BR112014025559B1 - Processo para medição de produtos de degradação peptídica de uma cascata proteolítica em amostras de sangue - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA MEDIÇÃO DE PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO PEPTÍDICA DE UMA CASCATA PROTEOLÍTICA EM AMOSTRAS DE SANGUE. A presente invenção refere-se a um processo de medição de produtos de degradação peptídica de uma cascata proteolítica (por exemplo, o sistema renina - angiotensina (RAS) e o sistema bradicinina) em amostras biológicas, especialmente amostras de sangue, onde a amostra é incubada até um equilíbrio de estado estável ser atingido para pelo menos um produto de degradação peptídica envolvido na dita cascata proteolítica e onde o dito pelo menos um produto de degradação peptídica em equilíbrio de estado estável da cascata proteolítica é quantificado na amostra.

Description

[001] A presente invenção refere-se à medição de produtos de degradação peptídica de uma cascata proteolítica em amostras de sangue.

[002] A ocorrência qualitativa e quantitativa de produtos de degradação peptídica de cascatas proteolíticas em sangue varia signifi- cantemente com o status fisiológico ou bioquímico do sujeito. Ela pode, por exemplo, depender do status de saúde do sujeito em relação a uma doença dada ou suspeita, e/ou sobre medicação, e/ou outros fatores. Os produtos de degradação proteolítica dependem principalmente da regulação e atividade de enzimas proteolíticas no sistema sanguíneo o que por si próprio é dependente do status fisiológico do paciente.

[003] O sistema renina - angiotensina (RAS) é uma cascata pro- teolítica, que é constituída por múltiplas enzimas e peptídeos. A cascata começa quando angiotensina I (angiotensina 1-10 ou Ang 1-10) é liberada a partir do pró-peptídeo angiotensinogênio (AGT) por renina secretada pelo rim. AGT é abundantemente expresso no fígado em seres humanos e secretado na circulação para constituir uma reunião em plasma virtualmente inexaurível de AGT. Os peptídeos metabólitos produzidos a partir de Ang 1-10 através de uma variedade de proteases atuam como ligantes para receptores de angiotensina em diferentes tecidos conduzindo a um painel diversificado de funções fisiológicas mediadas por peptídeos angiotensina.

[004] A regulação de pressão do sangue é uma resposta fisiológica bem estudada afetada por peptídeos angiotensina. Angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8) é produzida através da ação proteolítica de Enzima de Conversão de Angiotensina (ACE) através de remoção de dois aminoácidos terminais-C de Ang 1-10. Ang 1-8 se liga a receptores celulares conduzindo à vasoconstrição e um consecutivo aumento em pressão do sangue.

[005] Este papel crucial de ACE na produção de Ang 1-8, o torna um favorável alvo farmacológico com o foco principal de tratamentos anti-hipertensivos fixados sobre a redução de níveis de Ang 1-8 conduzindo a uma diminuição em pressão de sangue. Isto também é refletido pelo amplo painel de inibidores de ACE estando em uso para o tratamento de hipertensão. Mais recentemente outras enzimas-RAS alvejáveis incluindo renina ou endopeptidase neutra (NEP) foram identificadas como alvos farmacológicos para tratamentos anti- hipertensivos enquanto inibidores de ACE ainda foram otimizados para diminuição de frequência de efeitos colaterais que são pensados serem causados por uma falta de seletividade de domínio ACE. Frequentes efeitos colaterais ocorrendo durante administração de inibidores de ACE incluem tosse seca e angioedema e são pensados serem causados pela inibição de degradação de bradicinina (BK) por estes inibidores não somente como Ang 1-10 mas também certos peptídeos BK são descritos serem clivados por ACE.

[006] Tal limitada seletividade de substrato é uma característica muito comum observada entre enzimas RAS. Além de ACE, que é levemente diferente de outras enzimas RAS devido sua estrutura de dois domínios, também Enzima de Conversão de Angiotensina 2 (ACE2) é conhecida ser capaz de clivar Ang 1-8 e Ang 1-10 para render angiotensina 1-7 (Ang 1-7) e angiotensina 1-9 (Ang 1-9), respectivamente.

[007] Além disso, diferentes proteases RAS podem compartilhar seus substratos conduzindo a uma competição de enzimas para um dado substrato. Por exemplo, Ang 1-10 é conhecida ser clivada por ACE, ACE2, NEP e diferentes aminopeptidases. Todas estas considerações culminam em um quadro muito complexo da RAS, aparecendo como uma malha de diferentes enzimas, receptores e peptídeos conduzindo a concentrações de peptídeos afetadas por múltiplos fatores.

[008] Comparação de níveis de ACE solúvel em plasma publicados com concentrações de Ang 1-10 em plasma, torna-se claro que a enzima ACE está presente em significante excesso molar comparado ao peptídeo Ang 1-10 em circulação. Isto conduz a uma falha na descrição de RAS por meio de cinéticas de enzimas clássicas, que são baseadas na presença de um vasto excesso de substrato. Em condi-ções fisiológicas onde níveis de peptídeo angiotensina em circulação não excedem 10-200 fmoles/mL, maioria de enzimas estão presentes em excesso molar comparadas a seus substratos forçando o investigador a afastar-se de Cinéticas - Menten clássicas para obter uma visão confiável sobre processos bioquímicos em condições fisiológicas na matriz de amostra original.

[009] Por exemplo, Ang 1-10 foi descrita ser degradada por ACE2 com uma eficiência catalítica muito menor que Ang 1-8. Experimentos mostrando isto foram realizados em uma matriz artificial usando um vasto excesso dos substratos comparado às respectivas enzimas rendendo máxima taxa de conversão de ACE2 para Ang 1-8 a Ang 1-7 que é 65 vezes maior que a taxa de conversão para Ang 1-10 a Ang 19 [Rice et al., Biochem J., 383 (2004), 45-51].

[0010] Tomando junto as prévias considerações com o fato de que múltiplos peptídeos angiotensina mostram atividade biológica, torna-se óbvio que há uma grande necessidade de avaliação de RAS em amostras biológicas assegurando a manutenção de concentrações de substrato fisiológico na amostra. Manipulação do RAS por meios farmacológicos altera atividades de enzima e taxas de conversão de peptídeo em múltiplos níveis do sistema, o que claramente favorece a avaliação compreensiva do RAS para monitoração de eficácia de fármaco e seletividade de inibidor para definidas reações de enzima.

[0011] Por exemplo, inibidores ACE, que são descritos inibirem ambos domínios ACE em uma extensão desconhecida em concentrações de substrato fisiológicas, podem ser investigados para sua inibição da conversão de Ang 1-10 a Ang 1-8, mas também para seu potencial inibidor com relação à conversão de Ang 1-7 a angiotensina 1-5 (Ang 1-5) ou bradicinina 1-9 (BK 1-9) a bradicinina 1-7 (BK 1-7) ou BK 1-7 a bradicinina 1-5 (BK 1-5) de modo a otimizar seus perfis de efeitos colaterais.

[0012] Tomando junto dados publicados para concentrações de peptídeos angiotensina e enzimas metabolizantes em plasma humano, uma grande variância entre diferentes grupos torna-se óbvia apontando para uma baixa reprodutibilidade dos processos usados. Não obstante, existe um vasto excesso molar reportado para o pré-hormônio AGT em plasma humano comparado à renina significando que ele serve como uma fonte viva muito longa de Ang 1-10 que é produzida através de uma constante atividade renina na amostra de plasma. Este fato também é usado nos ensaios-PRA do estado da técnica onde a quantidade produzida de Ang 1-10 sobre um período de tempo definido é usada para calcular de volta para a atividade renina na amostra. Infelizmente, estes valores são frequentemente muito baixos devido a uma falta de estabilização (inibição incompleta de degradação) de Ang 1-10 produzida, o que requer um bem definido conjunto de inibidores de protease para assegurar que a taxa de degradação de Ang 1-10 está próxima de zero [Bystrom et al., Clin. Chem. 56(2010), 15611569]. Estas armadilhas junto com significantes variâncias entre doadores resultam em um procedimento pobremente reproduzível com somente limitado valor diagnóstico.

[0013] Por isso é um objetivo da presente invenção prover uma ferramenta nova e aperfeiçoada para análise de um status fisiológico ou bioquímico de um sujeito, especialmente o status fisiológico ou bioquímico de um sujeito ou paciente humano antes, durante e após um certo tratamento terapêutico, incluindo mas não limitado a administração de fármaco, cirurgia ou hemodiálise , através de uso de uma amostra de sangue de tal sujeito.

[0014] Por isso, a presente invenção provê um processo para medição de produtos de degradação peptídica de uma cascata proteolíti- ca em uma amostra biológica, especialmente uma amostra de sangue, onde a amostra é incubada até um equilíbrio de estado estável ser alcançado para pelo menos um produto de degradação peptídica envolvido na dita cascata proteolítica e onde o dito pelo menos um produto de degradação peptídica em uma concentração de equilíbrio de estado estável é quantificado na amostra.

[0015] O termo "equilíbrio de estado estável" (SSE) como aqui usado significa que a real taxa de degradação total de pelo menos um produto de degradação peptídica envolvido na cascata proteolítica é igual à real taxa de formação total do dito produto de degradação pep- tídica, pelo que conduzindo a uma concentração estável do dito produto de degradação peptídica, isto é, uma concentração de peptídeo de equilíbrio de estado estável que não varia substancialmente sobre um certo período de tempo, como ainda especificado abaixo. A real taxa de formação total de um produto de degradação peptídica é definida pela soma das reais taxas de quantidade metabolizada de todas as enzimas envolvidas na formação do dito produto de degradação peptí- dica, isto é, o dito produto de degradação peptídica é um produto direto da dita enzima(s). A real taxa de degradação total de um produto de degradação peptídica é definida pela soma das reais taxas de quantidades metabolizadas de todas as enzimas envolvidas na degradação do dito produto de degradação peptídica, isto é, o dito produto de de-gradação peptídica é um substrato direto da dita enzima(s).

[0016] O termo "cascata proteolítica" como aqui usado,deve significar uma cascata compreendendo pelo menos duas reações proteolí- ticas consecutivas. Em uma modalidade, a cascata proteolítica é uma cascata de pelo menos duas, três, quatro, ou cinco reações proteolíti- cas consecutivas. Tal cascata proteolítica pode compreender pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ou 17 reações pro- teolíticas consecutivas ou não consecutivas, ou suas combinações, que podem ser ramificadas ou multiplamente ramificadas. Por exemplo, cascatas proteolíticas de acordo com a invenção incluem o sistema renina - angiotensina (RAS), também chamado sistema renina - angiotensina - aldosterona (RAAS), o sistema bradicinina, o sistema cinina - calicreína, a cascata de coagulação de sangue, o sistema complemento, caminhos de apoptose, cascatas de neuropeptídeos (por exemplo, o sistema oxitocina), cascatas de peptídeos endotelina, e as cascatas de peptídeos natriuréticos.

[0017] Os termos "produto de degradação peptídica envolvido na cascata proteolítica" ou "produto de degradação peptídica da cascata proteolítica" como aqui usados devem significar um peptídeo, que é parte da dita dada cascata proteolítica, como substrato (peptídeo precursor) ou produto de pelo menos uma enzima envolvida na cascata proteolítica, ou como substrato e produto de pelo menos duas enzimas envolvidas na cascata proteolítica. Da mesma maneira, para a cascata proteolítica de RAS, peptídeos (ou produtos de degradação peptídica) envolvidos na cascata proteolítica podem ser selecionados de angio- tensinogênio, angiotensina I (Ang 1-10) e seus produtos de degradação biológica , especialmente angiotensina I (Ang 1-10), angiotensina 2-10 (Ang 2-10), angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angio- tensina III (angiotensina 2-8 ou Ang 2-8), angiotensina IV (angitotensi- na 3-8 ou Ang 3-8), angiotensina 1-9 (Ang 1-9), angiotensina 1-7 (Ang 1-7), angiotensina 2-7 (Ang 2-7), angiotensina 3-7 (Ang 3-7) e angio- tensina 1-5 (Ang 1-5). Para a cascata proteolítica de bradicinina, pep- tídeos (ou produtos de degradação peptídica) envolvidos na cascata proteolítica podem ser selecionados de calidina (KD ou Lys- bradicinina) e seus produtos de degradação biológica, especialmente bradicinina 1-9 (BK 1-9), bradicinina 2-9 ((BK 2-9), bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5). Em uma modalidade, o um ou mais produtos de degradação peptídica podem ser selecionados de peptídeos envolvidos em uma ou mais cascatas pro- teolíticas, por exemplo, a partir de duas ou mais cascatas proteolíticas, sendo tanto cascatas separadas como cascatas que podem estar relacionadas ou ligadas, por exemplo, por uma ou mais enzimas ou peptí- deos idênticos ou similares. Em uma modalidade, a cascata proteolíti- ca é o sistema renina - angiotensina (RAS) ou o sistema bradicinina, ou ambos. Por exemplo, o um ou mais produtos de degradação peptí- dica podem ser selecionados do RAS e o sistema bradicinina. Em uma modalidade, o produto de degradação peptídica é selecionado de an- giotensinogênio, angiotensina I (Ang 1-10), angiotensina 2-10 (Ang 210), angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensina III (angiotensina 2-8 ou Ang 2-8), angiotensina IV (angiotensina 3-8 ou Ang 3-8), angiotensina 1-9 (ang 1-0), angiotensina 1-7 (Ang 1-7), angi- otensina 2-7 (Ang 2-7), angiotensina 3-7 (Ang 3-7), angiotensina 1-5 (Ang 1-5), calidina (KD ou Lys-bradicinina), bradicinina 1-9 (BK 1-9), bradicinina 2-9 (BK 2-9), bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5).

