JPS63296693A - 逆転写酵素発現プラスミドとその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は逆転写酵素の発現活性が極めて高い逆転写酵素
の発現プラスミドとその製造方法に関するものである。

［従来の技術］ 遺伝子工学的手法による蛋白質の発現や、蛋白工学等の
バイオテクノロジー利用技術の開発が盛んに行なわれる
ようになってきた今日、より優れた技術開発が大いに期
待されている。この遺伝子工学において、ｃＤＮＡ　（
ＲＮＡに相補的な塩基配列を持つＤＮＡ）作製は、イン
トロンのないＤＮＡを得る目的のため重要な意味を有し
ている。

このｃＤＮＡを作製するに際しては、目的とする遺伝子
産物（タンパク質）の遺伝情報をもつメツセンジャー（
ｍ）ＲＮＡから、逆転写酵素（ＲＮＡ依存型ＤＮＡ合成
酵素）によりｃＤＮＡを合成しており、このｃＤＮＡを
適当なベクターにつなぐ方法がとられ、広く利用されて
いる。

［発明が解決しようとする問題点］ そこで、本発明においては、このように重要な逆転写酵
素の発現活性が高い逆転写酵素の発現プラスミドを見出
すべく、鋭意研究した結果、本発明に到達したものであ
る。

［問題点を解決するための手段］ 即ち、本発明は、新規な逆転写酵素発現プラスミドとそ
の製造方法を提供することを目的とするもので、この目
的は、本発明によれば、ＴＬＮＩＥＤＥＨＲＬＨＥＴＳ
ＫＥＰＤＶＳＬＧＳＴＷＬＳＤＦＰＱＡＷＡＥＴＧＧＭ
ＧＬＡＶＲＱＡＰＬＩ　ＩＰＬＫＡＴＳＴＰＶＳＩＫＱ
ＹＰＭＳＱＥＡＲＬＧＩＫＰＨＩＱＲＬＬＤＱＧＩ　Ｌ
ＶＰＣＱＳＰＷＮＴＰＬＬＰＶＫＫＰＧＴＮＤＹＲＰＶ
ＱＤＬＲＥＶＮＫＲＶＥＤ　Ｉ　ＨＰＴＶＰＮＰＹＮＬ
ＬＳＧＬＰＰＳＨＱＷＹＴＶＬＤＬＫＤＡＦＦＣＬＲＬ
ＨＰＴＳＱＰＬＦＡＦＥＷＲＤＰＥＭＧＩ　ＳＧＱＬＴ
ＷＴＲＬＰＱＧＦＫＮＳＰＴＬＦＤＥＡＬＨＲＤＬＡＤ
ＦＲＩＱＨＰＤＬＩ　ＬＬＱＹＶＤＤＬＬＬＡＡＴＳＥ
ＬＤＣＱＱＧＴＲＡＬＬＱＴＬＧＮＬＧＹＲＡＳＡＫＫ
ＡＱＩＣＱＫＱＶＫＹＬＧＹＬＬＫＥＧＱＲＷＬＴＥＡ
ＲＫＥＴＶＭＧＱＰＴＰＫＴＰＲＱＬＲＥＦＬＧＴＡＧ
ＦＣＲＬＷＩ　　ＰＧＦＡＥＭＡＡＰＬＹＰＬＴＫＴＧ
ＴＬＦＮＷＧＰＤＱＱＫＡＹＱＥ　Ｉ　ＫＱＡＬＬＴＡ
ＰＡＬＧＬＰＤＬＴＫＰＦＥＬＦＶＤＥＫＱＧＹＡＫＧ
ＶＬＴＱＫＬＧＰＷＲＲＰＶＡＹＬＳＫＫＬＤＰＶＡＡ
ＧＷＰＰＣＬＲＭＶＡＡＩ　ＡＶＬＴＫＤＡＧＮＶＴＭ
ＧＱＰＬＶ　Ｉ　ＬＡＰＨＡＶＥＡＬＶＫＱＰＰＤＲＷ
ＬＳＮＡＲＭＴＨＹＱＡＬＬＬＤＴＤＲＶＱＦＧＰＶＶ
ＡＬＮＰＡＴＬＬＰＬＰＥＥＧＬ　（但し、Ａはアラニ
ン（Ａｌａ）、Ｃはシスティン（Ｃｙｓ）、Ｄはアスパ
ラギン酸（Ａｓｐ）、Ｅはグルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｆ
はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｇはグリシン（Ｇｕｙ
）、Ｈはヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｉはイソロイシン（Ｉ
ｌｅ）、にはリジン（Ｌｙｓ）、Ｌはロイシン（Ｌｅｎ
）、Ｍはメチオニン（Ｍｅｔ）、Ｎはアスパラギン（Ａ
ｓｎ）、Ｐはプロリン（Ｐｒｏ）、Ｑはグルタミン（Ｇ
ｉｎ）、Ｒはアルギニン（Ａｒｇ）、Ｓはセリン（Ｓｅ
ｒ）、Ｔはスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｖはバリン（Ｖａｌ
）、Ｗはトリプトファン（Ｔ　ｒ　ｐ　）及びＹはチロ
シン（Ｔｙｒ）を表す） で表されるアミノ酸配列を有する逆転写酵素発現プラス
ミド、および、以下の（イ）〜（す）の工程を含むこと
を特徴とする当該逆転写酵素発現プラスミドの製造方法
、により達成することができる。

（イ）プラスミドｐＫＰ　１より逆転写酵素をコードし
ている遺伝子を分離する。

（０）マルチクローニングサイトを２個有し、該２個の
マルチクロニングサイトの間に３種の終止コドンを挿入
した中継ぎ塩基配列を有するベクターを、前記（イ）の
分離操作で用いた制限酵素と同一の制限酵素を用いてＤ
ＮＡ断片を分離する。

（ハ）前記（イ）及び（ロ）で得られたＤＮＡ断片を連
結する。

（ニ）前記（ハ）で得られたＤＮＡ溶液により大腸菌の
形質転換を行ない、青色の形質転換体コロニーを得る。

（ネ）前記（ニ）で得られたプラスミドを大腸菌に導入
し、白色の形質転換体コロニーを得る。

（へ）この形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製後、
このＤＮＡの逆転写酵素のＮ末端側の余分なアミノ酸配
列を除去する。

（ト）このＤＮＡを大腸菌に導入して形質転換を行ない
、青色の突然変異体を得る。

（チ）この突然変異体のＣ末端に終止コドンを導入する
。

（す）この突然変異体を大腸菌に導入して形質転換を行
ない、白色の突然変異体を得る。

また、本発明の逆転写酵素発現プラスミドの製造方法は
、さらに下記の工程（ａ）〜（ｇ）を付加させることに
より、変異型の逆転写酵素発現プラスミドを製造するこ
ともできる。

