KR20010075261A

KR20010075261A - 면역원성 리포좀 조성물

Info

Publication number: KR20010075261A
Application number: KR1020017003621A
Authority: KR
Inventors: 후지이게리; 크래머도날드브이.; 언스트윌리엄에이.; 애들러-무어질; 페리엘.지니
Original assignee: 추후제출; 몰레큘라 익스프레스 인코포레이티드
Priority date: 1998-09-22
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2001-08-09
Also published as: AP2001002096A0; ATE468108T1; EA200100269A1; IL141675A; AU6035199A; SK3222001A3; UA75327C2; EP1115382A2; SK287670B6; AP2010A; CA2344173A1; BG65675B1; DE69942393D1; NO330685B1; JP2002526436A; KR100592825B1; EP1115382B1; AU766772B2; CA2344173C; NZ510442A

Abstract

본 발명은 소낭-형성 지질 및 하나 이상의 항원결정기 및 소수성 도메인을 포함하는 항원 구조체를 포함하는 면역원성 리포좀 조성물을 제공한다.

Description

면역원성 리포좀 조성물{IMMUNOGENIC LIPOSOME COMPOSITIONS}

역사상 백신의 사용은 광범위한 다양한 감염 질환에 대해 많은 인구를 보호하는 안전하고 효과적인 방법을 제공해왔다. 바이러스 및 기타 미생물 유기체에 대한 면역법은 일반적으로 안전하고 효과적이며, 선진국에서 개인의 수명연장을 개선하는데 크게 기여해왔다. 그러나, 백신의 성질과 특정 면역원에 따라 수많은 부작용이 발생할 수 있다. 과거에는 완전한 바이러스의 부적합한 불활성으로 인해 백신 접종 후에 보호되는 대신 뜻하지 않게 감염되었다(Tigertt, 1959, Military Med. 124:342). 때때로, 인플루엔자와 같은 완전한 유기체를 사용한 면역법은 길레인 바르 증후군(Guillain Barre syndrome)과 같은 정상 조직에 대해 직접적인 자가면역 질환의 발병을 촉진시킬 수 있다(Langmuir et al., 1984, J.Epidemiol.119:841). 작용인자 자체 외에도, 세포 또는 복합 매질 내에 물질이 존재하면 이종 단백질에 대해 심각한 알레르기 반응을 유도할 수 있다(Yamane 및 Uemura, 1988, Epidem, Inf. 100:291). 효과적인 백신 접종 방법은 자주 다중 면역법을 필요로 하기 때문에, 이러한 불리한 결과는 백신의 효과를 감소시킬 수 있고, 백신 접종 방법의 대중적 수용을 감소시킬 수 있다. 현대의 분자생물 기술은 최근 향상된 안전성과 효능을 가진 새로운 백신 제제를 제공하기 위해 시험되어 왔다. 연구 하에 가능한 전략은 일반적으로 재조합 DNA 기술을 기초로 한백신(Conry et al., 1994, Cancer Res.54:1164; Hu et al., 1988, J.Virol.62:176), 항원으로서 단순 합성 펩티드 생성(Nardelli et al.,1992, Vaccines 8:1405; Watari et al.,1987, J.Exp.Med.165:459), 및 보호 반응을 자극하기 위한 조직 속에 유전 물질의 직접 주입(Ulmer et al., 1993, Science 259:1745)을 포함한다. 특히, 특정 면역 반응을 유도하기 위해 단순 펩티드 항원을 사용하는 것은 많은 연구의 핵심이 되어 왔다. 이 전략은 면역학적 특이성, 제조 과정의 보다 엄격한 통제를 제공하고, 면역원의 생성과 관련된 물질 또는 오염물의 이차 공급원 중 대부분을 제거할 수 있기 때문에 매력적이다.

그러나, 백신 접종을 위한 정제된 단백질 또는 펩티드 단편의 사용은 효과적인 항원 담체에 의해 물질이 면역 부위로 전달되는 것에 의존한다. 잠재적으로 가장 안정한 담체 중 하나는 지질/리포좀계 백신 복합체이다. 리포좀은 약의 독성을 줄이고, 혈류 내의 순환을 연장하고, 약 분자의 생물분포 및 약물 동력학을 변경시킬 수 있기 때문에, 오랫 동안 상업적으로 생존가능한 기술로 확립되어 왔다(Fujii,1996; Vesicles, ed. M.Rosoff, Marcel Dekker, New York NY, p.491). 리포좀을 생체 내에 투여하면, 리포좀은 혈액 내에서 순환하고, 특히, 간, 비장, 림프절, 및 폐조직에서 단핵세포/대식세포 식세포계에 의해 제거된다(Claasen, 1996; Vesicles, ed.M.Rosoff, Marcel Dekker, New York NY, p649). 항원 분포 패턴을 이끄는 리포좀의 능력은 리포좀 면역원이 면역계에 최대로 노출되게 할 것이라는 것을 암시한다. 지금까지, 지질에 결합된 펩티드(Nardelli et al., 1992, Vaccines 8:1405; Watari et al,. 1987, J.Exp.Med.165:459), 지질 존재 하의 전체단백질 서브유닛의 재구성(Morein and Simons, 1985, Vaccines 4:166; Gregoriadis, 1995, Tibtech 13:527), 및 단백질과 미리 형성된 리포좀의 결합(Therien and Shahum, 1989, Immunol. Lett.22:253; Alving et al., 1985, Vaccines 4:166)을 포함한 여러 지질계 시스템이 시험되어 왔다. 면역학적으로 활성화 되기 위해 이러한 전략들이 나타나고 있지만, 무리한 비용 뿐 아니라 단백질 및 이의 지질 담체의 대량 생산과 관련된 기술적 어려움 때문에 상업적 기술로서는 덜 매력적이다. 따라서, 백신 개발에 있어서 리포좀에 의해 제공된 가능성을 이용하기 위해 단백질 항원을 제조하기 위한 개선된 시스템 또는 접근방식이 필요하다.

도 1은 HSV2에 대한 보호에 있어서 본 발명에 따른 리포좀 조성물의 효과를 나타내는 그래프,

도 2는 본 발명에 따른 리포좀 조성물과 다른 백신 조성물의 효과를 비교한그래프,

도 3은 보호 면역 반응을 유도하기 위한 리포좀 HSV2g(1-23)-HD의 능력을 나타내는 마우스의 생존 곡선.

본 발명은 하나 이상의 항원결정기 및 소수성 도메인을 포함하는 항원 구조체와 소낭-형성 지질을 포함하여 이루어지는 면역원성 리포좀 조성물을 제공한다. 소수성 도메인은 리포좀 조성물의 막과 결합되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 소수성 도메인은 펩티드이고, 바람직한 실시형태에 따르면, 약 15 내지 약 500 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 약 300 이하, 그리고 가장 바람직하게는 약 50 잔기 이하로 이루어지며, 여기서, 하나 이상의 아미노산은 Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 구성된 그룹에서 선택된다.

본 발명의 실시형태에 따르면, 면역원성 리포좀 조성물은 하나 이상의 보강제를 더 포함한다. 적당한 보강제의 예로는, IL-2, IL-4, IL-12, 인터페론 등과 같은 사이토카인을 포함하는 가용성 분자 뿐 아니라 지질 A 및 기타 당지질, QuilA, QS21, MF59, P₃CSS, MTP-PE와 같은 지방친화성 분자도 포함된다. 사이토카인의 다른 예들은 하기 표 1에 제공된다.

본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 항원 구조체는 항원결정기(들)와 소수성 도메인을 연결하는 연결부를 더 포함하여 이루어진다. 바람직한 실시형태에서, 연결부는 1 내지 약 200 아미노산 잔기로 구성된 펩티드이다. 아미노산 잔기는 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및/또는 Val과 같은 자연발생 아미노산을 나타낸다.

본 발명은 또한 상기 리포좀 조성물을 면역학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 숙주동물에서 면역원성 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 숙주로는 가금을 포함한 어떤 동물도 가능하지만, 숙주동물은 포유류인 것이 바람직하고, 인간인 것이 더 바람직하다. 어떤 바람직한 실시형태에서, 면역원성 리포좀 조성물은 하나 이상의 보강제를 더 포함한다.

본 발명은 또한 소수성 단백질 도메인 및 하나 이상의 항원결정기를 포함하는 면역원성 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는, 벡터로 삽입하기 위한 DNA 카세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 항원결정기 및 소수성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키는 단계; 지질 및 융합 단백질을 적당한 유기용매 또는 유기용매의 혼합물에 용해시키는 단계; 유기용매를 증발시켜 지질막을 형성시키는 단계; 지질막을 수화하는 단계; 및 수화된 지질막을 분산시켜 면역원성 리포좀 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 면역원성 리포좀 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 항원결정기 및 소수성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키는 단계; 융합 단백질을 수성 완충액에 용해시키는 단계; 융합 단백질이 함유된 완충액으로 지질 분말 또는 지질막을 수화하는 단계; 및 지질 분말 및 막을 분산시켜 면역원성 리포좀 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 면역원성 리포좀 조성물의 제조방법을 제공한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 항원결정기 및 소수성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키는 단계; 융합 단백질을 수성 완충액에 용해시키는 단계; 및 융합 단백질을 미리 형성된 리포좀에 첨가하여 면역원성 리포좀 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 면역원성 리포좀 조성물의 제조방법을 제공한다.

또다른 실시형태에서, 본 발명은 항원결정기 및 소수성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키는 단계; 및 리포좀 대신 지질 분산액(예를 들어, 대두유와 같은 오일)을 사용하여 상기한 어떤 방법으로 면역원성 지질 에멀젼 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 면역원성 리포좀 조성물의 제조방법을 제공한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 항원결정기 및 소수성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 화학적으로 합성하는 단계; 및 상기한 어떤 방법으로 면역원성 리포좀 또는 지질 에멀젼 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 면역원성 리포좀 또는 지질 에멀젼 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 "막과 결합된"이라는 말은, 소수성 도메인이 적어도 부분적으로 리포좀 막에 포매(embed)되고, 바람직하게는 소낭-형성 지질에 공유결합되지 않는 것을 의미한다. 소수성 도메인은 또한 그 자체가 막에 포매되는 지질 지방산 "말단"에 결합될 수 있다.

본 발명은 다양한 미생물 작용체 및 암에 대한 면역법의 효과 및 안정성을 개선하기 위해 고안된 항원 전달 시스템을 제공한다. 면역원은 특정 항원 서열에 융합된 소수성 도메인(HD)으로 구성된 유전자 카세트에 의해 암호화될 수 있다. HD를 암호화하는 핵산 서열 및 항원 에피토프를 포함하는 플라스미드는 예를 들어, 대장균(E. coli), 피치아 패스토리스(P. pastoris), 곤충 세포, COS-1 세포 또는 CHO 세포와 같은 적당한 숙주 내에서 제조 및 발현된다(Genetic Engineering News, 18:17(1988)). 일단 단백질이 발현 및 정제되면, 리포좀 내에서 조직된다. 막 존재 하에, 단백질은 이중지질층과 결합하여 막과 결합된 소수성 부분 및 수성 매질로 배향된 항원 에피토프를 가진 안정한 구조를 형성한다. 플라스미드는 키 위치에서 제한 부위를 가지도록 설계될 수 있어, 다른 항원 에피토프가 쉽게 치환되어 이어지는 면역을 최대로 보호하기 위해 다른 항원 에피토프를 사용하는 능력을 제공할 수 있다. 이 카세트의 독특한 특성 중 하나는 단백질 성분이 숙주 세포에서 다량으로 생산되고, 쉽게 정제된 후, 리포좀으로 혼합될 수 있다는 것이다. 이것은 백신의 대용량 제조 및 상업적 분배라는 최종 목적을 유지하는 동안, 미생물 작용체 또는 암으로부터의 보호를 촉진하는 가장 적합한 에피토프를 결정하기 위해 최대의 유연성을 제공한다.

