CN1004145B - 橡胶聚合酶的生产方法 - Google Patents

Abstract

公开基本上纯的橡胶聚合酶及其类似物。基本上纯的橡胶聚合酶可以从化学稳定的巴西三叶胶胶乳中进行分离和提纯。类似物是巴西三叶胶聚合酶的同系物，或者在酶学方面具有同样功能。本发明提出了橡胶聚合酶的分离和提纯的种种方法。同时还提出了用基本上纯的橡胶聚合酶生产天然橡胶或有关共聚物的应用。

Description

橡胶聚合酶的生产方法

本发明涉及到基本上纯化的各种橡胶聚合酶、它们的生产方法以及在天然橡胶（特别是高分子量的天然橡胶）的体外合成方面的用途。

天然橡胶存在于上千种植物中。曾报道过几种真菌也可用来合成天然橡胶。大部份植物以及所有的真菌都含有少量的橡胶，但其分子量太低，做为橡胶而言无商业价值。

商业上天然橡胶的二个来源是巴西三叶胶和银胶菊。巴西三叶胶是天然橡胶的主要来源，银胶菊是本世纪前半期天然橡胶的商业来源，1910年占世界供应量的10%。二次大战时，美国在东南亚的天然橡胶来源被切断，银胶菊做为紧急橡胶生产计划的一部分，由美国林业部进行过大规模的种植。战后，巴西三叶胶的高使用性能和廉价，使银胶菊不再成为具有吸引力的天然橡胶的来源，巴西三叶胶的优势一直延续到今天。最近各种经济和政治的倾向使高分子量的天然橡胶向另一些来源发展。这另一些来源之一是体外合成。

巴西三叶胶的橡胶生物合成路线已建立并进行过详述，阿尔齐尔（Archer）和奥德利（Audley）曾发表在酶学进展（Advances in Enzymology）（第29期，221-257页，1967年）学报上;而李南（Lynen）曾发表在马来西亚橡胶研究所会刊上（J.Rubber Res Inst Malaya，21（4），389-406，1969）。橡胶生物合成的最后一步是借助于橡胶聚合酶的催化反应，而橡胶聚合酶可存在于胶乳中。酶的催化反应是使异戊烯焦磷酸（IPP）和焦磷酸烯丙酯进行聚合反应而制取橡胶，同时产生无机焦磷酸。这种酶也称为橡胶转移酶或焦磷酸顺式-1，4-聚异戊二烯：焦磷酸异戊烯酯，顺式-1，4-聚异戊二烯转移酶。它是被称为异戊烯转移酶的酶家族中的一个成员。它可使焦磷酸异戊烯酯聚合成不同的链长和不同的立体化学构象。“橡胶聚合酶”这一术语，在本文中用来描述该酶。

在巴西三叶胶胶乳中，该酶主要是与橡胶粒子结合在一起，但也可在溶液中发见（Archer和AUDLEY），橡胶的合成发生在橡胶粒子的表面（Lynen）。虽然橡胶聚合酶的研究曾在很多试验室中进行（Archer和Audley，Lynen，以及Archer和Cockbain）后者的文章发表在“酶学方法”中（见Methods in Enzymology，15，476-481，1969），但从巴西三叶胶或其他来源的基本上纯化的橡胶聚合酶的提取，在本文之前尚未成功。

基本上纯化形式的橡胶聚合酶，对橡胶工业而言，将具有很重要的多方面的用途。该酶即可以固相，又可以游离于溶液中，可用于体内天然橡胶的生产。这样不用巴西三叶胶胶乳也可以生产橡胶，并且可在工厂附近的许多地方直接将橡胶加工成最后部件，例如加工成轮胎。另外，用体外法生产的天然橡胶，甚至超过了从巴西三叶胶胶乳生产的橡胶，因为用体外法生产天然橡胶的各种条件能够控制，这样得到的橡胶纯度高，或者具有其他人们所希望的化学或物理性能。例如，体外法橡胶，质量均匀，基本上没有各种蛋白质和脂类，而它们会影响天然橡胶的某些用途。

其它的重要用途是用来制备基本上纯的橡胶聚合酶的各种抗体。这类抗体可用来发展植物的和其他生物的筛选方法，去测定在这类生物体内的橡胶聚合酶的数量。

另一个重要的用途是，纯化的酶的氨基酸顺序可以被测知。根据该酶的氨基酸顺序，能够合成出橡胶聚合酶的基因或者是该基团的信息。一旦该酶的基团被测定，就能将其生产天然橡胶的能力引入到其他生物体中。最后，如果知道了更多的关于酶的组成和结构，可用位置定向诱变法去生产具有各种催化性能的橡胶聚合酶。这样就更能够将天然橡胶通过体内和体外法的生物合成加以控制。

