JPS62502797A - ゴムポリメラ−ゼ及びその製造法と使用法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は実質的に純粋な形のゴムポリメラーゼ類（ｒｕｂｂθｒｐｏ１７ｍｅｒ ａｅθＧ）、それらの製造法及び天然ゴム、特に高分子量天然ゴムのインビトロ 合成におけるそれらゴムポリメラーゼ類の使用に関する。

天然ゴムは各稲科に属する数千の植物に見い出される。数種の菌も天然ゴムを合 成すると報告されている。はとんどの植物及び菌類の全ては極くわずかのゴムし か含有せず、そのダムの分子量も低過ぎて商業的価値はない。

ルゴムノキ）である。Ｈ，プラジリエンシスが主天然ゴム源である。今世紀の初 めの頃はグアニールゴムツキが商業的天然ゴム源で、１９１０年の全世界の供給 量の１０％を占めていた。第二次世界大戦中東南アジアがらの米国への天然ゴム の供給が止ったとき、米国、フォーレスト・サービス（Ｕ、Ｓ、ＦｏｒｅｓｔＳ ａｒｖｉ（Ｈｅ）　は緊急ゴムプロジェクト（Ｅｓｅｒｇｅｎｃｙ　Ｒｕｂｂｅ ｒＰｒｏｊｅｃｔ）の−環としてグアニールゴムツキの大規模栽培を行った。戦 争が終結したとき、Ｈ，プラジリエンシスゴムが低価格で容易に入手できるよう になると、グアニールゴムツキは天然ゴム源として魅力のないものになった。Ｈ ，ブラジリエンシスの優勢は今日まで続いている。しかし、最近の経済的、政治 的動向は高分子量天然ゴムに代る代替ダム源の開発を促している。

これらゴム源の１つがイン　ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）合成である。

Ｈ，ズラジリエンシスにおけるゴムの生合成経済は十分に解明され、アーチャー （Ａｒｃｈｅｒ）及びオートレー（Ａｕｄｌｅｙ）の２１（４）：　３８９−４ ０６．１９６９に述べられている。ゴムの生合成における最終工程は溝累ゴムホ リメラーゼによる触媒反応で、これはラテックス中に認められる。この酵素はイ ソペンテニルピロホスフェ−）　（工ＰＰ）　１７）アリル系ヒＯホス７　ニー 　）（ａｌｌｙｌｉｃ　ｐｙｒｏｐｈ、ｏｓｐｈａｔｅ）に対する重合反応を触 媒してゴムを造り、同時に無機ピロホスフェートを生成させる。この酵素はまた ゴムトランスフェラーゼ（ｒｕｂｂｅｒ　ｔｒａｎｓｐｈｅｒａＩ３ｅ）又はシ ス−１，４−ポリインプレンピロホスフエート：イソベンテニルピロホスフェー ト　シス−１，４−ポリイソプレニルトランスフェラーゼとも称されている。そ れはプレニルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素群の一員で、工ＰＰ　を色々の 鎖長と立体化学配置のものに重合させる。。ゴムポリメラーゼ“という用語は本 明細書では上記酵素を述べるために用いられる。

Ｈ，ブラジリエンシスラテックスにおいて、酵素は主としてゴム粒子と合体して いるが、溶解して遊離状態で存在しているものも認められる。前記のアーチャ及 びオートレーの雑文を参照。ゴムの合成はゴム粒子の表面で起こる。前記リネン の雑文を参照。多数の研究所でゴムポリメラーゼの研究が行われてきたが〔前記 アーチャー及びオートレーの雑文；前記リネンの報文；アーチャー及びコックベ イン（Ｃｏｃｋｂａｉｎ）のＭｅｔｈｏｄｓｉｎ、　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１ ５：４７６−４８１　、１９６９）、それにも係わらず本発明の以前にＨ，プラ ジリエンクス又は他のゴム源からゴムポリメラーゼを実質的に純粋な形で製造す るのに成功したものはなかった。

実質的に純粋な形のゴムポリメラーゼにはゴム工業にとって非常に重要な幾つか の用途がある。酵素は固定化されたものでも、あるいは溶解、遊離しているもの でも、天然ゴムを４７を加工して最終製品、例えばタイヤにする工場に近い場所 で天然ゴムを製造するのを可能にするだろう。更に、イン　ビトロで造られた天 然ゴムはＨ，ズラジリエンシスのラテックスから製造した天然ゴムより更に優れ ているだろう、というのは天然ゴムをイン　ビトロで製造する条件は一層高純度 の、又は他の望ましい化学的又は物理的な性質を持つ天然ゴムが生成するように コントロールすることかできるからである。例えば、このイン　ビトロのゴムは 一層均質であり、また天然ゴムのある種の適用を妨害する可能性がある蛋白質及 び脂質を実質的に含まもう１つの重要な用途は実質的に純粋なゴムポリメラーゼ に対する抗体を製造することである。斯る抗体は生体内に含まれるゴムポリメラ ーゼの量を定量する植物及びその他の生体の選別法を開発するのに用いることが できる。

更に他の重要な用途において、精製された酵素は序列化（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）す ることができ、この酵素のセクエンスを用いると、ゴムポリメラーゼの遺伝子又 は遺伝子のプローブを合成することができる。酵素に対する遺伝子が一亘同定さ れたら、天然ゴムの製造能を他の生体に導入することができる。最後に、酵素の セクエンスと構造について更に知りたいときは、特定部位の突然変異誘発法を用 いて変化した触媒特性を持つゴムホリントロールを可能にする。

発明の要約 本発明の目的は実質的に純粋なゴムポリメラーゼと斯るポリメラーゼの同等以上 の性質を持つ活性同族体を提供することである。

本発明のもう１つの目的はゴムポリメラーゼの単離、精製法を提供することであ る。

本発明の池の目的は実質的に純粋なゴムポリメラーゼを使用して天然ゴム、特に 高分子量の天然ゴムを製造する、又は共重合体を製造する方法を提供することで ある。

本発明の更に他の目的は天然ゴノ・、特に高分子量の天然ゴムの製造法において 用いられる物質の製造法を提供することである。

これらの目的を達成するために本発明によれば実質的に純粋な形のゴムポリメラ ーゼが開示される。１つの好ましい態様において、ゴムポリメラーゼはへペア　 ブラジリエンシスのラテックスから実質的に純粋な形で回収される。もう１つの 態様において、ゴムポリメラーゼ活性を持つ少な（とも１個の活性サイトを有す る実質的に純粋なポ１Ｊ　６プチドである活性同族体が提供される。活性サイト はへペアブラジリエンシスのラテックスから回収したゴムポリメラーゼと実質的 に相同であるか、そのようなゴムポリメラーゼと酵素的に同等の機構で機能する 。

更に他の態様において、活性サイトは高ゴムポリメラーゼ活性を有するポリペプ チドを形成すべ（変えられている。本発明の特に好ましい態様によれば、ゴムポ リメラーゼは単量体性で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気 泳動法で測定して約３６，０００〜約４４，０００の分子量を有する。

