JP2009503008A - 新規局所用抗出血剤としての活性型第X因子(FXa)の刺激因子 - Google Patents
新規局所用抗出血剤としての活性型第X因子(FXa)の刺激因子 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、被験体における出血のFXa刺激因子の使用による局所治療に関する。本発明は、脂質化組織因子(TF)が可溶性およびプロトロンビナーゼ複合体結合性の両方の形のFXaの全てのタンパク質分解活性(アミド分解活性およびプロトロンビン加水分解活性)を刺激する新しい調節の役割を果たすという発見に基づく。
1.凝固の生理学
止血は出血に対する生物の機能であり、傷害後に直ちに作動して長期間活性であり続ける二つの過程が関与する。一つ目は一次止血として知られ、血管病変部位での血管収縮および血小板凝集形成の発生によって特徴づけられる。二つ目は二次止血として知られ、様々な凝固カスケードのタンパク質分解酵素の作用によりフィブリン塊が形成されるフェーズである。
各凝固因子の先天的欠乏症は出血の出現と関連し、一般的に単一のタンパク質に関係している可能性があり、従って、例えば、血友病Aは、FVIIIに影響を及ぼす遺伝的出血性疾患である。後天性血液凝固疾患は、出血の前歴がない個人に生じ、複数の原因がある可能性があり、説明として、凝固因子に対する特異的阻害因子の存在が多数の輸血を受けた個人に生じる可能性がある。後天性凝固因子欠損症は、重度の止血問題も引き起こす未知の病因存在であるが、これらは血液凝固障害がある患者が対象となる複数輸血における最も重要な問題の一つでもある。後天性血液凝固障害の別の重要な原因は、ヘパリンやワルファリン薬などの抗凝固治療である。抗凝固剤で治療された患者は顕著な割合(5−10%)で出血症状を示し、これらの患者の多くは管理することが困難である。
(1)静脈内投与であること
(2)投与のために特別な装置が必要
(3)治療の焦点の狭さ
(4)特定の出血症状に投与される不適切または煩雑な治療
(5)急性効果の欠如
(6)フィブリン塊の不安定さ
(7)非常に危険な副作用
(8)高価な治療。
常に静脈内投与されなければならない、高価で利用しにくい治療である。治療焦点が非常に狭く、特定の欠損症の治療のみに有用である。いずれの出血症状にも局所治療には不適当である。効果的であるためには長い投与プロトコルが必要なため、出血の急性治療には有用でなく、何よりも非常に危険な治療である。血友病患者の20%が肝炎、5%がHIVを患い、また15%までがFVIIIまたはFIXに対して血漿抗体を示し(後天性血友病)、特別で非常に高価な代替治療(免疫抑制剤、高用量の凝固因子、血漿交換)を必要とする。これらの理由から、公衆衛生機関(WHO、FDA、EMEAなど)は、凝固因子濃縮物よりも良い新しい止血剤の開発に高い関心を寄せている。
高価な治療であり、一部の出血症状(例えば、鼻血)における投与は不適当であり、歯科治療には煩雑であり、不安定なフィブリン塊を形成し、凝固因子濃縮物と同じ危険な副作用の可能性がある。ヒトウイルスの感染リスクの可能性があるため、ヒト由来血液製剤を投与されたことがない患者または組換えFVIIIまたはFIXによる治療を受けている患者には使用すべきでない。
先進国のみで利用可能な最も高価な治療(平均コスト6,000ユーロ)である。凝固因子濃縮物と同様に、常に静脈内投与されなければならず、特定の欠損症の治療のみに有用であるため、治療焦点が非常に狭く、局所治療には不適当であり、効果的であるためには長い投与プロトコルが必要なために出血の急性治療には有用でなく、また、ヒトウイルス感染は報告されていないものの、同じパーセンテージの後天性血友病が報告されている(15%までが抗FVIIIまたはFIX抗体を示す)。凝固因子濃縮物と同様に、公的機関はその使用を大いに制限している。
これらの薬剤は治療焦点が非常に狭く、これが最も重要な制限事項である。これらの薬剤は、過去のフィブリン塊形成が有効である必要がある。従って、健康な被験体のみに有用であるが、フィブリン塊の形成が不適当である場合(すなわち、FVII欠損血友病などの先天性血液凝固障害)、治療効果は劇的に低下する。さらに、効果的であるためには長い投与プロトコルが必要なため、出血の急性治療には有用ではない。
これらの止血剤の最も重要な使用制限は、鼻血、歯科、手術など、多くの種類の出血には投与が不適切であることである。さらに、痛みを伴う発熱反応が報告されており、危機的な状況(戦争)での皮膚粘膜出血に対してのみに使用され、著しくその使用が減っている。
これまでに、TFは血液凝固の誘引に役割を果たす主要な因子であることが受け入れられている。凝固が開始されるには、プロトロンビン加水分解を開始するためにFXのFXaへの活性化が絶対に必要である。このFXaの供給源は、主にFVIIaとその受容体であるTFの相互作用によって生じる。FXaは血小板顆粒内に存在し、血小板が活性化した際に表面に露出される可能性があると述べられてきたが、血中に存在するFXaの生理的濃度(<150pM)は、補因子FVaの存在下および血小板凝血促進表面の存在下でさえ、トロンビン形成を開始するには不十分である(図1)。従って、凝固はFXaの基礎濃度が著しく上昇した場合にのみ開始することができると現在一般に考えられている。FXa基礎濃度の上昇の原因は、常にTF::FVlla複合体およびFIXaのタンパク質分解活性の両方が原因であるとされている(図2)。
(1)容易な局所投与
(2)局所投与のための特別な装置は不要
(3)幅広い治療焦点(FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、およびFXIIIの欠損)
(4)全てのタイプの出血症状(鼻血、歯科出血;皮膚粘膜、外傷および手術の出血)に投与される適切な治療
(5)強力な急性効果を発揮する
(6)生理的なフィブリン塊形成(極めて安定な凝血塊)
(7)副作用なし
(8)低コスト治療。
