JP6004249B2 - イソプレノイドの製造方法、及びイソプレノイド - Google Patents

Description

本発明は、イソプレノイドの製造方法、及び該製造方法により得られるイソプレノイドに関する。

天然ゴムなどのイソプレノイドの基本骨格はＣ５のイソプレン単位の重合体であるプレニル鎖であるが、このプレニル鎖の延長反応はプレニルトランスフェラーゼと総称される酵素によって触媒される。

プレニルトランスフェラーゼは、ヘベア・ブラジリエンシス樹（パラゴムノキ）のラテックスに含まれるが、該ラテックスを用いてインビトロでイソプレノイドを製造できることが知られている。

例えば、特許文献１では、天然ゴムラテックスから得たプレニルトランスフェラーゼやイソペンテニル二リン酸などを用いてインビトロでゴムを製造することが記載されている。しかしながら、特許文献１では、イソペンテニル二リン酸の取り込みが評価されず、実際にイソペンテニル二リン酸の取り込みによりイソプレノイドが生成したのかが明確でなく、単にインビトロにおけるイソプレノイド合成の可能性を示しているに過ぎない。また、イソプレノイドを効率的に製造するという点については充分に検討されていない。

特表昭６２−５０２７９７号公報

本発明は、前記課題を解決し、イソプレノイドの効率的な製造方法、及び該製造方法により得られるイソプレノイドを提供することを目的とする。

本発明は、プレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素の存在下、ｐＨ８．５以上の塩基性条件下でプレニル鎖延長反応を行うイソプレノイドの製造方法に関する。

前記ｐＨが９以上であることが好ましい。また、ホスファターゼ阻害剤の存在下、前記プレニル鎖延長反応を行うことが好ましい。前記ホスファターゼ阻害剤がフッ化カリウムであることが好ましい。

前記プレニル鎖延長反応は、イソペンテニル二リン酸が順次縮合する反応であり、前記イソペンテニル二リン酸の反応効率が０．３６ｎｍｏｌ／（時間・５０μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）以上であることが好ましい。前記イソペンテニル二リン酸の反応効率が０．５０ｎｍｏｌ／（時間・５０μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）以上であることが好ましい。

前記イソプレノイドの重量平均分子量が１０万以上であることが好ましい。

前記プレニル鎖延長反応は、低分子量アリル性二リン酸に前記イソペンテニル二リン酸が順次縮合する反応であることが好ましい。

前記イソプレノイドの製造方法は、前記イソプレノイドを０．２４ｍｇ／（時間・５０μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ・ｌ）以上の平均容積生産性で製造することが好ましい。また、前記イソプレノイドを０．３４ｍｇ／（時間・５０μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ・ｌ）以上の平均容積生産性で製造することが好ましい。

前記プレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素は、下記工程１〜２により得られる下記小ゴム粒子層１に含まれることが好ましい。
工程１：ヘベア・ブラジリエンシス樹から採取したラテックスを遠心分離して２層に分離し、前記２層のうちの下層を得る工程。
工程２：得られた前記下層を遠心分離して５層に分離し、前記５層のうちの最上層から数えて２層目の小ゴム粒子層１を得る工程。

前記工程１の前記遠心分離が１００００〜１８０００Ｇで行われ、前記工程２の前記遠心分離が３５０００〜５００００Ｇで行われることが好ましい。

前記プレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素は、下記工程３により得られる下記小ゴム粒子層２に含まれることが好ましい。
工程３：前記小ゴム粒子層１を緩衝液で希釈し、希釈液を４７０００Ｇ以上で遠心分離し、小ゴム粒子層２を得る工程。

前記工程１〜３の前記各遠心分離が０〜８℃で行われることが好ましい。
前記ラテックスは、タッピングを開始してから１０分以上経過した後に採取されたものであることが好ましい。また、前記ラテックスは、５℃以下で保存されたものであることが好ましい。

前記イソプレノイドの製造方法は、金属イオンの存在下、前記プレニル鎖延長反応を行うことが好ましい。前記金属イオンがマグネシウムイオンであることが好ましい。

本発明はまた、前記製造方法により製造されたイソプレノイドに関する。

本発明によれば、プレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素の存在下、ｐＨ８．５以上の塩基性条件下でプレニル鎖延長反応を行うイソプレノイドの製造方法であるので、イソプレノイドを効率的に製造できる。