（ａ）プラスミドｐｓＨ１より逆転写酵素領域を含むＤ
ＮＡ断片を切り出す。

（ｂ）マルチクローニングサイトを２個有し、該２個の
マルチクロニングサイトの間に３種の終止コドンを挿入
した中継ぎ塩基配列を有するベクターを、前記（ａ）の
分離操作で用いた制限酵素と同一の制限酵素を用いてＤ
ＮＡ断片を分離する。

（Ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）で得られたＤＮＡ断片を連
結する。

（ｄ）前記（ｃ）で得られた溶液により大腸菌の形質転
換を行ない、青色の形質転換体コロニーを得る。

（ｅ）前記（ｄ）で得られたプラスミドに部位特異的遺
伝子変換を行ない、この溶液を用いて大腸菌に形質転換
を行ない、白色の形質転換体コロニーを得る。

（ｆ）前記（ｅ）で得られたＤＮＡに対し、部位特異的
遺伝子変換を行ない、青色の形質転換体コロ　　゛ニー
を得、プラスミドを分離後大腸菌に形質転換する。

（ｇ）前記（ｆ）で得られたプラスミドを制限酵素を用
いて処理しＤＮＡＩ！ｙｒ片を精製し、これを上記と同
一の制限酵素を用いて処理した特許請求の範囲第２項の
製造方法により得られる突然変異体と連結し５．得られ
るＤＮＡ溶液を大腸菌に形質転換することにより形質転
換体コロニーを得、次いでプラスミドＤＮＡを分離する
。

一般にプラスミドにより発現した蛋白質、例えば逆転写
酵素は、そのプラスミド構築の際、結合部位に余分なア
ミノ酸が付着する。この場合、本発明では逆転写酵素を
純粋な形で発現させるために、前部の制限酵素旧ｎｄｍ
　、ＰｓｔＩ　、　Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃｌ。

１１ｉｎｃＩＩ　、Ｂａｇ旧、ＳｍａＩ　、ＥｃｏＲＩ
の各切断部位の塩基配列を持つマルチクローニングサイ
トを有するリンカ−（以後、ポリリンカーという）、中
継ぎ配列（必ず、３種の終止コドンが入る）、後部のポ
リリンカー、１ａｃＺ’と連なって構成されているベク
ターを用いて、合成りＮＡによる部位特異的遺伝子変換
を行なうことにより、容易に純粋な形の蛋白質を発現さ
せることができる。

そしてこのベクターのその他の構造はアンピシリン耐性
遺伝子（Ａ■ｐｒ）　、複製開始信号（Ｏｒｉ）を有す
るもの（これをｐＫＩＳベクターとよぶ）、および他の
構造として前記のほか更に従来のｐＵＣベクターと同様
に、Ｍ１３の遺伝子開領域（ＩＧ）を有しているものが
ある（これをｐＫＩｓ１ベクターとよぶ）。

上記のベクターは、３種のフレームのポリリンカー（前
部）×３種のフレームのポリリンカー（後部）×２（ク
ローニングサイトか逆向きもある）から、１８種類存在
するということになるのであり、これらの１８種類のベ
クターを組合わせて構成したベクターシリーズを用いる
ことにより、極めて容易に純粋な蛋白質（逆転写酵素）
の発現プラスミドを作製することがてきる。

このベクターにおいては、第１図におけるマルチクロー
ニングサイトであるＡ部分およびＢ部分は第１表に示す
ような塩基配列を有するものである。また、これらの塩
基配列は第２表に示す通りである。

また、−例としてｐＫＩＳベクターのうち、ｐＫＩＳ８
０１／ｐＫＩ　５１０８０１の構造の特徴部分を表わせ
ば、第３表の如くである。

第　　１　　表 ［実施例］ 以下、本発明を実施例に基いて説明する。

まず、本発明に使用するベクターの作成方法について説
明する。

■ｐＵｃ１０９０の作成方法 ■）プラスミドｐＵＣ９（全酒造■販売）　１０ＪＬｇ
を制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（５０単位）及び旧ｎｄｍ（
５０単位）を用いて３７°Ｃにて１時間反応させた後、
分解産物を０．７％アガロース電気泳動を用いて分離し
ＥｃｏＲＩ切断部位から旧ｎｄＩＩＩ切断部位までのポ
リリンカー断片（３０塩基対）をゲルより切り出し、フ
ェノール処理を行なうことにより精製した。

２）プラスミドｐＵｃ１１９（全酒造■販売）１０＝ｇ
を制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（５０単位）及び旧ｎｄ■（
５０単位）を用いて３７℃にて１時間反応させた後、分
解産物を０．７％アガロース電気泳動を用いて分離し、
ＥｃｏＲＩ切断部位から旧ｎｄＩ［Ｉ切断部位までのポ
リリンカ一部分を含まない断片（約３．１００塩基対）
をゲルより切り出し、フェノール処理を行なうことによ
り精製した。

３）１）で得られたポリリンカー断片０．０１ＪＬｇと
２）で得られたポリリンカーを含まない断片０．　　Ｉ
ＩＬｇを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用い
て４℃、１２時間連結反応を行なった。

４）３）で得られた反応生成物を、大腸菌ＪＭ８３株（
ａｒａ、Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）　、ｒｐｓＬ、φ８
０　、１ａｃＺΔＭ１５）を用いて形質転換を行なった
後、受容菌を寒天１．５％及びアンピシリンを１ｍＭ当
り１１００ｐを含むし寒天培地（組成：ｌ見当りトリプ
トンＬｏｇ、イーストエキス５ｇ、食塩１０ｇ、ｐＨ７
，５）に塗布し、３７℃にて一昼夜培養を行ないいくつ
かのコロニー（形質転換体）を得た。

５）コロニーの一つをアンピシリンを１ｍＪ１あたり１
１００ＩＬ含むＬ液体培地Ｉｏｎ文に移植し、３７℃に
て１２時時間上う培養を行ない、アルカリ−５ＤＳ法に
よりプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＵｃ１０
９０を得た。

■ＵＣ１０８０の成性 ■ｐＵｃ１０９０の作成方法のうち、１）のプラスミド
ＤＮＡとしてｐＵＣ８（全酒造■販売）を、又２）のプ
ラスミドＤＮＡとしてｐＵｃ１１８（全酒造■販売）を
用いることにより、同様の操作を経て、プラスミドｐＵ
ｃ１０８０を作成した。