[0018] Em uma modalidade, o produto de degradação peptídica é selecionado de angiotensina I (1-10), angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensina 1-7 (Ang 1-7), e angiotensina 1-5 (Ang 1-5). Em uma modalidade, os produtos de degradação peptídica que são quantificados são angiotensina I (1-10), angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensina 1-7 (Ang 1-7), e angiotensina 1-5 (Ang 1-5).

[0019] Em uma outra modalidade, o produto de degradação peptí- dica é selecionado de angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensina 1-7 (Ang 1-7), e angiotensina 1-5 (Ang 1-5). Em uma modalidade, os produtos de degradação peptídica que são quantificados são angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensina 1-7 (Ang 1-7), e angiotensina 1-5 (Ang 1-5).

[0020] Ainda em uma outra modalidade, o produto de degradação peptídica é selecionado de bradicinina 1-9 (BK 1-9), bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5). Em uma modalidade, os produtos de degradação peptídica que são quantificados são bradicinina 1-9 (BK 1-9), bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5).

[0021] Ainda em uma outra modalidade, o produto de degradação peptídica é selecionado de bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5). Em uma modalidade, os produtos de degradação peptídica que são quantificados são bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5).

[0022] Os termos "enzima envolvida na cascata proteolítica" ou "enzima da cascata proteolítica" como aqui usados devem significar uma enzima que é parte da dita dada cascata proteolítica, formando ou degradando pelo menos um peptídeo envolvido na cascata proteolí- tica. Da mesma maneira, para a cascata proteolítica RAS, enzimas envolvidas na cascata proteolítica podem ser selecionadas de renina, amino peptidases (AP, especialmente amino peptidase A (APA) e amino peptidase N (APN)), dipeptidil amino peptidases (DAP), carboxi peptidases (especialmente ACE2), dipeptidil carboxi peptidases (especialmente ACE), e endopeptidases (especialmente endopeptidase neutra, também chamada neprilisina). Para a cascata proteolítica de bra- dicinina, enzimas envolvidas na cascata proteolítica podem ser selecionadas de calicreína, amino peptidases (AP, especialmente amino peptidase A (APA) e amino peptidase N (APN)), dipeptidil amino peptidases (DAP), carboxi peptidases (especialmente ACE2), dipeptidil carboxi peptidases (especialmente ACE), e endopeptidases (especialmente endopeptidase neutra, também chamada neprilisina). O termo "real" como aqui usado significa a real (ou efetiva) taxa de formação ou degradação de um peptídeo, ou a real ou efetiva taxa de quantidade metabolizada de uma enzima, sob as condições como presentes na amostra.

[0023] O termo "igual a" como aqui usado significa que a concentração de peptídeo resultante de qualquer tal igual taxa(s) de formação ou degradação de dito peptídeo (a "concentração de peptídeo de equilíbrio de estado estável" ou "nível de peptídeo de equilíbrio de estado estável"), ou resultante de quaisquer tais taxas de quantidade metabo- lizada iguais de pelo menos duas enzimas envolvidas na formação ou degradação do dito peptídeo (a "taxa de quantidade metabolizada de enzima de equilíbrio de estado estável"), não varia mais que 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% sobre um período de tempo de pelo menos 30 minutos (minutos), 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou 300 minutos. Da mesma maneira, as reais taxas e quantidade metabolizada totais das enzimas envolvidas em degradação de dito peptídeo são determinadas pelas reais taxas de formação total de seu peptídeo(s) substrato, de modo que qualquer substrato formado recentemente ou adicionalmente é degradado. Entretanto, isto não significa necessariamente que a concentração líquida do dito peptídeo é zero, mas a concentração líquida como presente na amostra no equilíbrio de estado estável não varia significantemente como ainda descrito acima.

[0024] Da mesma maneira, em uma modalidade da invenção, a concentração do dito pelo menos um produto de degradação peptídica da cascata proteolítica permanece dentro de uma faixa constante sobre o período de tempo do equilíbrio de estado estável, a despeito de um fluxo contínuo de formação e degradação. Em uma modalidade da invenção, a concentração do dito pelo menos um produto de degradação peptídica em equilíbrio de estado estável não varia mais que 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% sobre um período de tempo de pelo menos 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou 300 minutos. Em uma modalidade, a concentração do dito pelo menos um produto de degradação peptídica em equilíbrio de estado estável não varia mais que 15%, ou não mais que 10%, dentro de 60 minutos. Da mesma maneira, o dito peptídeo não acumula significantemente nem diminui significantemente durante os períodos de tempo especificados acima.

[0025] Em uma modalidade, a amostra é incubada por até 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou até 300 minutos, antes de pelo menos um produto de degradação peptídica em concentração de equilíbrio de estado estável ser quantificado na amostra. Em uma outra modalidade, a amostra pode ser incubada por mais que 6 horas (h), especialmente por até 8 h, 12 h, 18 h, 24 h ou até 48 h. Apropriados períodos de tempo de incubação dependem principalmente da dada cascata proteolítica, dos específicos analitos a serem quantificados, da natureza da amostra e de parâmetros de incubação. Tais períodos de tempo de incubação podem ser facilmente determinados por aqueles versados na técnica. Em uma modalidade, o equilíbrio de estado estável é conservado (ou estabilizado ou congelado ou resfriado) após incubação. Os termos "con-servado", "estabilizado", "congelado" e "resfriado" como aqui usados devem significar a conservação de um status bioquímico, por exemplo, a conservação de níveis de peptídeo, por exemplo, através de inibição de degradação proteolítica. A estabilização dos níveis de peptídeo de equilíbrio de estado estável (ou os níveis de peptídeo in vivo) pode ser feita pela adição de um coquetel inibidor de protease. Da mesma maneira, um ou mais inibidores de protease podem ser adicionados após a incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido por pelo menos um produto de degradação peptídica. Apropriados inibidores de protease ou suas combinações podem ser selecionadas por aqueles versados na técnica e podem, por exemplo, compreender uma combinação de inibidores de enzima específicos ou não específicos, ou uma combinação dos mesmos. O um ou mais inibidores de protease ou o coquetel inibidor de protease assegura que especialmente as etapas proteolíticas da cascata que são de interesse (isto é, as enzimas for-mando e degradando os peptídeos a serem medidos), ou cada enzima da cascata proteolítica é completamente inibida.

[0026] Em uma modalidade, cada etapa da cascata proteolítica é inibida, isto é, cada enzima envolvida na cascata proteolítica é inibida por pelo menos um componente do coquetel inibidor de protease. Em uma outra modalidade, o coquetel inibidor de protease compreende pelo menos um inibidor específico ou não-específico de cada classe de proteases envolvidas na cascata proteolítica. O coquetel inibidor de protease pode compreender um ou mais inibidores inibindo uma ou mais enzimas envolvidas na cascata proteolítica. Exemplos de tais inibidores do RAS são Lisinopril (inibidor de ACE) e Aliskiren (inibidor de renina). O coquetel inibidor de protease também pode compreender um ou mais inibidores inibindo um ou mais grupos de enzimas envolvidas na cascata proteolítica, tal como, por exemplo, EDTA (inibe metalo proteases). Além disso, o coquetel inibidor de protease pode compre- ender um ou mais inibidores não específicos. Em uma modalidade, o coquetel inibidor de protease compreende uma combinação de pelo menos duas das classes de inibidores mencionadas anteriormente. Em uma outra modalidade, o coquetel inibidor de protease compreende um ou mais inibidores da enzima de alimentação, especialmente inibidores específicos da enzima de alimentação.

[0027] Por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três, ou pelo menos quatro inibidores de protease são adicionados à amostra. Em uma modalidade, o coquetel inibidor de protease compreende Pepsta- tina A, 1,10-fenantrolina, EDTA, ácido p-hidroxi mercuri-benzoico e Z- Arg.

[0028] Alternativamente, ou em adição ao uso de um ou mais inibidores de protease ou um coquetel inibidor de protease, o equilíbrio de estado estável pode ser conservado através de adição de um ou mais agentes caotrópicos, como iodeto de sódio, perclorato de sódio, perclorato de lítio, cloreto de magnésio, tiocianato de guanidina (GTC), cloreto de guanidínio, fenol, propanol, butanol, etanol, dodecil sulfato de sódio, tioureia, ureia ou outros. Alternativamente, ou em adição ao uso de um ou mais inibidores de protease ou um coquetel inibidor de protease, o equilíbrio de estado estável pode ser conservado por outros meios de inativação física das enzimas na amostra, por exemplo, desnaturação da enzima induzida por calor, sal, pH, ou detergente; ou através de resfriamento, por exemplo, colocação de amostras sobre gelo diretamente após incubação. Para uma ou mais das ainda etapas de processamento das amostras, por exemplo, a separação de plasma ou soro e a separação através de extração de fase sólida (SPE; por exemplo, para esgotamento de matriz e/ou enriquecimento de peptí- deo), uma temperatura ambiente de acordo também pode ser selecionada para assegurar que todas as enzimas na amostra são inativas. Por exemplo, qualquer pré-tratamento de amostra ou processamento de amostra antes de análise de amostra pode ser feito a 4oC temperatura ambiente (ou menor), pelo menos até a completa desnaturação ou inativação das enzimas envolvidas na cascata proteolítica (por exemplo, até eluação a partir da coluna SPE).

[0029] Em contraste, ensaios PRA clássicos são alvejados sobre inibição completa dos caminhos de degradação de Ang I imediatamente após a amostra ter sido tomada, e a atividade de enzima é calculada baseada na taxa de acumulação do peptídeo formado pela dita enzima. Mesmo se a inibição dos caminhos de degradação de Ang I pode ser incompleta em tais ensaios PRA, eles ainda estão longe de qualquer equilíbrio de estado estável de acordo com a invenção, uma vz que a concentração líquida de Ang I muda significantemente com o tempo. No ensaio PRA como descrito, por exemplo, em Bystrom et al. (Clin. Chem. 56(2010), 1561-1569), a concentração de Ang I aumenta significantemente com o tempo. Além disso, ensaios do estado-da- técnica estão buscando avaliar a atividade total do RAS através de medição de forma ativada conformacional de renina em amostras de plasma através de processos baseados em ELISA e RIA (DRG Diagnostics, http: //www.drg-diagnostics.de/49-1-DRG+Renin+active+ ELI- SA.html). Em contraste a

RSSE-Impressão digital

[0030] estes ensaios dependem criticamente da especificidade do anticorpo usado e não permitem conclusões sobre a concentração dos peptídeos efetores nas amostras, que são responsáveis pelos efeitos fisiológicos do RAS. A razão para isto é que ali existem múltiplas enzimas afetando o nível de peptídeos efetores. Todos estes peptídeos são simultaneamente analisados por

RSSE-Impressão digital

[0031] enquanto ensaios de estado da técnica focam sobre justo uma atividade de enzima ou concentração por amostra.

[0032] Em uma modalidade da invenção, no equilíbrio de estado estável, a real taxa de quantidade metabolizada da enzima de alimentação é máxima, isto é, o substrato de alimentação está presente em vasto excesso molar comparado à enzima de alimentação, e qualquer adição de substrato de alimentação externo não pode ainda aumentar a real taxa de quantidade metabolizada da enzima de alimentação. Da mesma maneira, a enzima de alimentação de uma cascata proteolítica é a enzima, que é responsável pela reação de conversão de alimentação, isto é, a etapa de limitação de taxa da subsequente cascata pro- teolítica (ou o gargalo da cascata proteolítica). Para a cascata proteolí- tica RAS sob condições fisiológicas, a enzima de alimentação é renina, que é responsável pela conversão de angiotensinogênio a angiotensi- na I. Em sistemas fisiológicos (por exemplo, no corpo, em amostras de sangue, plasma ou soro), angiotensinogênio como o substrato para renina está presente em vasto excesso molar de renina. Entretanto, em uma modalidade da invenção, uma ou mais, ou todas outras enzimas da cascata proteolítica RAS, tais como, por exemplo, amino peptidases (especialmente APA e/ou APN), dipeptidil amino peptidases, carboxi peptidases (especialmente ACE2), dipeptidil carboxi peptidases (especialmente ACE), e/ou endopeptidases (especialmente endo-peptidase neutra, também chamada neprilisina), estão presentes na amostra em concentrações suficientes para degradar qualquer substrato recentemente ou adicionalmente formado e assim, permitir o estabelecimento de um equilíbrio de estado estável para as ditas enzimas e peptídeo(s) durante incubação, isto é, suas reais taxas de quantidade metabolizada totais são determinadas pelas reais taxas de formação totais de seu peptídeo(s) substrato.

