NO330685B1

NO330685B1 - Immunogene liposompreparat samt fremgangsmate for fremstilling av dette

Info

Publication number: NO330685B1
Application number: NO20011406A
Authority: NO
Inventors: Gary Fujii; Jill Adler-Moore; Donald V Cramer; William A Ernst; L Jeanne Perry
Original assignee: Molecular Express Inc
Priority date: 1998-09-22
Filing date: 2001-03-20
Publication date: 2011-06-06
Also published as: EA200100269A1; UA75327C2; EP1115382A2; PL206260B1; SK287670B6; HUP0105391A3; CA2344173A1; MXPA01002973A; IL141675A; NO20011406L; CZ20011013A3; HK1039064A1; KR20010075261A; ID29082A; IL141675A0; BG65675B1; NZ510442A; DE69942393D1; WO2000016746A2; ZA200101829B

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse omfatter immunogent liposompreparat samt fremgangsmåte for fremstilling av dette.

Anvendelse av vaksiner har historisk frembrakt en sikker og effektiv metode for å beskytte store populasjoner mot et bredt spekter av infeksjonssykdommer. Immunisering mot virus og andre mikroorganismer er vanligvis sikkert og effek-tivt, og har vært ansvarlig for mye av den forbedring i leve-tid som oppleves hos individer i de utviklede land. Et antall skadelige bivirkninger kan imidlertid oppstå, avhengig av egenskapene til vaksinen og det spesifikke immunogen. Inadekvat inaktivering av intakt virus har tidligere ført til utilsiktede infeksjoner i stedet for beskyttelse etter vaksinasjon (Tigertt, 1959, Military Med., 124:342). Av og til kan immunisering med intakte organismer, slik som influensa, på-skynde utvikling av autoimmune sykdommer rettet mot normalt vev, slik som Guillain Barre-syndromet (Langmuir et al., 1984, J. Epidemiol., 113:841). I tillegg til stoffene selv kan tilstedeværelse av substanser fra celler eller komplekse media muliggjøre induksjon av allergiske reaksjoner mot fremmede proteiner (Yamane og Uemura, 1988, Epidem. Inf., 100:291). Siden effektive vaksinasjonsprosedyrer ofte krever flere immuniseringer, kan disse skadelige reaksjoner redusere effektiviteten av vaksinen og kan redusere den alminnelige tole-ranse for vaksinasjonsprosedyren. Moderne molekylærbiologiske teknikker er nylig blitt testet i et forsøk på å frembringe forbedret sikkerhet og effektivitet ved nye vaksinepreparater. Mulige strategier som for tiden undersøkes, omfatter: vaksiner basert på rekombinante DNA-teknikker (Conry et al., 1994, Cancer Res., 54:1164; Hu et al., 1988, J. Virol., 52:176), dannelse av enkle syntetiske peptider som antigener (Nardelli et al., 1992, Vaccines, 8:1405; Watari et al., 1987, J. Exp. Med., 155:459) og direkte injeksjon av genetisk materiale til vev for å stimulere beskyttende responser (Ulmer et al., 1993, Science, 253:1745). I særdeleshet har anvendelse av enkle peptidantigener for å indusere spesifikk immuniseringsrespons vært det sentrale ved mange studier. Denne strategien er attraktiv fordi den har mulighet for å frembringe immunologisk spesifisitet, tettere kontroll av fremstillingsprosessene og eliminering av det meste av sekundære kildematerialer eller forurensende stoffer forbundet med produksjon av immunogenet.

WO 8702250 Al (Moiken) 1986.10.16 angår en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent kompleks bestående av antigener eller antigene determinanter med hydrofobe domener som blandes med en eller flere løsningsmidler og danner komplekser mellom aktuelle antigener og løsningsmidlet.

Anvendelse av rensede proteiner eller peptidfragmen-ter for vaksinasjon avhenger imidlertid av avleveringen av materialet til immuniseringsstedet ved hjelp av en effektiv antigenbærer. Potensielt har en av de sikreste bærerne vært lipid-/liposombaserte vaksinekomplekser. Liposomer har lenge vært etablert som kommersielt tilgjengelig teknologi fordi de kan redusere medikamenttoksisitet, forlenge sirkulasjonen i blodstrømmen og endre biodistribusjonen og farmakokinetikken til medikamentmolekylene (Fujii, 1996, Vesicles, red. M. Rosoff, Marcel Dekker, New York NY, s. 491). Når liposomer administreres in vivo, sirkulerer de i blodet og fjernes ved monocytt-/makrofagfagocytosesystemet, spesielt i lever, milt, lymfeknuter og lungevev (Claasen, 1996, Vesicles, red. M. Rosoff, Marcel Dekker, New York NY, s. 649). Liposomenes evne til å styre det antigene distribusjonsmønster antyder at et liposomalt immunogen ville bli maksimalt eksponert for immunsystemet. Frem til i dag er flere lipidbaserte systemer blitt testet, inkludert peptider konjugert til lipider (Nardelli et al., 1992, Vaccines, 8:1405; Watari et al., 1987, J. Exp. Med., 155:459), rekonstitusjon av hele protein-subenheter i nærvær av lipider (Morein og Simons, 1985, Vaccines, 4:166; Gregoriadis, 1995, Tibtech, 13:527) og assosiering av proteiner med fordannede liposomer (Therien og Shahum, 1989, Immunol. Lett., 22:253; Alving et al., 1985, Vaccines, 4:166). Mens disse strategier er vist å være immunologisk aktive, gjør tekniske vanskeligheter forbundet med storskalaproduksjon av proteiner og deres lipidbærere, så vel som kostnadsrestriksjoner, dem mindre attraktive som kommersiell teknologi. Følgelig er det behov for et forbedret system eller en fremgangsmåte for å fremstille proteinantigener som gjør nytte av det potensialet som ligger i liposomer for vaksineutvikling.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse frembringer et immunogent liposompreparat, kjennetegnet ved at det omfatter:

vesikkeldannende lipider; og

et antigent proteinkonstrukt som er et vandig, løselig fusjonsprodukt omfattende én eller flere antigen determinanter og et hydrofobt domene, der det hydrofobe domenet er assosiert med membranen til liposompreparatet.

Foreliggende oppfinnelse frembringer også en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent liposompreparat, kjennetegnet ved at den omfatter: uttrykking av et gen som koder for et vandig, løselig fusjonsprotein omfattende en antigen determinant og et hydrofobt domene, og (a) oppløsning av vesikkeldannende lipider og fusjonsproteinet i et egnet organisk løsningsmiddel; dannelse av en lipidfilm eller spraytørket pulver ved fordamping av det organiske løsningsmiddel; hydratisering av lipidfilmen eller pulveret; og dispergering av den hydratiserte lipidfilm eller -pulver for å danne et immunogent liposompreparat,

eller

(b) oppløsning av fusjonsproteinet i en vandig buffer;

hydratisering av enten et lipidpulver eller en lipidfilm med bufferen inneholdende fusjonsproteinet; og dispergering av lipidpulveret eller -filmen for å

danne et immunogent liposompreparat, eller

(c) oppløsning av fusjonsproteinet i en vandig buffer; og tilsetning av fusjonsproteinet til på forhånd formede liposomer for å danne et immunogent liposompreparat.

Utfyllende informasjon

Fortrinnsvis er det hydrofobe domenet et peptid, og ifølge én foretrukket utførelsesform bestående av fra ca. 15 til ca. 500 aminosyrerester, mer foretrukket mindre enn 300, og helst mindre enn 50 rester, der minst én eller flere av aminosyrene er valgt fra gruppen bestående av Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val.

Ifølge én utførelsesform omfatter det immunogene liposompreparat ytterligere ett eller flere hjelpestoffer. Eksempler på egnede hjelpestoffer omfatter lipofile molekyler, slik som lipid A og andre lipopolysakkarider, Quil A, QS21, MF5 9, P3CSS, MTP-PE, så vel som vannløselige molekyler, inkludert cytokiner, slik som IL-2, IL-4, IL-12, interferonene og lignende. Andre eksempler på cytokiner gis i tabell 1 nedenfor.

Ifølge en annen utførelsesform omfatter det antigene konstrukt ytterligere en linkerregion som forbinder de antigene determinanter med det hydrofobe domenet. I én foretrukket utførelsesform er linkerområdet et peptid bestående av fra 1 til ca. 200 aminosyrerester. Fortrinnsvis er aminosyrerestene naturlig forekommende aminosyrer, slik som Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og/eller Val.

Det beskrives også en fremgangsmåte for å indusere en immunogen respons i et vertsdyr omfattende administrering av en immunogent effektiv mengde av et liposompreparat beskrevet nedenfor. Selv om verten kan være ethvert dyr omfattende fjærkre, er vertsdyret fortrinnsvis et pattedyr, og helst et menneske. I særskilt foretrukne utførelsesformer utgjør det immunogene liposompreparat ett eller flere egnede hjelpestoffer.

Det beskrives videre en DNA-kassett for innføyelse i en vektor omfattende sekvenser som koder for et immunogent fusjonsprotein, der fusjonsproteinet omfatter et hydrofobt proteindomene og én eller flere antigene determinanter.

Det beskrives videre en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent liposompreparat omfattende: uttrykking av et gen som koder for et fusjonsprotein omfattende en antigen determinant og et hydrofobt domene; oppløsning av fusjonsproteinet i en vandig buffer; hydratisering av enten lipidpulver eller lipidfilmer med bufferen som inneholder fusjonsproteinet; og dispergering av lipidpulveret eller -filmene for å danne et immunogent liposompreparat.

Det beskrives også en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent liposompreparat omfattende: uttrykking av et gen som koder for et fusjonsprotein omfattende en antigen determinant og et hydrofobt domene; oppløsning av fusjonsproteinet i en vandig buffer; og tilsetning av fusjonsproteinet til forformede liposomer for å danne et immunogent liposompreparat.

Det beskrives videre en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent lipidemulsjonspreparat omfattende: uttrykking av et gen som koder for et fusjonsprotein omfattende en antigen determinant og et hydrofobt domene; og fremstilling av et immunogent lipidemulsjonspreparat ved enhver fremgangsmåte beskrevet ovenfor ved hjelp av en lipid-dispersjon (f.eks. en olje, slik som soyabønneolje) i stedet for liposomer.

Det beskrives også en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent liposom- eller lipidemulsjonspreparat omfattende: kjemisk syntese av et fusjonsprotein omfattende en antigen determinant og et hydrofobt domene; og fremstilling av et immunogent liposom- eller lipidemulsjonspreparat ved enhver fremgangsmåte beskrevet ovenfor.

Oppfinnelsen omfatter også et immunogent liposompreparat som kan erholdes ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen .

Som anvendt her i dokumentet, betyr "assosiert med membranen" at det hydrofobe domenet i det minste delvis er innstøpt i liposommembranen, og fortrinnsvis ikke er kovalent bundet til de vesikkeldannende lipider. Det hydrofobe domenet kan også være bundet til en lipidfettsyre-"hale" som selv er innstøpt i membranen.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser effektiviteten til et liposompreparat ifølge foreliggende oppfinnelse til å beskytte mot HSV2. Figur 2 viser en sammenligning av effektiviteten til et liposompreparat ifølge oppfinnelsen med andre vaksinepreparater. Figur 3 viser overlevelseskurven for mus som demon-strerer evnen til det liposomale HSV2g(1-23)-HD til å lokke frem en beskyttende immunrespons.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse frembringer et antigen-avleveringssystem utformet for å forbedre effektiviteten og sikkerheten ved immunisering mot en mengde mikrobielle stoffer og cancere. Immunogenet kan kodes av en genkassett som består av et hydrofobt domene (HD) fusjonert med en spesifikk anti-gensekvens. Et plasmid som inneholder nukleinsyresekvensen som koder for HD og den antigene epitop, fremstilles og uttrykkes i en egnet vert, slik som f.eks. E. coli, P. pastoris, insekt-celler, COS-l-celler eller CHO-celler (Genetic Engineering News, 18:11 (1998)). Med en gang proteinet er blitt uttrykt og renset, formuleres det i et liposom. I nærvær av en membran assosierer proteinet med lipidbilaget og danner en stabil struktur med den hydrofobe delen assosiert med membranen og den antigene epitop orientert mot det vandige medium. Plasmidet kan konstrueres med restriksjonsseter på nøkkel-posisjoner slik at forskjellige antigene epitoper enkelt kan substitueres, følgelig frembringes evnen til å utnytte ulike antigene epitoper for å frembringe maksimal beskyttelse etter immunisering. Et av de unike trekk ved denne kassetten er at proteinkomponenten kan produseres i vertscellen i store mengder, renses enkelt og deretter inkorporeres i liposomer. Dette gir maksimal fleksibilitet for å bestemme den mest tilfredsstillende epitop som frembringer beskyttelse mot de mikrobielle stoffer eller fra cancere, samtidig som det virke-lige mål med storskalafremstilling og kommersiell distribu-ering av vaksinen opprettholdes.