工程２の遠心分離により形成された５層を模式的に示す図。 工程３の遠心分離により形成された小ゴム粒子層２を模式的に示す図。

ヘベア・ブラジリエンシス樹のラテックスやその生体内は総じて中性であることなどから、イソプレノイドのプレニル鎖延長反応の至適ｐＨも中性条件であると考えられてきた。このため、天然ゴムの生合成などに関する研究においては、長年にわたって中性条件での研究が行われてきた。しかしながら、本発明者らは、イソプレノイドの効率的な製造方法について思考錯誤する過程で、このような従来の技術常識にも疑いの目を向け検証を行った。
まず、従来は、もっぱら基質であるイソペンテニル二リン酸の消費量にのみ着目しており、ホスファターゼによるイソペンテニル二リン酸の加水分解の影響や、一般的なプレニルトランスフェラーゼ活性、長鎖長のイソプレノイドを生合成する活性を区別して評価できていなかった点に着目した。そこで、まず、極性が互いに異なる３種の溶媒を用いて、プレニル鎖延長反応の反応生成物から、基質であるイソペンテニル二リン酸がホスファターゼにより脱リン酸化されて生じるイソペンテノール、プレニルトランスフェラーゼによって重合された中鎖長（Ｃ_１０〜Ｃ_１００程度）のイソプレノイドや長鎖長（Ｃ_１００を超える）のイソプレノイドを分離することに成功した。
そして、１−^１４Ｃラベルされたイソペンテニル二リン酸を用いて反応を行い、上述の方法で各反応生成物を分離し評価することで、中鎖長のイソプレノイド及び長鎖長のイソプレノイドそれぞれにおけるイソペンテニル二リン酸の取り込み量を区別して測定することに成功した。
そして、反応系のｐＨを変えて反応を行い、上述の方法により、各反応生成物を分析した結果、ヘベア・ブラジリエンシス樹のラテックスのホスファターゼ活性の至適ｐＨは、約８であり、中鎖長のイソプレノイドを生合成する反応の至適ｐＨは、約６であることが分かった。一方、長鎖長のイソプレノイドを生合成する反応の至適ｐＨは、約９〜９．５であることが分かった。このように、本発明者らは、中鎖長のイソプレノイドを生合成する反応の至適ｐＨと、長鎖長のイソプレノイドを生合成する反応の至適ｐＨが異なり、従来行われてきた中性条件下ではなく、ｐＨ８．５以上の塩基性条件下でプレニル鎖延長反応を行うことにより、長鎖長のポリイソプレノイドを効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明のイソプレノイドの製造方法は、プレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素の存在下、ｐＨ８．５以上の塩基性条件下でプレニル鎖延長反応を行う方法である。このような塩基性条件下で著しいプレニル鎖伸長反応活性がみられることは、至適ｐＨを中性としていた従来の技術常識を覆すものであり、驚くべきことである。なお、本発明において、プレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素とは、単一のタンパク質（酵素）であってもよく、複数のタンパク質（酵素）からなるタンパク質群（酵素群）であってもよい。

プレニル鎖延長反応は、具体的には、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が順次縮合する反応であり、より具体的には、後述の低分子量アリル性二リン酸にイソペンテニル二リン酸が順次縮合する反応である。より更に具体的には、後述の低分子量アリル性二リン酸にイソペンテニル二リン酸が順次シス縮合する反応である。

本発明では、プレニル鎖延長反応は、ｐＨ８．５以上の塩基性条件下で行われる。ｐＨ８．５未満では、イソプレノイドの製造効率が著しく悪化する傾向がある。該ｐＨは好ましくは９以上である。また、該ｐＨは、好ましくは１１以下、より好ましくは１０．５以下、更に好ましくは９．５以下である。１１を超えると、イソプレノイドの製造効率が著しく悪化する傾向がある。

上記製造方法としては、緩衝液、プレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素、イソペンテニル二リン酸及び低分子量アリル性二リン酸を含む混合液を用いて、ｐＨ８．５以上の塩基性条件下でプレニル鎖延長反応を行う方法が好適である。