次いで、ｐＵｃ１０９１の作成方法を説明するが、まず
ｐＵｃ１０９０とｐＵｃ１０９１、ｐＵＣ１０９２の関
係をいうと、ｐＵｃ１０９０のポリリンカ一部分をはさ
んで、前部で１塩基、後部で２塩基欠失させたものがｐ
Ｕｃ１０９１で、ｐＵＣ１０９０のポリリンカ一部分を
はさんで、前部て２塩基、後部で１塩基欠失させたもの
がｐＵＣ１０９２である。また、ｐＵｃ１０８０とｐｔ
ｒＣ１０８１，ｐＵｃ１０８２の関係も、上記と同様で
ある。

■ｐＵｃ１０９１の作成方法 ｐＵｃ１０９１は次の段階にわけて作成した。

１）ｐＵＣ１０９０より一本鎖ＤＮＡの作成２）ポリリ
ンカ一部位の前部より一塩基欠いたオリゴヌクレオチド
の合成 ３）　　１）２）を用いた突然変異体の作成４）突然変
異体より一本鎖ＤＮＡの作成５）ポリリンカ一部位の後
部より２塩基欠いたオリゴヌクレオチドの合成 ６）　　４）５）を用いた再突然変異体の作成（ＰＵＣ
■−１） ｐＵｃ１０９０より一本鎖ＤＮＡの作成■ｐＵｃ１０９
０を大腸菌ＭＶ１１８４株（ａｒａ。

Δ（ｌａｃ−ｐｒｏ）　、５ｔｒＡ、ｔｈｉ、（φ８０
，１ａｃＺΔＭｉｓ）、Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６
：：ＴｎｌＯ（ｔｅｔ’）、Ｆ’　：ｔｒａＤ３６．ｐ
ｒｏＡＢ。

１ａｃｌｑＺ△Ｍ１５）を用いて形質転換を行なった。

■形質転換体を、アンピシリンを１ｎｉＪｌ当’）１０
０ｇｇ含む２ＸＹＴ液体培地（組成：１文当りトリプト
ン１６ｇ、イーストエキスＬｏｇ、食塩５ｇ、ｐＨ７，
６）１０ｍ見に植菌し、３７°Ｃにそ１２時時間上う培
養を行なった。

■　■で得られた培養液１００．文に、Ｍ１３に０７由
来のへルバーファージ液（１０”ｐｆｕ／ｍ　ｌ）を加
え、３７°Ｃで３０分間静置した後、アンピシリンを１
ｍＭ当り１５０ｐｇ、カナマイシンを１ｍＪｌ当り７０
．ｇ、チアミンをｏ、ｏｉ％含む２ｘＹＴ液体培地１０
ｍ１に加え、３７℃にて２４時時間上う培養を行なった
。

■培養液１　ｍ　ｌを取り、遠心分離により菌体を除い
た後、２０％ＰＥＧ６０００及び２．５ＭＮａＣＪＬ混
合溶液を２００．１加え遠心分離を行なうことにより、
ファージ粒子を沈降させ、エタノール沈殿処理を行なう
ことにより、１本鎖ＤＮＡを分離精製、最終的に５０終
文のＴＥ温溶液１０ｍＭ　　トリス塩酸、１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ８，０の溶液）に溶解させた。

収量は約２〜ｌｏｎｇ程度であった。

■−２） ・異邦　を　む合　ＤＮＡの作 ＤＮＡ合成機を用いて第４表に示すＮｏ、９−１−５な
る配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、Ｔ４ＤＮ
Ａキナーゼ（２単位）を用いて３７℃にて１時間反応を
行ない、５′末端部分をリン酸化させ、ブライマーＤＮ
Ａとした。

■−３） ポリリンカー′ｉ部に・　な　　る　１、・　体の１虞 ■−１）で得られた一本ｗ４ＤＮＡＩルｇと、■−２）
で得られたプライマーＤＮＡ２０ｐｍｏｉを混合して６
０℃で３０分間、引続き３７℃で３０分間保温し、アニ
ーリングさせた後、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及び
ＴＴＰを最終濃度が各々０．５ｍＭとなるように加え、
およびＡＴＰを２５ｐｍｏｉ加え、クレノー（ＫＬＥＮ
ＯＷ）酵素（４単位）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（１単位
）を用いて３７℃にて３時間反応を行ない、突然変異部
分を含む２本鎖ＤＮＡを合成した。

次に、反応生成物の一部（約０．１ｇｇ）を大腸菌ＪＭ
８３株を用いて形質転換を行なった後、受容菌を１．５
％寒天、アンピシリンを１ｍＪＬ当り１１００ＩＬ及び
Ｘ−ｇａｌをｏ、ｏｏｓ％含むＬ寒天培地に塗布し、３
７℃にて一昼夜培養を行ない、出現したコロニーの内、
白色コロニーを選択した。白色コロニーの出現率は５〜
ｉｏ％程度であった。

次いで、白色コロニーを、アンピシリンをｉｎ文当り１
００ｇｇ含むＬ液体培地１０ｍＪＬに植菌し、３７℃で
１２時時間上う培養を行ない、常法によりプラスミドＤ
ＮＡを回収した０回収したプラスミドＤＮＡを再び大腸
菌ＭＶ１１８４株を用いて形質転換を行なった後、受容
菌を寒天１．５％、アンピシリンを１ｍ１当り１１００
ＪＬ、Ｘ−ｇａｌを０．００５％及びＩＰＴＧを１ｍＭ
含むし寒天培地に塗布し、３７℃にて一昼夜培養を行な
い、白色コロニーを選択し、アンピシリンを１ｍＭ当り
１１００ＪＬ含むＬ液体培地１０ｍｊＬに移植し、３７
℃にて１２時時間上う培養を行ない、常法によりプラス
ミドＤＮＡを分離した。

■−４）／　　−鎖ＤＮＡの　。

■−３）で得られた突然変異体プラスミドを有する大腸
菌ＭＶ１１８４株より、■−１）と全く同じ方法を用い
て突然変異を有する一本鎖ＤＮＡを得た。

■−２）と同じ方法を用いて第４表のＮｏ、９−２−５
なる塩基配列を有する合成りＮＡを作成し、リン酸化を
行ないプライマーＤＮＡを作成した。

■−６）の ■−３）と同じ方法を用いて、■−４）で得られた一本
鎖ＤＮＡ及び■−５）で得られたブライマーＤＮＡより
二本鎖ＤＮＡを合成、大腸菌ＪＭ８３株を用いて形質転
換を行なうことにより青色コロニーを得た。これよりプ
ラスミドＤＮＡを回収し、再び大腸菌ＭＶ１１８４株を
用いて形質転換な行なうことにより青色コロニーを出現
させた。これよりプラスミドＤＮＡを回収することによ
り、ポリリンカ一部分の前後２個所に合計３塩基対欠失
したプラスミドｐＵｃ１０９１を得た。

