PT89964B

PT89964B - Processo para a purificacao do factor xiii por cromatografia de afinidade

Info

Publication number: PT89964B
Application number: PT89964A
Authority: PT
Inventors: Jurgen Romisch; Werner Stuber; Hartmut Loebermann
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1988-03-11
Filing date: 1989-03-09
Publication date: 1994-05-31
Also published as: DE58902637D1; DE3808048A1; JPH01279898A; GR3007030T3; YU49889A; AU627450B2; EP0332985B1; DK118789A; FI891121A0; US5047506A; KR890014731A; DK118789D0; PT89964A; ATE82130T1; JP2778086B2; EP0332985A3; AU3122489A; EP0332985A2; FI891121A

Description

DESCRIÇÃO

A invenção refere—se a um processo para a pu— «w rificaÇao por cromatografia de afinidade da subunidade a do factor XIII, a uma composição terapêutica e à utilização dea— sa composição terapêutica.

organismo dispõe de dois sistemas em equilí brio para se proteger de hemorragias e de tromboses: o sistema de coagulaçao e o sistema fibrinolitico. A acçao conjunta destes dois sistemas possibilita que antes de estancar o sangue se formem polímeros de fibrina insolúveis que serão pro— gressivamente degradados durante a cicatrizaÇao pelo processo de lisagem da fibrinólise.

A formaÇao de trombos estáveis como produtos finais do processo de coagulaçao e o resultado de um processo

ramificado em cascata, em cujo percurso um enzima já activado . activa por proteólise o enzima formado na cascata, amplifican do assim a resposta do organismo ao ferimento recebido.Um dos últimos passos críticos deste processo ê a polimerizaçao dos monómeros de fibrina. Os monómeros de fibrina orientam-se pa— ralelamente aos outros, após a sua formaçao, sob o efeito de ; forças electroestaticas. Neste estado, no entanto, estão apenas ligados por pontes de hidrogénio e podem voltzr ao estado ** * fluido sob a acçao de reagentes que quebrem pontes de hidroge

M nio, como por exemplo ureia. Consegue—se contudo uma ligaçao covalente entre os monómeros de fibrina na presença de ioes cálcio por meio da formaçao de ligações peptldicas entre os diversos monomeros. O enzima responsável por esta ligaçao cru zada é o factor XIII activado, o chamado factor XIII a.

O factor XIII é um proenzima do sistema de ‘ coagulaÇao do sangue e pode encontrar-ee tanto no plasma como | nas plaquetas. No plasma ocorre como um complexo das subunida , des a e b, que nao se encontram,contudo, ligadas covalentemen ' te entre si, enquanto que a forma existente nas plaquetas con siste apenas na subunidade a. Ambas as formas moleculares do factor XIII tem a mesma funÇao enzimática. Apos a activaçao pela trombina e pelo cálcio, o factor XIII agora activado (fa ctor XIII a) catalisa a formaçao de ligações análogas á peptl dica entre determinados grupos Usina e glutamina na fibrina, por meio do que os monómeros da fibrina se ligam de forma co— valente numa estrutura ramificada.

A falta de factor XIII de origem genética ou uma activaçao de factor XIII diminuída por inibidores conduz I a sérias perturbações da coagulaÇao do sangue. Por esta razao * ** ' desenvolveram—se vários processos para a purificação do fac— í tor XIII tanto do plasma como das plaquetas. Estes processos S em parte muito morosos consistem em vários passos de purifica ί * Λ ^w çao de proteínas, por exemplo precipitação fraccionada com etanol, precipitação com sulfato de amónio e polietilenogli— col, bem como cromatografia da permuta iónica ou flltraçao de

gel. Os autores Jan McDonagh et al. (Biochemica et Biophysica Acta, 446 (1976), 345—357) descreveram pela primeira vez um processo de cromatografia de afinidade para a purificação do factor XIXI. Utilizaram para isso benzoatos de mercúrio sobre ;

agarose. Os processos preveem a ligaçao reversível da subuni_# i dade a do factor XXII do plasma ao composto de mercúrio. Jan j

