JPS58500998A - 腸内毒素生成原であるエシエリキア コリによつて起される下痢症を予防するための新規免疫原組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 名称　腸内毒素生成菌であるエシェリキア　コリによって起される下痢症を予防 するための新規免疫原組成物 技術分野 本発明はエシェリキア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）の腸内毒 素生成原である菌株によって起される急性下痢症の免疫学的予防のために使用さ れ得る新規の免疫原に関する。この新規免疫原は接合剤、典型的には水溶性カル ボジイミド即ち／−エチル−３−（３−ツメチルアミノプロピル）カルボジイミ ドの存在下の接合工程によるエシェリキア　コリの熱安定性腸内肴累（エンテロ トキシン）とエシェリキア　コリの熱不安定性腸内毒素（完全ホロトキシン又は この毒素のＢサブユニット）との交差結合反応によって提供される。かようにし て独自の新規の分子であって該分子中での夫々の毒素の栃性は者しく減弱される がしかも熱不安定性毒素（又はその日サブユニット）はその抗原性を保持してい て熱安定性毒素は該反応の機能として免疫原性を保有している該新規の分子が提 供される。この交差結合免疫原を用いる免疫処理は熱不安定性又は熱安定性の腸 内毒素を単独に又は双万共に産生するＥ、コリの菌株によって誘発さｎる水性分 泌物に対する１乳動物の免役学的防衛を果す。

背景技術 エシェリキア　コリの腸内毒素生成原困株（ＥＴＥＣ）了知］症はひろい見地か らみて保健上の大きな課題である。

これらの微生物及びロタウィルス＜　ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　）は低開発熱帯諸国 に主として起る幼児の年間死亡数約千万の原因をなすと世界保健機構が推定する 児童の急性下痢症のΩつの主因をなすものである〔ブラック等の文献（Ｂｌａｃ ｋ。

Ｒ，Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、　／　９　ｇ　／−ｏＩｎｃｉｄｅｎｃｅ　ａｎｄ　 ５ｅｖｅｒｉｔｙ　ｏｆｒｏｔａｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 　ｃｏｌｉ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｉｎ　ｒｕｒａｌＢａｎｇｌａｄｅｓｈ、　Ｌ ａｎｃｅｔ　／　：　／　’ｌ　／　−／　４’　３〕参照〕。エシェリキア　 コリの腸内毒素生成菌は熱帯地方への旅行者（観光客）である温帯地方住民に起 る急性下痢症の主因をなし、温帯並びに熱帯地方に住む成人に起る特発性下痢症 の通常の原因をなし、又雛乳期の諸動物特に子羊及び子豚に起る屡々致命的な急 性下剤症の原因をなすことがら有畜農業上の大きな問題でもある。

ＥＴＥＣ株による下痢症発生の機構が明かとなった。経口摂取後に「菌は小腸中 心部の粘膜表面に付層する；この過程はプラスミドから誘導された特異的フィン ブリエ抗原がσ語の表面上に存在する句会に増強される。該フィンブリエ抗原は 宿主に特異的であって人体起源の菌株における巣落化因子であるとされている〔 エバンス等の文献（Ｅｖａｎｓ、　Ｄ＋Ｇ、、　ｅｔ　ａｈ　／　９７　ｇ　、 　Ｎｅｗ　５ｕｒｆａｃｅ　−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｈｅａｔ　−１ａｂｉｌ ｅ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒａｎｔｉｇｅｎ　（ＣＦＡ／Ｉｆ ）　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉ ｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ　ｏｆ　ｓｅｒｏｇｒｏｕｐｓ　Ｑ乙ａｎｄ　Ｑ　ｇ　。

Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　、２　／　：　Ｉｓ　３　ｇ＝乙グア蚕照〕。

人体起原のＥＴＥＣｍ体中には多重性で抗原的に異種であるフィンブリエ抗原が 存在しておシ、駅棟の病源性ＥＴＥＣ株の場合には特異的フィンブリエ抗原は検 出さｔてぃなかった〔デュク等の文献及びレビン等の文献（Ｄｅｕｋｅ、　Ｒ， ｅｔａｌ、　／　９　ｇ　／、５ｅｒｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ａｔｔａｃｈｍｅｎ ｔ　ｐｉｌｉ　ｏｆｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 　ｃｏｌｉ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍｈｕｍａｎｓ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉ ｍｍｕｎ、　３．２：　／　２３　’ｌ　−／　２乙θａｎｄ　Ｌｅｖｉｎｅ、 　Ｍ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、　／　９　ｇ　Ｏ。

Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｆａ ｃｔｏｒｓ　ｉｎｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ　ａｎｄ　ｅｎｔｅｒｏｐａ ｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ｔｈａｔ　ｃａｕｓｅ　 ｄｉａｒｒｈｅａ、　Ｊ、　１ｎｆｅｃ、　Ｄｉｓ、　／　’ｌ　／　ニア　３ ３−７３７）参照〕。該菌はこの環境下に増殖してシラスミドから誘導された。

２種類のエンテロトキシン（腸内毒素）即ち熱不安定性（ＬＴ）のトキシン及び 熱安定性（ＳＴ）のトキシンを夫々単独に又は−緒に生成する。

ＬＴ）キシンのホロトキシン（完全トキシン）は最近純粋型で単離され特性化さ ｎた〔クレメンッ等の文献（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ、　Ｊ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｔ、 　／　９７９．　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏ ｘｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｆｒｏ ｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　 Ｉｍｍｕｎ、　２　’ｌ　ニア乙０−７６９）参照〕。このものは５個の８サブ ユニツト（小単位）（夫々のＭＷ／、２．ｏｏｏダルトン）及び／イ固のＡサブ ユニツ）　（ＭＷ３／、３００ダルトン）をＩｊｆることがギル等（Ｇ１１ｌ、 　Ｄ、Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、　／　９　ｇ　／。

〜乙ｇ、２．）　によって報せら几た。ＨＢサブユニット（複数）は腸粘腰表面 上の特異四ＧＭｌガシグ１７オシド受容体に対してトキシンを付着させ、それに よってＡサブユニットを細胞へ透過さ−せる作用をなす。ＭＡサシユニットは細 胞内のアデニレートサイクラーゼを刺激し、該アデニレートサイクラーゼは流体 と電解質類とを腸管腔中へ分泌させる作用を果す。Ｅ、コリのＬＴ）キシンは作 用上、構造上及び免役掌上ビブリオ　コレラ（Ｖｉｂｒｉ。

ｃｈｏｌｅｒａｅ）が産生する毒素（コレラトキシン）と類似することに注目す べきである。ＬＴ）キシンとコレラトキシン（ＣＴ）とは共に同型同数の、はと んど同じ分子量のサブユニット（複数）を有し：該すブユニットは同じ作用を行 い、該ＬＴ）キシン及びＣＴ）キシンはそれらのＡサブユニット及びＢサブユニ ットの双方において共通の明確な抗原決定基を有する〔ホルムグレンの文献及び クレメンツ等の文献（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ、　Ｊ、、　／　９　ｇ　／。

Ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｈｏｌｅｒａ　ｔｏｘｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｅ ｖｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｈｏｌｅｒａ、　Ｎａｔ ｕｒｅ　２９２　’：　’Ｉ　／　３−’ｌ　／　７ａｎｄ　Ｃｌｅｍｅｎｔｓ 、　Ｊ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、　／　９７　ｇ、　５ｈａｒｅｄ　ａｎｄｕｎｉｑ ｕｅ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｅｎｔ ｅｒｏｔｏｘｉｎｓｆｒｏｍ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ　ａｎｄ　Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｔ　ｉ　、＼１ｎｆｅｃ。

