JP4714739B2 - 液体クロマトグラフィー溶出液の分析 - Google Patents

Description

本明細書に引用される全ての文書は、それらの全体が参考として援用される。

（技術分野）
本発明は、糖類の分析の分野にある。

（背景技術）
キャリアタンパク質に結合体化された莢膜糖類抗原を含む免疫原は、当該分野で周知である。結合体化は、Ｔ細胞非依存性抗原（Ｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ）をＴ細胞依存性抗原（Ｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ）に変換し、それによって、記憶応答を高め、防御免疫を発生させる。そしてプロトタイプ結合体ワクチンは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型（Ｈｉｂ）［例えば、参考文献１の第１４章を参照のこと］についてのものであった。このＨｉｂワクチン以来、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）から防御するための結合体化糖類ワクチンおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）から防御するための結合体化糖類ワクチンが開発された。結合体ワクチンが重要である他の生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓである。

糖類がワクチンおよび他の生物製剤中に含まれる場合、監督機関は、一般に、糖類の特徴付けを義務づけている。糖類の特徴付けに使用される一般的技術は、陰イオンクロマトグラフィー、特に、高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）であり、通常、パルス電流滴定検出（ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（ＰＡＤ）を伴う［２，３］。適切なＨＰＡＥＣ−ＰＡＤシステムは、Ｄｉｏｎｅｘ^ＴＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）によって提供され、例えば、ＢｉｏＬＣ^ＴＭシステムである。これらのシステムは、誘導体化する必要も、分析前に分離する必要もなしに混合物中の個々の糖類を定量的に分析する。そして混合した糖類の分析は、糖類プロファイリングにおいて使用され得る。

糖類を分析する場合、ＨＰＡＥＣカラムからの溶出液（ｅｌｕａｔｅ）は、代表的には、パルス電流滴定検出器（ＰＡＤ）を用いて分析される。すなわち、検出は、電流に基づく。適切な（高い）ｐＨにおいて、炭水化物は、正の電位を印加することによって、電極の表面において電気触媒的に酸化され得る。このようにして発生した電流は、炭水化物濃度に比例し、このことは、電流滴定法によるこの炭水化物の検出および定量を可能にする。単純な電流滴定検出と比較すると、このＰＡＤ技術は、クリーニング・再生電位の短いパルスに標準的な検出電位を散在させ、それによって、分析物の酸化生成物が、これら電極に付着する場合に生じる困難性を避ける。ＨＰＡＥＣ分析に使用される場合と同様に、ＰＡＤはまた、ＨＰ陽イオン交換クロマトグラフィー分析に［４］、および他のＨＰＬＣ分離に使用される。

さらなる分析情報を得るために、特に、電流滴定的に活性でない化合物および化学修飾された化合物を扱う場合、本発明者らは、溶出液を分光光度的手段によって分析することを決定した。不運なことに、莢膜糖類のＨＰＡＥＣ分析の間に使用される高いｐＨは、水酸化物イオンが、この溶出液中に存在することを意味する。そしてこれらのイオンの（特に、紫外線領域における）高い吸光度は、分光光度的分析の付加が、容易ではないことを意味した。水酸化物イオンは、マイクロメンブレン化学サプレッサーデバイス（ｍｉｃｒｏ−ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｄｅｖｉｃｅ）を用いることによって除去できたが、これは、新たな問題をもたらした。なぜなら、莢膜糖類を溶出するために「押し出し因子（ｐｕｓｈｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」として使用されるアセテートは、代表的には、このサプレッサーによって、高度に吸着性の酢酸に変換されるからである。

本発明の目的は、糖類の陰イオンクロマトグラフィーによる特徴付けを行うためのさらなるかつ改良されたシステムを提供することである。特に、目的は、水酸化物イオン、または水酸化物イオンの返還後には、酢酸のいずれかの存在から生じる溶出液の分光光度分析における困難性を克服することである。

（発明の開示）
水酸化物／アセテートベースの溶離液（ｅｌｕａｎｔ）を使用することによって引き起こされるこれらの困難性を克服するために、本発明者らは、２つのアプローチを利用した。第１は、本発明者らは、アセテート押し出し因子を要しない、より弱い陰イオン交換支持体を使用することを選択した。このようなカラムは、現時点で、炭水化物を分析するためには使用されていないが、より代表的には、多数の無機酸陰イオンおよび有機酸陰イオンを分離するために使用されている［５］。第２に、本発明者らは、低い分光光度的吸光度を有する押し出し因子を使用することを選択した。これらのアプローチの両方によって、分光光度的検出を、ＰＡＤ検出と組み合わせることが可能になった。さらに、これらのアプローチはまた、通常のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロトコルと適合性であり、かつ有利なことには、分光光度的検出が望ましくない場合ですら使用することができ、特に、これらアプローチが長いオリゴ糖類のより良好な分離を可能にする場合に、使用することができる。

従って、本発明の第１の局面によれば、電流滴定による検出が、分光光度的検出と組み合わされ、その結果、両方の検出法が使用される。従って、本発明は、液体クロマトグラフィーカラムからの溶出液を分析するための方法を提供し、ここでこの溶出液は、電流滴定法および分光法の両方によって分析される。本発明はまた、サンプルを分析するための装置を提供し、ここでこの装置は、（ｉ）液体クロマトグラフィーカラム、（ｉｉ）電流滴定検出器、および（ｉｉｉ）分光検出器を備え、これら２つの検出器は、このカラムからの溶出液を受容するように配置される。