■ｐＵＣ：１０９２の作成方法 プラスミドｐＵｃ１０９２の作成は、前記■のプラスミ
ドｐＵｃ１０９１の作成例に準じて行なった。変更点は
次の通りである。

（１）■−２）の塩基配列を第４表のＮｏ、９−１−３
とする。

（２）■−５）の塩基配列を第４表のＮｏ、９−１−５
とする。

これによりプラスミドｐＵｃ１０９０よりポリリンカ一
部分の前部を２塩基、後部を１塩基、合計３塩基欠いた
突然変異プラスミドｐＵｃ１０９２を得た。

■ｐＵｃ１０８１、ｐＵｃ１０８２の作成方法前記■■
■と同様に、プラスミドｐＵｃ１０８Ｏを基本としてポ
リリンカ一部分を１塩基および２塩基ずらした突然変異
プラスミドｐＵｃ１０８１、ｐＵｃ１０８２を作成した
。

変更点は次の通りである。

（１）ｐＵｃ　ｌ　０８１　、ｐＵｃ　１０Ｂ２共に、
■−１）のプラスミドとしてｐＵＣ１０８０を用いた。

（２）■−２）の合成りＮＡとして、ｐＵｃ１０８１に
おいては第４表のＮｏ、８−１−５、ｐＵＣ１０８２に
おいてはＮｏ、８−２−５を用いた。

（３）■−５）の合成りＮＡとして、ｐＵｃ１０８１に
おいては第４表のＮｏ、８−１−３、ｐＵｃ１０８２に
おいてはＮｏ、８−１−５を用いた。

以上、基本となるプラスミドｐＵｃ１０９０、ｐＵｃ１
０８０及び作成した突然変異プラスミドｐＵｃ１０９１
、ｐＵｃ１０９２、ｐＵｃ１０８１及びｐｔＪｃ１０８
２の間の関係についてまとめると、第５表のとおりとな
る。

第　　４　　表 合成りＮＡの塩基配列表 変異部分を含むＤＮＡ塩基配列 ５’　ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ３’
５’　ＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ３’
５’　ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧ３’
５’　ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧ３’
５’　ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴ３’
５’　ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣ３’
５’　ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ３’
５’　ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ３’
第　　５　　表 ■ｐＫＩｓ１ベクターシリーズの作成 ■−１）フラグメントの分離 プラスミドｐＵｃ１０９０　１０用ｇを制限酵素１１ｉ
ｎｄｍ　（５０単位）及びＡａｔｌｌ（４単位）を用い
て３７°Ｃにて１時間反応させ分解産物を０．７％アガ
ロース電気泳動を用いて分離し、ポリリンカ一部分を含
む旧ｎｄｍ切断部位からＡａｔ　ＩＩ切断部位までの断
片（約１０００塩基対）をゲルより切り出し、フェノー
ル処理を行なうことにより精製し、１０９０−Ｌフラグ
メントＩＪＬｇを得た。

同様に、制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（５０単位）及びＡａ
ｔＩＩ（４単位）を用いて、ポリリンカ一部分を含むＥ
ｃｏＲＩ切断部位からＡａｔ　Ｕ切断部位までのＤＮＡ
断片（約２２００塩基対）１０９０−Ｒフラグメント２
終ｇを得た。

以下、プラスミドｐＵｃ１０９１％　１０９２．１０８
０．１０８１．１ｏ８２を用イテ同様の操作を行なうこ
とにより、１０９１−Ｌ、１０９１−Ｒ１１０９２−Ｌ
、１０９２−Ｒ，１０８０−り、１０８０−Ｒ，１０８
１−Ｌ、１０８１−Ｒ，１０８２−Ｌ及び１０８２−Ｒ
フラグメント合計１２種類を得た。各フラグメント、切
断されるプラスミド及び切断する酵素の組合わせは次の
通りである。

ＤＮＡ合成機を用いて第６表に示すジヨイント配列の玉
鎖及び下調を各々合成した。

玉鎖ＩＪＬｇ及び下調ＩＩＬｇを混合し、７０°Ｃに３
０分間保温し、室内に放置し徐々に冷却することにより
アニーリングを行ない、２本鎖ＤＮＡとした。

■−：ｌ）Ｌ、Ｒフラグメントとジヨイント配列の結合 ■−１）で得られた１０９０−Ｌフラグメント０、ｌル
ｇ、１０９０−Ｒフラグメント０．２ルｇ及び■−２）
で得られたジヨイント配列０．０１ｐｇを、常法により
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて連結反応を行な
わせた。反応液を大腸菌ＪＭ８３株を用いて形質転換を
行なった後、受容菌を１．５％寒天及びアンピシリンを
１　ｍ　ｌ当り１１００ｐ含むＬ寒天培地に塗布し、３
７°Ｃにて一昼夜培養することにより形質転換コロニー
を出現させ、アンピシリンを１ｍ１当り１００．ｇ含む
Ｌ液体培地１６ｍＪＬに移植し、３７°Ｃにて１２時間
振どう培養を行なった。その後培養液より常法によりプ
ラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＫＩｓ１０９０
０を得た。

以下、フラグメントの組合わせを変えることにより、ｐ
ＫＩｓ１０９０１，１０９０２．１０９１Ｏ１１０９１
１，１０９１２，１０９２０，１０９２１，１０９２２
，１０８００，１０８０１，１０８０２，１０８１０，
１０８１１，１０８１２，１０８２０，１０８２１及び
１０８２２の合計１８種類のｐＫＩｓ１ベクターシリー
ズを作成した。

完成したｐＫＩｓ１ベクター及びフラグメントの組合わ
せは次の通りである。

■ｐＫＩＳベクターシリーズの作成 作成 プラスミドｐＵＣ９５ｐｇを制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩ（２
４単位）を用いて３７℃にて１時間反応させた後、０．
７％アガロース電気泳動にて分離を行い、ポリリンカ一
部分を含まないＤＮＡ断片（約２３００塩基対）をゲル
より切り出し精製した。

又、ｐＫＩｓ１０９シリーズ（即ち、ｐＫＩｓ１０９０
０．１０９０１，１０９０２，１０９１０．１０９１１
，１０９１２，１０９２０，１０９２１．１０９２２）
各々５ＩＬｇを同じく制限酵素ＰｖｕＩＩ（２４単位）
を用いて３７℃にて１時間反応させた後、０．７％アガ
ロース電気泳動にて分離を行い、ポリリンカ一部分を含
むＤＮＡ断片（約３００塩基対）をゲルより精製した。