따라서, 본 발명은 여러 가지 이점을 제공한다: (1) 에피토프는 쉽게 변하여 백신 디자인에 최대의 유연성을 제공할 수 있고; (2) 복합 에피토프는 담체 분자에 삽입될 수 있고; (3) 큰 항원 서열(즉, 피막 단백질 또는 수용체 도메인) 또는 서브 유닛을 필요시 포함할 수 있고; (4) 발현된 담체 단백질은 가용성이고, 표준 단백질 제조 방법을 사용하여 쉽게 정제할 수 있다. 수성 가용성 융합 생성물로서의 항원 구조체의 합성은 단백질의 소수성 도메인으로 인한 잠재적인 대용량 생산의 문제점을 최소화한다. 따라서, 리포좀 막 삽입을 위해 소수성 도메인을 가지고 여전히 수용성인 단백질 구조가 가장 유리할 것이다. 어떤 환경에서, 정제 과정 동안 구아니딘, 요소, 도데실황산나트륨, 옥틸 글루코시드 또는 데옥시콜레이트와 같은 가용제를 소량으로 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 둘 이상의 항원을 포함하는 구조를 제공한다. 이러한 구조는 다음과 같이 나타낼 수 있다:

H₂N - 항원 부위 I - HD - 항원 부위 II - COOH

본 발명은 또한 자연 유도된 또는 합성 단일 막횡단 나선 또는 나선 다발(2-12)의 사용을 고려한다. 항원 부위는 N- 또는 C-말단에 위치하거나, 또는 다발의 개별 가닥들 사이에 형성된 고리 사이에 놓일 수 있다.

본 명세서에 사용된 "항원"이라는 용어는, 숙주동물에 이질적일때, 그러한 동물의 조직에 접근함에 따라, 대식세포, 항원제시세포 및 항원 특이적 항체의 형성을 자극하고, 특별히 생체내 또는 생체외에서 그러한 항체들과 반응하는 어떤 물질(단백질 또는 단백질-다당류, 다당질, 미생물 서브유닛, 전체 병원체, 또는 암 표지를 포함한다)을 칭한다. 또한, 항원은 항원 및 교차-반응 항원(예를 들어, 자연면역(NK) 세포, 세포독성 T 세포 및 T 보조 세포)에 대한 수용체로 T-림프구의 증식 및/또는 활성을 자극하고, 림프구와 반응하여 세포-매개 면역이라 불리는 일련의 반응을 개시할 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물에서, 항원은 약 0.1 - 20 mg/ml 항원-HD의 양으로 존재하는 것이 바람직하다. 항원은 약 0.5 - 5 mg/ml 항원-HD의 양으로 존재하는 것이 더욱 바람직하다.

"항원결정기"는 면역학적 특이성을 결정하는 항원 또는 항원 구조체의 일부이다. 일반적으로, 항원결정기 또는 합텐은 자연발생항원에서 펩티드, 단백질 또는 다당류이다. 인공 항원에서, 그것은 아르사닐산 유도체와 같은 저분자량 물질일 수 있다. 항원결정기는 특히 생체내 또는 생체외에서 항원결정기의 항원 형태(예를 들어, 면역원성 물질에 부착된 항원결정기)에 의해 유도된 항체 또는 T-림프구와 반응할 것이다.

본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 항원결정기는 예를 들면 하기에 나타낸 항원으로부터 유도할 수 있다:

사용할 수 있는 항원 및 병원체의 추가적인 예들은 밀리치(Milich), 1989(Adv. Immunol. 45:195), 호시노 및 카플란(Hoshino and Kaplan), 1994(Curr.Top.Microbiol. Immunol. 185:179) 또는 베뉴고팔 및 구드(Venugopal and Gould), 1994(Vaccine 12:966)에 나타나 있다. 한 실시형태에 따르면, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터env유전자의 gp120 서브유닛과gag유전자의 p27이 사용된다. 다른 실시형태에서, 항원결정기는 HSV gD 또는 gB, HIV gp120, CMV gB, HCV E2, INFV HA 또는 NA, H.인플루엔자 P5 또는 P6, 섬모 단백질 및 단백질 D로부터 선택된 항원으로부터 유래할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "소수성 도메인"(HD)이라는 용어는 표면적이 500²보다 큰 소수성 부분 또는 구조를 가진 어떤 단백질, 펩티드, 지질 또는 분자를 의미한다. 가능한 HD의 예로는 어떤 막횡단(TM) 단편(예를 들어, 글리코포린 A; Tomita and Marchesi, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:2964), 시토크롬b ₅ 의 소수성 도메인(Taylor and Roseman, 1995, BBA 1278:35), 디프테리아 독소의 T 도메인(Choe et al., 1992, Nature 357:216), 슈도모나스 외독소 A의 도메인 II(Allured et al., 1986, PNAS 83:1320), 페니실린 감지도입기의 4-나선 다발(Hardt et al., 1997, Mol.Microbiol. 23:935), 박테리오로돕신의 7-나선 다발(Henderson and Unwin, 1975, Nature 257:28), 락토오스 퍼미아제(lac permease)의 12-나선 다발(Kaback et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:537) 및 콜리신의 기공 형성 도메인(Parker et al., 1989, Nature 357:93)이 포함된다.

본 명세서에서 사용된 "벡터"라는 용어는 플라스미드, 코스미드, 파지미드(phagmid) 또는 박테리오파지로부터 유래하거나, 또는 합성적으로 유래한, 그 속으로 핵산 단편이 삽입 또는 클로닝될 수 있는 핵산(예컨데, DNA)을 가리킨다. 이 목적을 위해 벡터는 하나 이상의 독특한 제한 부위를 포함할 수 있으며, 정의된 숙주 또는 유기체 내에서 자기 복제가 가능하여 클로닝된 서열을 복제할 수 있다. 벡터 분자는 숙주 유기체에 선택가능하거나 쉽게 검출되는 어떤 명확하게 정의된 표현형을 줄 수 있다. 벡터의 어떤 성분들은 전사, 번역, RNA 안정성 및 복제를 위해 조절 성분 및 다른 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "DNA 카세트"라는 용어는, 본 명세서에 기재된 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터 내의 유전자 서열을 칭한다. 핵산 카세트는 위치적으로 및 서열적으로 벡터 내에 배향되어, 카세트 내의 핵산은 RNA로 전사될 수 있고, 필요시, 융합 단백질 생성물로 번역될 수 있다. 카세트는 각 말단에 제한 엔도뉴클레아제를 가지는 것과 같이, 벡터속으로 쉽게 삽입하는데 적합한 3' 및 5' 말단을 가지는 것이 바람직하다.

항원 구조체는 재조합 기술을 사용하여 생성되는 것이 바람직하지만, 화학적 수단과 같은 이 분야의 공지된 방법을 사용하여 구조체를 합성할 수 있다. 이것은 비-펩티드 결합기가 사용되어야 하는 경우, 또는 소수성 도메인이 비-자연 발생 아미노산 잔기 또는 유사체를 포함하는 경우에 특히 유용할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시형태에서는 재조합 방법을 사용하여 항원 융합 단백질을 생성하는 반면, 본 발명은 또한 화학적 합성수단 또는 재조합과 화학적 수단의 조합에 의한 항원구조체를 제조하는 단계 및 상기한 면역원성 지질을 제조하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

바람직한 펩티드 결합기 이외에, 이 분야에 공지된 다른 결합기를 사용하여 항원을 소수성 도메인에 부착시킬 수 있다. 그러한 결합기의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜, 다당류, 폴리시알산, 숙신산, 부탄디온산, 아디프산, 및 SMPT(4-숙신이미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)-톨루엔), DSP(디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), EGS(에틸렌 글리콜 비스(숙신이미딜숙시네이트), SMCC(4-숙신이미딜옥시카르보닐-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트) 및 SPDP(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트)와 같은 표준 교차-결합 화학반응이 포함된다(Pierce catalog, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. 참조).

본 발명에 따르면, 항원-리포좀 복합체는 면역계의 세포에 의하여 순환으로부터 배제된 후에 면역계에 직접 제시되기 때문에, 리포좀은 항원 전달에서 중요한 역할을 한다. 또한, 면역자극 경로는 리포좀의 지질 조성물 변화에 따라 다르게 선택될 수 있다. 예를 들어, 지질 A(Asano and Kleinerman, 1993, J. Immunother. 14:286), P₃CSS(Lex et al., 1986, J. Immunol. 137:2676), 무라밀 디- 및 트리펩티드-PE(Fidler et al., 1981, PNAS 78:1680; Alving et al., 1985, Vaccines 4:166) 및 양이온 지질(Walker et al., 1992, PNAS 89:7915)와 같은 다른 면역자극 분자들이 리포좀으로 조직되어 다른 면역학적 경로를 자극할 수 있다. 예를 들어, MF59,Quil A, QS21 또는 명반과 같은 다른 보강제를 항원-리포좀 복합체와 결합시켜 사용할 수 있다. 또한, 사이토카인과 같은 면역조절 분자를 첨가하여 면역 반응을 유도할 수 있다.

본 발명의 실시에 사용된 리포좀은, 비타민 E 또는 비타민 C 팔미테이트와 같은 다른 부형제 뿐 아니라, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜글리세롤(PG) 및 포스파티딜콜린(PC)과 같은 포스파티딜 에테르류 및 에스테르류; 디올레오일글리세로숙시네이트와 같은 글리세리드류; 세레브로시드류; 강글리오시드류; 스핑고마이엘린; 콜레스테롤과 같은 스테로이드류; 및 기타 지질을 포함하는 광범위한 소낭-형성 지질로부터 제조될 수 있다(미국 특허 제 4,235,871호; 제 4,762,720호, 제 4,737,323호, 제 4,789,633호, 제 4,861,597호; 및 제 4,873,089호 참조). PC계 지질의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, (C-18)디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC); (C-16)디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC); (C-14)디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC); 및 (C-18, 불포화)디올레일포스파티딜콜린(DOPC)이 포함된다. 지질은 체온(약 38-39℃)에서 유체상으로 존재하는 것이 바람직하다. 따라서, DSPC 및 DPPC와 같이, 체온보다 높은 T_m을 가진 지질은 덜 바람직하다(그러나, 그럼에도 불구하고 여전히 유용할 수 있음). DMPC 또는 DOPC와 같이, 체온보다 낮은 T_m은 가진 지질이 더 바람직하다. 또한, 지질은 약 10% 이하의 콜레스테롤을 함유하는 것이 바람직하다. 지질 조성물이 약 0-10%의 콜레스테롤, 약 0-15%의 PG 및 약 0-100%의 PC를 포함하는 것이특히 바람직하다. 어떤 바람직한 실시형태에서, 조성물은 추가적으로 약 1-10%의 보강제(들)을 포함할 수 있으며; 보강제는 약 5% 이하의 양으로 존재하는 것이 바람직하다.

리포좀 제조는 종래 기술에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 리포좀은 초음파 처리 및 균질화 뿐 아니라 에탄올 주입(Batzri et al., 1973, Biochem. Biophys. Acta. 298:1015); 에테르 주입(Deamer et al., 1976, Biochem. Biophys. Acta. 443:629; Schieren et al., 1978, Biochem. Biophys. Acta. 542:137); 계면활성제 제거(Razin, 1972, Biochem. Biophys. Acta. 265:241); 용매 증발(Matsumato et al., 1977, J. Colloid Interface Sci. 62:149); 수 에멀젼에서 클로로포름으로부터 유기 용매의 증발(REV's)(Szoka Jr. et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4194); 핵공 폴리카보네이트 막을 통한 MLV's 또는 EUV's의 압출성형(Olson et al., 1979, Biochem. Biophys. Acta. 557:9); 인지질 혼합물의 동결 및 해동(Pick, 1981, Archives of Biochem. and Biophysics, 212:186)을 포함하는 수많은 다른 기술에 의해 제조되어 왔다.

조약에 의하면, 리포좀을 크기로 분류하고, 논의되고 있는 리포좀의 형태를 나타내기 위해 3개의 두문자를 사용한다. 다중박막 소낭은 일반적으로 "MLV"로 나타낸다. 작은 단일박막 소낭은 "SUV"로 나타내고, 큰 단일박막 소낭은 "LUV"로 나타낸다. 이러한 명칭은 때때로 리포좀의 화학적 조성에 따른다. 공지된 리포좀 형태의 학술 용어 및 개요를 논의하려면, 문헌(Storm et al., 1998,PSIT, 1:19-31)을 참조한다.

본 발명은 적당한 보강제를 가진 리포좀 조성물의 용도에 관한 것이다. 그러나, 본 발명은 또한 리포좀과 결합되지 않고, 적당한 보강제와 결합된 항원 구조체의 용도에 관한 것이다. 따라서, 백신 또는 면역원성 조성물은 두 성분: 소수성 도메인에 결합된 항원; 및 적당한 보강제 시스템으로 이루어진다. 사용할 수 있는 약제학적으로 허용가능한 담체 시스템의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 리포좀, 에멀젼, 프로인트(Freund's) 보강제(완전 또는 불완전), 명반, ISCOMS 및 피막 바이러스가 포함된다.