本发明的目的是提供各种基本上纯化形式的橡胶聚合酶，和具有相等或较高性能的这类聚合酶的活性类似物。

本发明的另一目的是提供橡胶聚合酶的各种分离及提纯方法。

本发明的其他目的是提供用基本上纯化形式的橡胶聚合酶去生产天然橡胶，特别是高分子量的天然橡胶或者生产共聚物。

本发明的更进一步的目的是提供用来生产天然橡胶（特别是高分子量天然橡胶）方法中的一种配料的制备方法。

为达到上述各目的，需要寻找基本上纯化形式的橡胶聚合酶。在一个较好的实例中，基本上纯化形式的橡胶聚合酶是从巴西三叶胶胶乳中找到的。在另外的实例中，提供的各种活性类似物基本上是各种纯的多肽，这类多肽至少有一个活性部位，具有橡胶聚合酶的活性，其部位同从巴西三叶胶胶乳中发现的橡胶聚合酶基本上同源，或者在酶学性质方面可与从巴西三叶胶胶乳中找到的这类聚合酶具有同等功能。在其他的实例中，活性部位可以改变，形成具有较高橡胶聚合酶活性的多肽。依据本发明中的一个特别好的实例，橡胶聚合酶是单体，分子量大约从36，000至44，000，是用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的。

根据本发明可提供一种基本纯化形式的橡胶聚合酶的生产方法，橡胶聚合酶是从三叶胶属的一种植物的化学稳定胶乳中提取出来的，胶乳中含有橡胶聚合酶，它可与胶乳中的橡胶粒子结合在一起，也可游离在溶液中，还提供一种橡胶聚合酶的分离方法，这一方法是将游离的橡胶聚合酶从胶乳中分离出来。再将分离的橡胶聚合酶进行提纯。化学稳定胶乳是将一种含有多羟基化合物，一种抗微生物试剂，缓冲试剂的稳定组合物加到入胶乳中而制备的。在一个较好的实例中，稳定组合物还含有巯基化合物。

溶液中的游离的橡胶聚合酶可以用层析法从橡胶中分离出来，最好选用离子交换层析分离法。

在较好的实例中，橡胶聚合酶是用透析法将分离后的橡胶聚合酶制成透析液而提纯的。将凝胶加到透析液中，使之生成凝胶-聚合物酶复合物，将此复合物分离，从复合物中提取聚合酶，然后将提取后的聚合酶再通过凝胶过滤层析，就可生产出基本上纯化的橡胶聚合酶。

在另外的较好的实例中，聚合酶的分离与提纯是使化学稳定胶乳与橡胶聚合酶的固相抗体接触，使生成橡胶聚合酶抗体复合物，分离此复合物，并从复合物中回收橡胶聚合酶。在另一实例中，橡胶聚合酶的提纯是将溶液中的游离的橡胶聚合酶与橡胶聚合酶的固相抗体接触，使生成橡胶聚合酶-抗体复合物，分离此复合物，然后从复合物中回收橡胶聚合酶。

本发明还提供用生成含有异戊烯焦磷酸，焦磷酸烯丙酯和基本上纯化的橡胶聚合酶的反应混合物生产天然橡胶的方法;将反应混合物培育足够的时间，用于生产天然橡胶;再将天然橡胶回收。在一个较好的实例中，可生产高分子量的天然橡胶。

在另一个实例中，提供了一个生产共聚物的方法，该方法是用生成一种含有异戊烯焦磷酸和至少含有一种其他的可共聚的单体，焦磷酸烯丙酯，和基本上纯化的橡胶聚合酶的反应混合物;将反应混合物培育足够时间使生成共聚物;然后再回收共聚物。

本发明还涉及到一种制备焦磷酸二甲基烯丙酯的方法：该方法是使之生成含有异戊烯焦磷酸，异戊烯焦磷酸异构酶，一种二价金属离子，一种磷酸酶抑制剂和缓冲试剂的反应混合物;再将反应混合物培育足够时间，使生成焦磷酸二甲基烯丙酯;然后再回收焦磷酸二甲基烯丙酯。

本发明的其他各项目的和优点将放在本发明的说明中进行阐述和实施。这些目的和优点是可以用各种手段和联合装置，特别是用在附加说明中提出的各种手段和联合装置而能实现和得到。

现在将用本发明的较好实例进行详细介绍，同时结合下述各例用来说明本发明的各项原理。

本发明与各种橡胶聚合酶，特别与分离、生产基本纯化形式的各种橡胶聚合酶有关。这里引用的“橡胶聚合酶”意味着是一种多肽化合物，它可催化异戊烯焦磷酸烯和焦磷酸烯丙酯生成天然橡胶（顺式-1，4-聚异戊二烯）。术语“基本上纯化的”和“基本上提纯的”，用来说明橡胶聚合酶时，将意味着橡胶聚合酶基本上无蛋白质或者不是橡胶聚合酶的多肽。本发明中的基本上纯化的橡胶聚合酶，以重量计，其纯度至少是75%，较好者是85%，最好者至少90%。换言之，本发明中的基本纯的橡胶聚合酶中所含各种蛋白质或不是橡胶聚合酶的多肽，以重量计，不超过25%，较好者不超过15%，最好者不超过10%。