本発明によれば、ヘベア属の植物からラテックス中のゴム粒子と結合したゴムポ リメラーゼと溶解して遊離の形を取っているゴムポリメラーゼを含有する化学的 に安定化されたラテックスを製造し；ラテックスから溶解、遊離しているゴムポ リメラーゼを分離し；そして分離されたゴムｓ９　リメラーゼを精製することに よって実質的に純粋な形のゴムｓｑ　ＩＪメラーゼを製造する方法が提供される 。化学的に安定化されたラテックスはポリヒドロキシ化合物、抗微生物剤及び緩 衝剤を含む安定化用組成物をラテックスに加えることによって製造される。好ま しい態様において、安定化用組成物はスルフヒドリル化合物を更に含む。

溶解、遊離しているゴムポリメラーゼはクロマトグラフィーでラテックスから分 離される。イオン交換クロマトグラフィーポリメラーゼを透析して透析液を得、 これにゲルを加えてゲル−ポリメラーゼコンプレックスを形成し、コンプレック スを分離し、コンプレックスからポリメラーゼを取り外し、取り外されたポリメ ラーゼをゲル濾過クロマトグラフィーに供してゴムｓｑ　ＩＪメラーゼを実質的 に純粋な形で生成させることによって精製される。

もう１つの好ましい態様において、ポリメラーゼは化学的に安定化されたラテッ クスを固定化された、ゴムポリメラーゼに対する抗体と接触させてゴムポリメラ ーゼ−抗体コンプレックスを形成し、コンプレックスを分離し、そしてコンプレ ックスからゴムポリメラーゼを回収することによって分離、精製される。別の態 様において、ゴムポリメラーゼは溶解、遊離しているゴムポリメラーゼを固定化 された、ゴムポリメラーゼに対する抗体と接触させてゴムポリメラーゼ−抗体コ ンプレックスを′形成し、コンプレックスを分離し、そしてコンプレックスから ゴムポリメラーゼを回収することによって精製される。

本発明はまたインにンテニルピロホスフエート、アリル系ピロホスフェート及び 実質的に純粋なゴムポリメラーゼを含有する反応混合物を形成し、この反応混合 物を天然ゴムが生成するのに十分な時間インキュベートし、そして生成天然ゴム を回収することによって天然ゴムを製造する方法を提供する。好ましい態様（Ｃ おいては、高分子量の天然ゴムが製造される。

別の態様ておいて、インペンテニルピロホスフェートと少なくとも１種の他の共 重合可能な単量体、アリル系ピロホスフェート及び実質的に純粋なゴムポリメラ ーゼを含有する反応混合物を形成し、この反応混合物を共重合体が生成するのに 十分な時間インギュイートし、そして生成共重合体を回収することによって共重 合体を製造する方法が提供される。

本発明はまたイソはンテニルピロホスフエート、インベンテニルピロホスフエー トイソメラーゼ、二価の金属イオン、ホスファターゼインヒビター及び緩衝剤を 含有する反応混合物を形成し、この反応混合物をジメチルアリルピロホス７エー トカ生成するのに十分な時間インキュベートし、そして生成ジメチルアリルピロ ホス７エートを回収することによってジメチルアリルピロホス７エートを製造す る方法に関する。

本発明の更に他の目的及び利点は以下の記述において説明され、また一部はその 記述から明白である力２又は本発明の実施によって仰ることができるだろう。こ れらの目的及び利点は後記請求の範囲において特に指摘される手段と組合せによ って実現、達成することができる。

発明の詳細な説明 本発明の現在のところ好ましい態様を参照して本発明の詳細な説明する。これら の態様は後記の実施例と共に本発明の詳細な説明するのに役立つものである。

本発明はゴムポリメラーゼ、特に実質的に純粋な形で単離、製造されたゴムポリ メラーゼに関する。本明細書で用いられている１ゴムポリメラーゼ０という用語 はインはンテニルピロホスフエート（ＩＰＰ）とアリル系ピロホスフェートから の天然ゴム（シス−１，４−ポリイソプレン）の形成反応を触媒するポリペプチ ドを意味する。また、”実質的に純粋な１という用語及び胃実質的に精製された ”といつ用語は、本書に開示されるゴムポリメラーゼを指して用いられるときは 、ゴムポリメラーゼではない蛋白質又はポリペプチドを実質的に含まないゴムポ リメラーゼを意味する。本発明の実質的に純粋なゴムポリメラーゼは重量で少な くとも７５チ、好ましくは少なくとも８５チ、最も好ましくは少なくとも９０％ 純度である。即ち、本発明の実質的に純粋なゴムポリメラーゼは２５％以下、好 ましくは１５％以下、最も好ましくは１０チ以下しか、ゴムポリメラーゼでない 蛋白質又はポリペプチドを含有しない。

好ましい態様において、本発明のゴムポリメラーゼはユ／％？７ブラジリエンシ スのラテックスから回収される。このゴム４リメラーゼはビデシル硫酸ナトリウ ムポリアクリルアミビゲル電気泳動法で測定して約３６，０００〜約４４，００ ０のサブユニット分子量を有する。この酵素の活性体はゲルヂ過クロマトグラフ ィーで測定して単量体性である。

本発明のゴムポリメラーゼは次の方法で実質的に純粋な形で製造することができ る。

（イ）二ご１属の植物から化学的に安定化されたラテックスを製造し； （ロ）溶解、遊離しているゴムポリメラーゼをラテックスから分離し；そして （／→　分離されたゴムポリメラーゼを精製する。

ゴムポリメラーゼの精製には大量のラテックス源が必要になる。輸送中に、凝集 、発酵を防ぐためにラテックスは安定化しなければならない。凝集、発募はポリ メラーゼの活性を損う。

普通、このような安定化はラテックスを冷却又は凍結することによって行われて いた。しかし、この安定化は面倒で、コストの高い操作である。本発明はラテッ クスを環境温度で輸送できろように化学的に安定化する手段を提供する。こうし て安定化されたラテックスは少なくとも１０日間は、凝集、発酵の徴候があって も、まれであって、高水準で活性ゴムポリメラーゼを保持している。

このラテックスの安定化法はラテックスに安定化用組成物を添加することから成 る。安定化用組成物はポリヒドロキシ化合物、抗微生物剤及び緩衝剤から成る。

好ましい態様において、安定化用組成物はシスティン又はグルタチオンのような スルフヒドリル化合物も含有する。スルフヒドリル化合物はポリメラーゼを安定 化するのを助ける。特に好ましい態様において、安定化用組成物はｍ液となって いる。約１〜約１０容量、好ましくはおおよそ２容量の安定化用溶液がおおよそ １容量のラテックスに混入される。

好ましいポリヒドロキシ化合物にはグリセロール、ソルビトール、スクロース等 がある。グリセロールが特に好ましい。ポリヒドロキシ化合物はゴムポリメラー ゼを安定化し、またゴムポリメラーゼを取り込んでしまうか、さもないと失活さ せてしまうと思われろラテックス中のゴム粒子の凝集を妨げると思われろ。