ＨＰＡＥＣカラムの出力を分析するためにＰＡＤ検出またはＵＶ検出を別個に使用することは、既に報告されている［６］。しかし、この溶出液を分析するために、電流滴定技術および分光光度技術の両方を使用することは新規である。両方の種類の検出を使用することから得られる情報の内容は、有利なことには、２つの検出法のいずれかを単独で使用した場合に得られる情報より優れている。例えば、図１に認められるように、あるピークは、ＰＡＤよりもＵＶにおいてよりよいダイナミックレンジを与え、あるピークは、ＵＶよりもＰＡＤにおいてより良好である。

第２の局面において、本発明はまた、莢膜糖類分析物を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出するための方法を提供し、ここでこの分析物は、アセテートもしくは水酸化物以外の陰イオンを含む溶離液を用いて溶出される。この溶離液は、好ましくは、硝酸イオン；塩化物イオン；炭酸イオン；およびホウ酸イオンからなる群より選択される陰イオンを含む。これらの陰イオンのナトリウム塩は、都合よく使用され得る。この方法は、特に、この溶離液が塩基性（例えば、ｐＨ＞９）である場合に有用であり、水酸化物イオンの化学サプレッサーが使用されている場合にはなおさら有用であり、そして長いオリゴ糖類のより良好な分離を提供する。さらに、この方法は、アセチル化糖類の分析に特に有用である。

第３の局面において、本発明はまた、陰イオン交換クロマトグラフィーによって糖類を分析するための方法を提供し、ここでクロマトグラフィーは、５０μｅｑ未満（例えば、≦４０μｅｑ、≦３０μｅｑ、≦２０μｅｑなど）のキャパシティーを有するカラムを用いて行われる。この低キャパシティーカラムの使用は、溶出が迅速でありかつ押し出し因子を使用する必要がないことを意味する。従って、水酸化物抑制が、酢酸を発生させることなく使用され得る。アセテートを含まない水酸化物溶離液が代表的には使用され、そしてアセテートイオンの回避が、アセチル化糖類の分析のために特に有用である。この低キャパシティーカラムは、長いオリゴ糖類のより良好な分離を可能にする。

本発明の第２の局面および第３の局面は、有利なことには、一緒に利用され得る。すなわち、本発明は、陰イオン交換クロマトグラフィーによって莢膜糖類分析物を分析するための方法を提供し、ここでこのクロマトグラフィーは、５０μｅｑ未満のキャパシティーを有するカラムを用いて行われ、このカラムからの溶出は、硝酸イオンおよび塩化物イオンからなる群より選択されるイオンを含む溶離液を利用する。

本発明はまた、本発明のクロマトグラフィー法の溶出液を提供する。本発明は、本発明の方法を用いて分析された物質を活性成分として含む医薬をさらに提供する。特に、本発明は、本発明の方法を用いて分析された細菌莢膜糖類を含む免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を提供する。

（液体クロマトグラフィーカラム）
本発明の第１の局面は、液体クロマトグラフィーカラムからの出力を分析するために有用である。この局面は、種々の液体クロマトグラフィーカラムに適用され得るが、好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）とともに使用される。本発明は、高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）による分離または高性能陽イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＣＥＣ）による分離の結果を分析するために特に有用である。

好ましいカラムは、糖類がこのカラムから溶出されなければならないように、糖類を自発的に保持するカラムである。このクロマトグラフィーカラムからの溶出は、定組成溶出（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ）または勾配溶出であり得る。水酸化ナトリウムおよび／または酢酸ナトリウムを含む溶離液は、糖類のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析の間に使用される代表的な溶離液である。しかし、本発明の第２の局面において、硝酸塩および／または塩化物塩溶離液（代表的には、ナトリウム塩）が使用され、通常、実質的に、いかなるアセテート溶離液も存在しない場合に使用される。次いで、陰イオン交換カラムから分析物を溶出するために、この溶離液は、一般に、塩基性である。例えば、そのｐＨは、＞８、＞９、＞１０、＞１１、＞１２、＞１３などである。水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）が、望ましいｐＨを達成するために使用され得、そして水酸化物イオンは、陰イオン交換溶離液において使用するのに代表的である。

この溶出液は、水酸化物イオンが、使用されている分析検出技術を妨げる場合に、水酸化物イオンの化学抑制に供され得る。マイクロメンブレンサプレッサーは、都合よく使用され得る（例えば、Ｄｉｏｎｅｘ^ＴＭのＭＭＳ製品）。この「ＭＭＳ ＩＩＩ」製品は、溶離液伝導率を減少させながら分析物伝導率を高めるために、連続的化学抑制を利用し、広い濃度範囲に対して定組成溶出または勾配溶出を用いるイオン交換適用に伴って直接伝導率検出を可能にする。アセテートイオンから酢酸を生成するサプレッサーは、アセテートイオンが溶離液中に含まれ、その生成した酢酸が使用されている分析的検出技術を妨げる場合に、特に回避される。