在本发明的最好实例中，橡胶聚合酶的从巴西三叶胶胶乳中得来的，其亚基分子量为约36，000至44，000，是用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的。酶的活性形式是单体，可用凝胶过滤层析测定。

本发明的各种橡胶聚合酶可用下述方法生产出基本上纯化的形式：

①可从三叶胶属的植物中，制取化学稳定的胶乳;

②分离橡胶聚合酶，它在胶乳溶液中呈游离状态;

③提纯分离后的橡胶聚合酶。

橡胶聚合酶的提纯需要大量的胶乳，装船时应先稳定胶乳，以防凝聚和发酵，它会导致聚合酶活性的丧失。最方便的稳定方法是将胶乳进行冷冻。然而这是一个昂贵而麻烦的办法。本发明提供了一种可将胶乳进行化学稳定而又可在室温下装船的方法。用这种方法稳定的胶乳，至少在10天内几乎没有凝聚和发酵现象，并使橡胶聚合酶的活性保持高水平。

稳定胶乳的方法是将一种稳定组合物加到胶乳中。该稳定组合物含有多羟基化合物，防微生物试剂和缓冲剂。在较好的实例中，稳定组合物还含有巯基化合物，例如半胱氨酸或谷胱甘肽，它可帮助聚合酶稳定。在特别好的实例中，稳定组合物是溶液。可将大约1至10个体积，最好是约2个体的稳定液与大约1个体积的胶乳混合。

较好的多羟基化合物有甘油、山梨糖醇、蔗糖等类似物。甘油最好。多羟基化合物可使橡胶聚合酶稳定，并阻止胶乳中的橡胶粒子凝聚，可防止或限制橡胶聚合酶失去活性。

防微生物试剂也可帮助防止凝聚和发酵反应。较好的防微生物试剂是叠氮化钠。

缓冲剂可限制pH值，而pH值变化能使酶失活。缓冲剂的选择是不受限制的，然而我们发现碳酸氢钠或磷酸钾特别有用。特别值得一提的是，0.1M的碳酸氢钠或0.1M的磷酸钾较好。

在较好的实例中，稳定溶液的组成如下：大约10%至80%（重量/体积）的甘油，和大约0.001%至1%（重量/体积）的叠氮化钠，以及大约0.1M的碳酸氢钠。碳酸氢钠的pH可以调节，以便使稳定混合物溶液的pH值保持在大约7至12，而最好为8。在一个特别好的实例中，稳定溶液是由大约50%（重量/体积）的甘油，大约0.3%（重量/体积）的叠氮化钠，大约0.1M的碳酸氢钠和大约5mM的半胱氨酸组成的。大约10%～20%的如上述方法稳定的巴西三叶胶胶乳橡胶聚合酶，是游离于溶液中。而其余的酶，紧紧地与胶乳中的橡胶粒子结合在一起，结合的酶很难从橡胶粒子上进行分离，除非使酶失活，本发明可使游离于溶液而又保持活性的橡胶聚合酶分离出来，并能基本上纯化。

游离的橡胶聚合酶可以用已知的一般分离技术，从胶乳中将其分离。本发明采用各项技术是工艺上现有规范中的一般的各项熟练技术。色谱分离法特别好。在特殊情况下，可用阴离子交换树脂的离子交换层析法。较好的树脂是二乙基氨乙基（DEAE）纤维素。将树脂加到胶乳中进行混合，这样游离的橡胶聚合酶就与树脂结合在一起。离心回收树脂并洗涤树脂，把酶用已知的技术从树脂上洗脱下来。与树脂结合在一起的某些橡胶粒子也被洗脱下来，然后再用超离心技术将它分离出来。分离温度大约在0℃至30℃，最好是在大约0℃至4℃。

就这一点而言，酶也只是进行了部分提纯，它还可用工艺上已知的一般技术进行进一步的提纯，本发明中所采用的技术就是工艺上现有规范中通用的各种技术。这些技术有：色谱分离法（其中又可分为亲和层析、离子交换层析、分子排阻层析和吸附层析等）、沉淀法、透析法、离心法、电泳法和等电聚焦法等，使用时可将它们变换使用，也可将它们联合使用。按照分子的物理和化学特性，在设计分离试验时，可以有计划的使用这些技术中的一种或多种。分子的物化物性有：橡胶聚合酶的疏水性、电荷和分子量。采用每种技术试验后，可得到不同组份，这些组份具有催化生成高分子量天然橡胶的能力。这些试验技术之一，李南在马来西亚橡胶研究所会刊上曾提出过（见会刊第21（4）期，389-406页，1967年）。具有橡胶聚合酶活性的那些部分，可在连续操作中的下一个技术中再进行分离产生的新的各组份再被鉴定。反复进行，直到得到一种组份，该组分能催化天然橡胶的形成。这组份中活性橡胶聚合酶的重量百分比，至少要含有75%，85%也可以，最好为90%。提纯时的温度可在0℃至30℃下进行，最好是在0℃至4℃下进行。

