CN88100484A - 各种橡胶聚合酶的用途 - Google Patents

Abstract

本文发现了基本上纯的橡胶聚合酶和其类似物。基本上纯的橡胶聚合酶可以从化学稳定的三叶胶巴西勒因胶乳中进行分离和提纯。类似物是三叶胶巴西勒因的大的同系物，在酶学方面具有同样功能。本发明提出了橡胶聚合酶的分离和提纯的种种方法。同时还提出了用基本上纯的橡胶聚合酶生产天然橡胶或有关共聚物的用途。

Description

本申请是86102341号申请的分案申请，涉及各种橡胶聚合酶在天然橡胶（特别是高分子量的天然橡胶）的体外合成方面的用途。

天然橡胶存在于上千种植物中。曾报道过几种真菌也可用来合成天然橡胶。大部份植物以及所有的真菌都含有少量的橡胶，但其分子量太低，做为橡胶而言无商业价值。

商业上天然橡胶的二个来源是三叶胶巴西勒因和银胶菊。三叶胶巴西勒因是天然橡胶的主要来源，银胶菊是本世纪前半期天然橡胶的商业来源，1910年占世界供应量的10%。二次大战时，美国在东南亚的天然橡胶来源被切断，银胶菊做为紧急橡胶生产计划的一部分，由美国林业部进行过大规模的种植。战后，三叶胶巴西勒因的高使用性能和廉价，使银胶菊不再成为具有吸引力的天然橡胶的来源，三叶胶巴西勒因的优势一直延续到今天。最近各种经济和政治的倾向使高分子量的天然橡胶向另一些来源发展。这另一些来源之一是体外合成。

三叶胶巴西勒因的生物合成路线已建立并进行过详述，阿尔齐尔（Archer）和奥德利（Andley）曾发表在酶学进展（Advance    in    Enzymology）（第29期，221-257页，1967年）学报上;而李南（Lynen）曾发表在马来西亚橡胶研究所会刊上（J.Rnhher    Res    Inst    Molaya，21（4），389-4061969）。橡胶生物合成的最后一步是借助于橡胶聚合酶的催化反应，而橡胶聚合酶可存在于胶乳中。酶的催化反应是用无机焦磷酸盐的生产方法，使焦磷酸异戊烯酯（IPP）在焦磷酸烯丙酯上进行聚合反应而制取橡胶。这种酶也称为橡胶转移酶或焦磷酸顺式-1，4-聚异戊二烯：焦磷酸异戊烯酯，顺式-1，4-聚异戊二烯转移酶。它是被称为异戊烯转移酶的酶家族中的一个成员。它可使焦磷酸异戊烯酯聚合成不同的链长和不同的立体化学构象。“橡胶聚合酶”这一术语，在本文中用来描述酶。

在三叶胶巴西勒因胶乳中，酶主要是与橡胶粒子结合在一起，但也可在溶液中发见（Archer和Andley），橡胶的合成发生在橡胶粒子的表面（Lynen）。虽然橡胶聚合酶的研究曾在很多试验室中进行（Archer和Audley，Lynen，以及Archer和Cockbain）后者的文章发表在酶学方法中（见Methods    in    Enzynology，15，476-481，1969），但从三叶胶巴西勒因或其他来源的基本上纯的橡胶聚合酶的合成，在本文之前尚未成功。

基本上纯形式的橡胶聚合酶，对橡胶工业而言，将具有很重要的多方面的用途。酶在溶液中即能固定不动，也能自由游离，可用于体内天然橡胶的生产。不用三叶胶巴西勒因也可以生产橡胶，但要在工厂附近的许多地方将橡胶加工成最后部件，例如加工成轮胎。另外，用体外法生产的天然橡胶，甚至超过了从三叶胶巴西勒因胶乳生产的橡胶，因为用体外法生产天然橡胶的各种条件能够控制，这样得到的橡胶纯度高，或者具有其他人们所希望的化学或物理性能。例如，体外法橡胶，质量均匀，基本上没有各种蛋白质和类脂物，它们会影响天然橡胶的某些用途。

其它的重要用途是用来制备基本上纯的橡胶聚合酶的各种抗体。这类抗体可用来发展植物的和其他生物的筛选方法，去测定在这类生物体内的橡胶聚合酶的数量。

在其他的更重要的用途中，纯酶可以连续使用，使用连续的酶可以合成橡胶聚合酶基因或者用于基因的探测。曾经用于酶的基因的测定，并能将其生产天然橡胶的能力引入到其他生物体中。后来知道了更多的关于酶的组成和结构，可用位置定向诱变法去生产具有各种催化性能的橡胶聚合酶。这样就更能够将天然橡胶通过体内和体外法的生物合成加以控制。