本発明の第１の局面および第２の局面とともに使用される好ましいＨＰＡＥＣカラムは、Ｄｉｏｎｅｘによって市販されている「ＣａｒｂｏＰａｃ」カラム（例えば、ＰＡ１［１０μｍ直径のポリスチレン基質（ジビニルベンゼンで２％架橋し、５００ｎｍ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ 四級アンモニウム官能化ラテックス（５％架橋）で凝集させた］、ＰＡ１００、ＰＡ２０、ＰＡ１０［１０μｍ直径のエチルビニルベンゼン基質（ジビニルベンゼンで５５％架橋し、４６０ｎｍ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ 二官能性四級アンモニウムイオン（５％ 架橋）で凝集させた］、ＰＡ２００またはＭＡ１カラム）である。好ましいＨＰＣＥＣカラムは、やはりＤｉｏｎｅｘによって市販されている「ＩｏｎＰａｃ」カラム（ＣＳ１０カラムを含む）である。

液体クロマトグラフィーを用いる代替法として、本発明の第１の局面は、キャピラリー電気泳動分離（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐ／ＡＣＥ システム）の出力を分析するために使用され得る。

本発明の第３の局面に関して、陰イオン交換カラムは、５０μｅｑ（ｍｉｌｌｉｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ ｏｆ ｃｈａｒｇｅ）未満（例えば、＜４０μｅｑ、＜３０μｅｑ、＜２０μｅｑなど）のイオンキャパシティーを有する。好ましいＨＰＡＥＣカラムは、ａｒｅ ｔｈｅ Ｄｉｏｎｅｘによって市販されている、アルカノール四級アンモニウム官能基を有する水酸化物選択的「ＩｏｎＰａｃ ＡＳ」カラム（例えば、ＡＳ１１カラム）である。その２×２５０ｍｍ分析形式において使用される場合、このＡＳ１１カラムは、１１μｅｑのキャパシティーを有し、このカラムは、４×２５０ｍｍ形式において使用される場合、４５μｅｑに増大する。低キャパシティーの水酸化物選択的カラムが好ましい。

（電流滴定検出および分光光度的検出）
本発明の第１の局面は、液体クロマトグラフィーカラムの溶出液を、電流滴定的にかつ分光光度的に分析する。カラムから溶出してくる物質は、分割され得、一部分は電流滴定的に分析され、もう一部分は、分光光度的に分析される。代替法として、カラムから溶出してくる物質は、分割することなく直列に（電流滴定的に、次いで分光光度的に、または分光光度的に、次いで電流滴定的に、のいずれかで）分析され得る。これら２つの異なる一般的方法は、図２および図３に図示される。直列分析が使用される場合、特に、分光光度的検出が、電流滴定による検出と比較して、構造を破壊しない場合には、電流滴定による検出の前に分光光度的検出を行うことが好ましいことであり得る。

この電流滴定による検出は、好ましくは、パルス電流滴定検出（ＰＡＤ）である。種々の波形が、ＰＡＤにおいて使用され得る［７］。これらの波形としては、図４において示されるプロフィールを有する波形のいずれかが挙げられる。電極をクリーニングするために負の電位を使用することが好ましい。図４Ａの波形は、電極クリーニングのための負の電位を利用し、長期間の再現性を改良しかつ電極の摩損を低下させる。

電流滴定による検出に使用される電極は、好ましくは、金電極である。

分光光度的検出は、好ましくは、電磁放射（好ましくは、１００ｎｍ〜９００ｎｍの間の波長（例えば、１００〜２００ｎｍ、１５０〜２５０ｎｍ、２００〜３００ｎｍ、２５０〜３５０ｎｍ、３００〜４００ｎｍ、３５０〜４５０ｎｍ、４００〜５００ｎｍ、４５０〜５５０ｎｍ、５００〜６００ｎｍ、５５０〜６５０ｎｍ、６００〜７００ｎｍ、６５０〜７５０ｎｍ、７００〜８００ｎｍ、７５０〜８５０ｎｍ、８００〜９００ｎｍの範囲の波長）を有する）の吸光度および／または放射に基づく。使用される光の波長は、検出されるべき分析物に従って選択され得る。紫外（ＵＶ）吸収分光法（例えば、２００ｎｍでの）および可視光吸収分光法は、糖類を分析するために特に好ましい２つの方法である。

電流滴定による検出を使用する代替法として、本発明は、伝導率検出（抑制伝導率検出を含む）を利用し得る。

（分析物）
本発明は、液体クロマトグラフィーカラムからの溶出液を分析するために使用される。この溶出液は、サンプル中の１種以上の分析物のクロマトグラフィー分離の結果である。

本発明は、糖類分析物を分析するために特に有用である。これらは、多糖類（例えば、少なくとも１０個、例えば、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個以上重合程度を有する）、オリゴ糖類（例えば、２〜１０個の重合程度を有する）、または単糖類であり得る。オリゴ糖類および単糖類は、親である多糖類の脱重合および／または加水分解の結果であり得る。例えば、この分析物は、より大きな糖類の糖類含有フラグメントであり得る。