在较好的一个实例中，从离子交换树脂中回收的部份提纯的橡胶聚合酶，可以通过纤维素膜进行透析，能将分子量小于12，000至14，000的所有物质除掉。透析介质是由pH值大约为5.5至6.7的标准缓冲溶液组成的，其pH值最好为6.2。这种透析作用会降低溶液的离子张度，将盐和稳定剂除去后也会使溶液的pH降至6.2，同时还可除掉酶的抑制剂。使用工艺上已知其他技术也可达到同样目的。溶液离子浓度的降低，对酶的有效提纯是很重要的。

然后将透析液与能吸附蛋白质或多肽的吸附剂，例如7-氧化铝进行混合，时间大约1小时。吸附剂可除去聚合酶的抑制剂，吸附剂的使用，我们相信不影响聚合酶的提纯。它可以用离心法除掉。

然后将含有橡胶聚合酶的上层清液与0.1至10体积的一种凝胶物质，例如磷酸钙进行混合，与酶生成复合物。混合物搅拌约1至100分钟，最好为30分钟。希望将混合物静止约10至100分钟，50分钟最好。然后用离心法将复合物提取出来，而上层清液弃之不要。再用缓冲溶液复合物进行洗涤，酶就被抽提出来。这时抽提物用十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定，大约有二个至三个主要的谱带和几条小带。

然后再将提出物进行凝胶过滤层析分离。可得到基本上纯的橡胶聚合酶，其纯度以重量计至少可达90%。若需要还可将基本上纯的橡胶聚合酶用层析分离法进一步提纯，最好采用亲合层析或离子交换层析法。

基本上提纯过的橡胶聚合酶可以用来生产酶的各种抗体。各种抗体对本身的抗原多肽具有很高的特弃性及很高的亲合力。与不溶解的载体连接时，它们很容易的和有效的从含有蛋白质或其他物质的混合物中将多肽分离出来。让固相的抗体与混合物接触，可使橡胶聚合酶与各种抗体结合，然后将混合物除去，并将含有与抗体结合的聚合酶的不溶解的载体进行洗涤，混合物中的痕量杂质可除掉。然后再将与抗体中结合的聚合酶分离和提取出来。使用抗体的这种方法，工艺上是众所周知的。在斯扣普的蛋白质提纯、原理和应用一书中曾提到（见纽约，斯平哥尔·维早拉哥，1982年版，132至136页）。

在本发明中，从化学稳定胶乳中分离后的在溶液中呈游离状的橡胶聚合酶，与固相的抗体接触，这样就可以生成聚合酶抗体复合物，这类复合物可从溶液中分离出来。又可从这类复合物中将聚合酶提取成基本上纯的形式。另外，化学稳定胶乳本身能够与固相抗体接触后，形成聚合酶抗体复合物。然后再将这类复合物从胶乳中分离出来。有些聚合酶抗体复合物也可以与橡胶粒子结合在一起，当提取酶时，有些酶又可与橡胶粒子结合在一起。结合酶的橡胶粒子，可用离心法将其分离出来，基本上纯的橡胶聚合酶便留在溶液中。

抗橡胶聚合酶的抗体，可以用工艺上已知的各种技术进行制造。多克隆抗体可以将橡胶聚合酶注射到兔、山羊、马和其他的动物身上而制造。然后从动物身上将血样抽出，抗体的存在可用双向扩散等方法测定，或者用碘¹²⁵示踪蛋白质A来检测抗体和抗原聚集体。从动物血清中可得到抗聚合酶的抗体。一般只需要部份提纯的抗体。在另一实例中，单克隆抗体可以代替多克隆抗体，然而实际上，只有用部分提纯的，含有橡胶聚合酶和其他多肽的混合物进行试验时，单克隆最适宜。单克隆抗体可用考拉尔（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）的技术制备（见《自然》，256期，495页，1975年）。

不必费力去制备特定的橡胶聚合酶抗原来制备所需的抗体。假若用不同种类的各种植物制备的橡胶聚合酶是一样或基本相似的话，抗一种聚合酶抗体就有可能与从另一种产生橡胶的植物中的橡胶聚合酶结合在一起。因此，利用本发明说明中提及的用于三叶胶属植物中基本上纯化的橡胶聚合酶生产的抗体，与使用抗体提纯蛋白质类物质的技术相结合，就可以检验任何一种生物是否具有产生橡胶聚合酶的能力。若找到这种能力，就可将这种聚合酶进行分离和提纯。