Ｉｍｍｕｎ、　、２２　：り０９−７　／　３）参照〕。更にＬＴ）キシン又は コレラトキシンを用いるラットの免疫処理はＬＴトキシンによる攻撃に対する予 防を達成する〔ピアスの文献及びクリブシュタインらの文ｙ　（Ｐｉｅｒｃｅ、 　Ｎ、Ｆ。

／、９７７．　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　 ｗｉｔｈＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ　ｅｎｔ ｅｒｏｔｏｘｉｎ　ｂｙｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ 　ｃｈｏｌｅｒａ　ｔｏｘｉｎ−ｔｏｘｏｉｄ。

Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　／　ｇ　：　３３　ｇ　−３’ｌ　／　、　ａ ｎｄＫｌｉｐｓｔｅｉｎ、　Ｆ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　／　９　ｇ　／、　Ｐｒ ｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｆｆｅｃｔｏｆ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａ ｔｓ　ｗｉｔｈ　ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ　ｏｒ　Ｂｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ 、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、３　／　：　／　’Ｉ　’Ｉ　−／　５０　 ）参照〕。

人体起源の菌株から得られたＥ、コリの熱安定性トキシン（ＳＴ）が純粋型にお いて最近特性化されたことはステイゾル等の文献（５ｔａｐｌｅｓ、　Ｓ、Ｊ、 、　ｅｔ　ａｌ、、　／　９　ｇ　００Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃ ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅｅｎｔｅｒｏ ｔｏｘｉｎ　ｐ’ｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙａ　５ｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｅ、ｃｏｌ　 ｉｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆｏｒ　ｍａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、 １３５　：　＋１７／Ａ−ダ７２））によシ報ぜられた通シである。ＳＴ）キシ ンは約２，０００ダルトンの分子量を有する。このトキシンが粘膜細胞表面にい かにして付着するかは不確実でりるｉれども細胞内に入シ込んだ場合には細胞内 の″グアニレート、サイクラーゼを刺激して流体分泌及び電解質分泌を起させる 。人体起源のＥＴＥＣ株の約２０係はＬＴ）キシンのみ（ＬＴ”／ＳＴ　）を、 約６０係はＬＴ及びＳＴ）キシ／ノ双方（ＬＴ”／ＳＴ”）　を、ソシテ約、２ ０％　、ｉｄ　Ｓ　Ｔトキシンのみ（ＬＴ　：／ＳＴ＋）Ｙ産生する；こｎらの 諸型のトキシンの夫々は急性下痢症乞起し得る。

Ｅ、コリのＥＴＥＣ株のｉに対する汚染にもとづく下痢による広範囲の罹病率と 死亡率との５太に対する防止への最も実用的なアプローチは予防接種の方策によ るものであった。３種の異る型のＥ、ユリ抗原が免疫原として有効であることが 判っており、こｎらの免疫原はモデル実験においてＥＴＥＣ株の攻撃からの防衛 を果す。

（１）菌体抗原（通常は死菌の全菌体の形）を用いる免疫処理−は小腸内での菌 生育を減することによシ下痢を防止する：但しこの防止効果は相同性の菌体の血 清型のＥ。

コリに及ぶのみであって非相同性の血清型のＥ、コリには及ばず、こｎらのうち の／乙ｌｌ体は抗原的に不同の菌体細胞の血清型のＥ、コリであることがみとめ られている〔グイの文献（Ｇａｙ、　Ｃ，Ｃ，、／　９７　／、　Ｐｒｏｂｌｅ ｍｓ　ｏｆｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、　Ａｎｎ−Ｎ、Ｙ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　／　７乙：３３６−３’１９）参照〕。

（１１）　腸柘膜表面上に接着して集落を形成することを防止するだめの特異的 フィンブリエ抗原を用いる免疫処理も又下痢防止を果すが但しこの防止効果は抗 原量に異るフィンブリエ抗原をもつＥＴＥＣ株にまでは及ばないし〔モルガン等 の文献（Ｍｏｒｇａｎ、　Ｒ，Ｌ−、ｅｔ　ａｔ、、　／ソ７ｇ。

１ｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｃｋｌｉｎｇ　ｐｉｇｓ　ａｇａｉｎｓ ｔｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ−ｉｎ ｄｕｃｅｄｄｉａｒｒｈｅａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｂｙ　ｖａｃｃｉｎａｔｉｎ ｇ　ｄａｍｓ　ｗｉｔｈｐｕｒｉｆｉｅ６９　ｇ　７ｐ　ｏｒ　Ｋ９９　ｐｉｌ ｉ　：　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｐｉｌｕｓ　 ｈｏｍｏｌｏｑｙ　ｏｆ　ｖａｃｃｉｎｅ　ａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅ、Ｉｎｆ ｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　、！２　：　７７　／　−７７７）参照〕また動物及び 人のＥＴＥＣ株の中に多重性の抗原的に不同のフィンブリエ抗原の存在が検出さ れている（上寿文献参照）。

（曲　Ｅ、コリのＬＴホロトキシンか又はその日すツユニットを用いる免疫処理 は抗毒素応答を起し、この抗毒素応答はトキシン自体による活性ある攻撃に対し 、及びＬＴトキシン（ＬＴ　／ＳＴ　）並びにＬＴ及びＳＴトキシン（複数）（ ＬＴ＋／ＳＴ”）を生成する生きている菌株に対し、防衛を果す〔クリブシュタ イン等の文献（に１ｉｐｓｔｅｉｎＦ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　／ワ７９　、Ｐ ｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆａｃｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉ ｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ｈｅａ ｔ−ｌａｂｉｌｅ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　ｉｎ　ｒａｔｓ、　Ｉｎｆｅｃｔ 。

Ｉｍｍｕｎ、　２３　：　５９２−５９９　ａｎｄ　Ｋ１１ｐｓｔｅｉｎ、　Ｆ 、Ａ、　ｅｔａｌ、／　９　ｇ　／　、　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ 　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｉンａｔｉｏｎｏｆ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈｏｌ ｏｔｏｘｉｎ　ｏｆ　Ｂ　５ｕｂｕｎｉｔ　ｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ ｌｉ　ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、　３　／　：　／　’ｌ　’Ｉ　−／　５０　）参照〕。種々の血 清型菌体抗原によって生成されるＬＴ）キシンは抗原的に均質であるのでこのト キシンを用いる免疫処理は該血清型菌体抗原又はフィンブリエ抗原であるにもか かわらすすベてのＬＴトキンン住成菌株に対して防衛する〔クリブシュタイン等 の文献（Ｋ１１ｐｓｔｅｉｎ、　Ｆ−Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、　／９ｇ／。

Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　、ｏｆ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ｈｅａｔ−１ａｂｉ ｌｅ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｐｒｏｖｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍ　ｐｒｏｔｅ ｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｓｅｒｏｔｙｐｅｓ　 ｏｆ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉ’ｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ Ｉｎｆｅｃｔ、　１ｍｍｕｎ、３．２　：　／　／　００−　／　／　０グ）参 照〕。

但しＬＴ）キシン又けそのＢサブユニットを用いる免疫処理はＳＴ）キシンのみ （、ＬＴ−／ＳＴ＋）を産生ずるＥＴＥＣ株に対して防衛することはない〔クリ ブシュタイン等の上寿文献（Ｋ１１ｐｓｔｅｉｎ、　Ｆ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、 、　／９７９．）参照〕。