[0033] De acordo com a presente invenção, o termo "enzima de alimentação" deve significar uma enzima com uma taxa de quantidade metabolizada máxima real, isto é, com uma taxa de quantidade meta- bolizada real que é a taxa de quantidade metabolizada obtenível máxima para a dita enzima na amostra. O termo "taxa de quantidade me- tabolizada obtenível máxima" deve significar a taxa de quantidade me- tabolizada de uma enzima contida na amostra, que pode ser obtida sob as dadas condições na amostra, se o peptídeo substrato está (ou pode estar) presente em vasto excesso molar comparado à enzima (ou uma quantidade virtualmente inexaurível) pelo menos até o equilíbrio de estado estável ser atingido. Da mesma maneira, a real taxa de quantidade metabolizada da enzima de alimentação não pode ser ainda aumentada pela adição de substrato externo, uma vez que o substrato de alimentação já está presente em vasto excesso molar comparado à enzima de alimentação. Se, por exemplo, qualquer peptídeo substrato externo (isto é, um peptídeo envolvido na cascata proteolíti- ca) ou um análogo de tal substrato é adicionado a uma amostra antes ou durante a incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido, isto pode - de acordo com a definição da presente invenção - resultar em uma mudança da etapa(s) de limitação de taxa para a cascata proteolítica, e assim, também a enzima)s) de alimentação da cascata proteolítica, se a quantidade de peptídeo substrato adicionada é suficiente para resultar em uma taxa de quantidade metabolizada obtenível máxima de pelo menos uma enzima envolvida na degradação do dito peptídeo substrato (isto é, uma outra enzima que não a enzima de alimentação sob condições fisiológicas). Por exemplo, se a cascata proteolítica sob investigação é o RAS, e se um vasto excesso molar de uma Ang 1-10 (ou um seu análogo, por exemplo, uma Ang 1-10 carreando um rótulo de massa) ou uma qualquer modificação covalente incluindo trocas de aminoácidos) comparado a uma ou mais ou todas as enzimas envolvidas em degradação de Ang 1-10 é adicionado à amostra antes ou durante incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido, pelo menos uma ou mesmo todas as enzimas envolvidas na degradação de Ang 1-10 (por exemplo, ACE, ACE2, AP, e/ou NEP) podem atingir máximas taxas de quantidade metabolizada obteníveis e assim, pode se tornar a etapa(s) de alimentação limitante de taxa para a subsequente reação(s) proteolítica da cascata.

[0034] Em uma modalidade da invenção, enzima de alimentação pode ser adicionada à amostra. A adição de enzima de alimentação aumenta o fluxo-através da cascata de enzimas e assim, conduz a níveis absolutos aumentados de peptídeos, enquanto os níveis relativos (razões de peptídeos) permanecem inalterados. Da mesma maneira, os níveis de equilíbrio de estado estável do um ou mais peptídeos ainda refletem a situação fisiológica, isto é, as atividades de enzima, entretanto, os níveis de peptídeos totais são aumentados proporcionalmente. Isto pode ser útil, por exemplo, se os níveis de peptídeo medidos sem a adição de enzima de alimentação podem estar abaixo de limite de detecção do processo usado para quantificar o peptídeo(s). Opcionalmente, substrato de alimentação pode ser também adicionado. Isto pode assegurar que substrato de alimentação está e permanece em excesso molar comparado à enzima de alimentação e que substrato de alimentação está ainda presente em quantidades virtualmente inexauríveis conduzindo a uma taxa de quantidade metaboliza- da da enzima de alimentação, que é estável para um certo tempo definindo o equilíbrio de estado estável, mesmo se enzima de alimentação é adicionada.

[0035] Ainda em uma modalidade, no equilíbrio de estado estável a real taxa de degradação total do produto da enzima de alimentação (isto é, o peptídeo formado pela enzima de alimentação) é igual à sua real taxa de formação total. Em uma outra modalidade, a cascata pro- teolítica é o RAS, e o produto da enzima de alimentação de acordo com a definição acima é Ang I. Na dita modalidade, a real taxa de quantidade metabolizada de dita enzima de degradação de ANg I no equilíbrio de estado estável é igual à real taxa de quantidade metaboli- zada de renina, que é a enzima formando Ang I, se somente um caminho de degradação de Ang I enzimático está "aberto" na amostra, isto é, somente a enzima de degradação de Ang I está ativa. Se mais de uma enzima de degradação de Ang I são ativas na amostra, a soma das reais taxas de quantidade metabolizada das ditas enzimas ativas de degradação de Ang I (isto é, a real taxa de degradação total de Ang I) é igual à real taxa de quantidade metabolizada de renina (isto é, a real taxa de formação de Ang I total) na dita modalidade.

[0036] Em uma outra modalidade, no equilíbrio de estado estável a real taxa de degradação total de mais de um peptídeo, especialmente de dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez peptídeos envolvidos na cascata proteolítica é igual à real taxa de formação total de dito peptídeo(s). Ainda em uma outra modalidade, no equilíbrio de estado estável a real taxa de degradação total de cada peptídeo envolvido na cascata proteolítica é igual à real taxa de formação total dos ditos peptídeos.

[0037] Da mesma maneira, um equilíbrio de estado estável é atingido para um ou mais peptídeos e as relacionadas enzimas, isto é, a enzima(s) formando ou degradando o dito peptídeo(s). Como descrito acima, o equilíbrio de estado estável é atingido, se a concentração líquida do pelo menos um peptídeo, dois ou mais peptídeos, ou todos os peptídeos envolvidos na cascata proteolítica, não varia mais que 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% sobre um período de tempo de pelo menos 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou 300 minutos. O dito equilíbrio de estado estável é atingido após incubação da amostra por 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou 300 minutos, ou por 8, 12, 18, 24, ou 48 h. O equilíbrio de estado estável continua por pelo menos 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou 300 minutos.

[0038] Em uma modalidade da invenção, no equilíbrio de estado estável a taxa de degradação máxima obtenível total de pelo menos um peptídeo envolvido na cascata proteolítica é igual a ou maior que sua real taxa de formação total. De acordo com a invenção, a taxa de degradação máxima obtenível de um peptídeo é a taxa de degradação total que pode ser obtida sob as dadas condições na presença de um vasto excesso molar de dito peptídeo comparado a cada enzima degradando o dito peptídeo (ou uma quantidade virtualmente inexaurível do dito peptídeo), isto é, através de adição de peptídeo externo. Da mesma maneira, a máxima taxa de degradação obtenível de um pep- tídeo é a soma de taxas de quantidade metabolizada obteníveis máximas de todas as enzimas envolvidas na degradação do dito peptídeo.

[0039] Em uma modalidade, no início do tempo de incubação a quantidade de todas as enzimas envolvidas na cascata proteolítica está em excesso da quantidade de seu respectivo substrato(s), exceto para a enzima de alimentação da cascata proteolítica. Em uma outra modalidade, a quantidade da dita uma ou mais enzimas ou de todas as enzimas envolvidas na cascata proteolítica está em excesso da quantidade de seu/seus respectivo substrato(s) durante o inteiro período de tempo de incubação, exceto para a enzima de alimentação da cascata proteolítica.

[0040] Em uma outra modalidade, as condições como especificado acima (isto é, que a quantidade de enzima esteja em excesso da quantidade do respectivo substrato, e/ou que a taxa de formação de um peptídeo é igual à taxa de degradação em equilíbrio de estado estável) são aplicadas a pelo menos um ou mais peptídeos a serem ana- lisados, e/ou a respectiva enzima(s) que forma ou degrada o dito pep- tídeo(s) a ser analisado.

[0041] Por exemplo, se o processo da presente invenção é usado para examinar um ou mais componentes da cascata proteolítica RAS, e os peptídeos a serem analisados são, por exemplo, Ang 1-10 e Ang 1-8, isto significa que até o equilíbrio de estado estável ser atingido, a real taxa de formação de Ang 1-10 por renina é maior que a soma das reais taxas de degradação de todas as enzimas envolvidas em degradação de Ang 1-10, incluindo mas não limitado a ACE, Amino peptidases, e ACE2; e a real taxa de formação de Ang 1-8 por ACE é maior que a soma das reais taxas de degradação de todas as enzimas envolvidas em degradação de Ang 1-8, incluindo mas não limitado a ACE2, AP, e/ou DAP. Da mesma maneira, a concentração de Ang 110 e Ang 1-8 aumenta, isto é, Ang 1-10 e Ang 1-8 acumulam, até um equilíbrio de estado estável ser atingido. Quando o equilíbrio de estado estável é atingido, a real taxa de formação de Ang 1-10 é igual à soma das reais taxas de quantidade metabolizada de todas as enzimas envolvidas em degradação de Ang 1-10 (a real taxa de degradação total de Ang 1-10); e a real taxa de formação de Ang 1-8 é igual à soma das reais taxas de quantidade metabolizada de todas as enzimas envolvidas em degradação de Ang 1-8 (a real taxa de degradação total de Ang 1-8). Se, por exemplo, todos os dez peptídeos envolvidos no RAS são para serem analisados (como mostrado, por exemplo, em Figuras 2, 3 e 4A, 4C1 e 4C2), as condições especificadas acima devem se aplicar a todos os dez peptídeos ou a todas as enzimas envolvidas no RAS.

[0042] Da mesma maneira, em uma modalidade do equilíbrio de estado estável da presente invenção, pelo menos uma reação de degradação proteolítica tem de ser ativa ou "aberta" para pelo menos um, especialmente para cada peptídeo da cascata proteolítica em uma ex- tensão que permita que a real taxa de degradação total seja igual à real taxa de formação total do dito peptídeo, isto é, não é inibida ou "fechada", por exemplo, através de uso de um ou mais inibidores de protease, para uma extensão onde a real taxa de formação total excede a real ou máxima taxa de degradação total obtenível do dito peptí- deo.

[0043] Em uma modalidade, agentes quelantes, tais como, por exemplo, EDTA, EGTA, 8-hidroxi quinolina, fenantrolina, e dimercaprol (também chamado British-anti-Lewisite ou BAL), não são adicionados antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido, especialmente não para a cascata RAS ou outras cascatas proteolíticas onde metaloproteases estão envolvidas, uma vez que agentes quelantes têm um efeito inibidor sobre metaloproteases através de quelação de íons bivalentes.

[0044] Em uma modalidade, agentes caotrópicos, tais como, por exemplo, iodeto de sódio, perclorato de sódio, perclorato de lítio, cloreto de magnésio, tiocianato de guanidina (GTC), cloreto de guanidínio, fenol, propanol, butanol, etanol, dodecil sulfato de sódio, tioureia, ureia, e/ou outros, não são adicionados antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado estável ser alcançado.

[0045] Em uma modalidade, o equilíbrio de estado estável é atingido sob condições fisiológicas para a dita cascata proteolítica, o que significa que os componentes da cascata proteolítica (enzimas e substrato ou peptídeos produtos), suas quantidades totais e/ou relativas como presentes na amostra biológica como tomada do corpo, assim como a matriz em relação à composição e/ou pH da amostra não são ou substancialmente não são modificadas antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido. Em uma modalidade, as concentrações das enzimas e/ou peptídeos envolvidos na cascata proteolítica presente na amostra biológica como tomada do corpo não são modificadas antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido.

[0046] Em uma outra modalidade, substratos ou análogos de substratos de qualquer enzima(s) envolvida na cascata proteolítica, tais como, por exemplo, padrões internos ou padrões de degradação, se em sua forma nativa ou modificada por rotulação (por exemplo, ro- tulação isotópica e/ou fluorescente, e/ou modificações de aminoácidos ou trocas de pelo menos um aminoácido), não são adicionados antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido. Em uma modalidade da presente invenção, a cascata proteolítica é o RAS, e nem angiotensinogênio, angiotensina I e/ou angiotensina II, nem quaisquer seus análogos, são adicionados antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido.

[0047] Em uma outra modalidade, ainda substâncias ou reagentes, tais como, por exemplo, substâncias tampões (Tris, PBS, MES, HEPES, citrato, borato, carbonato ou hidrogeno carbonato (ou bicarbonato) e/ou outras substâncias tampões ou respectivas soluções tampões não são adicionadas antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido.

[0048] Ainda em uma outra modalidade, substâncias ou reagentes, tais como EDTA, EGTA, PMSF, AEBSF, BSA, ácido maleico, anidrido maleico, ácido fórmico, e/ou água (em qualquer forma, por exemplo, desionizada e/ou destilada, etc.) não são adicionadas antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado estável ser alcançado.

[0049] Entretanto, e não obstante o anterior, um ou mais tais inibidores de protease, agentes quelantes, agentes caotrópicos, substratos, padrões, BSA, tampões, e/ou outras substâncias ou reagentes podem ser adicionados uma vez o equilíbrio de estado estável seja atingido e opcionalmente resfriado.

[0050] Especialmente, um ou mais padrões, por exemplo, padrões internos e/ou padrões de degradação, podem ser adicionados uma vez o equilíbrio de estado estável seja atingido e congelado. Padrões são, por exemplo, peptídeos da cascata proteolítica que são modificados por rotulação de massa e/ou rotulação química (por exemplo, rotula- ção isotópica e/ou fluorescente, e/ou modificações de aminoácidos e/ou o uso de etiquetas de massa, e/ou trocas de pelo menos um ami- noácido). Da mesma maneira, padrões internos são padrões internos rotulados com isótopo estáveis, por exemplo, mostrados em WO 03/016861 A. Em uma modalidade, a amostra biológica é incubada como tomada do sujeito (ex vivo), isto é, a matriz da amostra e/ou as concentrações dos componentes da cascata proteolítica a ser analisada não são modificados, mas opcionalmente ainda processados (por exemplo, para obter plasma ou soro), tanto antes como após um equilíbrio de estado estável ser atingido e estabilizado. Opcionalmente, an- ticoagulantes, isto é, substâncias que evitam coagulação (interrompendo coagulação de sangue), podem ser adicionados à amostra biológica antes e/ou durante incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido. Entretanto, tais anticoagulantes não devem afetar substancialmente as proteases da cascata proteolítica a ser analisada. Um apropriado anticoagulante para uso no processo de acordo com a presente invenção é heparina.

[0051] Se a cascata proteolítica a ser analisada é a cascata de coagulação de sangue, aqueles versados na técnica podem determinar apropriados agentes anticoagulantes a serem adicionados à amostra antes de ou durante incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido, o que pode prevenir coagulação de sangue, mas ainda pode permitir o estabelecimento de um equilíbrio de estado estável para pelo menos um peptídeo a ser analisado. Por exemplo, um anticoagulan- te pode ser selecionado que inibe coagulação de sangue em uma etapa ainda a jusante na cascata proteolítica, isto é, não inibindo qualquer enzima(s) envolvida na degradação do peptídeo(s) a ser analisado (a montante na cascata proteolítica).