본 발명의 방법들은 리포좀 조성물을 면역원적 유효량, 즉, 어떤 첨가된 부형제 또는 담체와 조합되어 숙주에서 검출가능한 면역원성 반응을 일으키는 조성물의 양으로 사용할 것이다. 조성물이 백신 조성물로 사용된 경우, 유효량은 어떤 첨가된 부형제 또는 담체와 조합되어, 미생물에 대한 연속적인 노출로부터 숙주를 보호하거나(예방 백신), 이미 병든 숙주를 보호하기(치료적 백신)에 특이적이고 충분한 면역학적 반응을 일으키는 양일 것이다.

지금까지 본 발명을 일반적으로 기술하였으나, 본 발명을 설명하고, 그렇게 특정되지 않는 한 본 발명을 한정하지 않는 하기 상세한 실시예를 참조하여 더 잘 이해될 것이다.

실시예 I - HSV2

HSV2gD(1-23)-TM의 제조.자동 펩티드 합성기에서 화학적 합성으로 HSV2의 gD 피막 단백질로부터의 N-말단 23-아미노산 단편을 막횡단(TM) 단편에 결합시켰다. 합성된 펩티드를 표준 HF 분할법으로 분할하고, 워터스(Waters) C18 컬럼 및 0.1% TFA을 가진 100% 아세토니트릴 이동상을 사용하여 예비 HPLC로 정제하였다. 펩티드는 질량 분광계 및 모세 전기 영동에 의해 95% 이상의 순도를 나타내었다.

리포좀 제조.상기 방법(Fujii et al., 1997, Biochemistry 36:4959)에 따른 탐침 초음파 처리로 리포좀을 제조하였다. 요약하면, (단백질을 가지거나 가지지 않은)지질을 클로로포름/메탄올과 같은 유기 용매에 용해시켰다. 지질 용액의 분액을 피펫으로 둥근 바닥 유리 튜브에 옮기고, 질소기류 하에 65℃에서 용매를 증발시켜 지질막을 생성하였다. 이 막을 8시간 이상 진공하에 두어, 남아있는 유기 용매를 제거하였다. 지질막을 완충액으로 수화하고, 65℃에서 5-10분 동안 배양한 후 탐침 초음파 처리하여 리포좀을 제조하였다. 그리고 나서, 리포좀을 0.22 m 여과기로 여과하여 제제를 멸균하였다. 동력 빛 산란에 의해 리포좀을 크기대로 분류한 후 4주 이상 동안 집합체를 형성하였다.

리포좀 HSV2gD(1-23)-TM은 2.5 중량%의 지질 A와 함께, DMPC:Chol:DMPG(디미리스토일포스파티딜콜린:콜레스테롤:디미리스토일포스파티딜글리세롤)가 15:2:3인 몰비를 가지는 것이 특히 바람직하다.

백신 접종 방법 및 바이러스 항원에 대한 면역 반응 유도 시험.BALB/c 또는 C57BL/6 암컷 마우스(6-8주령)에 실험 백신 제제 또는 완충액을 2, 3, 또는 4주 동안 주당 1회 피하주사하였다. 과립구 발달 및/또는 가피 형성과 같은 부작용에 대해 주사 부위를 관찰하였다. 동물들을 비강내 경로를 통해 백신으로 면역시키는 경우에는, 동물들을 할로테인으로 마취시키고, 조성물(10-20ℓ)을 마이크로피펫 상의 멸균 선단을 사용하여 호흡용 비강에 투여하였다(Gallichan et al., 1993, J.Inf.Dis. 168:622).

백신 접종 과정 동안 및 바이러스 면역성 검사 후에 일정한 간격으로, 바이러스 항원에 대한 마우스의 면역 반응을 측정하였다. 바이러스와 혼합된 다른 희석 상태의 마우스 혈청이 첨가된 1 x 10⁵BHK 세포를 함유한 24-웰 집단 플레이트를 사용하여 바이러스 중화 항체 시험을 수행하였다. CO₂배양기 내에서 37℃에서 48-72시간 배양한 후, 세포독성에 대해 세포 단일층을 시험하고, 중화한 항체의 역가를 분석하였다. 바이러스 항원 5-10g 또는 HSV2 원료 25-50ℓ(1 x 10⁵PFU)를 첨가한 다른 희석 상태의 혈청을 배양하여 바이러스에 대한 항체의 침강을 측정하였다. 항원 에피토프를 함유한 리포좀은 또한 전술한 항체/ELISA 분석을 위한 표적으로 사용된다(Tuso et al., 1993, Transplantation 55:1375). 후자 분석의 결과는 항체의 결합 수준 및 개별형 구조를 측정하기 위해 사용될 것이다.

백신 접종한 마우스에서 바이러스 항원에 대한 지연된 형태의 과민 반응은 발바닥 분석을 사용하여 시험하였다. 백신 접종한 동물들은 할로테인으로 마취시키고, 한쪽 뒷발바닥에는 50ℓ의 자외선-불활성화된 HSV2를, 그리고 다른쪽 뒷발바닥에는 50ℓ 용균된 비감염 세포를 주사하였다. 24, 48 및 72시간 후에, 버니어 캘리퍼를 사용하여 마우스 발바닥의 팽창 정도를 측정하고, 기본량 측정치와 비교하였다. 비장 T 세포에 바이러스 항원을 접종한데 반응한 사이토카인의 생산에 의해 이 동물들의 T 세포 활성도 측정하였다. 백신 접종한 동물들에서 비장을 꺼내어, 이 비장을 멸균 플런저로 부드럽게 분쇄하고, 세포를 나일론 스크린 메쉬에 통과시켜 비장 균등액을 제조하였다. 세포 현탁액을 세정하고, 96-웰 미세역가 플레이트에 1 x 10⁶세포/웰로 도말하였다. 37℃에서 3 내지 4일 동안 다른 양의 바이러스 항원으로 세포를 배양시킨 다음, 웰에서 상등액을 수집하고, 사이토카인이 존재하는지 시험하였다. 시판되는 사이토카인 ELISA 키트를 사용하여 사이토카인 프로파일을 정의하였다(PharMingen사제(San Diego, CA) IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ, γ-액틴, 및 TNF-α). 특정 사이토카인에 특이적인 모노클로날 항체(mAb)를 사용하여, 샌드위치 ELISA에 의한 조직 배양 상등액 내의 사이토카인 단백질을 검출하였다. 요약하면, ELISA 플레이트를 래트 항-마우스 사이토카인 mAb로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS 중의 3% 우태아 혈청으로 두 시간 동안 차단하고, 각 실험 시료의 분액을 각 웰에 첨가하였다. 사이토카인 특이적 비오틴화된 래트 항-마우스 mAb를 각 웰에 첨가한 후, 애비딘 과산화효소(avidin peroxidase)를 첨가하였다. 비색 물질을 첨가하여 색반응을 일으켰다. 플레이트는 ELISA 분광 측정법으로 판독하고, 사이토카인 농도는 대조구 재조합 사이토카인으로부터 얻은 표준 곡선으로부터 계산하였다.

리포좀 백신 제제를 시험하기 위한 HSV2 마우스 뇌염 모델.백신 접종 또는 백신 미접종(대조구)한 BALB/c 암컷 마우스(10-12주령)를 치사량(1 x 10⁵PFU)의 뇌 통과된 HSV2으로 복강내 면역성 검사를 하였다. 치사량의 HSV2로 질내 면역성 검사한 마우스는 면역성 검사하기 1주 전과 면역성 검사하기 하루전(-1)에 피하 에스트로겐으로 먼저 전처리하였다. 그리고 나서, 아세프로마진 및 케타민을 복강내 주사하여 마우스를 마취시켰다. 그리고 나서, 건조 칼지스와브(Calgiswab)를 사용하여 질을 소독한 후, 마이크로피펫의 멸균 선단을 사용하여 질내로 HSV2(10-30ℓ)를 투여하였다(McDermott et al., 1984, J. Virol. 51:747). 면역성 검사 후 80일 동안 동물들의 생존(매일), 체중감소(처음 두 주 동안은 이틀에 한번, 그리고 나서는 매주 한번), 털의 외관, 및 신경병적 증상(감소된 활동수준, 사지의 끌림 또는 마비)을 관찰하였다.

항원-유도된 T 세포 증식.항원-유도된 T 세포 증식 분석을 사용하여 gD 항원에 대한 숙주의 민감도를 측정하였다. 비장을 멸균 플런저로 부드럽게 분쇄하고, 세포를 나일론 스크린 메쉬로 통과시켜 비장 균등액을 제조하였다. 10% 우태아 혈청(FCS), 10mM 헤페스(Hepes) 완충액, L-글루타민(2 mM), 페니실린(25 IU/ml), 및 스트렙토마이신(25 g/ml)을 함유한 RPMI 1640 배지에 세포를 현탁시켰다. 이 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에서 gD(5-20 g/ml)을 가지거나 또는 가지지 않은 1 x 10⁶세포/ml의 농도로 5% CO₂중에서 4일 동안 배양하였다. 이 배양액을 20㎕의 레자주린(resazurin) 염료로 3시간 동안 펄스하고, 사이토플루어 II(Cytofluor II; Perspective Biosystems사제, Farmington, MA)상에서 형광성을 측정하였다.

사이토카인-특이적 mRNA 분석.IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-10을 포함하는 면역법과 관련된 민감도를 반영할 수 있는 주요 사이토카인에 대한 사이토카인-특이적 mRNA 수준에 대해, 면역시킨 동물 및 면역시키지 않은 동물로부터의 T 세포를 시험하였다. T 세포는 전술한 바와 같이 비장으로부터 얻었다. 촘진스키 및 사키(Chomczynsky and Sacchi)(Chomczynsky et al., 1987, Analyt. Biochem. 162:156)가 설명한 방법의 변형법(Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 신선하거나 냉동된 세포(2 x 10⁶)를 변성 용액(4mM 구아니디늄 티오시아네이트, 25mM 시트르산 나트륨(pH 7.0), 0.5% 사르코실, 및 0.1 mM 2-메르캅토에탄올) 1mL에서 분리하였다. -20℃에서 밤새 이소프로판올 1 부피와 배양하여 RNA를 침강시켰다. 전체 RNA의 농도는 260nM로 조절하고, 시료들은 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다.

코센자 등(Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16)이 설명한 방법의 변형법을 사용하여 사이토카인을 분석하였다. 조류 미엘로블라스토시스 바이러스 역전사효소를 사용하여 전체 반응 혼합물 20ℓ중에 있는 2g의 총 RNA를 전사하여 단일 가닥 cDNA를 제조하였다(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). 각각의 흥미로운 사이토카인 유전자의 소정 크기의 DNA 단편을 증폭시키는데 쥐의 사이토카인에 대한 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머(표 1)를 사용하였다.

PCR 혼합물은 1ℓ의 cDNA, 2.5ℓ의 PCR 10x 완충액, 1ℓ의 각 5' 및 3' 프라이머, 2.5ℓ의 10x dNTPs(2mmol/L) 및 0.125ℓ의 서머스 아쿠아티쿠스(T. aquaticus) 열안정성 DNA 중합효소(Boehringer Mannheim)으로 이루어져 최종부피가 25ℓ이다. 특이적 γ-액틴 프라이머는 내부 대조구로서 548 bp 단편을 증폭시키는데 사용된다. PCR 혼합물을 광유로 피복하고, 94℃에서 7분 동안 혼합물 배양, 94℃에서 30초 동안 38회 반복, 60℃에서 45초 동안 프라이머 어닐링, 72℃에서 60초동안 연장, 그리고 72℃에서 7분 동안 배양한 후, 증폭시켰다. PCR 생성물을 에티디움 브로마이드의 존재 하에 아가로즈 겔 상에서 분리하였다. 밴드를 UV 빛 하에서 가시화하고, 촬영하고, 분자 분석 소프트웨어 패키지(Bio-Rad, Richmond CA)를 사용하여 사진으로부터 밀도측정하여 정량화하였다.