Følgelig frembringer foreliggende oppfinnelse flere fordeler: (1) epitoper kan enkelt endres for å frembringe maksimal fleksibilitet ved vaksineutforming; (2) multiple epitoper kan innføyes i bærermolekylet; (3) store antigen-sekvenser (det vil si kappeproteiner eller reseptordomener) eller subenheter kan inkluderes hvis ønskelig; og (4) det uttrykte bærerprotein er vannløselig og kan enkelt renses ved standard proteinfremstillingsmetoder. Syntese av antigen- konstruktet som et vandig, løselig fusjonsprodukt minimali-serer potensielle storskalaproduksjonsproblemer forårsaket av den hydrofobe region til proteinet. Følgelig vil konstruksjon av et protein som har et hydrofobt domene for liposommembran-innføyelse og som fortsatt er vannløselig, være en hoved-fordel. I noen tilfeller kan en liten mengde løseliggjørende stoff, slik som guanidin, urea, natriumdodecylsulfat, oktyl-glukosid eller deoksycholat, anvendes under renseprosedyren. Foreliggende oppfinnelse frembringer også konstrukter som omfatter to eller flere antigener. Slike konstrukter kan betegnes som:

Oppfinnelsen vurderer også anvendelse av naturlig av-ledede eller syntetiske enkle transmembranhelikser, eller heliksbunter (2-12) . De antigene seter kan være lokalisert ved den N- eller C-terminale ende eller lokalisert mellom sløyfer dannet mellom de individuelle trådene i bunten.

Betegnelsen "antigen" anvendt her i dokumentet, hen-viser til enhver substans (inkludert et protein eller protein-polysakkarid, lipopolysakkarid, mikrobiell subenhet, helt patogen eller cancermarkører) som når den er fremmed for vertsdyret, og ved å få tilgang til vev hos et slikt dyr, stimulerer makrofager, antigenpresenterende celler og dannelse av antigenspesifikke antistoffer, og reagerer spesifikt in vivo eller in vitro med slike antistoffer. Videre stimulerer antigenet proliferasjonen og/eller aktiveringen av T-lymfocytter med reseptorer for antigenet og kryssreagerende antigener (f.eks. naturlige dreper(NK)celler, cytotoksiske T-celler og T-hjelperceller), og kan reagere med lymfocytter for å initiere serier av responser betegnet cellemediert immuni-tet. I de immunogene preparater ifølge foreliggende oppfinnelse er det foretrukket at antigenet er til stede i en mengde på ca. 0,1-20 mg/ml antigen-HD. Mer foretrukket er antigenet til stede i en mengde på ca. 0,5-5 mg/ml antigen-HD.

En "antigen determinant" er en del av et antigen eller et antigent konstrukt som bestemmer dens immunologiske spesifisitet. Vanligvis er en antigen determinant, eller et hapten, et peptid, protein eller polysakkarid i naturlig forekommende antigener. Syntetiske antigener kan være en substans med lav molekylvekt, slik som et arsanilinsyrederivat. En antigen determinant vil reagere spesifikt in vivo eller in vitro med et antistoff eller T-lymfocytter indusert av en antigen form av den antigene determinant (f.eks. den antigene determinant bundet til en immunogen substans).

Antigene determinanter som kan anvendes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, kan være avledet f.eks. fra antigenene presentert nedenfor:

<a>For en oversikt, se Pass, 1996, Inf. Ag. Dis., 5:240; Avery, 1998, Curr. Op. Cardiol., 13:122<b>Disse virus er alle flavivirus - beskrevet av Venugopal og Gould, 1994, Vaccine, 12:966 °For en oversikt, se Adimora et al., 1994, Inf. Dis. Clin. N. Amer., 8:859<d>For en opplisting av HIV-antigener, se HIV Molecular Immuno-logy Database, publ. Theoretical Biology and Biophysics, New Mexico (1995)<e>For en opplisting av rotavirusantigener, se "Rotavirus Antigens", Hoshino and Kapikian, 1994, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 185:179 <*>For en generell oversikt, se Middlebrook og Dorland, 1984, s. 199

Ytterligere eksempler på antigener og patogener som kan anvendes, finnes i Milich, 1989 (Adv. Immunol., 45:195), Hoshino og Kaplan, 1994 (Curr. Top. Microbiol. Immunol., 185:179) eller Venugopal og Gould, 1994 (Vaccine, 12:966). Ifølge én utførelsesform anvendes gp 12 0-subenheten av env-genet og p27 av gag-genet fra humanimmundeficiensvirus (HIV). I en annen utførelsesform kan den antigene determinant være avledet fra et antigen utvalgt fra HSV-gD eller -gB, HIV-gpl20, CMV-gB, HCV-E2, INFV-HA eller -NA, H. influenzae P5 eller P6, fimbrialt protein og protein D.

Som anvendt her i dokumentet, betyr betegnelsen "hydrofobt domene" (HD) ethvert protein, peptid, lipid eller molekyl med et hydrofobt område eller en struktur med et over-flateareal større enn 500Å. Eksempler på potensielle HD-er omfatter ethvert transmembrant (TM) segment (f.eks. glykoforin A; Tomita og Marchesi, 1975, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72:2964), det hydrofobe domenet til cytokrom b5(Taylor og Roseman, 1995, BBA, 1278:35), T-domenet til difteritoksin (Choe et al., 1992, Nature, 357:216), domene II til Pseudo-monas eksotoksin A (Allured et al., 1986, PNAS, 83:1320), 4-heliksbunten av penicillinsensorisk transduser (Hardt et al., 1997, Mol. Microbiol., 23:935), 7-heliksbunten av bakterio-rhodopsin (Henderson og Unwin, 1975, Nature, 257:28), 12-heliksbunten av lac-permease (Kaback et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol., 7:537) og det poredannende domenet til colicin (Parker et al., 1989, Nature, 357:93).

Betegnelsen "vektor" anvendt her i dokumentet, betegner en nukleinsyre (f.eks. DNA) avledet fra et plasmid, kosmid, fagmid eller en bakteriofag eller syntetisk avledet, hvori fragmenter av nukleinsyrer kan innføyes eller klones. Vektoren kan inneholde ett eller flere unike restriksjonsseter for denne hensikt, og kan være i stand til autonom replikasjon i en definert vert eller organisme, slik at den klonede sekvens reproduseres. Vektormolekylet kan meddele noen vel-definerte fenotyper hos vertsorganismen som enten er selekter-bare eller enkle å påvise. Noen komponenter av en vektor kan være et DNA-molekyl som inkorporerer reguleringselementer for transkripsjon, translasjon, RNA-stabilitet og -replikasjon og andre DNA-sekvenser.

Betegnelsen "DNA-kassett" anvendt her i dokumentet, betegner genetiske sekvenser i vektoren som kan uttrykke fusjonsproteinet beskrevet her i dokumentet. Nukleinsyre-kassetten er orientert posisjonelt og sekvensielt i vektoren, slik at nukleinsyren i kassetten kan transkriberes til RNA, og om nødvendig translateres til fusjonsproteinproduktet. Fortrinnsvis har kassetten sine 3' og 5<1>ender tilpasset for enkel innføyelse i en vektor, f.eks. har den restriksjonsendo-nukleaseseter ved hver ende.

Mens det er foretrukket at de antigene konstrukter produseres ved rekombinante teknikker, forstås det at konstruktene kan syntetiseres ved enhver kjent fremgangsmåte innen teknikken, slik som f.eks. kjemiske metoder. Dette kan være spesielt nyttig når en ikke-peptidlinker skal anvendes, eller der det hydrofobe domenet omfatter en ikke naturlig forekommende aminosyrerest eller -etterligning. Mens den foretrukne utførelsesform gjør bruk av rekombinante fremgangsmåter for å frembringe det antigene fusjonsprotein, frembringer også foreliggende oppfinnelse følgelig en fremgangsmåte omfattende: fremstilling av de antigene konstrukter ved kjemiske syntetiske metoder eller ved en kombinasjon av rekombinante og kjemiske fremgangsmåter og fremstilling av en immunogen lipid-formulering, som beskrevet ovenfor.

I tillegg til den foretrukne peptidlinker kan andre linkere kjent innen teknikken anvendes for å binde antigenet til det hydrofobe domenet. Eksempler på slike linkere inkluderer, men er ikke begrenset til, polyetylenglykoler, poly-sakkarider, polysialinsyrer, ravsyre, butandisyre, adipinsyre og standard kryssbindingskjemikalier, slik som SMPT (4-suksin-imidyloksykarbonyl-a-metyl-a-(2-pyridylditio)toluen), DSP (di-tiobis(suksinimidylpropionat)), EGS (etylenglykolbis(suksin-imidylsuksinat)) , SMCC (4-suksinimidyloksykarbonyl-4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-l-karboksylat) og SPDP (N-suksin-imidyl-3-(2-pyridylditio)propionat) (se også Pierce katalog, Pierce Chemical Co., Rockford, IL).

Liposomet spiller en kritisk rolle ved antigenav-levering, siden antigen-liposomkomplekset presenteres direkte for immunsystemet etter fjerning fra sirkulasjonen av celler fra immunsystemet. I tillegg kan valget av immunstimulerende reaksjonsveier endres ved å gjøre endringer i lipidsammen-setningen av liposomet. For eksempel kan ulike immunstimulerende molekyler, slik som lipid A (Asano og Kleinerman, 1993, J. Immunother., 14:286), P3CSS (Lex et al., 1986, J. Immunol., 137:2676), muramyldi- og -tripeptid-PE (Fidler et al., 1981, PNAS, 78:1680; Alving et al., 1985, Vaccines, 4:166) og kationiske lipider (Walker et al., 1992, PNAS, 83:7915), formuleres i liposomene for å stimulere ulike immunologiske reaksjonsveier. Andre hjelpestoffer, slik som f.eks. MF59, Quil A, QS21 eller alum, kan anvendes sammen med antigen-liposomkomplekset. I tillegg kan immunregulerende molekyler, slik som cytokiner, tilsettes for å frembringe en immunrespons.

Liposomene som ble anvendt ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, kan tilberedes fra et bredt spekter av vesikkeldannende lipider inkludert fosfatidyletere og -estere, slik som fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylserin (PS), fosfatidylglyserol (PG) og fosfatidylcholin (PC); glyserider, slik som dioleoylglyserosuksinat; cerebrosider; gangliosider; sfingomyelin; steroider, slik som kolesterol; og andre lipider så vel som andre eksipienser, slik som vitamin E- eller vitamin C-palmitat (se også US-patenter nr. 4 235 871, 4 762 720, 4 737 323, 4 789 633, 4 861 597 og 4 873 089). Eksempler på PC-baserte lipider inkluderer, men er ikke begrenset til, (C-18)distearoylfosfatidylcholin (DSPC); (C-16)dipalmitoyl-fosfatidylcholin (DPPC); (C-14)dimyristoylfosfatidylcholin (DMPC) og (C-18, umettet)dioleylfosfatidylcholin (DOPC). Det foretrekkes at lipidene er i væskefase ved kroppstemperatur (ca. 38-39 °C) . Derfor er lipider med en Tm over kroppstemperatur, slik som DSPC og DPPC, mindre foretrukket (men kan allikevel fortsatt være nyttige). Lipider med en Tm under kroppstemperatur, slik som DMPC eller DOPC, er mer foretrukket. I tillegg er det foretrukket at lipidformuleringen ikke inneholder mer enn ca. 10 % kolesterol. Spesielt foretrukne lipidblandinger omfatter ca. 0-10 % kolesterol, ca. 0- 15 % PG og ca. 0-100 % PC. I spesielt foretrukne utførelses-former kan blandingen i tillegg omfatte ca. 1-10 % hjelpestoffer; fortrinnsvis er et hjelpestoff til stede i en mengde mindre enn ca. 5 %.