[0052] Antes de análise, as amostras podem ser pré-tratadas ou ainda processadas, por exemplo, através de separação de plasma ou soro (por exemplo, por centrifugação ou ativação de coagulação seguida por centrifugação), e/ou purificação através de extração de fase sólida (SPE), por exemplo, para esgotamento de matriz e/ou enriquecimento de peptídeo. Da mesma maneira, a extração de fase sólida pode ser realizada com um material de cromatografia de fase reversa, um material de cromatografia de interação hidrofóbica, um material de troca de íons, um material de cromatografia de afinidade, por exemplo, um material de cromatografia de fase reversa, especialmente um material C18, C8 ou C6H5 (fenila).

[0053] Em uma modalidade, o um ou mais analitos são concentrados à secura após eluição a partir da superfície sólida e podem ser reconstituídos em um solvente compatível com HPLC, significando que a composição do solvente não interfere com ligação do um ou mais analitos à coluna de HPLC acoplada a MS. O solvente de reconstituição é, por exemplo, um solvente aquoso que pode ser suplementado com aditivos incluindo propanol, butanol, 2-butanol, pentanol, 2- propanol, acetona, metil etil cetona, acetonitrila, metanol, etanol, ácidos ou bases de modo a aperfeiçoar solubilidade de analitos e/ou facilitar ligação de analitos à coluna de HPLC.

[0054] Em uma outra modalidade, os processos de acordo com a invenção compreendem as etapas: provimento de uma amostra tratada com um anticoagulante; opcionalmente, ainda processamento de amostra para obter uma amostra de plasma ou soro; incubação de amostra até um equilíbrio de estado estável ser atingido para pelo menos um produto de degradação peptídica envolvido na cascata proteo- lítica; conservação de dito equilíbrio de estado estável; opcionalmente, adição de um ou mais padrões internos uma vez o equilíbrio de estado estável seja conservado; condução de uma extração de fase sólida com a amostra e análise de amostra. A separação de plasma ou soro pode ser feita tanto antes como após a etapa de incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido (e opcionalmente estabilizado), dependendo de se o equilíbrio de estado estável é para ser investigado em plasma, soro, ou sangue integral.

[0055] A análise do pelo menos um produto de degradação peptí- dica em equilíbrio de estado estável pode ser feita, por exemplo, por espectrometria de massa (MS); por cromatografia líquida, tal como cromatografia líquida de alta pressão (também chamada cromatografia líquida de alta performance, HPLC); especialmente por cromatografia líquida - ionização de eletrospray - espectrometria de massa (LC- MS/MS). Por exemplo, Cui et al. (Anal Biochem. 369 (2007), 27-33) mostra processos de cromatografia líquida - ionização de eletrospray - espectrometria de massa e cromatografia líquida tandem espectro- metria de massa para quantificação de peptídeos angiotensina. Para cada peptídeo e correspondentes padrões internos, diferentes transições de massa podem ser medidas. A performance do processo pode ser monitorada usando amostras de controle de qualidade.

[0056] Tais amostras de controle de qualidade podem incluir, por exemplo, amostras biológicas com concentrações de analito predefini- das, assim como amostras sintéticas compreendendo uma mistura de concentrações predefinidas de peptídeos sintéticos. Por exemplo, a amostra de controle de qualidade pode ser um sangue reunido, plasma, ou amostra de soro ou amostra de homogeneizado de tecido reunido com concentrações predefinidas de um ou mais peptídeos. Concentrações de peptídeo angiotensina podem ser calculadas através de relacionamento de sinais de peptídeo endógeno para sinais de padrão interno contanto que sinais integrados obtenham uma razão de sinal- para-ruído acima de 10.

[0057] Além disso, as análises podem ser feitas através de ensaio rádio imune (RIA) ou ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA). Opcionalmente, uma etapa de purificação de HPLC pode ser feita antes da quantificação baseada em RIA ou ELISA de produtos de degradação peptídica da cascata proteolítica.

[0058] Em uma modalidade, o pré-tratamento de amostra, processamento de amostra, e/ou a análise das amostras podem ser feitos em um formato multicavidades, por exemplo, sobre placas de 96 cavidades.

[0059] A presente invenção provê uma nova ferramenta para a análise do status fisiológico ou bioquímico de um sujeito baseado na observação de uma ou mais cascatas proteolíticas no sujeito, especialmente no sistema sanguíneo do sujeito. Especialmente, os processos da invenção permitem a determinação de múltiplos níveis de pep- tídeo sob condições de estado estável de cascatas proteolíticas. Além disso, os processos da invenção permitem a avaliação de uma cascata proteolítica em uma maneira específica de compartimento, por exemplo, o RAS pode ser analisado em diferentes compartimentos, tais como sangue integral, soro assim como plasma. A medição de produtos de degradação peptídica de uma cascata proteolítica de acordo com a invenção provê um resultado "semelhante de impressão digital" do status bioquímico ou fisiológico do sujeito, ou um perfil de atividade de enzima "semelhante à impressão digital" de um sujeito, que pode ser indicativo para presença ou ausência de certas doenças ou para a eficácia ou ineficácia de um tratamento desta doença (contanto, é claro, que a doença direta ou indiretamente afete a cascata proteolítica). Em adição, os processos da invenção permitem uma comparação de impressões digitais in vivo (amostras são imediatamente estabilizadas e assim, refletem os níveis de peptídeos circulantes), e impressões digi- tais ex vivo (níveis de peptídeo de equilíbrio de estado estável em plasma, soro ou sangue integral).

[0060] Da mesma maneira, os processos de acordo com a presente invenção podem ser usados para estudar uma cascata proteolítica em geral, seu status fisiológico ou bioquímico em um paciente ou em grupos de pacientes, para diagnóstico de uma doença diretamente ou indiretamente relacionada à cascata proteolítica (ou uma sua aberração), para determinar um tratamento ou regime de tratamento para tal doença, para determinar combinações de doses fixas, para examinar o mecanismo de ação, para minimizar efeitos colaterais associados com fármaco ou eventos adversos, ou para examinar a farmacologia de fármacos em uso ou de candidatos a fármacos, por exemplo, para examinar efeitos de curto termo e longo termo ou toxidez.

[0061] Além disso, os processos de acordo com a presente invenção podem ser usados para seleção e desenvolvimento de novos fár- macos, biomarcadores ou parâmetros biomarcadores, especialmente para tal seleção na matriz fisiológica de ditos fármacos ou biomarcado- res.

[0062] Em uma modalidade, os processos de acordo com a invenção são usados como um ensaio biomarcador para condições patológicas ou doenças relacionadas à cascata(s) proteolítica sob investigação com os processos de acordo com a invenção. Por exemplo, não somente a concentração de um produto de degradação peptídica, mas a inteira impressão digital de equilíbrio de estado estável (SSE- Impressão digital) compreendendo vários ou todos os peptídeos envolvidos na cascata proteolítica sob investigação de acordo com a invenção, e/ou funções matemáticas (por exemplo, produtos, razões, somas, diferenças) de contrações de dois ou mais produtos de degradação peptídica, e/ou combinações de pelo menos duas ou mais funções matemáticas, pode ser usada como biomarcador (ou compilação de biomarcadores).

[0063] Em uma outra modalidade, os processos de acordo com a invenção podem ser usados para determinação de um específico grupo de pacientes para um tratamento, tal como, por exemplo, para a identificação de respondedores e não respondedores de um tratamento.

[0064] Os processos de acordo com a presente invenção também podem ser usados como diagnósticos companheiros. Diagnósticos companheiros são ensaios (testes ou medições) pretendidos para auxiliarem médicos na tomada de decisões de tratamentos para seus pacientes. Eles assim o fazem através de provimento de informação sobre como um fármaco funciona no corpo e assim elucidando a eficácia e/ou segurança de um específico fármaco ou classe de fármacos para pacientes únicos, um grupo de pacientes alvejados ou subgrupos. Existem dois grupos principais de diagnósticos companheiros que incluem testes que são usados para fármacos que já estão no mercado assim como testes que já são usados na fase de desenvolvimento pré- clínico ou clínico de um fármaco potencial. O uso de diagnósticos companheiros para fármacos já em desenvolvimento inicial tem o potencial de alterar significantemente o processo de desenvolvimento e comercialização de candidatos a fármaco rendendo fármacos mais seguros com menos efeitos colaterais, com aperfeiçoada eficácia terapêutica em uma maneira mais rápida, de custo mais efetivo.

[0065] Da mesma maneira, o sujeito do qual a amostra biológica é tomada pode ter sido tratado com uma ou mais composições farmacêuticas (in vivo), por exemplo, uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor de protease, especialmente, se o processo de acordo com a presente invenção é usado para monitorar os efeitos de uma composição farmacêutica, ou para determinar a dose ótima de uma composição farmacêutica, ou para avaliar quaisquer interações tóxicas potenciais de uma ou mais composições farmacêuticas, ou para examinar múltiplas interações de fármacos.

[0066] Em uma modalidade da invenção, o sujeito é um ser humano. Em uma outra modalidade, o sujeito é um animal, por exemplo, um mamífero, um roedor, um porco, ou um macaco.

[0067] O processo de acordo com a presente invenção é um processo padronizado para a avaliação total de uma cascata proteolítica em amostras de sangue mas também é apropriado para cascatas pro- teolíticas em outras amostras, especialmente biopsias de tecidos, homogeneizados de tecidos, fatias de tecidos, licor, fluido de bile, urina, etc. A presente invenção pode ser usada em princípio para todas cascatas proteolíticas (sob o controle de clivagem enzimática de proteínas ou peptídeos em produtos de degradação peptídica sendo tanto meta- bólitos como intermediários ou produtos finais de uma cascata proteo- lítica), que ocorre no sistema sanguíneo. A presente invenção é especificamente apropriada para as cascatas proteolíticas mais relevantes no sistema sanguíneo humano, tal como o RAS, a cascata de coagulação de sangue, o sistema complemento, caminhos de apoptose, cascatas de neuropeptídeos, cascatas de peptídeos endotelina, cascatas de peptídeos natriuréticos. Com a presente invenção, um processo para a medição de concentrações de peptídeo de equilíbrio de estado estável, que refletem a atividade e taxas de conversão de suas enzimas metabolizantes, é provido. Uma concentração de equilíbrio de estado estável de um peptídeo neste contexto significa que sua taxa de formação é igual a sua taxa de degradação conduzindo a uma concentração de peptídeo, que não muda ou substancialmente não muda com o tempo sobre um certo período de tempo, e que é fortemente dependente de afinidades das enzimas para seus substratos sob as dadas condições antes que taxas de conversão de enzimas máximas, como ainda descrito acima. Uma vez que a presente invenção trata com sistemas biológicos, é claro que o termo "equilíbrio de estado estável" não pode ser visto como um ponto único a ser atingido, porém mais como uma região cinética alvo de concentrações de peptídeos, que não mudam significantemente com o tempo para um certo período de tempo. Períodos de tempo mais acurados até tais concentrações de equilíbrio de estado estável serem atingidas são principalmente dependentes da dada cascata proteolítica, dos analitos peptídicos a serem quantificados, da natureza da amostra e dos parâmetros de incubação. Isto pode ser facilmente determinado para cada cascata. Em geral, a "janela de equilíbrio de estado estável" onde a quantificação de acordo com a presente invenção pode ser realizada é antes grande, pelo menos para algumas das cascatas proteolíticas, especialmente aquelas no sangue. Usualmente, o equilíbrio de estado estável é atingido após um certo tempo de incubação, que é determinado empiricamente (por exemplo, 30 minutos para o sistema RAS) e então permanece estável por um estendido período de tempo (por exemplo, 6 horas (h) para o sistema RAS). Então, o equilíbrio de estado estável é perturbado por efeitos tais como degradação e inativação das enzimas envolvidas ou uma falta de substrato de alimentação na amostra. A concentração de substrato de alimentação baseada em tempo de estabilidade (ts) para uma dada cascata pode ser calculada através de divisão de concentração do substrato de alimentação (ou peptídeo(s) precursor de alimentação (cf) reduzida por uma constante específica de enzima e amostra definindo a concentração mínima de substrato para obter a máxima taxa de quantidade metabolizada da enzima de alimentação da cascata, pelo que definindo a taxa de alimentação (Vf) da cascata.

[0068] ts concentração de substrato de alimentação baseada em tempo de estabilidade [h]

[0069] cf concentração de substrato de alimentação [mol/L]

[0070] cmin concentração mínima de substrato específico de amostra para obter a máxima taxa de quantidade metabolizada da enzima de alimentação na amostra [mol/L]

[0071] Vf taxa de alimentação da cascata [[mol/L] / [h]]

[0072] e

[0073] f fator de excesso

[0074] cE concentração de enzima de alimentação

[0075] Por exemplo, a aplicação destas fórmulas acima sobre o RAS, onde a conversão de alimentação é realizada por renina, rende uma concentração de substrato de alimentação calculada baseada em tempo de estabilidade do equilíbrio de estado estável de RAS de cerca de 60 a 200 horas baseado em diferentes valores publicados para PRA (atividade de renina em plasma), PRC (concentração de renina em plasma), ver, por exemplo, [Nishiyama et al. 2010, e Bystrom et al., Clin. Chem. 56(2010), 1561-1569], e aplicando uma concentração AGT de, por exemplo, 70 μg/mL de plasma e um fator de excesso de, por exemplo, 1000. É claro, a dita concentração de substrato de alimentação calculada baseada em tempo de estabilidade deve servir somente como um ponto de referência teórico e grosseiro, uma vez que o tempo real de estabilidade do equilíbrio de estado estável pode diferir significantemente nas amostras.

