EA004797B1 - Иммуногенные липосомные композиции - Google Patents

Иммуногенные липосомные композиции Download PDF

Info

Publication number
EA004797B1
EA004797B1 EA200100269A EA200100269A EA004797B1 EA 004797 B1 EA004797 B1 EA 004797B1 EA 200100269 A EA200100269 A EA 200100269A EA 200100269 A EA200100269 A EA 200100269A EA 004797 B1 EA004797 B1 EA 004797B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
immunogenic
composition
protein
antigenic
composition according
Prior art date
Application number
EA200100269A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200100269A1 (ru
Inventor
Гэрри Фудзии
Доналд В. Креймер
Уильям А. Эрнст
Джилл Адлер-Мур
Л. Джинн Перри
Original Assignee
Молекьюлар Экспресс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Молекьюлар Экспресс, Инк. filed Critical Молекьюлар Экспресс, Инк.
Publication of EA200100269A1 publication Critical patent/EA200100269A1/ru
Publication of EA004797B1 publication Critical patent/EA004797B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Данное изобретение относится к иммуногенной липосомной композиции, включающей пузырек-образующие липиды и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант и гидрофобную область.

Description

Применение вакцин исторически обеспечило надежный и эффективный способ защиты всего населения от широкого разнообразия инфекционных болезней. Иммунизация от вирусных и других микробных организмов в целом надежна и эффективна и была причиной значительного увеличения продолжительности жизни людей в развивающихся государствах. Однако может иметь место ряд нежелательных побочных эффектов в зависимости от природы вакцины и специфического иммуногена. Неадекватная инактивация интактного вируса в прошлом привела к неожиданной инфекции вместо защиты после вакцинации (Пдетй, 1959, Мййагу Меб. 124:342). Иногда иммунизация интактными организмами, как например, грипп, может ускорить развитие аутоаллергических болезней, направленных против нормальных тканей, как например, синдром Гийена-Барре (йапщпшг е! а1., 1984, 1. Ер1бешю1, 119:841). Кроме того, сами агенты, присутствие веществ внутри клеток или сложной среды могут допустить появление тяжелых аллергических реакций к чужеродным белкам (Уашале, Иешита, 1988, Ер1беш. 1пГ. 100:291). Поскольку эффективные процедуры вакцинации часто требуют многократной иммунизации, эти нежелательные моменты могут уменьшить эффективность вакцины и могут снизить общественное признание процедуры вакцинации. Современные молекулярные биологические методики недавно проверены с целью обеспечить повышенную безопасность и эффективность новых препаратов вакцин. Исследуемые в настоящее время потенциальные стратегии включают: вакцины, основанные на методе рекомбинантных ДНК (Сопгу е! а1., 1994 Сапсег. Йе8. 54: 1164; Ни е! а1., 1988, 1. νίτοί. 62:176), генерирование простых синтетических пептидов в качестве антигенов (ИатбеШ е! а1., 1992, να^ΐηοδ 8:1405; \а1ап е! а1., 1987, 1. Ехр. Меб. 165:459) и прямое введение генетического материала в ткани для стимулирования защитных реакций (и1тег е! а1., 1993, 8с1епсе 259:1745). В частности, в центре внимания многих исследований находится применение простых пептидных антигенов для индуцирования специфических иммунизационных реакций. Данная стратегия является привлекательной, поскольку она обладает потенциалом для обеспечения иммунологической специфичности, более тесного контроля производственных процессов и исключения большинства второстепенных источников материалов или контаминантов, связанных с продуцированием иммуногена.
Однако применение очищенных белков или пептидных фрагментов пептидов для вакцинации зависит от доставки материала к месту иммунизации с помощью эффективного антигенного носителя. Возможно, одними из самых надежных носителей были липид/липосомные вакцинные комплексы. Липосомы давно при знаны в качестве коммерчески жизнеспособной технологии, поскольку они могут уменьшать токсичность лекарственных препаратов, пролонгировать циркуляцию в токе крови и изменять биораспределение и фармакокинетику молекул лекарственных препаратов (ЕнЩ, 1996; Vеκ^с1еκ, еб. М. КокоГГ, Магсе1 Иеккег, Ыете Уотк ΝΥ, р. 491). При введении ίη у1уо, липосомы циркулируют в крови и удаляются моноцит/макрофаг фагоцитарной системой, особенно в тканях печени, селезенки, лимфатических узлов и легких (С1аакеп, 1996; Vеκ^с1еκ, еб. М. Кокой; Магсе1 Иеккет, Νονν Υο^к ΝΥ, р. 649). Способность липосом направлять характер антигенного распределения наводит на мысль, что липосомный иммуноген будет максимально подвергаться действию иммунной системы. До сих пор исследованы несколько систем на основе липидов, включая пептиды конъюгированные с липидами (№гбеШ е! а1., 1992, να^ίι^ 8:1405; \\а!ап е! а1., 1987, 1. Ехр. Меб. 165:459), перестроение всех белковых субъединиц в присутствии липидов (Мотет, 81топк, 1985, να^ сшек 4: 166; СгедопабЦ 1995, Т1Ь!есй 13: 527) и связывание (ассоциация) белков с предварительно образованными липосомами (Тйейеп, 8йайит, 1989, 1ттипо1. Бей. 22:253; АМпд е! а1., 1985, ναοοί^κ 4:166). Хотя показано, что данные стратегии иммунологически активны, технические трудности, связанные с крупномасштабным продуцированием белков и их липидных носителей, а также ограничения в стоимости, делают их менее привлекательными в качестве коммерческой технологии. Таким образом, требуется улучшенная система или подход для получения белковых антигенов с тем, чтобы воспользоваться потенциалом предлагаемого липосомами в разработке вакцин.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к иммуногенной липосомной композиции, включающей пузырек-образующие липиды и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант и гидрофобную область. Предпочтительно, если гидрофобная область связана с мембраной липосомной композиции. Предпочтительно, если гидрофобная область является пептидом и согласно предпочтительному варианту содержит от 15 до 500 аминокислотных остатков, еще предпочтительнее менее 300 и наиболее предпочтительно - менее 50 остатков, где по крайней мере одну или несколько аминокислот выбирают из группы, состоящей из А1а, Акп, Сук, С1п, С1у, Ηίκ, 11е, Ьеи, Ме!, Рйе, Рго, 8ет, Тйт, Тгр, Туг и να1.
Согласно одному варианту данного изобретения иммуногенная липосомная композиция дополнительно включает один или несколько адъювантов. Примеры подходящих адъювантов включают липофильные молекулы, как например, липид А и другие липополисахариды,
Ош1 А, Ц821, МЕ59, Р3С88, МТР-РЕ, а также водорастворимые молекулы, включающие цитокины, как, например, 1Ь-2, 1Ь-4, ΙΩ-12, интерфероны и тому подобные. Другие примеры цитокинов приведены ниже в табл.1.
Согласно другому варианту изобретения антигенная конструкция дополнительно включает линкерную область, соединяющую антигенную(ые) детерминанту(ы) с гидрофобной областью. В предпочтительном варианте линкерная область является пептидом, содержащим от 1 до 200 аминокислотных остатков. Аминокислотными остатками предпочтительно являются встречающиеся в природе аминокислоты, как, например, А1а, Агд, Акп, Акр, Сук, С1и, С1п, С1у, Шк, Пе, Ьеи, Ьук, Мек РЬе. Рго, 8ег, Т11Г. Тгр, Туг и/или Уа1.
Кроме того, данное изобретение относится к способу индуцирования иммуногенной реакции в животном-хозяине, включающему введение иммунологически эффективного количества липосомной композиции, описанной выше. Хотя хозяин может быть любым животным, включая домашнюю птицу, предпочтительно, если животное-хозяин является млекопитающим и более предпочтительно - человеком. В некоторых предпочтительных вариантах иммуногенная липосомная композиция дополнительно включает один или несколько пригодных адъювантов.
Данное изобретение, кроме того, предлагает кассету ДНК для вставки в вектор, включающую последовательности, которые кодируют иммуногенный гибридный белок, где гибридный белок включает гидрофобную белковую область и одну или несколько антигенных детерминант.
Данное изобретение также предлагает способ получения иммуногенной липосомной композиции, включающий: экспрессию гена, который кодирует гибридный белок, включающий антигенную детерминанту и гидрофобную область; растворение липидов и гибридного белка в соответствующем органическом растворителе или смеси органических растворителей; образование липидной пленки испарением органического растворителя; гидратирование липидной пленки; диспергирование гидратной липидной пленки с образованием иммуногенной липосомной композиции.
Данное изобретение, кроме того, предлагает способ получения иммуногенной липосомной композиции, включающий: экспрессию гена, который кодирует гибридный белок, включающий антигенную детерминанту и гидрофобную область; растворение гибридного белка в водном буфере; гидратирование или липидных порошков, или липидных пленок с буфером, содержащим гибридный белок; диспергирование липидных порошков или пленок с образованием иммуногенной липосомной композиции.
В другом варианте данное изобретение предлагает способ получения иммуногенной липосомной композиции, включающий: экспрессию гена, который кодирует гибридный белок, включающий антигенную детерминанту и гидрофобную область; растворение гибридного белка в водном буфере и прибавление гибридного белка к предварительно образованным липосомам с получением иммуногенной липосомной композиции.
В другом варианте данное изобретение предлагает способ получения иммуногенной липидной композиции в виде эмульсии, включающий: экспрессию гена, который кодирует гибридный белок, включающий антигенную детерминанту и гидрофобную область; получение иммуногенной липидной композиции в виде эмульсии любыми способами, описанными выше, с применением липидного диспергирования (например, масла, такого как соевое масло) вместо липосом.
Еще в другом варианте данное изобретение предлагает способ получения иммуногенной липосомной или липидной композиции в виде эмульсии, включающий: химически синтезированный гибридный белок, включающий антигенную детерминанту и гидрофобную область, и получение иммуногенной липосомной или липидной композиции в виде эмульсии любыми способами, описанными выше.
В данном изобретении «связанный (ассоциированный) с мембраной» означает, что гидрофобная область, по крайней мере, частично внедряется (вставляется) в липосомную мембрану и предпочтительно не связывается ковалентно с пузырек-образующими липидами. Гидрофобная область может также связываться с жирной кислотой липида «хвостом», который сам внедряется (вставляется) в мембрану.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 иллюстрируется эффективность липосомной композиции, описанной в данном изобретении, в защите от Н8У2.
На фиг. 2 изображено сравнение эффективности липосомной композиции, описанной в данном изобретении, с другими композициями вакцины.
На фиг. 3 изображена кривая выживания мышей, демонстрирующая способность липосомной Н8У2д (1-23)-НО, для установления защитной иммунной реакции.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение предлагает способ доставки антигена, предназначенный для улучшения эффективности и надежности иммунизации от целого ряда микробных агентов и злокачественных опухолей. Иммуноген может кодироваться кассетой гена, которая состоит из гидрофобной области (НИ), слитой с последовательностью специфического антигена. Плазмиду, содержащую последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие НО и антигенный эпитоп, получают и экспрессируют в соответствующий хозяин, например, Е. сой, Р. рак1ог1к, клетки насекомых СО8-1 клетки или СНО клетки (ОеиеОс Еидшееттд 18:17 (1998)). Если белки экспрессированы и очищены, они используются в липосомной композиции. В присутствии мембраны белок связывается с двойным слоем липида с образованием стабильной структуры с гидрофобной частью, связанной с мембраной, и антигенным эпитопом, ориентированным к водной среде. Плазмида может создаваться рестрикционными сайтами на основных участках с тем, чтобы различные антигенные эпитопы могли бы легко замещаться, таким образом, обеспечивая способность утилизировать различные антигенные эпитопы для обеспечения максимальной защиты после иммунизации. Одно из уникальных свойств этой кассеты заключается в том, что белковый компонент может продуцироваться в клетках хозяина в больших количествах, легко очищаться и далее внедряться в липосомы. Это обеспечивает максимальную гибкость для определения наиболее подходящего эпитопа, который вызывает защиту от микробных агентов или от злокачественных опухолей, при сохранении конечной цели крупномасштабного приготовления и коммерческого распространения вакцины.
Таким образом, данное изобретение обладает несколькими преимуществами:
1) эпитопы могут легко изменяться, обеспечивая максимальную гибкость в дизайне вакцины;
2) многочисленные эпитопы могут вставляться в молекулу носителя;
3) последовательности больших антигенов (т.е. протеины оболочек или рецепторные области) или субъединицы могут включаться, если требуется;
4) экспрессированный белок-носитель является водорастворимым и может легко очищаться с использованием стандартных методов приготовления белков.
Синтез антигенной конструкции в виде водорастворимого гибридного продукта сводит к минимуму возможные проблемы крупномасштабного продуцирования, вызванные гидрофобной областью белка. Таким образом, конструкция белка, обладающая гидрофобной областью для инсерции липосомной мембраны и к тому же еще водорастворимая, будет являться основным преимуществом. При некоторых обстоятельствах, незначительные количества солюбилизирующего агента, как например, гуанидина, мочевины, додецилсульфата натрия, октилгликозида или деоксихолата, могут использоваться во время способа очистки. Данное изобретение также предлагает конструкции, включающие два или несколько антигенов. Такие конструкции можно представить в виде:
Н2Ы-сайт I антигена-НО- сайт II антигена-СООН
Изобретение также предполагает использование встречающихся в природе или синтетических отдельных трансмембранных спиралей или спиральных пучков (2-12). Сайты антигенов могут располагаться на Ν- или С-конце или между петлями, образованными между индивидуальными цепями пучков.
Термин «антиген», применяемый в данном изобретении, относится к любой субстанции (включая белок или белок-полисахарид, липополисахарид, микробную субъединицу, целый патоген или маркеры злокачественной опухоли), которая, если чужеродна к животному-хозяину и при достижении доступа к ткани такого животного стимулирует макрофаги, антиген присутствующих клеток и образование антигенспецифических антител и реагирует специфично ίη νίνο или ίη νίΐτο с такими антителами. Кроме того, антиген стимулирует пролиферацию и/или активацию Т-лимфоцитов рецепторами антигена и перекрестно реагирующими антигенами (например, природные клетки-киллеры (паШта1 кШег, ΝΚ), клетки с цитотоксической Тфункцией и Т-клетки-хелперы) и могут реагировать с лимфоцитами для инициирования серии реакций (ответов), названных клеточным иммунитетом. В иммуногенных композициях, описанных в данном изобретении, предпочтительно, чтобы присутствующий антиген находился в количестве 0,1-20 мг/мл антигена-НО. Более предпочтительно, если антиген присутствует в количестве 0,5-5 мг/мл антигена-НО.
«Антигенная детерминанта» представляет ту часть антигена или антигенной конструкции, которая определяет его иммунологическую специфичность. Обычно антигенная детерминанта или гаптен представляет собой пептид, белок или полисахарид, существующие в природных антигенах. В искусственных антигенах это могут быть низкомолекулярные вещества, как например, производное арсаниловой кислоты. Антигенная детерминанта будет специфично реагировать ίη νίνο или ίη νίΐτο с антителом или Тлимфоцитами, индуцируемыми антигенной формой антигенной детерминанты (например, антигенная детерминанта, присоединенная к иммуногенному веществу).
Антигенные детерминанты, описанные в данном изобретении, которые могут использоваться на практике, только в качестве примеров и могут быть получены из антигенов, представленных ниже:
Ί
Вирусные патогенные микроорганизмы
Вирус Катаральная лихорадка Бычий герпес (1ВК) Бычья вирусная диарея Антиген Структурный Е2
Вирус цитомегалии §р58
Чума (собачья) ОВ Полиэпитоп Ав РгМ Е Ε/Ν81 Ν81/Ν82 Оболочка В тип 4 капсид Г/Н
Эбола ΟΡ/ΝΡ
Ерзеет-Вагт ΕΒΝΑ 1,2,3,4,6
Ящур УР1
Гепатит А А/В сотЬо Αβ
Гепатит В НЬзАв
Гепатит С Ε2/Ν81
Вирус герпеса 1 N83 N54 N85 Е1 СО
Вирус герпеса 11‘ СВ
Герпес В Чума свиней сэ Е1
Иммунодефицит человека4
Папиллома человека Б1
Е6 Е7
Грипп ΗΑ/Ν ΝΡ
Японский энцефалит* Е
МагЬигв СР
Болезнь Марека (птиц) СА СВ
Корь НА ΝΡ
ΝοηνβΙΙί 561ГО капсид
Ньюкаслская (болезнь птиц) Г ΗΝ
Парагрипп Ε/ΗΝ
Парвовирус (собачий) УР2
Бешенство С
Респираторный синцитий Е протеин ГС субъединица
Чума крупного рогатого
скота Н/Г
Ко1ау|гиз' УР4 УР7 УР6
Краснуха Ветряная оспа- Е1
опоясывающий лишай СЕ
Желтая лихорадка ь Е N81 (48кО)
a. Обзор, см. Разз, 1996,1пГ. А£. Οϊ$· 5:240; Ауегу, 1998, Сигг. Ор. Сагбёок 13: 122.
b. Данные вирусы все являются флавивирусами - обзор дан в Уепи§ора1 апб Сои1б, 1994, Уассте 12:966.
c. Обзор, см. Абётога е( ак, 1994, Ιηί. ΒΪ5. СНп. Ν. Атег. 8:859.