Fremstilling av liposomer er vel kjent innen teknikken. Generelt er liposomer blitt laget ved flere forskjellige teknikker, inkludert etanolinjeksjon (Batzri et al., 1973, Biochem. Biophys. Acta, 238:1015); eterinfusjon (Deamer et al., 1976, Biochem. Biophys. Acta, 443:629; Schieren et al., 1978, Biochem. Biophys. Acta, 542:137); detergentfjerning (Razin, 1972, Biochem. Biophys. Acta, 255:241); løsnings-middel fordamping (Matsumato et al., 1977, J. Colloid Interface Sei., 52:149); fordamping av organiske løsningsmidler fra kloroform i vannemulsjoner (REV) (Szoka jr. et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:4194); ekstrudering av MLV eller EUV gjennom en nukleoporpolykarbonatmembran (Olson et al., 1979, Biochem. Biophys. Acta, 557:9; frysing og tining av fosofolipidblandinger (Pick, 1981, Archives of Biochem. and Biophysics, 212:186), så vel som sonikering og homogenisering.

Ved konvensjon kategoriseres liposomer etter størrel-se, og et 3-bokstavakronym anvendes for å betegne typen liposom som diskuteres. Multilamellære vesikler betegnes vanligvis "MLW". Små unilamellære vesikler betegnes "SUV", og store unilamellære vesikler betegnes "LUV". Disse betegnelser etter-følges noen ganger av den kjemiske blandingen av liposomet. For en diskusjon av nomenklatur og en oppsummering av kjente typer av liposomer, se Storm et al., 1998, PSIT, 1:19-31.

Foreliggende oppfinnelse betrakter anvendelse av liposomblandinger med et egnet hjelpestoff. Imidlertid vurderer også foreliggende oppfinnelse anvendelse av det antigene konstrukt, som ikke er assosiert med et liposom, i kombinasjon med et egnet hjelpestoff. Følgelig omfatter vaksinen eller det immunogene preparat to komponenter: et antigen bundet til et hydrofobt domene; og et egnet hjelpestoffsystem. Eksempler på potensielle farmasøytisk akseptable bærersystemer som kan anvendes, inkluderer, men er ikke begrenset til, liposomer, emulsjoner, Freunds adjuvans (fullstendig eller ufullstendig) , alum, ISCOMS og kappevirus.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen vil anvende en immunogent effektiv mengde av liposompreparatet, det vil si en mengde av preparatet som i kombinasjon med enhver tilført eksipiens eller bærer vil resultere i en påvisbar immunogen respons hos verten. Der preparatet vil anvendes som et vaksinepreparat, vil den effektive mengde være den mengde som i kombinasjon med enhver tilført eksipiens eller bærer vil forårsake at verten produserer en spesifikk og tilstrekkelig immunologisk respons, slik at den tilfører beskyttelse av verten for senere eksponering for en mikrobe (profylaktisk vaksinasjon), eller meddeler beskyttelse av den allerede syke verten (terapeutisk vaksinasjon).

Oppfinnelsen er nå blitt generelt beskrevet, det samme vil bli bedre forstått ved henvisning til de følgende detaljerte eksempler.

Eksempler

Eksempel I

HSV2

Fremstilling av HSV2gD( 1- 23)- TM

Det N-terminale 23. aminosyresegment fra gD-kappe-proteinet til HSV2 ble koblet til et transmembrant (TM) segment ved kjemisk syntese på en automatisert peptidsyntese-maskin. Det syntetiserte peptid ble spaltet ved standard HF-spaltemetoder og renset ved preparativ HPLC ved anvendelse av en "Waters C18"-kolonne og 100 % acetonitrilmobilfase med 0,1 % TFA. Peptidet ble vist å være minst 95 % rent ved masse-spektrometri og kapillærelektroforese.

Liposomfremstilling

Liposomene fremstilles ved probesonikering ifølge tidligere beskrevne fremgangsmåter (Fujii et al., 1997, Biochemistry, 35:4959). Kortfattet oppløses lipidene (med eller uten protein) i et organisk løsningsmiddel, slik som kloroform/metanol. Tynne lipidfilmer dannes ved å pipettere aliquoter av lipidløsningen i rundbunnede glassrør og fordampe løsningsmidlet ved 65 °C under en strøm av nitrogengass. Filmene plasseres under vakuum i minst 8 timer for å fjerne rester av organisk løsningsmiddel. Fremstilling av liposomer fullføres ved hydratisering av lipidfilmene med buffer og inkubering av suspensjonen ved 65 °C i 5-10 minutter før probesonikering. Liposomene filtreres deretter gjennom et 0,22 um filter for å sterilisere preparatet. Liposomene størrelses-bestemmes ved dynamisk lysspredning, og dannelsen av aggregater følges i minst 4 uker.

En særskilt foretrukket liposomal HSV2gD(1-23)-TM-formulering har et molart forhold på 15:2:3 av DMPC:Chol:DMPG (dimyristoylfosfatidylcholin:kolesterol:dimyristoylfosfatidyl-glyserol) , med 2,5 vekt% lipid A.

Vaksinasionsprosedyrer og testing av induksjon av immunrespons mot virusantigen

BALB/c- eller C57BL/6-hunnmus (6-8 uker gamle) injiseres subkutant én gang pr. uke il, 2, 3 eller 4 uker med testvaksinepreparatet eller buffer. Injeksjonsstedet kontrolleres for skadelige reaksjoner, slik som utvikling av granulomer og/eller skorpedannelse. Når dyrene immuniseres med vaksinen via den intranasale rute, anesteseres de med halotan, og preparatet (10-20 u.1) administreres til neseborene for inspirasjon ved hjelp av en steril tipp på en mikropipette (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis., 158:622).

Ved regelmessige intervaller under vaksinasjonsprosedyren og etter virusutformingen måles immunresponsen hos musen overfor virusantigenet. Den virusnøytraliserende antistofftest utføres ved anvendelse av 24-brønners plater inneholdende 1 x 10<5>BHK-celler der det er blitt tilsatt ulike fortynninger av museserum blandet med virus. Etter 48-72 timers inkubering ved 37 °C i en C02-inkubator undersøkes cellemonolagene for cytotoksisitet, og titeren av nøytraliserende antistoff analyseres. Presipiterende antistoffer med viruset måles ved å inkubere ulike fortynninger av serum med 5-10 u.g virusantigen eller 25-50 u.1 HSV2-løsning (1 x 10<5>PFU) . Liposomer inneholdende den antigene epitop anvendes også som mål for en antistoff-ELISA-analyse, som beskrevet tidligere (Tuso et al., 1993, Transplantation, 55:1375). Resultatene fra den sistnevnte analysen anvendes for å måle nivået av binding og isotypekonfigurasjon til antistoffene.

En forsinket type hypersensitivitetsrespons overfor virusantigenet hos vaksinerte mus undersøkes ved anvendelse av en fotbladanalyse. Vaksinerte dyr anesteseres med halotan og injiseres med 50 u.1 HSV2 inaktivert ved ultrafiolett stråling i én bakfot og 50 u.1 lyserte uinfiserte celler i den andre bak-foten. 24, 48 og 72 timer senere måles graden av svelling i fotbladet hos musen ved anvendelse av et skyvelær og sammenlignes med utgangsmålingene. T-celleaktiviteten hos disse dyrene måles også ved produksjon av cytokiner som respons på inkubering av milt-T-celler med virusantigen. Miltene fjernes fra de vaksinerte dyrene, og milthomogenater fremstilles ved forsiktig oppbrytning av miltene med en steril nål og pressing av cellene gjennom et nylonmaskenett. Cellesuspensjonene skylles og sås ut ved 1 x 10<6>celler/brønn i en 96-brønners mikrotiterplate. Etter inkubering av cellene ved 37 °C i 3-4 dager med ulike mengder virusantigen ble supernatantene fra brønnene høstet og testet for tilstedeværelse av cytokiner. Kommersielt tilgjengelige cytokin-ELISA-sett anvendes for å bestemme cytokinprofilen (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y, p-aktin og TNF-a fra PharMingen, Inc. (San Diego, CA)). Deteksjon av cytokinproteinet i vevskultursupernatantene ved hjelp av sandwich-ELISA utføres ved bruk av monoklonale antistoffer (mAb-er) spesifikke for de særskilte cytokiner. Kortfattet belegges ELISA-plater over natten med et rotte-antimusecytokin-mAb. Platene blokkeres med 3 % føtalt kalveserum i PBS i 2 timer, deretter tilsettes aliquoter av hver testprøve til hver brønn. Cytokinspesifikt, biotinylert rotte-antimuse-mAb tilsettes hver brønn, etterfulgt av avidinperoksidase. En fargereaksjon oppnås ved tilsetning av kolorimetriske substrater. Platene avleses i et ELISA-spektrofotometer, og cytokinkonsentrasjonene beregnes ut fra en standardkurve oppnådd fra rekombinante kontrollcytokiner.

HSV2- museencefalittmodell for testing av liposomale vaksine-preprater

Vaksinerte eller uvaksinerte (kontroll) BALB/c-hunnmus (10-12 uker gamle) utfordres intraperitonealt med en letal dose (1 x 10<5>PFU) av HSV2 som passerer til hjernen. De musene som utfordres intravaginalt med en letal dose av HSV2, er først forbehandlet med subkutant østrogen 1 uke før utfordringen og dag (-1) før utfordringen. De anesteseres deretter med en intraperitoneal injeksjon av acepromazin og ketamin. HSV2 (10-30 u.1) administreres deretter intravaginalt ved anvendelse av en steril tipp på en mikropipette etter først å ha vasket vagina med en tørr "Calgiswab" (McDermott et al., 1984, J. Virol., 51:747). Dyrene følges i 80 dager etter utfordringen med hensyn til overlevelse (daglig), vekttap (annenhver dag de første 2 ukene og deretter én gang pr. uke), pels-utseende og neurologiske symptomer (redusert aktivitetsnivå, trekking på lemmene eller paralyser).

Antigenindusert T- celleproliferasjon

Sensibilisering av verten for gD-antigenet måles ved anvendelse av en antigenindusert T-celleproliferasjonsanalyse. Milthomogenater fremstilles ved forsiktig å bryte opp miltene med en steril nål og presse cellene gjennom et nylonmaskenett. Cellene suspenderes i RPMI 1640-medium inneholdende 10 % føtalt kalveserum (FCS), 10 mM Hepes-buffer, L-glutamin (2 mM) , penicillin (25 IU/ml) og streptomycin (25 u.g/ml) . Cellene dyrkes ved en konsentrasjon på 1 x IO<6>celler/ml med eller uten gD (5-20 u.g/ml) i 96-brønners, rundbunnede plater i 4 dager i 5 % C02. Kulturene tilsettes 2 0 u.1 resazurinf arge-stoff i 3 timer, og deretter måles fluorescensen på Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc., Farmington, MA).

Cytokinspesifikke mRNA- analyser

T-celler fra immuniserte og ikke-immuniserte dyr undersøkes for cytokinspesifikke mRNA-nivåer av hovedcyto-kinene som kan gjenspeile sensibilisering forbundet med immunisering, inkludert IL-2, IFN-y, IL-4, IL-5, IL-6 og IL-10. T-cellene oppnås fra miltene, som beskrevet tidligere. Total-RNA isoleres ved modifisering (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg., 1:16) av en metode beskrevet av Chomczynski og Sacchi (Chomczynski et al., 1987, Analyt. Biochem., 152:156). Ferske eller fryste celler (2 x IO<6>) sprenges i 1 ml denatu-rer ingsløsning (4 mM guanidintiocyanat, 2 5 mM natriumsitrat (pH 7,0), 0,5 % sarkosyl og 0,1 mM 2-merkaptoetanol). RNA presipiteres ved inkubering med 1 volum isopropanol over natten ved -20 °C. Konsentrasjonen av total-RNA justeres til 260 nM, og prøvene lagres ved -80 °C inntil de analyseres.