McDonagh et al. verificaram que a subunidade b do factor do ' plasma, que nao contem ela própria grupos tiol livres e por *» isso nao pode intercatuai' com a matriz cromatografica, conti— nua ligada a subunidade a por forças nao covalentes ate esta ser pre—activada por cisão com trombina e finalmente activada por tratamento final com cálcio· Uma preparaçao de subunida— des a puras é por isso apenas possível, de acordo com o pro— J cesso descrito pelos autores referidos, após tratamento com cálcio e trombina. Alem disso, os compostos de mercúrio por eles utilizados sao altamente tóxicos} por isso, o processo descrito nao pode ser utilizado para a preparaçao de terapeu— J tlcas humanos. ¹ í

objectivo da presente invenÇao é assim conseguir um processo melhorado para a purificaÇao da subunidade a do factor XIII, conseguindo evitar a utilização de compostos tóxicos. (

Consegue—se atingir este objectivo, de acordo com a invenção, com um processo do tipo anterior, em que a subunidade a do factor XIII se liga de forma reversível a uma a» matriz de suporte apropriada para reacçoes de permuta de di— j —sulfureto e se remove da matriz de suporte por meio de uma reacçao com um agente redutor· i

í

A ligaçao reversível da subunidade a do factor XIII a matrizes de suporte apropriadas para reacçoes de permu ta de di—sulfureto tem a vantagem de ae poder evitar a utili— j zaçao de materiais cromatográficoe tóxicos. Além disso, todas ' as proteínas contidas na solução de factor XIII podem separar . —se do factor XIII, devido a uma menor reactividade em rela—

Çbo aos grupos mercapto livres, ou como resultado de um com— portamento diferente do factor XIII na eluição subsequente com um agente redutor das pontes de di—sulfureto. No processo «· de acordo com a invenção podem ainda remover—se as subunida— des b do factor XIII do plaama das ubunidades a. Descobriu—se surpreendentemente que o complexo de factor XIII do plasma, ao contrario da opinião de McDonagh, por meio de incubaÇao em soluçoes contendo cálcio ou magnésio na ausência de trombina, «a se decompoe em subunidades b e subunidades a biologicamente activas. Uma vez que as subunidades b nao possuem elas próprias grupos mercapto livres, existindo em vez disso todos os grupos SH da cisteina na forma de pontes di—sulfureto no eeio das subunidades b, nao se ligam à matriz de suporte e podem remover—ae por lavagem.

O factor XIII obtém—se de preferência a par— tir de homogeneizados com uma elevada concentraÇao de factor XIII· Ê por exemplo o caso de tecidos da placenta e das plaquetas sanguíneas. 0 factor XIII isolado a partir destes mate riais é constituído apenas pela aubunidade a· factor XIII biologicamente activo pode também obter—ae a partir do plasma· Como já se referiu, o factor

XIII do plasma é constituído contudo por um complexo de duas — subunidades nao ligadas covalentemente entre ai, as subunida— des a e b. De acordo com a invenção, a aubunidade biologicamente activa obtém—se a partir deste complexo de factor XIII· as

Para o processo de acordo com a invenção, coloca—ae o factor XIII, independentemente da sua origem, em ao «· a» luçao para purificaÇao por cromatografia de afinidade. Para tal, prepara—se o material biológico em causa, por exemplo por precipitação ou centrifugação das proteínas do sangue de mais as elevado peso molecular ou por homogeneização seguida de cen— as trifugaçao dos tecidos contendo o factor XIII.

Ê conhecido da publfcaçao de C.G. Curtia et

- 4 al. (Biochemistry 13, 197^, 377^—37θθ), que um tratamento do factor XIII com reagentes alquilantes de ioes divalenies do grupo lia da tabela periódica nao tem qualquer influência sobre a actividade biológica do factor XIII. Estes autores conseguiram mostrar que a cisteina activa do factor XIII a na subunidade a se encontra normalmente numa forma protegida. Só apos adiçao simultânea de ioes cálcio se expões esta cisteina «· *» devido a alterações de conformação sendo desse modo suscepti— vel de sofrer alquilaÇaoi o factor XIII a assim totalmente 5— -alq uilado também e inactivo apos cisão com trombina. Verifi— cou—se surpreendentemente que tratando soluçoes contendo factor XIII com agentes alquilantes na ausência de cálcio ou de ioes da mesma valência seguido de purificação por cromatograa» _ fia de afinidade, se pode obter uma preparaçao de factor XIII biologicamente activa de elevada pureza.