б. Перечень ВИЧ антигенов, см. Н1У Мо1еси1аг 1ттипо1о£у ОаиЬазе, риЫ. ТкеогеНса! Вю1ову апб Вкркузкз, Νβ* Мехко (1995).
е Перечень Косауёгиа антигенов, см. “Коеауциа АпИвепз, НозЬто апб Кар1к1ап, 1994, Сигг. Тор. МкгоЬюк 1гатипок 185:179.
Бактериальные токсины
Бактерия
Васб1и$ АМйгасез ВотбеееНа регГизз15 С1о5(пбшт ЬоТиНпит С1озггкНит άίΗϊςίΙβ С1озепб1ит (е(ат СогупеЬасеепит б|рк1кепае
ЕзсЬегкЫа
Рзеиботопаз аеги^тоза Экзотоксин А 8Ыве11а бувеШепае ЗЫва
У1Ьпо сЬокгае Холера
Токсин Сибирская язва
Коклюш Ботулин
О1(Г1сПе
Столбняк Дифтерия Энтеротоксин
Общий обзор, см. М1бб1еЬгоок апб Оог1апб, 1984, р. 199.
Ссылка
Мштау апб Еасоп, 1996, Аизггак Уе1. 3. 73:207 Ггап2е1а1., 1996, Уе1епт Мебюпа 41:213 ВгизсЬке е(ак. 1997, Уасс<пе 15.1940 Бибетап апб Каи, 1994, Вю1о£1са1з 22:21 У/авпег е! а!.. 1992,I. νίτοΐ. 66:5290 №П(«а1., 1996,1 1пГ. 015. 174:387 ТЪотзоп е1 а!., 1996,). 1ттшюк 157:822 Гопзеса ег ак, 1994, Уассте 12:279 Еопзесае! ак, 1994, Уассте 12:279 Уепи£ора! апб Соик), 1994, Уассте 12:967 Сгееп е1 ак, 1997, У:го1.234:383
Зтптопз βι ак, 1998, Ат. 3. Тгор. Меб. Ну§. 58:655 Са$поп е1 а!., 1996,3. Уток 70:141
Рагбо е1 ак, 1997, Ат. 3. Уе(. Кеа. 58:833 Уапбеггапбеп е1ак, 1998, Уток 246:134 Мозае(а1., 1992, Зет. [ттипо]. 4:97 ГНвиепа е1 а!., 1995, Уассте 13:953 Вп1£иегае(а1., 1996, Уассте 14; 1407 Тйапауа1а е1 а!., 1995, ΡΝΑ5 92:3358 8ке1)уе1ак, 1981, ЫаШге 290:51 Метете! ак, 1992, ΡΝΑ5 89:3468 Тап1висЫе1 ак, 1993, Уток 195:297 КЬибуакоу е1 ак, 1995, ΥίτοΙ. 206:666 КНибуакоу е! ак, 1995, Укок 206:666 Кйибуакоу е1 а)., 1995, Укок 206:666 Бескпет е1 ак, 1998, Уток 243:313 Боп^еСаБ, 1984,1пГ. 1ттип. 37:761 МсОегтоПе<ак, 1989, У1го1. 169:244 Боп^еОк, 1984, Ιηί. 1ттип. 37:761 Нип1 апб Мекпбег, 1969, БаЬ. Ап1та1 Саге 19:221 уап Куп е( ак, 1994,3. νίτοΐ. 68:3934
Н1У Мо1еси1аг 1ттипо1о£у ВаСаЬазе ЗиасЬ ее ак, 1995, ΡΝΑ8 92:11553 Зеаиааееа!., 1992, ΡΝΑ8 89:7871 8ишзе(ак, 1992, ΡΝΑ8 89:7871 Бииззегак, 1992,ΡΝΑ8 89:7871 Бахег апб У/еЬхеег, 1976, νίτοΐ. 69:511 Магетоп ееа!., 1993, Еиг. 1.1ттипо1.23:1719 Кшшга-Кигоба апб Уааш, 1988,3.1ттило1.141:3606 Ηβνβγ ее а!., 1997, νίτοί. 239:206
Воу!е апб Нете, 1993,1ттип. Се11 ΒίοΙ. 71:391 Воу1е апб Нете, 1993,1ттип. Се11 Βϊοΐ. 71:391 Согбоао ее а!., 1998,I. νίτοΐ. 72:2516 Согбоао ее а!., 1998,1. ΥίτοΙ. 72:2516 Ва|1 ее Λ, 1998, ί. νίτοΐ. 72:1345 Кеббуееа!., 1996, Уассте 14:469 Кеббуегак, 1996, Уассте 14:469 Мотет ее ак, 1983, Д. Оеп. νίτοΐ. 64:1557 БорехбеТипзоесак, 1992,3. νίτοΐ. 66:2748 ¥Лкеогееа1., 1984, ΡΝΑ8 81:7194 ГаЬеу апб \Уа1аЬ, 1996, Уассте 14:1214 Νβιιζίΐ ее а!.. 1997, Уассте 15:525
Нетттв ее ак, 1995, СНп. МкгоЬюк Кеу. 8:22
Ыа|ке1ак, 1997, Уассте 15:603 ΖΚοϋ ее ак. 1994,Б Укок 68:3955 гКоиееак, 1994,1. Укок 68:3955 РактЬоегак, 1994,3. Оеп. Укок 75:2415 Тгибе! ее ак, 1985,3. νίτοΐ. МеЖ. 12:243
Ео*1ет ееак, 1995, νίτοΐ. 214:531 Ατνίη, 1996, Ιηί. СНп. ϋίϊ. Ν. Атег. 10:529 Сои1б ее ак, 1986, 3. Оеп. νίτοΐ. 67:591 Зсккзсктеег ее ак, 1987,3.1ттипок 135:2805
Ссылка
Берр1а, 1982. ΡΝΑ8 79:852 νβϊχί апб Не*1еП, 1986, Апп. Кеу. МкгоЬюк 40: 8ίηρ$οη, 1981, РЬагтасок Κβν. 33:155
Кпоорее ак, 1993, СИп. МкгоЬюк Κβν. 6:251 Е)беЬ ее ак, 1983, МкгоЬюк Кеу. 47:596 Раррепйеппег, 1977, Апп. Κβν. Вюскет. 46:69 ОИ1 апб Кккатбзоп, 1980, Б Ιηί. 015. 141:64 181е*$к1 апб КаЬаГ, 1977, ΡΝΑ2 72:2284 Кеизскапб Засемйег, 1975,1.Ιηί. О»з. 131:833 Етке1з(ет, 1973, Спе. Κβν. МкгоЬюк 2:553
Бактериальные патогенные микроорганизмы
Бактерия Антиген Ссылка
ВасШиз зр РА/БЕ7ЕГ δίη^ι е1 ак, 1998, Ιηί. 1тшип. 66:3447
ВогбеюПа зр Пертактин/Р.69 Апбетзоп е( ак, 1996, Уассте 14:1384
ВоггеНазр ОзрА/ОзрВ Ма е£ ак, 1996, Уассте 14:1366
ОзрС Мабиезепесак, 1998, Ιηί. 1ттип. 66:4073
Вгисейа зр Б7/Б12 Васкпюй е1 а!., 1994, Ιηί. Ιπυηιιη. 62:5361
Отр1б Т1Ьег е1 а!., 1994, Ιηί. 1ттш. 62:3633
Сашру1оЬас(ег зр Отр 18 Копке1 е( ак, 1996, Ιηί. 1тт
СЫату<йа* МОМР Бралтвегак, 1994, ΡΝΑ5 91:2456
ЕИгНсЫа зр Кзкйнза, 1991, С1л. МкгоЬюк Κβν. 4:286
ЕзсИегкЫа зр Наеторкбиз1 зр РАБ СЬео апб Непптв, 1987, Еиг. I. В1осЬет. 163:73
Р1 БоеЬ, 1987, Ιηί. 1ттип. 55:2612
Р2 Мипзоп е1 а1, 1983,1. СНп. Ιηνβ3ΐ. 72:677
Р4 Сгееп е: ак, 1991, Ιηί. 1ттип. 59:3191
Р5 Мипзоп апб СгапоГГ 1985, Ιηί. 1ттип. 49:544
Р6 Сгееп е< ак, 1990, Ιηί. 1ттип. 58:3272
Протеин ϋ Аккоуип1и е( ак, 1996, Ιηί. 1тти
й15 ТЬотаз е1 ак, 1990, Ιηί. 1пипип. 58:1909 Уап£ е1 ак, 1998, Ιηί. 1ттип. 66:3349
98 кО протеин Кипигае1ак, 1985, Ιηί. 1ттип. 47:253
ΗϋΆ Боозтоге ¢1 ак, 1998, Ιηί. 1ттип. 66:899
НеНсоЬасиг ру1оН Уреаза А МкЪесНесак, 1994,баягоеп1его1.107:1002
Уреаза В МкЬеп1 е(ак, 1994, Саз<гоеп1егок 107:1002
Уас А К1еапбюи5 е( ак, 1998, Вгй Меб. ВиП. 54:229
Каталаза КабсППесак, 1997, Ιηί. 1ттип. 65:4668
БевюпеИа зр Рр1А Биб*1ве1ак, 1996, Ιηί. 1ттип. 64:1659
Берюзрка зр ОМА Вго\«1е1ак, 1991, Ιηί. Йптип. 59:1772
Б1з(епа зр ББО Напу апб Веуап, 1992,1. Ехр. Меб. 175:1531
МусоЬасСепит 1ергае 35кГ> протеин Тпсса$е1ак, 1996,1пГ. 1ттип. 64:5171
18кО Ваит&агС« ак, 1996,1пГ. 1ттип. 64:2274
Ав85А Баипок е1 ак. 1994, Ιηί. 1ттип. 62:3679
МусоЬас(епит шЬегси1озит МРВ59 Коскеееак, 1994,1пГ. 1ттип. 62:5319
Ав85А Баипои е1 ак, 1994, Ιηί. 1ттип. 62:3679
Мусор1азта 90 кО Ггапгозо е! ак, 1993, Ιηί. 1ттип. 61:1523
ΝβίΒΒβτίβ' зр ОМУ Албегзоп е! ак, 1997, Уассте 15:1225
Рог 5ралт£е(ак, 1994, ΡΝΑ8 91:2456
Рзеиботопаз зр ОргГ Ни$Ьез е< ак, 1992, Ιηί. !ттип. 60:3497
Орг1 8реск1 е1 ак, 1996, Уассте 14:1111
О-пол ис ахарид Наипо апб Ρϊβτ, 1998, Ιηί. 1ттип. 66:3719
8а1топе11а зр ОМР/Рог А!игкагапб Капа(, 1997, Ιηί. Ιπυηιιη. 65:2382
VI ΡΙοίλϊη апб ВоиуегеьБеСат, 1995, Агск. 1т. Меб.
8(арЬу1ососсиз зр СР ГаПопегак, 1996, Ιηί. 1ттип. 64:1659
КАР (38кО) Ва1аЬал е( ак, 1998, 8скпсе 280:438
81гер{ососсиз зр М Веаскеу е1 ак, 1988, Уассте 6:192
Тгеропета ра11абштг Уегзииа ТКОМР БрагНпв е( ак, 1994, ΡΝΑ8 91:2456
зр Е1/У Беагу е:ак. 1997, МкгоЫа! Рабю§еп. 23:167
ί. Обзор см. Аб1пюга се ак, 1994, ΙηΓ. ϋίβ. СНп. Ν. Атег. 8:859
Грибковые патогенные микроорганизмы
Микроб Антиген
Азрегвй1из
СалсНба Рга1
Сосабюкез 48кО протеин СЕ РКА
Сгурюсоссиз
Н15(ор1азта
Рагасосс1бЮ1без ЬгазШегшз Рпешпосузбз сагтй СрА
Паразитические патогенные микроорганизмы
Микроб Антиген
Сгур(озропб|шп ЕтатоеЬа Ик(о1угка 8КЕНР (К2)
С1агб1а 1атЬНа Апе1 170кП У8Р
Бе1$кташа зр 8р63
Р1азтоб1ит зр ΝηπιρΊ Т8А 27 кО протеин
8сЫз<о$ота зр АМА-1 С8 ргот ерйорез 195 кВ протеин. 55 кО протеин 35 кО протеин 8т2868Т
Тгурапозота зр 56 кВ протеин
**3локачественные опухоли
Опухоль Антиген
Молочной железы мис-1
Толстого кишечника СЕА
Лейкоз ВСН/АВБ
Лимфома 8βΙίΑβ
Меланома МАКТ-1
Овариальная МАСЕ-1 р97 мис-ι
Панкреатическая мис-1
Ссылка
Кигир апб Китае, 1991, СНп. МкгоЬюк Κβν. 4:439 Бееапбгеи ее ак, 1998,3. Васеепок 180:282
КШапб ее ак, 1998, Ιηί. !ттип. 66:424
Уалвееак, 1997, Ιηί. 1ттип. 65:4068
Кпк1апб ее а!.. 1998, Ιηί. 1ттип. 66:3519
МёескеИ апб РегГесе, 1995, СНп. МёстоЫок Κβν. 8:515 Веере, 1997, СНп. МкгоЫок Κβν. 10:585 Впшипегееак, 1993, СНп. МкгоЬюк Κβν. 6:89
ΟίΒΐίοαί ееак, 1998, Ιηί. 1ттип. 66:3179
Ссылка
Ситгепе апб Саппа, 1991, СНп. ΜίσκΑίοΙ. Κβν. 4:325 8еап1еу ее а!., 1990, ΡΝΑ8 87:4976
Мае апб 8атие1зоп, 1998,Ιηί. 1ттип. 66:353 БойегеТак, 1997,1. Ехр. Меб. 185: 1793
Зеавег ее а!., 1997,1т. 1. Рагазйок 27:965 КаЫ ее ак, 1990, Ιηί. 1ттил. 58:3233 1998, (пГЛттил. 66:1910 \УсЬЬ ее а!., 1998,1п£ 1ттип. 66:3279 Соеигетаа е( ак, 1998, Ιηί. 1пипип. 66:3579 Апбегзоп ееак, 1998, Уассте 16:240 Νκτ6ίηβί31., 1998, Уассте 16: 590;
1998, Ιηί. 1ттип. 66:2895
Раеаггоуо ее ак, 1987, Цвейге 328:629
Райггоуо ее ак, 1987, Цаеите 328: 629 Раеаггоуо ее ак, 1987, Цагиге 328: 629 Ва11опее1ак, 1987, Ыаеиге 326:149
НапЬеСак, 1994, Мок МкгоЬюк 11:261
Ссылка
Оепеопееак, 1993, Сапе. БеП.70:143 Сопгу ее ак, 1994, Сапе. Кез. 54:1164 СЬепееак, 1992, ΡΝΑ5 89:1468.
К«аке1ак, Ι992,Νβνν Εηβ. 1. Меб. 327:1209 Казакам: ее ак, 1994, ΡΝΑ5 91:3515 Тгауегзал ееак, 1992, к Ехр. Меб. 176:1453 Ниееак, 1988,1. Укок 62: 176 1еготе ееак, 1993.1.1ттипок 151:1654 ВазМогб ее ак, 1993, 1т. 1. Сапе. 54:778 ** Общий обзор, см. Γίηη, 1993, Сигг. Ор. 1ттипо1. 5:701
Дополнительные примеры антигенов и патогенов, которые могут применяться, можно найти в работах ΜίΙίοΗ. 1989 (Α6ν. 1ттипо1. 45:195); НокЫпо, Кар1ап, 1994 (Сигг. Тор. М1сгоЫо1. [ттипок 185:179) или Vеηидорак Сои1б, 1994 (Уассте 12:966). Согласно одному варианту применяют др120 субъединицу еп\г гена и р27 дад гена из вируса иммунодефицита человека (йитап 1ттипобе£1с1епсу νίιυδ, Н1У). В другом варианте антигенную детерминанту можно получить из антигена, который выбирают из НБУ дО или дВ, Н1У др120, СМУ дВ, НСУ Е2, 1ЫЕУ НА или ΝΑ, Н. тПиепхае Р5 или Р6, фимбриального белка и протеина Ό.