Cytokinanalysen utføres ved modifisering av en fremgangsmåte beskrevet av Cosenza et al. (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg., 1:16). Enkelttrådet cDNA fremstilles ved transkripsjon av 2 u.g total-RNA i 2 0 u.1 total reaksjonsblanding ved anvendelse av fjærkremyeloblastosevirus-reverstranskriptase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Sekvensspesifikke oligonukleotidprimere for murine cytokiner (tabell 1) anvendes for å amplifisere DNA-fragmentene av på forhånd bestemt størrelse for hvert av cytokingenene av interesse.

PCR-blandingen består av 1 u.1 cDNA, 2,5 u.1 10 x PCR-buffer, 1 u.1 av både 5'- og 3'-primere, 2,5 u.1 av 10 x dNTP

(2 mmol/1) og 0,125 u.1 T. aquaticus termostabil DNA-polymerase (Boehringer Mannheim) i et sluttvolum på 25 u.1. Spesifikke |3-aktinprimere anvendes for å amplifisere et 548 bp fragment som en intern kontroll. PCR-blandingen dekkes med en mineralolje, og amplifiseringen utføres etter inkubering av blandingen i 7 minutter ved 94 °C, 3 8 sykluser med 3 0 sekunders denaturering ved 94 °C, 4 5 sekunders primerannealing ved 6 0 °C, 6 0 sekunders forlengelse ved 72 °C og en 7 minutters inkubering ved 72 °C. PCR-produktene separeres på agarosegel i nærvær av etidiumbromid. Båndene visualiseres under UV-lys, fotograferes og kvantifiseres densitometrisk fra fotografiet ved anvendelse av databehandlingsprogrammet "Molecular Analyst" (Bio-Rad, Richmond, CA).

Cvtokinmåling ved hjelp av ELISA

Kommersielt tilgjengelige cytokin-ELISA-sett anvendes for å bestemme cytokinprofilen sekrert av milt-CD4<+->T-celler isolert fra immuniserte og ikke-immuniserte dyr. Deteksjon av cytokinproteinet i vevskultursupernatanter fra milt-T-celler ved hjelp av sandwich-ELISA utføres ved anvendelse av monoklonale antistoffer (mAb-er) spesifikke for de særskilte cytokiner. Kortfattet belegges ELISA-plater over natten med et rotte-antimusecytokin-mAb. Platene blokkeres med 3 % FCS i PBS i 2 timer, deretter tilsettes aliquoter av hver prøve til hver brønn. Cytokinspesifikt, biotinylert rotte-antimuse-mAb tilsettes hver brønn, etterfulgt av avidinperoksidase. En fargereaksjon oppnås ved tilsetning av kolorimetriske substrater. Platene avleses i et ELISA-spektrofotometer, og cytokinkonsentrasjonene beregnes fra en standardkurve oppnådd fra rekombinante kontroilcytokiner.

Ant i- HSV2- CTL- responser

Etter vaksinasjon ble tilstedeværelse av antigenspesifikke, cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) i milt-T-celler undersøkt. Miltlymfocytter ble oppnådd som tidligere beskrevet. Lymfocytter fra hver behandlingsgruppe samles (n = 5) og dyrkes deretter i 3 dager uten antigen ved IO<7>celler/brønn i 12-brønners kulturplater. EL-4 (H2b)-målceller (ATTC) inkuberes med et peptid tilsvarende HSV2-gB-CTL-epitopen lokalisert mellom restene 495-505 (Hanke et al., 1991, J. Virol., 55:1177) for H2<b->begrensede celler og inkubert i 4 timer ved 37 °C. Målene vaskes, og 100 u.1 titere inneholdende 1 x 10" celler tilsettes hver brønn. Effektorlymfocytter vaskes, tilsettes brønnene ved ulike konsentrasjoner og dyrkes i 4 timer ved 37 °C. Ved anvendelse av "CytoTox 96"-settet (Promega, Madison, WI) beregnes prosent spesifikk lyse fra laktatdehydrogenase (LDH) i supernatanten målt i en standard ELISA-plateavleser (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Eimer, San Jose, CA) ved registrering av absorbansen ved 4 90 nm. Bestemmelsen av HSV2-antigenspesifikk lyse utføres ifølge standardkriterier. Data er uttrykt som prosent spesifikk lyse = 100 x [(eksperimentell - spontan effektor - spontan målsøkt)/(målsøkt maksimum - målsøkt spontan)].

Resultater

Overlevelseskurven presentert i figur 1 viser effektiviteten av det liposomale peptid til å beskytte mus mot systemisk utfordring med en letal dose av HSV2, så vel som etablering av antall inokulasjoner nødvendig for å oppnå 100 % beskyttelse. Figur 1 viser antall doser med liposomal HSV2gD-(1-23)-TM-vaksine nødvendig for å beskytte BALB/c-mus fra en letal utfordring med HSV2. Gruppen på 7 mus ble gitt to, tre eller fire immuniseringer før utfordring med en letal dose av HSV2. Med fire vaksinasjoner hadde ingen av dyrene immunisert med den liposomale vaksine neurologiske komplikasjoner forbundet med infeksjon av HSV2, det var heller ingen andre tegn på infeksjon påvist under studien. Det viktigste var at alle mus overlevde den letale utfordring med HSV2. Med to eller tre ukentlige immuniseringer ble mindre enn 100 % av musene beskyttet. I motsetning til dette ble ikke mus som fikk fire vaksinasjoner med et placebo (det vil si buffer), beskyttet mot HSV2-utfordringen.

Liposomalt HSV2gD(1-23)-TM ble også testet i tre grupper av C57BL/6-mus og observert å utøve tilsvarende beskyttende effekter sammenlignet med resultatene oppnådd med BALB/c-mus. Tabell 2 oppsummerer disse resultater. Gruppe 1-mus ble vaksinert subkutant i ukene 1 og 4; gruppe 2-mus ble vaksinert subkutant i uke 1 og intrarektalt i uke 4; og gruppe 3-mus (kontrollgruppen) mottok ingen vaksinasjoner. 1 uke etter den siste vaksinasjonen (uke 4) ble musene utfordret intraperitonealt med en letal dose av HSV2, og ble observert i 3 uker for morbiditet og mortalitet. Som for BALB/c-musene hadde gruppen mus som mottok vaksinasjoner med liposomalt HSV2gD(1-23)-TM, et betydelig antall overlevere når de ble vaksinert enten ved subkutan injeksjon eller gitt en subkutan startdose etterfulgt av mukosale tilleggsdoser.

Figur 2 viser en sammenligning av liposomal HSV2gD-(1-23)-TM med andre fremgangsmåter for antigenpresentasjon. Hver gruppe på 7 mus fikk fire immuniseringer før utfordringen med en letal dose av HSV2. Igjen resulterte fire inokuleringer med liposomal HSV2gD(1-23)-TM-vaksine i 100 % beskyttelse av musene fra en letal dose av HSV2. Fire immuniseringer med ikke-liposomalt HSV2gD(1-23)-TM, eller liposomer uten HSV2gD-(1-23)-TM, var ikke i stand til å frembringe betydelig beskyttelse mot den letale HSV2-utfordring. Dette viser tydelig at både liposomet og de konstruerte proteinkomponenter må være assosiert med hverandre for å oppnå en effektiv immunrespons. Av særlig betydning er det funn at den liposomale HSV2gD-(1-23)-TM-vaksine frembringer mye bedre beskyttelse enn immunisering med varmeinaktiverte virus, fordi virusbaserte vaksiner vanligvis antas å frembringe en god stimulus for en immunrespons (Desrosiers, 1992, AIDS Res. Hum. Retrovir., 8:1457).

Ved slutten av studien ble musene avlivet, og serum ble samlet for å karakterisere egenskapene til immunresponsen ved dette tidspunkt. Serum fra de vaksinerte mus ble funnet å inneholde høye titere av antistoffer (1:100) som spesifikt gjenkjenner peptidet anvendt for å stimulere immunresponsen, og videre medførte presipitering av aktivt virus, hvilket antyder at antistoffene gjenkjenner en epitop på overflaten av viruset. Antistoffene presipiterer også HSV2gD(1-23)-TM-liposomene og ikke liposomene uten peptid, hvilket antyder at de gjenkjenner spesifikt gD-epitopen til HSV2.

Tabell 3 nedenfor gir en oppsummering av den immunologiske analysen som viser at liposomalt HSV2gD(1-23)-TM gitt subkutant én gang i uken i 4 uker frembringer en sterkere immunrespons sammenlignet med standardadjuvanser. Vaksinasjon med antigen blandet med ufullstendig Freunds adjuvans eller alum var ikke i stand til å frembringe mus med beskyttelse for virusutfordringen. Data oppnådd fra den nøytraliserende antistofftest og den forsinkede hypersensitivitetsrespons tilsvarte overlevelsesdataene med den høyeste antistofftiter (B-cellerespons) og den største grad av fotsålesvelling (T-celle-respons) observert for den liposomale HSV2gD(1-23)-TM-gruppen. En annen viktig fordel forbundet med den liposomale HSV2gD-(1-23)-TM-behandlingen var at til forskjell fra resultatene fra mus som fikk Freunds ufullstendige adjuvans med antigenet, var det ingen irritasjon eller inflammasjon på injeksjonsstedet hos noen mus (17/17 opplevde rødhet ved injeksjonsstedet med Freunds ufullstendige adjuvans versus 0/17 for det liposomale HSV2gD(1-23)-TM). Når alum ble anvendt, utviklet 17/17-musene palperbare granulomer ved injeksjonsstedet. I motsetning til dette forårsaket ikke liposomalt HSV2gD(1-23)-TM dannelse av granulomer hos noen mus. Oppsummert antyder disse resultater at B- og/eller T-celleresponsene (vurdert ved nøytraliserende antistofftiter og grad av fotbladsvelling) bidrar til den beskyttende immunrespons frembrakt av liposomalt HSV2gD(1-23)-TM hos mus mot en letal dose av HSV2.

Eksempel II

HSV2

Fremstilling av HSV2gD( 1- 23)- HD

Et genkonstrukt som koder for HSV2gD(1-23)-HD, ble dannet ved hjelp av overlappende oligonukleotider som koder for gD-epitopen bundet til et 45 aminosyrers hydrofobt domene (HD). Konstruktet ble dannet ved gradvis forlengelse og amplifisering av den kodende region av genet. Genet ble deretter ligert til pTrcHis-ekspresjonsvektoren og verifisert ved sekvensanalyse. En småskalaekspresjonsstudie ble startet ved induksjon med 1 mM IPTG og bekreftet ved western blot-analyse ved bruk av museantistoffene dannet i vaksinasjonsstudiene med liposomalt HSV2gD(1-23)-TM. Proteinet ble også analysert ved hjelp av SDS-PAGE, og et bånd ble funnet som tilsvarte den forventede molekylvekt (=6 kD), som vurdert ved Coomassie-farging. Når det var vist at det forventede protein ble uttrykt i en liten skala, ble en 10 liters fermenteringsporsjon av E. coli inneholdende pTrcHis/HSV2gD(1-23)-HD-konstruktet fullført, som ga omtrent 60 g cellemasse. Etter induksjon ble ekspresjon av HSV2gD(1-23)-HD verifisert ved hjelp av et western blot av fermenteringstidsforløpet. Bakterier fra ca. 30 g cellemasse ble lysert ved hjelp av "French Press" i en buffer inneholdende 1 % deoksycholat og 5 mM imidazol. Etter sentrifugering for å bunnfelle cellerestene ble HSV2gD(1-23)-HD i hovedsak funnet i den vannløselige supernatant.