ELISA에 의한 사이토카인 측정.시판되는 사이토카인 ELISA 키트를 사용하여 면역시킨 동물 및 면역시키지 않은 동물로부터 분리한 비장 CD4⁺T 세포에 의해 분비된 사이토카인 프로파일을 정의하였다. 특정 사이토카인에 특이적인 모노클로날 항체(mAb)를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 비장 T 세포로부터 조직 배양 상등액 중의 사이토카인 단백질을 검출하였다. 요약하면, ELISA 플레이트를 래트 항-마우스 사이토카인 mAb로 밤새 피복하였다. 플레이트를 2시간 동안 PBS 중의 3% FCS로 차단한 후, 각 시료의 분액을 각 웰에 첨가하였다. 사이토카인 특이적 비오틴화된 래트 항-마우스 mAb를 각 웰에 첨가한 후, 애비딘 과산화효소를 첨가하였다. 비색 물질을 첨가하여 색 반응을 일으켰다. 플레이트는 ELISA 분광계에서 판독되고, 사이토카인 농도는 대조구 재조합 사이토카인으로부터 얻은 표준 곡선으로부터 계산하였다.

항-HSV2 CTL 반응.백신 접종 후, 비장 T 세포 중의 항원특이적 세포독성 T 림프구(CTL)가 존재하는지 평가하였다. 비장 림프구는 상기한 바와 같이 얻었다. 각각의 치료 그룹으로부터 림프구를 모은 후(n=5), 12-웰 배양 플레이트에서 10⁷세포/웰로 항원 없이 3일 동안 배양하였다. EL-4(H2^b) 표적 세포(ATTC)를 H2^b제한된세포에 대해 잔기 495-505 사이에 위치한(Hanke et al., 1991, J.Virol. 65:1177) HSV2 gB CTL 에피토프에 대응하는 펩티드와 함께 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 표적들을 세척하고, 1 x 10⁴세포를 함유한 100㎕ 역가를 각 웰에 첨가하였다. 효과기 림프구를 세척하고, 다양한 농도로 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. CytoTox 96 키트(Promega, Madison WI)를 사용하여, 490nm에서 흡수를 기록함으로써, 표준 ELISA 플레이트 판독기(HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San Jose, CA)에서 측정된 상등액 락테이트 탈수소효소(LDH)로부터 퍼센트 특이적 용해를 계산하였다. HSV2-항원 특이적 용해는 표준 기준에 따라 결정하였다. 데이타는, 퍼센트 특이적 용해 = 100 x [(실험적-효과기 자발적-표적 자발적)/(표적 최대-표적 자발적)]으로 나타내었다.

결과

도 1에 나타난 생존 곡선으로부터 100% 보호하는데 필요한 접종의 수를 설정할 뿐 아니라 HSV2의 치사량을 사용한 전신성 면역성 검사에 대해 마우스를 보호하는 리포좀-펩티드의 효과를 알 수 있다. 도 1은 HSV2를 사용한 치사 면역성 검사로부터 BALB/c 마우스를 보호하는데 필요한 리포좀 HSV2gD(1-23)-TM 백신의 투여량 수를 보여준다. 7마리의 마우스 그룹을 2, 3, 또는 4회 면역시킨 후, 치사량의 HSV2로 면역성 검사를 하였다. 4회 백신 접종한 경우, 리포좀 백신으로 면역시킨 동물들은 HSV2에 의한 감염과 관련된 신경학적 합병증이나, 전체 연구에서 검출된 다른 어떤 감염의 징후도 나타내지 않았다. 가장 중요한 것은 HSV2를 사용한 치사면역성 검사에서 모든 마우스가 생존한 것이다. 2 또는 3주마다 면역시킨 경우, 100% 이하의 마우스가 보호되었다. 반대로, 위약(즉, 완충액)으로 4회 백신 접종한 마우스들은 HSV2 면역성 검사로부터 보호되지 않았다.

리포좀 HSV2gD(1-23)-TM은 또한 C57BL/6마리 마우스의 세 그룹에서 실험하였고, BALB/c 마우스에서 얻은 결과와 유사한 보호 효과를 발견하였다. 그 결과를 표 2에 요약하였다. 그룹 1의 마우스는 1주 및 4주에 피하에 백신 접종하고; 그룹 2의 마우스는 1주에 피하로, 4주에는 직장 내로 백신 접종하고; 그룹 3의 마우스(대조구)는 백신 접종하지 않았다. 최종 백신 접종(4주)한 지 일주일 후에, 마우스를 치사량의 HSV2로 복강내 면역성 검사를 하고, 3주 동안 사망률을 관찰하였다. BALB/C 마우스에서와 같이, 리포좀 HSV2gD(1-23)-TM으로 백신 접종시킨 마우스 그룹은 피하주사로 백신 접종한 경우 또는 피하로 미리 투여한 후에 점막 촉진체가 주어진 경우 상당수가 생존하였다.

도 2에는 리포좀 HSV2gD(1-23)-TM과 다른 항원 제시법의 비교를 나타내고 있다. 7마리 마우스의 각 그룹을 4회 면역시킨 후, 치사량의 HSV2로 면역성 검사를하였다. 다시 리포좀 HSV2gD(1-23)-TM 백신으로 4회 예방 접종시켰더니 치사량의 HSV2로부터 마우스를 100% 보호하였다. 비-리포좀 HSV2gD(1-23)-TM, 또는 HSV2gD(1-23)-TM이 없는 리포좀으로 4회 면역시키면, 치사 HSV2 면역성 검사로부터 상당히 보호할 수 없다. 이것은 리포좀과 조작된 단백질 성분이 모두 서로 결합되어 효과적인 면역 반응을 달성한다는 것을 명백하게 보여준다. 특히 중요한 점은, 리포좀 HSV2gD(1-23)-TM 백신이 열-불활성화된 바이러스를 사용하여 면역시킨 경우보다 더 우수하게 보호한다는 것인데, 이것은 바이러스계 백신이 일반적으로 면역 반응에 대해 우수한 자극을 제공하는 것으로 여겨지기 때문이다(Desrosiers, 1992, AIDS Res.Hum.Retrovir. 8:1457).

연구 마지막에, 마우스를 치사시키고, 혈청을 수집하여 그 때의 면역 반응 성질을 특징화하였다. 백신 접종한 마우스의 혈청이 면역 반응을 자극하는데 사용되고 활성 바이러스를 침강시키는 펩티드를 특이적으로 인식하는, 높은 역가의 항체(1:100)를 함유한다는 것을 발견하였고, 이는 항체가 바이러스 표면상의 에피토프를 인식한다는 것을 암시한다. 항체는 또한 펩티드가 없는 리포좀이 아닌 HSV2gD(1-23)-TM 리포좀을 침강시키고, 이는 항체가 HSV2의 gD 에피토프를 특이적으로 인식한다는 것을 암시한다.

하기 표 3은 4주 동안 매주 1회 피하주사한 리포좀 HSV2gD(1-23)-TM이 표준 보강제에 비해 더 강한 면역 반응을 일으키는 것을 나타내는 면역학적 분석을 요약한 것이다. 불완전한 프로인트 보강제 또는 명반과 혼합한 항원으로 백신 접종하면 바이러스 면역성 검사로부터 마우스를 보호할 수 없었다. 중화 항체 실험 및지연된 고감도 반응으로부터 얻은 데이타는 리포좀 HSV2gD(1-23)-TM 그룹에 대해 관찰된 최고 항체 역가(B 세포 반응) 및 최대량의 발바닥 팽창(T 세포 반응)을 가진 생존 데이타와 유사하였다. 리포좀 HSV2gD(1-23)-TM 치료와 관련된 다른 중요한 이점은, 불완전한 프로인트의 보강제를 항원과 함께 주사한 마우스에서의 결과와는 달리, 어떤 마우스에서도 주사 부위에 자극 또는 염증이 없었다는 것이다(불완전한 프로인트의 보강제를 주사한 경우 주사 부위가 붉어진 17/17 대 리포좀 HSV2gD(1-23)-TM의 경우 0/17). 명반을 사용한 경우, 17/17의 마우스는 주사 부위에 뚜렷한 과립구가 발달하였다. 이와 대조적으로, 리포좀 HSV2gD(1-23)-TM은 어떤 마우스에서도 과립구를 형성시키지 않았다. 요약하면, 이 결과들로부터 마우스에서 치사량의 HSV2에 대하여 리포좀 HSV2gD(1-23)-TM에 의해 유도된 보호 면역 반응에 B 및/또는 T 세포 반응(중화 항체 역가 및 발바닥 팽창 정도로 판단)이 기여한다는 것을 알 수 있다.

실시예 II - HSV2

HSV2gD(1-23)-HD의 제조.45-아미노산 소수성 도메인(HD)과 결합된 gD 에피토프를 암호화하는 중복 올리고뉴클레오티드를 사용하여, HSV2gD(1-23)-HD를 암호화하는 유전자 구조체를 생성하였다. 유전자를 암호화하는 부분을 연속 연장 및 증폭시켜 구조체를 만들었다. 그리고 나서, 유전자를 pTrcHis 발현 벡터속에 연결하고, 서열 분석으로 확인하였다. 소규모의 발현 연구는 1 mM IPTG로 유도하여 개시하고, 리포좀 HSV2gD(1-23)-TM을 사용한 백신 접종 연구에서 생성된 마우스 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석하여 확인하였다. 또한, 단백질은 SDS-PAGE로 분석하고, 코마시 염색(Coomassie staining)으로 판단된 바와 같이 예상 분자량(≒6kD)에 대응하는 밴드를 발견하였다. 예상 단백질이 소규모로 발현되는 것이 밝혀지면서, pTrcHis/HSV2gD(1-23)-HD 구조체를 함유하는 대장균의 10 리터 배치 발효를 완료하여 약 60 그램의 세포 페이스트를 수득하였다. 유도한 후, 발효 시간 과정의 웨스턴 블롯에 의해 HSV2gD(1-23)-HD의 발현을 입증하였다. 1% 디옥시콜레이트 및 5mM의 이미다졸을 함유하는 완충액에서 프렌치 프레스(French Press)를 사용하여 약 30그램의 세포 페이스트로부터 박테리아를 용균시켰다. 세포 파편을 펠렛화하기 위해 원심분리한 후, 수용성 상등액에서 HSV2gD(1-23)-HD가 우세하게 발견되었다.

가용성 HSV2gD(1-23)-HD 단백질을 함유하는 상등액을 니켈-충전된 킬레이트화 세파로즈 컬럼에 통과시켜 정제하였다. 컬럼을 5mM 이미다졸, 200mM의 이미다졸, 및 1% 디옥시콜레이트를 함유하는 5mM의 이미다졸을 함유하는 용액으로 연속적으로 세척하여 잔류 단백질을 모두 제거하였다. HSV2gD(1-23)-HD 단백질은 마지막으로 200mM 이미다졸, 1% 디옥시콜레이트 용액으로 용리하였다. 코마시 염색된 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 피크 분획을 확인하였다. HSV2gD(1-23)-HD을 포함하는 모든 피크 분획을 모아, 밀리포어 울트라프렙 농축기(Millipore Ultraprep concentrator)를 사용하여 농축하였다. 최종 농축물은 코마시 염색된 SDS-PAGE 겔 상에 단일 밴드의 존재로 판단된 바와 같이 순수 HSV2gD(1-23)-HD를 함유하는 것으로 나타났다. 첫 시행에서, 리포좀 형성 및 백신 접종 연구를 위하여 약 2-3 mg의 HSV2gD(1-23)-HD을 얻었다.

리포좀 제조 및 백신 접종 과정, 면역 반응 유도 실험, HSV2 마우스 뇌염 모델, 항원-유도된 T 세포 증식, 사이토카인-특이적 mRNA 분석, ELISA 사이토카인 측정 및 항-HSV2 CTL 반응은 본질적으로 실시예 I에 기재한 바와 같다.

결과.표 3에 도시된 생존 곡선은 보호 면역 반응을 유도하기 위한 HSV2gD(1-23)-HD의 능력을 보여주고 있다. 이러한 특정 공식화를 가지는 % 생존율은 40%로 관찰되었다. 비교해보면, HSV2gD(1-23)-TM 대조구 그룹은 100% 생존한 반면, 완충액 처리된 대조구 동물들 중에는 생존체가 없었다.