発明者らは、驚くべきことに、脂質化TFがFXaのタンパク質分解活性を高め、その結果、トロンビン生産を高めることを見いだした[本明細書の実施例の結果の節1を参照]。発明者らは、脂質化TFが、インビトロ[本明細書に含まれる実施例の結果の節1から5を参照]およびインビボ[本明細書に含まれる実施例の結果の節6および7を参照]の両方で、健康な被験体、ならびにFV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXIIおよびFXIIIの欠損患者、ならびに(限定を目的としない例として、ヘパリン、低分子量ヘパリン、またはクマリン誘導体といった薬剤による抗凝固治療を用いて)抗凝固処置された患者など、凝固因子欠損患者の血漿および血液を凝固させることも観察した。発明者らは、脂質化TFが血小板障害に苦しむ患者の血液を凝固させることをさらに見いだした[本明細書に含まれる実施例の結果の節5を参照]。これらの結果は、脂質化TFが被験体における出血の局所治療に有用な抗出血剤であることを明確に示す。
II.1 脂質化TF+FXa
知られているように、血液凝固の外因性経路において、TFは血中FVII/FVIIaに結合してTF::FVII複合体を形成し、カルシウム存在下でFXが活性化されるように基質として作用する。外因性経路の活性化は、TFとそのリガンドであるFVII/FVIIaの相互作用を伴う。この複合体、TF::FVIIaは、FVIIaによるFX活性化が起こるように基質として作用する。今般、発明者らは、驚くべきことに、脂質化TFがFXaと共にFVII欠損被験体においてでさえ凝固を誘導し、脂質化TFがFXa刺激因子として作用し、このセリンプロテアーゼのプロトロンビン加水分解の開始を可能にし、プロトロンビンを生成し、凝固の開始が行われることを見いだした。本明細書で用いられる、「FXa」は、タンパク質、特に活性型において、プロトロンビン加水分解に役割を果たし、その結果、凝固開始を引き起こすセリンプロテアーゼを示す。このタンパク質分解は、活性型血小板表面に結合し、FVaおよびカルシウムイオンの存在下でプロトロンビンを加水分解するFXaによって行われる。
発明者らは、驚くべきことに、脂質化TFおよび負に荷電した無機表面(NCIS)の組み合わせが、健康な被験体および凝固因子欠損患者の血漿および血液をインビトロ[本明細書に含まれる実施例の結果の節1(1.4)、2(2.2)、3(3.4)、4(4.2)、および5(5.25および5.4)を参照]ならびにインビボ[本明細書に含まれる実施例の結果の節6.1を参照]の両方で凝固させることを見いだした。
発明者らは、驚くべきことに、脂質化TF、FXa、およびNCISの組み合わせが、健康な被験体および凝固因子欠損患者の血漿および血液をインビトロ[本明細書に含まれる実施例の結果の節1(1.6)および2(2.2)を参照]で凝固させることを見いだした。
III.1 TF::FXa複合体
前述のように(本明細書の項11.1参照)、発明者らは、脂質化TFおよびFXaの組み合わせが、それ自体では凝固を誘導できない低濃度のFXaにおいてさえ、血漿を凝固させることを見いだした。何らかの理論と関連づける意図はないが、組み合わせまたは別々(任意の順序で)のいずれであっても、該脂質化TFおよびFXaは、医薬的効果(抗出血効果、特に局所抗出血効果)が発揮されなければならない部位で観察される該医薬的効果を発揮することができる複合体の形成を引き起こすと考えられる。
前述のように(本明細書の項11.2参照)、発明者らは、脂質化TFおよびNCISの組み合わせが、健康な被験体および凝固因子欠損患者両方の血漿および血液をインビトロおよびインビボで凝固させることを見いだした。何らかの理論と関連づける意図はないが、組み合わせまたは別々(任意の順序で)のいずれであっても、脂質化TFおよびNCISの投与は、治療効果(抗出血効果、特に局所抗出血効果)が発揮されなければならない部位で観察される該治療効果を発揮することができる複合体の形成を引き起こすと考えられる。
前述のように(本明細書の項11.3参照)、発明者らは、脂質化TF、FXaおよびNCISの組み合わせが血漿を凝固させることを見いだした。何らかの理論と関連づける意図はないが、組み合わせまたは別々(任意の順序で)のいずれであっても、脂質化TF、FXaおよびNCISの投与は、医薬的効果(抗出血効果、特に局所抗出血効果)が発揮されなければならない部位で観察される該治療効果を発揮することができる複合体の形成を引き起こすと考えられる。従って、別の態様において、本発明は、本明細書においてTF::FXa::NCISとして特定される脂質化TF、FXaおよびNCISを含んでなる複合体に関する。単純化のために該複合体はTF::FXa::NCISとして示されるが、該複合体は実際には各複合体のいくつかのユニットにより形成される可能性もあり、ならびに例えばTF::NCIS::FXa、FXa::NCIS::TF、FXa::TF::NCIS、NClS::TF::FXaまたはNCIS::FXa::TFといった該成分の間の相互作用の任意の可能性により形成される場合もあり、これら全ての可能性は本発明の範囲内である。前述の結果を考慮して、該複合体は薬剤として使用することができ、特に出血の治療、例えば被験体における出血の局所治療に使用することができる。特定の実施態様において、この複合体の製造に用いられる脂質化TFは、脂質化ヒトTFである。
前述のように、脂質化TFは抗出血剤として、特に局所的使用のための抗出血剤として使用することができる。従って、別の態様において、本発明は、脂質化TFと共に医薬的に許容可能な担体を含んでなる医薬組成物(以下「本発明の医薬組成物」という)に関する。特定の実施態様において、脂質化TFは脂質化ヒトTFである。
a)医薬的に許容可能な担体と共に(i)脂質化TFおよび(ii)FXaを含む製品;または
b)別々に、(i)医薬的に許容可能な担体と共に脂質化TF、および(ii)医薬的に許容可能な担体と共にFXa;または
c)医薬的に許容可能な担体と共に(i)脂質化TFおよび(ii)NCISを含む製品;または