Rensing ble oppnådd ved passere supernatanten inneholdende det løselige HSV2gD(1-23)-HD-protein over en nikkel-ladet, chelaterende Sepharose-kolonne. Kolonnen ble vasket suksessivt med løsninger inneholdende 5 mM imidazol, 200 mM imidazol og deretter 5 mM imidazol med 1 % deoksycholat for å fjerne alle proteinrester. HSV2gD(1-23)-HD-proteinet ble til slutt eluert med en løsning av 200 mM imidazol og 1 % deoksycholat. Toppfraksjonene ble identifisert ved Coomassie-farget SDS-PAGE og ved western blot. Alle toppfraksjoner inneholdende HSV2gD(1-23)-HD ble samlet og konsentrert ved hjelp av en Millipore Ultraprep-konsentrator. Sluttkonsentrasjonen ble vist å inneholde rent HSV2gD(1-23)-HD, vurdert ved tilstedeværelsen av ett enkelt bånd på en Coomassie-farget SDS-PAGE-gel. Ut fra denne første runde ble omtrent 2-3 mg HSV2gD-(1-23)-HD oppnådd for liposomformulering og vaksinasjons-studier.

Liposompreparatet og vaksinasjonsprosedyrene, immun-responsinduksjonstestingen, HSV2-museencefalittmodellen, antigenindusert T-celleproliferasjon, cytokinspesifikk mRNA-analyse, ELISA-cytokinmålinger og anti-HSV2-CTL-respons var i hovedsak som beskrevet i eksempel 1.

Resultater

Overlevelseskurven vist i figur 3 viser evnen hos HSV2gD(1-23)-HD til å frembringe en beskyttende immunrespons. Prosent overlevelse med denne spesielle formuleringen ble observert til å være 40 %. Til sammenligning viste buffer- behanlede kontrolldyr ingen overlevere, mens HSV2gD(1-23)-TM-kontrollgruppen hadde 100 % overlevelse.

Eksempel III

HIV

Fremstilling av HIV( gp! 20- HD) og HIV( Agpl20- HD) i COS- l- celler

For konformasjonsepitopstudien frembringes gpl2 0-sekvensen fra pHXB2-env-plasmidet inneholdende gpl60-genet (NIH AIDS Research and Reagent Program, Rockville, MD) ved amplifisering av plasmid-DNA ved PCR og subkloning av 1536 bp-produktet for sekvensering ved dideoksynukleotidmetoden. Ved anvendelse av en 51 -(sense)primer tilsvarende de første 21 bp av HIVgpl2 0-genet, ATGAGAGTGAAGGAGAAATAT, og en 3'-(antisense)primer tilsvarende nukleotidene 1515-1536, TGCTCTTTTTTCTCTCTGCAC, ved eliminering av HIVgp41-proteinet klones gpl20-segmentet og amplifiseres ved PCR. I tillegg flankeres hver primer med hensiktsmessige restriksjonsenzym-seter for å tilpasses de multiple kloningsseter til pcDNA4-His-ekspresjonsvektoren. PCR-produktet ligeres til pcDNA4-His inneholdende HD-domenet som et genkassettplasmid (Invitrogen, Inc., San Diego, CA). Delesjonsmutantene fremstilles ved PCR-amplifisering ved anvendelse av to 5'- og 3<1->primerpar som ekskluderer nukleotider som koder for restene i gpl2 0-proteinet; disse inkluderer A136-151gpl20, Al28-194gpl20 og A123-203gpl20. Primerne inneholder hensiktsmessige restrik-sjonsenzymsekvenser som muliggjør ligering av de to genproduk-tene. Hver mutasjon erstattes derfor med to aminosyrer som blir kodet av det spesielle restriksjonssetet av interesse. De endelige gener verifiseres ved sekvensering av DNA ved anvendelse av protokollen og reagenser fra "AutoCycle"-settet (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), og resultatene analyseres på et "ALFExpress"-sett-sekvenseringsapparat (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) og analyseres med AM-programvare, v. 3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Plasmidene transfekteres inn i COS-l-celler (ATCC, Rockville, MD) ved anvendelse av DEAE-dekstranreagenset. Stabile transfektanter utvelges ved anvendelse av Zeocin (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) og klones ved begrensende fortynning. gpl20-HD-proteinene renses ved selektiv affinitet til nikkel bundet til et fast støttemateriale. Kloner som produserer høye nivåer av protein, analyseres ved western blot-analyse eller FACS-analyse. Histidinlinkeren til HIV-(gpl20)-HD, HIVA136-I51gpl20, HIVAl28-194gpl20 og HIVA123-203gpl20 fjernes ved enterokinasespalting etter at rensingen er fullstendig. Om nødvendig utføres størrelseseksklusjons-, ionebytter- eller hydrofob interaksjonskromatografi for ytterligere rensing av HIVgpl20-HD- og HIVAgpl20-HD-proteiner.

Fremstilling av HIV- HD

Nukleotidsekvensen som kombinerer tre epitoper (CTL, T-hjelpercelle og B-celle) utvelges fra sekvensene funnet i ulike HIV-proteiner (KQIINMWQEVGKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK (sekvens nr 19)) og er avledet fra denne proteinsekvensen ved anvendelse av E. coli-kodonpreferanser (Looman et al., 1987, EMBO J., 5:2489). Det syntetiske gen som koder for HIV-sekvensen, settes sammen ved syntese, hybridisering, PCR og ligering av overlappende oligonukleotider. Sammensetningen av fullengdegenet som koder for HIV-fragmentene, amplifiseres ved PCR og ligeres deretter inn i et ekspresjonsplasmid. De endelige gener verifiseres ved sekvensering av DNA.

HIV-HD som inneholder pTrcHis-plasmider, transformeres inn i E. coli. Bakterier inkuberes i LB-medium med ampicillin (50 u.g/ml) ved 37 °C frem til midtre logfase. Ved dette tidspunkt tilsettes IPTG for å indusere trp/Iac-hybridpromoteren. Undersøkelser utføres hver time for å bestemme den optimale postinduksjonsekspresjon av HIV-HD-proteiner. Ved tidspunktet for optimal ekspresjon høstes cellene ved sentrifugering. Cellepelleten lyseres og sentrifugeres. Lysatet undersøkes for tilstedeværelse av protein. HIV-HD-proteinene renses ved selektiv affinitet til nikkel bundet til et fast støttemateriale. Om nødvendig utføres størrelseseksklusjons-, ionebytter- eller hydrofob interaksjonskromatografi for ytterligere å rense HIV-HD.

Liposomfremstilling

Vaksinasjonsprosedyrer og testing av induksjon av immunrespons overfor virusantigen

BALB/c-hunnmus (6-8 uker gamle) vaksineres subkutant i ukene 1, 4 og 8 med testvaksinepreparatet eller buffer. Injeksjonsstedet kontrolleres for skadelige reaksjoner, slik som utvikling av granulomer og/eller skorpedannelse. Når dyrene immuniseres med vaksinen via den intranasale rute, anesteseres de med halotan, og testsubstansen (10-20 ul) administreres til neseborene for inspirasjon ved hjelp av en steril tipp på en mikropipette (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis., 168:622).

Måling av antistoffrespons ved ELISA

Ved regelmessige intervaller under vaksinasjonsprosedyren (f.eks. 1 x pr. uke) måles musens immunrespons mot virusantigenet. Liposomer som inneholder den antigene epitop, anvendes også som mål for en antistoff-/ELISA-analyse, som beskrevet tidligere (Tuso et al., 1993, Transplantation, 55:1375). Resultatene fra den sistnevnte analysen anvendes for å måle nivået av binding og isotypekonfigurasjon til antistoffene .

Forsinket type hypersensitivitets( DTH) analyse

EN DTH-respons mot virusantigenet hos vaksinerte mus undersøkes ved anvendelse av en fotbladanalyse. Vaksinerte dyr anesteseres med halotan og injiseres med 50 u.1 av enten lipo somalt antigen eller fritt antigen i et bakre fotblad og 50 u.1 buffer i det andre bakre fotblad. 24, 48 og 72 timer senere måles graden av fotbladsvelling hos musene ved anvendelse av et skyvelær og sammenlignes med utgangsmålingene.

Cytokinspesifikk mRNA- analyse

T-celler fra immuniserte og ikke-immuniserte dyr undersøkes for cytokinspesifikke mRNA-nivåer av hovedcyto-kinene, som kan gjenspeile sensibilisering forbundet med immunisering, inkludert IL-2, IFN-y, IL-4, IL-5, IL-6 og IL-10. Milt-T-celler isoleres som beskrevet tidligere ved 1 og 4 uker etter immunisering. Total-RNA isoleres ved en modifisering (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg., 1:16) av en metode beskrevet av Chomczynski et al., 1987, Analyt. Biochem., 152:156. Ferske eller fryste celler (2 x IO<6>) øde-legges i 1 ml denatureringsløsning (4 mM guanidintiocyanat,

25 mM natriumsitrat (pH 7,0), 0,5 % sarkosyl og 0,1 mM 2-merkaptoetanol). RNA presipiteres ved inkubering med 1 volum isopropanol over natten ved -20 °C. Konsentrasjonen av total-RNA justeres til 260 nM, og prøvene lagres ved -80 °C inntil de analyseres. Cytokinanalysen utføres ved modifisering (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg., 1:16) av en fremgangsmåte beskrevet av Chomczynski et al., 1987, Analyt. Biochem., 152:156. Enkelttrådet cDNA fremstilles ved transkripsjon av 2 u.g total-RNA i 20 ul total reaksjonsblanding ved anvendelse av fjærkremyeloblastosevirus-reverstranskriptase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Sekvensspesifikke oligonukleotidprimere for murine cytokiner (tabell 1) anvendes for å amplifisere DNA-fragmentene av på forhånd bestemt størrelse for hvert av cytokingenene av interesse. PCR-blandingen består av 1 ul cDNA, 2,5 ul 10 x PCR-buffer, 1 ul av både 5'- og 3'-primere, 2,5 ul av 10 x dNTP (2 mmol/1) og 0,125 ul T. aquaticus termostabil DNA-polymerase (Boehringer Mannheim) i et sluttvolum på 25 ul. Spesifikke P~aktinprimere anvendes for å amplifisere et 548 bp fragment som en intern kontroll. PCR-blandingen dekkes med mineralolje, og amplifiseringen utføres etter inkubering av blandingen i 7 minutter ved 94 °C, 38 sykluser med 30 sekunders denaturering ved 94 °C, 45 sekun ders primerannealing ved 6 0 °C, 6 0 sekunders forlengelse ved 72 °C og en 7 minutters inkubering ved 72 °C. PCR-produktene separeres på agarosegel i nærvær av etidiumbromid. Båndene visualiseres under UV-lys, fotograferes og kvantifiseres densitometrisk fra fotografiet ved anvendelse av "Molecular Analyst"-programvarepakken (Bio-Rad, Richmond, CA).

Cvtokinmåling ved hjelp av ELISA i milt- T- celler

T-celleaktiviteten hos disse dyr måles også ved produksjon av cytokiner som respons på inkubering av milt-T-celler med virusantigen. Miltene fjernes fra vaksinerte dyr, og milthomogenater fremstilles ved forsiktig ødeleggelse av miltene med en steril spiss og pressing av cellene gjennom et nylonmaskenett. Cellesuspensjonene skylles og sås ut ved 1 x 10<5>celler/brønn i en 96-brønners mikrotiterplate. Etter inkubering av cellene ved 37 °C i 3-4 dager med ulike mengder virusantigen høstes supernatantene fra brønnene og undersøkes for tilstedeværelse av cytokiner. Kommersielt tilgjengelige cytokin-ELISA-sett anvendes for å bestemme cytokinprofilen. Deteksjon av cytokinproteinet i vevskultursupernatanter ved hjelp av sandwich-ELISA utføres ved bruk av monoklonale antistoffer (mAb-er) spesifikke for de særskilte cytokiner. Kortfattet belegges ELISA-plater over natten med et rotte-antimusecytokin-mAb. Platene blokkeres med 3 % føtalt kalveserum i PBS i 2 timer, deretter tilsettes aliquoter av hver testprøve til hver brønn. Cytokinspesifikt, biotinylert rotte-antimuse-mAb tilsettes hver brønn, etterfulgt av avidinperoksidase. En fargereaksjon oppnås ved tilsetning av kolorimetriske substrater. Platene avleses i et ELISA-spektrofotometer, og cytokinkonsentrasjonene beregnes ut fra en standardkurve oppnådd fra rekombinante kontrollcytokiner. Alle cytokin-ELISA-sett (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y og TNF-a) er inn-kjøpt fra PharMingen, Inc. (San Diego, CA).