緩衝液としては特に限定されず、公知の緩衝液を使用できるが、効率的にイソプレノイドを製造できるという点から、ｐＨ８．５以上の緩衝液を使用することが好ましい。
該緩衝液のｐＨは好ましくは９以上である。また、該緩衝液のｐＨは好ましくは１１以下、より好ましくは１０．５以下、更に好ましくは９．５以下である。このような緩衝液としては、トリス−塩酸バッファー、グリシン−水酸化ナトリウムバッファー、ホウ酸（カリウム）バッファー、ホウ酸（ナトリウム）バッファー、炭酸−重炭酸バッファー、２−(シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸バッファー、３−(シクロヘキシルアミノ)−１−プロパンスルホン酸バッファーなどが挙げられる。なかでも、グリシン−水酸化ナトリウムバッファー、２−(シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸バッファー、３−(シクロヘキシルアミノ)−１−プロパンスルホン酸バッファーが好ましい。
なお、該緩衝液の濃度は適宜設定できる。

低分子量アリル性二リン酸としては特に限定されないが、入手の容易さ、イソペンテニル二リン酸との反応性、取り扱いやすさという理由から、炭素数が５５以下のアリル性二リン酸が好ましく、ジメチルアリル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸及びウンデカプレニル二リン酸がより好ましい。

プレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素としては、前述のプレニル鎖延長反応を触媒するものであれば特に限定されないが、高分子量のイソプレノイドを良好に製造できるという点から、ヘベア・ブラジリエンシス樹から採取したラテックスに含まれるものが好ましい。なかでも、下記工程１〜２により得られる下記小ゴム粒子層１に含まれるものがより好ましい。
工程１：ヘベア・ブラジリエンシス樹から採取したラテックスを遠心分離して２層に分離し、上記２層のうちの下層を得る工程。
工程２：得られた上記下層を遠心分離して５層に分離し、上記５層のうちの最上層から数えて２層目の小ゴム粒子層１を得る工程。

なお、上記５層のうちの最上層から数えて４層目の第４層に含まれるものを用いてもよい。

ヘベア・ブラジリエンシス樹から採取したラテックスとしては特に限定されないが、例えば、タッピングを開始してから１０分以上経過した後に採取されたものなどを好適に使用できる。該ラテックスは、タッピング開始から１０分未満に得られた分を廃棄する方法などにより得られる。
また、ラテックスは新鮮なものほど好ましく、例えば、使用時まで５℃以下で保存されたものなどを用いることができる。このようなラテックスとして、例えば、予め５℃以下に冷却した容器に採取され、採取直後から５℃以下で保存されたラテックスなどが好適である。

工程１では、ラテックスを、必要に応じて試験管に移し、遠心分離により２層に分離した後、該２層のうちの下層（ラテックス下層）を回収する。
工程１の遠心分離の遠心加速度は、好ましくは１００００Ｇ以上、より好ましくは１１０００Ｇ以上である。該遠心加速度は、好ましくは１８０００Ｇ以下、より好ましくは１４０００Ｇ以下である。遠心加速度が上記範囲内であると、ラテックスを好適に２層に分離することができる。
遠心分離の時間は特に限定されないが、好ましくは５〜６０分、より好ましくは１５〜４５分である。また、遠心分離は、０〜８℃で行われることが好ましい。

下層の回収方法としては特に限定されず公知の方法により回収でき、例えば、上層を廃棄した後下層を回収する方法などが挙げられる。

工程２では、得られた下層を遠心分離して５層に分離し、５層のうちの最上層から数えて２層目の小ゴム粒子層１を回収する。工程２の遠心分離の遠心加速度は、好ましくは３５０００Ｇ以上、より好ましくは４００００Ｇ以上である。該遠心加速度は、好ましくは５００００Ｇ以下、より好ましくは４５０００Ｇ以下である。遠心加速度が上記範囲内であると、希釈液を好適に５層に分離することができる。
遠心分離の好ましい時間、温度は工程１と同様である。

遠心分離により下層が５層に分離された様子を図１に示す。
図１に示すように、該５層の最上層から順に、第１層としてラバーフラクション層、第２層として小ゴム粒子層１、第３層としてフレイウィスリング層（Ｆｒｅｙ−Ｗｙｓｓｌｉｎｇ層）、第４層としてＣ−セラム層（可溶タンパク質層）、第５層としてボトムフラクション層（膜タンパク質層）を形成するように、工程２により下層は分離される。
なお、該５層は容易に見分けることができる。特に、小ゴム粒子層１は青く光っているため、容易に見分けることができる。