[0076] O processo de acordo com a presente invenção é especificamente apropriado para o monitoramento e análise de Ang 1-10 e seus produtos de degradação, pelo que observando o status do RAS em amostras de sangue humano. As concentrações de equilíbrio de estado estável de Ang 1-10 e seus produtos de degradação são altamente indicativos do status fisiológico ou bioquímico do sujeito. Por exemplo, desvios a partir da distribuição normal dos produtos de de- gradação de Ang 1-10 são indicativos de má função enzimática do RAS e/ou sistema bradicinina, que pode conduzir a, por exemplo, um aumento patológico em pressão do sangue ou outras condições ou doenças patológicas. Por outro lado, a partir da distribuição e concentrações relativas dos produtos de degradação de Ang 1-10 no equilíbrio de estado estável de acordo com a presente invenção tipo e eficácia de tratamentos terapêuticos alvejando o RAS podem ser monitorados. Surpreendentemente, as concentrações de equilíbrio de estado estável de acordo com a presente invenção proporcionam indicações e correlações muito melhores que a determinação de Ang 1-10 ou outros produtos de degradação em amostras de sangue sem permitir os mesmos atingirem o equilíbrio de estado estável (isto é, as "clássicas" amostras de sangue imediatamente estabilizadas).

[0077] Em contraste aos processos do estado da técnica, onde inibidores são usados para imediata estabilização de peptídeos produzidos por certas enzimas com limitado sucesso [Bystrom et al., Clin Chem. 56(2010), 1561-1569], de acordo com a presente invenção a amostra é deixada atingir uma atividade de enzima definida equilíbrio de estado estável para pelo menos um peptídeo envolvido na cascata proteolítica. Esta nova abordagem permite uma avaliação total altamente reproduzível da cascata proteolítica, especialmente RAS, na matriz de amostra fisiológica enquanto integrando todas as atividades de enzimas envolvidas no metabolismo dos peptídeos da cascata pro- teolítica. Uma outra vantagem sobre tecnologias do estado-da-técnica é que concentrações de substrato no ensaio de acordo com a presente invenção genericamente permanecem abaixo da concentração de enzimas metabolizantes (exceto para a enzima de alimentação), levando em consideração a afinidade da enzima para cada substrato único sob as dadas condições na amostra (por exemplo, condições fisiológicas) em contraste a ensaios de atividade de enzima in vitro, onde esta ca- racterística importante é negligenciada por meio de simplificação através de uso de quantidades em excesso de substrato.

[0078] Finalmente, a medição de níveis de peptídeo de equilíbrio de estado estável através do processo de acordo com a presente invenção permite a identificação de potenciais sítios de dês-regulação em amostras de pacientes, pavimentando o caminho para uma abordagem específica de paciente na manipulação terapêutica das cascatas proteolíticas afetadas pela doença do paciente (por exemplo, seleção do tipo de medicação alvejada para RAS no tratamento de hipertensão e previsão de resistências a fármacos) e transportando signifi- cante potencial para o uso do processo na descoberta de biomarcado- res.

[0079] A presente invenção por isso provê uma excelente plataforma ex-vivo para análises diagnósticas, especialmente para o diagnóstico de uma doença relacionada as uma cascata proteolítica, especialmente o RAS. Uma tal doença relacionada ao RAS inclui, por exemplo, hipertensão, doenças cardíacas, especialmente insuficiência cardíaca congestiva, insuficiência cardíaca crônica, insuficiência cardíaca aguda, arteriosclerose, infartação miocardial, doenças dos rins, especialmente insuficiência renal, nefropatia diabética, doenças dos pulmões, especialmente dano de pulmão e/ou síndrome de doença respiratória (ARDS), doenças do fígado, especialmente fibrose, doenças inflamatórias, especialmente sepsia, artrite, reumatite, e/ou câncer. A invenção também é apropriada para análises de rotina de grande número de pacientes, para, por exemplo, identificação de substâncias afetando RAS, avaliação de efeitos de substâncias afetando RAS, e/ou monitoração de pacientes estando sob medicação afetando RAS. Tal medicação afetando RAS pode incluir um ou mais ingredientes ativos tais como, por exemplo, inibidores de amino peptidase, especialmente amastatina; inibidores de ACE, especialmente captopril, enalapril, fosi- nopril, lisinopril, perindopril, quinapril, ramipril, trandolapril, benzepril; antagonistas de receptor de angiotensina II, especialmente candesar- tam, eprosartam, irbesartam, losartam, olmesartam, telmisartam, val- sartam; antagonistas de receptor de aldosterona, especialmente eple- renona, sprionolactona; e/ou ACE2, especialmente ACE2 humana solúvel recombinante e inibidores de renina, especialmente aliscirem.

[0080] Especificamente para amostras de sangue, é importante para atingir o equilíbrio de estado estável para pelo menos um peptí- deo envolvido na cascata proteolítica, que a protease da cascata pro- teolítica, que as proteases da cascata proteolítica a serem observadas com o presente processo não sejam inibidas pela adição de inibidores de protease à amostra, pelo menos não em uma extensão que não permita pelo menos uma enzima envolvida na degradação do dito pelo menos um peptídeo trabalhar até o estado estável ser atingido para o dito pelo menos um peptídeo, isto é, pelo menos uma enzima de degradação do dito peptídeo(s) tem de ser ativa para uma extensão que permita equilíbrio de estado estável para o dito peptídeo(s). Por isso, em uma modalidade, inibidores de protease não são adicionados à amostra em uma extensão, em que as atividades das proteases envolvidas na formação e degradação de pelo menos um peptídeo a ser analisado sejam significantemente inibidas antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido. De acordo com a dita modalidade, as amostras não são combinadas com tais inibidores de protease ou, se tais inibidores já foram adicionados, tais inibidores são inibidos (em sua função de inibição de protease) ou removidos antes e/ou durante a incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido. É claro, inibidores que não afetam as proteases da cascata proteolítica relevante que deve ser estudada pelo processo de acordo com a presente invenção, mas que inibem outras atividades proteolíti- cas (por exemplo, inibidores de coagulação do sangue se o RAS) é estudado), podem ser adicionados à amostra, porque isto não pode afetar a habilidade da cascata proteolítica relevante (isto é, a cascata a ser analisada, por exemplo, o RAS) para atingir o equilíbrio de estado estável para pelo menos um peptídeo da cascata.

[0081] Cascatas proteolíticas estão presentes em um alto número de processos fisiológicos a partir da simples digestão de proteínas (por exemplo, proteína de alimento ou proteínas para serem eliminadas das células de corpo ou fluidos de corpo) a cascatas altamente reguladas, tais como o RAS ou o sistema de coagulação do sangue. Proteases tanto podem quebrar específicas ligações peptídicas (proteólise limitada), dependendo da sequência de aminoácidos de uma proteína, como degradarem um peptídeo completo para aminoácidos (proteólise ilimitada). A específica clivagem de ligações peptídicas é um mecanismo central para regulação de complexos processos biológicos. Especialmente hormônios peptídeos são frequentemente produzidos como peptídeos precursores inativos, que estão presentes em circulação em quantidades excessivas. Proteases seletivas são necessárias para liberação de hormônios ativos, que são então por sua vez degradados por outras proteases.

[0082] Em uma modalidade, o tipo de amostra, que pode ser analisada de acordo com a presente invenção, é uma amostra de sangue. "Amostra de sangue" de acordo com a presente invenção pode ser qualquer amostra contendo sangue ou uma ou mais de suas frações (contendo as proteases da cascata proteolítica relevante). Especificamente, todas as amostras de sangue, que são rotineiramente providas de doadores humanos podem ser usadas de acordo com a presente invenção, isto é, sangue integral, plasma ou soro, especialmente sangue integral anticoagulado congelado ou fresco ou plasma anticoagu- lado fresco ou congelado. Sangue ou plasma "anticoagulado" contém anticoagulantes, isto é, substâncias, que evitam coagulação (interrom- pen coagulação de sangue), é claro, sem afetar as proteases da cascata proteolítica a ser analisada em sua habilidade para atingir um equilíbrio de estado estável. Um anticoagulante apropriado é heparina; amostras de sangue heparinizadas são por isso um apropriado material fonte para o processo de acordo com a presente invenção. Amostras de sangue heparinizadas ainda podem ser processadas antes de processo de acordo com a presente invenção ser aplicado. Por exemplo, plasma ou soro heparinizado pode ser derivado da amostra de sangue. Alternativamente, o processo de acordo com a presente invenção também pode ser realizado sobre sangue integral, isto é, com todas as células de sangue ainda estando presentes (assim como as proteases sobre ou em tais células). Inibidores de protease atuando mais genericamente como anticoagulantes, tais como citrato ou EDTA são menos apropriados; ou, na alternativa (se a amostra, por exemplo, já contém tais anticoagulantes) podem requerer a adição de substâncias neutralizantes para tais inibidores de proteases de modo a permitir incubação da amostra até um equilíbrio de estado estável ser atingido.

[0083] Com o processo de acordo com a presente invenção , não somente um específico peptídeo ou produto de degradação peptídica como um marcador para o status de uma cascata proteolítica pode ser identificado. É possível analisar mais de um dos membros peptídeos da cascata, pelo que permitindo mesmo ainda análise de sintonia fina do status fisiológico ou bioquímico desta cascata no sujeito. Foi revelado no curso da presente invenção que as quantidades relativas de diferentes membros peptídeos de uma cascata proteolítica no equilíbrio de estado estável são altamente indicativas do status fisiológico ou bioquímico desta cascata no sujeito. Por exemplo, a razão de quantidades molares ou concentrações de dois ou mais produtos de degra-dação proteolítica em equilíbrio de estado estável podem ser indicati- vas de uma atividade de enzima, uma relacionada condição fisiológica ou patologia. Um exemplo provido com a presente invenção é a razão molar de Ang 1-8 para Ang 1-10 (ou razões relativas de outros produtos de degradação de Ang 1-10) em equilíbrio de estado estável que é indicativa do staus RAS do sujeito e/ou regime de tratamento influenciando RAS aplicado ao sujeito (por exemplo, tratamento com substância como Lisinopril, Amastatina, ACE, ACE2, NEP, etc.).

[0084] Por isso, uma modalidade da presente invenção compreende a quantificação de pelos dois, pelo menos três, especialmente pelo menos quatro produtos de degradação peptídica da cascata proteolíti- ca na amostra em concentração de equilíbrio de estado estável. Com os processos da presente invenção, é possível quantificar tantos produtos de degradação na cascata proteolítica em equilíbrio de estado estável quanto possível (ou: como conhecidos) para obter uma avaliação "semelhante à impressão digital" do status da cascata proteolítica.

[0085] De acordo com a presente invenção é necessário quantificar o um ou mais produtos de degradação proteolítica no equilíbrio de estado estável. Isto é essencialmente diferente das análises da técnica anterior, que usualmente aplicam quantificação de analitos em um sta-tus da cascata proteolítica imediatamente estabilizada após as amostras (isto é, amostras de sangue) serem tomadas dos sujeitos, isto é, não em um equilíbrio de estado estável. Usualmente, tais amostras da técnica anterior foram tratadas com inibidores de protease imediatamente após tomadas das amostras de modo a inibir indesejadas mudanças dependentes de enzima na cascata. A presente invenção, entretanto, usa tais mudanças dependentes de enzimas em análise de status fisiológico ou bioquímico do sujeito com relação à cascata pro- teolítica através de especificamente permitindo as proteases da dita cascata sob investigação realizarem sua atividade proteolítica até um equilíbrio de estado estável ser atingido. Isto usualmente conduzirá a uma mudança na quantidade e composição dos produtos de degradação peptídica na cascata proteolítica sob investigação comparado à amostra imediatamente estabilizada após tomada da amostra do sujeito. De acordo com a invenção, a atividade proteolítica específica de amostra conduz a um equilíbrio de estado estável que é muito mais indicativo do status bioquímico do sujeito com relação a esta cascata do que a amostra imediatamente estabilizada (sem a etapa de incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido de acordo com a presente invenção).

[0086] Como já indicado acima, o equilíbrio de estado estável de acordo com a presente invenção não é um ponto simples, quantitativamente exatamente determinado e isolado, mas um status onde mudanças nas razões relativas forram substancialmente reduzidas na amostra. Usualmente, um tal equilíbrio de estado estável pode ser atingido através de aplicação de usuais condições de incubação para as dadas amostras e a cascata sob investigação. Como especificado acima, a amostra pode ser incubada por até 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, ou 300 minutos. Para o RAS e/ou o sistema bradicinina, as amostras podem ser incubadas por pelo menos 30 minutos a até 300 minutos, ou por pelo menos 30 minutos até 180 minutos, ou por pelo menos 30 minutos até 120 minutos, ou por pelo menos 30 minutos até 90 minutos, ou por pelo menos 30 minutos até 60 minutos. Apropriadas temperaturas de incubação são aquelas presentes no sistema fisiológico ou aquelas, onde as proteases da cascata proteolítica sob investigação t~em sua temperatura ótima de ação, por exemplo, em uma temperatura de 30 a 50oC, 35 a 40oC, ou especialmente de cerca de 37oC (especificamente para amostras de sangue humano).