d)別々に、(i)医薬的に許容可能な担体と共に脂質化TF、および(ii)医薬的に許容可能な担体と共にNCIS;または
e)医薬的に許容可能な担体と共に(i)脂質化TF、(ii)FXa、および(iii)NCISを含む製品;または
f)別々に、(i)医薬的に許容可能な担体と共に脂質化TF、(ii)医薬的に許容可能な担体と共にFXa、および(iii)医薬的に許容可能な担体と共にNCIS;または
g)医薬的に許容可能な担体と共にTF::FXa複合体;または
h)医薬的に許容可能な担体と共にTF::NCIS複合体;または
i)医薬的に許容可能な担体と共にTF::FXa::NCIS複合体
を含んでなる。
本発明の医薬組成物は、支持体上に配置することができる。従って、別の態様において、本発明は、本発明の医薬組成物と支持体とを含んでなる製品に関する。本明細書において用いられる「支持体」の用語は、本発明の医薬組成物をその上に配置することが可能な適した材料の担体を意味し、本発明の医薬組成物は、所望の部位、例えば、本発明の医薬組成物が治療効果を発揮する部位に運ばれ、放出される。該支持体は、固形支持体、または例えば液状支持体またはガス状支持体といった非固形支持体とすることができる。説明のための、限定を目的としない固形支持体の例は、包帯剤、バンドエイド、圧迫包帯、硬膏等を含む。説明のための、限定を目的としない液状支持体の例は、ゲル、スプレー、口内洗浄剤等を含む。説明のための、限定を目的としないガス状支持体の例は、空気、高圧ガス等を含む。特定の実施態様において、前記支持体上に配置される本発明の医薬組成物は:
(a)(i)支持体、(ii)医薬的に許容可能な担体と共に脂質化TFおよびFXaを含む製品、(iii)医薬的に許容可能な担体と共に脂質化TFおよびNCISを含む製品、および(iv)医薬的に許容可能な担体と共に脂質化TF、FXaおよびNCISを含む製品;または
(b)医薬的に許容可能な担体と共にTF::FXa複合体;または
(c)医薬的に許容可能な担体と共にTF::NCIS複合体;または
(d)医薬的に許容可能な担体と共にTF::FXa::NCIS複合体
を含んでなる。
発明者らによって行われたアッセイにおいて得られた結果は、TFが:
−FXaのタンパク質分解活性を上昇させ、また、それに応じてトロンビンの生産を上昇させること、
−健康な被験体の血漿および血液、ならびにFVII欠損の血液などの、凝固因子欠損患者の血漿および血液を凝固させること、
−血小板障害を患う患者の血液を凝固させること、ならびに
−様々な動物モデルにおいて、重度および致命的な出血をインビボで停止させること、
を明確に示している。
1.1 脂質化TFは、FXaタンパク質分解活性を増加し、従ってFVIIの不存在下でのトロンビン産生を増加する(溶液におけるおよび洗浄された血小板の懸濁液における色素産生アッセイ)。
1.2 脂質化TFは、FVII欠乏患者からの血漿および血液を凝固することが出来る(血漿および非抗凝固処理全血における凝固アッセイ)。
1.3 脂質化TFは、FVIIに対する単クローン性抗体の存在下において健康被験体の血漿を凝固することが出来る。
1.4 脂質化TFとNCISとの組み合わせは、FVII欠乏血漿における血液凝固を相乗的に増加する(凝固アッセイ)。
1.5 脂質化TFとFXaとの組み合わせは、FVIIに対する単クローン性抗体の存在下における血液凝固を相乗的に増加する(FX欠乏血漿における凝固アッセイ)。
1.6 脂質化TF、FXaおよびNCISの組み合わせは、抗FVII抗体の存在下における凝固を相乗的に増加する(FX欠乏血漿における凝固アッセイ)。
2.1 このセリンプロテアーゼが低濃度で存在する場合、脂質化TFは、FXaの刺激因子として作用する。
2.2 脂質化TFと、FXaおよびNCISとの組み合わせは、FXaの刺激において相乗的に作用する。
3.1 脂質化TFは、凝固因子FV、FVIII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、およびFXIII(凝固因子欠乏血漿における、ならびにFXIIIおよびFIXからの非凝固全血における凝固アッセイ)が欠乏している患者からの血漿および血液を凝固する。
3.2 脂質化TFは、前もってヘパリン処理された全血および血漿を凝固する。
3.3 脂質化TFは、ワルファリンで処置された動物からの血漿を凝固する。
3.4 脂質化TFとNCISとの組み合わせは、凝固因子FV、FVIII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、およびFXIII(凝固因子欠乏血漿における凝固アッセイ)が欠乏している患者からの血漿における、および血友病患者からの全血における血液凝固を相乗的に増大する。
4.1 脂質化TFは、健康な被験体からの血漿および血液を凝固する。
4.2 脂質化TFとNCISとの組み合わせは、健康な被験体からの血漿および血液における血液凝固を相乗的に増大する。脂質化TFがリン脂質と組み合わされる場合、相乗作用はない。
5.1 脂質化TFは、先天性の血小板障害を患う患者からの血漿を凝固する。
5.2 脂質化TFとNCISとの組み合わせは、先天性の血小板障害を患う患者からの全血における凝固を増加する。
5.3 脂質化TFは、血小板減少症の試料を凝固する。
6.1 脂質化TF(単独またはNCISとの組み合わせで)は、ラットの尾の近位の切断による重度の出血動物モデルにおいて局所止血剤として有用である。
6.2 脂質化TFは、前もってヘパリンまたはワルファリンで処置された重度の出血動物モデルにおける局所止血剤として有用である。
6.3 脂質化TFは、ラットの尾の近位の切断による致死的な出血動物モデルにおける局所止血剤として有用である。
材料