本发明的目的是提供各种基本上纯形式的橡胶聚合酶，和具有相等或较高性能的这类聚合酶的活性类似物。

本发明的另一目的是提供各种橡胶聚合酶的分离及提纯方法。

本发明的其他目的是提供用基本纯形式的橡胶聚合酶去生产天然橡胶，特别是高分子量的天然橡胶或者生产共聚物。

本发明的更进一步的目的是提供用来生产天然橡胶（特别是高分子量天然橡胶）方法中的一种配料的制备方法。

为达到上述各目的，需要寻找基本上纯形式的橡胶聚合酶。在一个较好的实例中，基本上纯形式的橡胶聚合酶是从三叶胶巴西勒因胶乳中找到的。在另外的实例中，各种活性类似物基本上是各种纯的多肽，具有橡胶聚合酶的活性，这类多肽至少有一个活性位置，其位置同从三叶胶巴西勒因胶乳中发现的橡胶聚合酶基本上对等，或者在酶的作用方面可与从三叶胶巴西勒因胶乳中找到的这类聚合酶具有同等功能。在其他的实例中，活性位置可以改变，可形成具有较高橡胶聚合酶活性的多肽。在本发明中的一个特别好的实例中，橡胶聚合酶可以是单体，分子量大约从36，000至44，000，是用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的。

根据本发明可提供一种基本纯形式的橡胶聚合酶的生产方法，橡胶聚合酶是从含有三叶胶属的一种植物的化学稳定胶乳中提取出来的，三叶胶中含有橡胶聚合酶，它可与胶乳中的橡胶粒子结合在一起，也可游离在溶液中，还提供一种橡胶聚合酶的分离方法，这一方法是将游离的橡胶聚合酶从胶乳中分离出来。提供一种橡胶聚合酶的提纯方法，可将游离的橡胶聚合酶进行提纯。化学稳定胶乳是将一种含有多羟基化合物，一种抗微生物试剂，缓冲试剂的稳定组合物加入到胶乳中而制备的。在一个较好的实例中，稳定组合物还含有巯基化合物。

溶液中的游离的橡胶聚合酶可以用色谱法从胶乳中分离出来，最好选用离子交换色谱分离法。

在较好的实例中，橡胶聚合酶是用渗析法将分离后的橡胶聚合酶制成渗析液而提纯的。将凝胶加到渗析液中，使之生成凝胶-聚合物酶络合物，将此络合物分离，从络合物中提取聚合酶，然后将提取后的聚合酶再通过凝胶过滤色谱，就可生产出基本上纯的橡胶聚合酶。

在另外的较好的实例中，聚合酶的分离与提纯是使化学稳定胶乳与橡胶聚合酶的固定抗体接触，使生成橡胶聚合酶抗体络合物，分离此络合物，并从络合物中回收橡胶聚合酶。在另一实例中，橡胶聚合酶的提纯是将溶液中的游离的橡胶聚合酶与橡胶聚合酶的固定抗体接触，使生成橡胶聚合酶-抗体络合物，分离此络合物，然后从络合物中回收橡胶聚合酶。

本发明还提供用生成含有焦磷酸异戊二烯酯，焦磷酸烯丙酯和基本上纯的橡胶聚合酶的反应混合物而生产天然橡胶的方法;将反应混合物培育足够的时间，用于生产天然橡胶;再将天然橡胶回收。在一个较好的实例中，可生产高分子量的天然橡胶。

在另一个实例中，提供了一个生产共聚物的方法，该方法是用生成一种含有焦磷酸异戊烯和至少含有一种其他的可共聚的单体，焦磷酸烯丙酯，和基本上纯的橡胶聚合酶的反应混合物;将反应混合物培育足够时间使生成共聚物;然后再回收共聚物。

本发明还涉及到一种制备焦磷酸双二甲基烯丙酯的方法：该方法是使之生成含有焦磷酸异戊烯，焦磷酸异戊烯异构酶，二价金属离子，磷酸酶阻化剂和缓冲试剂的反应混合物;再将反应混合物培育足够时间，使生成焦磷酸二甲基烯丙酯;然后再回收焦磷酸二甲基烯丙酯。

本发明的其他各项目的和优点将放在本发明的说明中进行阐述和实施。这些目的和优点是可以用各种手段和联合装置，特别是用在附加说明中提出的各种手段和联合装置而能实现和得到。

现在将用本发明的较好实例进行详细介绍，同时结合下述各例用来说明本发明的各项原理。

本发明与各种橡胶聚合酶，特别与分离、生产基本纯形式的各种橡胶聚合酶有关。这里引用的“橡胶聚合酶”意味着是一种多肽化合物，它可从焦磷酸异戊烯酯和焦磷酸烯丙酯催化而生成天然橡胶（顺式-1，4-聚异戊二烯）。术语“基本上纯的”和“基本上提纯的”，用来说明橡胶聚合酶时，将意味着橡胶聚合酶基本上无蛋白质或者不是橡胶聚合酶的多肽。本发明中的基本上纯的橡胶聚合酶，以重量计，其纯度至少是75%，较好者是85%，最好者至少90%。换言之，本发明中的基本纯的橡胶聚合酶中所含各种蛋白质或不是橡胶聚合酶的多肽，以重量计，不超过25%，较好者不超过15%，最好者不超过10%。