Antigenindusert T- celleproliferasjon

Sensibilisering av verten mot HIV-antigener måles ved anvendelse av antigenindusert T-celleproliferasjon. Milthomogenater isoleres som beskrevet tidligere. Cellene suspenderes i RPMI 1640-medium inneholdende 10 % FCS, 10 mM Hepes-buffer,

L-glutamin (2 mM), penicillin (25 IU/ml), streptomycin

(25 u.g/ml) og gentamycin (80 u.g/ml) . Cellene dyrkes ved en konsentrasjon på 1 x IO<6>celler/ml med eller uten HIV-HD-peptidet (5 u.g/ml) i 96-brønners, rundbunnede plater i 3-4 dager i 5 % C02. Kulturene tilsettes 2 0 u.1 resazurinf arge-stoff i 3 timer, og deretter måles fluorescensen på Cytofluor II (Perseptive Biosystems, Inc., Farmington, MA).

Ant i- HIV- CTL- responser

Etter vaksinasjon undersøkes tilstedeværelsen av antigenspesifikke, cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) i milt-T-celler. Miltlymfocytter frembringes som tidligere beskrevet. Lymfocytter fra hver behandlingsgruppe samles (n = 5) og dyrkes deretter i 3 dager uten antigen ved 10<7>celler/brønn i 12-brønners kulturplater. L5198Y-lymfom (H2d)-målceller (ATTC) inkuberes med et peptid tilsvarende HIV-CTL-epitopen for H2<d->begrensede celler og inkuberes i 4 timer ved 37 °C. Målene vaskes, og 100 u.1 titere inneholdende 1 x 10" celler tilsettes hver brønn. Effektorlymfocytter vaskes, tilsettes brønnene ved ulike konsentrasjoner og dyrkes i 4 timer ved 37 °C. Ved anvendelse av "CytoTox 96"-settet (Promega, Madison, WI) beregnes prosent spesifikk lyse fra laktatdehydrogenase (LDH) i supernatanten målt i en standard ELISA-plateavleser (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Eimer, San Jose, CA) ved registrering av absorbansen ved 490 nm. Bestemmelsen av HSV2-antigenspesifikk lyse utføres ifølge standardkriterier. Data er uttrykt som prosent spesifikk lyse = 100 x [(eksperimentell - spontan effektor - spontan målsøkt)/(målsøkt maksimum - målsøkt spontan)].

Eksempel IV

Influensavirus ( INFV)

Fremstilling av INFV- HD

Nukleotidsekvensen til de valgte epitoper er avledet fra proteinsekvensen ved anvendelse av E. coli-kodonpreferanser (Looman et al., 1987, EMBO J., 5:2489). Antigensekvensene innføyd i genkassetten tilsvarer epitopene fra NP (147-161, TYQRTRALVRTGMDP; 55-6 9 (sekvens nr 2 0) , RLIQNSLTIERMVLS (sekvens nr 21)) og HA (91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASL (sekvens nr

22)). En kombinasjonsepitopvaksine kan konstrueres, bestående av en T-B-epitop, som rapportert av Brumeanu et al., 1997 (HA 110-120/HA 150-159, SFERFEIPKEGGWLTEKEGYSP (sekvens nr 23))

(Brumeanu et al., 1997, J. Virol., 71:5473). Med en gang den passende sekvens er oppnådd, settes et syntetisk gen som koder for INFV-HD sammen ved syntese, hybridisering, PCR og ligering av overlappende oligonukleotider. Det sammensatte fullengdegenet som koder for INFV-fragmentene, amplifiseres ved PCR og ligeres inn i et ekspresjonsplasmid. De endelige gener verifiseres ved sekvensering av DNA.

INFV-HD inneholdende plasmider transformeres til

E. coli. Bakterien inkuberes i LB-medium med ampicillin

(50 u.g/ml) ved 37 °C frem til midtre logfase. Ved dette tidspunkt tilsettes IPTG for å indusere trp/Iac-hybridpromoteren. Undersøkelser utføres hver time for å bestemme optimal postinduksjonsekspresjon av INFV-HD-proteiner. Ved tidspunktet for optimal ekspresjon høstes cellene ved sentrifugering. Cellepelleten lyseres og sentrifugeres. Lysatet undersøkes for tilstedeværelse av protein. INFV-HD-proteinene renses ved selektiv affinitet til nikkel bundet til et fast støttemateriale. Om nødvendig utføres størrelseseksklusjons-, ionebytter- eller hydrofob interaksjonskromatografi for ytterligere rensing av

INFV-HD.

Virusinfeksjonsmodell

INFV-stammen anvendt for å demonstrere effektiviteten til vaksinen, er en type av A/PR/8/34-viruset kalt PR8. Viruset dyrkes i 10-12 dager gamle befruktede kyllingegg ved allantoin-inokulering, etterfulgt av inkubering ved 3 7 °C i en vuggeinnretning i 40-48 timer og 20-24 timer ved 4 °C, og deretter gjenvunnet fra allantoinvæsken. En virushemagglutinin-analyse med 0,5 % røde blodceller fra kylling vil bli utført i 96-brønners mikrotiterskåler for å besteme hemagglutinerings-enheter(HAU)/ml av virusstammen.

I BALB/c-musemodellen er det vist at 1200 HAU av PR8-stammen administrert intranasalt med en steril tipp på en mikropipette til metofananesteserte mus (20 u.1) , utviklet ut-talte symptomer på infeksjon ved dag 4, inkludert redusert bevegelighet, mangel på stell, et 20 % tap i kroppsvekt og død innen 2 uker. Ved anvendelse av MDCK-cytolyseanalysen utført i 96-brønners mikrotiterskåler med et 50 % endepunkt ble en høy titer av infeksjonsvirus funnet å være til stede i lungehomo-genater fremstilt 4 dager etter infeksjon.

Vaksinasjonsprosedyrer og testing for induksjon av immunrespons mot virusantigen

BALB/c-hunnmus (6-8 uker gamle) injiseres subkutant i ukene 1, 4 og 8 med vaksinepreparatet eller buffer. Injeksjonsstedet kontrolleres for skadelige reaksjoner, slik som utvikling av granulomer. Når dyrene immuniseres med vaksinen via den intranasale rute, anesteseres de med metofan, og testsubstansen (10-20 u.1) administreres til neseborene for inspirasjon ved hjelp av en steril tipp på en mikropipette (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis., 158:622).

RT- PCR- deteksjon av INFV- RNA i lungevev

RT-PCR-deteksjon av INFV-RNA utføres på lungene fra forsøksdyr tatt 4 dager etter virusstimulering for å stadfeste effektiviteten av immunisering for å forhindre virusinfeksjon. Lungeprøver tatt fra musene ble raskt fryst, knust og det frosne pulver lagret ved -70 °C inntil det ble bearbeidet for evaluering. Isolering av total-RNA og RT-PCR-analyse for virus-RNA utføres ved en modifisering av tidligere beskrevne teknikker (Chomczynski et al., 1987, Analyt. Biochem., 152:156; Shirwan et al., 1993, J. Immunol., 151:5228; Lakeman og Whitley, 1995, J. Inf. Dis., 171:857). Primerne som anvendes, er spesifikke for matriksgenet (segment 7) av influensavirus A (Atmar et al., 1996, J. Clin. Microbiol., 34:2604). RT-PCR-analysen utføres ved anvendelse av reagenser og protokoll fra "Titan One Tube RT-PCR"-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) . Kortfattet inkuberes 1 pg til 1 u.g total-RNA-templat i nærvær av 0,2 mM dNTP, 0,4 u.M antisenseprimer FAMI (5<1->CAGAGACTTGAAGATGTCTTTGC-3<1>(sekvens nr 24)), 0,4 U.M senseprimer F AM 2 (5 1-GCTCTGTCCATGTTATTTGGA-3 1 (sekvens nr 25)), 5 mM DTT, 5 U RNase-inhibitor, 1,5 mM MgCl2og "AMV/Expand High Fidelity"-enzymer under de følgende betingelser: 1 syklus på 6 0 °C i 3 0 minutter; 94 °C i 2 minutter;

10 sykluser på 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder, 68 °C i 4 5 sekunder; 2 5 sykluser på 94 °C i 3 0 sekunder, 55 °C i 30 sekunder, 68 °C i 45 sekunder og økning av forlengelsen med

5 sekunder for hver syklus; etterfulgt av 1 syklus på 6 8 °C i

7 minutter. Et positivt resultat baseres på et synlig bånd av 212 bp i 1,5 % NuSieve-agarosegel (FMC Bioproducts, Rockland, ME) farget med etidiumbromid og fotografert med UV-trans-illuminator (BioRad Gel Doc 1000) . Denne fremgangsmåten er vist å være sensitiv og svært spesifikk for måling av tilstedeværelse av virus-DNA (Lakeman og Whitley, 1995, J. Inf. Dis., 171:857).

Sekvensen til HAI- domenet

HAI-domene(segment 4)sekvensen kan utredes ved amplifisering av HAl-domenet fra virus-RNA i en RT-PCR-reaksjon, deretter subklones det 1100 bp-produktet for sekvensering, og sekvensering ved dideoksy-nukleotidtermineringsmetoden. RT-PCR-analysen utføres ved "Titan One Tube RT-PCR"-systemet med de følgende forskjeller som bemerket ovenfor; amplifiserings-primerne er cDNA-primeren (5<1->AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAAC-3<1>(sekvens nr 26)) og PCR-primeren (5<1->CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3<1>(sekvens nr 27)) (Pyhala et al., 1995, J. Gen. Virol., 75:205), betingelsene vil være 1 syklus på 60 °C i 30 minutter; 94 °C i 2 minutter; 10 sykluser på 94 °C i 30 sekunder, 60 °C i

30 sekunder, 68 °C i 4 5 sekunder; 2 5 sykluser på 94 °C i

30 sekunder, 60 °C i 3 0 sekunder, 6 8 °C i 45 sekunder og økning av forlengelsen med 5 sekunder for hver syklus; etterfulgt av 1 syklus på 68 °C i 7 minutter. 1100 bp-produktet subklones i TA-PCR2.1-kloningsvektoren (Invitrogen, Carlsbad, CA) for etterfølgende sekvensering. Sekvensering utføres ved protokollen og reagensene fra "AutoCycle"-settet (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), og resultater kjørt på "ALFExpress"-sett-apparatet (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) analyseres med AM-programvare, v. 3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Måling av antistoffresponser ved ELISA

Ved regelmessige intervaller under vaksinasjons - prosedyren måles immunresponsen hos musene mot virusantigen. Liposomer inneholdende antigenepitopen anvendes også som mål for en antistoff-/ELISA-analyse, som beskrevet tidligere (Tuso et al., 1993, Transplantation, 55:1375). Resultatene fra den sistnevnte analyse anvendes for å måle bindingsnivået og iso-typekonfigurasjonen av antistoffene.

Antigenindusert T- celleproliferasion

Sensibilisering av verten mot INFV-antigener måles ved anvendelse av antigenindusert T-celleproliferasjon. Milter fjernes fra vaksinerte mus, og homogenater fremstilles ved forsiktig ødeleggelse av milten med en steril spiss og pressing av cellene gjennom et nylonmaskenett. Cellene suspenderes i RPMI 1640-medium inneholdende 10 % FCS, 10 mM Hepes-buffer, L-glutamin (2 mM), penicillin (25 IU/ml), streptomycin (25 u.g/ml) og gentamycin (80 u.g/ml) . Cellene dyrkes ved en konsentrasjon på 1 x IO<6>celler/ml med eller uten kjemisk syntetiserte peptider tilsvarende antigenene (5 u.g/ml) i 96-brønners, rundbunnede plater i 3-4 dager i 5 % C02. Kulturene tilsettes 20 ul resazurinfargestoff i 3 timer, og deretter måles fluorescensen på Cytofluor II (Perseptive Biosystems, Inc., Farmington, MA).