抗微生物剤も凝集、発酵防止の助けになる。好ましい抗微生物剤はアジドナトリ ウムである。

緩衝剤はｐＨが極端にずれてしまうのを防ぐ。このようなｐＨの変化が起こると 酵素を失活させる。緩衝剤として何を選ぶかは重要でないが、重炭酸す）　ＩＪ ウム又は燐酸カリウムが特に有用であることが分った。特に、０．１Ｍの重炭酸 ナトリウム又は０．１Ｍの燐酸カリウムが好ましい。

好ましい態様において、安定化用溶液は約１０〜約８０重量／容量係のグリセロ ール、約０．００１〜約１重量／容量チのアジドナトリウム及びおおよそ０．１ Ｍの重炭酸ナトリウムから成る。重炭酸ナトリウムのｐＨは安定化用混合物を含 有する溶液のｐＨを約７〜約１２、好ましくは約８にするように調整される。特 に好ましい態様において、安定化用溶液はおおよそ５０重量／容量チのグリセロ ール、おおよそ０．３重量／容量チのアジドナトリウム、おおよそ０．１Ｍの重 炭酸ナトリウム及びおおよそ５ｍＭのシスティンから成る。上記のようにして安 定化されたＨ、ブラジリエ／シスのラテックス中のゴムポリメラーゼのおおよそ １０〜２０％は溶解して遊離状態になっている。酵素の残りはラテックス中のゴ ム粒子にしつかり結合している。

結合酵素はそれを失活させずにゴム粒子から分離するのが極めて困難である。本 発明は溶解、遊離しているゴムポリメラーゼをその活性を保持しつつ単離し、実 質的に精製するのを可能にするものである。

遊離のゴムポリメラーゼはこの技術分野において一般によ（仰られている分離技 術でラテックスから分離することができる。

この分離技術を当業者は本明細書の教示にてらして本発明に適合させることがで きるだろう。クロマトグラフィーが特に好ましい。特に、アニオン交換樹脂を使 用するイオン交換クロマトグラフィーが用いられる。好ましい樹脂はジエチルア ミノエチル（ＤＥＡ、Ｅ）　セルロースである。樹脂は遊離ゴムポリメラーゼが その樹脂に結合するようにラテックスに混入される。樹脂を次に遠心分離で取り 出し、洗浄する。樹脂から周知の方法で酵素を溶離する。若干のゴム粒子も樹脂 に結合して溶離される。

これらのゴム粒子は超遠心分離で酵素から分離することができ、捨てられる。分 離操作は約Ｏ〜約３０℃の温度で行うことができるが、約Ｏ〜約４℃の温度で行 うのが好ましい。

この時点では酵素は部分的に精製されているに過ぎない。この酵素は当業者が本 明細書の教示にてらして本発明に適合するようにすることができるこの技術分野 で周だの方法で更に精製することができる。このような方法にはクロマトグラフ ィー（アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サ イズ排除クロマトグラフィー及び吸着クロマトグラフィーを含む）、沈殿法、透 析法、遠心分離法、電気泳動法、等電点電気泳動法（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　 ｆｏｃｕｓｉｎｇ）並びにそれらの変法及び組合せ法がある。これら方法の１つ 又は２つ以上を分子の物理的、化学的特性により分子を分離するように設計され た操作において逐次的に用いられる。これらの特性にはゴムポリメラーゼの疎水 度、電荷及び分子量がある。各方法の実施後に得られる物質の様々の画分な高分 子量天然ゴムの形成反応に対するそれらの触媒能を調べるためにテストする。こ れらのテスト法の１つはリネンのｃＴ、Ｒｕｂｂｅｒ　Ｒｅｓ、Ｉｎ５ｔ、Ｍａ ｌａｙａ。

２１（４）：　３８９−４０６．１９６７に記載されている。この雑文を本発明 に引用、参照するものとする。ゴムポリメラーゼ活性を示す両分を次にこの逐次 操作における次の方法に供し、そして新しい両分を再びテストする。この工程を 天然ゴムの形成反応に対する触媒能を有する唯一の画分が残り、かつその両分が 重量で少なくとも７５％、好ましくは少な（とも８５％、最も好ましくは少なく とも９０％の活性ゴムｓ、ＯＩＪメラーゼを含有するようになるまで繰り返す。

これらの精製工程は約０〜約３０℃の温度で行うことができるが、約Ｏ〜約４℃ の温度で行うのが好ましい。

好ましい態様において、イオン交換樹脂から回収された、部分的に精製されたゴ ムポリメラーゼは分子量が１２，０００〜１４．０００未満の物質を全て除去す るように設計されたセルロースの膜を通して透析される。透析媒体はおおよそ５ ．５〜６．７のｐＨを持つ標準後」浴液である。おおよそ６．２のｐＨが好まし い。この透析で溶液のイオン濃度が減少し、また塩及び安定化剤が除かれること によってそのｐＨがおおよそ６．２まで低下する。また、酵素のインヒビター類 も除かれるようである。同じ目的を達成するこの技術分野で公知の他の方法も使 用できる。

溶液のイオン濃度を下げるのは酵素の効率的な精製に重要である模様である。

透析液を次に蛋白質又はポリペプチドに対する吸着剤、例えばアルミナＣガンマ −と２およそ１時間混合する。吸着剤はポリメラーゼのインヒビターを除去する ようであるが、しかしその使用は精製に対して臨界的なものではないと考えられ る。吸着剤は遠心分離によって除去される。

ゴムポリメラーゼを含有する上澄液を次に０．１〜１０容量の、酵素とコンプレ ックスを形成するゲル、例えば燐酸カルシウムと混合する。この混合物をおおよ そ１〜１００分攪拌する。

３０分が好ましい。混合物は約１０〜１００分間、好ましくは５０分間放置する のが望ましい。コンプレックスを次に遠心分□　離で取り出し、その上澄液は捨 てろ。次に、コンプレックスを緩衝液で洗浄し、そして酵素を溶離する。この時 点で、溶離された物質はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳 動に付すとほぼ２個又は３個のメジャーバンドと幾つかのマイナーバンドを生成 させる。

溶離された物質を次にゲル濾過クロマトグラフィーにかける。

これによって実質的に純粋な、最も好ましくは少なくとも９０重量％純度のゴム ホＩＪメラーゼが生成される。所望によっては、この実質的に純粋なゴムポリメ ラーゼはクロマトグラフィーで更に精製することができる。特に、アフイニティ クロマトグラフイー又はイオン交換クロマトグラフィーが好ましい。

ゴムポリメラーゼの実質的な精製はこの酵素に対する抗体の製造を可能にする。

抗体は高度に特異性で、それに抗して生じせしめられたポリペプチドについて高 い親和性を有する。抗体が不溶性マトリックスに結合すると、抗体はそれに対し て生じせしめられたポリペプチドの、蛋白質性物質及びその他の物質の複雑な混 合物からの容易で効率的な分離を可能にする。即ち、固定化された抗体を上記混 合物と接触させ、ゴムホＩＪメラーゼを抗体に結合させる。この混合物を次に除 去し、抗体に結合したポリメラーゼを含有する不溶性マトリックスを洗浄して混 合物の余分の痕跡を除去する。ポリメラーゼを次に抗体から溶離、分離する。こ のように抗体を使用する方法はこの技術分野では周知で、７−ルー　ｘ、　コー プス（Ｒ＋５ｃｏｐｅｓ）　著Ｐｒｏｔｅｉｎヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）　 ニスプリンジャー・バーラグ（Ｓ　ｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ）　、　１９８ ２　）　第１３２〜１３６頁に記載されている。