脂質化TFの利用源として、ヒト組み換え組織因子(rTF)、Thromborel(登録商標)S、およびNeoplastin(登録商標)Plusを使用した。具体的に、以下の市販の製剤を使用した:Morrisseyにより記載された方法に従って再脂質化された(relipidated)、ヒト組み換え組織因子(非脂質化)(American Diagnostica,USA);カルシウムを含む、凍結乾燥された(lyofilized)ヒト胎盤トロンボプラスチン(Thromborel(登録商標)S,Dade Behring Inc);カルシウムを含む、凍結乾燥されたウサギの脳(Neoplastin(登録商標)Plus,Diagnostica Stago−Roche)。
オクチルグルコシドによる透析を用いる脂質ベシクルにおけるTFを再脂質化するための方法(Morrisey Method)
非脂質化TFを、非イオン性界面活性剤N−オクチル−β−D−グルコピラノシド(オクチルグルコシド)を用いて、脂質ベシクル中に取り込む。TFおよび脂質の両方を、ミセルを形成するオクチルグルコシド中に溶解する。オクチルグルコシドを、その高い臨界ミセル濃度(CMC=20から50mM)に起因して透析により溶液から容易に取り除くことが出来る。オクチルグルコシドが取り除かれる場合、該脂質は、単層のベシクルにおいて組織化される。TFを、その膜貫通領域によってこれらのベシクル中に浸漬する。通常、TF分子の50〜80%が、ベシクルから外側に向けて配置される。
Calbiochemからのオクチルグルコシド(n−オクチル−β−D−グルコピラノシド)
1.所望の脂質モル半径を用いて、2.6マイクロモルの総脂質を、それぞれの試料について調製する。
2.アルゴンまたは窒素を流して、脂質混合物を乾燥する。
3.管が乾燥したことが明らかな場合に、もう60分間真空乾燥する。
4.400μlのOG/HBSの新鮮な溶液(室温で)を乾燥脂質を含む管に加える。
1mlの最終容量を完成させるまで、400μlのOG/脂質および十分なHBSAを含む管に、TFの所望の量を加える。この段階を室温で実施する。
洗浄された血小板懸濁液を、Radomski Mらにより記載された方法(Radomski M,Moncada S.;1983 Thromb Res.)これは、プロスタサイクリンによりヒト血小板を洗浄するための改善された方法である.15;30(4):383−9)に従って、健康な志願者からの血液採取(3.15%クエン酸ナトリウム)から調製した。標本の処理を、血液採取後すぐに室温で、常時実施した。血小板活性化および機能性の状態を、アッセイの実施の前および実施中の凝集アッセイにより分析した。自己活性化および機能性を、既知のアゴニスト(コラーゲン)を用いた活性化により評価した。
色素産生アッセイ
異なる色素産生アッセイは、溶液および活性化血小板懸濁液中で設計し、因子Xaタンパク質分解活性に対するrTFの影響を実証した。
血漿における自然凝血促進活性(非刺激)を、コアギュロメータ(Fibrintimer BFT−II 血液凝固測定器 Dade−Behring,Germany)において、一定の段階での凝固アッセイにより測定した。要約すれば、50μlの血小板欠乏血漿を、すでに調節されたキュベットに加え、50μlの蒸留水を加えた。この混合物を放置して60秒間37℃でインキュベートし、50μlの25mM塩化カルシウムを直ちに加え、凝固時間を、コアギュロメータ((血餅の形成により検証される)において秒で測定し、血餅の形成を確認した。試料の1づつを、繰り返して分析した。血小板欠乏血漿を、遠心分離手順により得て、血小板の数を、Coulterにより測定した。
非抗凝固化全血における凝血促進活性を、凝固方法により測定した。調査される、異なる薬剤を、1mlの非抗凝固処理全血に加え、採取の開始から固まった血餅が現れるまで、クロノメータで、凝固時間を測定した。異なる薬剤の効果を、血液凝固時間の短縮または長期化により評価した。
ラットの尾の近位の切断による重度の出血モデル
重量が350〜450グラムである23匹のSprage−Dawley系の雄のラットを、3つの処置群に無作為に分配した:対照群は、生理食塩水で局所処置を受ける14匹の動物からなり、一方、他の2つの群はまた、1.2μg/mlのrTFでの局所処置、および1.2μg/mlのrTF+NCIS(容量:容量 1;2)でのn=4局所処置をそれぞれ受ける5匹の動物からなる。全ての化合物は、動物の尾の近位の切断部と局所的に接触し、プラスチックのエッペンドルフ型のピペットにより分配されて、止血的に(hemostastically)作用する。固定し、固まった血餅の形成は、更なる出血が無いことの確認により明らかであった。
重量が350〜450グラムである27匹のSprage−Dawley系の雄のラットを、5つの処置群に無作為に分配した:対照群は、生理食塩水で局所処置を受ける14匹の動物からなった。2つの群は、尾の切断手順が開始する前に静脈内で15分間200U/Kgのヘパリンを受け(TF n=3で処置され、食塩水n=5で処置される)、他の2つの群は、尾の切断手順が開始する前に3日間、経口的に0.1mg/kg/日のワルファリンを受けた(TF n=3で処置され、食塩水n=2で処置される)。1.2μg/ml rTFでの局所処置を、それぞれの処置群の一つのみに実施した。従って、それは、それぞれの抗凝固処置に対する対照の処置群であった。脂質化TFは、動物の尾の近位の切断部と局所的に接触し、プラスチックのエッペンドルフ型のピペットにより分配されて、止血的に作用する。固定し固まった血餅の形成は、更なる出血が無いことの確認により明らかであった。
重量が350〜450グラムである4匹のSprage−Dawley系のラットを、2匹の動物を含む、2つの処置群に無作為に分配した。対照群動物は、処置として、生理食塩水を受けた一方、他の群は、局所投与された脂質化TFを受けた(2μgの活性タンパク質の最終用量で)。ラットの頚動脈における穿刺による致死の出血モデルを、以下の標準手順に従って実施した。脂質化TFおよび生理食塩水を、それぞれの3mlを含む包帯剤において、穿刺の点上に直接投与した。これは、2分間の対応する処置の圧迫と接触とに組み合わされた。
1.脂質化TF(単独および組み合わせで)が、FVIIの不存在下(欠損、欠乏または免疫遮断により引き起こされる)でフィブリン血餅形成および血液凝固の原因となるFXaの直接刺激因子として作用することを実証するインビトロアッセイ