在本发明的最好实例中，橡胶聚合酶是从三叶胶巴西勒因胶乳中得来的，其分子量为约36，000至44，000，是用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的。酶的活性形式是单体，可用凝胶过滤色谱法测定。

本发明的各种橡胶聚合酶可用下述方法生产出基本上纯的形式：

①可从三叶胶属的植物中，制取化学稳定的胶乳;

②分离橡胶聚合酶，它在胶乳溶液中呈游离状态;

③提纯分离后的橡胶聚合酶。

橡胶聚合酶的提纯需要大量的胶乳，装船时应先稳定胶乳，以防凝聚和发酵，它会导致聚合酶活性的丧失。最方便的稳定方法是将胶乳进行冷冻。然而这是一个昂贵而麻烦的办法。本发明提供了一种可将胶乳进行化学稳定而又可在室温下装船的方法。用这种方法稳定的胶乳，至少在10天内几乎没有凝聚和发酵现象，并使橡胶聚合酶的活性保持高水平。

稳定胶乳的方法是将一种稳定组合物加到胶乳中。该稳定组合物含有多羟基化合物，防微生物试剂和缓冲剂。在较好的实例中，稳定组合物还含有巯基化合物，例如巯基丙氨酸或谷胱甘肽，它可帮助聚合酶稳定。在特别好的实例中，稳定组合物是溶液。可将大约1至10个体积，最好是约2个体积的稳定液与大约1个体积的胶乳混合。

较好的多羟基化合物有甘油、山梨糖醇、蔗糖等类似物。甘油最好。多羟基化合物可使橡胶聚合酶稳定，并阻止胶乳中的橡胶粒子凝聚，可防止或限制橡胶聚合酶失去活性。

防微生物试剂也可帮助防止凝聚和发酵反应。较好的防微生物试剂是叠氮化钠。

缓冲剂可限制PH值，而PH值能钝化酶。缓冲剂的选择是不受限制的，然而我们发现碳酸氢钠或磷酸钾特别有用。在特殊条件下，0.1M的碳酸氢钠或0.1M的磷酸钾较好。

在较好的实例中，稳定溶液的组成如下：大约10%至80%（重量/体积）的甘油，和大约0.001%至1%（重量/体积）的叠氮化钠，以及大约0.1M的碳酸氢钠。碳酸氢钠的PH可以调节，以便使稳定混合物溶液的PH值保持在大约7至12，而最好为8。在一个特别好的实例中，稳定溶液是由大约50%（重量/体积）的甘油，大约0.3%（重量/体积）的叠氮化钠，大约0.1M的碳酸氢钠和大约5mM的巯基丙氨酸组成的。大约10%～20%的橡胶聚合酶，在三叶胶胶乳中，正如上述，是游离于溶液中。而其余的酶，紧紧地与胶乳中的橡胶粒子结合在一起，结合的酶很难从没有失去活性酶的橡胶粒子上进行分离。本发明可使游离于溶液而又保持活性的橡胶聚合酶进行分离，并能基本上纯化。

游离的橡胶聚合酶可以用已知的一般分离技术，从胶乳中将其分离。本发明采用的各项技术是工艺上现有规范中的一般的各项熟练技术。色谱分离法特别好。在特殊情况下，可用阴离子交换树脂的离子交换色谱法。较好的树脂是二乙基氨乙基（DEAE）纤维素。将树脂加到胶乳中进行混合，这样游离的橡胶聚合酶就与树脂结合在一起，把酶用已知的技术将其洗涤下来。与树脂结合在一起的某些橡胶粒子也被洗涤下来，然后再用超离心技术将它分离出来。分离温度大约在0℃至30℃，最好是在大约0℃至4℃。

就这一点而言，酶也只是进行了部分提纯，它还可用工艺上已知的一般技术进行进一步的提纯，本发明中所采用的技术就是工艺上现有规范中通用的各种技术。这些技术有：色谱分离法（其中又可分为亲合色谱、离子交换色谱、筛分隔断色谱和吸附色谱等）、沉淀法、渗析法、离心法、电泳法和等电聚焦法等，使用时可将它们变换使用，也可将它们联合使用。按照它们的物理和化学特性，在设计分离试验时，可以有计划的使用这些技术中的一种或多种。它们的物化特性有：橡胶聚合酶的疏水性、电荷和分子量。采用各种技术试验后，可得到不同组份的各种材料，这些材料具有生成高分子量天然橡胶的催化能力。这些试验技术之一，李南在马来西亚橡胶研究所会刊上曾提出过（见会刊第21（4）期，389-406页，1967年）。具有橡胶聚合酶活性的那些部分，可在连续操作中的下一个技术中再进行试验，而新的各组份又可进行另外的试验。反复进行，直到生成的那部份的天然橡胶具有催化活性。这部份活性橡胶聚合酶的重量百分比，至少要含有75%，85%也可以，最好为90%。提纯时的温度可在0℃至30℃下进行，最好是在0℃至4℃下进行。