Anti- INFV- CTL- responser

Etter vaksinasjon undersøkes tilstedeværelsen av antigenspesifikke, cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) i milt-T-celler. Miltlymfocytter frembringes som tidligere beskrevet. Lymfocytter fra hver behandlingsgruppe samles (n = 5) og dyrkes deretter i 3 dager uten antigen ved 10<7>celler/brønn i 12-brønners kulturplater. P815-mastocytommålceller eller L5178-lymf om (H2d)-målceller (ATTC) inkuberes med et peptid tilsvarende INFV-NP-CTL-epitopen (aminosyrene 147-158) for H2<d->begrensede celler og inkuberes i 4 timer ved 37 °C. Målene vaskes, og 100 u.1 titere inneholdende 1 x 10" celler tilsettes hver brønn. Effektorlymfocytter vaskes, tilsettes brønnene ved ulike konsentrasjoner og dyrkes i 4 timer ved 37 °C. Ved anvendelse av "CytoTox 96"-settet (Promega, Madison, WI) beregnes prosent spesifikk lyse fra laktatdehydrogenase (LDH) i supernatanten målt i en standard ELISA-plateavleser (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Eimer, San Jose, CA) ved registrering av absorbansen ved 490 nm. Bestemmelsen av HSV2-antigenspesifikk lyse utføres ifølge standardkriterier. Data er uttrykt som prosent spesifikk lyse = 100 x [(eksperimentell - spontan effektor - spontan målsøkt)/(målsøkt maksimum - målsøkt spontan)].

Eksempel V

Ikke- typebestembare H . influenzae ( NTHi) og H . influenzae type b ( Hib)

Kloning av NTHi- proteiner

Fullengdegensekvensen som koder for P6, oppnås fra en stamme av NTHi ved RT-PCR-ampiifisering av P6-mRNA (Deich et al., 1988, J. Bacteriol., 170:489; Nelson et al., 1988, Inf. Immun., 56:128, Looman et al., 1987, EMBO J., 5:2489). Amplifiseringen utføres ved anvendelse av reagenser og protokoll fra "Titan One Tube RT-PCR"-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Kortfattet inkuberes bakterier i nærvær av 0,2 mM dNTP, 0,4 u.M antisenseprimer H-InvfP6AS (5<1->GAGTCCGCTGCTCTACCAAC-3<1>(sekvens nr 28)), 0,4 u.M senseprimer H-invfP6S (5<1->AATTTCCAGCTTGGTCTCCA-3<1>(sekvens nr 29)), 5 mM DTT, 5 U RNase-inhibitor, 1,5 mM MgCl2og "AMV/Expand High Fidelity"-enzymer under de følgende betingelser: 1 syklus på 60 °C i 3 0 minutter; 94 °C i 2 minutter; 10 sykluser på 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 3 0 sekunder, 6 8 °C i 4 5 sekunder; 25 sykluser på 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder, 68 °C i 45 sekunder og økning av forlengelsen med 5 sekunder for hver syklus; etterfulgt av 1 syklus på 68 °C i 7 minutter. Et positivt resultat baseres på et synlig bånd av 867 bp i 1,0 % NuSieve-agarosegel (FMC Bioproducts, Rockland, ME) farget med etidiumbromid og fotografert med et digitalt avbildingssystem (BioRad Gel Doc 2000). PCR-produktet subklones for sekvenser-ingsformål i TA-2.1-vektoren ved anvendelse av reagenser og protokoll fra "TA Cloning"-settet (Invitrogen, Carlsbad, CA). En fremstilling av plasmid i liten skala utføres ved standard alkalisk lysemetode (Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, s. 125). PCR-produktet innføyes i sekvensen ved den konvensjonelle dideoksyterminer-ingsmetoden ved anvendelse av protokollen og reagenser fra "AutoCycle"-settet (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), og resultatene analyseres på et "ALFExpress II"-sekven-seringsapparat (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) og analyseres med "AlfWin" sekvensanalysatorprogramvare, v. 2.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Fremstilling av NTHi( P6)- HD

Når genet som koder for P6 er oppnådd, settes et syntetisk gen som koder for NTHi(P6)-HD sammen ved syntese, hybridisering, PCR og ligering av overlappende oligonukleotider. HD-segmentet tilføres enten den N- eller C-terminale ende av proteinet via en linker sammensatt av glysin og serin. Dette muliggjør å teste effekten som den relative plassering av HD med hensyn til antigenet har på prosessering av immunsystemet. Det sammensatte fullengdegenet som koder for NTHi-(P6)-HD-fragmentet, amplifiseres ved PCR og ligeres i et ekspresjonsplasmid. Det endelige gen verifiseres ved å sekvensere DNA.

NTHi( P6)- HD- inneholdende plasmid transformeres i E . coli

Bakterier inkuberes i LB-medium med ampicillin

(50 u.g/ml) ved 37 °C frem til midtre logfase. Ved dette tidspunkt tilsettes IPTG for å indusere trp/Iac-hybridpromoteren. Undersøkelser utføres hver time for å bestemme den optimale postinduksjonsekspresjon av NTHi(P6)-HD-protein. Ved tidspunktet for optimal ekspresjon høstes cellene ved sentrifugering. Cellepelleten lyseres og sentrifugeres. Lysatet og cellepelleten analyseres for nærvær av protein. En 1-2 % løsning av natriumdeoksycholat anvendes for å ekstrahere NTHi-(P6)-HD-proteinet fra den lyserte cellepellet. NTHi(P6)-HD renses deretter ved selektiv affinitet til nikkel bundet til et fast støttemateriale. Om nødvendig utføres størrelses-eksklusjons-, ionebytter- eller hydrofob interaksjonskromato-graf i for ytterligere å rense NTHi(P6)-HD.

Liposomfremstilling

Det er tre generelle metoder for å fremstille stabile NTHi(P6)-HD-liposomer. I den første formuleres liposomene slik at proteinet og lipider oppløses sammen i et organisk løsningsmiddel (kloroform/metanol) og deretter tørkes til en tynn film. Ved resuspendering i vandig buffer settes lipidene og proteinet sammen til store bilagstrukturer. Suspensjonen sonikeres deretter for å lage små unilamellære vesikler (SUV). For små proteiner fungerer denne fremgangsmåten godt. Imidlertid kan det for disse eksperimenter være ønskelig ikke å eksponere proteinet for harde løsningsmiddelbetingelser på grunn av muligheten for å denaturere proteinet. For å unngå uønskede konformasjonsendringer kan derfor en annen fremgangsmåte anvendes som involverer løseliggjøring av NTHi(P6)-HD i resuspensjonsbufferen før hydratisering av lipidfilmen. Ved hydratisering med lipidene assosierer proteinet spontant med den nylig dannede membran og blir inkorporert i bilaget til SUV under sonikering. Den tredje fremgangsmåten involverer fremstilling av liposomene uten NTHi(P6)-HD-protein, og deretter tilsette det til de allerede dannede SUV, hvilket mulig-gjør at HD integrerer i lipidbilaget. Liposomene fremstilles ved probesonikering ifølge tidligere beskrevne fremgangsmåter (Fujii et al., 1997, Biochemistry, 35:4959). Kortfattet opp-løses lipidene (med eller uten protein) i et organisk løsningsmiddel, slik som kloroform/metanol. Tynne lipidfilmer dannes ved å pipettere aliquoter av lipidløsningen i rundbunnede glassrør og fordampe løsningsmidlet ved 6 5 °C under en strøm av nitrogengass. Filmene plasseres under vakuum i minst 8 timer for å fjerne rester av organisk løsningsmiddel. Alter-nativt kan lipidpulver av den ønskede blanding fremstilles ved en teknikk som spraytørking, og deretter anvendes i stedet for lipidfilmer. Fremstilling av liposomer fullføres ved hydratisering av lipidfilmene eller -pulverne i buffer og inkubering av suspensjonen ved 6 5 °C i 5-10 minutter før probesonikering. Liposomene filtreres deretter gjennom et 0,22 u.m filter for å sterilisere preparatet. Liposomene størrelsesbestemmes ved dynamisk lysspredning, og dannelsen av aggregater følges i minst 4 uker. Det er mulig at konformasjonen av NTHi(P6)-HD-proteinet kan trenges å konserveres. Av de tre fremgangsmåtene som kan anvendes ved fremstilling av liposomer, foreslås derfor at enten tilsetning av proteinet som en bestanddel av hydratiseringsløsningen eller tilsetning til liposomene etter at de allerede er dannet kan være foretrukket.

Bakteriestammer

NTHi-stammene 9333 (spinalvæskeisolat), 35056 (øvre luftveisinfeksjonsisolat), 43095 (otittvæskeisolat), 49766 (lungeabscessisolat, referansestamme ved antimikrobiell susceptibilitetstesting) (ATCC) og Hib-stammen 51654 (ATCC) ble anvendt for å demonstrere effektiviteten i bakterie-infeksjonsmodellen. Før anvendelse subdyrkes en fryst popu-lasjon av organismen i frisk hjerne-hjerteinfusjonsmedium tilsatt NAD (2 u.g/ml) og hem (10 u.g/ml) , og inkuberes i 24 timer ved 3 7 °C med 10 % karbondioksid. En standardkurve for hver organisme bestående av kolonidannende enheter versus turbi-ditet ved 480 nm anvendes for å tilpasse det inokulum av bakterier som er nødvendig for enten de bakteriedrepende analyser eller intraperitonealstimuleringsdosen.

Vaksinasjonsprosedyrer og testing av induksjon av immunrespons mot bakterieantigen

Grupper av nyfødte rotter (n = 6 pr. gruppe) immuniseres på dagene 5, 12, 19 og 26 eller på dagene 5 og 26 etter fødsel med testvaksinepreparatet eller buffer. Systemisk vaksinasjon av rottene utføres ved subkutan injeksjon av liposomvaksinene. Når dyrene immuniseres med vaksinen via den intranasale rute, anesteseres de med metofan, og testsubstansen (20 u.1) administreres ved hjelp av en steril tipp på en mikropipette (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis., 158:622). De nyfødte rottene oppstalles sammen med sine mødre og observeres for skadelige reaksjoner forbundet med vaksinasjonsprosedyren, slik som dannelse av granulom, rødhet og skorper ved injeksjonsstedet. 1 uke etter den siste vaksinasjonen anesteseres de nyfødte rottene med halotan, og blod samles ved hjertepunksjon, og slimhinnene skylles med saltvann for å samle mukosasekret. Dyrene avlives med karbondioksid. Den bakteriedrepende antistofftiter i serum og mukosavæske måles som beskrevet nedenfor.

Ved den intraperitoneale stimuleringsstudien stimu-leres nyfødte rotter (26 dager gamle) med bakterier, og deres blod og CSF analyseres for mengden bakterier sammenlignet med uvaksinerte rotter. Blodprøvetaking og prøvetaking av CSF for bakterier 2 dager etter stimulering antyder at det er en be tydelig bakteriemengde i dyrene (det vil si 1 x IO<4>CFU/ml blod; 1 x 10" CFU/ml CSF) . Serum fra de vaksinerte 2 6 dager gamle rottene som inneholdt høye titere av bakteriedrepende antistoffer, administreres intravenøst til 6 dager gamle rotter. Neste dag fikk nyfødte rotter (n = 10) en intraperitoneal dose av NTHi, som beskrevet nedenfor. De nyfødte rottene observeres deretter for morbiditet og mortalitet, overlevere avlives etter 2 6 dager, og blod og CSF samles og dyrkes for tilstedeværelse av NTHi.

Intraperitoneal stimulering med NTHi

En 24 timer gammel kultur av in vivo passert NTHi justeres til 5 x 10<7->5 x IO<9>CFU/ml, og 100 u.1 av denne kulturen injiseres intraperitonealt til 5-10 dager gamle rotter (Smith et al., 1973, Inf. Immun., 8:278). Stimulerte nyfødte rotter forblir hos sine diende mødre etter inokulering. Innen 18-96 timer etter stimulering døde minst 90 % av de nyfødte rottene ved denne dosen av passerte bakterier.