1.1.脂質化TFは、FXaタンパク質分解活性を増加し、従ってFVIIの不存在下でのトロンビン産生を増加する。
FVIIの不存在下における因子Xa刺激剤として脂質化TFの能力を評価するために、いくつかのインビトロアッセイを実施した:(i)溶液中のFXaアミド分解活性に対する色素産生アッセイ;および(ii)洗浄された血小板懸濁液におけるトロンビン形成活性に対する色素産生アッセイ。
FXa特異的基質S−2765を用いる溶液における、FXaアミド分解活性に対する直接アッセイは、脂質化TFが、FXaタンパク質分解活性を非常に著しく増加することが出来ることを実証した。高rTF濃度(1μg/ml)の存在において、低および高FXa濃度により生成される活性の増加(p<0.001)が、観察された。同様の著しい刺激効果(p<0.001)が、より低い脂質化TF濃度(0.1μg/ml)の存在下において観察された。表1は、5つの独立した実験において得られた結果を示す。
血小板懸濁液を、凝血促進表面の利用源として使用し、トロンビン形成を、特異的基質S−2238により測定した場合、検出された凝血促進作用は、非常により大きかった(表2)。外因性FXaの不存在下において、脂質化TFは、トロンビン形成において著しい刺激効果を生じた(p<0.001)。同様の刺激効果が、外因性FXaの存在下において、低および高濃度の両方で観察された(p<0.001)。
一連のインビトロ凝固アッセイを実施し、FVII欠乏患者からの血漿および非抗凝固処理全血における脂質化TFの凝固効果を示し、従って、脂質化TFは、抗出血性の処置のために有用な薬剤である。
市販のFVII枯渇血漿およびFVIIが欠乏している2人の患者からの非抗凝固処理全血を用いる凝固アッセイにより、脂質化TFの凝固に対する効果を調査した(表3)。脂質化TFは、濃度依存性に欠損FVII血漿における凝固を著しく促進することが出来た。同じ方法において、脂質化TFは、FVII欠乏患者からの非抗凝固処理全血をまた、低、中および高脂質化TF濃度の存在下において凝固し、FVIIの不存在下においてでさえ、脂質化TFにより正常の凝固を生じることが出来ることを示した。表3は、枯渇FVII血漿に対する5つの独立した実験から得られた結果を示す。
インビトロ凝固アッセイを実施し、FVIIに対する単クローン性抗体(この抗体は、正常の血漿において凝固を遮断することが出来る)の存在下において健康な被験体中の血漿における脂質化TFの凝固効果を示した。
脂質化TFの血漿凝固に対する効果を、FVIIに対する単クローン性抗体の存在下において、健康な志願者からの血漿を用いる凝固アッセイにより調査した(表5)。脂質化TFは、FVIIに対する単クローン性抗体(これは、血液凝固を完全に阻害することが出来る)の存在下においてでさえ凝固を引き起こすことが出来た。これらの実験条件(FVII欠乏試料などの)下で、脂質化TFは、血漿凝固を生じることが出来る。
一連のインビトロ凝固アッセイを実施し、FVII欠乏血漿における負に帯電した無機表面[NCIS]と組み合わされる脂質化TFの凝固効果を示した。該凝血促進作用は、脂質化TFが凝固促進剤として単独で使用された場合に得られたものを超えた。これらの結果は、脂質化TFにより介在される効果が、FVIIに依存せず、その特異的リガンドが存在しない場合でさえ血漿凝固を誘導することが出来ることを示す。表6は、5つの独立した実験において得られた結果を示す。
FVIIの不存在下における低濃度(170pMおよび1700pM)での脂質化TFおよびFXaの組み合わせの凝固効果を、抗FVIIで免疫遮断されるFXa欠損血漿において調査した(表7)。
低濃度(170pMおよび1700pM)での脂質化TF、FXaとNCISとの組み合わせの凝固効果をまた、FXa欠乏血漿において調査した(表8)。
2.1.このセリンプロテアーゼが低濃度で存在する場合、脂質化TFは、FXaの刺激因子として作用する。
インビトロ凝固アッセイを、凝固FX欠乏血漿において実施し、脂質化TFのFXaに対する相乗効果を示した(170pMおよび1700pMの低濃度でFX欠乏血漿に加え、従って、これらの血漿は、いかなる凝固経路からもFXaを生じることが出来ない)。低濃度での脂質化TFとFXaとの組み合わせの凝血促進作用を、表9に示す。
低濃度(170pMおよび1700pM)での脂質化TF、FXaとNCISとの組み合わせの凝血促進作用をまた、FX欠乏血漿において調査した(表10)。
3.1.脂質化TFは、凝固因子FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、およびFXIIIが欠乏している患者からの血漿および血液を凝固する。
脂質化TF(単独)の凝固因子欠乏血漿に対する凝血促進作用を、免疫親和性技法により、欠乏した市販の血漿、並びに血友病A(FVIII欠乏)と診断された3人の患者および血友病B(FIX欠乏)と診断された2人の患者からの血漿を用いて調査した。表11は、該結果を示す。1μg/mlの濃度で、脂質化TFは、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、およびFXIIIが欠乏している全ての血漿を効果的に凝固することが出来た。一方、既知のFXa補因子、FVaの不存在下において、脂質化TFはまた、高および中濃度でのみであるが、血漿凝固を生じることが出来た。残りの凝固因子欠乏において、脂質化TFは、使用される全ての濃度で効果的であり、非常に低濃度で、優れた結果が得られた。FX(1%)の不存在下においてでさえ、脂質化TFは、凝固することが出来たが、しかし高濃度のみであった。すべてのこれらの結果を、血友病Aおよび血友病Bを患う患者からの試料で確認した。
脂質化TFは、高ヘパリン濃度で前もってインキュベートされた、血漿(表13)および非抗凝固処理全血(表14)を凝固することが出来、FXaに対するこの作用は、ヘパリン型阻害剤の存在下でさえ、この抗凝固促進剤により介在された阻害作用から影響を受けないことを実証した。