Oa agentes alquilantes preferencialmente uti— * * lizados sao iodoacetamida ou acido iodoacetico. De acordo com a invenÇao podem contudo utilizar—se quaisquer outros agentes com a mesma capacidade de alquilaÇao.

Para a alquilaÇao devem empregar—se os agentes alquilantes, de acordo com processos conhecidos do estado da técnica, em concentrações de cerca de 5 a 100 mmol/l. Uma forma de realizaçao prefevencial preve o tratamento com acido iodoacetico a uma concentração de 5 a 50 mmol/l.

a»

De acordo com a invenção efectua—se a alquila çao na ausência de Ca ou de catioes analogos com o mesmo efeito. Se nao for este o caso, sujeita—se o centro activo a «· a» a» alquilaÇao por meio de alterações de conformação da subunida— de a, bloqueando—se desse modo. Utilizam—se nesse caso tam— *· ** 2 “F 2^ poes isentos de ioes Ca ou Mg · a»

Numa forme preferencial de concretização efe— ctua—se a alquilaÇao na presença de agentes quelantes adicionados. Prefere—se em especial a utilização de acido etilenodi

arainotetracetico (EDTA) numa concentração entre 0,001 e 0,1 mol/l.

De acordo com a invenção, a alquilaÇno de so— w w | luçoes contendo factor XIII efectua—se a um pH ao qual nao ocorrem alterações apreciáveis de confortnaçao do factor XIII. j

I

Utiliza-se de preferencia um pH na proximidade do valor de prí fisiológico, isto é, a alquilaçao efectua—se a um pH entre j

6,5 e 8,5· De modo a evitar que, por meio de alterações da es í # 2+ ^etrutura terciaria da molécula induzidas por Ca , se liberte o centro activo da subunidade a, adiciona—se EDTA á misture

X ** .

reaccional de preferencia a concentrações entre Ο,ΘΟΙ e0,04 ***** ¹ mol/l. A alquilaçao efectua—ae então por exemplo com 0,005 a

0,25 mol/l de ácido iodoacético. Ê contudo também possível em | ** # pregar concentrações maiores ou menores de acido iodoacético. Normalmente efectua—se a reacçao num tempo entre 1 e 360 minu «w I tos. De modo a conseguir—se uma alquilaçao completa dos grupos mercapto expostos, deve contudo a reacçao decorrer duran— j f ** í te mais 5 minutos. Nao ha limite para os tempos de reacçao, * * , i podendo contudo obter-se, apos um máximo de 60 minutos, uma | «· I carboximetilaçao dos grupos mercapto expostos.

# **

Apos efectuada a alquilaçao remove—se de novo | da solução o agente alquilante. Isto pode efectuar—se por pro cessos conhecidos do especialista, por exemplo por filtraçao de gel, precipitação do sal β/ou diálise. Pode também empregar—se qualquer outro processo desde que a aubstântla alqui— lante seja removida quantitativamente da solução.

No isolamento da subunidade a activa a partir do factor XIII do plasma tem de aeparar—se esta da subunidade b associada de modo nao covalente. Isto consegue—se de prefe—

A rencia por meio de uma incubaÇao do factor XIII do plasma, eventualmente ja alquilado, com ioes cálcio ou magnésio numa concentração de 0,05 e 0,6 mol/l, de preferencia de 0,05 a 0,2 mol/l. Apos uma incubaçao de 5 minutos a 2 horas na presença de cálcio ou de magnésio as subunldades a e b encontram—se

dissociadas. No isolamento da subunidade a a partir do factor XIII do plasma esta dissociação das subunidades é uma condi— çao necessária para a realizaÇao da adeorpçeo, a seguir descrita» sobre um material adequado para reacções de permuta de di—sulfureto.