Måling av antigenspesifikk antistoffrespons ved ELISA

Serum- og slimprøver fra hver rotte testes for IgG-og IgA-antistoffer spesifikke for P6-antigenet. Enten det klonede native P6 eller NTHi(P6)-HD-proteinet tilsettes til hensiktsmessig behandlede, 96-brønners plater for inkubering over natten ved romtemperatur. Plater blokkeres med 1 % bovint serumalbumin i bikarbonatbuffer, pH 9,6, i 30 minutter ved 37 °C. Platene skylles deretter med 0,05 % Tween 2 0/PBS. Fortynninger av hver serum- eller slimprøve tilsettes de antigen-belagte platene, etterfulgt av inkubering i 2 timer ved 37 °C og skylling med Tween-/PBS-buffer ved slutten av inkuberingen. Alkalisk fosfatase-bundne, monoklonale antistoffer spesifikke for rotte-IgG eller -IgA tilsettes brønnene i 1 time ved 37 °C. Brønnene skylles deretter med Tween-/PBS-buffer, og PNPP-substrat i dietanolaminbuffer, pH 9,5, tilsettes brønnene for å starte fargereaksjonen. Reaksjonene stoppes med 0,7 5 N natriumhydroksid og avleses ved 405 nm i en "Spectramax" ELISA-plateavleser. Rotte-IgG- og -IgA-konsentrasjonene beregnes fra en standardkurve oppnådd fra kontrollprøver med kjente konsentrasjoner av Rotte-IgG eller -IgA belagt på 96-brønners plater og behandlet som beskrevet ovenfor.

Analyse av bakteriedrepende antistoff

Serumprøver som skal testes for tilstedeværelse av bakteriedrepende antistoffer, inkuberes ved 56 °C i 30 minutter for å inaktivere komplement. Testsera fortynnes deretter serielt i fosfatbufret saltvann (PBS). En 24 timers bakterie-kultur justeres til 5 x 10<4>CFU/ml i steril PCM-buffer sammensatt av PBS og 0,15 mM CaCl2og 1 mM MgCl2inneholdende bovint serumalbumin (BSA). Sera fra uvaksinerte nyfødte rotter anvendes som komplementkilde. Disse sera samles, porsjoneres og lagres ved -70 °C frem til anvendelse. Bakterier (20 u.1) , seriefortynnet serum (20 u.1) , komplement (20 ul) og 4 0 u.1 av 1 % BSA i PCM-buffer tilsettes hver brønn på en 96-brønners plate. For å bestemme den initielle bakteriekonsentrasjon sås 10 u.1 aliquoter av en prøveblanding ut ved tid 0 på friske BHI-agarplater inneholdende næringsagar og tilsatt NAD og hem. Etter inkubering av reaksjonsblandingen ved 3 7 °C med 10 % karbondioksid i 1 time med risting sås 10 u.1 fra hver brønn ut i duplikater og inkuberes over natten ved 3 7 °C i nærvær av 10 % karbondioksid for å bestemme CFU/brønn. Kontroller omfatter en brønn uten serum for å sikre at komplement alene ikke dreper bakterier, og en brønn med testserum, men uten komplement, for å sikre at serumkomplementet i testprøven er fullstendig inaktivert. Alle analyser utføres i triplikat, og de fortynninger som frembringer 50 % dreping av bakteriene, anvendes for å sammenligne aktiviteten mellom ulike sera.

Eksempel VI

Hepatitt C- virus

Fremstilling av HCV( E2/ NS1)- HD og HCV( E2/ NS1AHVR1)- HD i CHO-celler

Nukleotidsekvensen til HCV-E2/NSl-proteinet er avledet fra PCR-amplifiseringen til en stamme av HCV oppnådd som beskrevet nedenfor. Ved anvendelse av en 5<1->primer tilsvarende de første 21 bp av E2/NS1-genet CAAACCATGATCGCCCACGGA og en 3<1->primer tilsvarende restene 622-628, GAAGTTGACAGTGCAGGGGTA, elimineres det transmembrane domenet (Cocquerel, L. et al., 1998, J. Virol., 72(3) :2183-91) . I tillegg flankeres hver primer med hensiktsmessige restriksjonsseter. PCR-produktet ligeres i pcDNA3.1-His inneholdende HD-domenet som et genkassettplasmid (Invitrogen, Inc., San Diego, CA). HCV(E2/NS1-AHVR1)-HD konstrueres ved å fjerne HVR1 i E2/NSl-genet tilsvarende de første 27 aminosyrene fra resten 384 til resten 410. Delesjonsmutanten fremstilles ved PCR-amplifisering ved anvendelse av en 5'-primer, CAACTCATCAACACCAATGGC, og den samme 3<1->primer anvendes for villtypekontrollen. De endelige gener verifiseres ved å sekvensere DNA. Plasmidene transfekteres til CHO-celler (Deen, K.C. et al., 1988, Nature, 331:82) (ATCC, Rockville, MD) ved hjelp av lipofeksjons-reagenset (Lipofectamine, Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) etter produsentens anbefalte protokoll. Stabile transfektanter selekteres ved anvendelse av G418 (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) og klones ved begrenset fortynning. Identifisering av klonene som produserer høye nivåer av protein, vurderes ved western blot-analyse. HCV(E2/NS1)-HD- og HCV(E2/NS1AHVR1)-HD)-proteiner renses ved selektiv affinitet til nikkel bundet til et fast støttemateriale. Denne histidinlinkeren fjernes ved enterokinasespalting etter at rensingen er fullstendig. Om nødvendig utføres størrelseseksklusjons-, ionebytter- eller hydrofob interaksjonskromatografi for ytterligere rensing av HCV(E2/NS1)-HD- og HCV(E2/NS1AHVR1)-HD)-proteinene.

Fremstilling av HCV( HVR1)- HD- og HCV( C)- HD- proteiner i E . coli

Nukleotidsekvensene til de valgte epitoper er avledet fra proteinsekvensen ved anvendelse av E. coli-kodonpreferanser (Looman et al., 1987, EMBO J. , 5:2489). Antigensekvensene som skal innføyes i genkassetten, tilsvarer epitopene fra NP (14 7-161, TYQRTRALVRTGMDP; 55-69, RLIQNSLTIERMVLS) og

HA (91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASL). Etter at de tilfredsstillende sekvenser er oppnådd, settes et syntetisk gen som koder for HCV-HD, flankert av hensiktsmessige restriksjonsseter, sammen ved syntese, hybridisering og ligering av overlappende oligonukleotider. Kortfattet oppnås sammensetning av fragmentene ved oppvarming til 65 °C og annealing av oligonukleotidene når de vender tilbake til romtemperatur. Etter inkubering i 2 minutter på is ligeres fragmentene med DNA-ligase. Det sammensatte fullengdegenet som koder for HCV-fragmentene, amplifiseres ved PCR, spaltes av restriksjonsenzymer og isoleres ved gelelektroforese. HCV-genet ligeres deretter til et tilsvarende spaltet ekspresjonsplasmid inneholdende HD-genet (f.eks. pTrcHis eller pQE3 0). De endelige gener verifiseres ved å sekvensere DNA.

HCV-HD-inneholdende plasmider transformeres til

E. coli. Bakteriene inkuberes i LB-medium med ampicillin

(50 u.g/ml) ved 37 °C frem til midtre logfase. Ved dette tidspunkt tilsettes IPTG for å indusere trp/Iac-hybridpromoteren. Undersøkelser utføres hver time for å bestemme den optimale postinduksjonsekspresjon av HCV-HD-proteiner. Ved tidspunktet for optimal ekspresjon høstes cellene ved sentrifugering. Cellepelleten lyseres og sentrifugeres. Lysatet undersøkes for tilstedeværelse av protein. HCV-HD-proteinene renses ved selektiv affinitet til nikkel bundet til et fast støtte-materiale. Histidinlinkeren fjernes ved enterokinasespalting etter at rensingen er fullstendig. Om nødvendig utføres størrelseseksklusjons-, ionebytter- eller hydrofob inter-aks j onskromatograf i for ytterligere å rense HCV-HD.

Liposompreparatet og vaksinasjonsprosedyrene, testing av immunresponsinduksjonen, målinger av ELISA-antistoffrespon-sen, DTH-analysen, den cytokinspesifikke mRNA-analysen, ELISA-cytokinmålinger, antigenindusert T-celleproliferasjon og anti-HIV-CTL-reponser er i hovedsak som beskrevet i eksempel III

ovenfor.

Claims

1. Immunogent liposompreparat,karakterisert vedat det omfatter: vesikkeldannende lipider; og et antigent proteinkonstrukt som er et vandig, løselig fusjonsprodukt omfattende én eller flere antigen determinanter og et hydrofobt domene, der det hydrofobe domenet er assosiert med membranen til liposompreparatet.

2. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det ytterligere omfatter ett eller flere hjelpestoffer.

3. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det antigene konstrukt er syntetisert kjemisk.

4. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det hydrofobe domenet er et peptid.

5. Immunogent liposompreparat ifølge krav 4,karakterisert vedat det hydrofobe domenet består av fra ca. 15 til ca. 500 aminosyrerester.

6. Immunogent liposompreparat ifølge krav 5,karakterisert vedat det hydrofobe domenet omfatter én eller flere aminosyrer utvalgt fra gruppen bestående av Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val.

7. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat den antigene determinant er avledet fra et antigen utvalgt fra gruppen bestående av HSV-gB eller -gD, HIV-gpl20, CMV-gB, HCV-E2, INFV-HA eller -NA, og H. influenzae P6.

8. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det antigene konstrukt ytterligere omfatter en linkerregion som forbinder det ene eller flere antigene determinanter med det hydrofobe domenet.

9. Immunogent liposompreparat ifølge krav 8,karakterisert vedat linkerområdet er et peptid.

10. Immunogent liposompreparat ifølge krav 9,karakterisert vedat linkerområdet består av fra 1 til ca. 200 aminosyrerester.

11. Immunogent liposompreparat ifølge krav 10,karakterisert vedat aminosyrerestene utvelges fra gruppen bestående av Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val.

12. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter et antigent konstrukt omfattende én eller flere antigendeterminanter og et hydrofobt domene; og en farmasøytisk akseptabel bærer.

13. Immunogent liposompreparat ifølge krav 12,karakterisert vedat det antigene konstrukt ytterligere omfatter en linkerregion som forbinder det ene eller flere antigendeterminanter med det hydrofobe domenet.

14. Immunogent liposompreparat ifølge krav 12,karakterisert vedat det ytterligere omfatter ett eller flere hjelpestoffer.

15. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat en eller flere av antigendeterminantene er en antigendeterminant fra et bakterielt patogen eller toksin, fra et viralt patogen, fra et patogen fra sopp, eller fra et patogen fra en parasitt.

16. Immunogent liposompreparat ifølge ethvert av de foregående krav, for anvendelse i en fremgangsmåte for immunisering av et vertsdyr.

17. Immunogent liposompreparat ifølge ethvert av de foregående krav, for anvendelse i en fremgangsmåte for indusering av en immunrespons hos et vertsdyr.

18. Immunogent liposompreparat ifølge krav 16 eller 17,karakterisert vedat vertsdyret er et pattedyr.

19. Immunogent liposompreparat ifølge krav 18,karakterisert vedat pattedyret er et menneske.

20. Immunogent liposompreparat ifølge krav 19,karakterisert vedat antigendeterminanten er utvalgt fra gruppen bestående av HSV-gB eller gD, HIV-gpl2 0, CMV-gB, HCV-E2, INFV-HA eller -NA og H.influensae p6.

21. Immunogent liposompreparat ifølge krav 16 eller 17,karakterisert vedat dyret er en fugl.

22. Fremgangsmåte for å fremstille et immunogent liposompreparat , karakterisert vedat den omfatter: uttrykking av et gen som koder for et vandig, løselig fusjonsprotein omfattende en antigen determinant og et hydrofobt domene, og (a) oppløsning av vesikkeldannende lipider og fusjonsproteinet i et egnet organisk løsningsmiddel; dannelse av en lipidfilm eller spraytørket pulver ved fordamping av det organiske løsningsmiddel; hydratisering av lipidfilmen eller pulveret; og dispergering av den hydratiserte lipidfilm eller -pulver for å danne et immunogent liposompreparat, eller (b) oppløsning av fusjonsproteinet i en vandig buffer; hydratisering av enten et lipidpulver eller en lipidfilm med bufferen inneholdende fusjonsproteinet; og dispergering av lipidpulveret eller -filmen for å danne et immunogent liposompreparat, eller (c) oppløsning av fusjonsproteinet i en vandig buffer; og tilsetning av fusjonsproteinet til på forhånd formede liposomer for å danne et immunogent liposompreparat.

23. Immunogent liposompreparat som kan erholdes ved en fremgangsmåte ifølge krav 22.