脂質化TFは、方法の中で詳細に示された手順に従ってワルファリン処置されたラットからの血漿を凝固することが出来た。該結果は、表15において、全てのビタミンK依存凝固因子の合成が止められる場合でさえ、脂質化TFが凝固することが出来ることを示し、FXaに対するこの作用が、この抗凝固剤により介在された阻害作用から影響を受けないことを実証する。
一連のインビトロ凝固アッセイを実施し、凝固因子欠乏患者(FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、およびFXIII)からの血漿におけるNCISと組み合わせた脂質化TFの凝固効果を示した。該凝血促進作用は、脂質化TFが凝血促進剤として単独で使用された場合に得られたものを超えた。脂質化TFがFV欠乏血漿(FV−D血漿)を凝固することが出来なかった低濃度(1μg/ml)でさえ、両方の薬剤の組み合わせは、著しい凝血促進作用をもたらした。同じく、同様の相乗作用が、FVII欠損血漿(FVII−D血漿)が使用された場合に得られた。これらの結果は、脂質化TFにより介在された効果が、FVIIに依存せず、FVの不存在下においてでさえ血漿凝固を誘導することができることを示す。同様に、組み合わせ(脂質化TF+NCIS)はまた、血友病患者(AおよびB)からの血漿試料における効力のある凝血促進作用を及ぼす。表16は、5つの独立した実験において得られた結果を示す。
4.1.脂質化TFは、健康な被験体からの血漿および血液を凝固する。
一連のインビトロアッセイを実施し、止血障害の病歴がない健康な志願者からの血漿および非抗凝固処理全血における脂質化TFの凝固効果を示す。表18は、健康な血漿における5つの独立した実験から得られた結果を示し、表19は、非抗凝固処理全血における結果を示す。
一連のインビボ凝固アッセイを実施し、健康な志願者からの血漿におけるNCISと組み合わされたrTFの凝固効果を示した。表20は、5つの独立した実験から得られた結果を示す。rTFが単独であったアッセイとの比較により、組み合わせ(rTF+NCIS)の凝血促進作用は、使用された濃度のそれぞれおよび全てにおいて有意に(p<0.001)より大きかった。
5.1.脂質化TFは、先天性の血小板障害を患う患者からの全血を凝固する。
血小板障害を患う患者における血液凝固に対する脂質化TFの凝血促進作用を、Glanzmann病およびベルナール・スリエ症候群を患う2人の患者からの血液を用いて凝固アッセイにより調査した。rTFは、Glanzmann病およびベルナール・スリエ症候群を患う個体における血液の凝固を、非常に著しく,かつ濃度依存性に促進することが出来た(表22);rTFは、従って、該個体の抗出血処置に対して有用な薬剤である。
一連のインビトロアッセイを実施し、先天的な血小板障害を患う患者からの全血においてNCISと組み合わせたrTFの凝固効果を示す。表23は、Glanzmann病、ベルナール・スリエ症候群を患う2人の患者から得られた結果を示す。rTFが単独であったアッセイとの比較により、組み合わせ(rTF+NCIS)の凝血促進作用は、それぞれの患者において有意に(p<0.001)より大きかった。
一連のインビトロ凝固アッセイを実施し、血小板数が異なる血漿における脂質化TFの凝固効果を示した。表24は、血小板減少性状態に対する正常の血小板数から得られた結果を示す。
6.1.脂質化TFは、ラットの尾の近位の切断による重度の出血動物モデルにおいて局所止血剤として有用である。
インビボアッセイを実施して、単独またはNCISとの組み合わせで投与された脂質化TFが、局所抗出血処置のために有用な薬剤であることを示した。単独またはNCISとの組み合わせで投与される、局所止血剤としての脂質化TFの使用を、ラットの尾の近位の切断による動物モデルにおける重度の出血の使用により評価した。得られた結果を、表25において示す。見られ得るように、該重度の出血モデルにおいて、出血は、対照動物(生理食塩水で処置された、PSS対照)において、18.1±5.98分で自然に凝固した;しかし、脂質化rTF(単独)の局所投与は、有意な減少をもたらした(11.1±5.54分、p<0.001)。rTFがNCISと組み合わせて投与された場合、凝血促進作用は、さらにより大きかった(5.0±1.1分、p<0.001)。
インビボアッセイが実施され、単独で投与された脂質化TFが抗凝固条件における局所抗出血(antihemorragic)処置のために有用な薬剤であることを示した(表25)。単独で投与される局所止血剤としての脂質化TFの使用を、尾の切断手順を開始する前に静脈内で15分間200U/Kgのヘパリンで、または尾の切断手順を開始する前に3日間0.1mg/kg/日のワルファリンで前もって処置されたラットの尾の近位の切断による動物モデルにおける重度の出血の使用により評価した。得られた結果を、表26に示す。見られ得るように、該重度の出血モデルにおいて、生理食塩水で処置された対照食塩水群は、18.1±5.98分で自然に凝固した。対照のヘパリン処置群の出血は、自然に凝固しなかった(>90分)。対照のワルファリン処置群は、41,6±8.5分で自然に凝固した。表26は、脂質化TF(単独)の局所投与が、全ての処置群において著しい減少をもたらしたことを示す。
インビボアッセイを実施して、単独で投与されたrTFが、血管上に直接適用された局所抗出血処置のために有用な薬剤であることを示した。単独で投与されたrTFの使用を、頚動脈における穿刺による動物モデルにおける致死的な出血の使用により評価した。得られた結果を表27に示し、この結果は、非常に有意であった。見られ得るように、対照動物の群において(生理食塩水で処置された、PSS対照)、全ての動物が出血で死亡した、他方、脂質化TFの群において、動物は死亡せず、切断部は、全ての場合において首尾よく塞がれ凝固され得た。該処置は、安定した凝固および穿刺創の封鎖を得るために必要な時間の観点から有効であった。
実施例番号1からの結果は、以下を明確に実証する。