この文献を本明細書で引用、参照するものとする。

本発明において、化学的に安定化されたラテックスから分離された後の溶解、遊 離しているゴムポリメラーゼはゴムポリメラーゼに対する固定化抗体と接触せし められ、ポリメラーゼ−抗体のコンプレックスを形成する。これらのコンプレッ クスを溶液から分離し、そのポリメラーゼをコンプレックスから実質的に純粋な 形で溶離させる。別法として、化学的に安定化されたラテックスそれ自体を固定 化抗体と接触させ、ポリメラーゼーー抗体コンプレックスを形成させることもで きる。これらのコンプレックスを次にラテックスから分離する。このポリメラー ゼ−抗体コンプレックスの若干がゴム粒子に結合されることもあり、また酵素の 溶離時に酵素の若干もゴム粒子に結合されることがある。結合酵素を有するゴム 粒子は遠心分離で分離することができ、後には実質的に精製されたゴムポリメラ ーゼが溶解して残される。

ゴムｙｙ＋）メラーゼに対する抗体はこの技術分野で周昶の各種方法で製造する ことができろ。ポリクローナル抗体はゴムポリメラーゼをウサギ、ヤギ、ウマそ の他の動物に注射することによって製造することができる。次に、その動物から 採血する。

抗体の存在は１２５工で標識した蛋白質Ａを用いる抗体−抗原集合体の二重拡散 法又は同検出法（ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｏｒｄθｔθｃｔｉｏｎ ）　のよう１よ方法で確認することができる。ポリメラーゼの抗体は血清から回 収される。一般的には、抗体は部分的に精製することが必要なだけである。別の 態様においては、モノクローナル抗体がポリクローナル抗体の代りに用いること ができる。つまり、それらはゴムポリメラーゼと他のポリベゾチドを含有する部 分的に精製された混合物だけと処理する場合に好ましいと思われる。モノクロー ナル抗体はコーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルステイア　（Ｍｉｌｅｔｅｉｎ） 著Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５゜１９７５の方法を用いて製造することができ る。この文献を本明細書で引用、参照するものとする。

これらの抗体シエ回収又は製造しようとする特定のゴムポリメラーゼを抗原とし て使用することによって造る必要はない。もし、色々なタイプの植物で造られた ゴムポリメラーゼが互いに同一であるか、又は実質的に類似であるならば、その ようなポリメラーゼに対する抗体は別のゴム生成植物から得られるゴムポリメラ ーゼに結合すると思われる。そうすれば、抗体を用いて蛋白質物質を精製するた めの周仰の技術とニコ王属の植物から実質的に純粋なフ゛ムボ゛リメラーゼを製 造する本発明の教示とを結合すると、いかなる生体についてもそのゴムポリメラ ーゼの製造能をテストできるようになり、そしてそのような能力が見い出される とすれば、そのようなポリメラーゼの単離、精製が可能になるだろ５゜ 抗体を固定化し、ゴムポリメラーゼを含有する混合物と接触させるのに各種の方 法を用いることができる。免疫吸着剤アフイニテイクロマトグラフイー（：Ｌｍ ｍｕｎＯａｂＳ　Ｏｒｂｅｎ　ｔａｆ　ｆ　１ｎ　ｉｔ７ｃｈｒｏｍａｔｇｒａ ｐｈｙ）の方法が好ましい。この方法において、抗体はカラムの中で吸着剤、例 えば又化シアノジエン活性化アガロースと結合される。ゴムポリメラーゼが固定 化抗体と十分に相互作用することができるように混合物が十分に遅い速度でカラ ムに流される。カラムを洗浄し、次いで溶離してポリメラーゼを抗体から取り外 すことが１きる。ポリメラーゼを溶離するりに洗浄剤又は他の緩衝剤が用いるこ とができる。

前記のよ５Ｋ、天然ゴムは色々な種の植物に見い出される。

Ｈ，ブラジリエンシスは好ましい商業的な天然ゴム源であって、ヘベア属の大体 ９つの種のうちの１つである。他の種におけるゴムの生合成はＨ，プラジリエン シスの場合はど十分には研究されていないけれども、他の種もＨ，ノラジリエン シスから単離、精製されたポリメラーゼと同一の、又は実質的に類似したコ゛ム ポリメラーゼを含有していると思われる。同様に、グアコールゴムツキに見い出 されるゴムポリメラーゼもＨ，プシジリエンシスからのポリメラーゼと同一であ るか、又は実質的に類似していると思われる。このようなゴムポリメラーゼはＨ ，ズラジリエンシスのラテックスに見い出されるゴムポリメラーゼと酵素的には 同等である。即ち、それらポリメラーゼは工ＰＰとアリル系ピロホスフェートか らの天然ゴムの合成反応を触媒する。

従って、本発明の教示は天然ゴムを産生する他の植物からのゴムポリメラーゼの 単離、精製にも適用することができ、そのようなポリメラーゼも本発明の範囲に 入るものである。

構造が共通の元素から構成され、同様の作用機構を有し、比較的わずかのアミノ 酸残基においてだけ互いに異なる一層のビムホリメラーゼも本発明の範囲に入る 。種々の植物から単離されることに加えて、そのような群のポリメラーゼが、製 造された抗体によってニー＜７　ズラジリエンシスのラテックスから精製された 本発明のゴムポリメラーゼといったん同定され、単離されると、それらのポリメ ラーゼは周却の方法で存在しているものの化学的修飾又は遺伝的修飾、例えば特 定部位の突然変異誘発法によって製造することができる。化学的修飾は元のポリ メラーゼの活性を高めることができるか、またはそのような活性に対して影響が ない。更に、本発明は活性ゴムポリメラーゼの遺伝子のコーディングのクローニ ングも可能にする。この遺伝子がいったんクローニングされろと、修飾された遺 伝子の各種宿主への塩基５換及び導入によって活性物質の無数の修飾がなされ得 る。

本発明のゴムポリメラーゼはそれらの活性には必要でない１個又は２個以上のア ミノ酸セクエンスを含有していてもよいものである。斯るセクエンスは周仰の方 法で外すことができろ。

例えば、トリプシン又はパ・ξインあるいは関連蛋白質加水分解酵素のような酵 素を用いて制限された蛋白質加水分解性消化によって不要なアミノ酸セクエンス を容易に外すことがでさる。