小ゴム粒子層１は、ＳＲＰ（Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ）と呼ばれる小ゴム粒子を含む層である。

小ゴム粒子層１の回収方法としては特に限定されず、小ゴム粒子層１をピペットやスパチュラなどで回収する方法などにより回収できる。

前述の通り、プレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素として、上記小ゴム粒子層１に含まれる酵素を好適に使用できるが、イソプレノイドを極めて効率的に製造できるという点から、小ゴム粒子層１を下記工程３により処理して得られる下記小ゴム粒子層２に含まれる酵素を使用することがより好ましい。
工程３：上記小ゴム粒子層１を緩衝液（希釈用緩衝液）で希釈し、希釈液を４７０００Ｇ以上で遠心分離し、小ゴム粒子層２を得る工程。

工程３では、小ゴム粒子層１を緩衝液（希釈用緩衝液）で希釈し、希釈液を調製する。
該緩衝液としては特に限定されず、公知の緩衝液を使用できる。緩衝液のｐＨは好ましくは６．５〜８．０、より好ましくは７．０〜７．５である。このような緩衝液としては、トリス−塩酸バッファー、リン酸カリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファーなどが挙げられる。
該緩衝液の濃度は適宜設定できる。また希釈方法は特に限定されず、公知の方法により希釈できる。

その後、希釈液は、４７０００Ｇ以上で遠心分離され、小ゴム粒子層２が回収される。

工程３の遠心分離の遠心加速度は、好ましくは４７０００Ｇ以上、より好ましくは４９０００Ｇ以上である。４７０００Ｇ未満であると、小ゴム粒子層２が緩衝液と充分に分離されない傾向がある。該遠心加速度の上限は特に限定されないが、例えば、６００００Ｇ以下である。
遠心分離の好ましい時間、温度は工程１と同様である。

遠心分離後の希釈液の様子を図２に示す。
図２に示すように、遠心分離により希釈液は、小ゴム粒子層２と緩衝液層の２層に分離される。小ゴム粒子層２は２層のうちの上層に形成される。小ゴム粒子層２は他の層と容易に見分けられる。小ゴム粒子層２は、小ゴム粒子層１と同様にＳＲＰを含む層である。
小ゴム粒子層２の回収方法としては特に限定されず、小ゴム粒子層２をピペットやスパチュラなどで回収する方法などにより回収できる。

なお、得られた小ゴム粒子層２を再度、同様の緩衝液（希釈用緩衝液）で希釈し、希釈液を同様の条件（４７０００Ｇ以上）で遠心分離し、小ゴム粒子層２を回収してもよい。

混合液の混合方法としては特に限定されず、公知の方法で混合でき、例えば、緩衝液に、プレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素、イソペンテニル二リン酸及び低分子量アリル性二リン酸を添加して混合液を調製し、撹拌する方法などが挙げられる。撹拌方法は特に限定されず、公知の方法で実施できる。

また、上記混合液には、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤、ホスファターゼ阻害剤、金属イオンなどを適宜添加できる。なかでも、基質であるイソペンテニル二リン酸がホスファターゼにより脱リン酸化されるのを防止し、イソプレノイドを効率的に製造できるという理由から、ホスファターゼ阻害剤を混合液に添加することが好ましい。また、良好な製造効率が得られるという理由から、金属イオンを添加することが好ましい。

ホスファターゼ阻害剤としては特に限定されないが、フッ化カリウム、フッ化ナトリウム、モリブデン（ＩＶ）酸二ナトリウム、オルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、バナジン酸ナトリウム、テトラミゾール塩酸塩、レバミゾール塩酸塩、アデノシンニリン酸（ＡＤＰ）などが挙げられる。なかでも、イソペンテニル二リン酸の脱リン酸化を良好に抑制でき、プレニルトランスフェラーゼ反応を阻害しないという点から、フッ化カリウムが好ましい。

金属イオンとしては特に限定されないが、本発明の効果が良好に得られるという点から、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオンなどの２価金属イオンが好ましく、マグネシウムイオンがより好ましい。