在较好的一个实例中，从离子交换树脂中回收的部份提纯的橡胶聚合酶，可以通过纤维素膜进行渗析，能将分子量小于12，000至14，000的所有物质除掉。渗析介质是由PH值大约为5.5至6.7的标准缓冲溶液组成的，其PH值最好为6.2。这种渗析作用会降低溶液的离子浓度，将盐和稳定剂除去后也会使溶液的PH降至6.2，同时还可除掉酶的阻化剂。使用工艺上已知其他技术也可达到同样目的。溶液离子浓度的降低，对酶的有效提纯是很重要的。

然后将渗析液与能吸附蛋白质或多肽的吸附剂，例如r-氧化铝进行混合，时间大约1小时。吸附剂可除去聚合酶的阻化剂，吸附剂的使用，我们相信不影响聚合酶的提纯。它可以用离心法除掉。

然后将含有橡胶聚合酶的上层清液与0.1至10体积的一种凝胶物质，例如磷酸钙进行混合，可与酶生成络合物。混合物搅拌约1至100分钟，最好为30分钟。希望将混合物静止约10至100分钟，50分钟最好。然后用离心法将络合物提取出来，而上层清液弃之不要。再用缓冲溶液将络合物进行洗涤，酶就被抽提出来。抽提物大约有二个至三个谱带，含量少的几组谱带再用十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳法将其提取出。

然后再将提出物进行凝胶过滤色谱分离。可得到基本上纯的橡胶聚合酶，其纯度以重量计至少可达90%。若需要还可将基本上纯的橡胶聚合酶用色谱分离法进一步提纯，最好采用亲合色谱或离子交换色谱法。

基本上提纯过的橡胶聚合酶可以用来生产酶的各种抗体。各种抗体是非常特殊的，对多肽而言具有很高的亲合力，并能进一步提高其亲合力。与不溶解的基体接触时，它们很容易的和有效的可从含有蛋白质或其他物质的络合物中将多肽分离出来。让不流动的抗体与混合物接触，可使橡胶聚合酶与各种抗体结合，然后将混合物除去，并将含有与抗体结合的聚合酶的不溶解的基体进行洗涤，混合物中的其他杂质可除掉。然后再将抗体中的聚合酶分离和提取出来。使用抗体的这种方法，工艺上是众所周知的。在斯扣普的蛋白质提纯、原理和应用一书中曾提到（见纽约，斯平哥尔·维早拉哥，1982年版，132至136页）。

在本发明中，从化学稳定胶乳中分离后的在溶液中呈游离状态的橡胶聚合酶，与固定的抗体接触，这样就可以生成聚合酶抗体络合物，这类络合物可从溶液中分离出来。又可从这类络合物中将聚合酶提取成基本上纯的形式。另外，化学稳定胶乳本身能够与固体抗体接触，形成聚合酶抗体络合物。然后再将这类络合物从胶乳中分离出来。有些聚合酶抗体络合物也可以与橡胶粒子结合在一起，当提取酶时，有些酶又可与橡胶粒子结合在一起。与酶结合在一起的橡胶粒子，可用离心法将其分离出来，基本上纯的橡胶聚合酶便留在溶液中。

抗体附在橡胶聚合酶上，可以用工艺上已知的各种技术进行制造。多克隆抗体可以将橡胶聚合酶注射到兔、山羊、马和其他的动物身上而制造。然后从动物身上将血样抽出，抗体的存在可用双向扩散等方法测定，或者用碘¹²⁵示踪蛋白质A来检测抗体和抗基因聚集体。抗体附在聚合酶上可以从血浆中找到。一般只需要部份提纯的抗体。在另一实例中，单克隆抗体可以代替多克隆抗体，然而实际上，用部分提纯的，含有橡胶聚合酶和其他多肽的混合物进行试验时，单克隆最适宜。单克隆抗体可用考拉尔（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）的技术制备（见《自然》，256期，495页，1975年）。

用抗原回收或生产橡胶聚合酶，还不能用来制备所需的抗体。假若用不同种类的各种植物制备橡胶聚合酶的方法是一样或基本相似的话，附在聚合酶上的各种抗体就有可能与从植物中制取各种橡胶的橡胶聚合酶结合在一起。那么在从三叶胶属的植物中去生产基本上纯的橡胶聚合酶的本发明的各种说明中，用附在纯蛋白质上的各种抗体的已知技术的联合装置，就有可能使被试验的有机体具有生产橡胶聚合酶的能力。若找到这种能力，就可将这种聚合酶进行分离和提纯。