次に、上記のｐＵＣ９由来のＤＮＡ断片０．２鉢ｇ及び
ＰＫＩＳ１０９シリーズ由来のＤＮＡ断片各々０．０５
ルｇを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて
４℃、１２時間連結反応を行い、大腸菌ＪＭ８３株を用
いて順次形質転換を行い、形質転換体よりプラスミドＤ
ＮＡを順次分離し、プラスミドｐＫＩｓ９００，９０１
，９０２．９１０，９１１，９１２，９２０，９２１゜
９２２を得た。

１虞 ■−１）ニおイテ、ｐＫＩｓ１０９シリーズの代りにｐ
ＫＩＳ１０８シリーズ（即ち、ｐＫＩｓ１０８００．１
０８０１．１０８０２，１０８１０．１０８１１，１０
８１２．１０Ｂ２０，１０８２１．１０８２２）を用い
ることにより、全く同様の操作を経てプラスミドｐＫＩ
ｓ８００，８０１．８０２，８１０，８１１，８２０，
８２１゜８２２を得た。

上記ベクターを用いた具体的な実施例を説明する。

（実施例１） マウス白血球ウィルスの逆転写酵素をコードしているｐ
ｏｌ遺伝子約２．３ｋｂ　（キロ塩基対）を含むプラス
ミドｐ　Ｋ　Ｐ　１　（（「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　Ｎ
ａｔｉｏｎａＩ　Ａｃａｄｅ＋＊ｙ　５ｃｉｅｎｃｅ（
ＰＮＡＳ）、ＬＩＳＡＪｖｏｌ、８２．ｐａｇｅ４９４
４〜４９４８．１９８５）に示されているプラスミドｐ
ｓＨ１のクローンの５ａｃｌ　−Ｈｉｎｄｍ　（２，３
ｋｂ）をｐＵｃ１８に組み換えたもの）２ｇｇを、制限
酵素ＥｃｏＲＩｌＯ単位と旧ｎｄＩ［ｒ１２１２単より
３７℃で１時間処理し、０．７％アガロース電気泳動後
、逆転写酵素遺伝子を含む約２．３ｋｂのＤＮＡ断片を
ゲルより切り出し、フェノール処理を行なうことにより
精製した。また、ｐＫＩｓ８１１　２終ｇを、制限酵素
ＥｃｏＲＩ（１０単位）と旧ｎｄｍ　（１２単位）によ
り３７℃で１時間処理し、同様に約２゜７ｋｂのＤＮＡ
１！ｙｒ片を回収した。得られた２、３ｋｂのＤＮＡ断
片０．１ルｇと２．７ｋｂのＤＮＡ断片０．１μｇを混
合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）により１６℃、１
２時間処理した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＪＭ８
３株の形質転換を行ない、受容菌を、寒天１．５％、ア
ンピシリン１１００ＩＬ／ｍｕ、Ｘ−ｇａｎｇ、００５
％を含むし寒天培地に塗布し、３７℃にて一昼夜培養を
行ない、形質転換体コロニーを青色で得た。

この形質転換株を、Ｌ液体培地で３７°Ｃ，１２時間培
養し、アルカリ−５ＤＳ法でプラスミドＤＮＡを調製し
、ｐＫＰＢとした。

ｐＫＰＢ　　２ＪＬｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（１０
単位）、クレノー酵素（２単位）、最終濃度が各々０．
１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰの混合
物を加え、３７°Ｃで１時間処理し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ（２単位）にて１６°Ｃ’？？　１２時間処理した後
、大腸菌ＪＭ８３株に同様に導入した。白い形質転換株
のコロニーをＬ液体培地に植菌し、３７℃で１２時間培
養した後、アルカリ−３ＤＳ法でプラスミドＤＮＡを調
製し、ｐＫＰＷとした。

ｐＫＰＷより、逆転写酵素のＮ太端側の余分なアミノ酸
配列を１合＠、ＤＮＡを用いた部位特異的遺伝子変換を
行なって除去した。

ｐにｐｗ　　ＳＩＬｇを、制限酵素ＰｖｕＩＩ（１８単
位）とＮｄｅｌ（２０単位）により３７°Ｃ１１時間処
理し、０．７％アガロース電気泳動後、約２．２ｋｂの
ＤＮＡ断片を回収した。また、ｐＫＰＷｓｇｇを、制限
酵素５ｃａｌ　（１８単位）と脱リン醸酵素ＢＡＰ　（
０，２単位）により３７℃、１時間処理し、同様に約５
ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。得られた２、２ｋｂおよ
び５ｋｂの両ＤＮＡ断片を夫々０．６ＪＬｇづつ、およ
び５０ｐｍｏｉの第７表ａに示す５′−リン酸化合成り
ＮＡ　（４０塩基）を混合し、１００ｍＭＮａＣ１，６
゜６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，６）、ａｍＭＭｇＣ文２
．１ｍＭβ−メルカプトエタノール溶液とし、１００℃
で３分間処理した後、３０℃で３０分間処理した。この
ＤＮＡ溶液１７．２ｐＪＬ、５ｍＭｄＮＴＰ　（ｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ）７ｐ、９．．１０ｍ
ＭＡＴＰ３．ＢＩＬｌと、クレノー酵素（４単位）、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（１単位）を加え、２５°Ｃで３時間
処理した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＪＭ８３株の
形質転換を行ない、アンピシリンとＸ−ｇａＭを含むＬ
寒天培地上で、青いコロニー）ン形成するクローンｐＫ
Ｐｐｏｌ−Ｎを得た。この突然変異体は約５％の頻度で
得られた。

ｐにＰｐｏｌ−Ｎ（逆転写酵素とβ−ガラクトシダーゼ
融合蛋白質をコードするプラスミド）に、合成りＮＡ　
（第７表す及びＣ）を用いた部位特異的遺伝子変換で逆
転写酵素の純粋な領域と思われるＣ末端（Ｔｌ及びＴ２
）に終止コドンを導入した。

プラスミドｐＫＰ　ｐｏｔ−Ｎ　　５　ｇ　ｇを、制限
酵素５ｃａＩ　（１８単位）と脱リン酸酵素ＢＡＰ　（
０，２単位）で３７°Ｃ１１時間処理し、同様に約４．
９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。

また、ｐＫＰ　ｐａｌ−Ｎ　　５　ｐ−１ｇを、制限酵
素Ｋｐｎｌ　（５０単位）とＢｉｎｄｍ　（２４単位）
により３７℃で１時間処理し、同様に約２．９ｋｂのＤ
ＮＡ断片を回収した。４．９ｋｂ及び２．９ｋｂのＤＮ
Ａｇｆｒ片をそれぞれ０．６ＪＬｇづつ、および５０　
ｐ　ｍ　ｏ　ｎの５′−リン酸化合成りＮＡ　（第７表
Ｃ）を用いて上記と同様の操作により、白い形質転換株
の突然変異体及びｐ　Ｋ　Ｐ　ｐｏｌ　−ＮＴ　２を得
た。