Как используют в данном изобретении, термин «гидрофобная область» (ΗΌ) означает любой белок, пептид, липид или молекулу с гидрофобной областью или структурой с площадью поверхности, большей 500 А2. Примеры потенциальных ΗΌδ включают любой сегмент трансмембраны (1гап5тстЬгапс. ТМ) (например, гликофорин А; Тотйа, Матсйеы, 1975, Ргос. Ыа11. Асаб. 8ск И8А 72:2964), гидрофобную область цитохрома Ь5 (Тау1ог, Ро^стап, 1995, ВВА 1278:35), Т области токсина дифтерии (С1юс е! а1., 1992, №Ц.1гс 357:216), область II экзотоксина А Ркеиботоиак (А11игеб е! а1., 1986, ΡΝΛ8 83:1320), 4-спиральный пучок пенициллинсенсорной клеткой - трансдуктора (Нагб! е! а1., 1997, Мо1. МктоЬюк, 23:935), 7-спиральный пучок бактериородопсина (Неибегаои, Инетт, 1975, №Пиге 257:28), 12-спирального пучка 1ас пермеазы (КаЬаск е! а1., 1997, Сигг. Ор. 81тис1. Вю1. 7:537) и поруобразующую область колицина (Рагкег е! а1., 1989, №11иге 357:93).
Термин «вектор» относится к нуклеиновой кислоте (например, ДНК), полученной из плазмиды, космиды, фагмиды или бактериофага или полученной синтетически, в которой фрагменты нуклеиновой кислоты могут вставляться и клонироваться. Для этих целей вектор может содержать один или несколько уникальных сайтов рестрикции и может быть способен автономно реплицироваться в определенном хозяине или организме так, чтобы репродуцировалась клонируемая последовательность. Молекула вектора может наделяться некоторым вполне определенным фенотипом на организме хозяина, который является выбираемым или легко детектируемым. Некоторые компоненты вектора могут быть молекулой ДНК, включающей регуляторные элементы для транскрипции, трансляции, стабильности и репликации РНК и других последовательностей ДНК.
Термин «кассета ДНК» относится к генетическим последовательностям внутри (в пределах) вектора, которые могут экпрессировать гибридный (слитый) белок, описанный в данном изобретении. Кассета нуклеиновой кислоты позиционно и последовательно ориентирована внутри вектора так, что нуклеиновая кислота в кассете может считываться в РНК и когда необходимо, транслироваться в продукт гибридного (слитого) белка. Предпочтительно, если кассета имеет 3' и 5' концы, приспособленные для быстрой (легкой) вставки в вектор, например, она имеет сайты рестрикционной эндонуклеазы на каждом конце.
Хотя предпочтительно, когда антигенные конструкции продуцируют с применением методов генной инженерии, понятно, что конструкции могут синтезироваться любыми известными способами, такими как, например, химические способы. Это может быть особенно полезным там, где должны использоваться пептидные линкеры или где гидрофобная область включает остатки не встречающихся в природе аминокислот или им подобные. Таким образом, хотя предпочтительный вариант использует рекомбинантные способы (способы генной инженерии) для продуцирования антигенного гибридного белка, данное изобретение также предлагает способ, включающий: получение антигенных конструкций с помощью химических синтетических способов или с помощью рекомбинантных и химических способов и получение иммуногенной жидкой композиции, как описано выше.
Кроме предпочтительного пептидного линкера могут применяться и другие известные линкеры для присоединения антигена к гидрофобной области. Примеры таких линкеров включают, но не ограничиваются, полиэтиленгликолем, полисахаридами, полисиаловыми кислотами, янтарной кислотой, бутандионовой кислотой, адипиновой кислотой и стандартными поперечно-сшивающими агентами, как например, 8МРТ (4-сукцинимидилоксикарбонил-аметил-а-(2-пиридилдитио)толуолом), Э8Р (дитиобиссукцинимидилпропионатом), ЕС8 (этиленгликоль бис (сукцинимидилсукцинатом), 8МСС (4-сукцинимидилоксикарбонил-4-Щмалеимидометил)циклогексан-1-карбоксилатом) и 8РЭР (Ц-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионатом) (см.также Р1егсе са!а1од, Р1егсе С11е1шса1 Со., РоскГогб, 1Ь).
Согласно данному изобретению липосомы играют важную роль в доставке антигена, поскольку антигенлипосомный комплекс непосредственно присутствует в иммунной системе после удаления из циркуляции (кровообращения) клетками иммунной системы. Кроме того, выбор иммуностимуляторных путей может изменяться при изменении липидной композиции липосомы. Например, различные иммуностимуляторные молекулы, такие как Липид А (Акаио, К1ететтаи, 1993, 1. 1ттиио!1ег. 14:286), Р3С88 (Ьех е! а1,. 1986, 1. 1ттиио1. 137:2676), мурамилдипептид и трипептид-РЕ (Е1б1ет е! а1., 1981, РNА8 78:1680; АМид е! а1., 1985, Уассшек 4:166) и катионные липиды (^а1кет е! а1., 1992, РNА8 89:7915) могут включаться в липосому для стимулирования различных иммунологических путей. Другие адъюванты, такие как, например, МЕ59, Ош1 А, 0521 или квасцы могут использоваться в сочетании с антигенлипосомным комплексом. Кроме того, иммунорегуляторные молекулы, такие как цитокины, могут добавляться для того, чтобы добиться иммунной реакции (ответа).
Липосомы, практически применяемые в данном изобретении, можно получить из широкого разнообразия пузырек-образующих липидов, включая фосфатидиловые эфиры (простые и сложные), такие как фосфатидилэтаноламин (рйо8рйа!1бу1е1йаио1ат1ие, РЕ), фосфатидилсерин (рйокрйаббукетте, Р8), фосфатидилглице11 рин (ρйο5ρйаΐ^бу1д1усе^ο1, РО) и фосфатидилхолин (ρйο5ρйаΐ^бу1сйο1^ηе, РС); глицериды, такие как диолеоилглицеросукцинат; цереброзиды; ганглиозиды; сфингомиелин; стероиды, такие как холестерин; и другие липиды, а также другие наполнители, такие как пальмитат витамина Е или витамина С (см. также и.8. Рай Νοκ. 4235871;4762720; 4737323; 4789633; 4861597; и 4873089). Примеры РС-липидов включают, но не ограничиваются, (С-18)дистеароилфосфатидилхолином (б^5ΐеа^οу1ρйο5ρйаΐ^бу1сйο1^ηе, Э8РС); (С-16) дипальмитоилфосфатидилхолином (б^ρа1т^ΐοу1ρйο5ρйаΐ^бу1сйο1^ηе, ЭРСС); (С14) димиристоилфосфатидилхолином (б1тупкΙονΙρΙιοκρΙιαΙίάνΕΙιοΙίικ. ЭМРС); и (С-18, ненасыщенным) диолеилфосфатидилхолином (б^ο1еу1ρйο5ρйаΐ^бу1сйο1^ηе, ЭОРС). Предпочтительно, если липиды находятся в жидкой фазе при температуре тела (приблизительно 3839°С). Поэтому липиды с Тпл, выше температуры тела, такие как Э8РС и ЭРРС менее предпочтительны (но, тем не менее, могут еще быть пригодными). Липиды с Тпл ниже температуры тела, такие как ЭМРС или ЭОРС более предпочтительны. Кроме того, предпочтительно, если липидная композиция содержит не более 10% холестерина. Особенно предпочтительные жидкие композиции включают около 0-10% холестерина, около 0-15% РО и около 0-100% РС. В некоторых предпочтительных вариантах композиция может дополнительно включать около 1-10% адъюванта(ов); предпочтительно, если адъювант присутствует в количестве менее 5%.
Приготовление липосом хорошо известно. Обычно липосомы получают с помощью ряда различных способов, включая инъекцию этанола (ΒαΙζπ еΐ а1., 1973, Вюсйет. Вюрйук. Ас1а 298:1015); вливание эфира (Эеатег еΐ а1., 1976, Вюсйет. Вюрйук. Ас1а 443:629; 8сЫе^еη еΐ а1., 1978, Вюсйет. Вюрйук. Ас1а 542:137); удаление детергента (Κ;ιζιη, 1972, Вюсйет. Вюрйук. Ас1а 265:291); упаривание растворителя (Маΐ5итаΐο еΐ а1., 1977, 1. Οο11οίύ И'ИегГасе 8ск 62:149); упаривание органических растворителей из эмульсий, содержащих хлороформ и воду (КЕУ'к) (8ζοΙΚ·ι 1г. еΐ а1., 1978. Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 75:4194); экструзии МЬУ'к или ЕИУ'к через пиο1οοροΐ€ поликарбонатную мембрану (Ο1κοη еΐ а1., 1979, Вюсйет. Вюрйук. Айа, 557:9); замораживание и размораживание смесей фосфолипидов (Рюк, 1981, АгсЫуек οί Вюсйет. апб Вюрйукюк, 212:186), а также разрушение ультразвуком и гомогенизацию.
Липосомы принято распределять по размерам, и для обозначения типа обсуждаемой липосомы используют 3-х буквенный акроним. Мультиламеллярные пузырьки обычно обозначают как МЬУ (ти11бате11аг уе8ю1е). Мелколамеллярные пузырьки обозначают как 8ИУ (кта11 иш1ате11аг уемЭе) и крупноламеллярные пузырьки обозначают как ЬИУ (1а где иш1ате11аг νе5^с1е). Эти обозначения иногда следуют за химическим составом липосомы. По обсуждению номенклатуры и краткому описанию известных типов липосом см. 8Югш еΐ а1.,
1998, Р81Т, 1:19-31.
Данное изобретение предполагает применение липосомных композиций с соответствующим адъювантом. Однако данное изобретение также предполагает использование антигенной конструкции, которая не связана с липосомой, вместе с соответствующим адъювантом. Таким образом, вакцина или иммуногенная композиция содержит два компонента: антиген, соединенный с гидрофобной областью, и соответствующую адъювантную систему. Примеры потенциальных фармацевтически приемлемых систем носителей, которые могут использоваться, включают, но не ограничиваются липосомами, эмульсиями, адъювантом Фрейнда (полным или неполным), квасцами, 18СОМ8 и оболочечными вирусами (егке^реб ν^^и5е5).
Способы, описанные в изобретении, предусматривают применять иммунологически эффективное количество липосомной композиции, т. е. количество композиции должно быть таково, чтобы вместе с любыми добавленными наполнителями или носителями она приводила бы к заметному иммунологическому ответу (реакции) в хозяине. Если композиция будет использоваться в качестве вакцинной композиции, эффективное количество будет количеством, которое вместе с любыми добавленными наполнителями или носителями будет заставлять хозяина продуцировать специфический и достаточный иммунологический ответ (реакцию) с тем, чтобы защитить хозяина от последующего воздействия микроорганизма (профилактическая вакцинация) или защитить уже заболевшего хозяина (терапевтическая вакцинация).
Итак, в общем виде описанное изобретение будет лучше понято после детального описания примеров, которые приводятся в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения, если это не указано особо.
Примеры
Пример I - Н8У2. Получение Н8У2дЭ(123)-ТМ.
Ν-концевой сегмент из 23 аминокислот из дЭ протеина Н8У2 соединяли с сегментом трансмембраны (ТМ) химическим синтезом на автоматическом синтезаторе пептидов. Синтезированный пептид расщепляли стандартными методами расщепления с помощью НЕ и очищали препаративной НРЬС, используя \Уа1ег8 С18 колонку и 100% ацетонитрил с 0,1% ТЕА в качестве подвижной фазе. С помощью массспектрометрии и капиллярного электрофореза показано, что чистота пептида составила по крайней мере 95%.
Получение липосомы. Липосомы получали разрушением ультразвуком пробы (зонда) по ранее описанным методикам (ЕиЩ еΐ а1., 1997,
ВюсйешМгу 36:4959). Вкратце, липиды (с белком или без него) растворяют в органическом растворителе, например, хлороформе/метаноле. Тонкие липидные пленки создают при отборе пипеткой аликвот липидных растворов в круглодонные стеклянные трубки и упариванием растворителя при 65°С в токе азота. Пленки помещают в вакуум по крайней мере на 8 ч для удаления остаточного органического растворителя. Получение липосом достигается гидратированием липидных пленок буфером и инкубированием суспензии при 65°С в течени 5-10 мин перед разрушением пробы (зонда) ультразвуком. Далее для получения стерильного препарата липосомы фильтруют через 0,22 мкм фильтр. Липосомы разделяют по размерам с помощью динамического рассеяния света и образование агрегатов продолжается по крайней мере четыре недели.
Особенно предпочтительная липосомная Н8У2дЬ(1-23)-ТМ композиция имеет молярное соотношение 15:2:3 ОМРССйоЮМРб (димиристоилфосфатидилхолин : холестерин : димиристоилфосфатидилглицерин) с 2,5% (вес.) липида А.
Методики вакцинации и проверка индукции иммунного отклика (реакции) к вирусному антигену. ВАЬВ/с или С57ВЬ/6 самкам мышей (6-8-недельным) подкожно вводят один раз в неделю, в 2 течение 2-х, 3-х и 4-х недель препарат проверяемой вакцины или буфер. Места инъекции контролируют на побочные реакции, такие как развитие гранулем и/или образование струпа. Если животных подвергают иммунизации вакциной интраназально, им дают наркоз галотаном и композицию (10-20 мкл) вводят в ноздри при вдыхании с применением стерильного наконечника на микропипетторе (СаШсйап е! а1., 1993, 1. Ιηί. Όίκ. 168:622).
Через постоянные промежутки времени во время процедуры вакцинации и после контрольного вирусного заражения измеряют иммунный отклик (реакцию) мышей к вирусному антигену. Тест вирусной нейтрализации антитела проводят с использованием 24-луночного планшета, содержащего 1х105 ВНК клеток, к которым добавлены в различных разбавлениях мышиная сыворотка, смешанная с вирусом. После 48-72 ч инкубации при 37°С в СО2инкубаторе проверяют цитотоксичность клеточных монослоев и анализируют (определяют) титр нейтрализирующих антител. Осаждение антител на вирусе измеряют инкубацией в различных разбавлениях сыворотки с 5-10 мкг вирусного антигена или 25-50 мкл Н8У2 штамма (биомассы) (1х105 РРИ). Липосомы, содержащие антигенную детерминанту, также используют в качестве мишеней для проверки антител /ЕЫ8А, как описано ранее (Тико е! а1., 1993, Тгапкр1ап1а1юп 55:1375). Результаты последней проверки будут использоваться для измерения уровня свызывания и конфигураций изотипа антител.
Реакцию гиперчувствительности замедленного типа к вирусному антигену у вакцинированных мышей проверяют с помощью теста на припухлость стопы. Вакцинированным животным дают наркоз галотана и вводят 50 мкл инактивированных ультрафиолетом Н8У2 в одну заднюю стопу и 50 мкл лизированных незараженных клеток в другую заднюю стопу. Через 24, 48 и 72 ч измеряют степень припухлости стопы мышей с помощью штанген-циркуля Уегшег и сравнивают с измерениями фона. Активность Т-клеток данных животных также измеряют продуцированием цитокинов в ответ на инкубацию Т-клеток селезенки с вирусным антигеном. Селезенки удаляют из вакцинированных животных и гомогенаты селезенки получают осторожным разрушением селезенок стерильным пружинным штифтом и проталкиванием клеток через нейлоновое сито. Клеточные суспензии промывают и помещают на планшет при 1х106 клеток/лунке в 96-луночном титрационном микропланшете. После инкубации клеток при 37°С в течение 3-4 дней с различными количествами вирусного антигена собирают супернатанты из лунок и проверяют на присутствие цитокинов. Для определения профиля цитокина (ГЬ-2, Ш-4, 1Ь-6, 1Ь-10, 1Ь-12, ΙΡΝ-γ, βактин и Т№-а из РйагМтдеп, 1пс. (8ап О|едо, СА)) используют коммерчески доступные ЕЫ8А наборы цитокина. Определение белка цитокина в тканях культуры супернатантов с помощью сэндвич-ЕЫ8А проводят моноклональными антителами (шАЬ) специфичными для отдельных цитокинов. Вкратце, ЕЫ8А планшеты сенсибилизируют в течение ночи тАЬ крыс против цитокина мышей. Планшеты блокируют 3% сывороткой эмбрионального теленка в РВ8 в течение 2 ч, далее аликвоты каждого проверяемого образца прибавляют к каждой лунке. Цитокинспецифические биотинилированные тАЬ крыс против мышей прибавляют к каждой лунке, за которым следует авидинпероксидаза. Цветную реакцию достигают добавлением колориметрических субстратов. Планшеты прочитывают в ЕЬ18А спектрофотометре и вычисляют концентрации цитокина с помощью стандартной кривой, полученной из контрольных рекомбинантных цитокинов.