可用各种技术去固定抗体，然后使它们与含有橡胶聚合酶的混合物接触。免疫吸附亲合色谱技术为最好。在这项技术中，各种抗体与吸附剂偶合，例如溴化氰活化的琼脂糖在分馏柱中耦合。混合物以足够的流速流过分馏柱，那么橡胶聚合酶就能充分地与固定的抗体作用。将分馏柱洗涤后，然后再抽提，以便从抗体中将聚合酶取出。各种去垢剂或缓冲剂都可以用来洗提聚合酶。

正如前述，天然橡胶可从很多不同种类的各种植物中找到。但天然橡胶最好的商业来源，三叶胶巴西勒因，是三叶胶属的九大品种之一。虽然其他品种的橡胶生物合成还不如三叶胶巴西勒因的研究那样成熟，但人们都期望，其他品种的橡胶聚合酶能与从三叶胶巴西勒因中分离和提纯的聚合酶相同或基本相似。同样人们也期望从银胶菊中找到的橡胶聚合酶，也能与从三叶胶巴西勒因来源的聚合酶是相同的或基本相似。在酶学上这类聚合酶与从三叶胶巴西勒因胶乳中得到的橡胶聚合酶是相当的。即，它们可以从焦磷酸异戊烯酯和焦磷酸烯丙酯催化合成天然橡胶。因此本发明的各项说明都可应用于从生产天然橡胶的植物中将橡胶聚合酶进行分离和提纯，这样的一些酶也包括在本发明中。

具有一般结构因素，作用机理和在相对少数的氨基酸残留物方面彼此不同的一组橡胶聚合酶也包括在本发明中。除了从不同植物中进行分离外，还可用工艺上熟知的技术，将这些聚合酶用化学变型或遗传变型，例如位置定向诱导法去生产。从三叶胶胶乳中提纯的，用来制备橡胶聚合酶的各种抗体，用本发明的方法，可以对它们进行鉴定和分离。化学变型能提高原来的聚合酶的活性，或者对其活性无影响。除此之外，本发明承认活性橡胶聚合酶是基因编码克隆。这种基因也曾经认为是克隆，活性物质的许多变体能用碱取代和将变型基因引入到各种宿主中而能将其制造出来。

本发明中的橡胶聚合酶可以含有一个或多个不需要它们的活性的氨基酸链节。这些链节可以用工艺上已知技术除去，例如用胰朊酶、木瓜酶和有关的解朊酶的有限解朊蒸煮法将那些不需要的链节除去。那么这一类的橡胶聚合酶也包括在本发明中。

本发明中的各种橡胶聚合酶都可以用来生产任一分子量的天然橡胶，其范围为1000-2，000，000。这类橡胶可用生成含有焦磷酸异戊烯酯，焦磷酸烯丙酯和纯的或基本上纯的橡胶聚合酶的反应混合物的方法去生产;将反应混合物培育足够时间，以便用来生产天然橡胶，并将其回收。本发明中的纯的或基本上纯的橡胶聚合酶，有可能用于极限竞争反应，这样会减少污垢物，因此比较容易和便宜的进行进一步提纯。

焦磷酸烯丙酯可以是低分子量的或者足够高分子量的天然橡胶粒子，或者是一种引发剂，例如，焦磷酸二甲基烯丙酯（DMAPP）。使用低分子量天然橡胶时，会将这些低分子量的天然橡胶转变成高分子量的天然橡胶。反应时用焦磷酸二甲基烯丙酯和天然橡胶粒颗最好。用体外法生产的天然橡胶的分子量可以用改变反应时间，焦磷酸异戊烯酯和焦磷酸烯丙酯的比例，焦磷酸烯丙酯的分子量，或将它们联合起来使用，进行控制。在较好的实例中，用2-10mM的焦磷酸异戊烯酯，3-50μM的焦磷酸二甲基烯丙酯，0.1%-1%（重量/体积）的橡胶粒子，0.1%-1%（重量/体积）的基本上纯的聚合酶可生产出高分子量的天然橡胶。

在较好的实例中，反应混合物还可含有二价的金属离子，重金属的螯合剂，酶的稳定剂和缓冲剂。二价金属的最好来源是氯化镁。虽然对反应说来，只需要痕量的二价离子，然而象Mg⁺⁺这样的离子在大多数试剂中都能找到，因此在反应混合物中，不一定加入氯化镁或类似的化合物。在反应混合物中氯化镁的浓度可从0至100mM。当使用时，浓度范围是0.01至100mM，但较好浓度是1-10mM。

重金属螫合物可以看成是聚合酶的保护剂，但不影响反应。乙二胺四醋酸二钾盐（EDTA）特别适用。浓度范围为0至100mM。使用时，浓度可从0.01至100mM。最好是5-10mM。

巯基化合物，象半胱氨酸和谷胱甘肽，对聚合酶而言，也可以看做为保护剂，而且不影响反应。谷胱甘肽特别适用。它的浓度为0-100mM。使用时，浓度可从0.01至100mM，最好是在1至10mM。