可用各种技术去固定化抗体，然后使它们与含有橡胶聚合酶的混合物接触。免疫吸附亲合层析技术为最好。在这项技术中，各种抗体与层析柱中吸附剂偶连，例如与溴化氰活化的琼脂糖偶连。混合物以足够慢的流速流过层析柱，那么橡胶聚合酶就能充分地与固定的抗体作用。将层析柱洗涤后，然后再洗脱，以便聚合酶与抗体分离。各种去垢剂或缓冲剂都可以用来洗提聚合酶。

正如前述，天然橡胶可从很多不同种类的各种植物中找到。但天然橡胶最好的商业来源，巴西三叶胶，是三叶胶属的九大品种之一。虽然其他品种的橡胶生物合成还不如巴西三叶胶的研究那样成熟，但人们都期望，其他品种的橡胶聚合酶能与从巴西三叶胶中分离和提纯的聚合酶相同或基本相似。同样人们也期望从银胶菊中找到的橡胶聚合酶，也能与从巴西三叶胶来源的聚合酶是相同的或基本相似。在酶学性质上这类聚合酶与从巴西三叶胶胶乳中得到的橡胶聚合酶是相当的。即，它们可以从异戊烯焦磷酸和焦磷酸烯丙酯催化合成天然橡胶。因此本发明的各项说明都可应用于从生产天然橡胶的植物中将橡胶聚合酶进行分离和提纯，这样的一些酶也包括在本发明的范围内。

具有共同的结构因素，作用机理和在相对少量的氨基酸残基方面彼此不同的一组橡胶聚合酶也包括在本发明中。一旦应用从三叶胶胶乳中提纯橡胶聚合酶所制备的抗体，以及本发明所用的方法，定性并分离了这样一组橡胶聚合酶，那么，除了从不同植物中进行分离外，还可用工艺上熟知的技术，将这些聚合酶用化学修饰或遗传变异，例如位置定向诱导法去生产。化学修饰能提高原来的聚合酶的活性，或者对其活性无影响。除此之外，本发明给出活性橡胶聚合酶的基因编码克隆。一旦这种基因被克隆，活性物质的许多变体能用碱基取代和将修饰后的基因引入到各种宿主中的方法制造出来。

本发明中的橡胶聚合酶可以含有一个或多个不影响它们的活性的氨基酸序列。这些序列可以用工艺上已知技术除去，例如用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和有关的蛋白水解酶的限制性蛋白水解法将那些不需要的序列除去。那么这一类的橡胶聚合酶也包括在本发明中。

本发明中的各种橡胶聚合酶都可以用来生产任一分子量的天然橡胶，其范围为1000-2，000，000。这类橡胶可用生成含有异戊烯焦磷酸，焦磷酸烯丙酯和纯化的或基本上纯化的橡胶聚合酶的反应混合物的方法去生产;将反应混合物培育足够时间，以便用来生产天然橡胶，并将其回收。本发明中的纯化的或基本上纯化的橡胶聚合酶，有可能用于限制竞争反应，这样会减少杂质，因此比较容易和便宜的进行进一步提纯。

焦磷酸烯丙酯可以是低分子量的或者高分子量的天然橡胶粒子，或者是一种引发剂，例如，焦磷酸二甲基烯丙酯（DMAPP）。使用低分子量天然橡胶时，会将这些低分子量的天然橡胶转变成高分子量的天然橡胶。反应时用焦磷酸二甲基烯丙酯和天然橡胶颗粒最好。用体外法生产的天然橡胶的分子量可以用改变反应时间，异戊烯焦磷和焦磷酸烯丙酯的比例，焦磷酸烯丙酯的分子量，或将它们联合起来使用，进行控制。在较好的实例中，用2-10mM的异戊烯焦磷酸，3-50μM的焦磷酸二甲基烯丙酯，0.1%-1%（重量/体积）的橡胶粒子，0.1%-1%（重量/体积）的基本上纯化的聚合酶可生产出高分子量的天然橡胶。

在较好的实例中，反应混合物还可含有二价的金属离子，重金属的螯合剂，酶的稳定剂和缓冲剂。二价金属离子的最好来源是氯化镁。虽然对反应说来，只需要痕量的二价离子，然而象Mg这样的离了在大多数试剂中都能找到，因此在反应混合物中，不一定加入氯化镁或类似的化合物。在反应混合物中氯化镁的浓度可从0至100mM。当使用时，浓度范围是0.01至100mM，但较好浓度是1-10mM。

重金属螯合物可以看成是聚合酶的保护剂，但不影响反应。乙二胺四醋酸二钾盐（EDTA）特别适用。浓度范围为0至100mM。使用时，浓度可从0.01至100mM。最好是5-10mM。

巯基化合物，象半胱氨酸和谷胱甘肽，对聚合酶而言，也可以看做为保护剂，而且不影响反应。谷胱甘肽特别适用。它的浓度范围为0-100mM。使用时，浓度可从0.01至100mM，最好是在1至10mM。

反应能在pH值大约5至10之间进行，最好在7至8之间。pH值可用缓冲试剂加以控制，很多缓冲试剂都可适用。使用较好者是三羟甲基氨基甲烷缓冲液。浓度范围是1mM至10M，最适的浓度是0.1M至1.6M。

反应可在大约4℃至60℃下进行，时间大约1至16小时。较好的温度约在30℃，反应时间大约4至8小时。

焦磷酸二甲基烯丙酯可以在含有异戊烯焦磷酸、异戊烯焦磷酸异构酶、二价金属离子、磷酸酶抑制剂和缓冲剂的反应混合物中去制备;培育反应混合物;并回收焦磷酸二甲基烯丙酯。焦磷酸二甲基烯丙酯可将混合物通过一个截止分子量为10，000的膜，将其过滤而回收。焦磷酸二甲基烯丙酯存在于滤液中。将反应混合物在大约35至40℃，最好在37℃下培育大约1-2小时。最适宜的二价金属离了是Mg，最好的磷酸酶的抑制剂是氟化钠，可用的缓冲剂是碳酸氢钠。异戊烯焦磷酸异构酶可用工艺上已知技术进行制备。这种技术是阿格瑞诸夫（Agranoff）等人提出的（见生物化学杂志235期，P326-332，1960）。

在另一实例中，可用提纯的或基本上提纯的橡胶聚合酶，从异戊烯焦磷酸和至少一个其他的可共聚的单体，以及焦磷烯丙酯存在下，在制备天然橡胶方法相同的条件下去生产共聚物。最合适的可共聚的单体有丁二烯、苯乙烯、丙烯腈和乙烯。共聚物的分子量能用改变反应时间、异戊烯焦磷酸对焦磷酸烯丙酯的比例、焦磷酸烯丙酯的分子量、可共聚单体的用量和将它们联合使用等办法，加以控制。

用本发明方法生产的天然橡胶，可以用工艺上已知的技术进行分析。这些技术包括臭氧分解反应（见杷克（Park）和棒尼尔（Bonner），生物化学杂志，233：341-343，1958）;反相薄层层析（见布衣（Bni）和阿木斯窗（Armstrong），液相色谱杂志7：29，1984）;和溶剂萃取（见北呢底克特（Benedict）等人的文章，植物生理学，27：897-899，1983）等方法。

本发明的一些说明可应用于一些特别问题或条件下。本发明的各种产物，它们的生产方法和使用方法见下述各实例。

实例1：巴西三叶胶胶乳的稳定作用和橡胶聚合酶

稳定混合物的制备方法如下：将1000克的甘油与1.2升的双蒸水混合。将16克的碳酸氢钠、6克的叠氮化钠和2克的半胱氨酸加入到混合物中。溶液的最终体积大约为2升，含有50%的甘油（重量/体积），0.3%（重量/体积）的叠氮化钠，5mM的半胱氨酸和0.1M的碳酸氢钠。将2升的稳定溶液与1升的从巴西三叶胶树上新收集来的胶乳，其中含有30%重量的干固体，进行充分混合。

实例2：从胶乳中分离橡胶聚合酶

用67mM的碳酸氢钠，33%（体积/体积）的甘油，和3mM的半胱氨酸使之与二乙胺基乙基纤维素平衡。在溶液中处于自由状态的橡胶聚合酶的所有分离操作都是在0℃至4℃下进行的。将胶乳和二乙胺基乙基纤维素在一起培育一小时。然后将二乙胺基乙基纤维素离心分离10分钟转速16，000×g。然后再将二乙胺基乙基纤维素重新悬浮在0.3升与平衡DEAE纤维素相同的缓冲溶液中，而后再离心分离，条件同上。与二乙胺乙基纤维素结合在一起的橡胶聚合酶，用含有0.4M氯化钠的平衡缓冲溶液将它们洗涤，酶就会被抽提出来。提取过的酶含有橡胶粒了，这是因为物理和静电的作用被二乙胺乙基纤维素捕获的，但是大部分的橡胶聚合酶游离在溶液中。随后在条件235，000×g下超离心，离心1小时，将橡胶从溶液中除去，大部份的橡胶聚合酶便留在溶液中。

实例3：从胶乳中分离橡胶聚合酶

我们设计了另一个用二乙胺乙基纤维素处理胶乳的操作。首先将胶乳离心处理1小时条件28，000×g。胶乳中的橡胶浮在溶液上面。然后用二乙胺乙基纤维素用上述方法处理溶液，不同之处在于在洗涤和抽提时用减压过滤法从溶液中将二乙胺乙基纤维素分离出来。由于在胶乳中的橡胶对二乙胺乙基纤维素-胶乳混合物的过滤有阻止效应，所以用离心法将二乙胺乙基纤维素从未离心的胶乳中进行分离。