[0087] Como já estabelecido, a presente invenção é ainda exem- plificada na seção de exemplo, especialmente sobre o sistema renina - angiotensina (RAS) e o sistema bradicinina. O um ou mais produtos de degradação peptídica a serem analisados podem ser selecionados de peptídeos angiotensina, tal como angiotensina I (Ang 1-10), angio- tensina 2-10 (Ang 2-10), angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensina III (angiotensina 2-8 ou Ang 2-8), angiotensina IV (angio- tensina 3-8 ou Ang 3-8), angiotensina 1-9 (Ang 1-9), angiotensina 1-7 (Ang 1-7), angiotensina 2-7 (Ang 2-7), angiotensina 3-7 (Ang 3-7) e angiotensina 1-5 (Ang 1-5); e/ou de peptídeos cinina, como calidina (KD ou Lys-bradicinina 1-9 (BK 1-9), bradicinina 2-9 (BK 2-9), bradici- nina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5).

[0088] Em uma modalidade, o produto de degradação peptídica é selecionado de angiotensina I (1-10), angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensina 1-7 (Ang 1-7), e angiotensina 1-5 (Ang 1-5). Em uma outra modalidade, o produto de degradação peptídica é selecionado de angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensina 1-7 (Ang 1-7) e angiotensina 1-5 (Ang 1-5). Ainda em uma outra modalidade, o produto de degradação peptídica é selecionado de bradicini- na 1-9 (BK 1-9), bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5).

[0089] Uma vez que o processo de acordo com a presente invenção se aplica a atividades proteolíticas contidas na amostra, a uma ou mais amostras, especialmente amostras de sangue, devem ser livres de inibidores de protease adicionados para a cascata proteolítica antes de equilíbrio de estado estável ser atingido.

[0090] Tais inibidores de protease podem ser adicionados após a incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido e estabilizado. Isto assegura que as concentrações de peptídeos refletindo o equilíbrio de estado estável ainda estão presentes durante a etapa de quantificação (embora o equilíbrio de estado estável seja usualmente estável sobre um certo período de tempo, isto provê adicional garantia de qualidade para o processo de acordo com a presente invenção).

[0091] Com os processos de acordo com a presente invenção é possível monitorar o status do sistema bradicinina e/ou RAS. Em uma modalidade, pelo menos dois produtos de degradação peptídica são quantificados e uma razão é calculada das quantificações de equilíbrio de estado estável dos pelo menos dois produtos de degradação peptí- dica. Da mesma maneira, uma modalidade da presente invenção emprega a quantificação de pelo menos dois de angiotensina I (Ang 110), angiotensina 2-10 (Ang 2-10), angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensina III (angiontensina 2-8 ou Ang 2-8), angiotensina IV (angiotensina 3-8 ou Ang 3-8), angiotensina 1-9 (Ang 1-9), angio- tensina 1-7 (Ang 1-7), angiotensina 2-7 (Ang 2-7), angiotensina 3-7 (Ang 3-7) e angiotensina 1-5 (Ang 1-5), calidina (KD ou Lys- bradicinina) e seus produtos de degradação biológica, tais como bradi- cinina 1-9 (BK 1-9), bradicinina 2-9 (BK 2-9), bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5). Então, uma razão ou produto daqueles pelo menos dois produtos de degradação peptídi- ca pode ser calculada para prover um parâmetro especialmente indicativo para o status da cascata proteolítica, por exemplo, o RAS, na amostra. Por exemplo, a razão de concentração de equilíbrio de estado estável entre Ang 1-8 e Ang 1-10 é indicativa do status fisiológico ou bioquímico, função, e/ou atividade de ACE. Da mesma maneira, a razão entre um produto de degradação peptídica e seu peptídeo precursor (isto é, o substrato da enzima formando o dito produto de degradação peptídica) em equilíbrio de estado estável é indicativa do status fisiológico ou bioquímico, função, e/ou atividade da enzima que cliva o dito substrato no dito produto de degradação peptídica. Em uma modalidade, mais de uma razão entre um produto de degradação pep- tídica e seu peptídeo precursor são calculadas. As ditas pelo menos duas razões podem ser novamente relacionadas uma com a outra, por exemplo, através de cálculo de razão ou produto das pelo menos duas razões, ou através de adição ou subtração de razões, ou ambas (calculando a razão(s) entre somas e/ou diferenças de subtrações). Em uma outra modalidade, a razão entre pelo menos um nível de peptídeo in vivo (imediatamente estabilizado) e o mesmo nível de peptídeo em equilíbrio de estado estável é calculada.

[0092] O processo de acordo com a presente invenção é dependente da exata e acurada quantificação dos produtos de degradação peptídica. Uma vez que muitas amostras, especialmente amostras de sangue contêm proteínas, sais, ácidos, bases, lipídeos, fosfolipídeos ou outros componentes, que podem perturbar quantificação de peptí- deo; processos para pré-tratamento das amostras antes de quantificação podem ser aplicados.

[0093] O processo de acordo com a invenção pode ser conduzido através do uso de um kit.

[0094] Da mesma maneira, em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit para a medição de produtos de degradação peptídica de uma cascata proteolítica em uma amostra biológica em concentração de equilíbrio de estado estável. O kit pode compreender uma instrução para incubar a amostra por um certo período de tempo até um equilíbrio de estado estável ser atingido para pelo menos um produto de degradação peptídica da cascata proteolítica. O kit ainda pode compreender uma ou mais instruções para condução de processo de acordo com a presente invenção, como especificado acima.

[0095] Da mesma maneira, em uma modalidade, o kit para a medição de produtos de degradação peptídica de uma cascata proteolíti- ca em uma amostra biológica em concentração de equilíbrio de estado estável (isto é, um kit para condução de processo de acordo com a invenção) compreende uma instrução para incubar uma ou mais amostras por um certo período de tempo até um equilíbrio de estado estável ser atingido por pelo menos um produto de degradação peptí- dica da cascata catalítica. Opcionalmente, o kit ainda compreende um ou mais reagentes químicos, bioquímicos e/ou biotecnológicos selecionados de peptídeos, enzimas, inibidores de enzimas, tampões, solventes, agentes caotrópicos, detergentes, e suas combinações. Opcionalmente, o kit ainda compreende um ou mais itens de laboratório químicos, bioquímicos e/ou biotecnológicos selecionados de materiais de extração de fase sólida ou outros materiais de purificação, recipientes, e suas combinações. Opcionalmente, o kit ainda compreende uma ou mais amostras biológicas selecionadas de amostras de sangue, amostras de soro, amostras de plasma, amostras de tecido, e suas combinações. Por exemplo, as ditas amostras biológicas podem ser amostras de sangue, plasma, e/ou tecido e podem ser usadas, por exemplo, com o um controle padrão e/ou de qualidade. Os ditos recipientes podem ser tubos ou frascos de coleta de amostra, ou qualquer outro recipiente padrão apropriado para compreender material químico, clínico, bioquímico, e/ou biotecnológico. Em uma modalidade, o recipiente é um recipiente de sangue ou tecido. O dito recipiente opcionalmente compreende um ou mais anticoagulantes. O dito recipiente ainda pode compreender um ou mais inibidores de enzima ou um co-quetel inibidor de protease, tal como ainda especificado acima ou na seção de exemplos.

[0096] Em uma modalidade, o kit ainda compreende um ou mais inibidores de protease ou coquetéis inibidores, um ou mais substratos de alimentação, um ou mais tubos de coleta de sangue, opcionalmente revestido com heparina, um ou mais padrões, uma ou mais amostras de controle de qualidade, um ou mais materiais de extração de fase sólida, e/ou um ou mais solventes, ou suas combinações.

[0097] Os componentes do kit e as instruções compreendidas pelo kit são ainda definidos acima com relação aos processos da presente invenção. A instrução para incubar as amostras por um certo período de tempo até um equilíbrio de estado estável ser atingido por pelo menos um produto de degradação peptídica ou uma cascata catalítica pode, por exemplo, incluir informação sobre os processos, reagentes, e/ou condições como especificado acima com relação aos processos da presente invenção, por exemplo, informação sobre a duração e condições para incubação, estabilização de amostra, e/ou análise. Da mesma maneira, a instrução ainda pode incluir instruções, tais como, por exemplo, não adicionar qualquer inibidor de protease antes de e/ou durante incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido, e/ou para inativar ou remover qualquer inibidor de protease que tenha sido adicionado. Específicas aplicações como a medição de simples atividades de protease baseadas em medições de peptídeo de estado estável ou a influência de certos inibidores de protease (ou respectivas composições farmacêuticas) sobre a cascata proteolítica e níveis de peptídeos em equilíbrio de estado estável podem requerer a adição de certos inibidores de protease antes de incubação para atingir equilíbrio de estado estável. Assim, as instruções podem incluir instruções para adição de certos inibidores de protease. Entretanto, como especificado acima, pelo menos uma reação de degradação proteolíti- ca tem de ser ativa para pelo menos um peptídeo da cascata proteolí- tica em uma extensão que permita que a real taxa de degradação total seja igual à real taxa de formação total do dito peptídeo.

[0098] Tal instrução pode ser provida, por exemplo, em um formato de papel (por exemplo, como um folheto ou manual) ou eletronicamente. Tal instrução pode acompanhar direta ou indiretamente o kit, por exemplo, ela é provida pelo fabricante e/ou fornecedor do kit e compreendida pela embalagem do kit ou de outro modo provida junto com o kit (por exemplo, por email a partir do fabricante e/ou fornecedor do kit ou através de descarga a partir de uma página da web do fabricante e/ou fornecedor do kit).

[0099] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso do kit para a medição de produtos de degradação peptídica de uma cascata proteolítica em uma amostra biológica em concentração de equilíbrio de estado estável. Tal uso do kit é ainda especificado acima com relação aos processos de acordo com a invenção. Em uma modalidade, o uso do kit compreende a etapa de incubação da amostra até um equilíbrio de estado estável ser atingido para pelo menos um produto de degradação peptídica envolvido na dita cascata proteolítica. Em uma outra modalidade, o uso do kit compreende a etapa de quantificação do dito pelo menos um produto de degradação peptídica en-volvido na dita cascata proteolítica. Em uma outra modalidade, o uso do kit compreende a etapa de quantificação do dito pelo menos um produto de degradação peptídica em uma concentração de equilíbrio de estado estável na amostra.

[00100] De acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-se a representação física ou eletrônica do resultado de quantificação do processo de acordo com a presente invenção ou do uso do kit de acordo com a presente invenção, onde pelo menos dois produtos de degradação peptídica foram quantificados sobre um veículo físico ou eletrônico e onde as quantidades quantificadas dos pelo menos dois produtos de degradação são providas na sequência da cascata proteolítica. Em outras modalidades, pelo menos três ou pelo menos quatro produtos de degradação peptídica foram quantificados sobre um veículo físico ou eletrônico e as quantidades quantificadas dos pelo menos três ou quatro produtos de degradação são providas na sequência da cascata proteolítica.

[00101] Em uma modalidade da representação física ou eletrônica de acordo com a presente invenção, os resultados de quantificação de pelo menos dois ou pelo menos três de angiotensina I (Ang 1-10), an- giotensina 2-10 (Ang 2-10), angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 18), angiotensina III (angiotensina 2-8 ou Ang 2-8), angiotensina IV (an- giotensina 3-8 ou Ang 3-8), angiotensina 1-9 (Ang 1-9), angiotensina 17 (Ang 1-7), angiotensina 2-7 (Ang 2-7), angiotensina 3-7 (Ang 3-7) e angiotensina 1-5 (Ang 1-5), calidina (KD ou Lys-bradicinina) e seus produtos de degradação biológica, como bradicinina 1-9 (BK 1-9), bra- dicinina 2-9 (BK 2-9), bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5) são incluídos e providos em dependência de suas quantidades relativas.

[00102] Da mesma maneira, esta representação física ou eletrônica pode ser provida em uma forma, onde os resultados de quantificação de angiotensina I (Ang 1-10), angiotensina 2-10 (Ang 2-10), angioten- sina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensina III (angiotensina 2-8 ou Ang 2-8), angiotensina IV (angiotensina 3-8 ou Ang 3-8), angioten- sina 1-9 (Ang 1-9), angiotensina 1-7 (Ang 1-7), angiotensina 2-7 (Ang 2-7), angiotensina 3-7 (Ang 3-7) e angiotensina 1-5 (Ang 1-5) são incluídos e providos em dependência de suas relativas quantidades. De acordo com uma outra modalidade, esta representação física ou eletrônica pode ser provida em uma forma, onde os resultados de quantificação de calidina (KD ou Lys-bradicinina) e seus produtos de degradação biológica , tais como bradicinina 1-9 (BK 1-9), bradicinina 2-9 (BK 2-9), bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicini- na 1-5 (BK 1-5) são incluídos e providos em dependência de suas quantidades relativas.

[00103] Em uma modalidade, esta representação física ou eletrônica pode ser provida em uma forma, onde os resultados de quantificação de angiotensina I (1-10), angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8),angiotensina 1-7 (Ang 1-7), e angiotensina 1-5 (Ang 1-5) são incluídos e providos em dependência de suas quantidades relativas.

[00104] Em uma outra modalidade, esta representação física ou eletrônica pode ser provida em uma forma, onde os resultados de quantificação de angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angio- tensina 1-7 (Ang 1-7), e angiotensina 1-5 (Ang 1-5) são incluídos e providos em dependência de suas quantidades relativas.

[00105] Ainda em uma outra modalidade, esta representação física ou eletrônica pode ser provida em uma forma, onde os resultados de quantificação de bradicinina 1-9 (BK 1-9), bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7), e bradicinina 1-5 (BK 1-5) são incluídos e providos em dependência de suas quantidades relativas.

[00106] Ainda em uma outra modalidade, esta representação física ou eletrônica pode ser provida em uma forma, onde os resultados de quantificação de bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5) incluídos e providos em dependência de suas quantidades relativas.