以上の製造工程を第２図に示す。

得られたクローンについて逆転写酵素活性を測定した。

まず、逆転写酵素活性の測定法を説明する。

各クローンについて、大腸菌ＪＭ１０３株に導入したも
のを使用した。各プラスミドを持った大腸菌を、Ｌ液体
培地で３７°Ｃ，１２２時間振う培養した培養液０．２
ｍ文をＭ９液体培地（組成：１１当りリン酸２ナトリウ
ム　１８ｇ、リン酸ｌカリウム　３ｇ、塩化アンモニウ
ム　１ｇ１食塩０．５ｇ、硫酸マグネシム　１ｍＭ、塩
化カルシウム　０．１ｍＭ、ｐＨ７，４）（＋０．２％
カザミノ酸＋０．２％グリセロール＋５１Ｌｇ　／　ｍ
　１チアミン）１０ｍＪＬに加え、３０℃で１時間振と
う培養した後、５０ル文の２００ｍＭＩＰＴＧをそれぞ
れ加え、さらに３０°Ｃで３時間振どう培養した。各培
養液を水中に１時間浸し、ｏＤ？：０をそれぞれ測定し
た０次にＭ９培地を用いて各試料を夫々０Ｄ７３°が０
．２となるように希釈した後、Ｏ，１ｍＭをマイクロ遠
心チューブに採取した。遠心して菌体を集めた後、緩衝
液（５０ｍＭトリス塩酸、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．３
ＭＮａＣ１，ｐＨ７，５）で菌体を洗浄し、遠心して集
めた菌体を８ＪＬ文の同緩衝液に攪拌した後、１展見の
１０ｍｇ／ｍｕリゾチーム溶液を加え、０°Ｃて１５分
間処理した。さらに、１％トリトンＸ−１００，１０ｍ
Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）１ル文を加え、０℃、
１０分間処理し、各粗抽出液とした。得られた各粗抽出
液に、９０ｐ−１の反応溶液（３０ｇｇ／ｍＪＬｐｏｌ
ｙ　　ｒＣ（ｄＧ１２−１６）又はｐｏ　１　ｙ　　ｒ
　Ａ　（ｄ　Ｇ　１２−１６　）　。

２０ルＭｄＧＴＰ又はＴＴＰ、１１００ＯＣＰ／ｐｍｏ
ｌ　　ａ−３２Ｐ−ｄＧＴＰ、０．５ｍＭＭ　ｎ　Ｃｌ
　２又はＭ　ｇ　Ｃｌ　ｚ　、　５０　ｍ　Ｍ　トリス
塩酸、ｐＨ８，３，２０ｍＭジチオスレイトール、６０
ｍＭＮａＣｆＬ、０．１％ＮＰ−４０）を加え、２５°
Ｃで３０分間処理した。反応終了後、反応溶液３０ル文
を、ＤＥ−８１デイスクにスポットし、２ＸＳＳＣ（組
成：　０．３ＭＮａＣ１，０゜０３Ｍクエン酸ナトリウ
ム）２００ｍＪＬで５分間処理を３回行ない、９９．５
％エタノール２００ｍ１で５分間処理後、空気乾燥した
。

乾燥したＤＥ−８１デイスクをバイアルに入れ、シンチ
レーションカウンターでチェレンコフ効果を用いてカウ
ントを測定したところ、第４図のようになった。

なお、チェレンコフ効果とは、透明な媒質中を高速荷電
粒子が通過する際、その速さが媒質中の光の速度よりも
大きい場合に、電磁波や光を発する現象をいう。

ベクターのみを含むクローンに比べ、ｐＫＰｐｏｌ−Ｎ
には逆転写活性が認められた。ｐＫＰｐｏｌ−ＮＴ２に
ついては、さらに活性が上昇していた。

更に、カリフラワーモザイクウィルスの逆転写酵素のア
ミノ酸配列より予想されるＣ末端（ＴＩ）に、同様に第
７表すに示す合成りＮＡを用いて部位特異的遺伝子変換
を行なった。

得られたクローンｐＫＰ　ｐｏｌ−ＮＴＩは、第４図に
示したように、ｐＫＰ　ｐｏｌ−ＮＴ２より更に高い活
性を示した。

く　　　　　の トく く　　　　　← ←く く　　　　　Ｏ トロ　　ｔ−Ｌ）　　　＜ ＜ａ＜ Φ　　　　　ｏ　　　　　Ｑ Ｕ＜＜ く　　　　　く　　　　　Ｏ ＱＯく ＜００ Ｕ＜＜ ←　　　　　Φ　　　　　ロ ＾唖　　　Ａり　　　Ａ１ １　　　　　Ａ　　　　　Ｑ （実施例２） 次に、モロニーマウス白血病ウィルスの変異型逆転写酵
素の発現プラスミドの作製法およびその逆転写活性につ
いて説明する。

モロニーマウス白血病ウィルスの逆転写酵素において、
他のレトロウィルス等と最も相同性の高いアミノ酸配列
の中に変異を挿入した。その結果、天然のものとよく似
た活性を示すものや、マンガンだけでなくマグネシウム
でも活性を示すもの、天然のものより活性の高いもの等
が得られた。

（作製法） モロニーマウス白血病ウィルスの逆転写酵素の最も相同
性の高いアミノ酸配列を含む領域を有するプラスミドｐ
ＢＢ９を作製した。逆転写酵素領域を含むクローンｐ　
Ｓ　Ｈ１（’Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ＮａｔｉｏｎａＩ
　Ａｃａｄｅｍｙ　５ｃｉｅｎｃｅ（ＰＮＡＳ）、ＵＳ
ＡＪｖｏｌ、８２．ｐａｇｅ４９４４〜４９４８，１９
８５）　　５　、　ｇを、制限酵素ＢａｍＨＩ　　（２
０単位）で３７°Ｃ１１時間処理し、０．７％アガロー
ス電気泳動を用いて０．３ｋｂ　（キロ塩基対）のＤＮ
Ａ断片を切り出し、フェノール処理を行なうことにより
精製した。一方、ｐＫＩｓ９００２牌ｇを制限酵素Ｒａ
ｍ旧　（１０単位）で３７℃、１時間処理した後、同様
の操作を行なうことにより２．７ｋｂのＤＮＡ断片を精
製した。上記の逆転写酵素領域の０．３ｋｂとｐＫＩｓ
９００の２．７ｋｂのＤＮＡ断片各々０．１ルｇを混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて、４℃、１
２時間連結反応を行なった。友応液の一部を大腸菌ＪＭ
８３株を用いて形質転換を行ない、受容菌を１．５％寒
天、アンピシリンｔｏｏｇｇ／ｍ文及びＸ−ｇａｌ０．
００５％を含むし寒天培地に塗布し、３７°Ｃにて一昼
夜培養を行ない、青色の形質転換体コロニーを得た。