1)そのリガンドFVIIの不存在下において、脂質化TFは、そのタンパク質分解活性を著しく増加するFXaと直接相互作用することが出来(両方、アミド分解およびトロンビン形成)、この結果は、FXaに対する新たな補因子(周知のFVaに依存しない)として作用する脂質化TFに対する新たな役割を初めて示す。
2)脂質化TFは、FVII欠損血漿を凝固することが出来る。従って、脂質化TFは、これらの患者の処置のための良好な代替法である(現在、唯一の処置法は、高価なヒト組み換えFVIIaである。)。
3)脂質化TFは、NCISおよびFXaと相乗的に作用する(低濃度では凝固を生じることが出来ない)。
1)脂質化TFは、生理学的FXa濃度(いかなる著しい凝血促進作用も、もたらすことが出来ない)が、プロトロンビン加水分解を誘発し、結果としてトロンビン形成が起こる原因となる。
2)脂質化TFには、FXa(可溶であり、プロトロンビナーゼ複合体に結合する。)の全ての形態の全てのタンパク質分解活性に対する補因子として作用する新たな役割がある。
3)FX欠損血漿(FXの痕跡を含む)でさえ、脂質化TFにより凝固され得る。従って、脂質化TFは、これらの患者の処置のための良好な代替法である。
4)脂質化TFは、FXa活性の刺激効果においてNCISと相乗的に作用する。
1)脂質化TFは、血友病患者(FVIII、FIXおよびFXI)における血液凝固を引き起こすことが出来る。従って、脂質化TFは、これらの患者の処置のための良好な代替法である。
2)脂質化TFは、FVの不存在下においてでさえ血液凝固を引き起こすことが出来る。これらの結果は、脂質化TFがFXaに対して強力な促進作用を引き起こすことを明らかに示すが、それは、その補因子の不存在下において(欠乏FV血漿)、脂質化TFが、同じ促進作用を引き起こす補因子として作用するからである。
3)脂質化TFは、FX欠損血漿(FXの痕跡を含む)においてでさえ、血液凝固を引き起こすことが出来る。従って、脂質化TFは、これらの患者の処置のための代替法である。
4)脂質化TFは、ヘパリンおよびワルファリン処置された血漿における血液凝固を引き起こすことが出来、脂質化TFがアンチトロンビンIIIの作用に干渉し、おそらくFXaの基礎濃度への促進作用を通して、ワルファリン処置条件においてでさえ、凝固する可能性があることを示す。
5)最後に、脂質化TFは、全ての因子凝固欠乏において観察される凝血促進作用において、NCISと相乗的に作用する。
1)脂質化TFは、健康な被験体における血液凝固を引き起こすことが出来る。従って、脂質化TFは、健康な被験体における出血症状の処置のための良好な代替法である。
2)脂質化TFは、健康な被験体において観察された凝血促進作用においてNCISと相乗的に作用するが、リン脂質のみでは、相乗的に作用しない。
1)脂質化TFは、先天性および後天性など血小板障害(すなわち、血小板減少症)を患う患者における血液凝固を引き起こすことが出来る。従って、脂質化TFは、血小板数および/または機能性の変性を有する患者における出血症状の処置のための良好な代替法である。
1)局所的に投与された脂質化TFは、重度の出血の動物モデル(近位の全ての尾の切断)における出血を停止することが出来る。
2)局所的に投与された脂質化TFは、抗凝固治療(ヘパリンまたはワルファリン)を絡ませて施した、重度の出血の動物モデル(近位の全ての尾の切断)における出血を停止することが出来る。
3)局所的に投与された脂質化TFは、致死的な出血の動物モデル(頚動脈における頚動脈穿刺)における出血を停止することが出来る。
Claims (46)
- 被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、脂質化組織因子(TF)またはその機能的断片の使用。
- 被験体が健康な被験体または出血性素因がある被験体であり、前記出血性素因が血液凝固障害および/または血小板障害を含むものである、請求項1に記載の使用。
- 血液凝固障害が先天性血液凝固障害または後天性血液凝固障害である、請求項2に記載の使用。
- 先天性血液凝固障害が、凝固第V因子、凝固第VII因子、凝固第VIII因子、凝固第IX因子、凝固第X因子、凝固第XI因子、凝固第XII因子、凝固第XIII因子およびそれらの組み合わせから選択される凝固因子の欠乏に基づく血液凝固障害である、請求項3に記載の使用。
- 先天性血液凝固障害が、凝固第V因子から選択される凝固因子の欠乏に基づく血液凝固障害である、請求項4に記載の使用。
- 先天性血液凝固障害が、凝固第VII因子から選択される凝固因子の欠乏に基づく血液凝固障害である、請求項4に記載の使用。
- 先天性血液凝固障害が、凝固第X因子から選択される凝固因子の欠乏に基づく血液凝固障害である、請求項4に記載の使用。
- 被験体が、抗凝固剤による抗凝固剤治療によって引き起こされる後天性血液凝固障害を有する、請求項2に記載の使用。
- 抗凝固剤が、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ワルファリン、クマリン誘導体またはジクマリンである、請求項8に記載の使用。
- 被験体が、先天性または後天性の血小板障害を有する、請求項2に記載の使用。
- 先天性血小板障害が、Glanzmann病、ベルナール-スーリエ症候群、Bolin−Jamieson症候群、ウィスコット−アルドリッチ症候群、Paris−Trousseau−Jacobsen症候群、X染色体の血小板減少症、灰色血小板症候群、Sebastian症候群およびファンコーニ貧血から選択されるものである、請求項10に記載の使用。
- 後天性血小板障害が、血小板血症、多血症または慢性骨髄性白血病などの骨髄増殖性疾患;骨髄様化生;壊血病、先天性心臓病、および肝硬変におけるタンパク異常血症から選択されるものである、請求項10に記載の使用。
- 脂質化TFが脂質化されたヒトTFである、請求項1に記載の使用。
- (i)脂質化TFおよび(ii)活性型凝固第X因子(FXa)を含んでなる、製品。