反应能在PH值大约5至10之间进行，最好在7至8之间。PH值可用缓冲试剂加以控制，很多缓冲试剂都可适用。使用较好者是三（羟甲基）硝基甲烷。浓度范围是1mM至10M，较适用的浓度是0.1M至1.6M。

反应可在大约4℃至60℃下进行，时间大约1至16小时。较好的温度约在30℃，反应时间大约4至8小时。

焦磷酸二甲基烯丙酯可以在含有焦磷酸异戊烯酯、焦磷酸异戊烯酯异构酶、二价金属离子、磷酸酶阻化剂和缓冲剂的反应混合物中去制备;培育反应混合物;并回收焦磷酸二甲基烯丙酯。焦磷酸二甲基烯丙酯可将混合物通过一个分子量为10，000的膜，将其过滤而回收。焦磷酸二甲基烯丙酯存在于滤液中。将反应混合物在大约35至40℃，最好在37℃下培育大约1-2小时。最适宜的二价金属离子是Mg⁺⁺，最好的磷酸酶的阻化剂是氟化钠，可用的缓冲剂是碳酸氢钠。焦磷酸异戊烯酯异构酶可用工艺上已知技术进行制备。这种技术是阿格瑞诺夫（Agranoff）等人提出的（见生物化学杂志235期，P326-332，1960）。

在另一实例中，可用提纯的或基本上提纯的橡胶聚合酶，从焦磷酸异戊烯酯和至少一个其他的可共聚的单体，以及焦磷烯丙酯存在下，在制备天然橡胶方法相同的条件下去生产共聚物。最合适的可共聚的单体有丁二烯、苯乙烯、丙烯腈和乙烯。共聚物的分子量能用改变反应时间、焦磷酸异戊烯酯对焦磷酸烯丙酯的比例、焦磷酸烯丙酯的分子量、可共聚单体的用量和将它们联合使用等办法，加以控制。

用本发明方法生产的天然橡胶，可以用工艺上已知的技术进行分析。这些技术包括臭氧化反应（见杷克（Park）和棒尼尔（Bonner），生物化学杂志，233：341-343，1958）;反相薄膜色谱（见布衣（Bni）和阿木斯窗（Armstrong），液相色谱杂志7：29，1984）;和溶剂萃取（见北呢底克特（Benedict）等人的文章，植物生物化学，27：897-899，1983）等方法。

本发明的一些说明可应用于一些特别问题或条件下。本发明的各种产物，它们的生产方法和使用方法见下述各实例。

实例1：三叶胶巴西勒因胶乳的稳定作用和橡胶聚合酶

稳定混合物的制备方法如下：将1000克的甘油与1.2升的水混合。将16克的碳酸氢钠、6克的叠氮化钠和2克的半胱氨酸加入到混合物中。溶液的最终体积大约为2升，含有50%的甘油（重量/体积），0.3%（重量/体积）的叠氮化钠，5mM的半胱氨酸和0.1M的碳酸氢钠。将2升的稳定溶液与1升的从三叶胶巴西勒因树上新收集来的胶乳，其中含有30%重量的干固体，进行充分混合。

实例2：从胶乳中分离橡胶聚合酶

用67mM的碳酸氢钠，33%（重量/体积）的甘油，和3mM的半胱氨酸使之与二乙胺基乙基纤维素平衡。在溶液中处于自由状态的橡胶聚合酶的所有分离操作都是在0℃至4℃下进行的。将胶乳和二乙胺基乙基纤维素在一起培育一小时。然后将二乙胺基乙基纤维素用16，000倍的重力加速度的离心机分离10分钟。然后再将二乙胺基乙基纤维素重新悬浮在0.3升相同的缓冲溶液中，用来使它与上述的离心物进行平衡。与二乙胺乙基纤维素结合在一起的橡胶聚合酶，用含有0.4M的氯化钠缓冲溶液将它们洗涤，二乙胺乙基纤维素就会被抽提出来。提取过的酶含有橡胶粒子，这是因为物理和静电的作用被二乙胺乙基纤维素捕获的，但是大部分的橡胶聚合酶游离在溶液中。随后用235，000倍的重力加速度的超离心机离心1小时，将橡胶从溶液中除去，大部份的橡胶聚合酶便留在溶液中。

实例3：从胶乳中分离橡胶聚合酶

我们设计了另一个用二乙胺乙基纤维素处理胶乳的操作。首先将胶乳用280，000倍重力加速度的离心机处理1小时。胶乳中的橡胶浮在溶液上面。然后用二乙胺乙基纤维素用上述方法处理溶液。不同之处在于每洗涤一次，要从溶液中将二乙胺乙基纤维素分离出来，或用真空过滤法将其提取出来。由于在胶乳中的橡胶对二乙胺乙基纤维素-胶乳混合物的过滤有阻止效应，所以用离心法将二乙胺乙基纤维素从未离心的胶乳中进行分离。