실시예 III - HIV

COS-1 세포에서 HIV(gp120-HD) 및 HIV(△gp120-HD)의 제조.구조적 에피토프 연구를 위해, PCR로 플라스미드 DNA를 증폭시키고, 디데옥시 뉴클레오티드 방법으로 서열확인하기 위한 1536-bp 생성물을 서브클로닝함으로써, gp160 유전자(NIH AIDS Research and Reagent Program, Rockville, MD)를 함유하는 pHXB2-env 플라스미드로부터 gp120 서열을 얻었다. HIVgp120 유전자ATGAGAGTGAAGGAGAAATAT의 처음 21-bp에 대응하는 5'(센스) 프라이머 및 HIV gp41 단백질을 제거하는 뉴클레오티드 1515 내지 1536TGCTCTTTTTTCTCTCTGCAC에 대응하는 3'(안티센스) 프라이머를 사용하여, gp120 단편을 클로닝하고, PCR로 증폭시켰다. 또한, 각각의 프라이머를 편리한 제한 효소 부위의 측면에 위치시켜, pcDNA4-His 발현 벡터의 다중 클로닝 부위와 매치시켰다. PCR 생성물을 유전자 카세트 플라스미드로서 HD 도메인을 포함하는 pcDNA4-His속으로 연결시켰다(Invitrogen, Inc., San Diego, CA). gp120 단백질 중의 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드를 제외한 두 5' 및 3' 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭으로 유전자 결여 돌연변이를 만들었다; 이들은 △136-151gp120, △128-194gp120 및 △123-203gp120을 포함한다. 프라이머는 두 유전자 산물의 연결을 허용하는 편리한 제한 효소 서열을 포함한다. 따라서, 각 돌연변이는 관련된 특이적 제한 부위에 의해 암호화되는 두 아미노산으로 대체된다. 최종 유전자는 오토사이클 키트(AutoCycle kit; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)의 프로토콜 및 시약 및 ALFExpress 키트(ALFExpress kit; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 서열확인 장치로 이어진 결과를 사용하여 DNA를 서열확인하여 확인하였고, 그 결과는 AM 소프트웨어 v.3.2 키트(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로 분석하였다. 플라스미드는 DEAE-덱스트란 시약을 사용하여 COS-1 세포(ATCC, Rockville, MD)로 유전자도입하였다. 제오신(Zeocin; Invitrogen, Ind., San Diego, CA)을 사용하여 안정한 유전자도입체를 선택하고, 제한된 희석액으로 클로닝하였다. 고체 지지체에 결합된 니켈에 대한 선택적 친화력으로 gp120-HD 단백질을 정제하였다. 높은 수준의 단백질을 생산하는 클론들은 웨스턴 블롯 분석 또는 FACS 분석으로 분석하였다. 정제가 완료된 후에 HIV(gp120)-HD, HIV△136-151gp120, HIV△128-194gp120 및 HIV△123-203gp120의 히스티딘 결합기는 엔테로키나아제 분해로 제거하였다. 필요시, 크기 배제, 이온 교환, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하여 HIVgp120-HD 및 HIV△gp120-HD 단백질을 더 정제한다.

HIV-HD의 제조.세 개의 에피토프(CTL, T 보조 세포, 및 B 세포)를 결합하는 뉴클레오티드 서열은 상이한 HIV 단백질(KQIINMWQEVGKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK(SEQ ID NO. 19))에서 발견된 서열로부터 선택하고, 대장균 코돈 선호도를 이용하여 이 단백질 서열로부터 유도하였다(Looman et al., 1987, EMBO J.6:2489). HIV 서열을 암호화하는 합성 유전자는 합성, 보합결합, PCR, 및 중복 올리고뉴클레오티드의 연결에 의해 조립하였다. HIV 단편을 암호화하는 조립된 전장 유전자는 PCR로 증폭시키고, 발현 플라스미드속에 연결시켰다. 최종 유전자는 DNA를 서열확인하여 확인하였다.

pTrcHis 플라스미드를 함유하는 HIV-HD를 대장균으로 형질전환시켰다. 박테리아를 암피실린(50 g/ml)을 첨가한 LB배지에서 37℃에서 중간-로그상까지 배양시켰다. 이 때, IPTG를 첨가하여 trp/lac 잡종 프로모터를 유도하였다. 매시간 점들을 조사하여 HIV-HD 단백질의 최적 유도 후 발현을 결정하였다. 최적 발현의 시점에서, 원심분리하여 세포들을 수집하였다. 세포 펠렛을 용균 및 원심분리하였다. 단백질이 존재하는지 용균물을 분석하였다. 고체 지지체에 결합된 니켈에 대한 선택적 친화력으로 HIV-HD 단백질을 정제하였다. 필요시, 크기 배제, 이온 교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하여 HIV-HD를 더 정제할 수 있다.

리포좀 제조.상기 과정에 따라 탐침 초음파 처리하여 리포좀을 제조하였다(Fujii et al., 1997, Biochemistry 36:4959). 요약하면, (단백질을 가지거나 가지지 않는)지질을 클로로포름/메탄올과 같은 유기 용매에 용해시켰다. 지질 용액의 분액을 피펫으로 둥근 바닥 유리 튜브에 옮기고, 질소 기류 하에 65℃에서 용매를 증발시켜 지질막을 만들었다. 그 막을 8시간 이상 진공하에 놓아, 잔류 유기 용매를 제거하였다. 지질막을 완충액으로 수화시키고, 5-10분 동안 65℃에서 현탁액을 배양한 후 탐침 초음파 처리하여 리포좀을 제조하였다. 그리고 나서, 리포좀을 0.22 m 여과기를 통해 여과시켜 제제를 멸균하였다. 동력 빛 산란에의해 리포좀을 크기대로 분류한 후 4주 이상 동안 집합체를 형성하였다.

백신 접종 방법 및 바이러스 항원에 대한 면역 반응 유도 실험.BALB/c 암컷 마우스(6-8주령)를 1, 4, 및 8주에 실험 백신 제제 또는 완충액으로 피하로 백신 접종하였다. 과립구 발달 및/또는 가피 형성과 같은 부작용에 대해 주사 부위를 관찰하였다. 비강내 경로를 통해 동물들을 백신으로 면역시키는 경우에는, 동물들은 할로테인으로 마취시키고, 실험물(10-20ℓ)을 마이크로피펫 상의 멸균 선단을 사용하여 호흡용 비강에 투여하였다(Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis. 168:622).

ELISA에 의한 항체 반응 측정.백신 접종 과정 동안 일정한 간격으로(예를 들어, 주당 1 x), 바이러스 항원에 대한 마우스의 면역 반응을 측정하였다. 항원 에피토프를 함유하는 리포좀은 또한 상기한 바와 같이 항체/ELISA 분석을 위한 표적으로 사용하였다(Tuso et al., 1993, Transplantation 55:1375). 후자 분석의 결과는 결합 수준 및 항체의 개별형 구조를 측정하기 위해 사용하였다.

지연된 형태의 과민성(DTH) 분석.백신 접종한 마우스에서 바이러스 항원에 대한 DTH 반응은 발바닥 분석을 사용하여 시험하였다. 백신 접종한 동물들은 할로테인으로 마취시키고, 한쪽 뒷발바닥에 50ℓ의 리포좀 항원 또는 항원 없이 주사하고, 다른쪽 뒷발바닥에는 50ℓ의 완충액을 주사하였다. 24, 48 및 72시간 후에, 버니어 캘리퍼를 사용하여 마우스의 발바닥 팽창 정도를 측정하고, 기본량 측정치와 비교하였다.

사이토카인-특이적 mRNA 분석.IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-10을 포함하는, 면역과 관련된 민감도를 반영할 수 있는 주요 사이토카인에 대한 사이토카인-특이적 mRNA 수준에 대해 면역시킨 동물 및 면역시키지 않은 동물로부터의 T 세포를 시험하였다. 면역시키고 1주 및 4주 후에 비장 T 세포를 상기한 바와 같이 분리하였다. 문헌(Chomczynsky et al., 1987, Analyt. Biochem. 162:156)에 기재된 방법의 변형법(Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 신선하거나 냉동된 세포(2 x 10⁶)를 변성 용액(4mM 구아니디늄 티오시아네이트, 25mM 시트르산 나트륨(pH 7.0), 0.5% 사르코실, 및 0.1 mM 2-메르캅토에탄올) 1mL에서 분리하였다. RNA를 -20℃에서 밤새 이소프로판올 1 부피와 배양하여 침강시켰다. 전체 RNA의 농도는 260nM로 조절하고, 시료들은 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다.

사이토카인은 문헌(Chomczynsky et al., 1987, Analyt. Biochem. 162:156)에 기재된 방법의 변형법(Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16)을 사용하여 분석하였다. 조류 미엘로블라스토시스 바이러스 역전사효소를 사용하여 전체 반응 혼합물 20ℓ중에 있는 2g의 총 RNA를 전사하여 단일 가닥 cDNA를 제조하였다(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). 각각의 흥미로운 사이토카인 유전자의 소정 크기의 DNA 단편을 증폭시키는데 쥐의 사이토카인에 대한 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머(표 1)를 사용하였다. PCR 혼합물은 1ℓ의 cDNA, 2.5ℓ의 PCR 10x 완충액, 1ℓ의 각 5' 및 3' 프라이머, 2.5ℓ의 10x dNTPs(2mmol/L) 및 0.125ℓ의 서머스 아쿠아티쿠스(T. aquaticus) 열안정성 DNA 중합효소(Boehringer Mannheim)으로 이루어져 최종부피가 25ℓ이다. 특이적 γ-액틴 프라이머는 내부 대조구로서 548 bp 단편을 증폭시키는데 사용된다. PCR 혼합물을 광유로 피복하고, 94℃에서 7분 동안 혼합물 배양, 94℃에서 30초 동안 38회 반복, 60℃에서 45초 동안 프라이머 어닐링, 72℃에서 60초 동안 연장, 그리고 72℃에서 7분 동안 배양한 후, 증폭시켰다. PCR 생성물을 에티디움 브로마이드의 존재 하에 아가로즈 겔 상에서 분리하였다. 밴드를 UV 빛 하에서 가시화하고, 촬영하고, 분자 분석 소프트웨어 패키지(Bio-Rad, Richmond CA)를 사용하여 사진으로부터 밀도측정하여 정량화하였다.

비장 T 세포에서 ELISA에 의해 사이토카인 측정.바이러스 항원과 비장 T 세포에 바이러스 항원을 접종한데 반응한 사이토카인의 생산에 의해 이 동물들의 T 세포 활성을 또한 측정하였다. 백신 접종한 동물들에서 비장을 꺼내어, 이 비장을 멸균 플런저로 부드럽게 분쇄하고, 세포를 나일론 스크린 메쉬를 통과시켜 비장 균등액을 제조하였다. 세포 현탁액을 세정하고, 96-웰 미세역가 플레이트에 1 x 10⁶세포/웰로 도말하였다. 37℃에서 3 내지 4일 동안 다른 양의 바이러스 항원으로 세포를 배양시킨 다음, 웰에서 상등액을 수집하고, 사이토카인이 존재하는지 시험하였다. 시판되는 사이토카인 ELISA 키트를 사용하여 사이토카인 프로파일을 정의하였다(PharMingen사제(San Diego, CA) IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ, γ-액틴, 및 TNF-α). 특정 사이토카인에 특이적인 모노클로날 항체(mAb)를 사용하여, 샌드위치 ELISA에 의한 조직 배양 상등액 내의 사이토카인 단백질을 검출하였다. 요약하면, ELISA 플레이트를 래트 항-마우스 사이토카인 mAb로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS 중의 3% 우태아 혈청으로 두 시간 동안 차단하고, 각 실험 시료의 분액을 각 웰에 첨가하였다. 사이토카인 특이적 비오틴화된 래트 항-마우스 mAb를 각 웰에 첨가한 후, 애비딘 과산화효소를 첨가하였다. 비색 물질을 첨가하여 색반응을 일으켰다. 플레이트는 ELISA 분광 측정법으로 판독하고, 사이토카인 농도는 대조구 재조합 사이토카인으로부터 얻은 표준 곡선으로부터 계산하였다. 모든 사이토카인 ELISA 키트(IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ, γ-액틴, 및 TNF-α)는 파민젠(PharMingen; San Diego, CA)사로부터 구입하였다.

항원-유도된 T 세포 증식.항원-유도된 T 세포 증식을 사용하여 HIV 항원에 대한 숙주의 민감도를 측정하였다. 상기한 바와 같이 비장 균등액을 분리하였다. 10% FCS, 10mM 헤페스(Hepes) 완충액, L-글루타민(2 mM), 페니실린(25 IU/ml), 스트렙토마이신(25 g/ml) 및 젠타마이신(80 g/ml)를 함유한 RPMI 1640 배지에 세포를 현탁시켰다. 이 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에서 gD(5-20 g/ml)을 가지거나 또는 가지지 않은 1 x 10⁶세포/ml의 농도로 5% CO₂중에서 3-4일 동안 배양하였다. 이 배양액을 20ℓ의 레자주린 염료로 3시간 동안 펄스하고, 사이토플루어 II(Perspective Biosystems사제, Farmington, MA)에서 형광성을 측정하였다.