- (i)脂質化TFおよび(ii)活性型FXaを別々に含んでなる、製品。
- (i)脂質化TFおよび(ii)FXaを、被験体への同時または連続投与のための組み合わせとして別々に含んでなる、製品。
- (i)脂質化TFおよび(ii)負に荷電した無機表面(NCIS)を含んでなる、製品。
- (i)脂質化TFおよび(ii)NCISを別々に含んでなる、製品。
- (i)脂質化TFおよび(ii)NCISを、被験体への同時または連続投与のための組み合わせとして別々に含んでなる、製品。
- (i)脂質化TF、(ii)FXaおよび(iii)NCISを含んでなる、製品。
- (i)脂質化TF、(ii)FXaおよび(iii)NCISを別々に含んでなる、製品。
- (i)脂質化TF、(ii)FXaおよび(iii)NCISを、被験体への同時または連続投与のための組み合わせとして別々に含んでなる、製品。
- 脂質化TFが脂質化されたヒトTFである、請求項14〜22のいずれか一項に記載の製品。
- 薬剤としての、請求項14〜23のいずれか一項に記載の製品。
- 被験体における出血の治療のための薬剤の製造における、請求項14〜23のいずれか一項に記載の製品の使用。
- 被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、請求項14〜23のいずれか一項に記載の製品の使用。
- 脂質化TFおよびFXaを含んでなる、複合体(TF::FXa)。
- 薬剤としての、請求項27に記載の複合体。
- 被験体における出血の治療のための薬剤の製造における、請求項27に記載の複合体の使用。
- 被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、請求項27に記載の複合体の使用。
- 脂質化TFおよびNCISを含んでなる、複合体TF::NCIS。
- 薬剤としての、請求項30に記載の複合体。
- 被験体における出血の治療のための薬剤の製造における、請求項31に記載の複合体の使用。
- 被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、請求項31に記載の複合体の使用。
- 脂質化TF、FXaおよびNCISを含んでなる、複合体TF::FXa::NCIS。
- 薬剤としての、請求項35に記載の複合体。
- 被験体における出血の治療のための薬剤の製造における、請求項35に記載の複合体の使用。
- 被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、請求項35に記載の複合体の使用。
- 脂質化TFを医薬的に許容可能なベヒクルと共に含んでなる、医薬組成物。
- 脂質化TFの局所投与のための医薬組成物であって、脂質化TFおよび該脂質化TFの局所投与に適した医薬的に許容可能なベヒクルを含んでなる、医薬組成物。
- a)医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項14に記載の製品;または
b)別々に、(i)医薬的に許容可能なベヒクルと共に脂質化TF、および(ii)医薬的に許容可能なベヒクルと共にFXa;または
c)医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項17に記載の製品;または
d)別々に、(i)医薬的に許容可能なベヒクルと共に脂質化TF、および(ii)医薬的に許容可能なベヒクルと共にNCIS;または
e)医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項20に記載の製品;または
f)別々に、(i)医薬的に許容可能なベヒクルと共に脂質化TF、(ii)医薬的に許容可能なベヒクルと共にFXa、および(iii)医薬的に許容可能なベヒクルと共にNCIS;または
g)医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項27に記載のTF::FXa複合体;または
h)医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項31に記載のTF::NCIS複合体;または
i)医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項35に記載のTF::FXa::NCIS複合体
を含んでなる、医薬組成物。 - 局所投与のための医薬的投与形態である、請求項41に記載の医薬組成物。
- 請求項39〜42のいずれか一項に記載の医薬組成物、および支持体を含んでなる、製品。
- 医薬組成物を含む製品であって、
(i)支持体、(ii)医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項14に記載の製品、(iii)医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項17に記載の製品、および(iv)医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項20に記載の製品;または
医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項27に記載のTF::FXa複合体;または
医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項30に記載のTF::NCIS複合体;または
医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項34に記載のTF::FXa::NCIS複合体
を含んでなる、製品。 - 凝固第VII因子欠乏症の被験体における出血の治療のための薬剤の製造のための、非脂質化TFまたはその機能的断片の使用。
- 非脂質化TFまたはその断片の非経口投与のための薬剤の製造における、請求項45に記載の使用。
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