JPS58162532A - 無毒化イ−・コリ神経毒、その製法およびそれを含有する免疫学的調製物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は鳳毒化したイー・コリ（Ｅ、ｃｏＪｉ）神経毒
、その製法およびそれを含有する免疫学的調製物に関す
る。

エシェリヒア−コリ（Ｉｉ：５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ　）　（７）病原性株によって生成されるある種
の毒素、すなわち、神経毒は激ルい子ブタの疾患である
子ブタ浮腫病（ｐｉｇｌｅＬ　、ｏｅｔｌｅｍａ　４ｉ
ｓｅａｓｅ　）の病因であることが知られている。

子ブタの浮瘍病は腸浮腫または腸性中毒症とも呼ばれ、
殆んどの国に広範にみられる急性の病気で、子ブタの死
因の５〜８０形を占める。この病気は子ブタの離乳後２
週間以内に発現し、その臨床症状としては、運動失調、
痙彎、局部または全身麻痺４前頭部またはまぶたの皮下
組織における浮腫、特に胃壁、螺旋状結腸および脳など
の神々の器官の病理的解剖像にみられる浮腫などが挙げ
られる。

該神経毒は種々のよく知られたイー・コリ血清型により
生成される。

ダブリュー・ジエイ・ソジカ（Ｗ、　Ｊ　、　５ｏｊｋ
ａ。

Ｒｅｓ、　Ｖｅｔ、　ｓｃｉ、ｅｌ　：　１７〜２７　
＊　１９６０　）は、子ブタ浮腫部側から分離した最も
一般的なイー・コリ血清型について記載しており、また
、エイチ・シムメ／Ｌ／フェニツヒ（Ｈ−５ｃｈｉｍｍ
ｅＪｐｆｅｎｎｉｇ、７．ｂｌ　。

Ｖｅ　ｔ　０Ｍｅｄ　。

［Ｂ］　　１１６２２〜６３３．１９７１）は、子ブタ
浮腫病より分離した優性なイー・コリ血清型、つまり、
０１３８．０１３９および０１４１血清型によって該神
経毒が生成されることを示している。

このようなイー・コリ株が感染すると、子ブタの腸内に
神経毒が放出され、吸収され、神経症状および浮腫の原
因となる全身的な動脈病を引き起こす。

現任まで、イー・コリの全菌体またはその溶解物からな
る種々のイー・コリ調製物を使って、子、ブタ浮腫に対
する活性な免疫を付すことが試みられテイル（Ｗ、Ｊ、
５ｏｊｋａ、　ｔｈｅ　Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌ　ｔｈ　
Ａｇｒｉ−ｃｕｌｔｕｒａｊ　Ｂｕｒｅａｕ　ｅｄ、、
Ｅ、ｃｏｌｉ　　ｉｎ　ｄｅｍｅｓｔｉｃａｍｉｍａｌ
ｓ　ａｎｄ　ｐｏｕＪ　１ｙ、１９６５　＊　ｐｉ　２
４　；　Ｅ、Ｋａｕｋｅｒ。

Ｄｅｕｔｓ、　１’１ｅｒａｅｒｚｔ、　Ｗｏｃｈｅｎ
ｓｃｈ、ｅ　７８　：　１８２〜１８４　、１　ｇ　７
１　；　ｉｃ　、ｔｕｔｔｅｒ、　Ｍｏｎａｔｓｈ。

Ｖｅｔｅｒｉｎａｅｒｍｅｄ、２９　：　６９４〜６９
９−１９７４）。

しかし、これらの調製物は子ブタを防御するに至らず、
調製物に用いられているイー・コリ血清５Ｊに対応する
血清型特異免疫を誘引するだけであった。

米国特許第４１３６１８１号は、子ブタ浮腫病に対して
有効なるワクチンに関する。これらのワクチンは部分的
に精製した神経毒をアジュバントで補足したもので、筋
肉内または皮下経路によって投与される。

エイチ・シムメルフエニツヒおよびアール・ウエーハニ
（Ｈ，Ｓｃｈｉｒｒｍｅｊｐｆｅｎｎｉｇ　ａｎｄ　Ｒ
＋Ｗｅｂｅｒ’　５ｔｕｄ−ｉｅｓ、　ｏｎ　ｔｈｅ　
ｏｅｄｅｍａ　ｄｉｓｃａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　
ｔｏｘｉｎｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏＪ　ｉ
、　’　Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｉｎ　Ｖｃｔ、　Ｍｅｄ。

５ｕｐｐｌｅ、　ｔｏ　Ｓｂ１．　ＶｅｔｏＭｅｄ、２
ｇ　：　２５〜３２　。

１９７８）は、毒素をホルムアルデヒドで処理したもの
は完全に無毒化されるが、該ホルマリン処理毒素には抗
体反応の向上を示さないことを報告し、彼らはまたホル
モルートキソイドが形成されり根拠は何もないと結論し
ている。さらにこの結果は、天然の毒素に比較してホル
マリン処理毒素が中和抗体の生産促進能力を著しく喪失
していることを示している。

米国特許第３９８３２２９号は、緩やかな操作条件下で
毒性生成物をグルタルアルデヒドと接触させ、不活化段
階に達した時、速やかに反応を停止させることからなる
ワクチンの製造方法に関する。

イー・コリ神経毒を緩やかな操作条件下でグルタルアル
デヒドと処理し、すなわち、例えば、力価５７マウスＥ
　Ｄ　５０／Ｍｌであるイー・コリ神経毒の水溶液をグ
ルタルアルデヒドの０．０１Ｍ溶液で室温にて処理し、
９０％の毒性不活化レベルに達する前、好ましくは不活
化レベルが５０〜９０％、さらには７０〜９０％に達し
た時、すなわち、５分〜２時間の期間で反応を停止させ
ると、本明細書にいう無毒化毒素なる生成物が得られ、
これは実質的には非毒性であるがなお高い免疫原性を有
し、それ故、若年性（つまり、約１週令）の子ブタに浮
腫に対する免疫を付与するのに有効であることが判明し
、これが本発明の目的とするものである。

グルタルアルデヒドは、抗原と反応して架橋重合反応生
成物を形成することがすでに知られている薬剤でありま
た、不活化反応を停止させる方法を含めてグルタルアル
デヒドによる不活化処理技術も知られている。この方法
には、例えば無機塩（例えば亜硫酸水素ナトリウム）ま
たはアミノ酸（好ましくはリジンまたはグリシン）の如
き反応遮断剤を添加する方法が包含される。

本発明の無毒化イー・コリ神経毒は米国特許第４１３６
１８１号の精製神経毒よりもさらに無害であり、本発明
の無毒化神経毒の調製にあたっては出発物質として該精
製神経毒を用いることができる。

驚くべきことに１本発明の無毒化神経毒の免疫原能力は
、免疫原性でない９０％以上の高い不活化レベルを示す
グルタルアルデヒド処理生成物ときわだって対比される
。

子ブタに浮腫に対する免疫を付与するためには、該無毒
化神経毒を、好ましくは、アジュバントと一緒に、また
もつとも好ましくはチメロサールのような防腐剤を補足
して筋肉内または皮下経路用に処方する。適当なアジュ
バントとしては水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミ
ニウムからなる群のもの、例えばアルヒドロゲル（ＡＩ
ｈｙｄｒｏｇｅＪ、５ｕｐｅｒｆｏｓ　Ｅｘｐｏｒｔ　
Ｃｏ、、　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋ製
造、販売）の水酸化アルミニウムゲル）が挙げられ、ま
た無毒化神経毒／補助剤の割合は、例えば、シンポジウ
ム・シリーズ・イムノバイオロジー・スタンダードＳｙ
ｍｐ、　５ｅｒｉｅｓ、　Ｉｍｎｕｎｏｂｉｏｌ、５ｔ
ａｎｄａｒｄ。

６：１７７〜１８０．１９６７）に示されるように、ア
ジュバントに対する吸収が最大になるように算定するの
が好ましい。

つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、これに限定されるものではない。

例えば、以下の実施例に挙げる神経毒の調製においては
、臨床的感染症例より分離したイー・コＩＪ　Ｏ１３９
血清型菌株を用いているが、神経毒産生体として知られ
るその池いずれのイー・コリ菌株も同じ目的に使用でき
る。

実施例１ 神経毒ｌ製 （ａ１種菌調製 典型的な子ウシ浮腫病より分離し、凍結乾燥状態に保持
したイー・コリ０１３９血清型菌株を滅菌食塩水で復元
させ、トリプトース・ブロス２６２、ディフコ寒天３０
Ｍ）リプドース・ブロスおよびディフコ寒天はＤｉｆｃ
ｏ　Ｌａｂｓ　　により製造販売されている）および全
量を１４とする量の水を混合し、該混合液を１１５°Ｃ
にて４５分間加熱して調製されたトリプトース寒天固体
培地を各々２０肩を含むペトリ皿中で、３７℃にて１８
時間インキュベートする。

ついで、液体培地を以下のように調製する。

プロテオース・ペプトン隘３　（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ
　　により製造販売されている製品）３０ｇ、酵母エキ
ス４ｇおよびデキストロース５ｇを６０°Ｃにて水１１
に溶解する。冷却後、ＮａＣ，ｇ　５　ｆ、Ｎ　ａＨＰ
０４５．０５ｇおよびＫＨ２ＰＯ４１，２ｇを添加する
。該培養液はｐＨ６，９〜７．０であり、す゛イツ・Ｅ
ＫＳフィルターで諷過し、１００＋＋ｒ／の培養フラス
コに分注する。

該培養フラスコにペトリ皿上で得たコロニーを前記液体
培地２０ｍ１に付き１個のコロニー数となるように接種
し、振とう棚（２２〜２４揺れ７分）上で振とうしなが
ら３７°Ｃにて６時間インキュベートする。

（ｂ）イー・コリの生産および神経毒の抽出イー・コリ
含有培養液の６　ｇ／　（すなわち、約６．１０９菌体
）を同様な液体培地３００ｍ１を含有する生産用フラス
コに接層し、該培養液を振とう棚（２２〜２４揺れ７分
）上にて振とうしながら１日インキュベートする。

生産フラスコ５個（１シリーズ）の収集物を集め、各シ
リーズの収集物を２０００Ｇにて２時間遠心分離し、沈
殿物を蒸留水１５０ｍ／に再懸濁させる。

該細胞懸濁液を融水浴中に保持しながら、ブランソン・
ユーロツパ・ソニケータＪ　２２（ＢｒａｎｓｏｎＥｕ
ｒｏｐａ　５ｏｎｉｃａｔｏｒ　ｍｏｄｅｌ　Ｊ　２２
、Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｅｕｒｏｐａ。

Ｎ　、　Ｖ　１Ｓｏｅｓ　ｔ　、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅ
ｒｌａｎｄｓ　）で３０分間超跨波処理する。

菌体を破壊した後、該懸濁液を５°Ｃにて２０００Ｇで
２時間遠心分離させて菌体の破片を除去する。

上清液を０．４５μミリポアフィルタ−（Ｍｉ　ｌ　ｌ
　１ｐｏｒｅはＭｉＮｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎの商標）に通゛し、力価が５７マウ７、　Ｅ　Ｄ　
５　Ｑ　（Ｒｅｅｄ　ａｎｄ　Ｍｕｅｎｃｈ　　終点法
によって測定する）のｒ液１００＋＋＋／を得る。

実施例２ 神経毒の無毒化およびワクチンの製造 前記で得られた神経毒の溶液９００ｒＪを、発熱因子を
含まない蒸留水１００耐中グルタルアルデヒド２５ｇの
溶液４．８１と共に室温にて１時間インキュベートする
。１時間後、発熱因子を含まない蒸留水１０ｓｒ／中Ｌ
−リジン・モノ塩酸塩４８ｇＩＩｇの溶液１１を添加し
て反応を止める。

該不活化毒素に水酸化アルミニウム（アルヒトｏ’ｙ’
ル）ｃ７）２９６減１１溶ｉ４４６ｍｌ、セーレンセン
緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４Ｍ／　１０　　”　２２　％、
ＫＨ２ＰＯ４Ｍ／１０ニアＢ％）４４６ｘｌおよび蒸留
水１０ｗｌ１中チメロサールｌダ溶液１．８　ｘｔｌを
補足する。該混合液を室温にて暗所で４８時間滅菌した
後、遠心分離する。

遠心分離による沈殿物を分離し、上清で希釈して最終容
量を４４６＊Ｚとする。この生成物をガラスバイアルに
分注し、用量屯位（つまり、２５６Ｅ　Ｄ　５０）また
はその倍数量の無毒性神経毒を含むようにする。

ワクチンとして使用するには、該生成物を筋肉内または
皮下経路により投与し、１用量単位は２Ｍ／である。

実施例３ 神経毒不活性レベルと抗原性との関係 グルタルアルデヒドの量および神経毒とグルタルアルデ
ヒドの反応時間を種々変更して実施例２の方法を行なう
と、残余の神経毒の力価（つまり不活化レベル）が異な
った生成物が得られ、各々についてその防御効果をマウ
スでテストする。

このテストでは、種々の生成物の不活化レベルヲエイチ
・シムメルフエニツヒ（ＨｏＳｃｈｉｒｒｍｅｒｐｆｅ
−ｎｎｉｇ、　Ｆｏｒｔｓｈｒ、　Ｖｅｔ、　Ｍｅｄ、
　１３　：　４９〜５０　＠１９７０）が記載している
方法に従い、マウスにおける毒性試験（麻痺および麻痺
による死亡率）によって評価し、その各々のマウスにお
ける防御レベルを、マウス１匹あたり０．４５ＥＤ５０
　　の投享単位量で静脈内投与し、さらに６日後にマウ
ス１匹あたり２．ＢＥＤ５０　の静脈内チャレンジ（Ｃ
ｈａ−Ｎｅｎｇｅ　）投与を行なうことにより評価する
。

結果を第１表に示す。防御効果は約５０〜９０％の毒性
不活化レベルに伴なうことがわかる。

中 味 実施例４ 子ブタにおける免疫反応 実施例２のワクチンの投与単位量（２ｔｌ中２５６ＥＤ
５ｏ）を、７日令の子ブタ７匹ずつからなる３群（Ｉａ
、Ｉｂ・および１群）に皮下または筋肉内のいずれかの
経路によって投与し、ついて同用量の増強投与をＩａ群
には皮下経路により、またＩｂ群には筋肉内経路により
２週間後に、また１群には筋肉内経路によって１週間後
に行なう。

５週令になった時、粗神経毒のチャレンジ接種を、１３
群の子ブタには体Ｍ　Ｉ　Ｋｇ当り２．２ＥＤ５ｏ、Ｈ
ｂおよび１群の子ブタには体重Ｉ　Ｋｇ当り１．ＩＥ　
Ｄ　ｓ　ｏ　　の用量で各子ブタに筋肉内経路により行
なう。

対照群、すなわち５週令の子ブタからなるＩａ対照群お
よびＩ　ｂ／ＩＩ対照群には各々、Ｉａ・Ｉｂおよび１
群ど同量のチャレンジ接種を筋肉内経路によって行なう
。

全ての子ブタの神経症状（運動失調、痙彎、麻痺）およ
び１週間の死亡率を調べる。血液試料をワクチン接種前
および接種後に採取し、ブエロ（Ｖｅｒｏ）細胞におけ
る血清中和テストにより抗神経毒抗体の検出を行なう。