得られた混合液のｐＨは、好ましくはｐＨ８．５以上である。ｐＨ８．５未満では、イソプレノイドの製造効率が著しく悪化する傾向がある。該ｐＨは好ましくは９以上である。また、該ｐＨは、好ましくは１１以下、より好ましくは１０．５以下、更に好ましくは９．５以下である。１１を超えると、イソプレノイドの製造効率が著しく悪化する傾向がある。

混合液のｐＨを８．５以上に調整する方法としては特に限定されず、例えば、前述のｐＨ８．５以上の緩衝液を用いることで上記範囲に調整できる。また、反応を行いながら、混合液に、アンモニアなどを添加して上記範囲に調整してもよい。

混合液中のイソペンテニル二リン酸の濃度は、好ましくは２０μＭ以上、より好ましくは５０μＭ以上、更に好ましくは８０μＭ以上である。２０μＭ未満であると、イソプレノイドの製造効率上好ましくない。また、該濃度の上限は特に限定されない。

混合液中の低分子量アリル性二リン酸の濃度は、好ましくは５μＭ以上、より好ましくは１０μＭ以上、更に好ましくは１２μＭ以上である。また、該濃度は、好ましくは５０μＭ以下、より好ましくは３０μＭ以下、更に好ましくは１５μＭ以下である。５０μＭを超えると、長鎖長イソプレノイドの製造効率上好ましくない。

混合液中のプレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素の濃度は、好ましくは０．１ｇ／ｌ以上、より好ましくは０．３ｇ／ｌ以上である。０．１ｇ／ｌ未満であると、充分な製造効率が得られないおそれがある。該濃度の上限は特に限定されない。
なお、本明細書において、プレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素として、該酵素以外に他のタンパク質成分を含むものを使用する場合（前述の小ゴム粒子層１に含まれる酵素や前述の小ゴム粒子層２に含まれる酵素などを使用する場合）、該濃度は、全タンパク質量（該酵素及び他のタンパク質成分の合計量）を該酵素量として算出される。
該濃度は、後述の実施例に記載の方法により測定できる。

プレニル鎖延長反応を行う方法としては特に限定されず、例えば、上記混合液を、所定温度で静置及び／又は撹拌することで、プレニル鎖延長反応を行うことができる。

反応の温度は適宜設定できるが、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは２５〜３５℃である。反応の時間は適宜設定できる。また、撹拌方法は特に限定されず、公知の方法で実施できる。

本発明の製造方法において、イソペンテニル二リン酸の反応効率は、好ましくは０．３６ｎｍｏｌ／（時間・５０μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）以上、より好ましくは０．５０ｎｍｏｌ／（時間・５０μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）以上である。
本発明では、塩基性条件下でプレニル鎖延長反応を行うため、このように優れた反応効率が得られる。
なお、本明細書において、イソペンテニル二リン酸の反応効率は、プレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素を５０μｇ使用した場合に、単位時間当たりにイソプレノイドへ取り込まれるイソペンテニル二リン酸の物質量であり、後述の実施例に記載の方法により測定、算出される。

また、本発明の製造方法は、通常、イソプレノイドを０．２４ｍｇ／（時間・５０μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ・ｌ）以上の平均容積生産性で製造し、好ましくは０．３４ｍｇ／（時間・５０μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ・ｌ）以上の平均容積生産性で製造する。本発明では、塩基性条件下でプレニル鎖延長反応を行うため、このように優れた平均容積生産性が得られる。
なお、本明細書において、イソプレノイドの平均容積生産性は、後述の実施例に記載の方法により測定、算出される。

本発明の製造方法により得られたイソプレノイドの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１０万以上であり、より好ましくは５０万以上である。該Ｍｗの上限は特に限定されないが、好ましくは１０００万以下、より好ましくは７００万以下である。
なお、本明細書において、重量平均分子量（Ｍｗ）は、後述の実施例に記載の方法により測定される。

以上のように、本発明の製造方法では、イソプレノイドを効率的に製造できる。このような効果は、例えば、１−^１４Ｃラベルされたイソペンテニル二リン酸をモノマーとして用い、その放射活性を測定することなどにより、明らかにできる。
また、極性が互いに異なる３種の溶媒を用いて、プレニル鎖延長反応後の溶液から、高分子量のイソプレノイドを分離抽出することで、高分子量イソプレノイドの製造効率を明らかにできる。