Модель энцефалита Н8У2 мышей для проверки липосомных преператов вакцины. Вакцинированных и невакцинированных (контрольных) ВАЬВ/с самок мышей (10-12 недельных) контрольно внутриперитонеально заражают летальной дозой (1х105 РРИ) пассированных Н8У2 головного мозга. Данные мыши контрольно зараженные интравагинально летальной дозой Н8У2 вначале предварительно обрабатывают подкожным эстрогеном одну неделю до контрольного заражения и день (-1) до кон трольного заражения. Им далее дают наркоз внутриперитонеальным введением ацепромазина и кетамина. Н8У2 (10-30 мкл) затем вводят интравагинально с использованием стерильного наконечника на микропипетторе после первого влагалищного мазка сухим Са1дк\\'аЬ (МсОегто!! е! а1., 1984, 1. νίτοί. 51:747). Животных контролируют в течение 80 дней после контрольного заражения на выживание (ежедневно), потерю веса (через день в течение первых двух недель и далее раз в неделю), появление налета на языке и нейрологических симптомов (уменьшенный уровень активности, задержка движения или паралич конечностей).
Пролиферация антиген-индуцированных
Т-клеток. Сенсибилизацию клеток хозяина к дВ антигену измеряют с помощью анализа с использованием пролиферации антиген-индуцированных Т-клеток. Гомогенаты селезенки получают осторожным разрушением селезенок стерильным пружинным штифтом и проталкиванием клеток через нейлоновое сито. Клетки суспендируют в КРМ1 1640 среде, содержащей 10% сыворотку эмбрионального теленка (Се!а1 са1Г кегит, ЕС8), 10 тМ Нерек буфер, Ьглутамин (2 тМ), пенициллин (25 ΐυ/мл) и стрептомицин (25 мкг/мл). Клетки культивируют при концентрации 1х106 клеток/мл без или с (5-20 мкг/мл) в 96-луночных планшетах с иобразными лунками в течение 4 дней в 5% СО2. Культуры подвергают действию импульсов с 20 мкл ресазуринового красителя в течение 3 ч и далее измеряют флуоресценцию на Су!оДиог II (РегкресДуе Вюкук!етк, 1пс., Еаттшд!ои, МА).
Цитокин-специфический мРНК анализ. Тклетки иммунизированных и неиммунизированных животных исследуют на цитокинспецифические мРНК уровни основных цитокинов, которые могут осуществлять рефлекторную реакцию сенсибилизации, связанную с иммунизацией, включающую 1Ь-2, ΙΝΡ-γ, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь6, 1Б-10. Т-клетки получают из селезенки, как описано ранее. Полную РНК выделяют с помощью модификации (Сокета е! а1., 1995, Ыуег Тгапкр1. 8игд. 1:16) метода, описанного СТотс/уикку и 8ассЫ (Скотс/уикку е! а1., 1987, Аиа1у!. ВюсЬет. 162:156). Свежие или замороженные клетки (2х106) разрушают в 1 мл денатурированного раствора (4 тМ тиоцианата гуанидина, 25 тМ цитрата натрия (рН 7,0), 0,5% саркозила и 0,1 тМ 2-меркаптоэтанола). РНК осаждают инкубацией с одним объемом изопропилового спирта в течение ночи при -20°С. Концентрацию полной РНК доводят до 260 нМ и образцы хранят при -80°С до тех пор, пока их анализируют.
Анализ цитокина проводят, используя модификацию метода, описанного Сокета е! а1. (Сокета е! а1., 1995, Ыуег Тгапкр1. 8игд. 1:16). Одноцепочечную кДНК получают транскрипцией 2 мкг полной РНК в 20 мкл полной реакционной смеси, используя птичий вирус миело идного лейкоза обратной транскриптазы (ВоеЬпидег Маппйе ίιη. 1ий1аиаро11к, ΙΝ). Последовательность специфических олигонуклеотидных праймеров цитокинов мышей (табл. 1) используют для амплификации ДНК-фрагментов заранее определенного размера для каждого из представляющих интерес генов цитокина.
Таблица1
Олигонуклеотидные праймеры, используемые для полуколичественного анализа цитокинов от мышей
Олигонуклеотид Последовательность нуклеиновой кислоты Размер ожидаемой мишени
1Ь-2 5’ Т0АТ00САССТАСА06А0СТССТ0А0 (8Еф ΙΟ ΝΟ. 1) 167 Ьр
3’ ОАОТСАААТССАОААСАТОССОСАО (5Еф ГО ΝΟ. 2)
1Е-4 5' ССААОААСАССАСАОАОАОТОАОСТ (8ЕО ГО ΝΟ. 3) 180 Ьр
3' ОАСТСАТТСАТСОТССАОСТТАТСО (8Еф ГО ΝΟ. 4;
1Б-5 5' АТОАСТОТОССТСТОТОССТОСАОС (8Εζ) ΙΟ ΝΟ. 5) 242 Ьр
3' сти 11111ССТООАОТАААСТОООО (ЗЕф ГО ΝΟ. 6)
1Ь-6 5’ ТООАОТСАСАОААООАОТООСТААО (8Е0 ГОМО. 7) 154 Ьр
з· ТСТОАССАСАОТОАООААТОТССАС (8Еф ГО ΝΟ. 8)
1Ы0 5’ ТСАААСАААССАССАССТООАСААСАТАСТОС (8Ер Ю ΝΟ. 9) 426 Ьр
3’ СТОТСТАООТССТОСАОТССАССАОАСТСАА (8ЕО ГО N0. 10)
1Ы2 5’ ТСССАСС АААССААСАТ6ТС (8ЕС? ГО N0.11) 315 Ьр
3' ОАОСАОСАОАТОТОАОТООС (8Е0 ГО ΝΟ. 12)
ΓΝΡ 5' АОСООСТСАСТОААСТСАОАТТОТАС (8Е0 ΙΟ ΝΟ. 13) 843 Ьр
3’ 6ТСАСА0ТТТТСА0СТСТАТА00С (8Е0 10 N0. 14)
ΓΝΕ-α 5' СОСАООТСТАСТТСОАОТСАТТОС (5Е0 10 N0. 15) 307 Ьр
3' АСАТТСОАООСТССАОТОААГГСОО (5Е0 [0 N0. 16)
□ - 5' ТСОААТССТОТООСАТССАТОАААС (ЗЕО10 ΝΟ. 17) 348 Ьр
актин 3' ТААААСОСАССТСАСТААСАОТССО (5Е0 Ю N0. 18)
РСК смесь содержит 1 мкл кДНК, 2,5 мкл РСК 10х буфер, 1 мкл каждого из 5' и 3' праймеров, 2,5 мкл 10хйКТРк (2 ммоль/л) и 0,125 мкл Т. асцк-Шсик термостабильной ДНК-полимеразы (ВоеЬпидег Маиикет) в конечно объеме - 25 мкл. Специфические β-актиновые праймеры используют для амплификации 548 Ьр фрагмента в качестве внутреннего контроля. РСК смесь покрывают минеральным маслом и амплификацию проводят после инкубации смеси в течение 7 мин при 94°С, 38 циклов с денатурацией при 94°С в течение 30 с, ренатурацию праймера при 60°С в течение 45 с, удлинение при 72°С в течение 60 с и инкубация при 72°С в течение 7 мин. РСК продукты разделяют на агарозном геле в присутствии этидиний бромида. Полосы делают видимыми в УФ-свете, фотографируют и количественно определяют денситометрическим методом по фотографии, используя программный пакет Мо1еси1аг Аиа1ук! (Вю-Кай, КюЬтоий СА).
Измерение цитокина с помощью ЕЫ8А. Коммерчески доступные ЕЫ8А наборы цитокина используют для определения профиля цитокина, секретируемого СЭ4' Т-клетками селезенки, выделенными из иммунизированных и неиммунизированных животных. Определение белка цитокина в супернатантах тканевой культуры из Т-клеток селезенки помощью сэндвичЕЫ8А проводят, применяя моноклональные антитела (тАЬ), специфичные для определенных цитокинов. Вкратце, ЕЫ8А платшеты покрывают в течение ночи тАЬ крыс против цитокина мыши. Планшеты блокируют 3% ЕС8 в РВ8 в течение 2 ч, далее аликвоты каждого образца прибавляют в каждую лунку. Цитокинспецифические биотинилированные тАЬ крыс против мыши прибавляют к каждой лунке, за которым следует авидинпероксидаза. Цветную реакцию достигают прибавлением колориметрических субстратов. Планшеты прочитывают в
ЕЫ8А спектрофотометре и вычисляют концентрацию цитокина из стандартной кривой, полученной из контрольных рекомбинантных цитокинов.
Анти-Н5У2 СТЬ отклики. После вакцинации определяют присутствие антигенспецифических цитотоксических Т лимфоцитов (СТЬ) в Т-клетках селезенки. Лимфоциты селезенки получают, как описано ранее. Лимфоциты из каждой обработанной группы, собирают (п=5) и далее культивируют в течение 3 дней без антигена при 107 клеток/лунке в 12-луночных культуральных планшетах. ЕЬ-4 (Н2Ь) клеткимишени (АТСС) инкубируют с пептидом, относящимся к Н8У2 дВ СТЬ эпитопу, расположенному между остатками 495-505 (Напке е! а1., 1991, I. У1го1. 65:1177) Н2Ь рестриктированных клеток и инкубируют в течение 4 ч при 37°С. Мишени промывают и к каждой лунке прибавляют 100 мкл титров, содержащих 1х104 клеток. Эффекторные лимфоциты промывают, прибавляют к лункам при различных концентрациях и культивируют в течение 4 ч при 37°С. Используя набор Су!оТох 96 (Рготеда, Маб1коп \Ι), процент специфического лизиса вычисляют из супернатантной лактатдегидрогеназы (1ас!а!е бейубгодепаке, ЬИН), измеренной в стандартном спектрофотометре для прочтения ЕЫ8А планшетов (НТ8 7000 +ВюАккау Кеабег, Регкш Е1тег, 8ап 1оке, СА), регистрируя абсорбцию при 490 нм. Определение Н8У2-антигенспецифического лизиса производят по стандартным критериям. Данные выражают в виде процента специфического лизиса = 100х [(экпериментальное - эффектор спонтанный - мишень спонтанная) /мишень максимальная - мишень спонтанная)].
Результаты
Кривая выживания, представленная на фиг. 1, демонстрирует эффективность липосомного пептида в защите мышей от систематического заражения летальной дозой Н8У2, а также установления количества инокуляций (вакцинаций, прививок), необходимых для достижения 100% защиты. Фиг. 1 показывает количество доз липосомной Н8У2§П(1-23)-ТМ вакцины, требуемых для защиты ВАЬВ/с мышей от летального заражения Н8У2. Группам из 7 мышей давали 2, 3 или 4 иммунизации до заражения летальной дозой Н8У2. Четырьмя вакцинациями животные, иммунизированные липосомной вакциной, не проявляли нейрологических осложнений, связанных с заражением Н8У2, никаких других симптомов инфекции не обнаруживалось на протяжении исследования. Наиболее существенно, что все мыши выживали при летальном заражении Н8У2. Двумя или тремя еженедельными иммунизациями защищали менее 100% мышей. Наоборот, мыши, получившие четыре вакцинации плацебо (т.е. буфера) не защищались от заражения Н8У2.
Липосомную Н8У2§Э(1-23)-ТМ также проверяли на трех группах С57ВБ/6 мышей и было найдено, что добиваются аналогичных защитных эффектов, сравнимых с результатами, полученными с ВАЬВ/с мышами. В табл. 2 суммировали данные результаты. Группу 1 мышей вакцинировали на 1-ой и 4-ой неделях подкожно; группу 2 мышей вакцинировали на 1 неделе подкожно и на 4 неделе интраректально; и группу 3 мышей (контрольная группа) оставили без вакцинаций. Через неделю после последней вакцинации (на 4 недели), мышей заражали внутриперитонеально летальной дозой Н8У2 и контролировали в течение трех недель заболеваемость и смертность. Что касается ВАЬВ/с мышей, группы мышей, получающие вакцинации липосомной Н8У2§П(1-23)-ТМ имели значительные количества оставшихся в живых, если их вакцинировали или подкожным введением, или если вводили дозу подкожной сенсибилизации, за которой следуют бустеринъекции в слизистую оболочку.
Таблица 2 Сводка результатов, сравнивающих выживание С57В176 мышей при различных лечениях вакцинацией липосомной Н8У2§О(1-23)-ТМ
Группа Лечение вакцинацией Выживание (п=7)
1 Неделя 1 - подкожно Неделя 4 - подкожно 6/7 (86%)
2 Неделя 1 - подкожно Неделя 4 - интраректально 5/7 (71%)
3 Контроль (без вакцинации) 1/7(14%)
На фиг. 2 показано сравнение липосомной Н8У2§П(1-23)-ТМ с другими методами представления антигена. Каждой группе из 7 мышей давали 4 иммунизации до заражения летальной дозой Н8У2. К тому же, четыре вакцинации липосомной Н8У2§Ь(1-23)-ТМ вакциной приводят к 100% защите мышей от летальной дозы Н8У2. Четыре иммунизации нелипосомной Н8У2§П(1-23)-ТМ или липосомами без Н8У2§П(1-23)-ТМ не обеспечивают существенную защиту от летального заражения с Н8У2. Это отчетливо демонстрирует, что и липосома, и белковые компоненты, полученные генной инженерией, должны связываться друг с другом для достижения эффективного иммунного ответа (реакции). Особенно важным является открытие, что липосомная Н8У2§П(1-23)-ТМ вакцина обеспечивает значительно лучшую защиту, чем иммунизация термоинактивированным вирусом, поскольку полагают, что противовирусные вакцины обычно дают хороший стимул для иммунного ответа (реакции) (Пекгоыегк, 1992, ΛΙΩ8 Кек. Нит. Ке!гоу1г. 8:1457).
В конце исследования мышей приносили в жертву и собирали сыворотку для установления природы иммунного ответа (реакции) в это время. Найдено, что сыворотка вакцинированных мышей содержит высокие титры антител (1:100), что в частности, признает использование пептида для стимуляции иммунного ответа (реакции) и, кроме того, вызванное осаждение активного вируса, предполагающее, что антите19 ла узнают эпитоп на поверхности вируса. Антитела также осаждают Н8У2дО(1-23)-ТМ липосомы, а не липосомы без пептида, предполагая, что они узнают, в частности др эпитоп Н8У2.
В табл. 3 представлена сводка иммунологических анализов, демонстрирующих, что липосомная Н8У2дО(1-23)-ТМ, введенная подкожно один раз в неделю в течение четырех недель, генерирует более сильный иммунный ответ (реакцию) по сравнению со стандартными адъювантами. Вакцинация антигеном, смешанным с неполным адъювантом Фрейнда или квасцами, не могла обеспечить мышам защиту от вирусного заражения. Данные получали из теста нейтрализующего антитела и реакцию гиперчувствительности замедленного типа проводили параллельно данным выживания с наиболее высоким титром антитела (гуморальная иммунная реакция) и наблюдали наибольшую степень припухлости стопы (Т-клеточная иммунная реакция) для липосомной Н8У2дЭ(1-23)ТМ группы. Другое важное преимущество, связанное с лечением липосомной Н8У2дЭ(1-23)ТМ заключалось в том, что в отличие от результатов у мышей, получивших неполный адъювант Фрейнда с антигеном, не было раздражения или воспаления в месте инъекции у любой из мышей (17/17 наблюдалось покраснение в месте инъекции с неполным адъювантом Фрейнда против 0/17 для липосомной Н8У2дЭ (1-23)-ТМ). Если применяли квасцы, у 17/17 мышей развивались осязаемые гранулемы в месте инъекции. Наоборот, липосомная Н8У2дО(1-23)-ТМ не вызывала образования гранулем у любой из мышей. В заключении данные результаты наводят на мысль, что В и/или Т-клеточные иммунные реакции (судя по титрам нейтрализующих антител и степени припухлости стопы) приводят к защитной иммунной реакции, вызванной липосомной Н8У2дО(1-23)-ТМ у мышей к летальной дозе Н8У2.
Таблица 3
Сводка результатов, сравнивающих иммунологические ответы (реакции) липосомной Η3ν2βύ(1-23)-ΤΜ, неполного адъюванта Фрейнда, смешанного с Н8У2$»О(1-23)-ТМ; квасцов, смешанных с Н8У2дО(1-23)-ТМ; и контрольной группы с введенным РВ8
Лечениевакциной Выживание мыши количество мышей в группе Титр нейтрализующих антител: дни заражения % припухлости стопы относительно контрольных мышей
Липосомная Н8У2§О(1-23)-ТМ 5/7 1:1638 8%
Неполный адъювант Фрейдна с 0/7 1:717 3%
Н8У2в1Х1-23)-ТМ антигеном
Квасцы, смешанные с 0/7 1:1024 5%
Н8У2дЕ>(1-23)-ТМ
Забуференный фосфатом 0/7 1:486 0%
физиологический раствор
Пример П-Н8У2. Получение Н8У2дЭ (123)-НО.