か（して、このようなゴムポリメラーゼも本発明の範囲に入るものである。

本発明のゴムＨｚ　ＩＪメラーゼはおおよそ１，０００〜２，０００，０００の 範囲内の所望とする任意の分子量を有する天然ゴムを製造するのに用いることが できろ。このようなゴムはイソペンテニルピロホスフェート、アリル系ピロホス フェート及び精製された、又は実質的に精製されたゴム４　リフ２−ゼを含有す る反応混合物を形成し、この反応混合物を天然ゴムが生成するのに十分な時間イ ンキュイードし、そして生成ゴムを回収することによって製造することができる 。本発明の精製された、又は実質的に精製されたゴムｙｙ＋）メラーゼは競争反 応を制限すると思われる。

これは汚染が少ない生成物を与え、従ってこれを更に精製−ｒるのが一層容易で 、かつ安価である。

アリル系ピロホスフェートは低分子量又は高分子量の天然ゴム粒子か、又はジメ チルアリルピロホスフェ−）、（ＤＭＡＰＰ）のよ５７ｚ開始剤であることがで きる。低分子量の天然ゴムを用いる場合、この方法でそのような低分子量天然ゴ ムはそれより高で製造されろ天然ゴムの分子量は反応時間、工ＰＰ対アリル系ピ ロホスフェートの比率、アリル系ピロホスフェートの分子量及びそれらの組合せ を変えることによってコントロールすることができる。好ましい態様において、 高分子量天然ゴムを製造するのに２〜１０ｍＭのＩＰＰ、３〜５０μＭのＤＭＡ ＰＰ、　０．１〜１チ（重量／容量）のゴム粒子及び０．１〜１％（重量／容量 ）の実質的に純粋なポリメラーゼが用いられる。

好ましい態様において、反応混合物は二価の金属イオン、重金属のキレート化剤 、酵素安定化剤及び緩衝剤も含有する。好ましい二価金属イオン源は埴化マグネ シウムである。二価金属イオンは反応に必要である模様であるが、他の試剤のほ とんどに痕跡夏の即　のようなイオンが認められるので反応混合物に塩化マグネ シウム又は同様の化合物を添加することは本質的なものとは思われない。反応混 合物中の塩化マグネシウムの濃度は０〜１００拓Ｍの範囲であることができる。

使用する場合、その濃度は０．０１〜１００ＭＭ　の範囲であることができる。

好ましい濃度は１〜１０ｍＭ　である。

重金属キレート化剤は、ｆ　＋）メラーゼの保護剤であるが、反応に対しては臨 界的であるとは思われない。エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）ジカリウ ムが特に好ましい。その濃度はＯ〜１００　ｍＭ　の範囲であることができる。

使用する場合、そのａ宜は０．０１〜１００ｍＭ　の範囲であることができる。

好ましい濃度は５〜１０ｍＭ　である。

システィン及びグルタチオンのようなスルフヒト９リル化合物もポリメラーゼの 保護剤であるが、それらは反応に対しては臨界的なものではない。グルタチオン が特に好ましい。その濃度範囲は０〜１００ｍＭである。使用する場合、その濃 度範囲は０．０１〜１００ｍＭである。好ましい濃度は１〜１０ｍＭである。

反応は約５〜約１０のｐＨで行うことができる。好ましいｐＨは約７〜約８であ る。ｐＨは緩衝剤でコントロールされる。多数の異なる緩衝剤が使用でき、満足 すべき結果を与え−る。

トリス緩衝剤（Ｔｒｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ）（）リス（ヒドロキシメチル）ニトロ メタン）を用いるのが好ましい。その濃度は１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲であること ができる。最適濃度は０．１〜１．６Ｍである。

反応は約４〜約６０℃の温度で約１〜約１６時間行うことができる。温度どして 約３０℃が、また反応時間と１−て約４〜８時間が好ましい。

ＤＩ、ＩｆＡＰＰはインペンテニルピロホスフェート、インペンテニルピロホス フェートイソメラーゼ、二価金属イオン、ホスファターゼインヒビター及び緩衝 剤を含有する反応混合物を形成し、この反応混合物をインキュベートし、そして 生成りＭＡＰＰを回収することによって製造することができる。ＤＩＡＡＰＰは カットオフ分子量が１０，０００である膜により混合物を濾過することによって 回収することができる。ＤＭＡＰＰはＦ液中に存在する。

反応混合物は約３５〜４０℃、好ましくは３７℃の温度で約１〜２時間インキュ ベートするのが好ましい。好ましい二価金属イオンはＭ、９　で、好ましいホス ファターゼインヒビターは弗化ナトリウムである。許容できる緩衝剤は重炭酸ナ トリウムである。工ＰＰイソメラーゼはこの技術分野で公昶の方法で製造するこ とができる。１つのそのような方法はアグラノフるものである。この和文を本明 細書で引用、参照するものとする。

別の態様において、精製された、又は実質的に精製されたゴムポリメラーゼは工 ＰＰと少なくとも１種の他の共重合可能の単量体、及びアリル系ピロホスフェー トから共重合体を前記の天然ゴムの製造法と同様の条件下で製造するのに用いる ことができる。適当な共重合性単量体はブタジェン、スチレン、アクリロニトリ ル及びその他のビニル単量体である。共重合体の分子量は反応時間、ＩＰＰＰＰ ジアリル系ピロホスフェート率、アリル系ピロホスフェートの分子量、共重合性 単量体の量及びそれらの組合せを変えることによってコントロールすることがで きる。

本発明の方法で製造した天然ゴムはこの技術分野で周矧の方法で検定することが できる。特に、そのような方法にはオゾン書で引用、参照するものとする〕、逆 相薄層クロマトグラフィー〔ブイ（Ｂｕｉ）及びアームストロング（Ａｒｍｅｔ ｒｏｎｇ）の文を本明細書で引用、参照まるものとする〕及び溶剤抽出法〔ばネ デイクト（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ）等のＰｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、７２：８９ ７−８９９．１９８３−この和文な本明細書で引用、参照するものとする〕があ る。

本発明の教示の具体的な問題又は環境に対する適用は本明細書に含まれる教示に てらして当業者の能力の範囲内にあることを理解すべきである。本発明の生成物 の例、それらの製造法及びそれらの使用法を次の実施例に示す。

実施例Ｉ Ｈ，ズラジリエンシスのラテックス及びゴムポリメラーゼの安定化： 安定化混合物は次のようにして調製した。１０００！！のグリセロールを１．２ ｆｌの蒸留水と混合した。この混合物に１６ｇの重炭酸ナトリウム、６Ｊのアジ ドナトリウム及び２Ｊのシスティンを加えた。最終溶液の容量はおおよそ２旦で 、５０％（重量／容量）のグリセロール、０．３％（重量／容量）のアジビナト リウム、５ｍＭリンスナイン及び０．１Ｍの重炭酸ナトリウムス（固形分３０重 量％）と完全に混合した。

実施例２ ラテックスからのゴムポリメラーゼの分離：ＤＥＡＥ　セルロースを６７ｍＭの ＮａＨＣＯ３，３３％（Ｖ／ｖ）のグリセロール及び３ｍＭのシスティンと平衝 させた。溶解、遊離しているゴムポリメラーゼの単離の全ての工程は０〜４℃の 温度で行った。ラテックス及びＤＥＡＥセルロースヲ−１１℃１時間インギュベ ートした。次に、１６，０ＯＯＸＦで１０分間の遠心分離によりＤＥＡＥセルロ ースを単離した。次いで、ＤＥＡＥセルロースをそれを平衝させるのに使用した のと同じ緩衝剤溶液０．：ｌに再懸濁させ、そして上記のように遠心分離した。