항-HIV CTL 반응.백신 접종 후, 비장 T 세포 중의 항원특이적 세포독성 T 림프구(CTL)가 존재하는지 평가하였다. 비장 림프구는 상기한 바와 같이 얻었다. 각각의 치료 그룹으로부터 림프구를 모은 후(n=5), 12-웰 배양 플레이트에서 10⁷세포/웰로 항원 없이 3일 동안 배양하였다. L5198Y 림프종 (H2^d) 표적세포(ATTC)를 H2^d제한된 세포에 대한 HIV CTL 에피토프에 대응하는 펩티드와 함께 37℃에서 4시간 동안 배양하였다(Hanke et al., 1991, J.Virol. 65:1177). 표적들을 세척하고, 1 x 10⁴세포를 함유한 100㎕ 역가를 각 웰에 첨가하였다. 효과기 림프구를 세척하고, 다양한 농도로 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. CytoTox 96 키트(Promega, Madison WI)를 사용하여, 490nm에서 흡수를 기록함으로써, 표준 ELISA 플레이트 판독기(HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San Jose, CA)에서 측정된 상등액 락테이트 탈수소효소(LDH)로부터 퍼센트 특이적 용해를 계산하였다. HSV2-항원 특이적 용해는 표준 기준에 따라 결정하였다. 데이타는, 퍼센트 특이적 용해 = 100 x [(실험적-효과기 자발적-표적 자발적)/(표적 최대-표적 자발적)]으로 나타내었다.

실시예 IV - 인플루엔자 바이러스(INFV)

INFV-HD의 제조.선택된 에피토프의 뉴클레오티드 서열을 대장균 코돈 선호도를 이용하여 단백질 서열로부터 유도하였다(Looman et al., 1987, EMBO J.6:2489). 항원 서열(들)을 NP(147-161, TYQRTRALVRTGMDP; 55-69(SEQ ID NO. 20), RLIQNSLTIERMVLS(SEQ ID NO.21)) 및 HA(91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASL(SEQ ID NO.22))로부터의 에피토프에 대응하는 유전자 카세트 속에 삽입하였다. 브루마누 등(Brumeanu et al., 1997(HA 110-120/HA 150-159, SFERFEIPKEGGWLTEKEGYSP(SEQ IDNO.23))(Brumeanu et al., 1997, J. Virol.71:5473))이 기재한 바와 같이 조합 에피토프 백신은 T-B 에피토프로 이루어지게 구성할 수 있다. 일단 적당한 서열(들)을 얻으면, INFV-HD를 암호화하는 합성 유전자는 합성, 보합결합, PCR, 및 중복 올리고뉴클레오티드의 연결에 의해 조립된다. INFV 단편을 암호화하는 조립된 전장 유전자는 PCR로 증폭시키고, 발현 플라스미드속에 연결시켰다. 최종 유전자는 DNA를 서열확인하여 확인하였다.

INFV-HD 함유 플라스미드를 대장균으로 형질전환시켰다. 박테리아를 암피실린(50 g/ml)을 첨가한 LB배지에서 37℃에서 중간-로그상까지 배양시켰다. 이 때, IPTG를 첨가하여 trp/lac 잡종 프로모터를 유도하였다. 매시간 점들을 조사하여 INFV-HD 단백질의 최적 유도 후 발현을 결정하였다. 최적 발현의 시점에서, 원심분리하여 세포들을 수집하였다. 세포 펠렛을 용균 및 원심분리하였다. 단백질이 존재하는지 용균물을 분석하였다. 고체 지지체에 결합된 니켈에 대한 선택적 친화력으로 INFV-HD 단백질을 정제하였다. 필요시, 크기 배제, 이온 교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하여 INFV-HD를 더 정제할 수 있다.

바이러스 감염 모델.백신의 효능을 설명하는데 사용되는 INFV 가닥은 PR8이라 불리는 A/PR/8/34 바이러스의 재분류체(reassortant)이다. 바이러스를 요막 접종하여 10 내지 12일 된 계란의 배에서 배양한 후, 로커에서 37℃에서 40-48시간 동안, 4℃에서 20-24시간동안 배양하고, 요막 유체에서 꺼내었다. 96-웰 미세적정 접시에서 0.5% 닭의 적혈구를 가지고 바이러스 혈구응집반응 분석을 수행하여 바이러스 원종의 혈구응집 단위(HAU)/ml를 측정하였다.

BALB/c 마우스 모델에서, 메토판(metofane)(20ℓ)으로 마취된 마우스에 마이크로피펫의 멸균 선단을 사용하여 비강내 투여한 PR8 가닥의 1200 HAU는 4일만에 감소된 운동성, 털의 감소, 20% 체중 감소 및 2주 내 치사를 포함하는 명백한 감염 증상을 보였다. 96-웰 미세적정 접시에서 50% 종말점으로 MDCK 세포 용해 분석을 수행하여, 높은 역가의 감염성 바이러스가 감염 후 4일만에 제조된 폐 균등액에 존재한다는 것을 발견하였다.

백신 접종 방법 및 바이러스 항원에 대한 면역 반응 유도 실험.BALB/c 암컷 마우스(6-8주령)에 실험 백신 제제 또는 완충액을 1, 4, 또는 8주에 피하주사하였다. 과립구 발달과 같은 부작용에 대해 주사 부위를 관찰하였다. 동물들을 비강내 경로를 통해 백신으로 면역시키는 경우, 동물들을 메토판으로 마취시키고, 실험물(10-20ℓ)을 마이크로피펫 상의 멸균 선단을 사용하여 호흡용 비강에 투여하였다(Gallichan et al., 1993, J.Inf.Dis.168:622).

폐조직에서 INFV RNA의 RT-PCR 검출.바이러스 면역성 검사 4일 후에 취한 실험 동물의 폐에서 INFV RNA의 RT-PCR을 검출하여 바이러스 감염을 방지하기 위한 면역의 효과를 입증하였다. 마우스로부터 취한 폐의 표본을 신속하게 냉동하고, 분쇄해서, 냉동 분말을 평가 과정이 진행될 때까지 -70℃에서 저장하였다. 상기 기술의 변형법을 사용하여, 바이러스 RNA에 대한 전체 RNA 분리 및 RT-PCR 분석을 수행하였다(Chomczynsky et al., 1987, Analyt. Biochem. 162:156; Shirwan et al., 1993, J.Immunol. 151:5228; Lakeman and Whitley, 1995, J.Inf. Dis. 171:857). 사용되는 프라이머는 인플루엔자 바이러스 A의 매트릭스 유전자(단편7)에 대해 특이적이다(Atmar et al., 1996, J.Clin.Microbiol.34:2604). 티탄 원 튜브 RT-PCR 시스템(Titan One Tube RT-PCR System; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 시약 및 프로토콜을 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 요약하면, 전체 RNA 주형 1 g에 대한 1pg를 0.2 mM dNTPs, 0.4 M 안티센스 프라이머 FAM1(5'-CAGAGACTTGAAGATGTCTTTGC-3'(SEQ ID NO. 24)), 0.4 M 센스 프라이머, FAM2(5'-GCTCTGTCCATGTTATTTGGA-3'(SEQ ID NO. 25)), 5 mM DTT, 5U RNase 억제제, 1.5 mM MgCl₂, 및 AMV/팽창 고성능 효소의 존재 하에 하기 조건에서 배양하였다: 60℃에서 30분 동안 1회 반복; 94℃에서 2분 동안; 94℃에서 30초 동안 10회 반복, 55℃에서 30초 동안, 68℃에서 45초 동안; 매 주기마다 5초씩 증가시키면서 94℃에서 30초 동안, 55℃에서 30초 동안, 68℃에서 45초 동안 25회 반복; 그리고 나서, 68℃에서 7분 동안 1회 반복. 명백한 결과는 에티디움 브로마이드로 염색되고, UV 트랜스조명기(BioRad Gel Doc 1000)로 촬영된, 1.5% NuSieve-아가로즈 겔(FMC Bioproducts, Rockland, ME) 내의 212 bp의 가시적인 밴드에 근거한 것이다. 이 방법은 바이러스 DNA의 존재여부를 측정하는데 민감하고 매우 특이적인 것으로 보인다(Lakeman and Whitley, 1995, J.Inf.Dis.171:857).

HA1 도메인의 서열.HA1 도메인(단편 4) 서열은 RT-PCR 반응에서 바이러스 RNA로부터 HA1 도메인을 증폭시켜 밝히고, 서열확인하기 위해 1100 bp 생성물을 서브클로닝하고, 디데옥시-뉴클레오티드 종결 방법을 사용하여 서열확인하였다. 증폭 프라이머는 cDNA 프라이머(5'-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAAC-3'(SEQ ID NO. 26))및 PCR 프라이머(5'-CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3'(SEQ ID NO. 27))(Pyhala et al., 1995 J.Gen. Virol. 76:205)이고, 조건은 60℃에서 30분 동안 1회 반복; 94℃에서 2분 동안; 94℃에서 30초 동안, 60℃에서 30초 동안, 68℃에서 45초 동안 10회 반복; 매 주기마다 5초씩 증가시키면서 94℃에서 30초 동안, 60℃에서 30초 동안, 68℃에서 45초 동안 25회 반복; 그리고 나서 68℃에서 7분 동안 1회 반복으로 하여 상기한 바와 같이 티탄 원 튜브 RT-PCR 시스템을 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 이어서 서열확인하기 위해, 1100 bp 산물을 TA PCR 2.1 클로닝 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 서브클로닝하였다. 오토사이클 키트(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)의 프로토콜 및 시약 및 ALFExpress 키트(ALFExpress kit; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 서열확인 장치로 이어진 결과를 사용하여 DNA를 서열확인하여 확인하였고, 그 결과는 AM 소프트웨어 v.3.2 키트(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로 분석하였다.

ELISA에 의한 항체 반응 측정.백신 접종 과정 동안 일정한 간격으로 바이러스 항원에 대한 마우스의 면역 반응을 측정하였다. 항원 에피토프를 함유하는 리포좀은 또한 상기한 바와 같이 항체/ELISA 분석을 위한 표적으로 사용하였다(Tuso et al., 1993, Transplantation 55:1375). 후자 분석의 결과는 결합 수준 및 항체의 개별형 구조를 측정하기 위해 사용하였다.

항원-유도된 T 세포 증식.항원-유도된 T 세포 증식을 사용하여 INFV 항원에 대한 숙주의 민감도를 측정하였다. 백신 접종한 마우스로부터 비장을 꺼내어, 그 비장을 멸균 플런저로 부드럽게 분쇄하고, 세포를 나일론 스크린 메쉬를 통과시켜 균등액을 제조하였다. 10% FCS, 10mM 헤페스(Hepes) 완충액, L-글루타민(2 mM), 페니실린(25 IU/ml), 스트렙토마이신(25 g/ml) 및 젠타마이신(80 g/ml)을 함유한 RPMI 1640 배지에 세포를 현탁시켰다. 이 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에서 gD(5-20 g/ml)을 가지거나 또는 가지지 않은 1 x 10⁶세포/ml의 농도로 5% CO₂중에서 3-4일 동안 배양하였다. 이 배양을 20ℓ의 레자주린 염료로 3시간 동안 펄스하고, 사이토플루어 II(Perspective Biosystems사제, Farmington, MA)에서 형광성을 측정하였다.

항-INFV CTL 반응.백신 접종 후, 비장 T 세포 중의 항원특이적 세포독성 T 림프구(CTL)가 존재하는지 평가하였다. 비장 림프구는 상기한 바와 같이 얻었다. 각각의 치료 그룹으로부터 림프구를 모은 후(n=5), 12-웰 배양 플레이트에서 10⁷세포/웰로 항원 없이 3일 동안 배양하였다. H2^d제한된 세포를 위해, P815 비반세포종 또는 L5178 림프종(H2^d) 표적 세포(ATTC)를 INFV NP CTL 에피토프(아미노산 147-158)에 대응하는 펩티드와 함께 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 표적들을 세척하고, 1 x 10⁴세포를 함유한 100㎕ 역가를 각 웰에 첨가하였다. 효과기 림프구를 세척하고, 다양한 농도로 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. CytoTox 96 키트(Promega, Madison WI)를 사용하여, 490nm에서 흡수를 기록함으로써, 표준 ELISA 플레이트 판독기(HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San Jose, CA)에서 측정된 상등액 락테이트 탈수소효소(LDH)로부터 퍼센트 특이적 용해를 계산하였다. HSV2-항원 특이적 용해는 표준 기준에 따라 결정하였다. 데이타는, 퍼센트 특이적 용해 = 100 x [(실험적-효과기 자발적-표적 자발적)/(표적 최대-표적 자발적)]으로 나타내었다.