[00107] Esta representação física ou eletrônica dos produtos de degradação peptídica de acordo com a presente invenção é uma valiosa ferramenta diagnóstica para qualquer médico permitindo uma signifi- cante assistência no diagnóstico de um distúrbio ou doença (por exemplo, um distúrbio ou doença ligada ao RAS). Ela permite comparação entre status saudável e adoentado (ou a comparação de diferentes estágios da doença ou diferentes estágios no tratamento) em uma maneira "semelhante à impressão digital", isto é, através de uma representação multiparâmetros dos resultados de quantificação obtidos (como mostrado nas representações gráficas nas figuras de acordo com a presente invenção("RAS-Impressões Digitais")). Estes resultados podem ser providos eletronicamente. No formato eletrônico, comparação e desenvolvimento destes padrões sobre o tempo tanto a partir do mesmo paciente, ou sobre uma população ou grupo de pacientes, podem facilmente ser analisados e monitorados. Em representa- ções gráficas, a cascata proteolítica pode ser mostrada de modo que os resultados do presente processo não são somente resultados de quantificação, mas também resultados "semelhantes à impressão digital" complexos e interdependentes sendo de alto valor no diagnóstico de uma doença e/ou tratamento mostrando as relações bioquímicas subjacentes de concentrações de peptídeos. Esta ferramenta de acordo com a presente invenção por isso permite um uso aperfeiçoado dos resultados obtidos com o processo de acordo com a presente invenção.

[00108] A invenção é ainda descrita pelos exemplos e as figuras que se seguem, é claro sem ser limitada aos mesmos:

[00109] A figura 1 mostra o equilíbrio de estado estável de RAS (RSSE. (A) sangue heparina foi coletado de um doador saudável e incubado a 37oC. Após períodos de tempo indicados coquetel inibidor de protease foi adicionado a uma alíquota da amostra do sangue hepari- nizado para conservar o equilíbrio de estado estável. Concentrações de angiotensina 1-10 (azul) e angiotensina 1-8 (verde) são mostradas e comparadas com uma alíquota da amostra de sangue coletada do mesmo doador, que foi estabilizada imediatamente durante coleta (ICE, t = 0). (B) Concentrações de angiotensina de equilíbrio de estado estável no sangue heparinizado foram determinadas na ausência (vermelho; controle) e presença de inibidores de RAS indicados (azul). O equilíbrio de estado estável foi congelado pela adição de um coquetel inibidor de protease às amostras imediatamente 90 h) ou após 2 horas e 4 horas de incubação a 37oC. (C) Concentrações de angiogê- nese em sangue heparinizado foram determinadas na ausência (vermelho; controle) e presença de EDTA e AEBSF (azul). As incubações foram congeladas pela adição de um coquetel inibidor de protease às amostras imediatamente (0 h) ou após 2 horas e 4 horas de incubação a 37oC. Concentrações de angiotensina 1-10 e angiotensina 1-8 são mostradas.

[00110] A figura 2 mostra a manipulação farmacológica do equilíbrio de estado estável de RAS. Agentes indicados foram adicionados antes de um período de incubação de 2 horas seguido por impressão digital -RSSE baseada em LC-MS/MS. Resultados são mostrados em ilustrações de impressão digital mostrando concentrações de peptídeo angiotensina como esferas de tamanhos diferenciado e enzimas me- tabolizantes representadas por setas e letras azuis. Anotações abaixo de esferas são constituídas por nome de peptídeo e concentração de peptídeo em pg/mL de sangue. RSSE-Impressões digitais são mostradas para inibidores de RAS de baixo peso molecular (A), enzimas de RAS adicionadas exogenamente (B) e combinações de ambas (C).

[00111] A figura 3 mostra dependência de matriz de RSSE- Impressão digital. Sangue heparinizado, plasma e plasma submetido a um ciclo de congelamento / descongelamento foram preparados a partir do mesmo doador e submetido à modalidade de RSSE-Impressão digital por 2h-37oC de incubação seguido por conservação de equilíbrio de estado estável adicionando um coquetel inibidor de protease à amostras e análises LC-MS/MS. Gráficos de impressão digital de amostras controles sem manipulação farmacológica (A) são dados e comparados com amostras onde Amastatina (B) ou ACE2 em combinação com Lisinopril (C) foram adicionados antes do período de incubação.

[00112] A figura 4 mostra RAS- assim como RSSE-Impressão digital em voluntários saudáveis. Amostras de sangue foram coletadas de voluntários saudáveis na presença de coquetel inibidor de protease para conservar níveis de peptídeo angiotensina como presentes in vivo, isto é, antes de qualquer equilíbrio (RAS-Impressão digital ou RAS- Impressão digital in vivo) e comparadas a sangue heparinizado e plasma submetido à incubação até um equilíbrio de estado estável ser atingido ((RSSE-Impressão digital ou Impressão digital ex vivo) em paralelo. O RAS-Impressão digital médio (níveis de peptídeo in vivo conservados) e o RSSE-Impressão digital médio (níveis de peptídeo de equilíbrio de estado estável gerados ex vivo conservados) para sangue heparinizado e plasma parra 12 voluntários saudáveis são mostrados (A). A razão-SSE molar para ACE [fmol/mL Ang 1-8] / [fmol/mL Ang 110] foi calculada e apresentada junto com correspondentes concentrações de angiotensina 1-10 e angiotensina 1-8 em pg/mL e fmol/mL para cada sujeito doador (B). As tabelas mostram os valores para níveis de peptídeos constituindo o RAS-Impressões digitais (Fig. 4B1; Tabela 1), RSSE-Impressões digitais de Sangue (Fig. 4B2; Tabela 2) e RSSE- Impressões digitais de plasma (Fig. 4B3; Tabela 3) para todos os doa-dores assim como Média e SEM calculadas. O RAS- e RSSE- Impressões digitais de 2 dos 12 doadores saudáveis são mostrados juntos com correspondentes valores para SSE-Razões molares abaixo (C; 4C1: Doador 3, 4C2: Doador 6).

[00113] A figura 5 mostra um resumo das principais etapas de degradação de peptídeo do sistema bradicinina, isto é, os principais pep- tídeos bradicinina e as respectivas enzimas formando e/ou degradando aqueles peptídeos.

[00114] A figura 6 mostra as tabelas com os níveis de peptídeos medidos para RAS (A) e o sistema bradicinina (B) nas mesmas amostras de plasma, estabilizado com GTC após incubação pelos períodos de tempo indicados.

[00115] A figura 7 mostra os respectivos gráficos de barras.

EXEMPLOS MATERIAIS:

[00116] Cartuchos C18: Sep-Pak Vac 3cc (500 mg), Waters

[00117] Espectrômetro de massa: Q TRA4000 - Applied Biosystems

[00118] Sistema de HPLC: 1100 Series, Agilent

[00119] Coluna RP-HPLC C18: Luna 3u C18(2) 100A, 100x2,00 mm, (Phenomenex, Cat. No. 00D-4251-B0)

REAGENTES:

[00120] Etanol, abs. (Merck, cat. No. 100983)

[00121] Metanol, (Fluka, cat. No. 14262)

[00122] Água, LiChrosolv (Merck, cat. No. 115333)

[00123] Acetonitrila, LiChrosolv (Merck, cat. No. 114291)

[00124] Ácido fórmico, >98%, (Fluka, cat. No. 06440)

[00125] Z-Arg, como inibidor de renina, (Bachem, C-3195)

[00126] Pepstatina A (Bachem (N-1125))

[00127] Ácido p-hidroxi mercuri benzoico, sal de sódio (Fluka, 55540)

[00128] Monidrato de 1,10-fenantrolina (Sigma, P9375)

[00129] Lisinopril (Sigma, L6394)

[00130] Captopril (Sigma, C4043)

[00131] Amastatina.HCl (Bachem, N-1410)

[00132] ACE, NEP e APN foram adquiridos de R&D Systems.

[00133] rhACE2 (CE2 humana solúvel recombinante) foi produzida por Apeiron Biologics

[00134] EDTA (Sigma)

[00135] GTC (Sigma, Cat. No. G9277)

[00136] Ácido triflúor acético (TFA) (Sigma-Aldrich, Cat. No. 302031)

PADRÕES INTERNOS:

[00137] Os padrões internos usados para quantificação absoluta de peptídeos em amostras biológicas foram peptídeos sintéticos, sua sequência foi idêntica aos analitos peptídeos e foi rotulada com um rótulo de massa permitindo a descriminação entre peptídeos endógenos e peptídeos padrões em análises LC-MS/MS. As propriedades físico - químicas idênticas destes peptídeos sintéticos os tornam padrões internos ideais para quantificação de peptídeos de baixa abundância mostrando comportamento idêntico e recuperação durante processamento de amostra comparado a seu analito peptídeo correspondente. Os padrões internos foram submetidos à amostra durante ou diretamente após coleta de sangue, levando em consideração todas as variações induzidas por manipulação. O uso de padrões internos específicos de peptídeos é recomendável, quando recuperações de peptídeos podem diferir entre peptídeos diferentes e amostras individuais.

[00138] Além disso, as características de fragmentação-MS/MS de peptídeos endógenos e padrões são idênticas permitindo alta precisão na determinação de níveis absolutos de peptídeos.

[00139] Exemplo I: Análises de produtos de degradação de cascata proteolítica em amostras de sangue de acordo com a presente invenção (RSSE impressão digital)

RSSE-Impressão digital

[00140] Amostras de sangue foram coletadas e anticoaguladas com tubos de heparina padronizados (BD). Como indicado na figura 3, separação de plasma foi feita para as respectivas amostras antes de incubação atingir equilíbrio de estado estável. Após incubação das amostras de sangue e plasma pelos períodos de tempo como indicados na figura 1, ou incubação por 2 horas para figuras 2, 3 e 4, em um banho de água a 37oC, amostras goram resfriadas sobre gelo seguido por imediata adição do coquetel inibidor de protease de conservação de equilíbrio de estado estável contendo Pepstatina A, 1,10- fenantrolina, EDTA, ácido p-hidroxi mercuri benzoico, e Z-Arg, assim como padrões internos.

Preparação de amostra de LC-MS/MS e análises:

[00141] Seguindo separação de plasma por centrifugação em 3000 rcf por 10 minutos a 4oC, 0,2-2 mL de plasma foram aplicados sobre um cartucho C18 Sep-Pak ativado e equilibrado. Componentes de matriz amostra foram removidos através de lavagem três vezes com 1 mL de água. Analitos ligados foram então eluídos com 1 mL de metanol. Eluatos foram evaporados à secura e reconstituídos em 10% acetoni- trila / 90% água suplementada com ácido fórmico 0,1% seguido por sujeição à análise LC-MS/MS.

EXTRAÇÃO DE FASE SÓLIDA

[00142] Um distribuidor de vácuo foi usado para processamento de amostra.

QUANTIFICAÇÃO E INTEGRAÇÃO DE SINAL.

[00143] Cromatogramas MRM forram integrados usando suporte lógico Analyst 1.5.1 provido por Applied Biosystems. O limite para o limite de quantificação foi fixado em uma razão de sinal-para-ruído de 10. Sinais de integração não atingindo esta razão foram fixados para zero. Sinais de analito foram relacionados a sinais de padrão interno e concentração foi calculada a partir de quantidades trespassadas inicialmente de padrões internos.

RESULTADOS

[00144] A avaliação do RAS em relação a concentrações de peptí- deo angiotensina é criticamente dependente das condições usadas para coleta de amostra e conservação de amostra. Um sistema analítico foi desenvolvido que é capaz de conservar efetivamente in vivo assim como ex vivo níveis de peptídeo angiotensina de equilíbrio de estado estável em sangue seguido por análises LC-MS/MS de alta sensi- tividade e quantificação absoluta.

[00145] Em geral, o RAS é um sistema de hormônio peptídeo constantemente produzindo novos peptídeos a partir do pró-hormônio AGT, onde a taxa de produção é primariamente dependente de atividade de renina. Os níveis de peptídeos, que estão presentes em circulação, são dependentes de proteases solúveis, proteases ligadas à célula de sangue e também proteases associadas com endotélio que podem ser espacialmente diferentes devido a padrões de expressão específicos de órgãos. A superfície interna de vasos sanguíneos é coberta com numerosos diferentes receptores de angiotensina e por isso toma uma parte central no estabelecimento de concentrações de peptídeos angi- otensina em circulação. Como uma consequência de expressão específica de órgão de proteases metabolizando angiotensina como ACE ou ACE2, torna-se óbvio que níveis de peptídeos no sangue podem ser espacialmente diferentes por todo o corpo. Não obstante, existem muitos componentes enzimáticos do RAS presentes no sangue tanto em uma forma livremente solúvel ou em uma forma associada com célula de sangue, o que afeta significantemente níveis de peptídeos circulantes. Tomando juntas as considerações anteriores, o RAS constitui um sistema com uma produtividade constante temporária de moléculas de hormônio peptídeo com diferenças locais com relação a concentrações de peptídeos em diferentes tecidos e órgãos.