ＤＥＡ、Ｅセルロースを平衝させるのに用いた緩衝剤溶液中の０．４ＭＮａ（４ によりＤＥＡＥセルロースを洗浄することによりＤＥＡＥに結合したゴムポリメ ラーゼを溶離した。溶離された酵素はＤＥＡＥセルロースによって物理的に又は 静電的に取り込まれたゴム粒子を含有していたが、ゴムポリメラーゼの大部分は 溶解、遊離していた。引き続き２３５，０ＯＯＸ５’　で１時間超遠心分離して 溶液からゴムを除去すると活性ゴムポリメラーゼのほとんどが浴液に残った。

実施例３ ラテックスからのゴムポリメラーゼの分離：ＤＥＡＥセルロースによるラテック スの処理について別法を考案した。ラテックスをまず２８，０００ｘ、９で１時 間遠心分離した。

ラテックス中のゴムのあるものが溶液の上に層となって析出した。次に、溶液を 上記のようにしてＤＥＡＥセルロースで処理した。但し、ＤＥＡＥセルロースは 各洗浄工程又は溶離工程において真空濾過で溶液から分離した。ＤＥＡＥセルロ ースを未遠心分離ラテックスから単離するのに遠心分離を用いた、と言うのはラ テックス中のゴムはＤＥＡＦ　−ラテックス混合物の効率的な濾過を妨げたから である。

ＤＥＡＥセルロースから溶離されたゴムポリメラーゼは依然としてゴムを含有し ていた。このゴムを２３５，０ＯＯｘ、９で１時間遠心分離することによって除 去した。相当の量の活性ゴムポリメラーゼを含有する澄明な溶液が得られた。

実施例４ ゴムポリメラーゼの精製： 実施例２足おけるようにして製造した溶解、遊離しているゴムポリメラーゼをほ とんど同質となるまで精製した。酵素精製中の全工程は０〜４℃で行った。

実施例２に記載のようにして製造したゴムポリメラーゼの澄明１ｊ訂液をｐＨ２ の１５．９の１　ｍＭ２　（Ｎ　−モルホリノ）エタンスルホン酸に対して一夜 透析した。透析された酵素中の蛋白質濃度をワーブルグ（Ｗａｒｂｕｒｇ）及び クリステイアン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ）ｆｆＪＢｉｏｃｈｅｐｉｃａｌ　Ｚｅｉ ｔｓｃｈｒｉｆｔ、　２４　：　２０６　、１９３１の方法で定量した。この雑 文な本明細書で引用、参照するものとする。この溶液に蛋白質のダラム当り０． ５ｇの１６ｍｇ／ｍｇアルミナＣガンマー〔シグマ−ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　 ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）　：ｌ’加え、１時間インキユベー　トシた 。１０，０００Ｘｐで５分間遠心分離することによってアルミナＣガンマ−を溶 液から除去した。ゴムポリメラーゼはアルミナＣガンマ−には結合しなかった。

燐酸カルシウムゲルをツポイ（Ｔｓｕｂｏｉ）及びノードソン（Ｈａｄｓｏｎ） がＪ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、２２４：８７９，１９５７に記載する通りにして調製 した。この雑文を本明細書で引用、参照するものとする。アルミナＣガンマ−で 処理した酵素を等容量の燐酸カルシウムゲル（Ｉ　Ｃｍ９　／　ｍｅ　）と混合 した。混合物を３０分間攪拌し、５０分間放置した。ゲルをＤＥＡＥを平衝させ るのに用いた緩衝剤（実施例２）３０ｍｌにプレングー中で低速で１分間ブレ、 ンドすることによって再ｉ％　／ｉｆｆさせた。次に、混合物を５０分間放置し た後そのゲルを再び単離した。酵素を次いでゲルから３０〜１００ｍ１！の０． ２　Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４、グリ七〇　−ＪＬｚ　３３　％（Ｗ／Ｖ）及び３ｍＭの ２−メルカプトエタノールとブレンドすることによって溶離した。

燐酸カルシウムゲルから溶離させた酵素をウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）　 ＡｃＡ　４４　（ＬＫＢ　インスツルメンツ社（ＬＫＥＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ 　、■ｎｃ、））を使用するゲル濾過で更に精製した。

使用カラムを０．２　ｍ　Ｍのトリスクロライド（Ｔｒｉｓ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ）、５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１ｍＭのＭｇＳＯ４と平衝させた。

酵素をカラムに適用し、次いでカラムをこれを平衝させるのに用いた同じ緩衝剤 で溶離処理した。それぞれ２００滴の各フラクションな採集した。酵素は１つの ピークとして溶離された。ゴムポリメラーゼ活性を持つ全てのフラクションをプ ールした。プールされたフラクションをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア ミド９ゲル電気泳動法で精製すると、酵素はほとんど均質となるまで精製された ことが示された。プールされたフラクションは一般に分光光度分析法で分析して 約１０ｎ９の蛋白質を含有していた。

実施例５ 高分子量天然ゴムの合成に対する実質的に精製されたゴム７＋？リメラーゼの使 用： 実施例４（心おけろよ５にして製造した実質的に精製されたゴムポリメラーゼを 次のようにして高分子量天然ゴムの合成に用いた。

試験管に５部の２Ｍトリスクロライ）゛（ｐＨｓ、ｏ）、１部の０６５Ｍ塩化マ グネシウム、２部の０．２２５　Ｍ　ＥＤＴＡジカリウム、１部の０．２Ｍグル タチオン、１部の１．５　ｍＭ　ＤＭＡＰＰ、２０部の実質的に純粋のゴムポリ メラーゼ（０，２ｒｔｑ／ｙｒｔｌ）を添加して反応を開始させた。混合物を３ ０℃で４時間インキユベートシた。

１００部のＱ、］、Ｍ　ＥＤＴＡジカリウムと４，０００部のメタノール中２％ （Ｗ／Ｖン　１−リクロロ酢酸を段階的に加えろことによって反応を停止させた 。この処理でゴムを沈殿させ、そしてンーバ、１１／　（Ｓｏｒｖａｌｌ）　Ｇ ＬＣ４遠心分離機で２，０００　ｒｐｍ　において１０分間遠心分離することに よって単離した。

実施例６ インペンテニルピロホスフェートの製造：インペンテノールのピロホスホリル化 （ｐｙｒｏｐｈｏｓＩｔｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）で工ＰＰを製造し、結晶化で精 製した。