실시예 V - 분류불가 H.인플루엔자(NTHi) 및 H.인플루엔자 타입 b(Hib)

NTHi 단백질의 클로닝.P6를 암호화하는 전장 유전자 서열은 P6 mRNA의 RT-PCR 증폭에 의해 NTHi의 가닥으로부터 얻었다(Deich et al., 1988, J.Bacterial. 170:489; Nelson et al., 1988, Inf.Immun. 56:128; Looman et al., 1987, EMBO J. 6:2489). 티탄 원 튜브 RT-PCR 시스템(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 시약 및 프로토콜을 사용하여 증폭시켰다. 요약하면, 박테리아를 0.2 mM dNTPs, 0.4 M 안티센스 프라이머 H-InvfP6AS(5'-GAGTCCGCTGCTCTACCAAC-3'(SEQ ID NO. 28)), 0.4 M 센스 프라이머, H-InvfP6S(5'-AATTTCCAGCTTGGTCTCCA-3'(SEQ ID NO. 29)), 5 mM DTT, 5U RNase 억제제, 1.5 mM MgCl₂, 및 AMV/팽창 고성능 효소의 존재 하에 하기 조건 하에서 배양하였다: 60℃에서 30분 동안 1회 반복; 94℃에서 2분 동안; 94℃에서 30초 동안, 55℃에서 30초 동안, 68℃에서 45초 동안 10회 반복; 매 주기마다 5초씩 증가시키면서 94℃에서 30초 동안, 55℃에서 30초 동안, 68℃에서 45초 동안 25회 반복; 그리고 나서, 68℃에서 7분 동안 1회 반복. 명백한 결과는 에티디움 브로마이드로 염색되고, 디지탈 이미지 시스템(BioRad, Gel Doc 2000)으로 촬영된, 1.0% NuSieve-아가로즈 겔(FMC Bioproducts, Rockland, ME) 내의 867bp의 가시적인 밴드에 근거한다. TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA) 시약 및 프로토콜을 사용하여 TA 2.1 벡터로 서열확인하기 위해 PCR 산물을 서브클로닝하였다. 표준 알칼리 용해법을 사용하여 소규모 플라스미드를 제조하였다(Maniatis, 1989Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, p.125). 오토사이클 키트(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)의 프로토콜 및 시약 및 ALFExpress 키트(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 서열확인 장치로 이어진 결과를 사용하여 통상의 디데옥시 종결방법에 의해 PCR 산물 삽입체를 서열확인하고, 그 결과는 AlfWin 서열 분석 소프트웨어 v.2.0(Amersham Pharmacia Biotech, Pisxataway, NJ)으로 분석하였다.

NTHi(P6)-HD의 제조.일단 P6를 암호화하는 유전자를 얻으면, NTHi(P6)-HD를 암호화하는 합성 유전자는 합성, 보합결합, PCR, 및 중복 올리고뉴클레오티드의 연결에 의해 조립된다. 글리신 및 세린으로 이루어진 결합기를 통해 HD 단편을 단백질의 N- 또는 C-말단에 첨가하였다. 이로써, 항원에 대한 HD의 상대적 위치가 면역계에 의한 처리에 대해 가지는 효과를 실험하였다. NTHi(P6)-HD 단편을 암호화하는 조립된 전장 유전자를 PCR로 증폭시키고, 발현 플라스미드속에 연결하였다. 최종 유전자는 DNA를 서열확인하여 확인하였다.

플라스미드를 함유하는 NTHi(P6)-HD를 대장균으로 형질전환시켰다.박테리아를 암피실린(50 g/ml)을 첨가한 LB배지에서 37℃에서 중간-로그상까지 배양시켰다. 이 때, IPTG를 첨가하여 trp/lac 잡종 프로모터를 유도하였다. 매시간 점들을 조사하여 NTHi(P6)-HD 단백질의 최적 유도 후 발현을 결정하였다. 최적 발현의 시점에서, 원심분리하여 세포들을 수집하였다. 세포 펠렛을 용균 및 원심분리하였다. 단백질이 존재하는지 용균물 및 세포펠렛을 분석하였다. 1-2% 나트륨 데옥시콜레이트 용액을 사용하여 용균된 세포 펠렛으로부터 NTHi(P6)-HD 단백질을 추출하였다. 고체 지지체에 결합된 니켈에 대한 선택적 친화력으로 NTHi(P6)-HD를 정제하였다. 필요시, 크기 배제, 이온 교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하여 HIV-HD를 더 정제할 수 있다.

리포좀 제조.안정한 NTHi(P6)-HD 리포좀을 제조하기 위한 통상의 세가지 접근법이 있다. 첫번째로, 리포좀을 제제화하여 단백질 및 지질을 유기 용매(클로로포름/메탄올)에 함께 용해시키고, 박막으로 건조하였다. 수성 완충액에 재현탁시켜서, 지질 및 단백질을 큰 이층 구조로 조립하였다. 그리고 나서, 현탁액을 초음파 처리하여 작은 단일박막 소낭(SUV)을 만들었다. 더 작은 단백질 구조에서 이 방법이 잘 수행된다. 그러나, 이 실험에서 단백질은 거친 용매 조건에 노출시키는 것이 바람직하지 않은데, 그 이유는 단백질이 변성될 수 있기 때문이다. 따라서, 바람직하지 못한 형태의 변화를 피하기 위해, 재현탁 완충액에 NTHi(P6)-HD를 용해시킨 후, 지질막을 수화시키는 것을 포함하는 두번째 방법을 사용할 수 있다. 지질로 수화시킴에 따라, 단백질은 자발적으로 새로 형성된 막과 결합되고, 초음파 처리 동안 SUV의 이중층에 결합된다. 세번째 방법은 NTHi(P6)-HD 단백질 없이 리포좀을 제조한 후, 이미 형성된 SUV에 그것을 첨가하고, HD가 지질 이중층에 통합되도록 방치하는 것을 포함한다. 상기 방법에 따라 탐침 초음파 처리하여 리포좀을 제조하였다(Fujii et al., 1997, Biochemistry 36:4959). 요약하면, (단백질을 가지거나 가지지 않는)지질을 클로로포름/메탄올과 같은 유기 용매에 용해시켰다. 지질 용액의 분액을 피펫으로 둥근 바닥 유리 튜브에 옮기고, 질소 기류 하에 65℃에서 용매를 증발시켜 지질 박막을 만들었다. 이 막을 8시간 이상 진공하에 위치시켜, 잔류 유기 용매를 제거하였다. 이와 달리, 스프레이 건조와 같은 기술을 사용하여 바람직한 조성의 지질 분말을 제조하여, 지질막 대신 사용할 수 있다. 완충액 중의 지질막 또는 분말을 수화시키고, 65℃에서 5-10분 동안 배양한 후 탐침 초음파 처리하여 리포좀을 제조하였다. 그리고 나서, 리포좀을 0.22 m 여과기로 여과하여 제제를 멸균하였다. 동력 빛 산란에 의해 리포좀을 크기대로 분류한 후 4주 이상 동안 집합체를 형성하였다. NTHi(6)-HD 단백질의 형태를 보존할 필요가 있을 수 있다. 따라서, 리포좀을 제조하는데 사용할 수 있는 세가지 접근법 중에서, 수화 용액의 성분으로서 단백질을 첨가하거나 이미 형성된 후에 리포좀에 첨가하는 것이 바람직할 수 있다고 예상된다.

박테리아 균주.NTHi 균주 9333(척추 유체 분리체), 35056(상부 호흡 감염 분리체), 43095(중이염 분리체), 49766(폐종양 분리체, 항미생물 민감성 실험 참조)(ATTC) 및 Hib 균주 51654(ATCC)는 박테리아 감염 모델에서 효능을 입증하는데 사용하였다. 사용하기에 앞서, 유기체의 동결물을 NAD(2 g/ml) 및 헴(10 g/ml)이 보충된 신선한 뇌 심장 주입 배지(Brain Heart Infusion broth)에서 2차 배양하고, 10% 이산화탄소와 함께 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 480 nm에서의 혼탁도 대 단위를 형성하는 군락으로 이루어진 각 유기체에 대한 표준 곡선을 사용하여 살균분석 또는 내복막 면역성 검사 투여에 필요한 박테리아의 접종물을 조절하였다.

백신 접종 방법 및 박테리아 항원에 대한 면역 반응의 유도 실험.어린 래트 그룹(그룹 당 n=6)을 출생 5, 12, 19, 및 26일 또는 5 및 26일 후에 실험 백신 제제 또는 완충액으로 면역시켰다. 리포좀 백신을 피하주사하여 래트를 계통 백신 접종하였다. 동물을 비강내 경로를 통하여 백신으로 면역시킨 경우, 동물들을 메토판으로 마취시키고, 마이크로피펫 상의 멸균 선단을 사용하여 실험물(20ℓ)을 투여하였다(Gallichan et al., 1993, J.Inf. Dis. 168:622). 어린 래트를 이들의 유모와 함께 우리에 가두고, 예방 접종 부위에서의 과립구 형성, 붉어짐 또는 가피와 같은 백신 접종 과정에 대한 부작용을 관찰하였다. 최종 백신 접종하고 일주일 후에, 어린 래트를 할로테인으로 마취시키고, 심장에 구멍을 내어 혈액을 수집하고, 점막 분비물을 수집하기 위해 점막 통로를 식염수로 세척하였다. 그 동물을 이산화탄소로 안락사시켰다. 혈청 및 점막 유체의 살균성 항체 역가는 다음과 같이 측정하였다.

내복막 면역성 검사 연구를 위해, 어린 래트(26일 됨)를 박테리아로 면역성 검사하고, 그 혈액 및 CSF를 백신 접종하지 않은 래트와 비교하여 박테리아 부담을 관찰하였다. 면역성 검사하고 2일 후에 박테리아에 대한 혈액 및 CSF를 샘플링하였더니 동물 안에 상당한 박테리아 부담이 있었다(즉, 1 x 10⁴CFU/혈액ml; 1 x 10⁴CFU/CSFml). 높은 역가의 살균성 항체를 함유하는 백신 접종한 26일 된 어린 래트로부터의 혈청을 6일 된 래트에 정맥투여하였다. 다음날, 어린 래트(n=10)에 하기한 바와 같이 NTHi를 내복막 투여하였다. 그리고 나서, 어린 래트를 사망률에 대해 관찰하고, 생존체는 26일 후에 안락사시키고, NTHi의 존재 여부를 확인하기 위해 혈액 및 CSF를 수집 및 배양하였다.

NTHi로 내복막 면역성 검사.생체내로 통과된 NTHi의 24시간 된 배양액을 5 x 10⁷-5 x 10⁹CFU/ml으로 조절하고, 이 배양액 100 ㎕를 5-10일 된 래트에 내복막 주사하였다(Smith et al., 1973, Inf. Immun. 8:273). 접종한 후에 면역성 검사한 어린 래트를 유모와 함께 두었다. 면역성 검사한 후 18-96 시간 내에, 어린 래트의 90% 이상이 통과된 박테리아의 이러한 투여로 죽었다.

ELISA에 의한 항원 특이적 항체 반응의 측정.각 래트로부터의 혈청 및 점막 시료를 P6 항원에 특이적인 IgG 및 IgA 항체에 대해 실험하였다. 실온에서 밤새 배양하기 위해 클로닝된 본래 P6 또는 NTHi(P6)-HD 단백질을 적당히 처리된 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 pH 9.6의 중탄산염 완충액 중의 1% 우태아 혈청 알부민으로 차단하였다. 그리고 나서, 플레이트를 0.05% 트윈 20/PBS로 세정하였다. 각 혈청 및 점막 시료의 희석액을 항원-피복된 플레이트에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 배양하고, 배양 마지막에 트윈/PBS 완충액으로 세정하였다. 래트 IgG 또는 IgA에 특이적인 모노클로날 항체에 연결된 알칼리성 포스파타아제를 37℃에서 1시간 동안 첨가하였다. 그리고 나서, 웰을 트윈/PBS 완충액으로 세정하고, pH 9.5의 디에탄올아민 완충액 중의 PNPP 기질을 웰에 첨가하여 비색 반응을 개시하였다. 0.75N 수산화나트륨을 사용하여 반응을중지시키고, 스펙트라맥스 ELISA 플레이트 판독기(Spectramax ELISA plate reader)에서 405 nm에서 판독한다. 96 웰 플레이트 상에 피복된 공지된 농도의 래트 IgG 및 IgA의 대조구 시료로부터 얻은 표준 곡선으로부터 래트 IgG 및 IgA 농도를 계산하고, 상기한 바와 같이 처리하였다.