以下に、プレニル鎖延長反応後の溶液から、高分子量のイソプレノイドを分離抽出する方法について具体的に説明する。
反応後の溶液に、まず、飽和ＮａＣｌ水溶液及びジエチルエーテルを加え、ジエチルエーテル相にイソペンテノールを抽出する。そして、このジエチルエーテル相を除去することにより、イソペンテノールの分離を行う。次いで、残った水相に水飽和ブタノールを加え、ブタノール相に中鎖長（Ｃ_１０〜Ｃ_１００程度）のイソプレノイドを抽出する。このブタノール相を除去することにより、中鎖長のイソプレノイドの分離を行う。その後さらに、水相とブタノール相の界面で凝固した高分子量のイソプレノイド（長鎖長（Ｃ_１００を超える）のイソプレノイド）をトルエン／ヘキサン（１：１）溶液に溶解させ、トルエン／ヘキサン相に高分子量のイソプレノイドを抽出することができる。
ラテックス中には、ホスファターゼが含まれており、該ホスファターゼがイソペンテニル二リン酸をイソペンテノールへ加水分解する。そのため、ジエチルエーテル抽出を行わなかった場合（イソペンテノールの分離を行わなかった場合）、イソペンテノールがトルエン／ヘキサン相に抽出されてしまい、ホスファターゼ活性の影響を除去できず、トルエン／ヘキサン相のイソプレノイド合成活性を正確に評価できない。

実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

以下、実施例及び比較例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
なお、各種バッファーは、表１〜６に示すｐＨに調整した。
天然ゴムラテックス：調製例１
Ｃ−セラム層：調製例２
精製ＳＲＰ層（小ゴム粒子層２）：調製例３
Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ：酢酸バッファー
Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ：クエン酸バッファー
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ：リン酸カリウムバッファー
Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｂｕｆｆｅｒ：トリス−塩酸バッファー
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ：グリシン−水酸化ナトリウムバッファー
ＣＨＥＳ ｂｕｆｆｅｒ：２−(シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸バッファー
ＣＡＰＳ ｂｕｆｆｅｒ：３−(シクロヘキシルアミノ)−１−プロパンスルホン酸バッファー
アリル性二リン酸（ＦＰＰ）：ファルネシル二リン酸
［１−^１４Ｃ］ＩＰＰ：１−^１４Ｃラベルされたイソペンテニル二リン酸（比活性：５Ｃｉ／ｍｏｌ）

（調製例１）
（天然ゴムラテックスの採取）
定期的に天然ゴムラテックスを採集しているパラゴムノキ（ヘベア・ブラジリエンシス樹）をタッピングして、新鮮な天然ゴムラテックスを採取した。なお、タッピング開始から１０分未満に得られた分を廃棄し、それ以降に得られた分を使用した。得られた天然ゴムラテックスを５℃以下に冷却された容器に集め、使用するまで冷蔵（５℃以下）で保管した。

（調製例２）
（天然ゴムラテックスの遠心分離、ＳＲＰ層及びＣ−セラム層の回収）
新鮮な天然ゴムラテックスを遠心管に入れ、１２０００Ｇで３０分間遠心を行い、天然ゴムラテックスを２層に分離した。上層のゴム層を除去し、下層を回収した。
次いで、該下層を４３０００Ｇで６０分間遠心し、５層に分離した。上記５層は、最上層から順に、ラバーフラクション層（ゴム層）、ＳＲＰ層（小ゴム粒子層１）、フレイウィスリング層（Ｆｒｅｙ−Ｗｙｓｓｌｉｎｇ層）、Ｃ−セラム層（可溶タンパク質層）、ボトムフラクション層（膜タンパク質層）であった（図１）。
このうち、ＳＲＰ層及びＣ−セラム層を回収した。

（調製例３）
（精製ＳＲＰ（小ゴム粒子）層の回収）
得られたＳＲＰ層に５倍量の５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）を加え、５００００Ｇで３０分間遠心を行い、ＳＲＰ層を精製、回収した。同様の操作を３回繰り返してＳＲＰ層を精製し、精製ＳＲＰ層（小ゴム粒子層２）を回収した（図２）。

（タンパク質濃度の測定）
Ｃ−セラム層及び精製ＳＲＰ層のタンパク質濃度は、ブラッドフォード法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ：ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて測定した。