Конструкцию гена, кодирующую Н8У2дЭ (1-23)-НЭ генерировали с помощью перекрывающих олигонуклеотидов, кодирующих дЭ эпитоп, соединенный с гидрофобной областью (НО) из 45 аминокислот. Конструкцию создавали удачным удлинением и амплификацией кодирующей области гена. Ген затем лигировали в рТтсН18 экспрессирующий вектор и проверяли исследованием последовательности. Исследование экспрессии в малом масштабе инициировали индукцией 1 тМ 1РТС и подтверждали анализом вестерн-блоттинга с применением антител мыши, генерируемых при исследованиях вакцинации липосомной Н8У2дЭ(1-23)-ТМ. Белок также анализировали с помощью 8Ό8РЛСЕ и находили полосы, которые соответствовали предполагаемому молекулярному весу (~6 кО), судя по окраске Кумасси. Продемонстрировав, что предполагаемый белок экпрессировал в малом масштабе, серию ферментации завершали в 10 л с Е. со11, содержащих рТгсН15/Н8У2дО(1-23)-НО конструкцию, которая давала примерно 60 г клеточной пасты. После индукции экспрессию Н8У2дО(1-23)-НО проверяли вестерн-блоттингом во время ферментации. Бактерии из примерно 30 г клеточной пасты лизировали с помощью Етепсй Ргезз в буфере, содержащем 1% дезоксихолата и 5 тМ имидазола. После центрифугирования осадка клеточного дебриса, Н8У2дО(1-23)-НО нашли преимущественно в водорастворимом супернатанте.
Очистка достигалась при пропускании супернатанта, содержащего растворимый
Н8У2дО(1-23)-НО белок, через колонку с никельсодержащей сефарозой. Колонку успешно промывали растворами, содержащими 5 тМ имидазола, 200 тМ имидазола и далее 5 тМ имидазола с 1% дезоксихолата, для удаления всех остаточных белков. Н8У2дО(1-23)-НО белок окончательно элюировали 200 тМ имидазола, раствором 1% дезоксихолата. Пиковые фракции определяли 8О8-РЛОЕ окрашенным Кумасси и вестерн-блоттингом. Все пиковые фракции, содержащие Н8У2дО(1-23)-НО, собирали и концентрировали с помощью М1Шроте иИтаргер концентратора. Показано, что конечный концентрат содержал чистый Н8У2дО(123)-НО, судя по присутствию единственной полосы на 8О8-РЛОЕ геле, окрашенном Кумасси. Из этого первого опыта получили примерно 2-3 мг Н8У2дО(1-23)-НО для исследования липосомной композиции и вакцинации.
Липосомный препарат и процедуры вакцинации, проверка индукции иммунного ответа (реакции), модель энцефалита Н8У2 мыши, пролиферация антиген-индуцированных Тклеток, цитокин-специфический анализ мРНК, измерения ЕЬ18Л цитокина и анти-Н8У2 СТЬ реакции были, по существу, такими, как описано в примере I.
Результаты. Кривая выживания, представленная на фиг. 3, показывает способность
Н8У2дО(1-23)-НО вызывать защитную иммунную реакцию. Процент выживания с помощью данной особой композиции достигал 40%. Для сравнения, буфером обработанные контрольные животные не оставались в живых, в то время как
Н8У2дР(1-23)-ТМ контрольная группа имела 100% выживаемость.
Пример 111-Н1У. Получение Н1У (др120НР) и Н1У(Адр120-НР) в СО8-1 клетках.
Для конформационного изучения эпитопа получают др 120 последовательность из рНХВ2-епт плазмиды, содержащей др160 ген (ΝΜ АГО8 Кекеагсй апб Кеадеп! Ргодгат, КосктШе, МР) при амплификации плазмидной ДНК с РСК и субклонированием 1536-Ьр продукта для секвенирования с помощью дидезоксинуклеотидного метода. Используя 5' («кепсе») праймер, соответствующий первым 21-Ьр Н1У 120 гена АТСАСАСТСААССАСАААТАТ и 3' («апйкепсе») праймер, соответствующий нуклеотидам 1515 до 1536 ТССТСТТТТТТСТСТСТССАС, удаляющих Н1У др41 белок, др120 сегмент клонируют и амплифицируют РСК. Кроме того, каждый праймер фланкируют (ограничивают) удобными сайтами фермента рестрикции для того, чтобы совместить множественные клонирующие сайты рс^NА4-Н^к экспрессирующего вектора. РСК продукт лигируют в рс^NА4-Н^к. содержащий НО область в виде плазмиды кассеты гена (депе саккеИе р1акпий) (1пу|1годеп, 1пс. 8ап О|едо, СА). Делеционные мутанты создают с помощью РСК амплификации, используя две 5' и 3' праймерные пары, которые исключают нуклеотиды, кодирующие остатки в др120 белке; они включают А136-151др120, А128-194др120 и А123-203др120. Праймеры содержат удобные последовательности фермента рестрикции, предусматривающие лигирование двух продуктов гена. Каждую мутацию, следовательно, замещают двумя аминокислотами, кодируемыми специфическим представляющим интерес сайтом рестрикции. Конечные гены проверяют секвенированием ДНК с применением схемы и реагентов из набора Ан1оСус1е (Атегкйат Рйагтас1а Вю1ес11, Р|кса1а\уау, ΝΊ) и результаты проводят на наборе АЬРЕхргекк (АтегкЬат Рйагтааа Вю1ес11, Р|кса1а\уау, ΝΊ) аппарате секвенирования и анализируют АМ программным обеспечением ν.3.02 (АтекЬат Рйагтааа Вю1ес11, Р1кса1а\уау, ΝΊ). Плазмиды трансфектируют в СО81 клетки (АТСС, КосктШе, МР) с помощью реагента РЕАЕ-декстрана. Стабильные трансфектанты собирают с помощью 2еосш (1пт11годеп, 1пс., 8ап О|едо, СА) и клонируют ограниченным разведением. др120-НР белки очищают селективным сродством к никелю, связанному с твердым носителем. Клоны, которые продуцируют высокие уровни белка, оценивают вестерн-блоттингом или РАС8 анализом. Гистидиновый линкер Н1У(др120)-НР, Н1УА136151др120, НТУА128-194др120 и Н1УА123203др120 удаляют расщеплением энтерокиназой после того, как закончена очистка. Если необходимо, выполняют исключение размера (численности), ионный обмен или хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующей очисткой Н1Удр120-НР и Н1УАдр120-НЬ белков.
Получение Н1У-НР. Нуклеотидную последовательность, объединяющую три эпитопа (СТЬ) Т-клетку-хелпер и В-клетку), отбирают из последовательностей, найденных в различных НРУ белках (ΚΟΙΙΝΜ АОНУОКАМУАСТКР NΥNККККШIСРСКАΡΥТТК (БЕф ΙΡ Νθ. 19)) и получают из последовательности данного белка, используя преимущества Е.соБ кодона (Ьоотап е! а1., 1987, ЕМВО ί. 6:2489). Синтетические гены, кодирующие Н1У последовательность, собирают синтезом, гибридизацией, РСК и лигированием при перекрывании олигонуклеотидов. Собранный ген полной группы, кодирующий НРУ фрагменты, амплифицируют с помощью РСК и затем лигируют в экспрессирующую плазмиду. Конечные гены проверяют секвенированием ДНК.
ШУ-НР-со держащие рТгсН|к плазмиды трансформируют в Е.соБ. Бактерии инкубируют в ЬВ среде с ампициллином (50 мкг/мл) при 37°С до «мид-лог» фазы. Во время оптимальной экспрессии клетки собирают центрифугированием. Клеточный дебрис лизируют (разрушают) и центрифугируют. Лизат анализируют на присутствие белка. Н1У-НР-белки очищают с помощью селективного сродства к никелю, связанному с твердым носителем. Если необходимо, можно проводить исключение размера (численности), ионный обмен или хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующей очисткой НРУ-НР.
Получение липосомы. Липосомы получают воздействием ультразвука на зонд согласно ранее описанным процедурам (Рнщ е! а1., 1997, Вюсйетщйу 36:4959). Вкратце, липиды (с белком или без) растворяют в органическом растворителе, таком как хлороформ/метанол. Тонкие липидные пленки создают при отборе пипеткой аликвот липидных растворов в круглодонные стеклянные трубки и упариванием растворителя при 65°С в токе азота. Пленки помещают в вакуум, по крайней мере, на 8 ч для удаления остаточного органического растворителя. Получение липосом достигается гидратированием липидных пленок буфером и инкубированием суспензии при 65°С в течение 5-10 мин перед разрушением пробы (зонда) ультразвуком. Далее для получения стерильного препарата липосомы фильтруют через 0,22 мкм фильтр. Липосомы разделяют по размерам с помощью динамического рассеяния света и образование агрегатов продолжается по крайней мере четыре недели.
Процедуры вакцинации и проверка индукции иммунного ответа (реакции) к вирусному антигену. ВАЬВ/с самок мышей (6-8-недельных) подкожно вакцинируют 1, 4 и 8 недели препаратом проверяемой вакцины или буфером.
Места инъекции контролируют на побочные реакции, такие как развитие гранулем и/или об23 разование струпа. Когда животных подвергают иммунизации вакциной интраназально, или дают наркоз галотаном, проверяемый продукт (1020 мкл) вводят в ноздри при вдыхании с применением стерильного наконечника на микропипетторе (СаШсйаи е! а1., 1993, 1. 1иГ. И1к. 168:622).
Измерение гуморальных иммунных ответов с ЕЬ18А. Через постоянные промежутки времени во время процедуры вакцинации (например, 1х в неделю), измеряли иммунный отклик (реакцию) мышей к вирусному антигену. Липосомы, содержащие антигенную детерминанту, также используют в качестве мишеней для анализа антитело / ЕЫ8А, как описано ранее (Тико е! а1., 1993, Тгаикр1аи!а!юи 55:1375). Результаты последней проверки используют для измерения уровня связывания и конфигурации изотипа антител.
Анализ гиперчувствительности замедленного типа (бе1ауеб !уре йурегкеикфуйу, ИТН). ИТН ответ к вирусному антигену у вакцинированных мышей проверяют с помощью теста на припухлость стопы. Вакцинированным животным дают наркоз галотана и вводят 50 мкл липосомного антигена или свободного антигена в одну заднюю стопу и 50 мкл буфера в другую заднюю стопу. Через 24, 48 и 72 ч измеряют степень припухлости стопы мышей с помощью штангенциркуля Уегшег и сравнивают с фоновыми изменениями.
Цитокин-специфический анализ мРНК. Тклетки иммунизированных и неиммунизированных животных исследуют на цитокинспецифические мРНК уровни основных цитокинов, которые могут осуществлять рефлекторную реакцию сенсибилизации, связанную с иммунизацией, включающую 1Ь-2, ΙΕΝ-γ, 1Ь-4, 1Ь5, 1Ь-6 и Ι6-10. Т-клетки селезенки выделяют, как описано ранее, через 1 и 4 недели после иммунизации. Полную РНК выделяют с помощью модификации (Сокеиха е! а1., 1995, Шег Тгаир1. 8игд. 1:16) метода, описанного СНотсхуикку е! а1., 1987, Аиа1у!. ВюсНет. 162:156. Свежие или замороженные клетки (2х106) разрушают в 1 мл денатурированного раствора (4 тМ тиоцианата гуанидина, 25 тМ цитрата натрия (рН 7,0), 0,5% саркозила и 0,1 тМ 2-меркаптоэтанола). РНК осаждают инкубацией с одним объемом изопропилового спирта в течение ночи при -20°С. Концентрацию полной РНК доводят до 260 иМ и образцы до проведения анализа хранят при -80°С.
Анализ цитокина проводят, используя модификацию (Сокеиха е! а1., 1995, Шег Тгаикрк 8игд. 1:16) метода, описанного СНотсхуикку е! а1., 1987, Аиа1у!. ВюсНет. 162:156. Одноцепочечную кДНК получают транскрипцией 2 мкг полной РНК в 20 мкл полной реакционной смеси, используя птичий вирус миеломного лейкоза обратной транскриптазы (ВоеНпидег Маиийет, 1иб1аиаро11к, ΙΝ). Последовательности специфи ческих олигонуклеотидных праймеров цитокинов мышей (табл. 1) используют для амплификации ДНК-фрагментов заранее определенного размера для каждого из представляющих интерес генов. РСК смесь содержит 1 мкл кДНК, 2,5 мкл РСР 10х буфер, 1 мкл каждого из 5' и 3' праймеров, 2,5 мкл 10хб№ГР8 (2 ммол/л) и 0,125 мкл Т.ас.|иаЦсик термостабильной ДНКполимеразы (ВоеНпидег МаииНет!) в конечном объеме - 25 мкл. Специфические Р-актиновые праймеры используют для амплификации 548 Ьр фрагмента в качестве внутреннего контроля. РСР смесь покрывают минеральным маслом и амплификацию проводят после инкубации смеси в течение 7 мин при 94°С, 38 циклов с денатурацией при 94°С в течение 30 с, ренатурацию праймера при 60°С в течение 45 с, удлинение при 72°С в течение 60 с и инкубация при 72°С в течение 7 мин. РСР продукты разделяют на агарозном геле в присутствии этидиний бромида. Полосы делают видимыми в УФ-свете, фотографируют и количественно определяют денситометрическим методом по фотографии, используя программный пакет Мо1еси1аг Аиа1ук! (Вю-Раб, РюНтоиб, СА).
Измерение цитокина с помощью ЕЫ8А в Т-клетках селезенки. Активность Т-клеток данных животных также измеряют продуцированием цитокинов в ответ на инкубацию Т-клеток селезенки с вирусным антигеном. Селезенки удаляют из вакцинированных животных и гомогенаты селезенки получают осторожным разрушением селезенок стерильным пружинным штифтом и проталкиванием клеток через нейлоновое сито. Клеточные суспензии промывают и помещают на планшет при 1х105 клеток/лунке в 96-луночном титрационном микропланшете. После инкубации клеток при 37°С в течение 3-4 дней с различными количествами вирусного антигена собирают супернатанты из лунок и проверяют на присутствие цитокинов. Коммерчески доступные ЕЫ8А наборы цитокина используют для определения профиля цитокина. Определение белка цитокина в супернатантах тканевой культуры с помощью сэндвич-ЕЫ8А проводят с применением моноклональных антител (тАЬ), специфических для определенных цитокинов. Вкратце, ЕЬ18А планшеты покрывают в течение ночи тАЬ крыс против цитокина мыши. Планшеты блокируют 3% сывороткой эмбрионального теленка в РВ8 в течение 2 ч, далее аликвоты каждого образца прибавляют в каждую лунку. Цитокин-специфические биотинилированные тАЬ крыс против мыши прибавляют к каждой лунке с последующим прибавлением авидинпероксидазы. Цветная реакция достигается прибавлением колориметрических субстратов. Планшеты прочитывают в ЕЬ18А спектрофотометре и вычисляют концентрацию цитокина из стандартной кривой, полученной из контрольных рекомбинантных цитокинов. Все наборы ЕЬ18А цитокинов (1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь25
10, Ш-12, ΣΕΝ-γ и ΤΝΕ-α) куплены в Р^М^де^ Шс. (8аη ^^едο, СА).
Пролиферация антиген-индуцированных Т-клеток. Сенсибилизацию хозяина к ШУ антигенам измеряют с помощью пролиферации антиген-индуцированных Т-клеток. Гомогенаты селезенки выделяют, как описано ранее. Клетки суспендируют в КРМГ 1640 среде, содержащей 10% ЕС8, 10 тМ Нерек буфер, Ь-глутамин (2 тМ), пенициллин (25 ГО/мл), стрептомицин (25 мкг/мл) и гентамицин (80 мкг/мл). Клетки культивируют при концентрации 1х106 клеток/мл с ШУ-НО пептидом (5 мкг/мл) или без него в 96луночных планшетах с ϋ-образными лунками в течение 3-4 дней в 5% СО2. Культуры подвергают действию импульсов 20 мкл ресазуринового красителя в течение 3 ч и далее измеряют флуоресценцию на ΟνΙοΠιιοΓ II (РегкерШ'е Είοкукΐетк, Шс., Еат-иидти МА).
Анти-ШУ СТЬ отклики. После вакцинации определяют присутствие антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЬ) в Тклетках селезенки. Лимфоциты селезенки получают, как описано ранее. Лимфоциты из каждой обработанной группы собирают (η=5) и далее культивируют в течение 3 дней без антигена при 107 клеток/лунке в 12-ти луночных культурных планшетах. Клетки мишени Ь5198У лимфомы (Н2б) (АТТС) инкубируют с пептидом, относящимся к ШУ СТЬ эпитопу Н2б рестриктированных клеток и инкубируют в течение 4 ч при 37°С. Мишени промывают и к каждой лунке прибавляют 100 мкл титров, содержащих 1х104 клеток. Эффекторные лимфоциты промывают, прибавляют к лункам при различных концентрациях и культивируют в течение 4 ч при 37°С. Используя набор СуФ^х 96 (Рготеда, Маб^кοη VI), процент специфического лизиса вычисляют из супернатантной лактатдегидрогеназы (ЬОН), измеренной в стандартном спектрофотометре для прочтения ЕЫ8А (НТ8 7000 + ВюАккау Кеабег, Регкш Е1тег, 8аη Шке, СА), регистрируя абсорбцию при 490 нм. Определение Н8У2-антигенспецифического лизиса производят по стандартным критериям. Данные выражают в виде процента специфического лизиса = 100х[( экспериментальное - эффектор спонтанный - мишень спонтанная)/мишень максимальная - мишень спонтанная)].