A solução contendo factor XIII nao pré—tratada ou já submetida a uma substancia alquilante» poe—se em seguida em contacto com a matriz de suporte apropriada para re— acçoes de permuta de di—sulfureto contendo grupos mercapto li vres. Um material prefeiido apropriado para a reacçao de permuta de di—sulfureto é por exemplo tiolsepharose 4B. A reac- j «m çao pode desenro lar—se tanto num chamado processo batch*¹ (des continuo) como em colunas preparativas. ί

De acordo com a invenção, poe—se a solução contendo o factor XIII em contacto com a matriz, na presença í de ioes cálcio ou magnésio, de preferencia a uma concentra— |

I «e am çao de 0,01 a 0*2 mol/1. A adsorçao deve ocorrer a um pH próximo do fisiológico» de preferência a um pH entre 6,5 a 8*5· !

I

Os grupos mercapto da matriz de suporte activem—se previamente, de acordo com a invenÇao, de acordo com I métodos em si conhecidos» por reacçao com di—sulfureto de di— -2-piridilo» 2,2*-ditiobispiridina—N-óxido, ácido 2»2-dinitro —5,5—ditiodibenzoico» derivados destes compostos ou derivados de ácidos azodicarboxilicos, preparando—se assim para a forma çao das pontes de di—sulfureto com a amostra posteriormente aplicada.

Após a ligaçao do factor XIII á matriz conten do grupos mercapto» lava—se esta matriz com uma solução contendo ioes cálcio ou magnésio numa concentração de 0,01 a 0,2 mol/1. Todos os outros componentes da solução contendo factor XIII que nao interactuam com a matriz, quer por nao conterem eles próprios qualquer grupo cistelna ou então por os seus grupos mercapto jáo estarem alquilados, sao quantitativamente eluídos, e no caso do factor XIII do plasma eluindo-ee também por tratamento com cálcio ou magnésio» as subunidades b separadas das subunidades a·

Num passo processual seguinte elui—se a subunidade a do factor XIII a partir da matriz. Como meio de elu

Μ, içao pode utilizar—se qualquer meio apropriado para reacções de permuta de di—sulfureto* que substitui a subunidade a do factor XIII acoplada á matriz» reduzindo a ponte de di—sul fu— reto entre a matriz e-a subunidade a. Uma forma de realizaçao preferencial é a eluiçao com 0,005 a 0»05 mol/1 de um agente redutor, de preferência ditiotreitol, mercaptoetanol, etanodi 24· 24- ^— tiol, glutationa ou ciatelna, na presença de Ca ou Mg 0,01 a 0,2 mol/1. Uma forma particularmente preferida, que conduz a um aumento de rendimento da subunidade a activa emprega a adiçao de 0,1 a 0,7 g de sacarose/ml de meio de elui— «V

Çao.

Este processo pode nao só aplicar-se ao factor XIII isolado a partir de fontes naturais, mas também a factor XIII obtido por processos de engenharia genética em bactérias, leveduras ou culturas celulares. Além disso pode aplicar—se a qualquer proteína com actividade de factor XIII, deade que a cisteína do centro activo esteja aob a influência de uma alto raçao de configuração por adiçao de ioea cálcio ou de ioes do mesmo efeito.

processo de acordo com a invenção leva a uma preparaçao de factor XIII cuja actividade se mantém aenaivel— s» mente constante durante a purificação.

Segundo o processo de acordo com a invenção o factor XIII obtido pode ser utilizado para composiçoea tera— peuticaa. As compoaiçoea preferidas sao soluçoea contendo fa— ctor XIII que, para além dele, contêm ainda componentes fisio logicamente assimiláveis, como por exemplo cloreto de sódio, albumina, glucose ou sacarose, sendo apropriadas para infusões

- 8 ** 4*

Uma composição terapêutica deste tipo pode empregar—se princi pelmente na terapia de doenças de deficiência de factor XIII. Uma outra utilização preferencial do factor XIII preparado de acordo com a invenção ê por exemplo a mistura com conservas de sangue ou com concentrados de eritrócitos , de modo a man— ter a capacidade de coagulaÇao do sangue fornecido apoe grandes perdes de sangue.

Os exemplos seguintes destinam—se a ilustrar o

4» *» processo de acordo com a invenção para a purificação do factor XIII.

Exemplo 1

R

Activaçao de Tiol—Sepharose 4B com di—aulfureto de di—2—piri— dilo) Reagente de Ellniann ou 2*2*—ditiobiapiridina—N—óxido

Trataram-se en primeiro lugar 50 ml de Tiol— —Sepharose durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) com tampao A (0»05 mol/1 de Tris/HCl» pH 7*5» 0*15 mol/1 de NaCl)i ao qual se adicionaram 0*03 mol/1 de mercaptoetanol.

M

Em seguida lavou—se a resina com tampao A e fez—se reagir com este tampao ao qual ae adicionou ainda 1*5 mmol/l de di—aulfu .4»· « reto de di—2—piridilo. Após activaçao completa e protecção «w dos grupos mercapto da matriz de resina* lavou—se com tampao A e utilizou—se a matriz de resina para a reacçao de permuta de di—aulfureto.

Em vez do di—aulfureto de di—2—piridilo podem empregar—se também para a activaçao* com a mesma molaridade* ácido 2*2·—dinitro—5*5’—ditiobenzoico (Reagente de Ellmann)ou 2*2’—ditiobi spiridina—N—óxido.

Exemplo 2

Reacçao de uma solução contendo factor XIII com tiol—Sepharo— ae 4B activada

Saturaram—se cora sulfato de amónio a 40% (p/v) «w ml de uma solução contendo factor XIII, que continha 7θθΕ de factor XIII (I E de factor XIII corresponde ao teor de factor XIII em 1 ml de plasma normal—citrato).

Dialisou—se o resíduo de sulfato de amónio, durante a noite a 4°C, contra tampao A (exemplo 1) e adicionou—se—lhe em seguida 30 nunol/l de CaCl^· A resina de tiol activada, que se activara como descrito por exemplo no exemplo 1, equilibrou—se com tampao A, ao qual se adicionaram 3θ mmol/1 de CaCl . O dialisado contendo cálcio colocou—se sobre a matriz de afinidade preparada* lavou—se a resina em seguida com tampao A, com 3θ mmol/1 de CaCl e eluiu—se o factor XIII dá com tampao A ao qual se tinham adicionado 15 mmol/1 de ditio— treitol e 3θ mmol/1 de CaCl^· 0 eluído continha 5θθ E de fac— j tor XIII. í

Exemplo 3

A activaçao da tiol—Sepharose 4B e a sua reac çao com uma solução contendo factor XIII, efectuarem—se como descrito nos exemplos 1 e 2* mas adicionaram—se ainda aos tara poes de lavagem e de eluiçao 0,5 S de sacarose/ml de solução. O eluido continha 600 E de factor XIII·

Exemplo 4

Reacçao de uma solução contendo factor XIII de plasma com TioA ' R ......... ---— —Sepharose 4B activada

I

I ** ί

Dialisaram—se 5θ ml de uma solução contendo j factor XIII de plasma, que continha 1000 unidades de factor • O ··

XIII mas sem trombina, durante a noite a 4 C, contra tampao A (exemplo l) e adicionaram—se—lhe em seguida 0,3 mol/l de CaCl e 0,1 g de sacarose/ml. Após um tempo de incubaÇao de 6θ minu 1 o ** tos a 4 C colocou—se a solução sobre uma resina de tiol que fora activada como descrito, por exemplo no exemplo 1, e equi

librada cotn tampao E, constituído por 0,05 mol/l de Trís/HCl, pH 7,5; 0,15 nol/l de NaCl} 0,1 mol/l de CaCl e 0,1 g de sa—

A0 carose/ml. Em seguida, lavou—se a resina com tampao B e eluiu —se con tampao B ao qual se tinham adicionado 20 mmol/l de L— — cist eína· eluído continha 820 E de factor XIII e encontrava—se isento de subunidades B.

Exemplo 5 «S «· AS

Alquilaçao de uma solução contendo factor XIII e reacçao sub— sequente com Tiol—Sepharose 4B activada

Af

Dialisaram—se 5θ ml de uma solução contendo Factor XIII, que continha 700 E de Factor XIII, contra tampao A, ao qual se tinham adicionado 5 mmol/l de EDTA, e incubou— —se com 10 mmol/l de ácido iodoacático, durante 1 hora a RT. Saturou—se a solução com sulfato de amónio a 40% (p/v) e tra— «V tou—se o precipitado como descrito no exemplo 2. Sem adiçao de sacarose obtiveram—se 450 E de Factor XIII no eluído, com sa— m a» carose nos tampões de lavagem e de elulçao, 5°0 E de Factor XIII. Apos a alquilaçao eluiu—se o Factor XIII com muito maior

A» pureza da resina de afinidade, comparado com o Factor XIII nao alquilado.

A actividade biológica do Factor XIII numa ao « AS luçao determinou—se num teste de ligaçao cruzada com fibrina da firma Behringwerke AG· Diluíram—se para isso as amostras numa série de diluições com tampao de barbiturado dietílico— —acetato, a pH 7,6» de l!5i U10, 1220, 1:40, etc. Em seguida,

AS misturaram—se 50 ml de cada diluição de amostra com 0,1 ml de solução de Ca—Trombina—caulino e incubou—se durante 10 minutos a 37°C. Adicionou—se imediatamente a cada uma 1 ml de uma solução a 5% de ácido monocloroacético, incubou—se mais duran re 2 minutos e verificou—se, após agitaçao, a turvaçao de cau

A» lino da solução.

Claims

Processo para a purificaÇao d» sub—unidade a do Factor XIII» por cromatografia de afinidade, caracterizado por se ligar a sub—unidade a do Factor XIII de forma reverei— vel a uma matriz de suporte apropriada para reacçoes de permu ta de di—sulfureto, e se remover da matriz de suporte por meio de uma reacçao com um agente redutor·

-
2» «V

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter a »ub—unidade a do Factor XIII a par tir de homogeneizado de placenta ou de homogeneizado de plaquetas·

-
3· a·

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ae obter a sub—unidade a do Factor XIII a par tir de plasma·

- 4· «*

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ae efectuar um tratamento prévio do Factor * XIII com um agente alquilante·

5^a Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o agente alqullante ser iodoacetamida ou ácido iodoacético.

- 6« Processo de acordo com a reivindicação 4, ca—
4^ ** racterizado por se efectuar a alquilaÇao na ausência de ioes Ca e Hg · i

- 7^a Processo de acordo com a reivindicação 4, ca— «· racterizado por se efectuar a alquilaÇao na presença de substancias quelantes, de preferência ácido etilenodiaminatetra— j acético (EDTA), numa concentração de 0,001—0,1 mol/1, em espe j ciai de 0,002—0,02 mol/1· !

Processo de acordo com a reivindicação 1, ca— racterizado por se libertar previamente a sub—unidade a do Fa ctor XIII, do complexo de Factor XIII no plasma, por incubação com Ca^⁺ ou Mg²⁺ numa concentração de 0,05—0,6 mol/1, de preferência de 0,05—0*2 mol/1·

9« - 13 i

I

Processo de acordo cora a reivindicação lj ca— racterizado por se por em contacto uma solução contendo Fac— tor XIII com uma matriz de suporte contendo grupos mercapto, p

de preferzncia Thiolsepharose ' 4B.

10 a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a ligaÇao à matriz de suporte se efectuar na presença de Ca^⁺ ou Mg^⁺, de preferência numa concentração de 0,01—0,2 mol/l, de preferência a um pH de 6,5—8,5·

- lia Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se ter activado previamente a matriz de supor «M te por reacçao com di—sulfureto de di—2—piridilo, 2,2*—ditio— bispiridina—N—óxido, ácido 2,2*—dinitro—5,5* —ditiobenzoico, com derivados destes compostos ou com derivados do ácido azi— docarboxilico.

- 12a !

Processo de acordo com a reivindicação 1, ca— ! racterizado por se elulr o material ligado á matriz de suporte com 0,01—0,2 mol/l de Ca^⁺ ou de Mg^⁺ e 0,005—0,05 mol/l de um agente redutor, de preferência ditiotreitol, mercapto— etanol, etanoditiol, glutationa ou cisteina e, conforme o caso, com 0,1-0,7 g/ml de sacarose.

- 14 13^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o Factor XIII ser a proteína natural, um Fac tor XIII preparado por engenharia genética ou as respectivas sub—unidades a e/ou qualquer proteína natural ou preparada ar tificialmente com actividade de Factor XIII.

I !

í

A requerente declara que o primeiro pedido dea ta patente foi apresentado na República Federal Alema em 11 de Março de 1988, eoh o n° P 38 08 048. 6.