从二乙胺乙基纤维素中提取后的橡胶聚合酶，仍含有橡胶。可在235，000×g条件下，离心一小时将其除去。含有足够数量的活性橡胶聚合酶的澄清溶液能做出来。

实例4：橡胶聚合酶的提纯

按实例2生产的、游离于溶液中的橡胶聚合酶，可提纯至几乎是均一的提纯酶时的所有操作都是在0-4℃下进行的。

用实例2生产的橡胶聚合酶澄清液，用15升、1mM的2（N-吗啉）代乙基磺酸，pH值为6.2，透析过夜。在透析后的酶中蛋白质的浓度可用瓦伯格（Warbnrg）和柯瑞斯坦（Chcristian）的方法进行测定（见生物化学杂志，24：206，1931）。每克蛋白质用0.5克的16mg/ml的γ-氧化铝（西格码Sigma化学公司出品），将其加入到溶液中，培育一小时，在10，000×g条件下离心5分钟，将γ-氧化铝从溶液中分离出来，橡胶聚合酶不与γ-氧化铝结合在一起。

磷酸钙凝胶可用袒包（Tsuboi）和胡得逊（Hudson）提出的方法制备（见生物化学杂志，224：879，1957）。用γ-氧化铝处理后的酶，与等体积的磷酸钙凝胶（10mg/ml）混合。混合物搅拌30分钟，然后静止50分钟。将凝胶重新悬浮在30ml用来平衡二乙胺基乙基纤维素（见实例2）的缓冲溶液中，并低速将混合物搅动1分钟。在胶液再次分离前，混合物放置50分钟。然后再用30-100ml的0.2M的磷酸氢二钾（K HPO），33%（重量/体积）的甘油和3mM的2-巯基乙醇混合物，把酶从凝胶中提取出来。

从磷酸钙凝胶中提取出的酶，用ULTrogel ACA44凝胶进行凝胶过滤层析（LKB仪器公司产品），将其进一步提纯。分馏柱用0.2mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液平衡，内含5mM的2-巯基乙醇和1mM的硫酸镁。将酶通过分馏柱，然后月平衡它的同一缓冲溶液，将分馏柱进行洗脱。每200滴做为一组份，将其收集起来。洗脱的酶有一高峰。把含有橡胶聚合酶活性的所有组份都合并起来，合并在一起的各组份的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明：已经提纯的酶几乎是均一的。合并后的各组份，可以用光谱法进行分析，通常大约含有10毫克的蛋白质。

实例5：用基本上纯的橡胶聚合酶合成高分子量天然橡胶

实例4生产的基本上纯化的橡胶聚合酶，可以用来合成高分子量天然橡胶，方法如下：

在一试管中，加入5份2M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH值为8.0），1份0.65M的氯化镁，2份0.225M的乙二胺四醋酸二钾盐，1份0.2M的谷胱甘肽，1份1.5mM的焦磷酸二甲基烯丙酯，1份6mM的异戊烯焦磷酸，和19份经过洗涤的榕橡树橡胶粒子的悬浮液，橡胶含量为0.5%（重量/体积），再加入20份基本上纯化的橡胶聚合酶（0.2mg/ml），用来引发反应。混合物在30℃放置4小时。

逐步加入100份0.1M的乙二胺四醋酸二钾盐和4000份，2%（重量/体积）的三氯乙酸甲醇溶液，使反应终止。用这样的方法使橡胶沉淀，用2000转/分离心10分钟，使橡胶分离，离心机为索尔瓦尔（Sorvall）GLC-4型。

实例6：异戊烯焦磷酸的制备

异戊烯焦磷酸可用异戊二醇的焦磷酸化反应制备，用结晶法提纯。

在装有搅拌器和分液漏斗的烧瓶中放入90ml（130g，900mM）的三氯乙腈，并加入15.12ml（12.9g，150mM）的异戊醇。将磷酸双（三乙基胺）酯（104g，36mM），在5ml的乙腈中加热溶解，然后通过分液漏斗，在五个半小时内将其加完。将反应混合物保持在室温，不停的搅拌，室温下放置过夜。将333ml的0.4N的氨水和700ml的乙醚，加入到盛在分液漏斗中的反应混合物中，磷酸盐萃取在水相中。用333ml0.4N的氨水，反复抽取二次以上。将水相合并，用500ml乙醚，分三次萃取，然后在旋转蒸发器中，在55℃，将其浓缩至大约200ml。然后加入环己胺（50ml，437mM），并将其连续浓缩至大约100ml，此时含有异戊烯单磷酸的二环己胺盐的结晶出现。在4℃放置过夜，可得7.6克的单磷酸盐的结晶。

母液用100ml的浓氨水处理，用2体积（350ml）的乙醚萃取二次。将醚除去后，加500ml 1M的氯化锂，将溶液浓缩至500ml，此时会出现异戊烯焦磷酸的锂盐的沉淀。在4℃放置24小时，收集沉淀，用冰水洗涤，然后再用丙酮和乙醚洗涤，在70℃的炉子里干燥过夜。产量为8克。