从二乙胺乙基纤维素中提取后的橡胶聚合酶，仍含有橡胶。可用235，000倍重力加速度的离心机，离心一小时将其除去。含有足够数量的活性橡胶聚合酶的澄清溶液就能做出来。

实例4：橡胶聚合酶的提纯

按实例2生产的、游离于溶液中的橡胶聚合酶，可提纯至几乎为同系物。提纯酶时的所有操作都是在0-4℃下进行的。

用实例2生产的橡胶聚合酶澄清液，用15升、1mM的2（N-吗啉）代乙基磺酸，PH值为6.2，渗析过夜。在渗析后的酶中蛋白质的浓度可用瓦伯格（Warbnrg）和柯瑞斯坦（Chcristian）的方法进行测定（见生物化学杂志，24：206，1931）。每克蛋白质用0.5克的16mg/ml的r-氧化铝（西格码Sigma化学公司出品），将其加入到溶液中，培育一小时，用10，000倍重力加速度的离心机，用5分钟，将r-氧化铝从溶液中分离出来，橡胶聚合酶不与r-氧化铝结合在一起。

磷酸钙凝胶可用袒包（Tsnboi）和胡得逊（Hodson）提出的方法制备（见生物化学杂志，224：879，1957）。用r-氧化铝处理后的酶，用等体积的磷酸钙凝胶（10mg/ml）混合。混合物搅拌30分钟，然后静止50分钟。将凝胶重新悬浮在30ml的缓冲溶液中，用来平衡二乙胺基乙基纤维素（见实例2），并低速将混合物搅动1分钟。在胶液再次分离前，混合物放置50分钟。然后再用30-100ml的0.2M的磷酸氢二钾（K₂HPO₄），33%（重量/体积）的甘油和3mM的2-巯基乙醇混合物，把酶从凝胶中提取出来。

从磷酸钙凝胶中提取出的酶，用乌尔托葛尔（ULTrogel    ACA44;LKB仪器公司产品）离心机，将其进一步提纯。分馏柱用0.2mM的三氯化合物，5mM的2-巯基乙醇和1mM的硫酸镁平衡。将酶通过分馏柱，然后用平衡它的同一缓冲溶液，将分馏柱进行洗提。每200滴做为一组份，将其收集起来。洗提的酶有一高峰。把含有橡胶聚合酶活性的所有组份都合并起来，合并在一起的各组份的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明：已经提纯的酶几乎是同系物。合并后的各组份，可以用光谱法进行分析，通常大约含有10毫克的蛋白质。

实例5：用基本上纯的橡胶聚合酶合成高分子量天然橡胶

实例4生产的基本上纯的橡胶聚合酶，可以用来合成高分子量天然橡胶，方法如下：

在一试管中，加入5份2M的三价氯化物（PH值为8.0），1份0.65M的氯化镁，2份0.225M的乙二胺四醋酸二钾盐，1份0.2M的谷胱甘肽，1份1.5mM的焦磷酸二甲基烯丙酯，1份6mM的焦磷酸异戊烯酯，和19份经过洗涤的榕橡树橡胶粒子的悬浮液，橡胶含量为0.5%（重量/体积），再加入20份基本上纯的橡胶聚合酶（0.2mg/ml），用来引发反应。混合物在30℃静止4小时。

加入100份0.1M的乙二胺四醋酸二钾盐和4000份，2%（重量/体积）的三氯乙酸甲醇溶液，使反应终止。用这样的方法使橡胶沉淀，用2000转/分的离心机，离心10分钟，使橡胶分离，离心机为索尔瓦尔（Sorvall）GLC-4型。

实例6：焦磷酸异戊烯酯的制备

焦磷酸异戊烯酯可用异戊二醇的焦磷酸的酯化反应制备，用结晶法提纯。

在装有搅拌器和分液漏斗的烧瓶中放入90ml（130g，900mM）的三氯乙腈，并加入15.12ml（12.9g，150mM）的异戊醇。将磷酸双（三乙基胺）酯（104g，36mM），加热溶解在5ml的乙腈中，然后通过分液漏斗，在五个半小时内将其加完。将反应混合物保持在室温，不停的搅拌，室温下放置过夜。将333ml的0.4N的氨水和700ml的乙醚，加入到盛在分液漏斗中的反应混合物中，磷酸盐萃取在水相中。用333ml    0.4N的氨水，反复抽取二次以上。将水相合并，用500ml乙醚，分三次萃取，然后在旋转蒸发器中，在55℃，将其浓缩至大约200ml。然后加入环己胺（50ml，437mM），并将其连续浓缩至大约100ml，此时含有单磷酸异戊酯的二环己胺盐的结晶出现。在4℃放置过夜，可得7.6克的单磷酸盐的结晶。