[00146] Na presente invenção é descrito um processo que leva em conta todos os fatores associados de sangue afetando sistemas de hormônio peptídeo como o RAS através de incubação de uma amostra de sangue ou plasma até um equilíbrio de estado estável ser alcançado para um ou mais níveis de peptídeos, seguido por quantificação de peptídeos. Como mostrado na Figura 1A, a RAS-Impressão digital que representa as concentrações de peptídeo angiotensina circulantes in vivo em amostras de sangue coletadas através de perfuração de veia de braço e imediata estabilização de amostra através de adição de um coquetel inibidor de protease,é significantemente diferente da RAS- Impressão digital ex vivo (ou RSSE-Impressão digital) observada quando sangue é incubado a 37oC sem a adição de inibidores de protease. Interessantemente, as concentrações de peptídeo angiotensina obtidas sob estas condições atingem níveis, que foram verificados serem constantes sobre um destacável período de tempo. Isto indicou um estado de equilíbrio atingido pela amostra, que é caracterizado por taxas iguais de formação e degradação para peptídeos individuais, a saber, o equilíbrio de estado estável. Os níveis de peptídeo de equilíbrio de estado estável foram atingidos dentro de 30 minutos e permaneceram estáveis por pelo menos 6 horas a partir do início de incuba-ção (Fig. 1A). O período de estabilidade terminou com um forte aumento de concentração de Ang 1-10 na amostra indicando uma mudança de atividades de enzimas dentro da amostra. Finalmente, após 24 h de incubação, a concentração de Ang 1-10 caiu acentuadamente. Além de Ang 1-10 e Ang 1-8, não existiram quantidades significantes de outros metabólitos de angiotensina detectados nas amostras durante o curso de tempo. A assim chamada RSSE-Impressão digital (Impressão digital de equilíbrio de estado estável de RAS) foi verificada ser significantemente afetada por agentes farmacológicos interferindo com o RAS (Fig. 1B, Fig. 2A). Foi ainda testado se a adição de agentes afetando RAS pode desviar o equilíbrio de estado estável da amostra para uma condição de equilíbrio de estado estável, mas diferente. O inibidor de ACE (Captopril) e o inibidor de amino peptidase (Amasta- tina) ou uma combinação de ambos foi adicionado a sangue antes de incubação por 2 ou 4 horas a 37oC. Todos os tratamentos atingiram equilíbrio de estado estável característico para o inibidor(s) como indicado por níveis comparáveis de Ang 1-10 e Ang 1-8 após 2 e 4 horas de incubação (Fig. 1B). Os inibidores de ACE Lisinopril ou Captopril aumentaram os níveis de equilíbrio de estado estável de Ang 1-10 e diminuíram os de Ang 1-8 quando comparados a níveis controles. Inibidores de renina, que bloqueiam a etapa inicial de produção de angio- tensina, foram verificados desligarem completamente o RAS. Amasta- tina, que é um inibidor de certas amino peptidases, foi verificada aumentar massivamente níveis de Ang 1-8 apontando para o importante papel de amino peptidases na regulação de níveis de Ang 1-8 in vivo.

[00147] A Fig. 1C compara as concentrações de peptídeos atingidas após 2h e 4h de incubação a 37oC na ausência (barras vermelhas) e presença de EDTA e AEBSF (barras azuis) seguido pela conservação de concentrações de peptídeos pela adição de um coquetel inibi-dor em pontos de tempos indicados. A combinação de EDTA e AEBSF é usada nos processos do estado-da-técnica para a medição de atividade de renina de plasma (PRA) (Bystrom et al.; Clin. Chem. 56(2010), 1561-1569). As concentrações de angiotensina 1-10 (painel superior) e angiotensina 1-8 (painel inferior) em amostras controles atingem equilíbrio de estado estável como indicado através de menores alterações entre 2 h e 4 h de incubação a 37oC (comparar figura 1B). Em contraste, na presença de EDTA e AEBSF, existem significan- tes mudanças nos níveis de tanto Ang 1-10 e Ang 1-8 entre 2 h e 4 h de incubação a 37oC. A forte acumulação de Ang 1-10 na amostra tratada com EDTA/AEBSF como tempo mostra claramente a ausência de um equilíbrio de estado estável nestas amostras.

[00148] Além disso, os efeitos de enzimas RAS recombinantes sobre RSSE-Impressões digitais foram testados por adição de 5 μg/mL de ACE, CE2, NEP, ou APN às amostras antes dos períodos de incubação. As RSSE-Impressões digitais desviaram como esperado nestas amostras (Fig. 2B) e também em amostras onde combinações de enzimas com diferentes inibidores farmacológicos foram adicionadas (Fig. 2C). De nota, a comparação de amostras tratadas com o inibidor de ACE Lisinopril com a combinação de ACE2 e Lisinopril revelou, que Ang 1-10 é um substrato para ACE2 em concentrações fisiológicas na matriz amostra original, produzindo eficientemente Ang 1-9 (Fig. 2A1, 2C1). Embora os níveis de estado estável de Ang 1-10 após adição de ACE2 permaneçam altos, há um destacável fluxo de peptídeos na direção de Ang 1-9, que pode ser um importante mecanismo de ação de inibidores de ACE em uso clínico. Além disso, esta produção de Ang 1-9 mediada por ACE2 é mostrada de modo impressionante na presença de Amastatina, que ainda aumenta níveis de Ang 1-10 de equilíbrio de estado estável através de inibição de sua degradação proteo- lítica de terminal-N (Fig. 2C3). Inibição de ACE foi verificada ser um pré-requisito para detecção de níveis de Ang 1-9 em equilíbrio de estado estável significantes o que aponta para uma afinidade significan- temente maior de Ang 1-10 para ACE que para ACE2. Esta maior afinidade de Ang 1-10 para ACE do que para ACE2 também pode ser confirmada pela observação de menores concentrações de Ang 1-10 em equilíbrio de estado estável comparando adição de ACE a ACE2 (Fig. 2B1).

[00149] Os resultados obtidos destes experimentos demonstraram claramente uma direta associação da RSSE-Impressão digital com as atividades de enzima RAS integradas contidas na amostra.

[00150] Baseado nestas verificações, o efeito de uso de plasma fresco ou congelado ao invés de sangue foi explorado quando pode ser mais fácil manuseio com relação a análises em larga escala, conhecimento de que componentes de RAS associados com célula de sangue podem ser perdidos sob estas condições. A RSSE-Impressões digitais foram comparadas para sangue, plasma e plasma congelado / descongelado a partir do mesmo doador para amostras controles (Fig. 3A), amostras trespassadas com Amastatina (Fig. 3B) e amostras trespassadas com ACE2 e Lisinopril (Fig. 3C). Os inibidores e combinações foram selecionados de modo a se obter um desvio claramente visível do equilíbrio de estado estável enquanto usando tanto enzimas como inibidores de baixo peso molecular para provar a propriedade do processo para questões analíticas clínicas. Congelamento e descongelamento de plasma foram verificados causar mínimas variações na RSSE-Impressão digital enquanto uso de sangue ao invés de plasma resultou em significantes diferenças especialmente com relação a Ang 1-10, Ang 1-8 e Ang 1-7 o que aponta para a presença de NEP (CD10) e ACE (CD143) associadas a célula de sangue.

[00151] Finalmente a variabilidade de RAS-Impressão digital e RSSE-Impressão digital foi investigada entre 12 voluntários saudáveis e analisada em sangue imediatamente estabilizado, sangue equilibrado e plasma equilibrado de cada doador. A média das concentrações de angiotensina medidas é dada como um gráfico de impressão digital na Fig. 4A.Dados específicos de doadores com relação a Ang 1-10 e Ang 1-8, que são os peptídeos predominantes presentes em voluntários saudáveis, são dados para RAS-Impressões digitais (4B1-Tabela 1), RSSE-Impressão digital em sangue (4B2 - Tabela 2) assim como RSSE-Impressão digital em plasma (4B3 - Tabela 3). Além de concentrações dos peptídeos em pg/mL, as concentrações foram calculadas em fmol/mL e usadas para constituir uma razão de atividade de estado estável molar para ACE através de divisão de concentração de Ang 18 pela concentração de Ang 1-10. Comparadas às RAS-Impressões digitais medidas, as RSSE-Impressões digitais mostraram maiores variâncias entre doadores, o que reflete potenciais diversidades na constituição dos componentes de RAS solúveis entre diferentes doadores. Dois doadores representativos são mostrados na Figura 4C. Doador 3 (Fig. 4C1) teve uma razão-SSE molar para ACE em sangue (1-8/1-10) de 4,5 enquanto Doador 6 (Fig. 4C2) mostrou uma ACE-SSE-Razão de 20,5 apontando para um papel mais proeminente de ACE na produção de Ang 1-8 neste doador. Também há uma diferença na RAS- razão para ACE (0,35 vs. 0,79), entretanto, as diferenças baseadas em RSSE-Impressão digital são muito mais distintas.

[00152] Como uma conclusão, um processo poderoso para a avaliação do RAS ou seus componentes em amostras biológicas é provido com a presente invenção. A combinação do presente processo de quantificação de peptídeo angiotensina baseado em LC-MS/MS altamente sensível com o novo equilíbrio de estado estável da amostra antes de estabilização representa uma ferramenta altamente reproduzível para avaliação de atividades de enzimas RAS associadas com célula de sangue e solúvel. O uso desta nova tecnologia tem um grande potencial para a descoberta de biomarcadores na medida em que o RAS está envolvido em uma variedade de condições patológicas. Além disso, atividades de enzima RAS associada com célula de sangue e solúvel representam um principal sítio de atividade farmacológica de vários fármacos anti-hipertensivos. O entendimento da individualidade de sistema pode pavimentar o caminho para abordagens específicas de paciente no tratamento de doenças associadas com RAS. A tecnologia de acordo com a presente invenção empurrará este desenvolvimento para frente através de provimento de um discernimento profundo e compreensivo no sistema renina - angiotensina em amostras biológicas.

[00153] Exemplo II: Análise de produtos de degradação de cascata proteolítica do sistema renina - angiotensina assim como o sistema bradicinina em amostras de sangue de acordo com a presente invenção

[00154] Todos os processos foram realizados como descrito no Exemplo I, exceto que as amostras de plasma foram estabilizadas pela adição de $M GTC / 1% TFA, tanto imediatamente como após incubação por 1 ou 3 horas em uma banho de água a 37oC.

RESULTADOS

[00155] As Figuras 6 e 7 mostram que o processo de acordo com a presente invenção pode ser aplicado não somente ao RAS, mas também a outras cascatas proteolíticas, tal como o sistema bradicinina. Além disso, estas figuras mostram que o equilíbrio de estado estável pode ser eficientemente estabilizado não somente pela adição de um coquetel inibidor de protease, mas também por um agente caotrópico como GTC. Após um período de incubação de 1 hora, um equilíbrio de estado estável foi atingido para o RAS e o sistema bradicinina e permaneceu estável, como pode ser visto a partir de comparação de níveis de peptídeos entre 1 h e 3 h de incubação.

Claims (13)

1. Processo para medição de produtos de degradação pep- tídica de uma cascata proteolítica, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos duas reações proteolíticas consecutivas em uma amostra de sangue, em que a amostra é incubada até que a taxa de degradação global real de pelo menos um produto de degradação peptídica seja igual à taxa de formação global real do referido pelo menos um produto de degradação peptídica e um equilíbrio em estado estacionário seja atingido para o referido pelo menos um produto de degradação peptídica envolvido na referida cascata proteolítica e em que o referido pelo menos um produto de degradação peptídica em uma concentração de equilíbrio no estado estacionário é quantificado na amostra e em que substratos de qualquer(quaisquer) enzima(s) en- volvida(s) na cascata proteolítica não são adicionados antes e/ou durante a incubação até que seja alcançado um equilíbrio no estado estacionário.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida amostra de sangue é sangue total, plasma ou soro, especialmente sangue total anticoagulado fresco ou congelado ou plasma anticoagulado fresco ou congelado.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois, pelo menos três ou pelo menos quatro produtos de degradação peptídica da cascata proteolítica são quantificados na amostra em concentração de equilíbrio no estado estacionário.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois produtos de degradação peptídica são quantificados e em que é calculada uma razão das quantificações de equilíbrio no estado estacionário dos pelo menos dois produtos de degradação peptídica.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a amostra é incubada por até 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos ou até 300 minutos.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a amostra é incubada a uma temperatura de 30 a 50° C, de 35 a 40° C ou de 37° C.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a cascata proteolítica é o sistema renina-angiotensina (RAS) ou o sistema bradicinina, ou ambos.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o produto de degradação peptídica é selecionado dentre angiotensinogênio, angiotensina I (Ang 1-10), angiotensina 2-10 (Ang 2-10), angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensina III (angiotensina 2-8 ou Ang 2-8), angioten- sina IV (angiotensina 3-8 ou Ang 3-8), angiotensina 1-9 (Ang 1-9), an- giotensina 1-7 (Ang 1-7), angiotensina 2-7 (Ang 2-7), angiotensina 3-7 (Ang 3-7), angiotensina 1-5 (Ang 1-5), calidina (KD ou Lis-bradicinina), bradicinina 1- 9 (BK 1-9), bradicinina 2-9 (BK 2-9), bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5).

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que os produtos de degradação peptídica quantificados são - angiotensina I (1-10), angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensina 1-7 (Ang 1-7) e angiotensina 1-5 Ang 1-5); ou - angiotensina II (angiotensina 1-8 ou Ang 1-8), angiotensi- na 1-7 (Ang 1-7) e angiotensina 1-5 (Ang 1-5); ou - bradicinina 1-9 (BK 1-9), bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradici- nina 1-7 (BK 1-7) e bradicinina 1-5 (BK 1-5); ou - bradicinina 1-8 (BK 1-8), bradicinina 1-7 (BK 1-7) e bradi- cinina 1-5 (BK 1-5).

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que um ou mais inibidores de protease são adicionados após a incubação até que seja alcançado um equilíbrio em estado estacionário para pelo menos um produto de degradação peptídica.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que um ou mais agentes cao- trópicos são adicionados após a incubação até que seja alcançado um equilíbrio em estado estacionário para pelo menos um produto de degradação peptídica.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o equilíbrio no estado estacionário é conservado pela desnaturação das enzimas induzidas pelo calor, sal, pH, detergente ou resfriamento.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um nível de peptídeo de equilíbrio no estado estacionário não varia mais de 15% durante um período de 60 minutos.