com um espectrômetro de massa quadropol triplo XEVO TQ-S (Águas) em modo MRM. Duas transições de massa diferentes foram medidas per analito e padrão e as concentrações foram calculadas relacionando os sinais endógenos aos sinais de padrão interno sob consideração dos fatores de resposta correspondentes, determinados pelas curvas de calibração em plasma de ser humano em branco.

Claims

1. Método para o diagnóstico de hiperaldosteronismo primário em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende medir o nível de aldosterona e o nível de angiotensina II (Ang II) em uma amostra biológica do indivíduo, em que a amostra é incubada até que seja alcançado um equilíbrio no estado estacionário da angiotensina II, em que a taxa de degradação global real da angiotensina II é igual à taxa de formação global real da angiotensina II, o nível de angiotensi- na II é medido no equilíbrio do estado estacionário e calculando a razão entre o nível de aldosterona e o nível de Ang II (relação aldostero- na-angiotensina II, AA2R).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma AA2R alta em comparação com a AA2R de um ou mais indivíduos não-PHA confirmados indica hiperaldosteronismo primário e/ou uma AA2R baixa em comparação com a AA2R de um ou mais indivíduos com PHA confirmados não indica hiperaldosteronismo primário.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proporção de valores entre um ou mais indivíduos positivos para PHA confirmados e um ou mais indivíduos negativos para PHA confirmados (o fator de discriminação) com base na AA2R é maior do que entre os mesmos conjuntos de dados com base na ARR .

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a especificidade e/ou a sensibilidade do método é maior que a especificidade e/ou a sensibilidade da AAR no mesmo grupo de pacientes.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está sob tratamento anti-hipertensivo.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que aumentam a concentração e/ou a atividade de renina.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que diminuem o poder de diagnóstico do ARR.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas selecionadas dentre inibidores da renina, inibidores da ECA, ECA2, diuréticos e / ou bloqueadores dos canais de cálcio.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido tratamento não diminui o poder de diagnóstico do AA2R ou diminui o poder de diagnóstico do AA2R em menor extensão.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não é tratado com bloqueadores dos receptores da angiotensina (ARB).

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o método é um diagnóstico em uma etapa e não requer nenhum teste de confirmação.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de sangue ou uma amostra derivada de sangue.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos níveis é medido por espectrometria de massa; e/ou em que pelo menos um dos níveis é medido por métodos de quantificação baseados em anticorpos.