将8克，30mM的异戊烯焦磷酸锂盐与50ml水搅拌，用50%的醋酸进行微酸化，除去碳酸盐，用2N的NaoH调节pH值至8.0，然后将48ml水溶液（其中含有16.45克，64mM的醋酸钡）逐滴加入并混合，难溶的无定形的异戊烯焦磷酸的钡盐会沉淀。离心分离，用5ml水洗涤五次，然后再用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。产量11.55克。

将异戊烯焦磷酸钡（11.55克）悬浮在150ml水中，用Dowex50（H形式）离子交换树脂60克进行处理。在0℃用电磁搅拌器搅拌1.5小时，然后在4℃过夜。接着用稀硫酸（1N），通过点滴试验将钡盐除去，将离子交换树脂进行过滤，用去离子水洗涤，一直到溶液中无钡离子为止。水溶液用浓氨水中和，在旋转蒸发器中浓缩至几乎干燥，可得一种黄色浆状物。黄色浆状物用丙酮洗涤，然后用醚洗涤，产量5.5克。异戊烯焦磷酸可用氢或磷³¹的核磁共振及气相色谱质谱得到证实。

Claims (32)

1、一种生产基本上纯化形式的橡胶聚合酶的方法，包括下述各步骤：

（1）先从含有橡胶聚合酶的三叶胶属的一种植物中制备化学稳定的胶乳，这种酶可与上述胶乳中的橡胶粒子结合在一起，也可以游离于溶液中，制备方法是将大约1至10体积的由多羟基化合物、防微生物试剂和缓冲剂组成的稳定溶液，加入到大约一个体积的上述胶乳中;

（2）用层析分离法在0-4℃分离上述胶乳溶液中的游离的橡胶聚合酶;

（3）将分离出的橡胶聚合酶提纯，以制备基本上纯化形式的橡胶聚合酶。

2、根据权利要求1的方法，其中所述的植物是巴西三叶胶。

3、根据权利要求1的方法，其中所述稳定溶液可以含有巯基化合物。

4、根据权利要求1的方法，其中所述多羟基化合物可以是甘油，山梨糖醇、蔗糖等。

5、根据权利要求1的方法，其中所述稳定溶液是由大约10%至80%（重量/体积）的甘油，大约0.001%至1%（重量/体积）的叠氮化钠，和缓冲剂组成的;溶液pH值大约从7至12。

6、根据权利要求5的方法，其中所述稳定溶液是由50%（重量/体积）的甘油，大约0.3%（重量/体积）的叠氮化钠和大约0.1M的碳酸氢钠组成的。

7、根据权利要求6的方法，其中所述稳定溶液，还含有大约5mM的半胱氨酸。

8、根据权利要求1的方法，其中所述层析分离法是指离子交换层析法。

9、根据权利要求8的方法，其中所述离子交换层析法是指包括用离子交换树脂与上述胶乳混合的层析分离方法，上述在溶液中游离的橡胶聚合酶与树脂结合，产生聚合酶-树脂复合物，分离复合物，然后从复合物中分离出橡胶聚合酶。

10、根据权利要求9的方法，其中所述离子交换树脂是指阴离子交换树脂。

11、根据权利要求1，其中所述提纯，包括下述各步骤：

将分离后的橡胶聚合酶进行透析制成一种透析液;

加一种凝胶剂到上述透析液中，使生成凝胶聚合酶复合物;

将上述复合物从上述透析液中分离出来;

将上述聚合酶从上述复合物中分离出来;

将取出的聚合酶进行凝胶过滤层析分离，以制备基本上纯化形式的橡胶聚合酶。

12、根据权利要求11的方法，其中所述的提纯还包括另一操作步骤：将上述渗析液与一种吸附蛋白质的吸附剂混合，然后在加入上述凝胶前，从透析液中分离出吸附剂。

13、根据权利要求12的方法，其中所述吸附剂是指γ-氧化铝。

14、根据权利要求11的方法，其中所述凝胶剂是指磷酸钙凝胶。

15、根据权利要求1的方法，其中所述提纯，包括下述各步骤：

将上述溶液中游离的橡胶聚合酶与抗橡胶聚合酶的各种固相抗体接触，以便生成橡胶聚合酶抗体复合物;

从上述溶液中将复合物分离;

从上述复合物中分离出橡胶聚合酶。

16、生产基本上纯化形式的橡胶聚合酶的方法，包括下述各步骤：

从三叶胶属的植物中制备化学稳定的胶乳;

使上述化学稳定胶乳与抗橡胶聚合酶的各种固相抗体接触，以便生成橡胶聚合酶抗体复合物;

从上述胶乳中将上述复合物进行分离;

从上述复合物中提取基本纯化的橡胶聚合酶。

17、根据权利要求16的方法，其中所述的植物是巴西三叶胶。