実施例及び比較例
表１〜６に従い、２ｍｌマイクロチューブに反応溶液（トータル１００μｌ）を調製した。反応溶液を３０℃で所定時間反応させた。
反応後の溶液を用いて、下記方法により、ジエチルエーテル相（イソペンテノールを含む相）、ブタノール相（Ｃ_１０〜Ｃ_１００程度の中鎖長のポリプレニルニリン酸を含む相）、トルエン／ヘキサン相（高分子量ゴム（Ｃ_１００を超える長鎖長のイソプレノイド）を含む相）を得て、各相について放射活性の測定を行った。
放射活性の測定結果から、ＩＰＰ取り込み率、反応効率、平均容積生産性を下記方法により算出した。また、得られたイソプレノイドの重量平均分子量Ｍｗを下記方法により測定した。
結果を表１〜６に示す。

（放射活性の測定）
反応後の溶液に、飽和ＮａＣｌ２００μｌ及びジエチルエーテル１ｍｌを加え、イソペンテノールの抽出を行った。ジエチルエーテル相は他の容器に取り除き、放射活性の測定に用いた。なお、イソペンテノールは、ホスファターゼ活性によりＩＰＰのニリン酸が脱離しアルコールへと変換されることで生成する。
次いで、水相に水飽和ブタノール０．５ｍｌを加え、水飽和ブタノールを用いた中鎖長のポリプレニルニリン酸の抽出操作を２回行った。ブタノール相は他の容器に取り除き、放射活性の測定に用いた。
その後さらに、水相とブタノール相との界面、又は水相に存在していた高分子量ゴムをトルエン／ヘキサン（１：１）０．５ｍｌに抽出した。トルエン／ヘキサンを用いた高分子量ゴムの抽出操作を２回行った。これにより高分子量ゴムを含むトルエン／ヘキサン相を得た。
ジエチルエーテル相、ブタノール相、トルエン／ヘキサン相について、液体シンチレーションカウンターを用いて^１４Ｃの放射活性を測定した。

（ＩＰＰ取り込み率（天然ゴム生合成酵素活性）の算出）
２時間反応させた反応溶液のジエチルエーテル相、ブタノール相、トルエン／ヘキサン相を用いて、放射活性の測定を行い、下記式によりＩＰＰ取り込み率（％）を算出した。
ＩＰＰ取り込み率（％）＝取り込まれたＩＰＰの放射活性量／添加したＩＰＰの放射活性量×１００

（反応効率の算出）
反応開始２時間まで（反応開始後０時間、０．５時間、１時間、２時間）の反応溶液のトルエン／ヘキサン相を用いて、放射活性の測定を行い、反応時間を横軸、放射活性を縦軸にプロットした。これにより、反応溶液のトルエン／ヘキサン相の放射活性は、反応開始２時間まで、反応時間に対して直線的に増加することがわかった。そこで、これらのプロットを直線近似し、反応初速度（ｄｐｍ／時間）を算出し、上記反応初速度を下記条件に従い換算し、Ｃ−セラム層又は精製ＳＲＰ層のタンパク質５０μｇあたりの反応効率（ｎｍｏｌ／（時間・５０μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ））を算出した。
１ｄｐｍ＝４．５０５×１０^−１３Ｃｉ
ＩＰＰの比活性：５Ｃｉ／ｍｏｌ

（平均容積生産性（生成物収量）の算出）
前述の反応効率（ｎｍｏｌ／（時間・５０μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ））を、イソプレン（Ｃ_５Ｈ_８）単位当たりの分子量を６８として、平均容積生産性（ｍｇ／（時間・５０μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ・ｌ））を算出した。

（重量平均分子量Ｍｗの測定）
２時間反応させた反応溶液のトルエン／ヘキサン相を用いて、トルエン／ヘキサン相中の高分子量ゴムについて、Ｒａｄｉｏ ＨＰＬＣ（下記条件）により重量平均分子量Ｍｗを測定した。
ＨＰＬＣシステム：ＧＩＬＳＯＮ社製
カラム：ＴＯＳＯＨ社製のＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＭＰ（ＸＬ），ＴＳＫｇｅｌ Ｍｕｌｔｉｐｏｒｅ ＨＸＬ−Ｍ（２本）
カラム温度：４０℃
溶媒：Ｍｅｒｃｋ社製のＴＨＦ
流速：１ｍｌ／分
ＵＶ検出：２１５ｎｍ
ＲＩ検出：Ｒａｍｏｎａ Ｓｔａｒ（Ｒａｙｔｅｓｔ ＧｍｂＨ）