好ましい糖類分析物は、細菌の糖類であり、特に、細菌莢膜糖類（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５またはＹ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型またはＶＩＩＩ型）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（タイプ分け可能な株：ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅまたはｆ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどに由来する）である。他の糖類分析物としては、グルカン（例えば、真菌のグルカン（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓにおけるグルカン）、真菌の莢膜糖類（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの莢膜に由来する）が挙げられる。

このＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清群Ａ莢膜は、（α１→６）結合Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーである。このＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ莢膜は、（α２→８）結合シアル酸のホモポリｍらーである。このＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ莢膜糖類は、（α２→９）結合シアル酸のホモポリマーである。このＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗ１３５糖類は、シアル酸−ガラクトース二糖類ユニット［→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→］からなるポリマーである。このＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙ糖類は、その二糖類反復ユニットが、ガラクトースの代わりにグルコースを含む［→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（１→］ことを除いて、血清群Ｗ１３５糖類と類似である。このＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型莢膜糖類は、リボース、リビトール、およびホスフェート［「ＰＲＰ」、ポリ−３−β−Ｄ−リボース−（１，１）−Ｄ−リビトール−５−ホスフェート）］のポリマーである。全長莢膜糖類を分析するために有用であるのに加えて、本発明は、それらのオリゴ糖類フラグメントとともに使用され得る。

他の好ましい糖類抗原は、糖結合体から、例えば、糖類−タンパク質結合体ワクチン抗原から切断されたものである。ヒトでの使用に関して認可された３種類のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ結合体化ワクチンのうち、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭ［８］およびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭは、オリゴ糖類に基づくのに対して、ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ^ＴＭは、全長多糖類を利用する。

他の好ましい糖類抗原は、真核生物糖類（例えば、真菌糖類、植物糖類、ヒト糖類（例えば、癌抗原）など）である。

中性ｐＨで荷電した（例えば、陰イオン性の）糖類が好ましい分析物である。複数のホスフェートおよび／または複数のカルボキシレート基を有する糖類分析物は、本発明の方法を用いて分析され得る。従って、本発明は、ポリアニオン性糖類分析物を分析するために特に有用である。

他の好ましい分析物は、リポ多糖類およびリポオリゴ糖類である。

本発明は、異なる長さの種々の糖類（例えば、同じ親である糖類の異なるフラグメント）を含む分析物で使用するために特に有用である。

この分析物は、一般に、水溶液中に存在し、この溶液は、ＨＰＡＥＣの結果として、高ｐＨおよび高塩濃度を有する。

代表的な分析物は、電流滴定技術および分光光度技術の両方によって検出され得る分析物である。

目的の分析物を含むのみならず、分析されるべきサンプルは、他の物質も含み得る。これらは、クロマトグラフィーカラムによって保持されてもよいし、保持されなくてもよいので、溶出液中に存在してもよいし、存在しなくてもよい。代表的には、このような成分は、カラムに結合しない。

従って、本発明の方法によって分析される溶出液は、これら分析物を含むかまたはこれら分析物を含むと疑われる。

この分析物は、遊離前に（例えば、製造または品質管理試験の間に）試験されるべき生成物であってもよいし、遊離後に試験される（例えば、安定性、保管寿命などを評価する）べき生成物であってもよい。

（さらなる工程）
液体クロマトグラフィーカラムからの溶出液を分析する前に、本発明の方法は、分析物含有サンプル（または分析物を含有すると疑われるサンプル）をカラムに添加する工程を包含し得る。従って、本発明は、サンプル中の分析物の存在を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）このサンプルを、このサンプル中の分析物がカラムによって保持されるように、液体クロマトグラフィーカラムに適用する工程；（ｂ）このカラムからの分析物を溶出する工程；および（ｃ）上記のように、この溶出液を分析する工程を包含する。

糖類分析のために、カラムに入れる前に、サンプルから、少なくともいくつかの非分析物化合物を濾過することが望ましいことであり得る。そしてＤｉｏｎｅｘ^ＴＭは、プレカラム工程およびこの目的のためのガード（例えば、アミノ酸を除去するためのアミノトラップ、ホウ酸トラップなど）を製造する。

溶出および分析の後、本発明は、検出された分析物の特徴（例えば、そのＤＰ（代表的には、平均ＤＰ）、その分子量、その純度など）を決定するためのさらなる工程を包含し得る。電流滴定検出器および分光検出器の後ろで、この溶出液は、質量分析器（例えば、ＦＡＢ／ＭＳまたはＥＳＩ／ＭＳ）に連結され得る。

（望ましい糖類を選択するための本発明の使用）
本発明は、正確にサイズ分けされた糖類の鎖が結合体の生成のために選択されることを確実にすることが必要である段階での結合体化前に、特に有用である。