かかる目的のために、血清を５６°Ｃにて３０分間加熱
し、組織培養保存培地中、血清の２倍希釈系列を少なく
とも５０％のブエロ細胞に細胞毒性効果を引き起こす所
定の希釈度の、等容量の標準神経毒の存在下に３７°Ｃ
にて１時間インキュベートする。

２つの該毒素−血清混合物の０．２　ｔｅｌ試料を細胞
中層−トで３７°Ｃにて２４時間インキュベートし、抗
毒素の力価測定の終点を、該標準毒素の細胞毒性効果を
阻止する血清の最大希釈度の逆数として表わす。

各子ブタおよび各群について得られた結果を第２表に示
す。ワクチン接種後、何ら害となる反応はみられなかっ
た。

第２表 子ブタの浮腫病に対する無毒化神経毒の免疫原性 第２表の数値は、非常に若い子ブタに２５６ＥＤ５ｏを
２週間隔で２回注入してワクチン接種を行なった場合、
優れた免疫応答が得られることを示している。

防御効果は、チャレンジした対照動物の１００％致死用
量に対して５７％であり、チャレンジした動物に各々、
１４％の死亡率および７９％の疾病率を起す用量に対し
て８２のである。

第２表からはまた、浮腫病に対する防御効果が対照動物
の場合と著しく異なる血清変換率（５７％）と非常に関
係のあること、および１週間間隔で２回注入するワクチ
ン接種計画はあまり効果のないことがわかる。

実施例５ ５〜８週令の子ブタにおける無毒化神経毒による免疫応
答 実施例２のワクチン調製物の投与単位量およびそれより
少ない用量を、５〜８週令の子ブタからなる２群に皮下
経路により投与し、３週間後に増強を投与する。５〜８
週令の子ブタからなる別の２群を同様な条件下でアルヒ
ドロゲル上に吸着させた神経毒を同じ方法で処理する。

ワクチン接種後の抗神経毒抗体力価を、増強投与１４日
後のブエロ細胞における血清中和によって１ｊｌｌｌ定
する。

ワクチン接種計画および得られた結果を第３表にまとめ
る。これから無毒化神経毒投与後に良好な血清転換レベ
ルがみられることがわかる。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）イー・コリ神経毒をグルタルアルデヒドと反応さ
   せて得られ、不活性化レベルか９０％以下であることを
   特徴とする無毒化され、かつ、免疫原性のイー・コリ神
   経毒。
2. （２）不活性化レベルが５０〜９０％の間にある前記第
   （１〕項の神経毒。
3. （３）イー・コリ神経毒を穏やかな操作条件下でグルタ
   ルアルデヒドと接触させ、該神経毒の９０％か不活化さ
   れる前に反応を停止させることを特Ｗとする無毒化され
   、かつ、免疫原性のイー・コリ神経毒の製法。
4. （４）該神経毒の５０〜９０％が不活化されたときに反
   応を停止させる第（３１項の製法。
5. （５）イー・コリ神経毒とグルタルアルデヒドの反応を
   グルタルアルデヒドの濃度０．０１Ｍにて、室温で５分
   〜１時間行ない、未だ免疫原性を有する無毒化イー・コ
   リ神経毒を得る前記第（３）項または第（４）項の製法
   。
6. （６）イー・コリ神経毒をグルタルアルデヒドと反応さ
   せて得られ、不活性化レベルが９０％以下である無毒化
   され、かつ、免疫原性のイー・コリ神経毒の有効量から
   なることを特徴とする子ブタ浮腫部用ワクチン。
7. （７）水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムか
   らなる群から選ばれるアジュバント上に吸着された、イ
   ー・コリ神経毒をグルタルアルデヒドき反応させて得ら
   れ、不活性化レベルが９０％以下である無毒化され、か
   つ、免疫原性のイー・コリ神経毒の有効量からなること
   を特徴とする子ブタ浮腫部用ワクチン。