形質転換体コロニーをＬ液体培地（アンピシリンを１　
ｍ　ｌ当り１１００ＩＬ含む）１０ｍｆＬに植菌し、３
７°Ｃにて１２時間振どう培養を行ない、常法によりプ
ラスミドＤＮＡ　　ｐ　Ｂ　Ｂ　９を分離した。

ｐＢＢ９　２ｈｇを制限酵素５ｃａＩ　（１８単位）と
脱リン酸酵素ＢＡＰ　（０，２単位）を用いて、３７°
Ｃで１時間処理した後、０．７％アガロース電気泳動を
用いて約３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また、ＰＢＢ
９　２ＪＬｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩ（２０単位）とＰ
ｓｔＩ　（２０単位）を用いて３７℃で１時間処理した
後同様の操作を行なうことにより、２．７ｋｂのＤＮＡ
断片を精製し、以下の部位特異的遺伝子変換を行なった
。

上記のＤＮＡ断片各０．１３Ｐｇと、５０　ｐ　ｍ　。

文の５′リン酸化合成りＮＡ　（第８表ａに示す）を用
いて、１００℃で３分間処理した後、３０６Ｃで３０分
間アニーリングを行ない、更にこのＤＮＡ溶液１７．２
．１に５ｍＭｄＮＴＰ　　７ＪＬＪ１と１０ｍＭＡＴＰ
３．６ＪＬｌ、クレノー酵素（４単位）およびＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（１単位）を加えて、２５℃で３時間処理し
た。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＪＭ８３株に形質転
換を行ない、Ｘ−ｇａｌ、アンピシリンを含むし寒天培
地にて形質転換体の白いコロニーを得た。この形質転換
体コロニーを１０ｍＪＬのし液体培地に植菌し、３７°
Ｃで１２時間培養し、常法によりプラスミドＤＮＡ　（
ｐＢＢＤ７）を分離した。

ｐＢＢＤ７　　ＺＪＬｇを制限酵素５ｃａｌ　（１８単
位）と脱リン酸酵素ＢＡＰ　（０，２単位）、を用いて
、３７°Ｃで１時間処理し、０．７％アガロース電気泳
動を用いて３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

また、ｐＢＢＤ７　２ｈｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩ　　
（２０単位）とＰｓｔｌ　（２０単位）を甫いて３７℃
で１時間処理した後同様の操作で、２．７ｋｂのＤＮＡ
′Ｕｒ片を精製した。これらの３ｋｂと２．７ｋｂのＤ
ＮＡ断片を夫々０．６ＪＬｇと、５０　ｐ　ｍ　。

又の５′リン酸化合成りＮＡ　（第８表すに示す）を用
いて、上記の方法により部位特異的遺伝子変換を行なっ
た。得られた形質転換体の青いコロニー２４個を植菌し
、常法によりプラスミドＤＮＡを分離した後、大腸菌Ｊ
Ｍ８３株に形質転換した。

２４枚のプレートよりそれぞれ青いコロニーを、Ｌ液体
培地に植菌し、培養後常法によりプラスミドＤＮＡ　（
ｐＢＢＸ）を分離した。各々のＤＮＡをジデオキシ法に
よるＤＮＡシーケンシングを行ない、変換した塩基配列
及びアミノ酸を確認した。

各々のアミノ酸の変換したプラスミド２ＩＬｇを、制限
酵素Ｂａ＋＊ＨＩ　　（１０単位）を用いて３７℃で１
時間処理した後０．７％アガロース電気泳動を用いて０
．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また、天然の逆転写
酵素発現プラスミドｐＫＰｐｏｌ　−ＮＴＩ（バリン）
５ｇｇを、Ｂａｍ旧　（５０単位）を用いて３７°Ｃで
１時間処理した後同様の操作を行なうことにより、約４
．７ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。この４．７ｋｂのＤ
ＮＡ断片と各々のアミノ酸変異を含む０．３ｋｂのＤＮ
Ａ＠片をそれぞれ０．ＩＪＬｇづつ混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（２単位づつ）を用いて４°Ｃで１２時間連結
反応を行なった。

これらのＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＪＭ８３株に形質転
換を行ない、アンピシリン、Ｘ−ｇａｌを含むＬ寒天培
地にて形質転換体コロニーをそれぞれ得た。これらを、
Ｌ液体培地に植菌し、３７°Ｃ１１２時間振どう培養を
行ない、常法によりプラスミドＤＮＡを分離した。

以上の製造工程を第３図に示す。

これらはそれぞれ、ｐＫＰ−ＴＩＬ（ロイシン）、ｐＫ
Ｐ−ＴＩＩ　（イソロイシン）、ｐＫＰ−ＴＩＡ（アラ
ニン）、ｐＫＰ−ＴＩＦ　（フェニルアラニン）、ｐＫ
Ｐ−ＴＩＲ（アルギニン）、ｐＫＰ−ＴＩＫ（リジン）
、ＰＫＰ−ＴＩＤ　（アスパラギン酸）、ｐＫＰ−ＴＩ
Ｎ　（アスパラギン）、ｐＫＰ−ＴＩＭ　（メチオニン
）、ＰＫＰ−ＴＩＧ（グリシン）である。