表１〜６に示す通り、ｐＨ８．５未満の比較例では、高分子量ゴム（トルエン／ヘキサン相）のＩＰＰ取り込み率が低く、イソプレノイドの充分な製造効率が得られなかった。
一方、ｐＨ８．５以上の実施例では、高分子量ゴムのＩＰＰ取り込み率が極めて高く、早い反応速度（高い反応効率）で高分子量ゴムが製造された。また、実施例では平均容積生産性も極めて高かった。特に、マグネシウムイオンを反応溶液に添加することで、優れた製造効率が得られた（実施例１９など）。
なお、本実施例では物理的な相互作用により酵素に結合したＩＰＰの放射活性は測定されず、プレニル鎖延長反応により取り込まれたＩＰＰの放射活性が測定されたこともわかった。これは、１００℃で１０分間熱処理（変性処理）した酵素（Ｃ−セラム層及び精製ＳＲＰ層）を用いて反応させた場合、トルエン／ヘキサン相において放射活性が測定されなかったためである。

Claims (15)

1. ヘベア・ブラジリエンシス樹から採取したラテックスを遠心分離して得られた小ゴム粒子を含む層若しくはＣ−セラム層、イソペンテニル二リン酸及び低分子量アリル性二リン酸を含む混合液を混合してプレニル鎖延長反応を行い、
   前記混合した液のｐＨが、８．５以上１０．５以下である
   イソプレノイドの製造方法。
2. 前記ｐＨが９以上である請求項１記載のイソプレノイドの製造方法。
3. ホスファターゼ阻害剤の存在下、前記プレニル鎖延長反応を行う請求項１又は２記載のイソプレノイドの製造方法。
4. 前記ホスファターゼ阻害剤がフッ化カリウムである請求項３記載のイソプレノイドの製造方法。
5. 前記イソプレノイドの重量平均分子量が１０万以上である請求項１〜４のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
6. 前記プレニル鎖延長反応は、低分子量アリル性二リン酸に前記イソペンテニル二リン酸が順次縮合する反応である請求項１〜５のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
7. 前記小ゴム粒子を含む層は、下記工程１〜２により得られる下記小ゴム粒子層１である請求項１〜６のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
   工程１：ヘベア・ブラジリエンシス樹から採取したラテックスを遠心分離して２層に分離し、前記２層のうちの下層を得る工程。
   工程２：得られた前記下層を遠心分離して５層に分離し、前記５層のうちの最上層から数えて２層目の小ゴム粒子層１を得る工程。
8. 前記工程１の前記遠心分離が１００００〜１８０００Ｇで行われ、
   前記工程２の前記遠心分離が３５０００〜５００００Ｇで行われる請求項７記載のイソプレノイドの製造方法。
9. 前記小ゴム粒子を含む層は、下記工程３により得られる下記小ゴム粒子層２である請求項７記載のイソプレノイドの製造方法。
   工程３：前記小ゴム粒子層１を緩衝液で希釈し、希釈液を４７０００Ｇ以上で遠心分離し、小ゴム粒子層２を得る工程。
10. 前記工程１〜３の前記各遠心分離が０〜８℃で行われる請求項９記載のイソプレノイドの製造方法。
11. 前記Ｃ−セラム層は、下記工程１、４により得られる下記Ｃ−セラム層である請求項１〜６のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
    工程１：ヘベア・ブラジリエンシス樹から採取したラテックスを遠心分離して２層に分離し、前記２層のうちの下層を得る工程。
    工程４：得られた前記下層を遠心分離して５層に分離し、前記５層のうちの最上層から数えて４層目のＣ−セラム層を得る工程。
12. 前記ラテックスは、タッピングを開始してから１０分以上経過した後に採取されたものである請求項１〜１１のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
13. 前記ラテックスは、５℃以下で保存されたものである請求項１〜１２のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
14. 金属イオンの存在下、前記プレニル鎖延長反応を行う請求項１〜１３のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
15. 前記金属イオンがマグネシウムイオンである請求項１４記載のイソプレノイドの製造方法。

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