母液用100ml的浓氨水处理，用2体积（350ml）的乙醚萃取二次。将醚除去后，加500ml    1M的氯化锂，将溶液浓缩至500ml，此时会出现焦磷酸异戊烯的锂盐。在4℃放置24小时，收集沉淀，用冰水洗涤，然后再用丙酮和乙醚洗涤，在70℃的炉子里干燥过夜。产量为8克。

将8克，30mM的焦磷酸异戊烯锂盐与50ml水搅拌，用50%的醋酸进行微酸化，除去碳酸盐，用2N的NaoH调节PH值至8.0，然后将48ml水溶液（其中含有16.45克，64mM的醋酸钡）逐滴加入并混合，难溶的无定形的焦磷酸异戊烯的钡盐会沉淀。离心分离，用5ml水洗涤五次，然后再用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。产量11.55克。

将焦磷酸异戊烯钡（11.55克）悬浮在150ml水中，用刀魏科斯（Dowex）50（H⁺形式）离子交换树脂60克进行处理。在0℃用电磁搅拌器搅拌1.5小时，然后在4℃过夜。接着用稀硫酸（1N）。通过点滴试验将钡盐除去，将离子交换树脂进行过滤，用去离子水洗涤，一直到溶液中无钡离子为止。水溶液用浓氨水中和，在旋转蒸发器中浓缩至几乎干燥，可得一种黄色浆状物。黄色浆状物用丙酮洗涤，然后用醚洗涤，产量5.5克。焦磷酸异戊烯酯可用氢或磷³¹的核磁共振及气体色谱分离质谱得到证实。

Claims (20)

1、用于生产天然橡胶的方法包括下述各步骤：

生成一种含有焦磷酸异戊酯，焦磷酸烯丙酯和基本上纯的橡胶聚合酶的反应混合物；

将上述反应混合物培育足够时间，以便生产上述的天然橡胶；

回收上述天然橡胶。

2、根据权利要求1，其特征在于其中所述天然橡胶是高分子量的天然橡胶。

3、根据权利要求1，其特征在于其中所述焦磷酸烯丙酯，是指从含有焦磷酸二甲基烯丙酯、高分子量天然橡胶粒子和低分子量天然橡胶粒子的一群中选择出来的。

4、根据权利要求1，其特征在于其中所述反应混合物，还包括下述各组份：一种缓冲剂，二价金属离子，重金属螯合剂和对上述聚合酶具有稳定作用的稳定剂。

5、根据权利要求1，其特征在于其中所述反应混合物，还包括一种缓冲剂，氯化镁，乙二胺四醋酸二钾盐和巯基化合物。

6、根据权利要求5，其特征在于其中所述缓冲剂是由0.1M至1.6M的三氯化物组成的。

7、根据权利要求5，其特征在于各组份的浓度如下：氯化镁的浓度为大约1mM至10mM，乙二胺四醋酸二钾盐的浓度为约5mM至10mM，而巯基化合物是指谷胱甘肽，其浓度大约1mM至10mM。

8、根据权利要求1，其特征在于上述反应混合物的PH值大约是5至10。

9、根据权利要求1，其特征在于上述反应混合物PH值大约是7至8。

10、根据权利要求1，其特征在于上述培育温度大约是4℃至60℃。

11、根据权利要求1，其特征在于上述培育温度大约是30℃。

12、根据权利要求1，其特征在于上述培育时间大约是1小时至16小时。

13、根据权利要求1，其特征在于上述培育时间大约是4小时至8小时。

14、根据权利要求1，其特征在于用上述方法可以生产高分子量的天然橡胶。

15、生产共聚物的方法包括下述各步骤：

生成含有焦磷酸异戊酯和至少一个其他的可共聚的单体，焦磷酸烯丙酯，和基本上纯的橡胶聚合酶的一种反应混合物;

将上述反应混合物培育足够的时间，使之生成上述共聚物;

回收上述共聚物。

16、根据权利要求15，其特征在于可生产共聚物。

17、用来制备焦磷酸二甲基烯丙酯的方法，包括下述各步骤：

组成含有焦磷酸异戊酯、焦磷酸异戊酯异构酶，二价金属离子，磷酸酶阻化剂和缓冲剂的反应混合物;

将上述反应混合物培育足够时间，可生产出上述的焦磷酸二甲基烯丙酯;

回收上述焦磷酸二甲基烯丙酯。

18、根据权利要求17，其特征在于其中所述二价离子是二价的镁离子（Mg⁺⁺）;其中所述磷酸酶阻化剂是氟化钠;其中所述缓冲剂是碳酸氢钠;而且其中所述的培育时间是大约1至2小时。

19、根据权利要求17，其特征在于其中所述培育温度是大约35至40℃。

20、根据权利要求17，其特征在于其中所述回收焦磷酸二甲基烯丙酯，是指将培育的反应混合物，使之通过一个分子量为10，000的膜过滤而得到的。