これらのクローンについて、逆転写活性を測定した。結
果を第８表に示す。

［発明の効果］ 以上説明したように、本発明の逆転写酵素発現プラスミ
ドの製造方法によれば、逆転写酵素の発現活性が極めて
高い逆転写酵素発現プラスミドを得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に使用するベクターの一例の遺伝子地図
、第２図は本発明の製造方法の一実施例を示す工程図、
第３図は本発明の製造方法の他の実施例を示す工程図、
第４図は逆転写活性を示すグラフである。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）【遺伝子配列があります】 〔但し、Ａはアラニン（Ａ ｌａ）、Ｃはシステイン（Ｃｙｓ）、Ｄはアスパラギン
   酸（Ａｓｐ）、Ｅはグルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｆはフェ
   ニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｇはグリシン（Ｇｌｙ）、Ｈ
   はヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｉはイソロイシン（Ｉｌｅ）
   、Ｋはリジン（Ｌｙｓ）、Ｌはロイシン（Ｌｅｎ）、Ｍ
   はメチオニン（Ｍｅｔ）、Ｎはアスパラギン（Ａｓｎ）
   、Ｐはプロリン（Ｐｒｏ）、Ｑはグルタミン（Ｇｌｎ）
   、Ｒはアルギニン（Ａｒｇ）、Ｓはセリン（Ｓｅｒ）、
   Ｔはスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｖはバリン（Ｖａｌ）、Ｗ
   はトリプトファン（Ｔｒｐ）及びＹはチロシン（Ｔｙｒ
   ）を表す〕 で表されるアミノ酸配列を有する逆転写酵素発現プラス
   ミド。
2. （２）第２２３番目のＶ（バリン）を、Ｌ（ロイシン）
   に置換してなる特許請求の範囲第１項記載の逆転写酵素
   発現プラスミド。
3. （３）第２２３番目のＶ（バリン）を、Ｉ（イソロイシ
   ン）に置換してなる特許請求の範囲第１項記載の逆転写
   酵素発現プラスミド。
4. （４）第２２３番目のＶ（バリン）を、Ａ（アラニン）
   に置換してなる特許請求の範囲第１項記載の逆転写酵素
   発現プラスミド。
5. （５）第２２３番目のＶ（バリン）を、Ｆ（フェニルア
   ラニン）に置換してなる特許請求の範囲第１項記載の逆
   転写酵素発現プラスミド。
6. （６）第２２３番目のＶ（バリン）を、Ｒ（アルギニン
   ）に置換してなる特許請求の範囲第１項記載の逆転写酵
   素発現プラスミド。
7. （７）第２２３番目のＶ（バリン）を、Ｋ（リジン）に
   置換してなる特許請求の範囲第１項記載の逆転写酵素発
   現プラスミド。
8. （８）第２２３番目のＶ（バリン）を、Ｄ（アスパラギ
   ン酸）に置換してなる特許請求の範囲第１項記載の逆転
   写酵素発現プラスミド。
9. （９）第２２３番目のＶ（バリン）を、Ｎ（アスパラギ
   ン）に置換してなる特許請求の範囲第１項記載の逆転写
   酵素発現プラスミド。
10. （１０）第２２３番目のＶ（バリン）を、Ｍ（メチオニ
    ン）に置換してなる特許請求の範囲第１項記載の逆転写
    酵素発現プラスミド。
11. （１１）第２２３番目のＶ（バリン）を、Ｇ（グリシン
    ）に置換してなる特許請求の範囲第１項記載の逆転写酵
    素発現プラスミド。
12. （１２）以下の（イ）〜（リ）の工程を含むことを特徴
    とする 【遺伝子配列があります】 〔但し、Ａはアラニン（Ａ ｌａ）、Ｃはシステイン（Ｃｙｓ）、Ｄはアスパラギン
    酸（Ａｓｐ）、Ｅはグルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｆはフェ
    ニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｇはグリシン（Ｇｌｙ）、Ｈ
    はヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｉはイソロイシン（Ｉｌｅ）
    、Ｋはリジン（Ｌｙｓ）、Ｌはロイシン（Ｌｅｎ）、Ｍ
    はメチオニン（Ｍｅｔ）、Ｎはアスパラギン（Ａｓｎ）
    、Ｐはプロリン（Ｐｒｏ）、Ｑはグルタミン（Ｇｌｎ）
    、Ｒはアルギニン（Ａｒｇ）、Ｓはセリン（Ｓｅｒ）、
    Ｔはスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｖはバリン（Ｖａｌ）、Ｗ
    はトリプトファン（Ｔｒｐ）及びＹはチロシン（Ｔｙｒ
    ）を表す〕 で表されるアミノ酸配列を有する逆転写酵素発現プラス
    ミドの製造方法。 （イ）プラスミドｐＫＰ１より逆転写酵素をコードして
    いる遺伝子を分離する。 （ロ）マルチクローニングサイトを２個有し、該２個の
    マルチクロニングサイトの間に３種の終止コドンを挿入
    した中継ぎ塩基配列を有するベクターを、前記（イ）の
    分離操作で用いた制限酵素と同一の制限酵素を用いてＤ
    ＮＡ断片を分離する。 （ハ）前記（イ）及び（ロ）で得られたＤＮＡ断片を連
    結する。 （ニ）前記（ハ）で得られたＤＮＡ溶液により大腸菌の
    形質転換を行ない、青色の形質転換体コロニーを得る。 （ホ）前記（ニ）で得られたプラスミドを大腸菌に導入
    し、白色の形質転換体コロニーを得る。 （ヘ）この形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製後、
    このＤＮＡの逆転写酵素のＮ末端側の余分なアミノ酸配
    列を除去する。 （ト）このＤＮＡを大腸菌に導入して形質転換を行ない
    、青色の突然変異体を得る。 （チ）この突然変異体のＣ末端に終止コドンを導入する
    。 （リ）この突然変異体を大腸菌に導入して形質転換を行
    ない、白色の突然変異体を得る。
13. （１３）さらに下記の工程を含む特許請求の範囲第２項
    記載の製造方法。 （ａ）プラスミドｐＳＨ１より逆転写酵素領域を含むＤ
    ＮＡ断片を切り出す。 （ｂ）マルチクローニングサイトを２個有し、該２個の
    マルチクロニングサイトの間に３種の終止コドンを挿入
    した中継ぎ塩基配列を有するベクターを、前記（ａ）の
    分離操作で用いた制限酵素と同一の制限酵素を用いてＤ
    ＮＡ断片を分離する。 （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）で得られたＤＮＡ断片を連
    結する。 （ｄ）前記（ｃ）で得られた溶液により大腸菌の形質転
    換を行ない、青色の形質転換体コロニーを得る。 （ｅ）前記（ｄ）で得られたプラスミドに部位特異的遺
    伝子変換を行ない、この溶液を用いて大腸菌に形質転換
    を行ない、白色の形質転換体コロニーを得る。 （ｆ）前記（ｅ）で得られたＤＮＡに対し、部位特異的
    遺伝子変換を行ない、青色の形質転換体コロニーを得、
    プラスミドを分離後大腸菌に形質転換する。 （ｇ）前記（ｆ）で得られたプラスミドを制限酵素を用
    いて処理しＤＮＡ断片を精製し、これを上記と同一の制
    限酵素を用いて処理した特許請求の範囲第２項の製造方
    法により得られる突然変異体と連結し、得られるＤＮＡ
    溶液を大腸菌に形質転換することにより形質転換体コロ
    ニーを得、次いでプラスミドＤＮＡを分離する。