本発明は、結合体化の前に全長多糖類のフラグメント化の進捗が、チェックされるまたはモニターされることを可能にする。特定の長さの（または長さの範囲の）オリゴ糖類が望ましい場合、この多糖類のフラグメント化が、望ましい点を通り過ぎた脱重合を受けるほどには徹底的であるべきでない（例えば、極端には、単糖類を与える）ことが重要である。本発明は、この部分的脱重合の進捗を、糖類鎖長を経時的に測定することによって、モニターすることを可能にする。従って、本発明は、組成物中の糖類を分析するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）この組成物中の糖類の脱重合を開始する工程；およびその後の１回以上の時点で、（ｂ）その糖類を本明細書に記載のように分析する工程を包含する。経時的に進捗を測定するために、実験の最初の実施において、いくつかの時点で分析することは通常であるが、標準的な条件が確立された後で、確認目的で、あるセットの時点で分析することが通常である。一旦望ましい終点に達したら、そのプロセスは、（ｃ）この脱重合を、例えば、洗浄、分離、冷却などによって停止するさらなる工程を包含し得る。このプロセスはまた、最適な化学的活性化の後に、この脱重合した糖類をキャリアタンパク質へと結合体化するさらなる工程を包含し得る。

本発明はまた、フラグメント化の後に望ましいオリゴ糖類鎖を選択することを可能にする。従って、本発明は、糖結合体を調製することにおいて使用するための糖類を選択するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）種々の多糖類フラグメントの混合物を含む組成物を得る工程；（ｂ）この混合物を、サブ混合物（ｓｕｂ−ｍｉｘｔｕｒｅ）に分ける工程；（ｃ）本明細書に記載されるプロセスを用いて、１つ以上のサブ混合物を分析する工程；および（ｄ）工程（ｃ）の結果を用いて、結合体化において使用するための１種以上のサブ混合物を選択する工程を包含する。このプロセスは、工程（ａ）の前に多糖類のフラグメント化を伴ってもよいし、既に調製された混合物で開始してもよい。このフラグメントは、同じ多糖類のフラグメント（例えば、同じ血清群のフラグメント）であり得る。工程（ｄ）の後に、このプロセスは、任意の化学的活性化の後に、キャリアタンパク質への結合体化工程を包含し得る。

結合体化の前に、糖類が、そのキャリアと反応し得る官能基を導入するために化学的に活性化されることが通常である。糖類活性化の条件は、加水分解を引き起こし得るので、活性化後に、糖類を分析することは有用である。用語「糖類」とは、適切である場合、これら活性化糖類を含むと解釈されるべきである。さらに、本発明は、糖結合体の調製において使用するために、活性化糖類を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）糖類を得る工程；（ｂ）この糖類を化学的に活性化して、キャリアタンパク質と反応し得る官能基を導入する工程；および（ｃ）工程（ｂ）の前に、本明細書に記載されるように、生成物を分析する工程を包含する。このプロセスは、（ｄ）この活性化糖類と、キャリアタンパク質（これ自体も活性化され得る）とを反応させて、この糖結合体を与える工程をさらに包含し得る。このプロセスは、工程（ａ）の前に多糖類のフラグメント化を伴ってもよいし、既に調製された混合物で開始されてもよい。

本発明はまた、結合体化の後に使用され得る。結合体化の後、組成物は、３つの方法で本発明を用いて分析され得る：第１に、組成物中の合計糖類が、例えば、種々の結合体の混合前に、またはワクチンをリリースする前に（調節目的でまたは品質管理目的で）、測定され得る；第２に、組成物中の遊離している非結合体化糖類は、例えば、不完全な結合体化をチェックするために、または増大する遊離糖類を経時的にモニターすることによって結合体加水分解を追跡するために、測定され得る；第３に、同じ理由で、組成物中の結合体化した糖類が測定され得る。第１の方法および第３の方法は、分析する前に、糖類が結合体から遊離されることを要する。結合体化した糖類および結合体化していない糖類を別個に評価するために、これらを分離しなければならない。水性組成物中の遊離の（すなわち、結合体化していない）糖類は、種々の方法で結合体化した糖類から分離され得る。この結合体化反応は、その糖類についての種々の化学的パラメーターおよび物理的パラメーターを変化させ、そしてその差異は、分離のために利用され得る。例えば、サイズ分離は、遊離糖類および結合体化した糖類を分離するために使用され得る。なぜなら、結合体化した物質は、キャリアタンパク質に起因してより大きな質量を有するからである。限外濾過が、好ましいサイズ分離法である。さらなる代替法として、結合体がアジュバントに吸着された場合、遠心分離が、吸着した結合体（ペレット）を、加水分解後に脱着される遊離糖類（上清）から分離する。

本発明は、糖結合体を分析するための方法を提供し、この方法は、（ａ）この糖結合体を処理して、糖類をキャリアから遊離させる工程；および（ｂ）この遊離した糖類を本明細書で記載のように分析する工程を包含する。本発明は、糖結合体組成物を分析する方法を提供し、この方法は、（ａ）この組成物中の結合体化していない糖類を、結合体化した糖類から分離する工程；および（ｂ）上記のように、結合体化していない糖類および／または結合体化した糖類を分析する工程を包含する。

本発明はまた、医師による使用のためのワクチンをリリースする方法を提供し、この方法は、（ａ）ワクチンを製造する工程（本明細書中に記載される分析工程を包含する）；および工程（ａ）からの結果が、ワクチンが臨床使用に関して許容できることを示す場合、（ｂ）医師による使用のためにこのワクチンをリリースする工程を包含する。工程（ａ）は、梱包されたワクチンに対して、梱包する前のバルクワクチンに対して、または結合体化前の糖類に対して、などで行われ得る。

本発明はまた、ワクチンのバッチを提供し、ここでこのバッチ内の１つのワクチンは、本発明の方法を用いて分析されている。

（概略）
用語「含む、含有する、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる、構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ）、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸからなっていてもよいし、何かさらなるものを（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含み得る。

語句「実質的に」とは、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要であれば、語句「実質的に」は、本発明の定義から削除されてもよい。

用語「約」は、数値ｘに関連して、例えば、ｘ±１０％を意味する。

本発明の方法は、分析目的でおよび／または調製（分取）目的で使用され得る。「分析する」、「分析」などへの言及は、調製（分取）方法を排除すると解釈されるべきではない。

糖類の重合の程度（ＤＰ）は、その糖類における反復ユニットの数として規定される。ホモポリマーに関しては、従って、ＤＰが、単糖類ユニットの数と同じである。しかし、ヘテロポリマーに関しては、ＤＰは、鎖全体における単糖類ユニットの数／最小反復ユニットにおける単糖類ユニットの数である。例えば、（Ｇｌｃ−Ｇａｌ）_１０のＤＰは、２０ではなく１０であり、（Ｇｌｃ−Ｇａｌ−Ｎｅｕ）_１０のＤＰは、３０ではなく１０である。

（発明を実施するための形態）
（ＨＰＡＥＣ出力の紫外検出）
莢膜糖類のＨＰＡＥＣ分析の間に使用される高いｐＨは、水酸化物イオンが溶出液中に存在するが、これらイオンは、紫外領域では高い吸光度を有することを意味する。図１９に示されるように、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムで、水だけとともに、標準的なアセテート／水酸化物溶離液を使用すると、任意の目的の分析物を不明瞭にするＵＶ領域における溶出プロフィールを与える。ＵＶ検出をＨＰＡＥＣ溶離液の分析に加えるために、異なるストラテジーが必要であった。

（ＨＰＡＥＣ溶離液のＰＡＤ分析とＵＶ分析との併用）
血清群Ａ 髄膜炎菌の莢膜糖類を脱重合に供して、混合した長さ（高ＤＰ）の荷電した（マンノサミン−１−ホスフェートモノマーからのホスフェート）糖類のプールを与えた。ＨＰＡＥＣ分離のためにＰＡ１カラムを使用するよりむしろ、この混合物を、溶離液（流速１．０ｍｌ／分）として水酸化ナトリウム勾配を使用して、製造業者の示唆したガードを備えたＤｉｏｎｅｘ ＩｏｎＰａｃ ＡＳ１１カラムで分離した。ＨＰＡＥＣカラムからの溶出液を、電気化学的検出器（ＰＡＤ、金電極）およびＵＶ検出器によって、直列で分析した。まとめた電流滴定による検出からの出力を、図１の上のプロフィールにおいて示し、ＵＶ−可視検出（２００ｎｍにおいて）からの出力を、下のプロフィールに示す。

ＡＳ１１カラムは、低キャパシティー（１１μｅｑ）を有する。同じ分析物を、高キャパシティーのＤｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム（１００μｅｑ）に適用し、塩化ナトリウムを、溶離液中の押し出し因子として使用した。図５に示されるように、ＰＡ１カラムからの溶離液は、ＰＡＤによって検出できなかった（下のトレース）が、ＵＶによって検出できた（上のトレース）。従って、ＵＶ検出によって、低キャパシティーＡＥＣカラムを、莢膜糖類の分析のために使用することが可能になる。

（ニトレート溶離液とアセテート溶離液との比較）
血清群Ｗ１３５ 髄膜炎菌の莢膜糖類のオリゴ糖類フラグメントのプールを、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１００カラムを用いて、１００ｍＭ 水酸化ナトリウムでの酢酸ナトリウムを使用する勾配溶出によって、従来のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって分析した。結果を図７に示す。

比較目的で、同じ分析を、ただし酢酸ナトリウムの代わりに溶離液中の硝酸ナトリウムで行った。図８に示されるように、この出力のダイナミックレンジは、遙かに大きくなり、高ＤＰフラグメントの分離がよくなった。ＤＰ５０フラグメントが検出できた。

ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムに変更すると、ダイナミックレンジがさらに増し（図９）、ＤＰ４０フラグメントが検出できた。５μｍ ＰＡ２００カラムを用いると、ＤＰ８０フラグメントが認められた（図１０）。

従って、硝酸塩は、陰イオン交換カラムから種々の長さの莢膜糖類を溶出するために有用である。

（経時的ＤＰ検出のためのニトレート溶離液）
結合体ワクチンの糖類成分は、ゆるやかな加水分解に供され得、これは、時間を経るにつれてＤＰにおける低下をもたらし、より少量のタンパク質キャリアに結合した糖類をもたらす。種々のｐＨ条件下での髄膜炎菌の血清群Ａ糖類の脱重合を、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムを用いてＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによってモニターした。この溶離液は、１．０ｍｌ／分の流速で、１００ｍＭ 水酸化ナトリウム中の酢酸ナトリウムと硝酸ナトリウムとの混合物であった。

３種類の異なる保管条件を、使用した：（１）ｐＨ約９、３７℃で４日間；（２）ｐＨ約４、３７℃で４日間；および（３）ｐＨ約７、−２０℃（すなわち、推奨される保管条件）で。

図６に示されるように、ニトレートを溶離液に添加すると、溶出液についてＰＡＤが可能になり、低ＤＰフラグメントが、脱重合後に検出され得る。０℃未満で保管された物質についてピークが認められない位置（上の線）で、短いフラグメントが、３７℃で保管される物質について見ることができる。

（低キャパシティーカラムでのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ分析）
Ｈｉｂオリゴ糖類（ＤＰ ２〜６）のプールを、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１００カラムで従来のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって分析した。この溶離液は、０．８ｍｌ／分の流速で２４分間にわたる、１００ｍＭ ＮａＯＨを含む３０ｍＭ〜１００ｍＭの酢酸ナトリウム勾配であった。結果を図１１に示す。

短鎖のオリゴマーのみが、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ−１００から溶出し、溶出は、押し出し因子として高パーセンテージの酢酸ナトリウムを必要とした。さらにその後、ＤＰ５オリゴマーおよびＤＰ６オリゴマーは、分離が不十分であり、感度が低かった。従って、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ−１００は、ＤＰ＞４のＨｉｂオリゴ糖類のプールのプロファイリングには適していない。結果として、異なるクロマトグラフィーカラムを、調査した。

ＩｏｎＰａｃ ＡＳ１１カラムを、平均ＤＰ１２．４４の加水分解したＨｉｂ糖類のプールを分析するために使用した。このカラムは、高い水酸化物選択性を有し、従って、強く保持されたポリアニオン（例えば、Ｈｉｂフラグメント）のために以前に使用されたものより低い水酸化物濃度で、高度に荷電された陰イオンの溶出を可能にする。この溶離液は、１５分間にわたる３ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＯＨであった。結果を図１２に示す。これは、繰り返すと、低キャパシティーカラムが、細菌莢膜糖類を分析するために使用され得ることを示す。この溶出は非常に早く、水酸化物勾配だけを必要とした。Ｈｉｂプールからの全ての成分は、１０分間未満で持続するクロマトグラフィー実施において分離できた。

（低いキャパシティーカラムでの髄膜炎菌の血清群Ａ糖類）
ＩｏｎＰａｃ ＡＳ１１カラムを、血清群Ａの髄膜炎菌莢膜多糖類の分子量分布を分析するために使用した。図１３は、１９分間で１０〜１５０ｍＭの水酸化物勾配を使用して、約２００のＤＰを有する多糖類のサンプルについて得られたクロマトグラムを示す。驚くべきことに、このカラムは、この高ＭＷのポリアニオンを分離することができ、このカラム効率は非常に高いので、この分析物は、比較的狭いピークでちょうど１７分間で溶出してきた。この結果は、ゲル濾過クロマトグラフィーのような方法より遙かに優れている。

同じカラムを、多糖類の酸加水分解後に得たオリゴ糖類をプロファイルするために使用した。図１４において示されるように、増大しているＤＰのオリゴ糖類が分離でき、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで、ＤＰと保持時間との間の相関関係があった。

（低キャパシティーカラムでの髄膜炎菌の血清群Ｃ糖類）
血清群Ｃ多糖類は、部分的にＯ−アセチル化されているα−２，９結合Ｎ−アセチル−ノイラミン酸のホモポリマーである。従って、これは、ポリカルボキシレートアニオンである。血清群Ｃ糖類のクロマトグラフィーパターンは、Ｏ−アセチル基の存在によって複雑になる。なぜなら、各オリゴマーは、その構造中のアセチル基の分布に依存して、多くのピークを生じるからである。

精製されたＤＰ５標準物質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析し、複数の異なるオリゴマーの分布を含むことが認められた（図１５）。ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムでのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによる同じ標準物質の分析を、図１６に示す。このカラムからの溶出には、強い条件（５００ｍＭ 酢酸ナトリウム、１００ｍＭ 水酸化ナトリウム）が必要であった。図１５と図１６の間の差異は、このアセテート処理が、糖類中のアセチル基のもとの分布を変更することを示す。従って、アセチル化糖類の分析に強い高キャパシティーＡＥＣカラムを使用することは、最善ではない。

従って、抑制伝導率検出と組み合わせたＩｏｎＰａｃ ＡＳ１１カラムを、代わりに使用した。図１７に示されるように、１０ｍＭ〜６０ｍＭの水酸化ナトリウム勾配（アセテートなし）を使用すると、種々のオリゴ糖類およびＯ−アセチル基分布を示すプロフィールを伴って、ＤＰ５標準物質を溶出することが可能であった。クロマトグラフィーパターンの解釈は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦパターン（これは、アセチル基重量の半分に等しい分子量を有する対イオンとしての種々の量のナトリウムイオンの存在によって複雑になる）より遙かに単純である。

ＤＰ５標準物質で認められた溶出パターンはまた、莢膜多糖類の加水分解生成物についての種々の長さで繰り返して認められた（図１８）。

本発明は、例示によって記載されるに過ぎず、改変は、行われ得るものの、本発明の範囲および趣旨の範囲内にとどまることが理解される。

（参考文献；これらの内容は、本明細書に参考として援用される）

図１は、電流滴定手段（上段のプロフィール）およびＵＶ_{２００ｎｍ}の分光法（下段のプロフィール）によって直列に分析された、ＨＰＡＥＣからの出力を示す。上段のプロフィールにおける測定単位は、ｎＣである；下段のプロフィールは、任意の単位を使用する。 図２は、電流滴定的検出および分光光度的検出の直列配置を示す。 図３は、電流滴定的検出および分光光度的検出の並列配置を示す。 図４は、３つのＰＡＤ波形を示す。ｘ軸は、時間（秒）を示す。ｙ軸は、Ａｇ／ＡｇＣｌ照合電極に対する電位（ボルト）を示す。３つ全ての波形は、遅れ期間（第１の棒）、検出期間（第２の棒）、次に、クリーニング期間を有する。 図５は、ＰＡ１カラムからの、ＰＡＤ（下のトレース）またはＵＶ（上のトレース）によって検出された溶離液の分析を示す。 図６は、種々の条件下で保管された血清群ＡサンプルのＰＡ１カラムからの溶出液分析を示す。この溶出プログラムは、図１９の溶出プログラムと同じである。 図７は、種々の溶離液を用いるＰＡ１００カラムでの血清群Ｗ１３５糖類の溶出液分析を示す。 図８は、種々の溶離液を用いるＰＡ１００カラムでの血清群Ｗ１３５糖類の溶出液分析を示す。 図９は、ＰＡ１カラムでの同じ分析物の溶出を示す。 図１０は、ＰＡ２００カラムでの同じ分析物の溶出を示す。 図１１は、ＰＡ１００カラムでのＨｉｂオリゴ糖類の溶出液分析を示す。 図１２は、ＡＳ１１カラムでの加水分解したＨｉｂ糖類のプールの溶出液分析を示す。 図１３は、ＡＳ１１カラムでの血清群Ａ多糖類の溶出液分析を示す。 この糖類の加水分解後の同じ分析を、図１４に示す。 図１５は、血清群Ｃ標準物質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を示す。 図１６は、ＰＡ１カラムでの同じ標準物質の溶出液分析を示す。 図１７において示されるように、この標準物質も、ＡＳ１１カラムによって分析した。 図１８は、ＡＳ１１カラムでの加水分解した血清群Ｃ多糖類の分析を示す。 図１９は、アセテート／水酸化物溶離液と、ニトレート／水酸化物溶離液とを、マイクロメンブレン抑制を伴ったＰＡ１カラムで用いた、２１４ｎｍで測定した水の溶出プロフィールを示す。この溶出プログラムは、図６の溶出プログラムと同じであった。

Claims (19)

1. サンプル中の糖類分析物の存在を検出するための方法であって、該方法は、
   （ａ）該サンプル中の分析物が、カラムに結合するように、該サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程；
   （ｂ）硝酸イオン、塩化物イオン、炭酸イオン、およびホウ酸イオンからなる群より選択される陰イオンを含む溶離液を用いて、該分析物を該カラムから溶出する工程；ならびに
   （ｃ）該溶出液を電流滴定法および分光法の両方によって分析する工程、
   を包含する、方法。
2. 前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは、高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）カラムである、請求項１に記載の方法。
3. パルス電流滴定検出（ＰＡＤ）が使用される、請求項１または２に記載の方法。
4. 紫外（ＵＶ）吸収分光法および／または可視光吸収分光法が使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記溶出液は、細菌莢膜糖類、または細菌莢膜糖類の糖類含有フラグメントを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記細菌莢膜糖類は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来する、請求項５に記載の方法。
7. 糖類を含むサンプルを分析するための装置であって、該装置は、
   （ｉ）陰イオン交換クロマトグラフィーカラム、
   （ｉｉ）硝酸イオン、塩化物イオン、炭酸イオン、およびホウ酸イオンからなる群より選択される陰イオンを含む溶離液、
   （ｉｉｉ）電流滴定検出器、ならびに
   （ｉｖ）分光検出器、
   を備え、ここで該２つの検出器は、該カラムからの溶出液を受容するように配置されている、装置。
8. 前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは、ＨＰＡＥＣカラムである、請求項７に記載の装置。
9. 前記電流滴定検出器はＰＡＤである、請求項７または８に記載の装置。
10. 前記分光検出器は、ＵＶ検出器である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の装置。
11. 前記サンプルは、細菌莢膜糖類を含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の装置。
12. 前記溶離液は、硝酸陰イオンを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の装置。
13. 前記クロマトグラフィーカラムは、５０μｅｑ未満のキャパシティーを有する、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の装置。
14. 該クロマトグラフィーは、５０μｅｑ未満のキャパシティーを有するカラムを用いて行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記方法は、水酸化物選択的陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用する、請求項１〜６および１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記溶離液は、硝酸陰イオンを含む、請求項１〜６および１４〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記分析物は、異なる長さの種々の糖類を含む、請求項１〜６および１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記分析物は、親である多糖類の脱重合および／または加水分解の結果生じるオリゴ糖類および単糖類を含む、請求項１〜６および１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記糖類は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗ１３５、またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型に由来する細菌莢膜糖類である、請求項１〜６および１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。

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