Пример ГУ. Вирус гриппа (ЮТУ).
Получение ЮТУ-НО. Нуклеотидную последовательность выбранных эпитопов получают из белковой последовательности, используя преимущества Е.отН кодона (Οοοιικιη еΐ а1., 1987, ЕМВО Σ. 6:2489). Последовательность(и), вставленная в кассету гена, относится к эпитопам из №(147-161, ТУрКТКАЬУКТбМОР; 55-59 (8ЕС) ГО Νο. 20), К1.Ю\81.ТШК\1\Т8 (8ЕО ГО Νο.21)) и НА (91-108, ЖАЕ^СУРУОУРО УА8Ь (8ЕО ГО Νο. 22)). Комбинация эпитопов вакцины может создаваться из Т-В эпитопа, как сообщалось В^итеаηи еΐ а1., 1997 (НА 110
120/НА 150-159, 8ΕЕΒΕЕIРΚЕ66V^ΤЕΚЕ6У8Р (8ЕО ГО Νο.23)) (Бгишеапи * а1., 1997, Σ. У1го1. 71:5473). Если соответствующую(ие) последовательность(и) получают, синтетический ген, кодирующий ЮТУ-НО собирают синтезом, гибридизацией, РСК и лигированием при перекрывании олигонуклеотидов. Собранный ген полной длины, кодирующий ЮТУ фрагменты, амплифицируют РСК и затем лигируют в экспрессирующую плазмиду. Конечные гены проверяют секвенированием ДНК.
ЮТУ-НО содержащие плазмиды трансформируют в Е.отН. Бактерии инкубируют в ЬВ среде с ампициллином (50 мкг/мл) при 37°С до «мид-лог» фазы. В это время добавляют ШТС для индуцирования 1гр/1ас гибридного промотора. Ежечасно точки исследуют для определения оптимальной постиндукционной экспрессии ЮТУ-НО белков. Во время оптимальной экспрессии клетки собирают центрифугированием. Клеточный дебрис лизируют и центрифугируют. Лизат анализируют на присутствие белка. ЮТУ-НО белки очищают с помощью селективного сродства к никелю, связанному с твердым носителем. Если необходимо, можно проводить исключение размера (численности), ионный обмен или хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующей очисткой ЮТУ-НО.
Модель вирусной инфекции. ЮТУ штамм, используемый для демонстрации эффективности вакцины, представляет рекомбинацию А/РК/8/34 вируса, названную РК8. Вирус культивируют в 10-12 дневных оплодотворенных яйцеклетках цыпленка с помощью аллантоидной инокуляции с последующей инкубацией при 37°С в шюттль-аппарате в течение 40-48 и 20-24 ч при 4°С и далее выделяют из аллантоидной жидкости. Реакция вирусной гемагглютинации с 0,5% эритроцита цыпленка должна проводиться в 96-луночных микротитрационных планшетах для определения гемагглютинирующих единиц (йетадд1иΐ^ηаΐ^ηд ι.ιηίΐ, НАИ), в мл вирусного штамма.
На ВАЬВ/с модели мыши показано, что 1200 НАИ штамма РК8, введенный внутриназально с помощью применения стерильного наконечника на микропипетторе мышам, которым давали наркоз метофаном (20 мкл), продуцировали явные симптомы инфекции через 4 дня, включая уменьшенную подвижность, подтянутость, 20% потерю веса тела и смерть в течение недель. Используя МОСК анализ цитолиза, проведенного в 96-луночных микротитрационных планшетах с 50% точкой эквивалентности, было найдено, что высокий титр инфекционного вируса, присутствующего в гомогенатах легкого, получали через 4 дня постинфекции.
Процедуры вакцинации и проверка индукции иммунного ответа (реакции) к вирусному антигену. ВАЬВ/с самкам мышей (6-8 недельным) подкожно вводят 1, 4 и 8 недель препарат вакцины или буфера. Места инъекции контро27 лируют на побочные реакции, такие как развитие гранулем. Если животных подвергают иммунизации вакциной интраназально, им дают наркоз метофаном и проверяемый продукт (1020 мкл) вводят в ноздри при вдыхании с применением стерильного наконечника на микропипетторе (СаШсНап е! а1., 1993, 1. 1пГ. Ь|к. 168:622).
КТ-РСК определение (обнаружение) ΙΝΕν РНК в легочной ткани. КТ-РСК обнаружение ΙΝΕν РНК проводят на легких экспериментальных животных, взятых через 4 дня после вирусного заражения для установления эффективности иммунизации для профилактики вирусной инфекции. Образцы легкого, взятого от мышей, быстро замораживают, растирают и замороженный порошок хранят при -70°С до обработки данных. Выделение полной РНК и КТ-РСК анализ вирусной РНК проводят, используя модификацию ранее описанных методик (СНотсху пкку е! а1., 1987, Апа1у!. ВюсНет. 162:156; 81нг\уап е! а1., 1993, I. 1ттипо1. 151:5228; Ьакетап, \Н!1еу, 1995, I. 1пГ. О1к. 171:857). Праймеры, которые должны использоваться, являются специфическими для матричного гена (сегмент 7) А вируса гриппа (А!таг е! а1., 1996, 1. С1ш. МкгоЬю1. 34:2604). КТ-РСК анализ проводят, используя Тйап Опе ТиЬе КТ-РСК систему (Воейлпдег МаппНепп, 1пб1апаро11к, ΙΝ) реагентов и процедуры. Вкратце, 1 пкг - 1 мкг полной РНК матрицы инкубируют в присутствии 0,2 тМ б№ТР8, 0,4 мкМ «апйкепке» праймера РАШ (5'САСАСАСТТСААСАТСТСТТТСС-3' (8ЕС) ΙΌ №. 24)), 0,4 мкМ «кепке» праймера, РАМ2 (5'ССТСТСТССАТСТТАТТТССА-3' (8 ЕС) ΙΌ №. 25)), 5 тМ ОТТ, 5 и К№ке ингибитора и 1,5 тМ МдС12 и ΛМV/Еxраηб Н1дй Р1бе1йу ферментов при следующих условиях: один цикл при 60°С в течение 30 мин; 94°С в течение 2 мин; 10 циклов при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 68°С в течение 45 с, 25 циклов при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 68°С в течение 45 с, увеличивая удлиняющий сегмент 5 с для каждого цикла; за которым следует один цикл при 68°С в течение 7 мин. Положительные результаты основаны на видимой полосе 212 Ьр в 1,5% №8к\ге-агарозном геле (РМС Вюргобис!к, Коск1апб, МЕ), окрашенном этидиний бромидом и сфотографированном с помощью УФ-лампы для просвечивания гелей (ВюКаб Се1 Эос 1000). Было показано, что данный способ чувствителен и высокоспецифичен для измерения присутствия вирусной ДНК (Ьакетап, \Ы!1еу, 1995, Ь Μ. ϋΐδ. 171:857).
Последовательность ΗАI области. Последовательность НАI области (сегмент 4) можно объяснить амплифицированием ΗАI области из вирусной ДНК в КТ-РСК реакции, далее 1100 Ьр продукт субклонировали для секвенирования и секвенировали с использованием метода дидезокси-нуклеотидной терминации. КТ-РСК анализ проводят с применением Тйап Опе ТиЬе КТ
РСК 8ук!ет, как указано выше, со следующими различиями; праймеры амплификации являются кДНК праймером (5'-АССААААССАССССА АААТАААААС-3' (8 ЕС) ΙΌ №. 26)) и РСКпраймером (5'-СААТСАААСССССААТСССТС С-3' (8ЕС) ΙΌ №. 27)) (РуНа1а е! а1., 1995, Ь Сеп. У1го1. 75:205), условиями будут - один цикл при 60°С в течение 30 мин; 94°С в течение 2 мин, 10 циклов при 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с, 68°С в течение 45 с; двадцать пять циклов при 94°С в течение 30 , 60°С в течение 30 с, 68°С в течение 45 с, усвеличивая удлиняющий сегмент 5 с для каждого цикла; за которым следует один цикл при 68°С в течение 7 мин. 1100 Ьр продукт субклонируют в ТА РСК 2.1 клонирующий вектор (ΙπνίΙ годен, Саг1кЬаб, СА) для последующего секвенирования. Секвенирование проводят с использованием процедуры и реагентов от набора Аи!оСус1е (Атегкйат Рйагтас1а Вю!есй, Р1кса!а^ау, N1) и результаты получают на наборе АЬРЕхргекк (Атегкйат Рйагтас1а Вю!есй, Р1кса!а^ау, N1) установки секвенирования и анализируют с помощью АМпрограммного обеспечения ν.3.02 комплекта (Атегкйат Рйагтааа Вю!есй, Р1кса!атеу, N1).
Измерение ответов антител с помощью ЕЫ8А. Через постоянные промежутки времени во время процедуры вакцинации, измеряют иммунный ответ мышей к вирусному антигену. Липосомы, содержащие антигенную детерминанту также используют в качестве мишеней для анализа антитело/ЕЬКА, как описано ранее (Тико е! а1., 1993, Тгапкр1ап!а!юп 55:1375). Результаты последней проверки используются для измерения уровня связывания и конформации изотипа антител.
Пролиферация антиген-индуцированных Т-клеток. Сенсибилизацию хозяина к ΕΝΕΝ антигенам измеряют с помощью пролиферации антиген-индуцированных Т-клеток. Селезенки удаляют из вакцинированных мышей и гомогенаты получают осторожным разрушением селезенок стерильным пружинным штифтом и проталкиванием клеток через нейлоновое сито. Клетки суспендируют в КРМI 1640 среде, содержащей 10% РС8, 10 тМ Нерек буфера, Ьглутамин (2 тМ), пенициллин (25 Ιυ/мл), стрептомицин (25 мкг/мг) и гентамицин (80 мкг/мл). Клетки культивируют при концентрации 1х106 клеток/мл с химически синтезированными пептидами, соответствующими антигенам (5 мкг/мл), или без них в 96-луночных планшетах с υ-образными лунками в течение 3-4 дней в 5% СО2. Культуры подвергают действию импульсов с 20 мкл ресазуринового красителя в течение 3 ч и далее измеряют флуоресценцию на Су!оГ1иог ΙΙ (Регкер!йе Вюкук!етк, Шс, Рагттд!оп, МА).
Анти-ЮТУ СТЬ ответы. После вакцинации определяют присутствие антигенспецифических цитотоксичных Т-лимфоцитов (СТЬ) в
Т-клетках селезенки. Лимфоциты селезенки по29 лучают, как описано ранее. Лимфоциты из каждой обработанной группы собирают (п=5) и далее культивируют в течение 3 дней без антигена при 107 клеток/лунке в 12-луночных культуральных планшетах. Клетки мишени (АТСС) Р815 мастоцитомы или Ь5178 лимфомы (Н2б) инкубируют с пептидом, относящимся к ЮТУ ЫР СТЬ эпитопу (аминокислоты 147-158) Н2б рестриктированных клеток и инкубируют в течение 4 ч при 37°С. Мишени промывают и к каждой лунке прибавляют 100 мкл титров, содержащих 1х104 клеток. Эффекторные лимфоциты промывают, прибавляют к лункам при различных концентрациях и культивируют в течение 4 ч при 37°С. Используя набор Су1оТох 96 (Рготеда, Маб1зоп VI). процент специфического лизиса вычисляют из супернатантной лактатдегидрогеназы (ЬЭН), измеренной в стандартном спектрофотометре для прочтения ЕЫ8А (НТ8 7000 + ВюАззау Кеабег, Регкш Е1тег, 8ап Юзе, СА), регистрируя абсорбцию при 490 нм. Определение Н8У2-антигенспецифического лизиса производят по стандартным критериям. Данные выражают в виде процента специфического лизиса = 100 х [(экспериментальное - эффектор спонтанный - мишень спонтанная)/(мишень максимальная - мишень спонтанная)].
Пример У. Нетипичный Н. тПиепхае (ΝΊΉί) и Н. 1пГ1иепхае типа Ь (Н1Ь).
Клонирование ЫТН1 белков. Последовательность гена полной длины, кодирующего Р6, получают из штамма ΝΊΉί с помощью КТ-РСК амплификации Р6 мРНК (ОекИ е! а1., 1988, 1. ВасЮгюЕ 170:489; Ые1зоп е! а1., 1988, 1пГ. 1ттип. 56:128; Ьоотап е! а1., 1987, ЕМВО 1. 6:2489). Амплификацию проводят с помощью Тйап Опе ТиЬе ВТ-РСК 8уз1ет (Воейппдег Маппйет, 1пб1апаро11з, ΙΝ) реагентов и процедуры. Вкратце, бактерии инкубируют в присутствии 0,2 тМ бЫТРз, 0,4 мкМ «апбзепзе» праймера НΙπνίΡ6Λ8 (5'-САСТССССТССТСТАССААС-3’ (8ЕО ΙΌ Ыо. 28)), 0,4 мкМ «зепзе» праймера, НΙπνίΡ68 (5'-ААТТТССАССТТССТСТССА-31 (8 ЕС) ΙΌ Ыо. 29)), 5 тМ ЭТТ, 5 и КЫазе ингибитор, 1,5 тМ МдС12 и АМУ/Ехрапб Н1дй Е1бе111у ферментов при следующих условиях: один цикл при 60°С в течение 30 мин; 94°С в течение 2 мин; десять циклов при 94°С в течение 30 с; 55°С в течение 30 с; 68°С в течение 45 с; двадцать пять циклов при 94°С в течение 30 с; 55°С в течение 30 с; 68°С в течение 45 с, увеличивая удлиняющий сегмент 5 с для каждого цикла; за которым следует один цикл 68°С в течение 7 мин. Положительные результаты основаны на видимой полосе 867 Ьр в 1,0% Ыи81еуеагарозном геле (ЕМС ВюргобисЮ Коск1апб, МЕ), окрашенном этидиний бромидом и сфотографированном с помощью цифровой системы обработки изображений (ВюКаб, Се1 Эос 2000). РСК продукт субклонируют для целей секвенирования в ТА 2.1 векор, используя ТА клони рующий набор (1иуйгодеи, Саг1зЬаб, СА) реагентов и процедуры. Получение плазмиды в малом масштабе осуществляют с помощью стандартного метода щелочного лизиса (Машабз, 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 2пб Еб., 8атЬгоок, Егйзсй, Машабз, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргезз, ΝΥ, р. 125). Вставку РСК продукта секвенируют с помощью стандартного метода дидезокситерминации, используя процедуру и реагенты из набора Аи1:оСус1е (Атегзйат Рйагтааа ВюЮсй, Р1зсаЮтеау, N1) и результаты получают на АЬЕЕехргезз II (Атегзйат Рйагтас1а ВюЮсй, Р|зса1атеау, N1) приборе секвенирования и анализируют с помощью программного обеспечения А1Г\Ут 8ес.|иепсе Апа1узег ν.2.0 (Атегзйат Рйагтааа ВюЮсй, Р|зса1атеау, N1).
Получение №ГН1(Р6)-НО. Если получают ген, кодирующий Р6, синтетический ген, кодирующий №ГН1(Р6)-НО собирают синтезом, гибридизацией, РСК и лигированием при перекрывании олигонуклеотидов. НЭ сегмент добавляют к Ν- или С-концу белка через линкер, содержащий глицин и серин. Это позволяет нам проверить влияние, которое оказывает относительное расположение НЭ в отношении антигена на процессирование иммунной системы. Собранный ген полной длины, кодирующий №ГН1(Р6)НЭ фрагмент, амплифицируют с помощью РСК и лигируют в плазмиду экспрессии. Конечный ген проверяют секвенированием ДНК.
NТΉ^(Р6)-Н^ содержащую плазмиду трансформируют в Е.со11. Бактерии инкубируют в ЬВ среде с ампициллином (50 мкг/мл) при 37°С до «мид-лог» фазы. В это время добавляют 1РТС для индуцирования 1гр/1ас гибридного промотора. Ежечасно точки проверяют для определения оптимальной постиндукционной экспрессии №ГШ(Р6)-НО белка. Во время оптимальной экспрессии клетки собирают центрифугированием. Клеточный дебрис лизируют и центрифугируют. Лизат и клеточный дебрис анализируют на присутствие белка. Для экстракции №Г№(Р6)-НО белка из лизированного клеточного дебриса используют 1-2% раствор дезоксихолата натрия. №Г№(Р6)-НО далее очищают селективным сродством к никелю, связанному с твердым носителем. Если необходимо, можно проводить исключение размера (численности), ионный обмен или хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующей очисткой №ГН1(Р6)-НО.