１５．１２ｍ１（１２，９９，１５０ｍＭ　）のインペンテノールに攪拌器及び 滴下漏斗を備えたフラスコ中で９０ゴ（１３０ｇ。

９００ｍＭ　）のトリクロロアセトニトリルを加えた。次に、５ゴのアセトニト リルＩＣ加熱、溶解させたビス−（トリエチルアンモニウム）ホスフェ−）（１ ０４７，３６ｍＭ）を滴下漏斗から５．５時間（（ｒ、わたって導入し、その間 反応混合物を呈温に保ち、かつ連続攪拌した。呈ｌで一夜放置後、分液１斗中の 反応混合物に３３３ｍＪの０．４Ｎアンモニア水と７００ｍ／！のエーテルを加 え、そのホスフェート類を水性層に抽出させた。３３３　ｍ、ｌ！の０．４Ｎア ンモニア水による抽出を２回以上操り返した。水性層を合’ｅ、５００ｒｎｌの エーテルで３回抽出し、次いで５５℃において回転蒸発器で約２００ｍｅＫなろ まで濃縮した。シクロヘキシルアミン（５０ｍｌ、　４．３７　ｍＭ）を次に加 え、そして約１００ｍ１になるまでその濃縮を続げた。そのときインば／テニル モノホスフェートのジシクロヘキシルアンモニウム塩の結晶が析出した。４℃で 一夜放置後、７．６ｇの結晶性モノホスフェートが集められた。

上記の母液をＬｏｏｍｌの濃アンモニア水で処理し、２容量のエーテル（３５０ ＋ｎｌ）のエーテルで２回抽出した。エーテルの除去後、５００ｍ１のＩ　Ｍ　 ＬｉＣ４を加え、その溶液を約５００ｖｔｌになろまで濃縮した。そのとぎイン ペンテニルピロホスフェートのリチウム塩の沈殿が現われた。４℃で２４時間放 置後、沈殿を集め、氷冷水で、次いでアセトン及びエーテルで洗浄し、７０℃の オーブンで一夜乾燥した。収量は８ｙであった。

インはンテニルピ口ホス７エートのリチウム塩（８ｇ、３０ｍＭ）　を５０ｍ１ の水と共に攪拌し、そして存在するカーボネートの除去のために５０％酢酸で弱 酸性となし、　２Ｎ　ＮａＯＨでｐＨ８に調整し、そして１６．４５ｇ（６４ｍ Ｍ）　のＢａ（Ｃ２Ｈ３０ｚ）２の４８ｍ水中溶液と滴加混合すると、溶解性の 乏しい非晶質のインペンテニルピロ燐酸バリウムが沈殿した。これを遠心分離し 、５ｍｌの水で５回、次いでエタノール、アセトン及びエーテルで洗浄した。収 量は１１．５５．９であつ１こ。

インペンテニルビロリン燐酸バリウム（１１，５５ｇ）全１５０ゴの水中に懸濁 させ、これを６０ｇのダウエックス（Ｄｏｙｅｘ　）５０（Ｈ＋形）イオン交換 樹脂で磁気攪拌下において０℃で１．５時間、次いで４℃で一夜処理した。バリ ウムの除去を稀Ｈ２Ｓ０４（１Ｎ）による斑点試験：・ζよって行った。イオン 交換樹脂を濾過し、そして溶解しているバリウムがなくなるまで脱イオン水で洗 浄した。この水溶液を濃アンモニアで中和し、そして回転蒸発器で乾固近くにな るまで濃縮して黄色がかつ１こシロップを得た。この黄色がかったシロップをア セトンで、次いでエーテルで洗浄した。収量は５．５ｇであった。ＩＰＰの構造 はプロトンと燐の両者の３１　ＮＭＲ及びガスクロマトグラフィー／質量分光測 定法で確認された。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に純粋な形のゴムポリメラーゼ。 ２．ヘべア属の植物から回収されたものである請求の範囲第１項記載のゴムポリ メラーゼ。 ３．ヘべアブラジリエンシスのラテックスから回収されたものである請求の範囲 第１項記載のゴムポリメラーゼ。 ４．前記ポリメラーゼがモノマー性で、ドデッル硫酸ナトリウムポリアクリルア ミドゲル電気泳動法で測定して約３６，０００〜約４４，０００の分子量を有し ている請求の範囲第１項記載のゴムポリメラーゼ。 ５．ゴムポリメラーゼ活性を持つ少なくとも１個の活性サイトを有する実質的に 純粋なポリペプチドから成るゴムポリメラーゼ。 ６．前記ポリペプチドがヘべアブラジリエンシスのラテックスから回収したゴム ポリメラーゼと実質的に同族関係にある請求の範囲第５項記載のゴムポリメラー ゼ。 ７．前記の少なくとも１個の活性サイトへべアブラジリェンシスのラテックスか ら回収したゴムポリメラーゼの活性サイトと酵素的に同等に機能する請求の範囲 第５項記載のゴムポリメラーゼ。 ８．前記の少なくとも１個の活性サイトがヘべアブラジリエンシスから回収した ゴムポリメラーゼの対応するサイトから、高ゴムポリメラーゼ活性を有するポリ ペプチドを形成するように変えられている請求の範囲第５項記載のゴムポリメラ ーゼ。 ９ヘべア属の植物からラテックス中のゴム粒子と結合したゴムポリメラーゼと溶 解して遊離の形を取っているゴムポリメラーゼを含有する化学的に安定化された ラテックスを製造し；該ラテックスから溶解、遊離している該ゴムポリメラーゼ を分離し；そして 分離された該ゴムポリメラーゼを精製して実質的に純粋な形のゴムポリメラーゼ を得る 工程から成ることを特徴とする実質的に純粋な形のゴムポリメラーゼを製造する 方法。 １０．前記植物がヘべアブラジリエンシスである請求の範囲第９項記載の方法。 １１．前記の安定化されたラテックスを、該ラテックス約１容量に対しポリヒド ロキシ化合物、抗微生物剤及び緩衝剤を含む安定化用溶液約１〜約１０容量を加 えることから成る方法で製造する請求の範囲第９項記載の方法。 １２．前記安定化用溶液がスルフヒドリル化合物を更に含んでいる請求の範囲第 １１項記載の方法。 １３．前記ポリヒドロキシ化合物がグリセロール、ソルビトール及びスクロース より成る群から選択されたものである請求の範囲第１１項記載の方法。 １４．前記安定化用溶液が約１０〜８０％重量／容量のグリセロール、約０．０ ０１〜約１％重量／容量のアジドナトリウム及び緩衝剤を含み、そのｐＨが約７ 〜約１２である請求の範囲第１１項記載の方法。 １５．前記安定化用溶液が約５０％重量／容量のグリセロール、約０．３％重量 ／容量のアジドナトリウム及び約０．１Ｍの重炭酸ナトリウムを含む請求の範囲 第１４項記載の方法。 １６．前記安定化用溶液が約５ｍＭのシステインを更に含む請求の範囲第１５項 記載の方法。 １７．前記分離をクロマトグラフ分離法により行う請求の範囲第９項記載の方法 。 １８．前記クロマトグラフ分離法がイオン交換クロマトグラフィーである請求の 範囲第１７項記載の方法。 １９．イオン交換クロマトグラフィーを用いる前記クロマトグラフ分離法が、ラ テックスにイオン交換樹脂を混合、導入して溶解、遊離しているゴムポリメラー ゼが該樹脂に結合してポリメラーゼー樹脂のコンプレックスを形成するようにな し、該コンプレックスを分離し、そして該コンプレックスからゴムポリメラーゼ を取り外すことから成る請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０．前記イオン交換樹脂がアニオン交換樹脂である請求の範囲第１９項記載の 方法。 ２１．前記分離を０〜４℃で行う請求の範囲第９項記載の方法。 ２２．前記精製工程が、分離されたゴムポリメラーゼを透析して透析液を得；該 透析液にゲルを加えてゲルーポリメラーゼのコノプレックスを形成し；該コンプ レックスを該透析液から分離し；該ポリメラーゼを該コンプレックスから取り外 し；そして取り外された該ポリメラーゼをゲル濾過クロマトグラフィーにかけて 実質的に純粋な形のゴムポリメラーゼを生成させることから成る請求の範囲第９ 項記載の方法。 ２３．前記透析液を蛋白質に対する吸着剤と混合し、そして透析液にゲルを加え る前に該吸着剤を除去する工程を更に含む請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４．前記吸着剤がアルミナＣガンマーである請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５．前記ゲルが燐酸カルシウムゲルである請求の範囲第２２項記載の方法。 ２６．前記精製が、溶解、遊離しているゴムポリメラーゼをゴムポリメラーゼに 対する固定化された抗体と接触させてゴムポリメラーぜ−抗体のコンプレックス を形成し；該コンプレックスを該溶液から分離し；そして該ゴムポリメラーゼを 該コンプレックスから回収する工程から成る請求の範囲第９項記載の方法。 ２７．へベア属の植物から化学的に安定化されたラテックスを製造し； 化学的に安定化された該ラテックスをゴムポリメラーゼに対する固定化された抗 体と接触させてゴムポリメラーゼ−抗体のコンプレックスを形成し； 該コンプレックスを該ラテックスから分離し；そして該ゴムポリメラーゼを該コ ンプレックスから実質的に純粋な形で回収する 工程から成ることを特徴とする実質的に純粋な形のゴムポリメラーゼの製造法。 ２８．請求の範囲第９項記載の方法で製造された実質的に純粋なゴムポリメラー ゼ。 ２９．ラテックスにポリヒドロキシ化合物、抗微生物剤及び緩衝剤を含む安定化 用組成物を加えることを特徴とするラテックスの安定化法。 ３０．前記安定化用組成物がスルフヒドリル化合物を更に含む請求の範囲第２９ 項記載の方法。 ３１．前記安定化用組成物が溶液である請求の範囲第２９項記載の方法。 ３２．前記溶液のｐＨが約７〜約１２である請求の範囲第３１項記載の方法。 ３３．約１〜約１０容量の前記安定化用溶液を約１容量のラテックスに加える請 求の範囲第３１項記載の方法。 ３４．約２容量の前記安定化用溶液を約１容量のラテックスに加える請求の範囲 第３１項記載の方法。 ３５．前記安定化用溶液が約５０％重量／容量のグリセロール、約０．３％重量 ／容量のアジドナトリウム及び約０．１Ｍの重炭酸ナトリウムを含む請求の範囲 第３１項記載の方法。 ３６．次の、 イソペンチニルピロホスフエート、アリル系ピロホスフエート及び突質的に純粋 なゴムポリメラーゼを含有する反応混合物を形成し； 該反応混合物を天然ゴムが生成するのに十分な時間インキュベートし；そして 該天然ゴムを回収する 工程から成ることを特徴とする天然ゴムの製造法。 ３７．前記天然ゴムが高分子量天然ゴムである請求の範囲第３６項記載の方法。 ３８．前記アリル系ピロホスフエートがジメチルアリルピロホスフエート、高分 子量天然ゴムの粒子及び低分子量天然ゴムの粒子より成る群から選ばれたもので ある請求の範囲第３６項記載の方法。 ３９．前記反応混合物が緩衝剤、二価の金属イオン、重金属キレート化剤及びポ リメラーゼに対する安定化剤を更に含んでいる請求の範囲第３６項記載の方法。 ４０．前記反応混合物が緩衝剤、塩化マグネシウム、ＥＤＴＡジかリウム及びス ルフヒドリル化合物を更に含んでいる請求の範囲第３６項記載の方法。 ４１．前記緩衝剤が０．１〜１．６Ｍのトリスクロライドから成る請求の範囲第 ４０項記載の方法。 ４２．前記塩化マグネシウムの濃度が約１〜約１０ｍＭであり、前記ＥＤＴＡジ カリウムの濃度が約５〜約１０ｍＭであり、そして前記スルフヒドリル化合物が 約１〜約１０ｍＭの濃慶のグルタチオンから成る請求の範囲第４０項記載の方法 。 ４３．前記反応混合物のｐＨが約５〜約１０である請求の範囲第３６項記載の方 法。 ４４．前記反応混合物のｐＨが約７〜約８である請求の範囲第３６項記載の方法 。 ４５．前記インキユベーションを約４〜約６０℃の温度で行う請求の範囲第３６ 項記載の方法。 ４６．前記インキュベーションを約３０℃の温度で行う請求の範囲第３６項記載 の方法。 ４７．前記インキユベーシヨンを約１〜約１６時間行う請求の範囲第３６項記載 の方法。 ４８．前記インキユベーシヨンを約４〜約８時間行う請求の範囲第３６項記載の 方法。 ４９．請求の範囲第３６項記載の方法によって製造された高分子量の天然ゴム。 ５０．次の、 インペンテニルピロホスフエート及び少なくとも１種の他の共重合性モノマー、 アリル系ピロホスフエート及び実質的に純粋なゴムポリメラーゼを含有する反応 混合物を形成し；該反応混合物を共重合体が生成するのに十分な時間インキュべ ートし；そして 該共重合体を回収する 工程から成ることを特徴とする共重合体の製造法。 ５１．請求の範囲第５０項記載の方法で製造された共重合体。 ５２．次の イソペンテエルピロホスフエート、イソペンテニルピロホスフエートイソメアー ゼ、二価の金属イオン、ホスファターゼインヒビター及び緩衝剤を含有する反応 混合物を形成し；核反応混合物をジメチルアリルピロホスフエートが生成するの に十分な時間インキュベートし；そして該ジメチルアリルピロホスフエートを回 収する工程から成ることを特徴とするジメチルアリルピロホスフエートの製造法 。 ５３．前記二価金属イオンがＭｇ＋＋であり、前記ホスファターゼインヒビター が弗化ナトリウムであり、前記緩衝剤が重炭酸ナートリウムであり、そして前記 インキユべーシヨンを約１〜２時間行う請求の範囲第５２項記載の方法。 ５４．前記インキユべーツヨンを約３５〜４０℃の温度で行う請求の範囲第５２ 項記載の方法。 ５５．インキュベートされた前記反応混合物をカットオフ分子量が１０，０００ である膜により濾過することによってジメチルアリルピロホスフエートを回収す る請求の範囲第５２項記載の方法。