살균성 항체 분석.살균성 항체의 존재 여부에 대해 실험할 혈청 시료를 56℃에서 30분 동안 배양하여 보체를 불활성화시켰다. 그리고 나서, 실험 혈청을 연속적으로 포스페이트 완충 염수(PBS)에 희석시켰다. 24시간 박테리아 배양액을 소의 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 0.15 mM CaCl₂및 1 mM MgCl₂이 첨가된 PBS로 이루어진 멸균된 PCM 완충액에서 5x10⁴CFU/ml로 조절하였다. 백신 접종하지 않은 어린 래트의 혈청을 보체원으로 사용하였다. 그 혈청을 모아서, 분취하고, 사용할 때까지 -70℃에서 저장하였다. 박테리아(20ℓ), 연속적으로 희석된 혈청(20ℓ), 보체(20ℓ) 및 40ℓ의 PCM 완충액 중의 1% BSA를 96-웰 집단 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 초기 박테리아 농도를 결정하기 위해, 시료 혼합물의 10ℓ 분액을 영양물 세균 배양기를 포함하는 신선한 BHI 세균 배양기 플레이트 상에 일시에 도말하고, NAD 및 헴으로 보충하였다. 37℃에서 10% 이산화탄소를 가진 반응 혼합물을 1시간 동안 흔들면서 배양한 후, 각 웰로부터 10ℓ를 이중으로 도말하고, 10% 이산화탄소 존재 하에 37℃에서 밤새 배양하여 CFU/웰을 측정하였다. 대조구는 보체 단독으로는 박테리아를 죽이지 않는다는 것을 확인하기 위해 혈청이 없는 웰과 실험 혈청을 가지지만 실험 시료 안의 혈청 보체가 성공적으로 불활성화되었다는 것을 확인하기 위해 보체를 가지지 않은 웰을 포함한다. 모든 분석은 3회 수행하였고, 박테리아 중 50%를 사멸시키는 희석액은 상이한 혈청 사이의 활성을 비교하기 위해 사용하였다.

실시예 VI - C형 간염 바이러스

CHO 세포 중의 HCV(E2/NS1)-HD 및 HCV(E2/NS1△HVR1)-HD의 제조.HCV E2/NS1 단백질의 뉴클레오티드 서열을 하기와 같이 얻은 HCV 가닥의 PCR 증폭으로부터 유도하였다. E2/NS1 유전자 CAAACCATGATCGCCCACGGA의 첫번째 21-bp에 대응하는 5' 프라이머 및 잔기 622 내지 628, GAAGTTGACAGTGCAGGGGTA에 대응하는 3' 프라이머를 사용하여 막횡단 도메인을 제거하였다(Cocquerel, L. et al., 1998, J.Virol. 72(3):2183-91). 또한, 각 프라이머를 편리한 제한 부위 측면에 위치시켰다. PCR 생성물은 유전자 카세트 플라스미드로서 HD 도메인을 함유하는 pcDNA3.1His속에 연결시켰다(Invitrogen.Inc.,San Diego,CA). 잔기 384 내지 잔기 410의 첫번째 27 아미노산에 대응하는 E2/NS1 유전자의 HVR1을 삭제하여 HCV(E2/NS1△HVR1)-HD를 구성하였다. 5' 프라이머 CAACTCATCAACACCAATGGC 및 야생형 대조구로 사용되는 동일한 3' 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켜 유전자 결여 돌연변이를 만들었다. 최종 유전자는 DNA를 서열확인하여 확인하였다. 제조자가 추천한 프로토콜에 의해 리포펙션 시약(Lipofectamine, Gibco/BRL Gaitherberg, MD)을 사용하여 플라스미드를 CHO 세포속으로 유전자도입하였다(Deen, K.C.et al., 1988, Nature 331:82)(ATCC, Rockville, MD). G418(Gibco/BRL, Gaithersberg, MD)을 사용하여 안정한 유전자 도입체를 선택하고, 제한 희석액으로 클로닝하였다. 높은 수준의 단백질을 생산하는 클론은 웨스텐 블롯 분석으로 확인하였다. HCV(E2/NS1)-HD 및 HCV(E2/NS1△HVR1)-HD 단백질은 고체 지지체에 결합된 니켈에 대한 선택적 친화력으로 정제하였다. 정제가 완료된 후 엔테로키나아제 분할에 의해 히스티딘 결합기를 제거하였다. 필요시, 크기 배제, 이온 교환, 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하여 HCV(E2/NS1)-HD 및 HCV(E2/NS1△HVR1)-HD 단백질을 더 정제한다.

대장균에서 HCV(HVR1)-HD 및 HCV(C)-HD 단백질의 제조.대장균 코돈 선호도를 이용하여 단백질 서열로부터 선택된 에피토프의 뉴클레오티드 서열을 유도하였다(Looman et al., 1987, EMBO J. 6:2489). 유전자 카세트로 삽입할 항원 서열(들)은NP(147-161, TYQRTRALVRTGMDP;55-69, RLIQNSLTIERMVLS) 및 HA(91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASL)로부터의 에피토프에 대응한다. 일단 적당한 서열(들)이 얻어지면, 편리한 제한 부위의 측면에 위치하는 HCV-HD를 암호화하는 합성 유전자를 합성, 보합결합, 및 중복 올리고뉴클레오티드의 연결에 의해 조립한다. 요약하면, 65℃로 가열하고, 실온으로 돌아옴에 따라 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 단편들을 조립하였다. 얼음 위에서 2분 동안 배양시킨 다음, 단편들을 DNA 리가아제로 연결시켰다. HCV 단편을 암호화하는 조립된 전장 유전자를 PCR을 사용하여 증폭시키고, 제한 효소로 절단하고, 겔 전기영동으로 분리하였다. 그리고 나서, HCV 유전자를 HD 유전자(예를 들어, pTrcHis, 또는 pQE30)를 함유하는 유사하게 절단된 발현 플라스미드속에 연결시켰다. 최종 유전자는 DNA를 서열확인하여 확인하였다.

플라스미드를 함유하는 HCV-HD는 대장균 속으로 형질전환시켰다. 박테리아를 암피실린(50 g/ml)을 첨가한 LB배지에서 37℃에서 중간-로그상까지 배양시켰다. 이 때, IPTG를 첨가하여 trp/lac 잡종 프로모터를 유도하였다. 매시간 점들을 조사하여 HIV-HD 단백질의 최적 유도 후 발현을 결정하였다. 최적 발현의 시점에서, 원심분리하여 세포들을 수집하였다. 세포 펠렛을 용균 및 원심분리하였다. 단백질이 존재하는지 용균물을 분석하였다. 고체 지지체에 결합된 니켈에 대한 선택적 친화력으로 HIV-HD 단백질을 정제하였다. 정제를 완료한 후, 엔테로키나아제 분해하여 히스티딘 결합기는 제거하였다. 필요시, 크기 배제, 이온 교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하여 HIV-HD를 더 정제할 수 있다.

리포좀 제조 및 백신 접종 방법, 면역 반응 유도 시험, ELISA 항체 반응 측정, DTH 분석, 사이토카인 특이적 mRNA 분석, ELISA 사이토카인 측정, 항원-유도 T 세포 증식, 및 항-HIV CTL 반응은 본질적으로 상기 실시예 III에 기재된 바와 같다.

Claims

소낭-형성 지질; 및

하나 이상의 항원결정기, 및 리포좀 조성물의 막과 결합되는 소수성 도메인을 포함하는 항원 구조체를 포함하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물이,

하나 이상의 보강제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 항원 구조체가 화학적으로 합성되는 것을 특징으로 하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 소수성 도메인이 펩티드인 것을 특징으로 하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 4항에 있어서,

상기 소수성 도메인이 약 15 내지 약 500 아미노산 잔기로 이루어지는 것을특징으로 하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 5항에 있어서,

상기 소수성 도메인이 Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 항원결정기가 HSV gB 또는 gD, HIV gp120, CMV gB, HCV E2, INFV HA 또는 NA, 및 H.인플루엔자 P6으로 구성된 그룹에서 선택된 항원으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 항원 구조체가 항원결정기와 소수성 도메인을 연결하는 연결부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 8항에 있어서,

상기 연결부가 펩티드인 것을 특징으로 하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 9항에 있어서,

상기 연결부가 1 내지 약 200 아미노산 잔기로 구성되는 것을 특징으로 하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 10항에 있어서,

상기 아미노산 잔기가 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 항원 구조체가 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 9항에 있어서,

상기 항원 구조체가 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 면역원성 리포좀 조성물.
제 1항의 조성물을 면역원적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 숙주동물에서 면역원성 반응을 유도하는 방법.
제 2항의 조성물을 면역원적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 숙주동물에서 면역원성 반응을 유도하는 방법.
제 14항에 있어서,

상기 숙주동물이 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서,

상기 포유류가 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,

상기 동물이 조류인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17항에 있어서,

상기 항원결정기가 HSV gB 또는 gD, HIV gp120, CMV gB, HCV E2, INFV HA 또는 NA, 및 H.인플루엔자 P6으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
유효량의 제 1항의 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신 조성물.
제 20항에 있어서, 상기 조성물이,

하나 이상의 보강제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
소수성 단백질 도메인 및 하나 이상의 항원결정기를 포함하는 면역원성 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는, 발현 벡터에 삽입하기 위한 DNA 카세트.
제 22항에 있어서,

상기 항원결정기가 HSV gB 또는 gD, HIV gp120, CMV gB, HCV E2, INFV HA 또는 NA, 및 H.인플루엔자 P6으로 구성된 그룹에서 선택된 항원으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 DNA 카세트.
제 22항에 있어서,

상기 소수성 도메인이 약 15 내지 약 500 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드인 것을 특징으로 하는 DNA 카세트.
제 24항에 있어서,

상기 펩티드가 Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 카세트.
제 22항에 있어서,

상기 융합 단백질이 항원결정기와 소수성 도메인을 연결하는 연결부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 카세트.
제 26항에 있어서,

상기 연결부가 1 내지 약 200 아미노산 잔기로 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA 카세트.
제 27항에 있어서,

상기 아미노산 잔기가 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 카세트.
제 22항의 DNA 카세트를 포함하는 벡터.
항원결정기 및 소수성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키는 단계;

소낭-형성 지질 및 융합 단백질을 적당한 유기용매에 용해시키는 단계;

유기용매를 증발시켜 지질막 또는 스프레이 건조된 분말을 형성하는 단계;

지질막 또는 분말을 수화하는 단계; 및

수화된 지질막 또는 분말을 분산시켜 면역원성 리포좀 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 면역원성 리포좀 조성물의 제조방법.
항원결정기 및 소수성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키는 단계;

융합 단백질을 수성 완충액에 용해시키는 단계;

융합 단백질을 함유하는 완충액으로 지질 분말 또는 지질막을 수화하는 단계; 및

지질 분말 또는 막을 분산시켜 면역원성 리포좀 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 면역원성 리포좀 조성물의 제조방법.
항원결정기 및 소수성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하는 단계;

융합 단백질을 수성 완충액에 용해시키는 단계; 및

융합 단백질을 미리 형성된 리포좀에 첨가하여 면역원성 리포좀 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 면역원성 리포좀 조성물의 제조방법.
하나 이상의 항원결정기 및 소수성 도메인을 포함하는 항원 구조체; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
제 33항에 있어서,

상기 항원 구조체가 항원결정기와 소수성 도메인을 연결하는 연결부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 33항에 있어서, 상기 조성물이,

하나 이상의 보강제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
소낭-형성 지질; 및

하나 이상의 항원결정기 및 소수성 도메인을 포함하는 항원 구조체를 포함하는 면역원성 에멀젼 조성물.
제 36항에 있어서,

상기 항원 구조체가 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.