低分子量のＳＴ）キシンは非抗原性である；けれども最近になって牛、豚及び人 のＥＴＥＣ株からの純化されたＳＴの調製法が記載され、いくつかの研光にょ９ ３丁トキシンがハプテン性であることが判った。大分子量の担体例、えば牛血清 アルブミン又は牛の免疫グロブリンＧと複合された純化ＳＴを用いてしサギ又は 山羊を免疫させるとＳＴ）キシンに対する抗拗累を産生することが示され、これ は幼獣マウス試験におけるＳＴ活性を中和する抗血清の該申和罷によって証明さ れた〔フランツ寺の文献及びギアネラ等の文献（Ｆｒａｎｔｚ、、　Ｊ、Ｃ，、 ｅｔ　ａｌ、。

／　９　ｇ　／、１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ　ｅｎｔｅｒｏｔｏ ｘｉｎｓ：　ｄｅｖｅｊｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓ ａｙ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ　ｅｎｔｅｒｏ−ｔ ｏｘｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｓｕｃｋｌｉｎｇ　ｒｍｕｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｉ ｎｆｅｃｔ。

１ｍｍｕｎ、　３３　：　／　９３−　／　９　ｇ、　ａｎｄ　Ｇｉａｎｎｅｌ ｌａ、　Ｒ，Ａ、。

ｅｔ　ａｔ、、／　９　ｇ　／、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｈｅａ ｔ−ｓｔａｂｌｅ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ：　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔ ｈ　ｔｈｅ　５ｕｃｋｌ　ｉｎｇｍｏｕｓｅ　ｂｉｏａｓｓａｙ、Ｉｎｆｅｃｔ 、　１ｍｍｕｎ、　、：ｊ　３　：　／　ｇ乙−／９２）参照〕。更に豚の免疫 グロブリンに複合された半純化のＳＴ調製吻を用いるラットの免疫処理はＳＴ） キシン又は１このＳＴトキンンを産生ずる生活菌株”を用いる活性ある攻撃に対 して防衛を果すが但しＬＴ）キシン又はＬＴ＆生性の生活菌株に対して防衛を果 し得ないことを示した〔クリブシュタイン等の文献（に１ｉｐｓｔｅｉｎ、　Ｆ 、Ａ、、　ｅｔ　ａｔ、、　／　９　ｇ　２．　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　１ｎｒ ａｔｓ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　 ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　１ｍｍｕ ｎ、　３　’ｌ　：乙３７−乙３９）参照〕。

上記のトキシンの諸型はＥ、コリのＥＴＥＣ株に対する免疫処理用のワクチンと して使用され／ｇｆない。ＬＴボロトキシン自体（又はコレラトキシン）は人の 免役処理のための実用的凭投原ではない。こｎＶこはいくつかの理由かめる。即 ち第一にその免疫原の型はこｆを人に投与した離合に有性ン保持しているのでそ の稍呆許容さｎ４ない副作用（非′経口投与のときの筋肉及び皮Ｎの炎症並びに 縦口投与のと−の下痢）を起す。第二にはＬＴホロトキシン又はその日サブユニ ットは上記のＥＴＥＣ株（ＳＴ）キシンを産生する）に対して何ら防衛を果さな い〔クリブシュタイン等の文献（にｌ１ｐｓｔｅｉｎ、　Ｆ、Ａ、。

ｅｔ　ａｌ、　／　ｑ　７９．　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　 ａｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉ ｎｓ　ｉｎ　ｒａｔｓ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　１ｍｍｕｎ、　２３　：！；９２− ３９９）参照〕。該ＳＴトキシンも又急性下痢症の通常の要因をなす。ＳＴトキ シンは有毒であるから実用的でない；それ−は非抗原性であってそれを免疫原と なすために必要な大分子量の動物性タンパク質担体は人体への使用のために安全 ではない；そして該ＳＴ）キシンを用いる免疫処理はＬＴ）キシンを産生するＥ ＴＥＣ株に対して防衛を果し侍すい。

従ってここに必要とされるワクチンは下記の諸条件を具える新規の抗原から成る ワクチンである：即ち該抗原は（ａ）　Ｌ　Ｔか又はＳＴを産生するＥＴＥＣ株 に対し完投学的防衛を果し、（ｂｌ該仇原においてＳＴトキシンは免疫原を与え 、（Ｃ１この抗原を用いる免疫処理が悪い鉤作用を起さないように該抗原の毎性 は充分に語釈されるものでめシ、そして（ｄ）該抗原はＢサブユニット（単独で 又はＬＴホロトキシンの一部として）乞包含し、該Ｂサブユニットは腸粘膜表面 上の特異的受容個所への接層能にもとづき経口投与による免疫処理を増強して粘 膜＃胞が長期にわたって免疫原に対し曝露されるようにするものである。

発明の開示 従って本発明の目的ｉ、４ＬＴ又はＳＴＹ夫々単独に又は共に産生するＥ、コリ の腸内毒素生成原の菌体によって起る急性下痢症に対する哺乳ｆＩＤＪ物の免段 学的防衛を果丁ために有効であってしかも熱釜性である新規組成物の提供にある 。

本発明の他の１旧はＥＴＥＣにより誘発さｎる急性下痢症の予防のための新規の ワクチンの提供にある。

本発明の他の目的はＬＴ又はＳＴを産生するＥＴＥＣ株に対して防衛するワクチ ンの提供にある。

本発明のその他の目的はＳＴ及びＬＴ（又はその日サブユニット）を組合せた組 成物であって該組成物においてＳＴ及びＬＴの夫々のトキシンの毒性が減ぜられ ており、夫々の抗原性は保持さｎており、そして特異的粘膜受容体に対するＢサ ブユニットの接着能が維持されぞいる該組成物の提供にある。

本発明に従えばエシェリキア　コリの熱不安定性（ＬＴ）腸内毒素（ホロトキシ ンが又はその日サブユニットの形における）或はコレラトキシン（ホロトキシン か又はその日サブユニットの形における）と熱安定性（ＳＴ）腸内毒素とを退官 の接合剤の存在下に反応させる工程による生成物が提供される。単一の理論に支 持されてはいないけｎども上記の工程による生成物１＝ＬＴ分子又はＣ７分子及 びＳＴ分子の夫々に存在するカルボキシル基とアミノ基とを介して父差結合した 分子であって、更にＬＴ又はＣ７分子の鎖円粕合を含む分子である。従って本明 細曹の記載においてＬＴ又はＣＴホロトキシンから成る群から選ばれた反応体と ＳＴとの反応の工程による住放物は又差結合５Ｔ−ＬＴ又は５Ｔ−ＣＴと杯さｎ 、ＳＴとＢサブユニットとの反応による生成物は交差結付５Ｔ−１３と称さｎる 。

上記の交差結合分子（複数）は予防接種の方法において有効であって、該予防接 種の方法において本発明の組成１勿は本明細書中に参照されているクリブシュタ イン等の文献（Ｋｌ　１ｐｓｔｅｉ−ｎ、　Ｆ、Ａ−、ｅｔ　ａｌ、　／　９　 ｇ　／。

Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ 　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈｔｈｅ　ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ　ｏｒ　Ｂ　５ｕｂｕｎｉｔ 　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉｈｅａｔ−１ａｂｉｌｅ　ｅｎｔｅ ｒｏｔｏｘｉｎ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　３　／　：１ｑｔｙ−−ｉ ｓｏ）に報告されているような典型的な予防接種操作による一次免疫処理及びブ ースター免疫処理（ｂｏｏｓｔｅｒ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ、大量抗体産生 のための免疫処理）の双方のための適宜の助剤（アジュバント）の使用下に投与 さ扛る。本発明の組成物は人を含む踊乳動吻に対して有効である。

図面の簡単な説明 添付図面の第１図は各種の免疫原の抗原性の比較に用いられた酵素結合の免疫吸 着試験（ＥＬＩＳＡ）の方法と得られたデータとの図示であって交差結合ＬＴ− ３Ｔ調製物のＬＴ抗原性とＬＴ単独の抗原性との比較を示す。

第２図は未免疫化ラットにおける純化ＬＴ及びＳＴに対する分泌応答を測定して 得られたデータの図示である。

第３図は１００／／の分子比の半純化ＳＴ／ＬＴからのＳＴ交差結合度に関する ＥＤＡＣ対全毒累タンノクク質の比の効果の図１示であって反応時１間（ｒＪ、 ／ｇ待時間最終的に得ら肛だ接合物（交差結合吻）の中に存在するＳＴの値を百 分率で示す。

第７図は放射性ヨウ素標識ＳＴによる追跡物質投与で測定さｎた最ｆ：交差結合 物の中に存在するＳＴ（百分率）に関する純化ＳＴ対しＴ又は純化ＳＴ対日サブ ユニットの初期分子比の効果の図示であシ、ＥＤＡＣ／全タンパク質の比はｌ１ ３／／であって反応時間は／ｇ待時間あった。

第５図はＥＤＡＣ／全覆素タン・やり質比１０／／、ＳＴ／ＬＴ分子比１００／ ／を用いた場合の半純化ＳＴの交差結合度に関する交差結合反応時間の効果の図 示であって抗原性の値は１００係の毒素に対応するように調整された訂正済みの 試料からみちびかれた。

発明を実施するための最良の形態 ５丁及びＬＴ又はＣＴ（又はその日サブユニット）の毒素（複数）を用いるワク チンの使用法はその発展のために夫々の毒素がその生物学的活性を戯じても適切 な免疫応答を刺１ｇするために元号な免疫原性を保有し続けることを必要とした 。この方式の中へ不適切な抗原を担体として導入することなく、１丁及びＣＴ（ 又はそれらのＢサシユニット）をＳＴの免疫学的担体として選択したのでめる。

ＳＴは異る１０種のアミノ酸から５ｙ、Ｄ　、全部で７ｇ個のアミノ酸残基な有 し、その３分のｌは半シスチン（ｈａｌｆ−ｃｙｓｔｉｎ　）である。各分子ハ ／仙の担体に対して交差結合するために用いられる３個のアミノ基（２個のアス ・々ラギン残基、そのうちのｌ制はＮＨ２−末端のアミノ酸）及び交差結合のた めに用いられる７個のカルボキシル基（７個のグルタミン酸残基）を石する。Ｌ Ｔは３０６個のアミノ酸残基（構造式Ａ□Ｂ５と推定されるから族シフ３３個の 交差結合可能のアミン基（大部分はリジン及びアルギニン中のイプシロンアミノ 基）と／４９個のカルボキシル基（アスパラギン酸及びグルタミン酸として存在 する）とを有する。本発明はその基本的概念として交差結合可能カルがキシル基 と２個の分子上のアミン基（複数）とを介する交差結合ＳＴ及びＬＴ又はＣＴ（ 或はそれらの８サブユニツト）並びに毒性減弱化の手段としてのし１分子又はＣ Ｔ分子の領内結合を包含する。

接合された抗原の製造における交差結合用の接合剤としては水溶性カルボジイミ ドが汎用されている。最有用の水溶性カルボッイミドは／−エチル−３−（３− ツメチルアミノゾロビル）カルボッイミド（ＥＤＡＣ）及び／−シクロベキ／ル ー３−Ｃ２−モルホリニル−ル〕カルがジイミド（　ＭＣＤ　ｌ　）である。交 差結合ＳＴ−ＬＴ，ＳＴ−ＣＴ又はＳＴ−８の製造のための本発明の工程に適切 ないかなる接合剤をも使用し得る。上記の水溶性カルボジイミド（複数）が現在 のところ好適である。

下記の諸例と本発明の説明とにお（・て多数の文献が弓１用される。これらの文 献は本発明の記述の短縮化のために引用されるものである。

且 細形のＬＴホロトキシンはクレメンツ等の方法［　Ｃ’ｌｅｍｅｎｔｓ，Ｊ．　 Ｄ．　、ｅｔ　ａｌ．、　／　９　７　９．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄｃｈ ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｏｍｏｇｅｎ’ｅｏｕｓ　ｈｅａｔ− Ｉａｂｉｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｓｐｅｃｉｆｉ ｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｆｒｏｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｃｕｌｔ ｕｒｅｓ．　ｌｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　２　’ｌ　ニア乙０ー７乙？、ｆ ｒｏｍ　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｓｔｒａｉｎ　７　／　／　（ＦＩＬＴ）。

ａ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　Ｋ−　／　、ｌ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　ｂｅａ ｒｉｎｇ　ＬＴ　ｇｅｎｅ（ｓ）ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｆｒ ｏｍ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｓｔｒａｉｎ　Ｐ　３　０　７　。

ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　ｂｙ　Ｓｏ，　Ｍ．、　ｅｔ　ａｔ．　／　９　７　ｇ　 。

Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ ｏｌｉ　ｐｌａｓｍｉｄｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ 　ｈｅａｔ−１ａｂｉｌｅ　ｔｏｘｉｎ：′Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎ ｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｘｉｎ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ。

Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．、２／　：’１０３−’ＩＩ／）によって製造さ れた。該トキシン調製物の均質性はポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって 確認された；その生物学的活性は組織培養法でのＹ−／腎細胞の活性化能の発現 （ＬＴ活性の標準的試験法）によシ証明され、その抗原均質性は山羊の単内子Ｌ Ｔの高度免疫血清を用いる均質な単帯反応（　ｓｉｎｇｌｅ　ｂａｎｄ　ｒｅａ ｃｔｉｏｎ　）における免疫拡散の発現によシ確認された。ＢサブユニットのＬ Ｔホロトキシンカラの分別はクルメンツ等のクロマトグラフィによる方法（　Ｃ ｌｅｍｅｎｔｓ，　Ｊ．Ｄ．、　ｅｔ　ａｔ．　／ヲｇｏ。

Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｈｅａｔ−１ａｂｉｌ ｅ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｆｒｏｍ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｉ ｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、２　ワ　：　ｑ　／−９７）に従った。

ＳＴ）キシンは人体起源のＬ　Ｔ、、’Ｓ　Ｔ＋株であるＥ、コリ菌株／ｇＤ　 （０’１２：Ｃ３７）及びテキサス（Ｔｅｘａｓ）ｌ１３．２（０７ｇ　：Ｈ／ 、２）から産生されたものであってステイゾル等の方法（５ｔａｐｌｅｓ、　Ｓ 、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　／９ｇ０゜Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈ ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅｅｎｔｅｒｏｔ ｏｘｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａ　５ｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｅ、ｃｏｌｉｐ ａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆｏｒ　ｍａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、　２ ３３　ニゲ７／乙−１ｌ−７２／）によって細形にされた。この方法は下記の諸 工程から成る＝（１）培養Ｆ液→（２）アムベルライト（Ａｍｂｅｒｌ　ｉｔｅ 　）　Ｘ　Ａ　Ｄ　−，２によるクロマトグラフィ→（３）アセトンによる沈澱 化→（４）第１回セファデクス（５ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５によるクロマ トグラフ　（−＋（５）［）ＥＡＥセファクリル（５ｅｐｈａｃｒｙｌ　）によ るりＣ１７トグラフイ→（６）第ユ回セファデクスＧ−，２５によるクロマトグ ラフィ→（７）薄層クロマトグラフィ。夫々の製造工程から得られた諸試製品の 活性をギアネラの方法（Ｇｉａｎｎｅｌ　ｌ　ａ。

Ｒ，Ａ、、　／　９７乙、Ｓｕｃｋｌｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ 　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ　ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 　ｃｏｌｉ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ。

Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ 、　１ｍｍｕｎ＋／　４１：ｑＳ−ヲ９）の通シ幼獣マウス試験によシ測定した 。

測定値を幼獣マウス単位即ち腸内／胴体内の重量比≧０．０ｇ３を与える青紫重 量として定義さｎる単位で表′わす。児全に純粋なＳＴ（工程７によシ得られる ）は／μり当シ２Ｓθマウス単位を含有していた；このＳＴをウサギ及び山羊の 行異的筒度免反抗血清の調製のため及び放射性ヨードを用いる研究のために使用 した。半純化ＳＴ（工程夕の後に得られる）は／μｙ当シ／ｇ５マウス単位を含 ■していた；これを接合（交差結合）研究及び免疫処理研究に使用した。

トキシン調製物及びその接合物の濃度をロウソイ法（Ｌｏｗｒｙ、　Ｏ，Ｈ，、 ｅｔ　ａｌ、　／　９３　／、Ｐｒｏｔｅｉｎｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｗｉｔ ｈ　ｔｈｅ　Ｆｏｌｉｎ　ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔ、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　／ワ３：、２乙５−、２’７５）によるタンｔＰり′ 質含有量で表す。トキシンに関するモル幽量はＬＴホロトキシンについては９／ 、’ｌ！；０ダルトン、Ｂサブユニットについては５７．４１００ダルトン及び ５丁トキシンについては２，０００ダルトンの既知文献記載の数値に′もとうカ ルボジイミド反応を用いて１丁トキシンとＳＴ）キシンとを又差結合させたが該 反応の使用は・ぐラミングルによシ一般的に述べられている（　Ｂａｕｍｉｎｇ ｅｒ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ。

／　９　ｇ　Ｏ，Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｄ口ｍ１ｄｅｓ　ｉｎ　ｔ ｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ’ｏｆ　ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ　ｃｏｎｊｕｇａｔ ｅｓ、　ｐ、　／　ｋ　／　−１５ワ、Ｉｎ　Ｓ、Ｐ、　Ｃｏｌｏｗｉｃｋ　ａ ｎｄ　Ｎ、Ｏ，Ｋａｐｌａｎ　（ｅｄ、）。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｑｙ、　ＡｃａｄｅｍｉＣＰｒｅｓｓ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。

特に記載しない限シを合剤はｌ−エチル−３−（３−ツメチルアミノゾロピル） カルボジイミド（ＥＤＡＣ）であつた。交差結合された５Ｔ−ＬＴ組Ｆｉ、物に ／−シクロへキシル−３−〔２−モルホリニル−＋１１１−エチル〕カルボジイ ミド（ＭＣ，ＤＩ）の使用の地方法によっても製造され得るがこ扛は特にＥＤＡ Ｃの使用によらなくても他の諸方ことを示すものである。各糧組成→勿の評価の だめの交差結合操作の詳細及び−交差結合における変数〔例えばトキシン（複数 ）の比、接合順序、ＥＤＡＣ使用量、ｐＨ１温度及び反応時間〕を下文に示す。

夫々の場合において接合反応完了の後に寮合すを分子量／２．０００の除去袋（ ｃｕｔｏｆｆ　、ｂａｇ）即ち接合物を保持するが未接合ＳＴ又は接合剤（即ち ＥＤＡＣ）を保持しない除去袋の使用下に水に対し徹底的に透析した。最終的に 得られた接合葡中のＳＴ存在童はＬＴ又はＢサブユニットを添加した当初のタン パク質量を越えるタンパク質増量によって示された。

トキシン及び交差結合ＬＴ−３Ｔの毒性及び抗原性に関する試験 交差結合５Ｔ−ＬＴ組厄吻の夫々についてＳＴ及びＬＴの毒性並びに抗原性に関 して試験した結果と未接合のトキシンによって得られた同様の試験の結果とを比 較した。その成績を未接合トキシンに比する交差結合組成物の希釈倍数の変化△ で示すか又は百分率減少で示す。

（ａ）ＬＴの播性はサック等の記載の方法（５ａｃｋ、　Ｄ、Ａ。

ｅｔ　ａｌ、　／　９７３．　Ｔｅ５ｔ　ｆｏｒ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎ ｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｕｓｉｎｇ　Ｙ　−／　ａｄｒｅｎａ ｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｍｉｎｉｃｕｌｔｕｒｅ−Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、 　／　／　：　３３　’ｌ　−３３６）を用いるＹ−／腎細胞組織培養による組 織培養中の被検試料の１−次的なコ倍希釈の試験により測定さｎた。該測定はア デニレートサイクラーゼを刺激するトキシンの能力を測定するものであるから従 って腸粘膜が水及び電解質を分泌するようにさぜる訴導能を測定するものである 。

（ｂ）ＬＴの抗原性はクリブシュタイン等の文献（Ｋｌｉｐｓｔｅｉｎ、　Ｆ、 Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　／　ｑ　ｇ　／、　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈｏｌ ｏｔｏｘｉｎ　ｏｒ　Ｂｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ ｌｉ　ｈｅａｔ−１ａｂｉｌｅ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ、　′Ｉｎｆｅｃｔ、 　Ｉｍｍｕｎ、　３　／　：　／　’ｌ　’ｌ　−／　３０　）記載の方法を用 いる酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）により試験された。基質としてのｐ− ニトロフェニルホスフェートを用いると九にアルカリホスファターゼに接合させ たウサギ抗血清を山羊に対して用いることにより山羊の高度免疫血清対純化ＬＴ （力価／　：　１０２，０００）に関して被検試料の順次２倍希釈拗を直接に試 験した。接合吻対禾接会ＬＴの活性比は乙００の元学苦度即ちＯＤを与える投与 量例えば第７図に例示の投与ｔからみちびかｎｌこの場合に交差結合Ｌ　Ｔ−Ｓ Ｔの抗原性は／、グ倍減じた。

（ｃ）ＳＴの視性は前掲文献（Ｇｉｎｎｅｌｌａ、　Ｒ，Ａ、　／　９７乙）記 載の幼獣マウス試験によシ測定された。この測定値は未希釈のＳＴのマウス単位 に比する交差結合抗原のマウス単位の減少値として記載さｎる。

（ｄ）ＳＴの抗原性は６ダブルサンドインチ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓａｎｄｗｉｃｈ 　）　”　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａによシ評価さねだが該法において仮構試料のコ倍 順次希釈物を、２種の異る高度免疫血清対ＳＴ（これらは山羊及びウサギ対ＳＴ に生成されたものである）の中間に存在させた；これらの抗血清対ＳＴ）キシン の抗体力価は／　：　／３／、０００であった。ＬＴ抗原性に関する記載の方法 と同様の方法で接合物の抗原性の値をＳＴと比較した。

ラットの免疫処理及び攻撃 ラットを免疫処理してからクリゾシュタイン等の詳細記載の操作法（Ｋ１１ｐｓ ｔｅｉｎ、　Ｆ、Ａ、　ｅｔ　ａｔ、　／　９　ｇ　／。

Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ 　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈｔｈｅ　ｈｏ）ｌｏｔｏｘｉｎ　ｏｒ　Ｂ　５ｕｂｕｎｉ ｔ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉｈｅａｔ−ｌａｂｉｌ’ｅ　ｅｎ ｔｅｒｏｔｏｘｉｎ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　１ｍｍｕｎ、　３　／　：　／’ｌ’ １−／汐０）を用いて攻撃した。−人免疫処理のために完全フロインドアジュバ ントを腹腔内に用い非経口的に免疫処理した。胃の酸性の除去のためにシメチジ ン［ｃｉｍｅｔｉｄｉ’ｎｅ；商標名タガメソト（Ｔａｇａｍｅｔ　）の下にス ミス、クリン及び７１／７チ社（ｈｉｔｈ、Ｋｌ　ｉｎｅ　＆　ＦｒｅｎｃｈＣ ｏ、・、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　Ｐａ、）から販売されティる〕を経口 投与してからコ時間後に胃内管を介してブースター免疫処理を施した。

免疫処理されたラットを攻撃するためにＬＴ）キシン及びＳＴトキシンを用いる と共にＬＴのみ（ＬＴ＋／ＳＴ）を産生ずるＥ、コリの生活菌ＰＢ２ｊｆｉｇ株 、ＬＴと５Ｔ（ＬＴ　／ＳＴ　）を産生ずるＨ１Ｑダ０７株、及びＳＴのみ（Ｌ Ｔ−／ＳＴ　）を産生ずるテギサスグ３２株を用いた未免疫処理動物に最高分泌 量を産生させる量で被検試料の夫々を投与した。夫々のデータは３頭の動物の試 験によって得られた。試験結果は同様な攻撃を受けた未免疫処理動物について得 られた値と対比する免疫処理動物における分泌減少百分率の平均値上平均標準誤 差［ＳＥＭ）として示される。免疫処理動物におけるＳＯ係以上の分泌減少は免 疫処理ラットにおける分泌量と未免疫処理対照ラットにおける分泌量との間の統 計学的に有意（ｐ＜０．００／）な差を表す。

最初の諸研究（これについてのデータは原特許出願明細書の第２表にまとめられ ている）はＥＤＡＣ対全トキシンタンパク質の重重比が４を左／／の場合にＳＴ とＬＴとの有意の交差結合を与えると共に減少されたＬＴｉ性Ｃ＞１００θ倍） 及びＳＴ毒性（＞１００倍）を与え、しかも強度の抗原性を保持すること、ただ しＥＤＡＣ／トキシンの比率がｏ、１１ｔｓ／ｉの場合にはこの成績が達成され ないことを示した。

交差結合度の極大値を与えるのに必要なＥＤＡＣ対トキシトキシン比率なＮ’ｔ Ｈに決定するためにＳＴ／ＬＴの最初の分子比１００／／をＥＤＡＣ対トキシン タンパク質の比（これを２／／〜２００／／に変化させる）と対応して反応させ た。この反応をｐＨ７，０，２０℃の下に反応時間として／ｇ待時間要して行っ た。これらの諸結果を第３図に示すがこれはこれらの諸条件下で、ＥＤＡＣ／） キシンの比がおよそ’ｌ　！；／／のところでＳＴ対しＴの最ＥＤＡＣの１ｏｏ ｖｕ２及び反応時間１時間を用いる接合条件下でＳＴ／ＬＴ比（重量基準）を増 すと最終接合物中のＳＴの比率は増大した。得られたデータを第１表に示す。

これらの諸観察の確認のためにハンター（Ｈｕｎｔｅｒ、　Ｒ。

／９７θ、５ｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｌｏｒａｍｉ ｎｅ−Ｔｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１ｏｄｉｎａｔｉｏｎ、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

Ｍｅｄ、）のクロラミンＴ法に従い純化ＳＴを無担体の１１２５で標識した。Ｓ Ｔ／ＬＴ又はＳ”１７Ｂのモル比を／／／〜コθθ／／に変えなからＳＴ　の標 識投与量を用いＥＤＡＣ／）キシンタンｉ４り質の比４．５　／　／の条件下で グ℃に／ｇ時間接合反応を行った。これらの結果を第７図に示す。

交差結合５Ｔ−ＬＴ：初期のＳＴ／ＬＴ比を順次に高めるともとの混合物へ加え られて接合物中に保持されていたＳＴの百分率は直線的に増し、その結果最終接 合物のＳＴ比率を順次に増す。初期のＳ　Ｔ／Ｌ　Ｔモル比の１００／ｌを用い ると最終接合物は９６憾のＳＴ（モルで表す）を含有していた。

交差結合５Ｔ−８：初期のＳＴ／Ｂ比を順次に高めると接合物中のＳＴの比率は 直線的に増す。初期のＳＴ／Ｂモル比の／２左／／を用いると最終接合物は９７ 係のＳＴ（モルで表す）を含有して（、・た。

（Ｃ）　接合工程の時間の影響 ＥＤＡＣ／）キシンタンパク質の比の’Ｉ！；／／を用い／ｇ待時間接合反応を 行うと７時間の接合反応の場合よＪもＬＴ　）キシンの毒性を有意に大きく減じ た。ＬＴ及びＳＴの抗原性は接合反応順序をＬＴ＋ＳＴ十ＥＤＡＣとした場合に １ｇ時間の反■６によシ認めらｎる程度に減することはないけれども他の接合反 応順序の離合に抗原性は中等度に減する。得られたデータを第２表に示す。

６ 追加の諸研究においてＳ　Ｔ／Ｌ　Ｔ比を１００／／とし及びＥＤＡＣ／）キシ ンタンパク質の比をｌＯ：／とし、Ｌ　Ｔ　＋　Ｓ　Ｔ　＋　ＥＤＡＣの添加順 序の下での接合混合物を用いｐＨ７，０及び＋’Ｏの下で接合時間を変えた場合 の影響を評価した。第左図に総括して示される通り接合反応時間を２〜１９２時 間の範囲で増加させるとＬＴに対するＳＴの結合量が漸次増加したが、この場合 に接合されたトキシンの抗原性を有意に希釈させることはなかった。

カルデジイミドの７０θ〜を用いる／ｇ待時間接合の条件下でＥＤＡＣ及びＭＣ Ｄ　ｌは共に減少された毒性及び持続性の抗原性の特性をもつ交差結合５Ｔ−１ ７分子を生成した。ＥＤＡＣを用いて生成させた交差結合分子は毒性を大きく減 すると共に永続性の抗原性を有する。

得られたデータを第３表に示す。

（ｅ）　コレラトキシンを用いるＳＴの接合Ｅ、コリのＳＴとＬＴ又はそのＢサ ブユニットとの交差結合に使用される条件と同じ接合条件の下でＥ、コリのＳＴ 、！：ＣＴホロトキシン（又はその日サブユニット）とを接合させ得る。ＳＴト キシン対ＣＴホロトキシン又はその日サブユニットの接合は同様の態様を伴う。

既述の通、りＣＴ　トキシンとＬＴ）キシンとは構造的にも免疫学的にも相似で ある。−例としてＳＴ／ＣＴモル比１００／ｌ及びＥＤＡＣ／全接合物比１０／ ／を用いて／ｇ時間反応させると３’１重量係（モル表示で９ｇ％）のＳＴを有 する接合物を生成する。５Ｔ（５０１）の抗原性とＣＴ　Ｃ３／４）の抗原性と が反応生成物中に保持される。

（２）最適の交差結合ワクチン及びその効果上述の観察の結果からＳＴとＬＴ又 はその日サブユニットとの交差結合の最適条件はＳ　Ｔ／Ｌ　Ｔ又はＳＴ／Ｂの 初期モル比は１００／／　、　Ｅ　Ｄ　Ａ　Ｃ／全全トキシンタンノブ質比は／ θ／／（重量基準）及び接合反応時間はグ℃で９６・時間と決定さ扛た。

（ａ）　交差結合５Ｔ−ＬＴワクチン二上記の接合条件を用いて製造された交差 結合５Ｔ−ＬＴ免疫原の性質を第１１表に示す。

第　ダ　表 交差結合５Ｔ−ＬＴワクチンの性質 （注）（ａ）接合物の濃度を各トキシンのｉｏｏ＜に相当させるように調整した （ｂ）　未訂正ワクチンについての直接測定値免疫処理：上記のワクチンを腹腔 内注射／回ｆｔ　／　０００Ｔｇ及び経口大量２回投与量、２３００μｓ　とし て投与することによシラットを免疫処理した。経口免疫用のものは全部で約／１ １．５−θＳＴ抗原単位（投与量Ｘ抗原性）及び２．！；！；ＯＬＴ抗原単位を 含有していた。第３表に示す通シこの免疫処理の紹果ＬＴ）キシンとＳＴトキシ ンとの双方及びこれらのトキシンを産生ずる生活細菌に対して有意の防御を達成 した。

（ｂ）　交差結合Ｓ　Ｔ　−Ｂワクチン二上文中の最適接合条件を用いて製造さ れた交差結合５Ｔ−８サブユニツトワクチンの性質を第乙表に示す。

交差結合５Ｔ−８サブユニツトワクチンの性質（ａ）（ａ）Ｂサブユニットに対 し高度免疫抗血清を用いＥＬＩＳＡによシ測定した値 免疫処理：第６表に示す性質にもとづき交差結合５Ｔ−Ｂサブユニットワクチン は全経口投与量ｓ、ｏｏｏμｙの中にＢサブユニット抗原単位２．／！；０及び ＳＴ抗原単位／、１００を含有していた。この投与量を用いてラットを免疫処理 したところＬＴｉ生性の生活菌株ＰＢ２．！；ｇ（ＬＴ　／ＳＴ　）Ｃ！；、２ ±２４分泌減少）又はＳＴ産生性生活菌株テキサス４を左コ（ＬＴ　／ＳＴ　） Ｃ６２±１４分泌減少）に対し強度の防御を達成した。

（３）交差結合ワクチンへの合成ＳＴの利用本明細誉記載のＥ、コリの餉内毒素 生成原の菌の生育様から得られたトキシンの純化によってみちびかれたＳＴ（生 物学的ＳＴ）の接合にもとづき、又はアミノ酸シンセサイザーによって生成され た合成ＳＴの接合にもとづき、交差結合５Ｔ−ＬＴ又は５Ｔ−８サブユニツトの 新規の抗原を創製することができる。生育中の菌株／ｇＤから得られる純化され た生物学的Ｓ　Ｔ　（５ｔａｐｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ。

／　９　ｇ　Ｏ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ ａｔｉｏｎ　ｏｆｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　ｐｒｏｄ ｕｃｅｄ　ｂｙ　ａ　５ｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｅ。

ｃｏｌｉ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆｏｒ　ｍａｎ、Ｊ、日ｉｏ１．Ｃｈｅｒｎ −、！　５３　：ｌ１７／乙−１１７２／）を構成する７ｇ種のアミノ酸の結合 順序はチャン及びギアネラ（Ｃｈａｎ　ａｎｄ　Ｇｉａｎｎｅｌｌａ。

／　９　ｇ　／　＋Ａｍ１ｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｅａｔ −ｓｔａｂｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｏｒ　ｍａｎ、Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、２３　乙　ニア７４ｔ４ｔ−７７１１６）によって述べられている 。この結合順序を用いて合成８丁がホウトｙ　（Ｄｒ、　Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｈｏ ｕｇｈｔｅｎ、　５ｃｒｉｐｐｓＣ１１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆ ｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｌａ　Ｊｏｌ　ｌａ、　Ｃａ１ｉ−ｆｏｒｎｉａ）によ って調製された。この合成ＳＴ）キシンが生物学的ＳＴと生物学的及び免疫学的 に同一であることは幼獣マウス試験における、又は精すツされたラットの回腸係 蹄における流体分泌発現能にもとづき、及び幼獣マウス試験における合成ＳＴ及 び生物学的ＳＴの分泌効果を高度免疫ウサギ抗血清対生物学的ＳＴが中１口する 能力にもとづき、証明された。

合成ＳＴと８サブユニツトとを接合させる反応においてＥＤＡＣ／全タンノぞり 質比／、左／／、ＳＴ／Ｂサブユツトのモル比！；０／／、及び反応１４間とし て７５時間を使用した。第７表に示さ扛る通シこのワクチンの性質は第６表に示 された交差結合塗物学的５Ｔ−８ワクチンの性質と実用上同じである。

（注）（ａ）高度免疫血清対日サブユニットを用いるＥＬＩＳＡによる測定値 生物学的５Ｔ−８サブユニツトワクチンについて上述されたのと同じ技法及び同 じ投与量によシ合成５Ｔ−８サブユニットワクチンを用いてラットを免疫処理し たところＬＴトキシン及びＳＴ）キシン並にこれらのトキシンを産生ずる生活菌 株に対し１８ｇｇ表に示す通シの有慧の防御を達成した。

上記の観察結果は生育細菌から純化によシ導か扛、又は合成的に調製されたＳＴ ）キシンとＬＴ）キシン又はＣＴ）キシン（ホロトキシン或はその日サブユニッ ト）とをカルがジイミドの存在下に接合させると新規の分子即ち交差結合Ｓ　Ｔ 　−Ｌ　’Ｔ及び５Ｔ−ＣＴ　（又は交差結合５Ｔ−８サブユニット）を与える こと、この新規分子は減弱された毒性をもつと共に夫々の成分としてのトキシン 類に関して継続的抗原性並びにＳＴ）キシンに関する獲得された免疫原性をもつ ことを示している。ＥＤＡＣは最有効の接合剤であるけれども本発明者の観察に よれば交差結合はこの接合剤について特異的ではない。インビトロの研究におい て下記の諸変数ハ交差結合工程に影響を及ぼすことが示さｎた：接合工程順序、 使用のカルボジイミドの濃度、使用のＳＴ対しＴ（又はその日サブユニット）の 比、及び反応時間。最適交差結合反応はり６係（モル基準）のＳＴを含む分子を 生成し、該交差結合したトキシン（複数）の毒性は未接合トキシンの毒性の＜０ ．／！Ｓ％にまで減じたがしかもその抗原性はＥＬＩＳＡ試験で測定すると＞ｇ ｏ優に保持されていた。

同様の接合条件の下でＳＴ）キシンとＬＴエンテロトキシンのＢサブユニットと を、又はＣＴとを、交差結合させると均等の性質を示す。こｎらの分子の免疫原 としての刃部ＩはＬＴ）キシン又はＳＴトキシン自体又はこれらのトキシン類を 産生する生活細菌を夫々単独で又は併用して免疫処理ラットを攻撃した場合に該 分子カニ強度の防御を果す事実によって証明された。

接合物中のＳＴ対しＴ（又はその日サブユニット）の比は接合反応条件を変える ことによシ分子内ＬＴホロトキシン又はＢサブユニットの交差結合の程度を変化 させることにもとづき変えられ得る。かようにして得られた５Ｔ−ＬＴ　（又は ５Ｔ−８サブユニツト）接合物はその分子の生物学的毒性が大幅に減ぜられ、Ｌ Ｔ（又はその日サブユニット）はその抗原性を保持し、そしてＳＴは反応の関数 として免疫原性を獲得している点で、独自である。

産業上の利用可能性 使用に際し本発明の新規の免疫原はこれを投与対象、即ち動物又は人に対し種々 の方法で投与し得る。例えば該方法には無毒性のアジュバント例えばミョウバン 沈澱物と共に用いる非経口的（皮下）投与法、又は胃液作用を減じ又は除去した 後に用いらｎる経口投与法、或は胃液による不活化に対抗して抗原を保護する製 薬学的形状゛（例えば保護用カプセル若しくは微小球）における投与法が包含さ れる。

既述の諸成績は本発明の新規の交差結合５Ｔ−ＬＴ（又は５Ｔ−Ｂサブユニット ）組成物の有効量を投与することによって患者を治療することの証明を与えるも のである。

本発明の他の特徴的態様はエシェリキアコリ又はビプリオコレレの熱不安定性エ ンテロトキシン（ホロトキシン又はその日サブユニット）が常用の大分子量タン ｚｅり質の代シに担体として使用され得ることの発見である。

即ち本発明に従い比較的低分子量のトキシンを交差結合させ得る新規の担体が提 供さｎる。この新規父差結合物のＬＴ又はＣＴ部分（又はその日サブユニット） は共に担体でもあシ且つ抗原でもめる。両者のトキシンは既述の通シそれらの結 合形の場合にその毒性が著しく減ぜられているがしかも双方共に抗原として作用 する。Ｂサブユニット（サブユニット単独又はホロトキシンの一部分として）は 腸粘膜表面上の特異的なＧＭエ　受容体に接着することによシ抗原と粘膜との間 の緊密で持続的な接触を保たせるＢサブユニットの特性にもとづき経口用ワクチ ンとしてのこの抗原の価値を増大させる。Ｂサブユニット（Ｊ１独又はＬＴ或は ＣＴホロトキシンの一部として）の該経口的免疫処理効果の増大化の性質は５Ｔ −ＬＴ又は５Ｔ−８サブユニツト（この場合にＢサグユニットは担体としても抗 原としても作用する）の新規の又差結合物の一部分の性質として記載さ扛だけれ どもＬＴ又はコレラトキシンのＢサブユニットのこの独自の性質はＳＴ以外の他 の抗原のための担体として特に使用されて経口月ワクチンとして投与され罠とき の効果を増大するために４０用されるのである。

本発明は接合剤、アジュ・マント及び反応条件の特別な諸例に関して記載された けれども本発明の技術範囲を逸脱することなく他の均等の組成物及び反応条件を 使用し得るものである。本明細曹はＳＴ）キシンとＥ、コリのＬＴホロトキシン 又はその日サブユニットとを交差結合させることによる新規抗原の提供の例示を 主として記載した。コレラトキシンのホロトキシン及ヒソのＢ、ｆブユニット並 びにＥ、コリのＬ’Ｔホロトキシン及びその日サブユニットの相互間の構造的、 機能的及び完投学的近似性は本明細書記載の諸性質を有する類似の新規抗原がＥ 、コリＳＴ）キシンとコレラトキシンのホロトキシン又はその日サブユニットと の交差結合によっても創製されることを明示するものである。

冷加抗原（Ｐ９） 槍唯−寓フ噌 ＬＴ（一対するＳＴの交を刹Ｐ釦良１：関するＥＤＡＣ，対　仝要素タンパク黄 の北−〃呆ＥＤＡＣ：　夕］１悼脅１１北（！量比）第３図 第４図 文Ｓ整介反爬略葡（ｈｒ） 第５図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．熱安定性（ＳＴ）エンテロトキシンとエシェリキアコリの熱不安定性（ＬＴ ）エンテロトキシン、該熱不安定性（ＬＴ）エンテロトキシンの８サブユニツト 、シン及び該コレラトキシン（ＣＴ）ホロトキシンの８サツユニツトから成る群 から選ばれる反応体とを適切な接合剤の存在下で反応させることによ）製造され た生成物を包含することを特徴とする下痢症に対する噌乳動物の免疫処理のため の組成物。 ２、熱不安定性エンテロトキシン又は熱安定性エンテロトキシンを一単独に又は 双方共に産生ずる相同性及び非相同性の菌体細胞の血清型のエシェリキアコリ株 によって起される下痢症の予防のための免疫処理に使用される有効で無毒性の抗 原の提供のために逝切な゛アノユパントと組合せらｎｆｃことを特徴とする請求 の範囲第１項に記載の組成物゛。 ３、反応混合物におけるＳＴ対対反鉢体モル比が少くともＳ一対／であることを 特徴とする請求の範囲第１項に記載の組、底物。 ４、接合剤が水溶性カルがジイミド又はその他の有効な接合剤であることを特徴 とする諸本の範囲第１項に記゛載の組成物。 ５、　カルがジイミドがｌ−エチル−３−（３−ジメチルする請求の範囲第９項 に記載の組成物。 ６、反応を１時間以上継続させることを特徴とする請求の範囲ｉ／項に記載のｍ ｌ１Ｘ、物。 ７、腸内毒素原性のエシェリキアコリ株による下痢症の免疫学的予防に使用され る有効な抗原の提供のために適切なアジュバントと組合せられたことを特徴とす る請求の範囲第３項に記載の組成物。 ８、アジュバントがフロイントの完全アジュバント又はその他の適宜のアジュバ ント例えばミョウｉＮンであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成 物。 ９、反応体が熱不安定性（ＬＴ）エンテロトキシンであることを特徴とする請求 の範囲第１項に記載の組成物。 １０、反応体が熱不安定性（ＬＴ）エンテロトキシンのＢサブユニットであるこ とを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成物。 １１、　反応体がコレラトキシン（ＣＴ）のホロトキシンであることを特徴とす る請求の範囲第１項に記載の組成物。 １２、反応体がコレラトキシン（ＣＴ）ホロトキシンのＢサブユニットであるこ とを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成物。 １３、請求の範囲第１項に記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする腸 内毒素原性のエシェリキアコリ株による下痢症に対する踊乳動物の免疫処理方法 。 １４、組成物を非経口的に投与することを特徴とする特許の範囲第／３項に記載 の方法。 １５０組成物を経口的に投与することを特徴とする請求の範囲第７３項に記載の 方法。 １６、反応体が熱不安定性（ＬＴ）エンテロトキシン又はその日サブユニットで あることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の方法。 １７、反応体がコレラトキシン（ＣＴ）ホロトキシン又はその日サブユニットで あることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の方法。 １８、＠乳動物が人であることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の方法。 １９、抗原と結合さｎる担体がエシェリキアコリの熱不安定性、（Ｌ、：＋Ｔ　 ）エンテロトキシンのＢサブユニット又はコレラトキシン（ＣＴ）の８サブユニ ツトであることを特徴とする抗原の経口投与のための担体の使用。