Получение липосомы. Имеются три общих подхода для получения стабильных №ГН1(Р6)НЭ липосом. Сначала липосомы включают в композицию так, что белок и липиды растворяют вместе в органическом растворителе (хлороформ/метанол) и далее сушат в тонкую пленку. При повторном суспендировании в водном буфере липиды и белки собирают в большие бислойные структуры. Суспензию затем разрушают ультразвуком для получения мелколамеллярных пузырьков (8ИУ). Для меньших белковых кон струкций данный метод работает хорошо. Однако для данных экспериментов возможно нежелательно подвергать действию белок в жестких условиях растворителя вследствие возможности денатурирования белка. Таким образом, чтобы предотвратить нежелательные конформационные изменения, может применяться второй метод, который включает солюбилизацию ΝΤΗί(Ρ6)-ΗΌ в ресуспендированном буфере до гидратации липидной пленки. При гидратации липидами белок спонтанно связывается с заново образованной мембраной и включается в бислой 8ИУ во время действия ультразвука. Третий метод включает получение липосом без ΝΤΗί(Ρ6)-ΗΌ белка и далее прибавлением его к уже образованным 8ИУ, давая возможность ΗΌ интегрировать в липидный бислой. Липосомы получают действием ультразвука на зонд согласно ранее описанным методикам (ЕиЩ е! а1., 1997, Вюейеш181гу 36:4959). Вкратце, липиды (с белком или без) растворяют в органическом растворителе, таком как хлороформ/метанол. Тонкие липидные пленки создают при отборе пипеткой аликвот липидных растворов в круглодонные стеклянные трубки и упариванием растворителя при 65°С в токе азота. Пленки помещают в вакуум, по крайней мере, на восемь часов для удаления остаточного органического растворителя. Наоборот, липидные порошки нужного состава можно получить техническим приемом, таким как распылительной сушкой, и далее их используют вместо липидных пленок. Получение липосом выполняют гидратированием липидных пленок или порошков в буфере и инкубированием суспензии при 65°С в течение 5-10 мин до воздействия ультразвука на зонд (пробу). Липосомы затем фильтруют через 0,22 мкм фильтр для стерилизации препарата. Липосомы должны разделяться по размерам с помощью динамического рассеяния света и образованием агрегатов, продолжающихся, по крайней мере, четыре недели. Возможно, что конформацию ΝΤΗί(Ρ6)-ΗΌ белка необходимо сохранить. Поэтому из трех подходов, которые могут применяться для получения липосом, мы предвидим, что прибавление белка в качестве компонента гидратирующего раствора или прибавление к липосомам после того, как они уже образованы, может быть предпочтительным.
Бактериальные штаммы. ΝΤΗί штаммы 9333 (изолят цереброспинальной жидкости), 35056 (изолят верхней респираторной инфекции), 43095 (изолят воспаления среднего уха), 49766 (изолят абсцесса легкого, штамм сравнения для проверки антимикробной восприимчивости) (АТСС) и ШЬ штамм 51654 (АТСС) использовали для демонстрации эффективности в модели бактериальной инфекции. До применения замороженную биомассу организма пассируют в свежем бульоне Вгаш ИеаП ΙηΓιϊδίοη. дополненным ΝΑΌ (2 мкг/мл) и гемом (10 мкг/мл) и инкубируют в течение 24 ч при 37°С с 10%
СО2. Стандартную кривую для каждого организма, состоящего из колоний-образующих единиц, от помутнения при 480 нм используют для регулирования инокулята бактерий, необходимых или для бактериальных проверок, или для дозы интраперитонеального заражения.
Процедуры вакцинации и проверка индукции иммунного ответа к бактериальному антигену. Группы крыс раннего возраста (η=6 на группу) иммунизируют на 5, 12 19 и 26 послеродовые дни или на 5 и 26 дни проверяемым препаратом вакцины или буфера. Систематическая вакцинация крыс проводится подкожным введением липосомных вакцин. Когда животных подвергают иммунизации вакциной интраназально, им дают наркоз метофаном и проверяемый препарат (20 мкл) вводят с применением стерильного наконечника на микропипетторе (СаШсЬал е! а1., 1993, 1. ΙηΓ. ϋΐ8. 168:622). Крыс раннего возраста помещают с их кормящими матерями и проверяют побочные реакции на процедуру вакцинации, такие как образование гранулем, покраснение или образование струпа в месте вакцинации. Через одну неделю после последней вакцинации, крысам раннего возраста дают наркоз галотаном и собирают кровь кардиальной пункцией и отхождения слизистой оболочки, промытые солевым раствором для сбора секретов слизистой оболочки. Животных умерщвляют с помощью двуокиси углерода. Титры антител с бактерицидными свойствами сыворотки и жидкости слизистой измеряют, как описано ниже.
Для исследования интраперитонеального заражения крысы раннего возраста (26-дневного возраста) заражают бактериями и их кровь и С8Е проверяют на бактериальную нагрузку, сравнивая с невакцинироваными крысами. Взятие образцов крови и С8Е для бактерий двумя днями после заражения указывает, что имеется значительная бактериальная нагрузка у животных (т.е. 1х104 СЕИ/мл крови; 1х104 СЕИ/мл С8Е). Сыворотку от вакцинированных крыс 26дневного возраста, содержащих высокие титры антител с бактерицидными свойствами, вводят внутривенно крысам 6-дневного возраста. На следующий день крысы раннего возраста (η=10) получают дозу ΝΗΤί интраперитонеально, как описано ниже. Затем крыс раннего возраста проверяют на заболеваемость и смертность, выживших умерщвляют после 26 дней и кровь и С8Е собирают и культивируют на присутствие ΝΗΤί.
Интраперитонеальное заражениее с ΝΤΗί. Культуру 24 часового возраста ίη νίνο, пассированную ΝΗΤί , доводят до 5х107 - 5х109 СЕИ/ мл и 100 мкл данной культуры вводят интраперитонеально крысам 5-10 дневного возраста (8ιηί11ι е! а1., 1973, ΙηΓ. 1ттип. 8:278). Зараженных крыс раннего возраста оставляют с кормящими матерями после вакцинации. В течение 18-96 ч после заражения, по крайней мере, 90% крыс раннего возраста умирают при использовании данной дозы пассированных бактерий.
Измерение ответов антигенспецифического антитела с помощью ЕЫ8Л. Образцы сыворотки и слизистой каждой крысы проверяют на Ι§0 и 1дА антитела, специфические для Р6 антигена. Клонированный нативный Р6 или ΝΤΗί(Ρ6)-ΗΌ белок прибавляют к соответствующим образом обработанным 96-луночным планшетам при инкубации в течение ночи при комнатной температуре. Планшеты блокируют 1% бычьим сывороточным альбумином в бикарбонатном буфере, рН 9,6 в течение 30 мин при 37°С. Затем планшеты промывают 0,05% Тетееп 20/ΡΒ8. Разбавленные аликвоты каждого образца сыворотки и слизистой прибавляют к планшетам, покрытых антигеном, за которым следует инкубация в течение 2 ч при 37°С и промывание Т\сееп 20/ΡΒ8 буфером в конце инкубации. Моноклональные тела, соединенные щелочной фосфатазой, специфические для 1дО и 1дА крысы прибавляют к лункам в течение одного часа при 37°С. Далее клетки промывают Ттееп/ΡΒδ буфером и ΡΝΡΡ субстратом в диэтаноламинном буфере, рН 9,5, прибавляют к лункам для инициирования цветной реакции. Реакцию останавливают с помощью 0,75н. гидроокиси натрия или считывают при 405 нм в спектрофотометре 8рес!гатах ЕЫ8А для прочтения планшетов. Концентрации 1дО и 1дА крыс вычисляют из стандартной кривой, полученной из контрольных образцов известных концентраций 1дО или 1дА крысы, покрытых на 96-луночных планшетах и обрабатывают, как описано выше.
Анализ антитела с бактерицидными свойствами. Образцы сыворотки, проверяемые на присутствие антител с бактерицидными свойствами, инкубируют при 56°С в течение 30 мин для инактивации комплемента. Далее проверяемые сыворотки серийно разбавляют забуференным фосфатом физиологическим раствором (ΡΒ8). 24-часовую бактериальную культуру доводят до 5х104 СЕИ/мл в стерильном РСМ буфере, состоящем из ΡΒ8 с 0,15 тМ СаС12 и 1 тМ МдС12, содержащего бычий сывороточный альбумин (Ьоуше кегцт а1Ьитт, Β8А). Сыворотки от невакцинированных крыс раннего возраста используют в качестве комплементного источника. Данные сыворотки собирают, разделяют на аликвоты и хранят при -70°С до использования. Бактерии (20 мкл), серийно разбавленная сыворотка (20 мкл), комплемент (20 мкл) и 40 мкл 1% Β8А в РСМ буфере прибавляют к каждой лунке 96-луночного агглютинационного планшета. Для определения начальной бактериальной концентрации 10 мкл аликвотов образца смеси помещают при нулевом времени на свежие ΒΗΙ агаровые пластинки, содержащие питательный агар и добавляют ΝΛΌ и гель. После инкубации реакционных смесей при 37°С с 10% двуокиси углерода в течение одного часа с встряхиванием, 10 мкл из каждой лунки помещают на планшет в двух экземплярах и инкубируют в течение ночи при 37°С в присутствии 10% двуокиси углерода для определения СЕИ/лунке. Контроли включают лунку без сыворотки для обеспечения того, чтобы один комплемент не вызывал киллинг бактерий и лунку с проверяемой сывороткой, но без комплемента, чтобы быть уверенным, что сывороточный комплемент в проверяемом образце успешно инактивирован. Все анализы проводят трижды и данные разбавления, продуцирующие 50% киллинг бактерий, используют для сравнения активности различных сывороток.
Пример VI. Вирус гепатита С.
Получение Ηθν(Ε2/Ν8Ι)-Ηϋ и НС7 (Ε2/Ν8ΙΔΗνΚΙ)-ΗΌ в СНО клетках. Нуклеотидную последовательность ΗСV Ε2/Ν8Ι белка получают из ΡΟΚ. амплификации штамма ΗСV, полученного как описано ниже. Используя 5' праймер, соответствующий первому 21 Ьр Ε2/Ν81 гена САААССАТ6АТС0СССАС00А и 3' праймер, соответствующий остаткам 622-628, 0АА6ТТ6АСА6Т6СА6660ТА, элиминируют трансмембранный домен (Сосс.|иеге1 е! а1., 1998, I. νίτοί. 72(3):2183-91). К тому же каждый праймер фланкируют удобными сайтами рестрикции. БСВ продукт лигируют в рс^NА3.1Η^8, содержащий ΗΌ область в качестве плазмиды кассеты гена Дпуйгодеп, Ιηα, 8ап О|едо. СА). №ν(Ε2/Ν8ΙΔΗνΚΙ)-ΗΌ создают делецией ΗνΚ1 Ε2/Ν8Ι гена, соответствующего первым 27 аминокислот от остатка 384 до остатка 410. Делеционный мутант получают ΡΟΚ. амплификацией, используя 5' праймер СААСТСАТСААСАССААТООС и тот же самый 3' праймер используют для контроля дикого типа. Конечные гены проверяют секвенированием ДНК. Плазмиды трансфектируют в СНО клетки (Пееп, К.С. е! а1., 1988, ХаИие 331:82) (АТСС КоскуШе, МО) используя реагент липофекции (Ыро!ес!атше, Оксо/ЕКЕ ОаййегаЬигд, ΜΌ) согласно рекомендуемой производителем методике. Стабильные трансфектанты отбирают, используя 0418 (Оксо/ЕКЕ, ОаййегаЬигд, ΜΌ) и клонируют с помощью ограничивающего разбавления. Идентификацию клонов, которые продуцируют высокие уровни белка, проводят вестерн-блоттингом. Ηθν(Ε2/Ν81)-ΗΌ и ^'.’ν(Έ2/Ν8ΙΔΗνΒ1)-ΗΌ белки очищают с помощью селективного сродства к никелю, связанному с твердым носителем. Гистидиновый линкер удаляют расщеплением энтерокиназой после окончания очистки. Если необходимо, можно проводить исключение размера (численности), ионный обмен или хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующей очисткой Ηθν(Ε2/Ν81)-ΗΌ и Ηθν(Ε2/ Ν81ΔΗνΚ1)-ΗΌ белков.
Получение Ηθν(ΗνΒ1)-ΗΌ и 11С\'(С)-1 II) белков в Е. сой. Нуклеотидные последователь35 ности выбранных эпитопов получают из белковой последовательности, используя преимущества Е. соИ кодона (Ьоотап е! а1., 1987, ЕМВО ί. 6:2489). Последовательность(и) антигена, вставляемая в кассету гена, соответствует эпитопам от №(147-161, ТУОКТКАЬУКТСМРР; 55-69 КЬЮ№ЬТ1ЕКМУЬ8) и НА (91-108, 8КАР8№ УРУОУРЭУАБЬ). Когда соответствующая последовательность(и) получена, синтетический ген, кодирующий НСУ-НР, флакируют удобными сайтами рестрикции, собирают синтезом, гибридизацией и лигированием перекрывающихся олигонуклеотидов. Вкратце, сборку фрагментов достигают нагреванием при 65°С и ренатурацией олигонуклеотидов, когда их возвращают к комнатной температуре. После инкубации в течение 2 мин на льду фрагменты лигируют ДНК-лигазой. Собранные гены полной длины, кодирующие НСУ фрагменты, амплифицируют РСК, расщепляют ферментами рестрикции и изолируют гель-электрофорезом. Затем НСУ ген лигируют в подобным образом расщепленную плазмиду экспрессии, содержащую НР ген (например, рТгсН|к или рЦЕ30). Конечные гены проверяют секвенированием ДНК.
НСУ-НР содержащие плазмиды трансофрмируют в Е.соР. Бактерии инкубируют в ЬВ среде с ампициллином (50 мкг/мл) при 37°С до «мид-лог» фазы. В это время добавляют 1РТС для индуцирования 1гр/1ас гибридного промотора. Ежечасно точки проверяют для определения оптимальной постиндукционной экспрессии НСУ-НР белка. Во время оптимальной экспрессии клетки собирают центрифугированием. Клеточный дебрис лизируют и центрифугируют. Лизат анализируют на присутствие белка. НСУ-НР белки очищают селективным сродством к никелю, связанному с твердым носителем. Гистидиновый линкер удаляют расщеплением энтерокиназой после окончания очистки. Если необходимо, можно проводить исключение размера (численности), ионный обмен или хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующей очисткой НСУ-НР.
Липосомный препарат и процедуры вакцинации, проверка индукции иммунного ответа, измерения ответа ЕЫ8А антитела, РТН анализ, анализ цитокин-специфической мРНК, измерения ЕЬ18А цитокина, пролиферация антигениндуцированных Т-клеток и анти-Н1У СТЬ ответы являются по существу такими, как описано выше в примере ΙΙΙ.

Claims (60)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммуногенная одноламеллярная липосомная композиция, включающая пузырекобразующие липиды и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант и гидрофобную область, при этом гидрофобная область имеет площадь поверхности более 500 А2 и связана с мембраной данной одноламеллярной липосомной композиции, причем иммуногенная композиция вызывает ответ, связанный с клеточным иммунитетом.
  2. 2. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, дополнительно включающая один или несколько адъювантов.
  3. 3. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является рекомбинантно продуцированной, химически синтезированной или их комбинацией.
  4. 4. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что гидрофобная область является пептидом.
  5. 5. Иммуногенная липосомная композиция по п.4, отличающаяся тем, что гидрофобная область содержит от 15 до 500 аминокислотных остатков.
  6. 6. Иммуногенная липосомная композиция по п.5, отличающаяся тем, что гидрофобная область включает одну или несколько аминокислот, которые выбирают из группы, состоящей из А1а, Акп, Сук, С1п, С1у, Нк, 11е, Ьеи, Ме!, РЬе, Рго, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг и Уа1.
  7. 7. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что антигенная детерминанта происходит из антигена, который выбирают из группы, состоящей из Н8У дВ или дР, Н1У др120, СМУ дВ, НСУ Е2, ЮТУ НА или NА, НапПиепхае Р5 или Р6, фимбриального протеина и протеина Р.
  8. 8. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что антигенная конструкция дополнительно включает линкерную область, соединяющую антигенные детерминанты с гидрофобной областью.
  9. 9. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что линкерная область является пептидом.
  10. 10. Иммуногенная липосомная композиция по п.9, отличающаяся тем, что пептидная линкерная область содержит от 1 до 200 аминокислотных остатков.
  11. 11. Иммуногенная липосомная композиция по п.10, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки выбирают из группы, состоящей из А1а, Агд, Акп, Акр, Сук, С1и, С1п, С1у, НОЛе, Ьеи, Ьук, Ме!, РЬе, Рго, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг и Уа1.
  12. 12. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является гибридным (слитым) белком.
  13. 13. Иммуногенная липосомная композиция по п.9, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является гибридным (слитым) белком.
  14. 14. Применение иммуногенно эффективного количества композиции по п.1 для индуцирования иммуногенного ответа у животногохозяина.
  15. 15. Применение иммуногенно эффективного количества композиции по п.2 для индуци рования иммуногенного ответа у животногохозяина.
  16. 16. Применение по п.14, отличающееся тем, что животное-хозяин является млекопитающим.
  17. 17. Применение по п.16, отличающееся тем, что млекопитающее является человеком.
  18. 18. Применение по п.14, отличающееся тем, что животное является птицей.
  19. 19. Применение по п.17, отличающееся тем, что антигенную детерминанту выбирают из группы, состоящей из Н8У дВ или дИ, Н1У др120, СМУ дВ, НСУ Е2, 1№У НА или т, НаиЛнеи/ае Р5 или Р6, фимбриального протеина и протеина Ό.
  20. 20. Вакцинная композиция, включающая эффективное количество композиции по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
  21. 21. Вакцинная композиция по п.20, дополнительно включающая один или несколько адъювантов.
  22. 22. Кассета ДНК для вставки в экспрессирующий вектор, включающая последовательности, которые кодируют иммуногенный гибридный (слитый) белок, при этом данный белок включает гидрофобную область с площадью поверхности более 500 А2 и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант.
  23. 23. Кассета ДНК по п.22, отличающаяся тем, что антигенная детерминанта происходит от антигена, который выбирают из группы, состоящей из Н8У дВ или дИ, Н1У др120, СМУ дВ, НСУ Е2, ΙΝΤΎ НА или КА Нлийиеихае Р5 или Р6, фимбриального протеина и протеина Ό.
  24. 24. Кассета ДНК по п.22, отличающаяся тем, что гидрофобная область является пептидом, состоящим из от 15 до 500 аминокислотных остатков.
  25. 25. Кассета ДНК по п.24, отличающаяся тем, что пептид включает одну или несколько аминокислот, которые выбирают из группы, состоящей из А1а, Аки, Сук, С1и, С1у, Н1к, 11е, Ьеи, Ме!, РНе, Рго, 8ег, ТНг, Тгр, Туг и Уа1.
  26. 26. Кассета ДНК по п.22, отличающаяся тем, что гибридный (слитый) белок дополнительно включает линкерную область, соединяющую антигенную детерминанту и гидрофобную область.
  27. 27. Кассета ДНК по п.26, отличающаяся тем, что линкерная область содержит 1-200 аминокислотных остатков.
  28. 28. Кассета ДНК по п.27, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки выбирают из группы, состоящей из А1а, Агд, Аки, Акр, Сук, С1и, С1и, С1у, Н1к, 11е, Ьеи, Ьук, Ме!, РНе, Рго, 8ег, ТНг, Тгр, Туг и Уа1.
  29. 29. Вектор, включающий кассету ДНК по п.22.
  30. 30. Способ получения иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции, включающий экспрессию гена, который кодирует гибридный (слитый) белок, включающий гидрофобную область с площадью поверхности более 500 А2 и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант, растворение пузырек-образующих липидов и гибридного (слитого) белка в подходящем органическом растворителе, образование липидной пленки или высушенного распылением порошка при испарении органического растворителя, гидратирование липидной пленки или порошка и диспергирование гидратированной липидной пленки или порошка с образованием иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции.
  31. 31. Способ получения иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции, включающий экспрессию гена, который кодирует гибридный (слитый) белок, включающий гидрофобную область с площадью поверхности более 500 А2 и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант, растворение гибридного (слитого) белка в водном буфере, гидратирование или липидных порошков или липидных пленок с буфером, содержащим гибридный (слитый) белок, и диспергирование липидных порошков или пленок с образованием иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции.
  32. 32. Способ получения иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции, включающий экспрессию гена, который кодирует гибридный (слитый) белок, включающий гидрофобную область с площадью поверхности более 500 А2 и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант, растворение гибридного (слитого) белка в водном буфере и прибавление гибридного (слитого) белка к предварительно образованным одноламеллярным липосомам с получением иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции.
  33. 33. Иммуногенная одноламеллярная композиция, включающая антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант и гидрофобную область с площадью поверхности более 500 А2, и фармацевтически приемлемый носитель.
  34. 34. Иммуногенная композиция по п.33, отличающаяся тем, что антигенная конструкция дополнительно включает линкерную область, соединяющую антигенные детерминанты с гидрофобной областью.
  35. 35. Иммуногенная композиция по п.33, дополнительно включающая один или несколько адъювантов.
  36. 36. Иммуногенная липидная композиция в виде эмульсии, включающая масло, пузырекобразующие липиды и антигенную конструкцию, содержащую одну или несколько антигенных детерминант и гидрофобную область, которая имеет площадь поверхности более 500 А2.
  37. 37. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что антигенная конструкция представляет собой гибридный (слитый) белок.
  38. 38. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что ответ, связанный с клеточным иммунитетом, включает ответ аллергической реакции замедленного типа.
  39. 39. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что липиды, содержащие липосому, находятся в жидкой фазе при температуре тела.
  40. 40. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что липиды содержат не более 10% холестерина.
  41. 41. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что липиды, содержащие липосому, находятся в жидкой фазе при температуре тела.
  42. 42. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что липиды содержат не более 10% холестерина.
  43. 43. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является рекомбинантно продуцированной, химически синтезированной или их комбинацией.
  44. 44. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что гидрофобная область является пептидом.
  45. 45. Вакцинная композиция по п.44, отличающаяся тем, что гидрофобная область содержит от 15 до 500 аминокислотных остатков.
  46. 46. Вакцинная композиция по п.44, отличающаяся тем, что гидрофобная область включает одну или несколько аминокислот, которые выбирают из группы, состоящей из А1а, Αδη, Сук, 61η, 61у, ΗΪ8, 11е, Ьеи, Ме!, РЬе. Рго, 8ег, ΤΙιγ. Ττρ, Туг и Уа1.
  47. 47. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что антигенная детерминанта происходит из антигена, который выбирают из группы, состоящей из Ηδν дВ или дИ, Ηΐν §ρ120, СМV дВ, ИСТ Е2, ΙΝΕν НА или ΝΑ, Η.ίηΠικι^κ Р5 или Р6, фимбриального протеина и протеина Ό.
  48. 48. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что антигенная конструкция дополнительно включает пептидную линкерную область, соединяющую антигенные детерминанты с гидрофобной областью.
  49. 49. Вакцинная композиция по п.48, отличающаяся тем, что пептидная линкерная область содержит от 1 до 200 аминокислотных остатков.
  50. 50. Вакцинная композиция по п.49, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки выбирают из группы, состоящей из А1а, Агд, Аки, Акр, Сук, 61и, 61η, 61у, Η18, 11е, Ьеи, Ьук, Ме!, РЬе, Рго, 8ег, ΤΙιγ. Ττρ, Туг и Vа1.
  51. 51. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что липиды находятся в жидкой фазе при температуре тела.
  52. 52. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что липиды содержат не более 10% холестерина.
  53. 53. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является рекомбинантно продуцированной, химически синтезированной или их комбинацией.
  54. 54. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что гидрофобная область является пептидом.
  55. 55. Композиция по п.54, отличающаяся тем, что гидрофобная область содержит от 15 до 500 аминокислотных остатков.
  56. 56. Композиция по п.55, отличающаяся тем, что гидрофобная область включает одну или несколько аминокислот, которые выбирают из группы, состоящей из А1а, Аки, Сук, 61η, 61у, Η18, 11е, Ьеи, Ме!, РЬе, Рго, 8ег, ΤΙιγ. Ττρ, Туг и Vа1.
  57. 57. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что антигенная детерминанта происходит из антигена, который выбирают из группы, состоящей из Ηδν дВ или дЭ. Ηΐν др120, СМV дВ, ΗΟν Е2, ΙΝΕν НА или ЫА, 1 РтПиеп/ае Р5 или Р6, фимбриального протеина и протеина Ό.
  58. 58. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что антигенная конструкция дополнительно включает пептидную линкерную область, соединяющую антигенные детерминанты с гидрофобной областью.
  59. 59. Композиция по п.58, отличающаяся тем, что пептидная линкерная область содержит от 1 до 200 аминокислотных остатков.
  60. 60. Композиция по п.59, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки выбирают из группы, состоящей из А1а, Агд, Аки, Акр, Сук, 61и, 61η, 61у, Η 1к. 11е, Ьеи, Ьук, Ме!, РЬе, Рго, 8ег, ΤΙιγ. Ττρ, Туг и Vа1.
EA200100269A 1998-09-22 1999-09-22 Иммуногенные липосомные композиции EA004797B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10135198P 1998-09-22 1998-09-22
US40072399A 1999-09-21 1999-09-21
PCT/US1999/020880 WO2000016746A2 (en) 1998-09-22 1999-09-22 Immunogenic liposome compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200100269A1 EA200100269A1 (ru) 2001-12-24
EA004797B1 true EA004797B1 (ru) 2004-08-26

Family

ID=26798150

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200100269A EA004797B1 (ru) 1998-09-22 1999-09-22 Иммуногенные липосомные композиции

Country Status (31)

Country Link
EP (1) EP1115382B1 (ru)
JP (1) JP2002526436A (ru)
KR (1) KR100592825B1 (ru)
CN (1) CN1555254A (ru)
AP (1) AP2010A (ru)
AT (1) ATE468108T1 (ru)
AU (1) AU766772B2 (ru)
BG (1) BG65675B1 (ru)
BR (1) BR9914004A (ru)
CA (1) CA2344173C (ru)
CY (1) CY1110718T1 (ru)
CZ (1) CZ20011013A3 (ru)
DE (1) DE69942393D1 (ru)
DK (1) DK1115382T3 (ru)
EA (1) EA004797B1 (ru)
EE (1) EE200100168A (ru)
ES (1) ES2345695T3 (ru)
GE (1) GEP20053444B (ru)
HK (1) HK1039064A1 (ru)
HU (1) HUP0105391A3 (ru)
ID (1) ID29082A (ru)
IL (2) IL141675A0 (ru)
MX (1) MXPA01002973A (ru)
NO (1) NO330685B1 (ru)
NZ (2) NZ528055A (ru)
OA (1) OA11657A (ru)
PL (1) PL206260B1 (ru)
SK (1) SK287670B6 (ru)
UA (1) UA75327C2 (ru)
WO (1) WO2000016746A2 (ru)
ZA (1) ZA200101829B (ru)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2604683C (en) 2005-04-12 2019-04-30 Duke University Method of inducing neutralizing antibodies to human immunodeficiency virus
US9539209B2 (en) 2009-06-04 2017-01-10 National Institute Of Infectious Diseases Vaccine for mycoplasma infection
KR101998431B1 (ko) * 2011-04-26 2019-07-09 몰레큘라 익스프레스 인코포레이티드 리포솜 제제
US10076567B2 (en) 2013-09-27 2018-09-18 Duke University MPER-liposome conjugates and uses thereof
IL302880A (en) * 2017-04-04 2023-07-01 Avidea Tech Inc Peptide-based ingredients, production methods, and their uses for inducing an immune response
KR20240033309A (ko) * 2022-09-05 2024-03-12 주식회사 차백신연구소 에멀전 제형의 면역증강제 조성물 및 이의 제조 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8405493D0 (sv) * 1984-11-01 1984-11-01 Bror Morein Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel
US5374548A (en) * 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
SE462375B (sv) * 1985-10-15 1990-06-18 Morgaardshammar Ab Centro Traadblock
DE3776966D1 (de) * 1986-05-20 1992-04-09 Wako Pure Chem Ind Ltd Funktionelle gruppen tragende liposome und verfahren zu deren herstellung.
FR2754543B1 (fr) * 1996-10-11 1998-12-31 Pasteur Institut Souche de bordetella deficiente dans la production de toxine et exprimant une proteine hydride, liposomes comprenant de la fha et leurs utilisations comme vaccins, et utilisation de la fha pour stimuler les reponses immunitaires

Also Published As

Publication number Publication date
UA75327C2 (en) 2006-04-17
NZ528055A (en) 2005-01-28
CZ20011013A3 (cs) 2002-03-13
WO2000016746A8 (en) 2000-08-10
SK3222001A3 (en) 2001-09-11
ES2345695T3 (es) 2010-09-29
EP1115382A2 (en) 2001-07-18
EE200100168A (et) 2002-06-17
ZA200101829B (en) 2002-06-05
NZ510442A (en) 2003-10-31
WO2000016746A3 (en) 2000-11-23
HUP0105391A2 (hu) 2002-05-29
JP2002526436A (ja) 2002-08-20
GEP20053444B (en) 2005-02-25
CA2344173A1 (en) 2000-03-30
PL348604A1 (en) 2002-06-03
SK287670B6 (sk) 2011-05-06
AP2010A (en) 2009-06-29
ID29082A (id) 2001-07-26
CN1555254A (zh) 2004-12-15
BR9914004A (pt) 2001-07-24
EA200100269A1 (ru) 2001-12-24
KR20010075261A (ko) 2001-08-09
HK1039064A1 (en) 2002-04-12
WO2000016746A2 (en) 2000-03-30
NO330685B1 (no) 2011-06-06
WO2000016746A9 (en) 2000-09-21
CY1110718T1 (el) 2015-06-10
IL141675A0 (en) 2002-03-10
IL141675A (en) 2007-06-17
BG65675B1 (bg) 2009-06-30
AP2001002096A0 (en) 2001-03-31
DE69942393D1 (de) 2010-07-01
OA11657A (en) 2004-12-08
PL206260B1 (pl) 2010-07-30
EP1115382B1 (en) 2010-05-19
AU6035199A (en) 2000-04-10
AU766772B2 (en) 2003-10-23
CA2344173C (en) 2010-02-23
KR100592825B1 (ko) 2006-06-23
NO20011406D0 (no) 2001-03-20
ATE468108T1 (de) 2010-06-15
DK1115382T3 (da) 2010-09-06
MXPA01002973A (es) 2003-03-27
HUP0105391A3 (en) 2006-02-28
BG105372A (en) 2001-10-31
NO20011406L (no) 2001-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0245078B1 (en) Enhancement of antigen immunogenicity
McEwen et al. Synthetic recombinant vaccine expressing influenza haemagglutinin epitope in Salmonella flagellin leads to partial protection in mice
US4454121A (en) Synthetic peptides corresponding to antigenic determinants of the M protein of Streptococcus pyogenes
US20090053248A1 (en) Compositions and methods for transepithelial molecular transport
Bessler et al. Synthetic lipopeptides as novel adjuvants
EA018084B1 (ru) Виросомоподобные везикулы, содержащие антигены, производные от gp41, и их применение
HUT69935A (en) Vaccines containing non-ionic surfactant vesicles
Golovliov et al. Adjuvanticity of ISCOMs incorporating a T cell-reactive lipoprotein of the facultative intracellular pathogen Francisella tularensis
JPH03502687A (ja) レスピラトリイ・シンシチアル・ウイルス：ワクチンおよび診断法
JPS61502957A (ja) 大腸菌のｌｔ―ｂエンテロトキシンサブユニットと莢膜ポリマーとの免疫原性結合体
Partidos et al. The adjuvant effect of a non‐toxic mutant of heat‐labile enterotoxin of Escherichia coli for the induction of measles virus‐specific CTL responses after intranasal co‐immunization with a synthetic peptide
Boeckler et al. Design of highly immunogenic liposomal constructs combining structurally independent B cell and T helper cell peptide epitopes
US5874083A (en) Immunopotentiating complexes comprising TraT proteins
JPH04502402A (ja) 組み換えフラジエリンのワクチン
EP0356340B1 (en) Affinity associated vaccine
CN101094685B (zh) 鞭毛蛋白在鼠疫耶尔森氏菌的免疫疗法中的用途
JPH11509200A (ja) 粘膜アジュバントとしてのクロストリジウム・ディフィシール（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシン
Beachey et al. Opsonic antibodies evoked by hybrid peptide copies of types 5 and 24 streptococcal M proteins synthesized in tandem.
EP0725653B1 (en) Vaccine compositions
US4919930A (en) Synthetic M proteins-streptococci type 5
US5897873A (en) Affinity associated vaccine
EA004797B1 (ru) Иммуногенные липосомные композиции
AU7300091A (en) Lfa-3 as a vaccine adjuvant
JPS58500998A (ja) 腸内毒素生成原であるエシエリキア　コリによつて起される下痢症を予防するための新規免疫原組成物
WO1990001947A1 (en) Affinity associated vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU