JP2002526436A

JP2002526436A - 免疫原性リポソーム組成物

Info

Publication number: JP2002526436A
Application number: JP2000573707A
Authority: JP
Inventors: フジイ、ゲーリー; ブィ．クラマー、ドナルド; エイ．アーンスト、ウィリアム; アドラー−ムーア、ジル; ペリー、エル．ジーン
Original assignee: モレキュラーエキスプレスインコーポレイテッド
Priority date: 1998-09-22
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2002-08-20
Also published as: AP2001002096A0; ATE468108T1; KR20010075261A; EA200100269A1; IL141675A; AU6035199A; SK3222001A3; UA75327C2; EP1115382A2; SK287670B6; AP2010A; CA2344173A1; BG65675B1; DE69942393D1; NO330685B1; KR100592825B1; EP1115382B1; AU766772B2; CA2344173C; NZ510442A

Abstract

(57)【要約】本発明は、小胞形成脂質と、１つ以上の抗原決定基および疎水性ドメインを含む抗原構成物とを含む免疫原性リポソーム組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

（発明の背景）ワクチンの使用により、歴史的に多くの人々を広範な種類の感染病から安全か
つ効果的に予防する方法が提供されてきた。ウィルスや他の微生物に対抗する免
疫化は一般に安全かつ効果的であり、先進国の人々の長寿化に多大なる役割を果
たしてきた。しかしながら、ワクチンの性質や特殊な免疫原によっては多数の有
害な副作用が起こることもある。過去には無傷のウィルスを十分に不活化しなか
ったために、ワクチン接種後の防御の代わりに不本意な感染が起こっていた（タ
イガート（Ｔｉｇｅｒｔｔ）、１９５９年、ＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄ．第１
２４巻３４２頁）。時には、インフルエンザなどの無傷の生物体による免疫化が
、ギラン−バレー症候群などの、正常な組織に対する自己免疫疾患の発症を早め
ることもある（ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）ら、１９８４年、Ｊ．Ｅｐ
ｉｄｅｍｉｏｌ．第１１９巻８４１頁）。薬剤そのものに加えて、細胞または
複合培地中の物質の存在によって、外来タンパク質に対する重度のアレルギー反
応が引き起こされることもある（ヤマネ（Ｙａｍａｎｅ）とウエムラ（Ｕｅｍｕ
ｒａ）、１９８８年、Ｅｐｉｄｅｍ，Ｉｎｆ．第１００巻２９１頁）。有効
なワクチン接種処置はしばしば多数回の免疫化を必要とするため、こうした不都
合な事象がワクチンの有効性を低下させたり、ワクチン接種処置を公衆に受け入
れられにくくしている可能性がある。近頃、新しいワクチン調製物の安全性およ
び有効性を高めるための試みにおいて、現代の分子生物学的技術が試されている
。現在研究中の戦略としては、組換えＤＮＡ技術に基づくワクチン（コンリー（
Ｃｏｎｒｙ）ら、１９９４年、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．第５４巻１１６４頁、
ヒュ（Ｈｕ）ら、１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６２巻１７６頁）、抗原
としての単純な合成ペプチドの作成（ナーデリ（Ｎａｒｄｅｌｌｉ）ら、１９９
２年、Ｖａｃｃｉｎｅｓ第８巻１４０５頁、ワタリ（Ｗａｔａｒｉ）ら、１９
８７年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１６５巻４５９頁）、および、防御反応
を刺激するための遺伝物質の直接注射（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ）ら、１９９３年
、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２５９巻１７４５頁）が含まれる。特に、特定の免疫化反
応を誘導するための単純なペプチド抗原の使用が多くの研究の焦点となってきた
。この戦略は、免疫学的特異性を与えると共に、製造工程の厳密な制御を可能に
し、免疫原の製造に伴う物質または混入物の二次供給源の殆どを無くすという潜
在性を有していることから、魅力あるものである。

【０００１】しかしながら、ワクチン接種のための精製タンパク質またはペプチド断片の使
用は、有効な抗原担体による免疫化部位への物質の送達によって左右される。こ
れまでの潜在的に最も安全な担体の１つに、脂質／リポソームをベースとしたワ
クチン複合体がある。リポソームは、薬物の毒性を低減し、血流中の循環時間を
延ばし、薬物分子の体内分布と薬物動態を変えることができることから、実用的
技術として長きにわたって確立されてきた（フジイ（Ｆｕｊｉｉ）、１９９６年
、Ｖｅｓｉｃｌｅｓ、Ｍ．ロゾフ（Ｒｏｓｏｆｆ）編、マーセル・デッカー、ニ
ューヨーク州、ニューヨーク、４９１頁）。リポソームはｉｎｖｉｖｏで投与
される場合、血液中を循環し、特に肝臓、脾臓、リンパ節、および肺組織内の単
球／マクロファージ食細胞系によって除去される（クラーセン（Ｃｌａａｓｅｎ
）、Ｖｅｓｉｃｌｅｓ、１９９６年、Ｍ．ロゾフ（Ｒｏｓｏｆｆ）編、マーセル
・デッカー（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ）、ニューヨークＮＹ、６４９頁）
。リポソームが抗原性分布パターンを指示する能力を有することは、リポソーム
免疫原が免疫系に最大限に暴露されることを示唆するものである。今日までに、
脂質に結合されたペプチド（ナーデリ（Ｎａｒｄｅｌｌｉ）ら、１９９２年、Ｖ
ａｃｃｉｎｅｓ第８巻１４０５頁、ワタリ（Ｗａｔａｒｉ）ら、１９８７年、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１６５巻４５９頁）、脂質存在下における全タン
パク質サブユニットの再構成（モーリン（Ｍｏｒｅｉｎ）とシモンズ（Ｓｉｍｏ
ｎｓ）、１９８５年、Ｖａｃｃｉｎｅｓ第４巻１６６頁、グレゴリアディス（
Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）、１９９５年、Ｔｉｂｔｅｃｈ第１３巻５２７頁）
、予め形成しておいたリポソームとタンパク質との会合（ゼリーン（Ｔｈｅｒｉ
ｅｎ）とシャーム（Ｓｈａｈｕｍ）、１９８９年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ
．第２２巻２５３頁、アルビン（Ａｌｖｉｎ）ら、１９８５年、Ｖａｃｃｉｎ
ｅｓ第４巻１６６頁）を含む、いくつかの脂質をベースとした系が試験されて
いる。これらの戦略は免疫学的に有効であることが示されているが、タンパク質
とその脂質担体の大量生産に関連する技術的難しさならびにコスト面での制約が
、実用的技術としての魅力を低下させている。したがって、ワクチン開発におい
てリポソームによって与えられる可能性を利用するために、タンパク質抗原を調
製するための改良された系または方法が必要とされている。（発明の要約）本発明は、小胞形成脂質と、１つ以上の抗原決定基および疎水性ドメインを含
む抗原構成物とを備えた、免疫原性リポソーム組成物を提供する。好ましくは、
疎水性ドメインはリポソーム組成物の膜に結合している。好ましくは、疎水性ド
メインはペプチドであり、好ましい実施形態によれば、疎水性ドメインは約１５
個から５００個のアミノ酸残基から成り、より好ましくは約３００個未満、最も
好ましくは約５０個未満のアミノ酸残基から成り、同アミノ酸残基のうちの少な
くとも１個以上は、Ａｌａ，Ａｓｎ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ
，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶ
ａｌからなる群より選択される。

【０００２】本発明の１つの実施形態によれば、免疫原性リポソーム組成物は、１つ以上の
アジュバントをさらに含む。適切なアジュバントの例としては、脂質Ａなどの親
油性分子や他のリポ多糖、ＱｕｉｌＡ，ＱＳ２１，ＭＦ５９，Ｐ₃ＣＳＳ，ＭＴ
Ｐ−ＰＥ、ならびにＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−１２、インターフェロンなどの
サイトカインを含む水溶性分子が含まれる。サイトカインの他の例については下
記の表１に示す。

【０００３】本発明の他の実施形態によれば、抗原構成物は、抗原決定基を疎水性ドメイン
に連結するリンカー領域をさらに含んでいる。好ましい実施形態において、リン
カー領域は、約１個から約２００個のアミノ酸残基から成るペプチドである。好
ましくは、アミノ酸残基は、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｃｙｓ，Ｇｌｕ
，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ
，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒおよび／またはＶａｌなどの天然に存在する
アミノ酸である。

【０００４】本発明はさらに、宿主動物中に免疫原性反応を誘導する方法であって、免疫原
として有効な量の上記リポソーム組成物を投与することを含む方法も提供する。
宿主は家禽を含むいかなる動物であってもよいが、好ましくは、宿主動物は哺乳
動物、より好ましくはヒトである。ある好ましい実施形態において、免疫原性リ
ポソーム組成物は、１つ以上の適切なアジュバントをさらに含む。

【０００５】本発明はさらに、免疫原性融合タンパク質をコードする配列を含むベクター挿
入用ＤＮＡカセットであって、該融合タンパク質は疎水性タンパク質ドメインと
１つ以上の抗原決定基とを含むＤＮＡカセットを提供する。

【０００６】本発明はまた、免疫原性リポソーム組成物の製造方法であって、抗原決定基と
疎水性ドメインとを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させることと
、脂質および融合タンパク質を適切な有機溶媒または有機溶媒混合物に溶解する
ことと、有機溶媒を蒸発させることによって脂質フィルムを形成することと、脂
質フィルムを水和させることと、水和した脂質フィルムを分散させて免疫原性リ
ポソーム組成物を形成することとを含む方法を提供する。

【０００７】本発明はさらに、免疫原性リポソーム組成物の製造方法であって、抗原決定基
と疎水性ドメインとを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させること
と、融合タンパク質を水性緩衝液中に溶解することと、脂質粉末または脂質フィ
ルムのいずれかを融合タンパク質を含む緩衝液に水和させることと、脂質粉末ま
たは膜を分散させて免疫原性リポソーム組成物を形成することとを含む方法を提
供する。

【０００８】他の実施形態において、本発明は、免疫原性リポソーム組成物の製造方法であ
って、抗原決定基と疎水性ドメインとを含む融合タンパク質をコードする遺伝子
を発現させることと、融合タンパク質を水性緩衝液に溶解することと、融合タン
パク質を予め形成しておいたリポソームに加えて免疫原性リポソーム組成物を形
成することとを含む方法を提供する。

【０００９】他の実施形態において、本発明は、免疫原性脂質エマルション組成物の製造方
法であって、抗原決定基と疎水性ドメインとを含む融合タンパク質をコードする
遺伝子を発現させることと、リポソームの代わりに、脂質分散（たとえば大豆油
などの油の）を利用した上述の任意の方法によって免疫原性脂質エマルション組
成物を調製することとを含む方法を提供する。

【００１０】さらに別の実施形態において、本発明は、免疫原性リポソームまたは脂質エマ
ルジョン組成物の製造方法であって、抗原決定基と疎水性ドメインとを含む融合
タンパク質を化学的に合成することと、上述の任意の方法によって免疫原性リポ
ソームまたは脂質エマルション組成物を調製することとを含む方法を提供する。

【００１１】本明細書中で用いる「膜に結合した」という表現は、疎水性ドメインが少なく
とも部分的にリポソーム膜内に埋め込まれていて、好ましくは小胞形成脂質に共
有結合されていないことを意味する。疎水性ドメインは、それ自体が膜に埋め込
まれている脂質脂肪酸「尾部」に結合されていてもよい。（発明の詳細な説明）本発明は、種々の微生物病原体およびガンに対する免疫化の有効性および安全
性を高めるように設計された抗原送達システムを提供する。免疫原は、特異的抗
原配列に融合された疎水性ドメイン（ＨＤ）から構成される遺伝子カセットによ
ってコードすることができる。ＨＤと抗原性エピトープとをコードする核酸配列
を含むプラスミドを調製し、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シロイヌナズ
ナ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞、ＣＯＳ−１細胞またはＣＨＯ細胞な
どの適切な宿主中で発現させる（遺伝子工学ニュース（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇＮｅｗｓ）、第１８巻１７頁（１９９８年））。タンパク質
を発現させて精製したところで、該タンパク質をリポソーム中に調合する。膜の
存在下において、該タンパク質は、その疎水性部分が膜に結合し抗原性エピトー
プが水性溶媒に配向した状態で、脂質二重膜に結合して安定な構造物を形成する
。プラスミドは、異なる抗原性エピトープを容易に置換し、これにより異なる抗
原性エピトープを利用可能にして免疫化後の最大限の防御を与えるように、問題
となる位置における制限部位を用いて構築することができる。本発明のカセット
に固有の特徴の１つに、タンパク質成分が宿主細胞内で大量に産生されると共に
、容易に精製され、リポソームに組み込まれるということがある。これにより、
ワクチンの大量調製および商品流通という究極の目的を維持しつつ、微生物病原
体またはガンからの防御を促進する最も適切なエピトープを決定するための柔軟
性が最大限に与えられる。

【００１２】したがって、本発明はいくつかの利点を提供する。すなわち、（１）エピトー
プを容易に変えることができ、ワクチン設計に最大限の柔軟性が与えられる。（
２）担体分子中に複数のエピトープを挿入することができる。（３）所望により
大きい抗原配列（すなわちエンベロープタンパク質または受容体ドメイン）また
はサブユニットを含めることができる。（４）発現された担体タンパク質は水溶
性であり、標準的なタンパク質調製方法によって容易に精製することができる。
抗原構成物を水溶性融合タンパク質として合成することにより、タンパク質の疎
水性領域に起因する大量生産における潜在的問題を最小限に抑えることができる
。したがって、リポソーム膜への挿入のための疎水性ドメインを有しながらも水
溶性であるタンパク質を構築することが、主要な利点となると考えられる。状況
によっては、グアニジン、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、オクチルグルコシド
、またはデオキシコール酸などの可溶化剤を少量だけ精製過程で使用してもよい
。本発明は２つ以上の抗原を含む構成物も提供する。そのような構成物は下記の
ように表すことができる。

【００１３】Ｈ₂Ｎ−抗原部位１−ＨＤ−抗原部位２−ＣＯＯＨ本発明はまた、天然由来または合成の単膜貫通ヘリックスまたはヘリックス束
（２−１２）を使用することも包含する。抗原部位は、Ｎ末端またはＣ末端のい
ずれに位置していてもよいし、あるいは束の個々の鎖の間に形成されたループ間
に位置していてもよい。

【００１４】本明細書中で用いる「抗原」という用語は、宿主動物に対して外来性のもので
ある場合に、宿主動物の組織への接近が増すと、マクロファージ、抗原提示細胞
および抗原特異的抗体の形成を刺激して、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒ
ｏにおいてそのような抗体と特異的に反応する任意の物質（タンパク質またはタ
ンパク質−多糖、リポ多糖、微生物サブユニット、全病原体、もしくは癌マーカ
を含む）のことを指す。さらに、抗原は、抗原および交差反応性抗原に対する受
容体を有するＴリンパ球（たとえば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞障害
性Ｔ細胞およびＴヘルパー細胞）の増殖および／または活性化を刺激し、リンパ
球と反応して、細胞性免疫と呼ばれる一連の反応を開始させることができる。本
発明の免疫原性組成物において、抗原は約０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ抗原−ＨＤの
量で存在することが好ましい。より好ましくは、抗原は約０．５〜５ｍｇ／ｍｌ
抗原−ＨＤの量で存在する。

【００１５】「抗原決定基」とは、抗原または抗原構成物のなかの免疫学的特異性を決定す
る部分のことである。一般に、抗原決定基またはハプテンは、天然に存在する抗
原においてはペプチド、タンパク質または多糖である。人工抗原の場合、アルサ
ニル酸誘導体などの低分子量物質であり得る。抗原決定基は、ｉｎｖｉｖｏま
たはｉｎｖｉｔｒｏにおいて、抗原型の抗原決定基（たとえば、免疫原性物質
と結合した抗原決定基）によって誘導された抗体またはＴリンパ球と特異的に反
応する。

【００１６】本発明を実施するにあたって使用されうる抗原決定基は、以下に示す抗原に由
来するものであり得るが、これらは例示にすぎない。

【００１７】

【表１】

【００１８】

【００１９】

【００２０】

【００２１】使用されうる抗原および病原体のさらなる例は、ミリッチ（Ｍｉｌｉｃｈ）、
１９８９年（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４５巻１９５頁）、ホシノ（Ｈｏ
ｓｈｉｎｏ）とカプラン（Ｋａｐｌａｎ）、１９９４年（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１８５巻１７９頁）、またはベ
ヌゴパル（Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ）とゴールド（Ｇｏｕｌｄ）、１９９４年（Ｖａ
ｃｃｉｎｅ第１２巻９６６頁）に記載されている。１つの実施形態によれば、
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）由来のｅｎｖ遺伝子のｇｐ１２０サブユニット
とｇａｇ遺伝子のｐ２７とが用いられる。他の実施形態においては、抗原決定基
は、ＨＳＶｇＤまたはｇＢ，ＨＩＶｇｐ１２０，ＣＭＶｇＢ，ＨＣＶＥ
２，ＩＮＦＶＨＡまたはＮＡ，Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＰ５またはＰ６，
線毛タンパク質、およびタンパク質Ｄから選択される抗原に由来するものであっ
てもよい。

【００２２】本明細書中で用いる「疎水性ドメイン（ＨＤ）」という用語は、５００ ²よ
り大きな表面積を有する疎水性の領域または構造を有する任意のタンパク質、ペ
プチド、脂質または分子を意味する。ＨＤの例としては、任意の膜貫通（ＴＭ）
セグメント（たとえば、グリコホリンＡ；トミタ（Ｔｏｍｉｔａ）とマーケイジ
（Ｍａｒｃｈｅｓｉ）、１９７５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ第７２巻２９６４頁）、チトクロームｂ₅の疎水性ドメイン（テ
イラー（Ｔａｙｌｏｒ）とローズマン（Ｒｏｓｅｍａｎ）、１９９５年、ＢＢＡ
第１２７８巻３５頁）、ジフテリア毒素のＴドメイン（チョー（Ｃｈｏｅ）ら
、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ第３５７巻２１６頁）、シュードモナス外毒素Ａ
のドメインＩＩ（アールレッド（Ａｌｌｕｒｅｄ）ら、１９８６年、ＰＮＡＳ
第８３巻１３２０頁）、ペニシリン感受性トランスデューサの４−ヘリックス束
（ハート（Ｈａｒｄｔ）ら、１９９７年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第
２３巻９３５頁）、バクテリオロドプシンの７−ヘリックス束（ヘンダーソン（
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）とアンウィン（Ｕｎｗｉｎ）、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ
第２５７巻２８頁）、ｌａｃパーミアーゼの１２−ヘリックス束（カバック（
Ｋａｂａｃｋ）ら、１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ
．第７巻５３７頁）、およびコリシンの孔形成ドメイン（パーカー（Ｐａｒｋ
ｅｒ）ら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ第３５７巻９３頁）が含まれる。

【００２３】本明細書中で用いる「ベクター」という用語は、プラスミド、コスミド、ファ
ージミドまたはバクテリオファージに由来するか、合成によって得られる核酸（
たとえばＤＮＡ）であって、その内部に核酸の断片を挿入またはクローン化でき
る核酸のことをいう。ベクターはこの目的のために１つ以上の固有の制限部位を
含むことができ、クローン化配列が再生されるように定義された宿主または生物
体の中で自律複製できるものであってもよい。ベクター分子は、容易に選択可能
か容易に検出される、明確に定義された表現型を宿主生物体に付与することがで
きる。ベクターのいくつかの成分は、転写、翻訳、ＲＮＡの安定性および複製の
ための調節因子を組み込んだＤＮＡ分子、および他のＤＮＡ配列であってもよい
。

【００２４】本明細書中で用いる「ＤＮＡカセット」という用語は、本明細書中に記載する
融合タンパク質を発現することのできるベクター内の遺伝子配列のことをいう。
核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写されることができ、必要に応
じて融合タンパク質産物に翻訳されることができるような位置および順序に配置
される。好ましくは、カセットはベクターにそのまま挿入できるようにされた３
’および５’末端を有し、たとえば各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有す
る。

【００２５】抗原構成物は組換え技術を用いて生産することが好ましいが、抗原構成物は当
該技術分野において周知の任意の手段、たとえば化学的手段などによって合成す
ることができることが理解される。この手段は非ペプチドリンカーが用いられる
場合、あるいは疎水性ドメインが非天然由来アミノ酸残基または類似体からなる
場合には特に有用である。したがって、好ましい実施形態は抗原性融合タンパク
質を生産するために組換え技術を用いるが、本発明はまた、化学合成手段か、組
換え手段と化学合成手段との組み合わせかによって抗原構成物を調製することと
、上述のように免疫原性脂質製剤を調製することとを含む方法も提供する。

【００２６】好ましいペプチドリンカーに加えて、当該技術分野において周知の他のリンカ
ーを用いて抗原を疎水性ドメインに結合してもよい。そのようなリンカーの例と
しては、ポリエチレングリコール、多糖、ポリシアル酸、コハク酸、ブタン二酸
、アジピン酸、および、たとえばＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボ
ニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）−トルエン）、ＤＳＰ（ジチオ
ビス（スクシンイミジルプロピオネート）、ＥＧＳ（エチレングリコールビス（
スクシンイミジルスクシネート）、ＳＭＣＣ（４−スクシンイミジルオキシカル
ボニル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
）およびＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロ
ピオネート）（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）カタログ、ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒ
ｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．），イリノイ州ロックフォールド（Ｒｏｃｋ
ｆｏｒｄ）所在，も参照のこと）のような標準的な架橋化学物質が含まれるが、
これらに限定されるわけではない。

【００２７】本発明によれば、抗原−リポソーム複合体が循環中に免疫系の細胞により取り
出された後で、免疫系に直接与えられることから、リポソームは抗原送達におけ
る重要な役割を果たしている。さらに、免疫活性化経路の選択は、リポソームの
脂質組成物を変化させることによって変えることができる。たとえば、様々な免
疫刺激分子、たとえば脂質Ａ（アサノ（Ａｓａｎｏ）とクライナーマン（Ｋｌｅ
ｉｎｅｒｍａｎ）、１９９３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．第１４巻２８
６頁）、Ｐ₃ＣＳＳ（レックス（Ｌｅｘ）ら、１９８６年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．第１３７巻２６７６頁）、ムラミルジ、およびトリペプチド−ＰＥ（フィ
ドラー（Ｆｉｄｌｅｒ）ら、１９８１年、ＰＮＡＳ第７８巻１６８０頁、アル
ビン（Ａｌｖｉｎｇ）ら、１９８５年、Ｖａｃｃｉｎｅｓ第４巻１６６頁）、
およびカチオン脂質（ウォルカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９２年、ＰＮＡＳ
第８９巻７９１５頁）などをリポソームに配合して、様々な免疫学的経路を刺激
することができる。他のアジュバント、たとえば、ＭＦ５９、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ
２１またはミョウバンなどを抗原−リポソーム複合体と組み合わせて使用しても
よい。さらに、免疫反応を引き出すためにサイトカインなどの免疫調節分子を使
用することもできる。

【００２８】本発明の実施にあたって用いるリポソームは、ホスファチジルエタノールアミ
ン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（Ｐ
Ｇ）、およびホスファチジルコリン（ＰＣ）などのホスファチジルエーテル類や
エステル類、ジオレオイルグリセロスクシネートなどのグリセリド類、セレブロ
シド類、ガングリオシド類、スフィンゴミエリン類、コレステロールなどのステ
ロイド類、および他の脂質を含む広範な種類の小胞形成脂質、ならびにビタミン
ＥまたはビタミンＣパルミチン酸塩などの賦形剤から調製することができる（米
国特許第４，２３５，８７１号、第４，７６２，７２０号、第４，７３７，３２
３号、第４，７８９，６３３号、第４，８６１，５９７号、および第４，８７３
，０８９号も参照のこと）。ＰＣをベースとする脂質の例としては、（Ｃ−１８
）ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、（Ｃ−１６）ジパルミト
イルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、（Ｃ−１４）ジミリストイルホスファ
チジルコリン（ＤＭＰＣ）、および（Ｃ−１８、不飽和）ジオレイルホスファチ
ジルコリン（ＤＯＰＣ）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。脂質
は体温（約３８〜３９℃）において流動相にあることが好ましい。したがって、
ＤＳＰＣやＤＰＰＣなどの体温より高いＴｍを有する脂質は、あまり好ましくな
い（が、それでも有用ではある）。ＤＭＰＣやＤＯＰＣなどの体温より低いＴｍ
を有する脂質がより好ましい。さらに、脂質製剤のコレステロール含量は約１０
％以下であることが好ましい。特に好ましい脂質組成物は、約０〜１０％のコレ
ステロールと、約０〜１５％のＰＧと、約０〜１００％のＰＣとを含む。ある好
ましい実施形態において、組成物はさらに約０〜１０％のアジュバントを含んで
いてもよく、好ましくは、アジュバントは約５％未満の量で存在する。

【００２９】リポソームの調製は従来分野において周知である。一般に、リポソームは、エ
タノール注入（バツリ（Ｂａｔｚｒｉ）ら、１９７３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．第２９８巻１０１５頁）、エーテル注入（ディー
マー（Ｄｅａｍｅｒ）ら、１９７６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ．第４４３巻６２９頁、シーレン（Ｓｈｉｅｒｅｎ）ら、１９７８年
、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．第５４２巻１３７頁）、
界面活性剤除去（レージン（Ｒａｚｉｎ）、１９７２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．第２６５巻２４１頁）、溶媒蒸発（マツモト（Ｍ
ａｔｓｕｍｏｔｏ）ら、１９７７年、Ｊ．ＣｏｌｌｏｉｄＩｎｔｅｒｆａｃ
ｅＳｃｉ．第６２巻１４９頁）、水中クロロホルムエマルションからの有機
溶媒蒸発（ＲＥＶ’ｓ）（ゾーカ（Ｓｚｏｋａ）Ｊｒ．ら、１９７８年、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第７５巻４１９４頁）、ヌ
クレオポアポリカーボネート膜を介したＭＬＶまたはＥＵＶの押し出し（オルソ
ン（Ｏｌｓｏｎ）ら、１９７９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ．第５５７巻９頁）、リン脂質混合物の凍結と解凍（ピック（Ｐｉｃｋ）
、１９８１年、ＡｒｃｈｉｅｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄＢｉｏ
ｐｈｙｓｉｃｓ第２１２巻１８６頁）、ならびに超音波処理および均質化を含
む、多くの様々な技術によって製造されてきた。

【００３０】慣習により、リポソームは大きさによって分類され、問題とするリポソームの
種類を表すために３文字頭字語が用いられている。多重ラメラ小胞は一般に「Ｍ
ＬＶ」と呼ばれる。小さな単ラメラ小胞は「ＳＵＶ」と呼ばれ、大きな単ラメラ
小胞は「ＬＵＶ」と呼ばれる。これらの呼称の後に、リポソームの化学的組成が
続くこともある。命名法についての議論と既知のリポソーム種の概要については
、ストーム（Ｓｔｏｒｍ）ら（１９９８年、ＰＳＩＴ第１巻１９〜３１頁）を
参照のこと。

【００３１】本発明は、適切なアジュバントを有するリポソーム組成物を使用することを包
含する。しかしながら、本発明は、リポソームに結合していない抗原構成物を適
切なアジュバントとともに使用することも包含する。したがって、ワクチンまた
は免疫原性組成物は、２つの成分、すなわち疎水性ドメインに結合された抗原と
適切なアジュバント系とを含んで構成される。使用されうる薬学的に許容されう
る可能な担体系の例としては、リポソーム、エマルション、（完全または不完全
）フロイントアジュバント、ミョウバン、ＩＳＣＯＭＳおよびエンベロープを有
するウィルスなどが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

【００３２】本発明の方法は免疫原として有効な量のリポソーム組成物を使用するが、この
免疫原として有効な量とは、すなわち任意の添加された賦形剤または担体との組
み合わせにおいて宿主中で検出可能な免疫原性反応を引き起こす組成物量のこと
である。組成物がワクチン組成物として用いられる場合は、有効量は、任意の添
加された賦形剤または担体との組み合わせにおいて、宿主に特異的かつ十分な免
疫学的反応を起こし、宿主にその後の微生物への暴露からの防御能力を与えるか
（予防的ワクチン接種）、あるいはすでに罹患した宿主に防御能力を与える（治
療的ワクチン接種）ような量である。

【００３３】本発明について上で一般的な説明を行ってきたが、本発明は以下の詳細な実施
例を参照することにより、より深く理解されるであろう。以下の実施例は説明の
ためのものであり、特記しない限りは本発明の限定を意図したものではない。（実施例）実施例１−ＨＳＶ２ＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＴＭの調製ＨＳＶ２のｇＤエンベロープタンパク質に由来するＮ末端２３アミノ酸断片を
、自動ペプチド合成装置による化学合成によって、膜貫通（ＴＭ）断片に連結し
た。合成されたペプチドを標準的なＨＦ切断方法によって切断し、ウォーターズ
（Ｗａｔｅｒｓ）Ｃ１８カラムおよび０．１％ＴＦＡを含む１００％アセトニト
リル流動相を用いた分取ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドは質量分析と毛管
電気泳動によって少なくとも９５％の純度のものであることが示された。

【００３４】リポソームの調製リポソームは、以前に記述されている方法（フジイ（Ｆｕｊｉｉ）ら、１９９
７年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３６巻４９５９頁）に従ったプローブ超音
波処理によって調製した。簡単に説明すると、脂質（タンパク質を有する、ある
いは有しない）をクロロホルム／メタノールなどの有機溶媒中に溶解する。脂質
溶液のアリコートを丸底試験管内にピペットで滴下し、溶媒を窒素ガス流下、６
５℃で蒸発させることにより、薄い脂質フィルムが形成される。この膜を少なく
とも８時間真空下に放置して残留有機溶媒を除去する。リポソームの調製は、脂
質フィルムを緩衝液で水和させ、６５℃で５〜１０分間懸濁液をインキュベート
してから、プローブ超音波処理を行うことによって達成される。次にリポソーム
を０．２２ｍフィルタに通して濾過し、調製物を無菌化する。リポソームを動
的光散乱により分粒し、凝集体の形成を少なくとも４週間にわたって追跡する。

【００３５】特に好ましいリポソームＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＴＭ製剤は、ＤＭＰＣ：
Ｃｈｏｌ：ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルコリン：コレステロール：
ジミリストイルホスファチジルグリセロール）のモル比が１５：２：３であり、
２．５重量％の脂質Ａを含む。

【００３６】ワクチン接種処置およびウィルス抗原に対する免疫反応の誘導の試験ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６の雌マウス（６−８週齡）に、1 週間に１
回の割合で、２、３あるいは４週間にわたって、試験ワクチン調製物または緩衝
液を皮下注射する。注射部位に肉芽腫の発症やかさぶたの形成などの副作用が見
られないかどうか観察する。動物を鼻腔内経路を介してワクチンで免疫する場合
、それらの動物をハロタンで麻酔し、組成物（１０〜２０ｌ）を吸息のための
外鼻孔にマイクロピペッタに装着した無菌チップを用いて投与する（ガリチャン
（Ｇａｌｌｉｃｈａｎ）ら、１９９３年、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．第１６８
巻６２２頁）。

【００３７】ワクチン接種処置を行っている最中、およびウィルス攻撃後において、一定間
隔で、ウィルス抗原に対するマウスの免疫反応を測定する。ウィルス中和抗体試
験は、マウス血清の異なる希釈物をウィルスとを混合して添加しておいた１×１
０⁵ＢＨＫ細胞を含む２４ウェルクラスタープレートを用いて行う。ＣＯ₂恒温器
内において３７℃で４８〜７２時間のインキュベートした後、細胞の単分子層の
細胞毒性について調べ、中和抗体の力価を検定する。ウィルスに対して沈殿した
抗体は、血清の異なる希釈物を５〜１０ｇのウィルス抗原または２５〜５０
ｌのＨＳＶ２ストック（１×１０⁵ＰＦＵ）とともにインキュベートすることに
より測定する。抗原性エピトープを含むリポソームは以前に開示されているよう
に（ツソ（Ｔｕｓｏ）ら、１９９３年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ第５
５巻１３７５頁）抗体／ＥＬＩＳＡ検定のためのターゲットとしても用いられる
。後者の検定の結果は抗体の結合レベルおよびアイソタイプ構成を測定するため
に用いられる。

【００３８】ワクチン接種したマウスにおけるウィルス抗原に対する遅延型過敏反応は、足
蹠検定によって試験する。ワクチン接種したマウスをハロタンで麻酔し、一方の
後肢足蹠内に５０ｌの紫外線不活化ＨＳＶ２を、そして他方の後肢足蹠内に５
０ｌの溶菌された非感染細胞を注射する。２４時間後、４８時間後、および７２時間後、マウスの足蹠の腫脹の程度を副尺
付きノギスで測定し、基準測定値と比較する。これらの動物のＴ細胞活性は、脾
臓Ｔ細胞をウィルス抗原とともにインキュベートすることに応答したサイトカイ
ンの産生によっても測定される。脾臓は、ワクチン接種した動物から取り出し、
無菌プランジャによって脾臓を穏やかに分解し、細胞をナイロンスクリーンメッ
シュに押し通すことによって、脾臓ホモジネートを調製する。細胞懸濁液をリン
スし、９６ウェルのマイクロタイタープレートに１×１０⁶細胞／ウェルとなる
ように蒔く。細胞を様々な量のウィルス抗原とともに３７℃で３〜４日間インキ
ュベートした後、ウェルからの上清を回収し、サイトカインが存在するかどうか
を試験する。市販のサイトカインＥＬＩＳＡキットを用いてサイトカインプロフ
ァイルを規定する（ファーミンゲン社（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、カ
リフォルニア州サンディエゴ（ＳａｎＤｉｅｇｏ）所在）からのＩＬ−２，Ｉ
Ｌ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＦＮ−□，□−アクチン、およ
びＴＮＦ−α）。サンドイッチＥＬＩＳＡによる組織培養上清内のサイトカイン
タンパク質の検出は、特定のサイトカインに特異的なモノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）を用いて行う。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレートをラット抗マウスサ
イトカインｍＡｂで一晩コートする。プレートをＰＢＳに溶解した３％ウシ胎児
血清で２時間ブロックし、各試験試料のアリコートを各ウェルに加える。サイト
カイン特異的ビオチン化ラット抗マウスｍＡｂを各ウェルに加えた後、アビジン
ペルオキシダーゼを加える。比色基質を加えることにより着色反応を行わせる。
プレートはＥＬＩＳＡ分光計において読みとり、対照の組換え型サイトカインか
ら得られた標準曲線からサイトカイン濃度を計算する。

【００３９】リポソームワクチン調製物を試験するためのＨＳＶ２マウス脳炎モデルワクチン接種した、あるいはワクチン接種していない（対照）ＢＡＬＢ／ｃ雌
マウス（１０〜１２週齡）を、致死量（１×１０⁵ＰＦＵ）の脳継代ＨＳＶ２で
腹腔内攻撃する。上記致死量のＨＳＶ２によって腹腔内攻撃されたマウスは、ま
ずはじめに攻撃の１週間前および１日前に皮下エストロゲンで前処理する。次に
上記マウスをアセプロマジンおよびケタミンの腹腔内注射によって麻酔する。そ
して、まず最初に乾燥したカルギス織物（Ｃａｌｇｉｓｗａｂ）で膣を清浄した
後、マイクロピペッタに装着した無菌チップを用いてＨＳＶ２（１０〜３０ｌ
）を投与する（マクダーモット（ＭａｃＤｅｒｍｏｔｔ）ら、１９８4 年、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．第５１巻７４７頁）。これらの動物を攻撃から８０日間の間、
生存（毎日）、体重減少（最初の２週間は一日おき、その後は一週間に一度）、
毛皮の外観、および神経学的症状（活動レベルの低下、無気力または四肢の麻痺
）について観察する。

【００４０】抗原誘導性Ｔ細胞増殖ｇＤ抗原に対する宿主の感作は、抗原誘導性Ｔ細胞増殖検定によって測定する
。脾臓ホモジネートは、無菌プランジャによって穏やかに分解し、細胞をナイロ
ンスクリーンメッシュに押し通すことによって調製する。細胞は、１０％ウシ胎
児血清（ＦＣＳ）、１０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペ
ニシリン（２５ＩＵ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（２５ｇ／ｍｌ）
を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁する。細胞を９６ウェルＵ底プレート中、
ｇＤ（５〜２０ｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、１×１０⁶細胞／ｍｌの
濃度で、５％ＣＯ₂存在下に４日間培養する。培養物を２０μｌのリサズリン色
素で３時間パルス標識し、ＣｙｔｏｆｌｕｏｒＩＩ（パースペクティブバイオシ
ステムズ社（ＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、
マサチューセッツ州ファーミントン（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ）所在）上で蛍光を
測定する。

【００４１】サイトカイン特異的ｍＲＮＡ分析免疫した動物および免疫していない動物からのＴ細胞に対して、ＩＬ−２，Ｉ
ＦＮ−□，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６およびＩＬ−１０を含む、免疫化に付
随する感作を反映するであろう主要なサイトカインに対するサイトカイン特異的
ｍＲＮＡの量を調べる。Ｔ細胞は脾臓から前述のようにして得られる。全ＲＮＡ
はチョムチンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｙ）とサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）（チ
ョムチンスキーら、１９８７年、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１６２
巻１５６頁）によって記載された方法を改良したもの（コウゼンツァ（Ｃｏｓｅ
ｎｚａ）ら、１９９５年、ＬｉｖｅｒＴｒａｎｓｐｌ．Ｓｕｒｇ．第１巻
１６頁）を用いて単離する。新鮮なあるいは凍結した細胞（２×１０⁶）を１ｍ
Ｌの変性溶液（４ｍＭチオシアン酸グアニジン、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（
ｐＨ７．０）、０．５％サルコシル、および０．１ｍＭ２−メルカプトエタノ
ール）中で分解させる。同体積のイソプロパノールとともに−２０℃で一晩イン
キュベートすることにより、ＲＮＡを沈殿させる。全ＲＮＡ濃度は２６０ｎＭに
調整し、試料は分析時まで−８０℃で保存する。

【００４２】サイトカイン分析は、コウゼンツァ（Ｃｏｓｅｎｚａ）らによって開示された
方法を改良したものを用いて行う（コウゼンツァ（Ｃｏｓｅｎｚａ）ら、１９９
５年、ＬｉｖｅｒＴｒａｎｓｐｌ．Ｓｕｒｇ．第１巻１６頁）。一本鎖ｃ
ＤＮＡは、２ｇの全ＲＮＡを全量２０ｌの反応混合液中で鳥類骨髄芽球ウィ
ルス逆転写酵素（ベーリンガーマンハイム社（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎ
ｈｅｉｍ），インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）
所在）を用いて転写することにより調製する。目的とする各サイトカイン遺伝子
に対する所定の大きさのＤＮＡ断片を増幅するために、マウスサイトカインに対
する配列特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いる（表１）。

【００４３】

【表２】

【００４４】ＰＣＲ混合液は、最終容量２５ｌ中、１ｌのｃＤＮＡと、２．５ｌのＰ
ＣＲ用１０×緩衝液と、各１ｌの５’および３’プライマーと、各２．５ｌ
の１０×ｄＮＴＰ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）と、０．１２５ｌのＴ．ａｑｕａｔｉｃ
ｕｓ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）
から成る。内部対照として５４８ｂｐ断片を増幅するために、特異的 −アクチ
ンプライマーを用いる。ＰＣＲ混合液をミネラルオイルで覆い、混合液を９４℃
で７分間インキュベートした後、９４℃３０秒間の変性と、６０℃４５秒間のプ
ライマーアニーリングと、７２℃６０秒間の伸展のサイクルとから成るサイクル
を３８サイクル行い、７２℃で７分間インキュベートする。ＰＣＲ産物を臭化エ
チジウムの存在下にアガロースゲル上で分離する。ＵＶ光の下でバンドを可視化
し、写真撮影し、モレキュラー・アナリスト・ソフトウェア・パッケージ（バイ
オラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ），カリフォルニア州リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ）所在）を用いて写真からデンシトメータ定量する。

【００４５】ＥＬＩＳＡによるサイトカイン測定市販のサイトカインＥＬＩＳＡキットを用いて、免疫した動物および免疫して
いない動物から単離された脾臓ＣＤ４⁺Ｔ細胞によって分泌されるサイトカイン
プロファイルを特定する。サンドイッチＥＬＩＳＡによる脾臓Ｔ細胞からの組織
培養上清中のサイトカインタンパク質の検出は、特定のサイトカインに対して特
異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて行われる。簡単に説明すると、Ｅ
ＬＩＳＡプレートをラットの抗マウスサイトカインｍＡｂで一晩コートする。プ
レートをＰＢＳに溶解した３％ＦＣＳによって２時間ブロックし、各試料のアリ
コートを各ウェルに加える。サイトカイン特異的ビオチン化ラット抗マウスｍＡ
ｂを各ウェルに加え、次にアビジンペルオキシダーゼを加える。比色基質を加え
ることにより着色反応を行わせる。プレートはＥＬＩＳＡ分光計において読み取
り、対照の組換え型サイトカインから得られた標準曲線からサイトカインの濃度
を計算する。

【００４６】抗ＨＳＶ２ＣＴＬ反応ワクチン接種後、脾臓Ｔ細胞中に抗原特異的細胞障害Ｔリンパ球が存在するか
どうかについて調べる。脾臓リンパ球は前述のようにして得られる。それぞれの
処理群から得られるリンパ球をプールし（ｎ＝５）、１２ウェル培養プレート中
、１０⁷細胞／ウェルの濃度で抗原の非存在下に３日間培養する。ＥＬ−４（Ｈ
２^b）標的細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ））を、
Ｈ２^b制限細胞に対する４９５〜５０５残基の間に位置するＨＳＶ２ＣＴＬエ
ピトープ（ハンケ（Ｈａｎｋｅ）ら、１９９１年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６５
巻１１７７頁）に対応するペプチドとともにインキュベートし、３７℃で４時間
インキュベートする。標的細胞を洗浄し、１×１０⁴個の細胞を含む１００μｌ
力価を各ウェルに加える。エフェクターリンパ球を洗浄し、様々な濃度でウェル
に加え、３７℃で４時間培養する。ＣｙｔｏＴｏｘ９６キット（プロメガ社（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在）を用
いて、特異的溶菌百分率を、標準的なＥＬＩＳＡプレート読取装置（ＨＴＳ７
０００＋ＢｉｏＡｓｓａｙＲｅａｄｅｒ）（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋ
ｉｎＥｌｍｅｒ），カリフォルニア州サンホゼ（ＳａｎＪｏｓｅ）所在）に
おいて測定される上清乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）から４９０ｎｍにおける
吸光度を記録することにより計算する。ＨＳＶ２−抗原特異的溶菌の決定は、標
準的な基準に従っておこなう。データは、特異的溶菌百分率＝１００×［（実験
値−エフェクター自発溶菌−標的細胞自発溶菌）／（標的細胞最大値−標的細胞
自発溶菌）］として表される。

【００４７】図１に示される生存曲線は、致死量のＨＳＶ２による全身攻撃からマウスを防
御する際のリポソームペプチドの有効性を示すとともに、１００％の防御を達成
するために必要とされる接種回数を立証するものである。図１はＢＡＬＢ／ｃマ
ウスをＨＳＶ２による致死的攻撃から防御するために必要とされるリポソームＨ
ＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＴＭワクチンの投与回数を示している。７匹のマウス
から成る各群に対し、致死量のＨＳＶ２による攻撃の前に、２，３または４回の
免疫を行った。４回のワクチン接種を行った場合、リポソームワクチンで免疫さ
れたどの個体もＨＳＶ２の感染に付随する神経学的合併症を示さず、また研究の
間中いかなる感染の兆候も検出されなかった。最も重要なことは、すべてのマウ
スがＨＳＶ２による致死的攻撃に対して生き残ったことである。２回または３回
の週単位のワクチン接種を行った場合、１００％未満のマウスが防御された。こ
れに対し、プラシーボ（すなわち緩衝液）を４回投与したマウスはＨＳＶ２攻撃
から防御されなかった。

【００４８】リポソームＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＴＭについて、さらに３群のＣ５７Ｂ
Ｌ／６マウスにおける試験を行ったところ、ＢＡＬＢ／ｃマウスの場合に得られ
た結果に匹敵する類似の防御効果が引き出されることがわかった。表２は結果を
まとめたものである。第１群のマウスは１週目と４週目に皮下にワクチン接種し
、第２群のマウスは１週目に皮下に、４週目に直腸内にワクチン接種し、第３群
のマウス（対照群）に対してはワクチン接種を行わなかった。最後のワクチン接
種（４週目）から１週間後、マウスに対して致死量のＨＳＶ２による腹腔内攻撃
を行い、３週間にわたって罹患率および死亡率を観察した。ＢＡＬＢ／ｃマウス
の場合と同様に、リポソームＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＴＭによるワクチン接
種を受けたマウス群は、皮下注射によってワクチン接種した場合、あるいは初回
抗原刺激量を皮下投与した後に追加抗原刺激を粘膜に行った場合には、有意な生
存数を有していた。

【００４９】

【表３】

【００５０】図２はリポソームＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＴＭを他の抗原提示方法と比較
した結果を示すものである。７匹のマウスから成る各群に、致死量のＨＳＶ２に
よる攻撃の前に４回の免疫を行った。この場合も同様に、リポソームＨＳＶ２ｇ
Ｄ（１−２３）−ＴＭワクチンによる４回の接種を行った場合には、マウスを致
死量のＨＳＶ２から１００％防御できる。非リポソームＨＳＶ２ｇＤ（１−２３
）−ＴＭまたはＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＴＭを含まないリポソームによって
４回の接種を行っても、致死量のＨＳＶ２攻撃から有意に防御することはできな
い。このことは、有効な免疫反応を達成するためには、リポソームと構築された
タンパク質成分のどちらもが互いに結合している必要があることを明確に実証す
るものである。中でも重要なのは、ウィルスをベースとするワクチンは一般に免
疫反応に対する優れた刺激を与えると考えられている（デスロージアス（Ｄｅｓ
ｒｏｓｉｅｒｓ）、１９９２年、ＡＩＤＳ．Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏ
ｖｉｒ．第８巻１４５７頁）ため、リポソームＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−Ｔ
Ｍワクチンは熱不活化ウィルスによる免疫化よりも遙かに良好な防御を与えると
いう知見である。

【００５１】研究の最後に、マウスを犠牲にして血清を回収し、この時点における免疫反応
の性質の特徴付けを行う。ワクチン接種したマウスの血清は、免疫反応を刺激す
るために用いられるペプチドを特異的に認識し、活性ウィルスを沈殿させ、した
がってウィルス表面上のエピトープを認識する抗体であることが示唆される高い
力価の抗体（１：１００）を含んでいることが判った。抗体はＨＳＶ２ｇＤ（１
−２３）−ＴＭリポソームも沈殿させたが、ペプチドを有しないリポソームは沈
殿させず、抗体がＨＳＶ２のｇＤエピトープを特異的に認識していることが示唆
される。

【００５２】下記の表３は、４週間にわたって週一回リポソームＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）
−ＴＭを皮下投与すると、標準的なアジュバントと比較して、強い免疫反応が発
生されることを証明する免疫学的検定をまとめたものである。不完全フロイント
アジュバントまたはミョウバンと混合した抗原によるワクチン接種の場合、ウィ
ルス攻撃に対する防御能をマウスに与えることができなかった。中和抗体試験お
よび遅延型過敏反応のデータは、リポソームＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＴＭ群
に対して観察された、抗体力価が最も高く（Ｂ細胞反応）、足蹠の腫脹が最も大
きい（Ｔ細胞反応）生存データに匹敵するものであった。リポソームＨＳＶ２ｇ
Ｄ（１−２３）−ＴＭ処理に付随する別の重要な利点は、抗原とともに不完全フ
ロイントアジュバントを投与したマウスでの結果とは異なり、どのマウスにおい
ても過敏や炎症が全く見られなかったということである（不完全フロイントアジ
ュバントによる注射部位では１７匹中１７匹に赤化が認められたのに対し、リポ
ソームＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＴＭによる注射部位に赤化が認められたのは
１７匹中０匹であった）。ミョウバンを使用した場合、１７匹中１７匹のマウス
が注射部位に触知可能な肉芽腫を発症した。これに対し、リポソームＨＳＶ２ｇ
Ｄ（１−２３）−ＴＭは、どのマウスにおいても肉芽腫を形成させることはなか
った。まとめると、上記の結果は、Ｂおよび／またはＴ細胞反応（中和抗体力価
および足蹠の腫脹の程度によって判定される）が、マウス内でリポソームＨＳＶ
２ｇＤ（１−２３）−ＴＭによって引き出される、致死量のＨＳＶ２に対抗する
防御免疫反応に貢献していることを示唆するものである。

【００５３】

【表４】

【００５４】実施例２−ＨＳＶ２ＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＨＤの調製ＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＨＤをコードする遺伝子構成物は、４５アミノ酸
疎水性ドメイン（ＨＤ）に結合されたｇＤエピトープをコードする重複オリゴヌ
クレオチドを用いて作成した。この構築物は遺伝子のコード領域を連続的に伸展
し増幅することによって構築した。次に遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓ発現ベクター内
にライゲーションし、配列解析によって確認した。スモールスケールでの発現実
験は、１ｍＭＩＰＴＧによる誘導によって開始し、リポソームＨＳＶ２ｇＤ（
１−２３）−ＴＭによるワクチン接種の実験で生成したマウス抗体を用いたウェ
スタンブロット分析によって確認した。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
も分析し、クーマシー染色により、バンドは予想される分子量（約６ｋＤ）に一
致することが判明した。予想されるタンパク質がスモールスケールにおいて発現
することが証明されたので、ｐＴｒｃＨｉｓ／ＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＨＤ
構築物を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の１０リットルのバッチ発酵を行ったと
ころ、約６０グラムの細胞ペーストが得られた。誘導に続き、ＨＳＶ２ｇＤ（１
−２３）−ＨＤの発現を発酵時間経過のウェスタンブロットによって確認した。
約３０グラムの細胞ペーストからの菌体を１％デオキシコール酸と５ｍＭイミダ
ゾールとを含む緩衝液中、フレンチプレスによって溶菌した。遠心分離により細
胞残渣をペレット化した後、ＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＨＤの大部分が水溶性
上清中に見られた。

【００５５】精製は、可溶性ＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＨＤタンパク質を含む上清をニッ
ケル充填キレート化セファロースカラムを通過させることにより行った。カラム
は、５ｍＭイミダゾール、２００ｍＭイミダゾール、１％デオキシコール酸を含
む５ｍＭイミダゾールを含む溶液で連続的に洗浄し、すべての残留タンパク質を
除去した。ＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＨＤは最終的に２００ｍＭイミダゾール
、１％デオキシコール酸溶液で溶出した。ピーク画分をクーマシー染色ＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって同定した。ＨＳＶ２ｇＤ（１−２３
）−ＨＤを含んだすべてのピーク画分をプールし、ミリポア・ウルトラプレップ
（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＵｌｔｒａｐｒｅｐ）濃縮器を用いて濃縮した。最終濃
縮物は、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル状の単一バンドの存在から
判定されるように、純粋なＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＨＤを含んでいることが
示された。この最初の実施により、リポソーム調合およびワクチン接種実験のた
めの約２〜３ｍｇのＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＨＤが得られた。

【００５６】リポソーム調製およびワクチン接種法、免疫反応誘導試験、ＨＳＶ２マウス脳
炎モデル、抗原誘導性Ｔ細胞増殖、サイトカイン特異的ｍＲＮＡ分析、ＥＬＩＳ
Ａサイトカイン測定、および抗ＨＳＶ２ＣＴＬ反応については、本質的に実施
例１に記載した通りである。

【００５７】結果図３に示される生存曲線は、ＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＨＤの防御免疫反応
誘起能力を示している。この特殊な製剤による生存百分率は４０％であると観察
された。比較してみると、ＨＳＶ２ｇＤ（１−２３）−ＴＭの対照群が１００％
の生存率を示したのに対し、緩衝液で処理した対照動物では生存は認められなか
った。実施例３−ＨＩＶＣＯＳ−１細胞内でのＨＩＶ（ｇｐ１２０−ＨＤ）およびＨＩＶ（Δｇｐ１２
０−ＨＤ）の調製エピトープの立体構造を研究するために、ｇｐ１６０遺伝子を含むｐＨＸＢ２
−ｅｎｖプラスミド（ＮＩＨＡＩＤＳＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＲｅａｇ
ｅｎｔＰｒｏｇｒａｍ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から、プラスミドＤ
ＮＡをＰＣＲにより増幅することによりｇｐ１２０配列を得、１５３６ｂｐ産物
をジデオキシヌクレオチド法による配列決定のためにサブクローニングする。Ｈ
ＩＶｇｐ４１タンパク質を除いて、ＨＩＶｇｐ１２０遺伝子の最初の２１ｂｐに
相当する５’（センス）プライマーＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＡ
Ｔ、およびヌクレオチド１５１５〜１５３６に相当する３’（アンチセンス）プ
ライマーＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣを用い、ｇｐ１２０断片
をクローン化し、ＰＣＲによって増幅する。さらに、各プライマーはｐｃＤＮＡ
４−Ｈｉｓ発現ベクターのマルチクローニングサイトに合致するように、都合の
よい制限酵素部位を用いて平滑化する。ＰＣＲ産物を、遺伝子カセットプラスミ
ドとしてＨＤ領域を含んだｐｃＤＮＡ４−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）内にライゲーションする。欠失変異体
は、ｇｐ１２０タンパク質内の残基をコードするヌクレオチドを除いた５’およ
び３’プライマー対を用いてＰＣＲ増幅によって作成する。上記欠失変異体には
、Δ１３６−１５１ｇｐ１２０、Δ１２８−１９４ｇｐ１２０、およびΔ１２３
−２０３ｇｐ１２０が含まれる。プライマーは、２つの遺伝子産物のライゲーシ
ョンを可能にする、都合のよい制限酵素配列を含んでいる。したがって、各変異
体は対象とする特定の制限部位によってコードされる２つのアミノ酸で交換され
る。最終遺伝子は、ＡｕｔｏＣｙｃｌｅキット（アマーシャムファルマシアバイ
オテク社、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）所在）
から入手したプロトコールおよび試薬と、ＡＬＦＥｘｐｒｅｓｓキット（アマー
シャムファルマシアバイオテク社、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）配
列決定装置上での結果を用いてＤＮＡの配列決定を行うことによって確認し、Ａ
Ｍソフトウェアｖ．３．０２キット（アマーシャムファルマシアバイオテク社、
ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）を用いて解析される。プラスミドをＤ
ＥＡＥ−デキストラン試薬を用いてＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ，メリーランド
州ロックヴィル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在）にトランスフェクションさせる。
安定なトランスフェクタントをゼオチン（Ｚｅｏｃｉｎ）（インビトロジェン社
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．），カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａ
ｎＤｉｅｇｏ）所在）を用いて選択し、限界希釈によりクローン化する。ｇｐ
１２０−ＨＤタンパク質は、固体支持体に結合されたニッケルに対する選択的親
和性により精製する。タンパク質を高生産するクローンをウェスタンブロット分
析またはＦＡＣＳ分析によって評価する。ＨＩＶ（ｇｐ１２０）−ＨＤ，ＨＩＶ
Δ１３６−１５１ｇｐ１２０，ＨＩＶΔ１２８−１９４ｇｐ１２０およびＨＩＶ
Δ１２３−２０３ｇｐ１２０のヒスチジンリンカーは、精製完了後にエンテロキ
ナーゼ切断により除去する。必要であれば、サイズ排除、イオン交換、あるいは
疎水的相互作用クロマトグラフィーを行って、ＨＩＶｇｐ１２０−ＨＤおよびＨ
ＩＶΔｇｐ１２０−ＨＤタンパク質をさらに精製する。

【００５８】ＨＩＶ−ＨＤの調製３つのエピトープ（ＣＴＬ、Ｔヘルパー細胞、およびＢ細胞）を組み合わせた
ヌクレオチド配列は、異なる複数のＨＩＶタンパク質において発見された配列（
ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡＣＴＲＰＮＹＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦ
ＹＴＴＫ（配列番号１９））から選択し、このタンパク質配列から大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）コドン選択性を用いて得る（ルーマン（Ｌｏｏｍａｎ）ら、１９８
７年、ＥＭＢＯＪ．第６巻２４８９頁）。ＨＩＶ配列をコードする合成遺伝
子は、重複オリゴヌクレオチドの合成、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲおよび
ライゲーションによって会合させる。会合したＨＩＶ断片をコードする全長遺伝
子は、ＰＣＲによって増幅し、発現プラスミド内にライゲーションする。最終的
な遺伝子は、ＤＮＡの配列決定を行うことにより確認する。

【００５９】ＨＩＶ−ＨＤを含むｐＴｒｃＨｉｓプラスミドを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）を形質転換する。細菌をアンピシリン（５０ｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地
中、３７℃で対数中期まで培養する。この時点でＩＰＴＧを加えてｔｒｐ／ｌａ
ｃハイブリッドプロモーターを誘導する。ＨＩＶ−ＨＤタンパク質の最適な誘導
後発現を決定するために、１時間ごとに経時変化を調べる。最適な発現が認めら
れた時点で、遠心分離によって細胞を集菌する。細胞ペレットを溶菌し、遠心分
離する。溶菌液中にタンパク質が存在するかどうかを検定する。ＨＩＶ−ＨＤタ
ンパク質は、固体支持体に結合されたニッケルへの選択的親和性によって精製す
る。必要であれば、サイズ排除、イオン交換または疎水的相互作用クロマトグラ
フィーを用いて、ＨＩＶ−ＨＤをさらに精製することもできる。

【００６０】リポソームの調製リポソームは上述した手順（フジイ（Ｆｕｊｉｉ）ら、１９９７年、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ第３６巻４９５９頁）に従ってプローブ超音波処理によって
調製する。簡単に説明すると、脂質（タンパク質を含むか、あるいは含まない）
をクロロホルム／メタノールなどの有機溶媒中に溶解する。脂質溶液のアリコー
トを丸底ガラス試験管にピペットで滴下し、窒素ガス流下、溶媒を６５℃で蒸発
させることにより、薄い脂質フィルムが形成される。この膜を少なくとも８時間
真空下に放置して残留有機溶媒を除去する。リポソームの調製は、脂質フィルム
を緩衝液で水和させ、６５℃で５〜１０分間懸濁液をインキュベートしてから、
プローブ超音波処理を行うことによって達成される。次にリポソームを０．２２
ｍフィルタに通して濾過し、調製物を無菌化する。リポソームを動的光散乱に
より分粒し、凝集体の形成を少なくとも４週間にわたって追跡する。

【００６１】ワクチン接種処置とウィルス抗原に対する免疫反応の誘導の試験ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（６−８週齡）に対し、１、４および８週目に試験ワク
チン調製物または緩衝液を皮下注射する。注射部位に肉芽腫の発症やかさぶたの
形成などの副作用が見られないかどうか観察する。動物を鼻腔内経路を介してワ
クチンで免疫する場合、それらの動物をハロタンで麻酔し、試験物（１０〜２０
ｌ）を吸息のための外鼻孔にマイクロピペッタに装着した無菌チップを用いて
投与する（ガリチャン（Ｇａｌｌｉｃｈａｎ）ら、１９９３年、Ｊ．Ｉｎｆ．
Ｄｉｓ．第１６８巻６２２頁）。

【００６２】ＥＬＩＳＡによる抗体反応の測定ワクチン接種処置を行っている間の一定期間おきに（たとえば一週間に一回）
、ウィルス抗原に対するマウスの免疫反応を測定する。抗原性エピトープを含む
リポソームは以前に開示されているように（ツソ（Ｔｕｓｏ）ら、１９９３年、
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ第５５巻１３７５頁）、抗体／ＥＬＩＳＡ検
定のためのターゲットとしても用いられる。後者の検定の結果は抗体の結合レベ
ルおよびアイソタイプ構成を測定するために用いられる。

【００６３】遅延型過敏反応（ＤＴＨ）検定ワクチン接種したマウスにおけるウィルス抗原に対する遅延型過敏反応は、足
蹠検定によって試験する。ワクチン接種したマウスをハロタンで麻酔し、一方の
後肢足蹠内に５０ｌのリポソーム抗原または遊離抗原を、そして他方の後肢足
蹠内に５０ｌの緩衝液を注射する。２４時間後、４８時間後、および７２時間
後、マウスの足蹠の腫脹の程度を副尺付きノギスで測定し、基準測定値と比較す
る。

【００６４】サイトカイン特異的ｍＲＮＡ分析免疫した動物および免疫していない動物からのＴ細胞に対して、ＩＬ−２，Ｉ
ＦＮ−□，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６およびＩＬ−１０を含む、免疫化に付
随する感作を反映するであろう主要なサイトカインに対するサイトカイン特異的
ｍＲＮＡの量を調べる。脾臓Ｔ細胞は免疫化の１週間後、および４週間後に前述
のようにして単離する。全ＲＮＡはチョムチンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｙ
）ら（１９８７年、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１６２巻１５６頁）
によって記載された方法を改良したもの（コウゼンツァ（Ｃｏｓｅｎｚａ）ら、
１９９５年、ＬｉｖｅｒＴｒａｎｓｐｌ．Ｓｕｒｇ．第１巻１６頁）を用
いて単離する。新鮮なあるいは凍結した細胞（２×１０⁶）を１ｍＬの変性溶液
（４ｍＭチオシアン酸グアニジン、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
、０．５％サルコシル、および０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール）内で分
解させる。同体積のイソプロパノールとともに−２０℃で一晩インキュベートす
ることにより、ＲＮＡを沈殿させる。全ＲＮＡ濃度は２６０ｎＭに調整し、試料
は分析時まで−８０℃で保存する。

【００６５】サイトカイン分析は、チョムチンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｙ）ら（１９
８７年、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１６２巻１５６頁）によって記
載された方法を改良したもの（コウゼンツァ（Ｃｏｓｅｎｚａ）ら、１９９５年
、ＬｉｖｅｒＴｒａｎｓｐｌ．Ｓｕｒｇ．第１巻１６頁）を用いて行う。
一本鎖ｃＤＮＡは、２ｇの全ＲＮＡを全量２０ｌの反応混合液中で鳥類骨髄
芽球ウィルス逆転写酵素（ベーリンガーマンハイム社，インディアナ州インディ
アナポリス所在）を用いて転写することにより調製する。目的とする各サイトカ
イン遺伝子に対する所定の大きさのＤＮＡ断片を増幅するために、マウスサイト
カインに対する配列特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いる（表１）。Ｐ
ＣＲ混合液は、最終容量２５ｌ中、１ｌのｃＤＮＡと、２．５ｌのＰＣＲ
用１０×緩衝液と、各１ｌの５’および３’プライマーと、各２．５ｌの１
０×ｄＮＴＰ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）と、０．１２５ｌのＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社）から成る。特異的
−アクチンプライマーを用いて、内部対照としての５４８ｂｐ断片を増幅する。
ＰＣＲ混合液をミネラルオイルで覆い、混合液を９４℃で７分間インキュベート
した後、９４℃３０秒間の変性と、６０℃４５秒間のプライマーアニーリングと
、７２℃６０秒間の伸展とから成るサイクルを３８サイクル行い、７２℃で７分
間インキュベートする。ＰＣＲ産物を臭化エチジウムの存在下にアガロースゲル
上で分離する。ＵＶ光の下でバンドを可視化し、写真撮影し、モレキュラー・ア
ナリスト・ソフトウェア・パッケージ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，
ＣＡ）を用いて写真からデンシトメータ定量する。

【００６６】脾臓Ｔ細胞におけるＥＬＩＳＡによるサイトカインの測定これらの動物のＴ細胞活性は、脾臓Ｔ細胞をウィルス抗原とともにインキュベ
ートすることに応答したサイトカインの産生によっても測定される。脾臓をワク
チン接種した動物から取り出し、無菌プランジャによって脾臓を穏やかに分解し
、細胞をナイロンスクリーンメッシュに押し通すことによって、脾臓ホモジネー
トを調製する。細胞懸濁液をリンスし、９６ウェルのマイクロタイタープレート
に１×１０⁵細胞／ウェルとなるように蒔く。細胞を様々な量のウィルス抗原と
ともに３７℃で３〜４日間インキュベートした後、ウェルからの上清を回収し、
サイトカインが存在するかどうかを試験する。市販のサイトカインＥＬＩＳＡキ
ットを用いてサイトカインプロファイルを規定する。サンドイッチＥＬＩＳＡに
よる組織培養上清内のサイトカインタンパク質の検出は、特定のサイトカインに
特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて行う。簡単に説明すると、ＥＬ
ＩＳＡプレートをラットの抗マウスサイトカインｍＡｂで一晩コートする。プレ
ートをＰＢＳに溶解した３％ウシ胎児血清で２時間ブロックし、各試験試料のア
リコートを各ウェルに加える。サイトカイン特異的ビオチン化ラット抗マウスｍ
Ａｂを各ウェルに加えた後、アビジンペルオキシダーゼを加える。比色基質を加
えることにより着色反応を行わせる。プレートはＥＬＩＳＡ分光計において読み
とり、対照の組換え型サイトカインから得られた標準曲線からサイトカイン濃度
を計算する。すべてのサイトカインＥＬＩＳＡキット（ＩＬ−２，ＩＬ−４，Ｉ
Ｌ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＦＮ−□、およびＴＮＦ−α）は、（ファ
ーミンゲン社、カリフォルニア州サンディエゴ所在）から購入する。

【００６７】抗原誘導性Ｔ細胞増殖ＨＩＶ抗原に対する宿主の感作は、抗原誘導性Ｔ細胞増殖を用いて測定する。
脾臓ホモジネートは、前述のようにして調製する。細胞は、１０％ＦＣＳ、１０
ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（２５ＩＵ／ｍ
ｌ）、ストレプトマイシン（２５ｇ／ｍｌ）およびゲンタマイシン（８０ｇ
／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁する。細胞を９６ウェルＵ底プレ
ート中、ＨＩＶ−ＨＤペプチド（５ｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、１×
１０⁶細胞／ｍｌの濃度で、５％ＣＯ₂存在下で３〜４日間培養する。培養物を２
０ｌのリサズリン色素で３時間パルス標識し、ＣｙｔｏｆｌｕｏｒＩＩ（Ｐｅ
ｒｓｐｅｃｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｔｏ
ｎ，ＭＡ）上で蛍光を測定する。

【００６８】抗ＨＩＶＣＴＬ反応ワクチン接種後、脾臓Ｔ細胞中に抗原特異的細胞障害Ｔリンパ球が存在するか
どうかについて調べる。脾臓リンパ球は前述のようにして得られる。それぞれの
処理群から得られるリンパ球をプールし（ｎ＝５）、１２ウェル培養プレート中
、１０⁷細胞／ウェルの濃度で抗原の非存在下に３日間培養する。Ｌ５１９８Ｙ
リンパ腫（Ｈ２^d）標的細胞（ＡＴＣＣ）を、Ｈ２^d制限細胞に対するＨＩＶＣ
ＴＬに対応するペプチドとともにインキュベートし、３７℃で４時間インキュベ
ートする。標的細胞を洗浄し、１×１０⁴個の細胞を含む１００μｌ力価を各ウ
ェルに加える。エフェクターリンパ球を洗浄し、様々な濃度でウェルに加え、３
７℃で４時間培養する。ＣｙｔｏＴｏｘ９６キット（プロメガ社、ウィスコンシ
ン州マディソン所在）を用いて、特異的溶菌百分率を、標準的なＥＬＩＳＡプレ
ート読取装置（ＨＴＳ７０００＋ＢｉｏＡｓｓａｙＲｅａｄｅｒ）（パー
キンエルマー社、カリフォルニア州サンホゼ所在）において測定される上清乳酸
デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）から４９０ｎｍにおける吸光度を記録することによ
り計算する。ＨＳＶ２−抗原特異的溶菌の決定は、標準的な基準に従っておこな
う。データは、特異的溶菌百分率＝１００×［（実験値−エフェクター自発溶菌
−標的細胞自発溶菌）／（標的細胞最大値−標的細胞自発溶菌）］として表され
る。実施例４−インフルエンザウィルス（ＩＮＦＶ）ＩＮＦＶ−ＨＤの調製選択されたエピトープのヌクレオチド配列は、タンパク質から大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）のコドン選択性を用いて得られる（ルーマン（Ｌｏｏｍａｎ）ら、１
９８７年、ＥＭＢＯＪ．第６巻２４８９頁）。遺伝子カセットに挿入する抗
原配列は、ＮＰ（１４７−１６１，ＴＹＱＲＴＲＡＬＶＲＴＧＭＤＰ；５５−６
９（配列番号２０），ＲＬＩＱＮＳＬＴＩＥＲＭＶＬＳ（配列番号２１））およ
びＨＡ（９１−１０８，ＳＫＡＦＳＮＣＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬ（配列番号２２
））からのエピトープに対応する。複合エピトープワクチンは、ブラミアニュ（
Ｂｒｕｍｅａｎｕ）ら、１９９７年によって報告されているように、Ｔ−Ｂエピ
トープから成るものとして構築することもできる（ＨＡ１１０−１２０／ＨＡ
１５０−１５９，ＳＦＥＲＦＥＩＰＫＥＧＧＷＬＴＥＫＥＧＹＳＰ（配列番号
２３）（ブラミアニュ（Ｂｒｕｍｅａｎｕ）、１９９７年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
第７１巻５４７３頁）。適当な配列が得られたところで、重複オリゴヌクレオ
チドの合成、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲおよびライゲーションによって、
ＩＮＦＶ−ＨＤをコードする合成遺伝子を会合させる。会合したＩＮＦＶ断片を
コードする全長遺伝子は、ＰＣＲによって増幅し、発現プラスミド内にライゲー
ションする。最終遺伝子は、ＤＮＡの配列決定を行うことにより確認する。

【００６９】ＩＮＦＶ−ＨＤを含むプラスミドを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転
換する。細菌をアンピシリン（５０ｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地中、３７℃で
対数中期まで培養する。この時点でＩＰＴＧを加えてｔｒｐ／ｌａｃハイブリッ
ドプロモーターを誘導する。ＩＮＦＶ−ＨＤタンパク質の最適な誘導後発現を決
定するために、１時間ごとに経時変化を調べる。最適な発現が認められた時点で
、遠心分離によって細胞を集菌する。細胞ペレットを溶菌し、遠心分離する。溶
菌液中にタンパク質が存在するかどうかを検定する。ＩＮＦＶ−ＨＤタンパク質
は、固体支持体に結合されたニッケルへの選択的親和性によって精製する。必要
であれば、サイズ排除、イオン交換または疎水的相互作用クロマトグラフィーを
用いて、ＩＮＦＶ−ＨＤをさらに精製する。

【００７０】ウィルス感染モデルワクチンの効力を証明するために用いるＩＮＦＶ株は、ＰＲ８と呼ばれるＡ／
ＰＲ／８／３４ウィルスの再構築ウィルスである。ウィルスは、１０〜１２日齢
のニワトリの孵化卵に尿膜接種を行い、ロッカー内で３７℃で４０〜４８時間イ
ンキュベートし、４℃で２０〜２４時間インキュベートすることにより培養し、
尿膜液から回収する。９６ウェルマイクロタイタープレー内で０．５％ニワトリ
赤血球を用いてウィルス血球凝集反応検定を行い、ウィルス保存液の血球凝集単
位（ＨＡＵ）／ｍｌを決定する。

【００７１】ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおいては、１２００ＨＡＵのＰＲ８株をメトファ
ン麻酔したマウスにマイクロピペッタの無菌チップで鼻腔内注入すると（２０
ｌ）、４日目までに、運動性の減少、グルーミングの欠如、２０％の体重減少お
よび２週間以内の死亡率を含む顕著な感染の兆候が現れた。９６ウェルマイクロ
タイタープレート内で５０％終点によって実施されるＭＤＣＫ細胞溶解検定によ
り、感染４日後に調製した肺ホモジネート中に感染ウィルスが高い力価で存在し
ていることが見いだされた。

【００７２】ワクチン接種処置とウィルス抗原に対する免疫反応の誘導の試験ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（６−８週齡）に対し、１、４および８週目にワクチン
調製物または緩衝液を皮下注射する。注射部位に肉芽腫の発症などの副作用が見
られないかどうか観察する。動物を鼻腔内経路を介してワクチンで免疫する場合
、それらの動物をハロタンで麻酔し、試験物（１０〜２０ｌ）を吸息のための
外鼻孔にマイクロピペッタに装着した無菌チップを用いて投与する（ガリチャン
（Ｇａｌｌｉｃｈａｎ）ら、１９９３年、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．第１６８
巻６２２頁）。

【００７３】肺組織におけるＩＮＦＶＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ検出ウィルス感染を予防するための免疫化の効果を立証するために、ウィルス攻撃
から４日後に採取した実験動物の肺に対してＩＮＦＶＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ検
出を行う。マウスから採取した肺試料を急速凍結し、粉砕し、凍結粉末を評価の
ために処理するまで−７０℃で保存する。全ＲＮＡの単離およびウィルスＲＮＡ
のためのＲＰ−ＰＣＲ分析は、前述の技術に改良を加えて行う（チョムチンスキ
ー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｙ）ら、１９８７年、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．第１６２巻１５６頁、シャーワン（Ｓｈｉｒｗａｎ）ら、１９９３年、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５１巻５２２８頁、レークマン（Ｌａｋｅｍａｎ）
とホイットリー（Ｗｈｉｔｌｅｙ）、１９９５年、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．
第１７１巻８５７頁）。使用するプライマーは、インフルエンザウィルスＡのマ
トリックス遺伝子（断片７）に特異的なものである（アットマー（Ａｔｍａｒ）
ら、１９９６年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第３４巻２６０４
頁）。ＲＴ−ＰＣＲ検定は、チタン・ワン・チューブＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｔ
ｉｔａｎＯｎｅＴｕｂｅＲＴ−ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ）（ベーリンガーマ
ンハイム社，インディアナ州インディアナポリス所在）の試薬およびプロトコー
ルを使用して行う。簡単に説明すると、１ｐｇから１ｇの全ＲＮＡ鋳型を、０
．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．４ＭアンチセンスプライマーＦＡＭ１（５’−Ｃ
ＡＧＡＧＡＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣ−３’）（配列番号２４））、
０．４Ｍセンスプライマー、ＦＡＭ２（５’−ＧＣＴＣＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴ
ＡＴＴＴＧＧＡ−３’）（配列番号２５）、５ｍＭＤＴＴ、５ＵＲＮａｓｅ
阻害剤、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、およびＡＭＶ／Ｅｘｐａｎｄ高忠実度酵素酵
素（ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙｅｎｚｙｍｅ）の存在下に、以下の条件でイ
ンキュベートする。６０℃３０分間、９４℃２分間のサイクルを１サイクル、９
４℃３０秒間、５５℃３０秒間、６８℃４５秒間、のサイクルを１０サイクル、
各サイクルごとに５秒間延長した９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、６８℃４５
秒間のサイクルを２５サイクル、次に６８℃７分間のサイクルを行う。陽性の結
果は、臭化エチジウムによって染色され、ＵＶライトボックス（ＢｉｏＲａｄ
ＧｅｌＤｏｃ１０００）によって写真撮影された１．５％ＮｕＳｉｅｖｅア
ガロースゲル（ＦＭＣバイオプロダクツ社（ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）
，メリーランド州ロックヴィル所在（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ））中の２１２
ｂｐの可視バンドに基づく。この方法は、ウィルスＤＮＡの存在の測定に対して
感受性が高く非常に特異性があることが示されている（レークマン（Ｌａｋｅｍ
ａｎ）とホイットリー（Ｗｈｉｔｌｅｙ）、１９９５年、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉ
ｓ．第１７１巻８５７頁）。

【００７４】ＨＡ１ドメインの配列ＨＡ１ドメイン（断片４）の配列は、ＲＴ−ＰＣＲ反応におけるウィルスＲＮ
ＡからのＨＡ１ドメインを増幅し、次に１１００ｂｐ産物を配列決定のためにサ
ブクローニングし、ジデオキシヌクレオチドターミネーション法を用いて配列決
定することによって解明することができる。ＲＴ−ＰＣＲ検定は、上述のように
チタン・ワン・チューブＲＴ−ＰＣＲ系を用いて行うが、以下の点が異なってい
る。増幅プライマーがｃＤＮＡプライマー（５’−ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧ
ＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣ−３’）（配列番号２６）およびＰＣＲプライマー（
５’−ＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＡＴＧＧＣＴＣＣ−３’）（配列番号２７
））（フィファラ（Ｐｙｈａｌａ）ら、１９９５年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．第７６巻２０５頁）であり、条件は、６０℃３０分間、９４℃２分間のサ
イクルを１サイクル、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、６８℃４５秒間のサイ
クルを１０サイクル、各サイクルごとに５秒間延長した９４℃３０秒間、６０℃
３０秒間、６８℃４５秒間のサイクルを２５サイクル、次に６８℃７分間のサイ
クルを行う。１１００ｂｐ産物を配列決定のためにＴＡＰＣＲ２．１クロー
ニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブ
クローニングする。配列決定は、ＡｕｔｏＣｙｃｌｅキット（アマーシャムファ
ルマシアバイオテク社、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）からのプロト
コールおよび試薬を用いて行い、結果は、ＡＬＦＥｘｐｒｅｓｓキット（アマー
シャムファルマシアバイオテク社、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）配
列決定装置で泳動して、ＡＭソフトウェアｖ．３．０２キット（アマーシャムフ
ァルマシアバイオテク社、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）を用いて解
析する。

【００７５】ＥＬＩＳＡによる抗体反応の測定ワクチン接種処置を行っている間の一定期間おきに、ウィルス抗原に対するマ
ウスの免疫反応を測定する。抗原性エピトープを含むリポソームは以前に開示さ
れているように（ツソ（Ｔｕｓｏ）ら、１９９３年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔ
ｉｏｎ第５５巻１３７５頁）抗体／ＥＬＩＳＡ検定のためのターゲットとして
も用いられる。後者の検定の結果は抗体の結合レベルおよびアイソタイプ構成を
測定するために用いられることになる。

【００７６】抗原誘導性Ｔ細胞増殖ＩＮＦＶ抗原に対する宿主の感作は、抗原誘導性Ｔ細胞増殖検定によって測定
する。ワクチン接種したマウスから脾臓を取り出し、無菌プランジャによって穏
やかに分解し、細胞をナイロンスクリーンメッシュに押し通すことによって脾臓
ホモジネートを調製する。細胞を１０％ＦＣＳ、１０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液、Ｌ
−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（２５ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン
（２５ｇ／ｍｌ）、およびゲンタマイシン（８０ｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ
１６４０培地中に懸濁する。細胞を９６ウェルＵ底プレート中、抗原に対応する
化学合成ペプチド（５ｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、１×１０⁶細胞／
ｍｌの濃度で、５％ＣＯ₂存在下に４日間培養する。培養物を２０ｌのリサズ
リン色素で３時間パルス標識し、ＣｙｔｏｆｌｕｏｒＩＩ（パースペクティブバ
イオシステムズ社、マサチューセッツ州ファーミントン所在）上で蛍光を測定す
る。

【００７７】抗ＩＮＦＶＣＴＬ反応ワクチン接種後、脾臓Ｔ細胞中に抗原特異的細胞障害Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が
存在するかどうかについて調べる。脾臓リンパ球は前述のようにして得られる。
それぞれの処理群から得られるリンパ球をプールし（ｎ＝５）、１２ウェル培養
プレート中、１０⁷細胞／ウェルの濃度で抗原の非存在下に３日間培養する。Ｐ
８１５肥満細胞腫またはＬ５１７８リンパ腫（Ｈ２^d）標的細胞（ＡＴＣＣ）を
、Ｈ２^d制限細胞に対するＩＮＦＶＮＰＣＴＬエピトープ（アミノ酸１４７
−１５８）に対応するペプチドとともにインキュベートし、３７℃で４時間イン
キュベートする。標的細胞を洗浄し、１×１０⁴個の細胞を含む１００μｌ力価
を各ウェルに加える。エフェクターリンパ球を洗浄し、様々な濃度でウェルに加
え、３７℃で４時間培養する。ＣｙｔｏＴｏｘ９６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，
ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）を用いて、特異的溶菌百分率を、標準的なＥＬＩＳＡプ
レート読取装置（ＨＴＳ７０００＋ＢｉｏＡｓｓａｙＲｅａｄｅｒ、Ｐｅ
ｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）において測定される上清
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）から４９０ｎｍにおける吸光度を記録すること
により計算する。ＨＳＶ２−抗原特異的溶菌の決定は、標準的な基準に従ってお
こなう。データは、特異的溶菌百分率＝１００×［（実験値−エフェクター自発
溶菌−標的細胞自発溶菌）／（標的細胞最大値−標的細胞自発溶菌）］として表
される。実施例５−型決定不能（ｎｏｎｔｙｐａｂｌｅ）Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｎ
ＴＨｉ）およびｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈｉｂ）ＮＴＨｉタンパク質のクローニングＰ６をコードする全長遺伝子を、Ｐ６ｍＲＮＡ（ダイク（Ｄｅｉｃｈ）ら、１
９８８年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７０巻４８９頁、ネルソン（Ｎｅ
ｌｓｏｎ）ら、１９８８年、Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．第５６巻１２８頁、ルー
マン（Ｌｏｏｍａｎ）ら、１９８７年、ＥＭＢＯＪ．第６巻２４８９頁）の
ＲＴ−ＰＣＲ増幅によってＮＴＨｉ株から得る。増幅は、チタン・ワン・チュー
ブＲＴ−ＰＣＲシステム（ＴｉｔａｎＯｎｅＴｕｂｅＲＴ−ＰＣＲＳｙ
ｓｔｅｍ）（ベーリンガーマンハイム社，インディアナ州インディアナポリス所
在）の試薬およびプロトコールを使用して行う。簡単に説明すると、細菌を０．
２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．４ＭアンチセンスプライマーＨ−ＩｎｖｆＰ６ＡＳ
（５’−ＧＡＧＴＣＣＧＣＴＧＣＴＣＴＡＣＣＡＡＣ−３’）（配列番号２８）
）、０．４Ｍセンスプライマー、Ｈ−ＩｎｖｆＰ６Ｓ（５’−ＡＡＴＴＴＣＣ
ＡＧＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＡ−３’）（配列番号２９）、５ｍＭＤＴＴ、５Ｕ
ＲＮａｓｅ阻害剤、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、およびＡＭＶ／Ｅｘｐａｎｄ高
忠実度酵素の存在下に、以下の条件でインキュベートする。６０℃３０分間、９
４℃２分間のサイクルを１サイクル、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、６８℃
４５秒間、のサイクルを１０サイクル、各サイクルごとに５秒間延長した９４℃
３０秒間、５５℃３０秒間、６８℃４５秒間のサイクルを２５サイクル、次に６
８℃７分間のサイクルを行う。陽性の結果は、臭化エチジウムによって染色され
、デジタル撮像システム（ＢｉｏＲａｄＧｅｌＤｏｃ２０００）によって
写真撮影した１．０％ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル（ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）中の８６７ｂｐの可視バンドに基づく
。配列決定を行う目的で、ＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（インビトロジ
ェン社、カリフォルニア州カールズバド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在）試薬および
プロトコールを用いてＴＡ２．１ベクターにサブクローニングする。スモールス
ケールでのプラスミド調製を標準的なアルカリ溶菌法（マニアティス（Ｍａｔｉ
ａｔｉｓ）、１９８９年、分子クローニング−実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、第２版
、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッツ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、マニアテ
ィス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、コールドスプリングハーバー研究所出版、ＮＹ、１
２５頁）を用いて行う。ＰＣＲ産物インサートの配列は、ＡｕｔｏＣｙｃｌｅキ
ット（アマーシャムファルマシアバイオテク社、ニュージャージー州ピスカタウ
ェイ所在）からのプロトコールおよび試薬を用いた従来のジデオキシターミネー
ション法により行い、結果は、ＡＬＦＥｘｐｒｅｓｓキット（アマーシャムファ
ルマシアバイオテク社、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）配列決定装置
上で泳動して、ＡＭソフトウェアｖ．３．０２キット（アマーシャムファルマシ
アバイオテク社、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）を用いて解析する。

【００７８】ＮＴＨｉ（Ｐ６）−ＨＤの調製Ｐ６をコードする遺伝子が得られたところで、重複オリゴヌクレオチドの合成
、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲおよびライゲーションによって、ＮＴＨｉ（
Ｐ６）−ＨＤをコードする合成遺伝子を会合させる。ＨＤ断片はグリシンとセリ
ンから成るリンカーを介してタンパク質のＮまたはＣ末端のいずれかに付加され
る。これにより、我々は抗原に対するＨＤの相対位置が免疫系によるプロセッシ
ングにもたらす効果を試験することが可能になる。会合したＮＴＨｉ（Ｐ６）−
ＨＤ断片をコードする全長遺伝子をＰＣＲによって増幅し、発現プラスミド内に
ライゲーションする。最終的な遺伝子は、ＤＮＡの配列決定を行うことにより確
認する。

【００７９】ＮＴＨｉ（Ｐ６）−ＨＤを含むプラスミドを用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
の形質転換細菌をアンピシリン（５０ｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地中、３７℃で対数中
期まで培養する。この時点でＩＰＴＧを加えてｔｒｐ／ｌａｃハイブリッドプロ
モーターを誘導する。ＮＴＨｉ（Ｐ６）−ＨＤタンパク質の最適な誘導後発現を
決定するために、１時間ごとに経時変化を調べる。最適な発現が認められた時点
で、遠心分離によって細胞を集菌する。細胞ペレットを溶菌し、遠心分離する。
溶菌液および細胞ペレットにタンパク質が存在するかどうかを検定する。１〜２
％のデオキシコール酸ナトリウム溶液を用いてＮＴＨｉ（Ｐ６）−ＨＤを溶菌細
胞ペレットから抽出する。ＮＴＨｉ（Ｐ６）−ＨＤタンパク質は、固体支持体に
結合されたニッケルへの選択的親和性によって精製する。必要であれば、サイズ
排除、イオン交換または疎水的相互作用クロマトグラフィーを用いて、ＮＴＨｉ
（Ｐ６）−ＨＤをさらに精製することもできる。

【００８０】リポソームの調製安定なＮＴＨｉ（Ｐ６）−ＨＤリポソームを調製するためには３つの主要な方
策がある。まず１つ目としては、タンパク質と脂質とを有機溶媒（クロロホルム
／メタノール）中に一緒に溶解して、乾燥させて薄いフィルムを得るというよう
にしてリポソームを調製するものである。水性緩衝液に再懸濁すると、脂質とタ
ンパク質が会合して大きな二重膜構造をとる。この懸濁液に超音波処理を行い、
小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）を作る。タンパク質が小さく設計される場合には
、この方法は有用である。しかしながら、これらの実験については、タンパク質
を変性させてしまう可能性からタンパク質を厳しい溶媒条件にさらすことが望ま
しくないかもしれない。したがって、不要なコンホメーション変化を避けるため
に、脂質フィルムの水和に先立ってＮＴＨｉ（Ｐ６）−ＨＤを再懸濁緩衝液に可
溶化することを包含する第２の方法を用いることができる。脂質による水和が起
こると、タンパク質は自発的に新しく形成された膜に結合し、超音波処理の間に
ＳＵＶの二重膜に組み込まれる。第３の方法は、ＮＴＨｉ（Ｐ６）−ＨＤタンパ
ク質を含まないリポソームを調製してから、該タンパク質を予め形成しておいた
ＳＵＶに加えて、ＨＤが脂質二重膜に組み込まれるようにすることを含む方法で
ある。リポソームは以前に述べられた手順（フジイ（Ｆｕｊｉｉ）ら、１９９７
年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３４巻４９５９頁）に従ってプローブ超音波
処理によって調製される。簡単に説明すると、脂質（タンパク質を有するか、あ
るいは有しない）をクロロホルム／メタノールなどの有機溶媒中に溶解する。脂
質溶液のアリコートを丸底試験管内にピペットで滴下し、溶媒を窒素ガス流下、
６５℃で蒸発させることにより、薄い脂質フィルムが形成される。この膜を少な
くとも８時間真空下に放置して残留有機溶媒を除去する。あるいは、所望の組成
の脂質粉末を噴霧乾燥などの技術によって調製し、脂質フィルムの代わりに使用
してもよい。リポソームの調製は、脂質フィルムまたは粉末を緩衝液中に水和さ
せ、６５℃で５〜１０分間懸濁液をインキュベートしてから、プローブ超音波処
理を行うことによって達成される。次にリポソームを０．２２ｍフィルタに通
して濾過し、調製物を無菌化する。リポソームを動的光散乱により分粒し、凝集
体の形成を少なくとも４週間にわたって追跡する。ＮＴＨｉ（Ｐ６）−ＨＤタン
パク質のコンホメーションは保存される必要があるかもしれない。したがって、
リポソームを調製するために使用されうる３つの方策のなかでは、タンパク質を
水和溶液の成分として加えるか、あるいは、予め形成しておいたリポソームに加
えるかのいずれかが好ましいと我々は予測している。

【００８１】細菌株ＮＴＨｉ９３３３株（髄液分離株）、３５０５６（上気道感染分離株）、４３
０９５（中耳炎分離株）、４９７６６（肺膿瘍分離株、抗菌物質感受性試験のた
めの参照）（ＡＴＣＣ）、およびＨｉｂ株５１６５４（ＡＴＣＣ）を用いて、細
菌感染モデルにおける効力を実証した。使用に先立って、生物体の凍結ストック
を、ＮＡＤ（２ｇ／ｍｌ）およびヘム（１０ｇ／ｍｌ）を添加した新鮮な脳
−心臓混合培地中で継代培養し、１０％二酸化炭素存在下、３７℃で２４時間イ
ンキュベートする。４８０ｎｍでの濁度に対するコロニー形成単位を示した各生
物体に対する標準曲線を用いて、殺菌性検定または腹腔内攻撃用量のいずれかに
必要な細菌接種量を調節する。

【００８２】ワクチン接種処置と細菌抗原に対する免疫反応誘導の試験幼ラットの各群（１群あたりｎ＝６）に対し、出生後５，１２，１９および２
６日目、あるいは５および２６日目に、ワクチン調製物または緩衝液による免疫
を行う。ラットの全身ワクチン接種は、リポソームワクチンの皮下注射によって
行う。動物を鼻腔内経路を介してワクチンで免疫する場合、それらの動物をハロ
タンで麻酔し、試験物（１０〜２０ｌ）を吸息のための外鼻孔にマイクロピペ
ッタに装着した無菌チップを用いて投与する（ガリチャン（Ｇａｌｌｉｃｈａｎ
）ら、１９９３年、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．第１６８巻６２２頁）。幼ラッ
トは授乳母ラットと一緒に収容し、ワクチン接種に対しての副作用、たとえば接
種部位における肉芽腫の形成、赤化または瘡蓋などについて観察する。最後のワ
クチン接種から１週間後、幼ラットをハロタンで麻酔し、心臓穿刺によって血液
を回収し、粘膜分泌物を回収するために粘膜通路を生理食塩水で洗浄する。動物
を二酸化炭素で安楽死させる。血清および粘膜液の殺菌性抗体力価は以下のよう
にして測定する。

【００８３】腹腔内攻撃実験のために、幼ラット（２６日齢）を細菌によって攻撃し、同ラ
ットの血液とＣＳＦを観察して、細菌負荷をワクチン接種していないラットの場
合と比較する。攻撃２日後の細菌についての血液およびＣＳＦをサンプリングし
たところ、動物には顕著な細菌負荷がみられることが示される（すなわち、１×
１０⁴ＣＦＵ／ｍｌ血液、１×１０⁴ＣＦＵ／ｍｌＣＳＦ）。ワクチン接種した２
６日齢のラットから得た高い力価の殺菌性抗体を含む血清を６日齢のラットの静
脈内投与する。翌日、幼ラット（ｎ＝１０）に、以下に示すようにＮＴＨｉを腹
腔内投与する。幼ラットの罹患率と死亡率について観察し、生存したラットを２
６日後に安楽死させ、ＮＴＨｉの存在を調べるために血液とＣＳＦを回収して、
培養する。

【００８４】ＮＴＨｉによる腹腔内攻撃ｉｎｖｉｖｏ継代培養されたＮＴＨｉの２４時間培養物を５×１０⁷〜５×
１０⁹ＣＦＵ／ｍｌに調整し、この培養物１００μｌを５〜１０日齢のラットに
腹腔内注射する（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９７３年、Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ
．第８巻２７８頁）。攻撃された幼ラットは接種後も授乳母ラットと一緒にし
ておく。幼ラットの少なくとも９０％が、攻撃から１８〜９６時間以内にこの用
量の継体培養細菌によって死亡する。

【００８５】ＥＬＩＳＡによる抗原特異的抗体反応の測定各ラットから得た血清および粘膜試料について、Ｐ６抗原に特異的なＩｇＧお
よびＩｇＡに対しての試験を行う。クローン化された野生型Ｐ６またはＮＴＨｉ
（Ｐ６）−ＨＤタンパク質を適切に処理された９６ウェルプレートに加え、室温
で一晩培養する。プレートを重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解した１％ウシ血
清アルブミンで、３７℃で３０分間ブロックする。次に、プレートを０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳでリンスする。各血清および粘膜試料の希釈液を抗原で
コートしたプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートし、インキュベート
終了時にＴｗｅｅｎ／ＰＢＳ緩衝液でリンスする。ラットＩｇＧまたはＩｇＡに
特異的なアルカリホスファターゼに結合された抗体をウェルに加え、３７℃で１
時間おく。次にウェルをＴｗｅｅｎ／ＰＢＳ緩衝液でリンスし、ジエタノールア
ミン緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解したＰＮＰＰ基質をウェルに加えて比色反応を
開始させる。反応は０．７５Ｎ水酸化ナトリウムによって停止させ、Ｓｐｅｃｔ
ｒａｍａｘＥＬＩＳＡプレート読取装置において４０５ｎｍにおける値を読み取
る。９６ウェルプレート上にコートされ、上述のように処理されたラットＩｇＧ
またはＩｇＡの既知の濃度の対照試料から得られる標準曲線より、ラットＩｇＧ
およびＩｇＡの濃度を計算する。

【００８６】殺菌性抗体の検定殺菌性抗体の存在を調べる血清試料を５６℃で３０分間インキュベートして、
補体を不活性化する。試験血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に連続希釈
する。２４時間細菌培養物を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有し、０．１
５ｍＭＣａＣｌ₂および１ｍＭＭｇＣｌ₂を含むＰＢＳから成る無菌ＰＣＭ緩
衝液中に５×１０⁴ＣＦＵ／ｍｌとなるように調整する。ワクチン接種していな
い幼ラットからの血清を補体供給源とする。この血清をプールし、アリコートに
分割し、使用時まで−７０℃で保存する。細菌（２０ｌ）、連続希釈した血清
（２０ｌ）、補体（２０ｌ）、および４０ｌのＰＣＭ緩衝液に溶解した１
％ＢＳＡを９６ウェルクラスタープレートに各ウェルに加える。初期細菌濃度を
決定するために、試料混合液の１０ｌアリコートを時間ゼロにおいて、栄養寒
天を含み、ＮＡＤおよびヘムを添加した新鮮なＢＨＩ寒天平板にプレーティング
する。反応混合物を１０％二酸化炭素存在下、３７℃で１時間振盪しながらイン
キュベートした後、各ウェルから１０ｌを２枚にプレーティングし、１０％の
二酸化炭素存在下、３７℃で一晩インキュベートしてＣＦＵ／ウェルを決定する
。対照は、補体のみでは細菌を殺すことがないことを確認するために血清を含ま
ないウェルと、試験試料中の血清補体が十分に不活性化されていたことが確かめ
るために試験血清は含むが補体は含まないウェルとを含む。全ての検定は３回ず
つ行い、細菌を５０％殺す希釈液を用いて異なる血清間での活性を比較する。実施例６−Ｃ型肝炎ウィルスＣＨＯ細胞におけるＨＣＶ（Ｅ２／ＮＳ１）−ＨＤおよびＨＣＶ（Ｅ２／ＮＳ
１ΔＨＶＲ１）−ＨＤの調製ＨＣＶＥ２／ＮＳ１タンパク質のヌクレオチド配列は、ＨＣＶの株のＰＣＲ
増幅から以下のようにして得られる。膜貫通領域を除く、Ｅ２／ＮＳ１遺伝子の
最初の２１ｂｐに対応する５’プライマーＣＡＡＡＣＣＡＴＧＡＴＣＧＣＣＣＡ
ＣＧＧＡ、および６２２〜６２８残基に対応する３’プライマー、ＧＡＡＧＴＴ
ＧＡＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＴＡを用いる（コックレル，Ｌ（Ｃｏｃｑｕｅｒｅ
ｌ）ら、１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（３）、２１８３〜２１９１頁
）。さらに、各プライマーを適当な制限部位によって平滑にする。ＰＣＲ産物を
遺伝子カセットプラスミドとしてＨＤドメインを含むｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ中
にライゲーションする（インビトロジェン社，カリフォルニア州サンディエゴ所
在）。ＨＣＶ（Ｅ２／ＮＳ１ΔＨＶＲ１）−ＨＤは、３８４残基から４１０残基
までの最初の２７アミノ酸に対応するＥ２／ＮＳ１遺伝子のＨＶＲ１を欠失させ
ることにより構築する。欠失変異体は、野生型の対照のために用いる５’プライ
マーＣＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣおよび同３’プライマーを用
いたＰＣＲ増幅によって作成する。最終遺伝子はＤＮＡ配列決定により確認する
。プラスミドは、製造者の推奨するプロトコールによってリポフェクション試薬
（リポフェクタミン、（ギブコ／ＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ），メリーラン
ド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）所在）を用いてＣＨＯ細
胞（ディーン（Ｄｅｅｎ）Ｋ．Ｃ．ら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ第３３１巻
８２頁）（ＡＴＣＣ，メリーランド州ロックヴィル所在）にトランスフェクショ
ンする。安定なトランスフェクタントをＧ４１８（（ギブコ／ＢＲＬ社，メリー
ランド州ゲーサーズバーグ）を用いて選択し、限界希釈によりクローン化する。
タンパク質を高生産するクローンをウェスタンブロット分析により評定する。Ｈ
ＣＶ（Ｅ２／ＮＳ１）−ＨＤおよびＨＣＶ（Ｅ２／ＮＳ１ΔＨＶＲ１）−ＨＤタ
ンパク質は、固体支持体に結合されたニッケルに対する選択的親和性により精製
する。ヒスチジンリンカーは、精製終了後にエンテロキナーゼ切断によって除去
する。必要であれば、サイズ排除、イオン交換、あるいは疎水的相互作用クロマ
トグラフィーを行って、ＨＣＶ（Ｅ２／ＮＳ１）−ＨＤおよびＨＣＶ（Ｅ２／Ｎ
Ｓ１ΔＨＶＲ１）−ＨＤタンパク質をさらに精製する。

【００８７】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＨＣＶ（Ｅ２／ＮＳ１）−ＨＤおよびＨＣ
Ｖ（Ｅ２／ＮＳ１ΔＨＶＲ１）−ＨＤタンパク質の調製選択されたエピトープのヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコ
ドン選択性を用いて得られる（ルーマン（Ｌｏｏｍａｎ）、１９８７年、ＥＭＢ
ＯＪ．第６巻２４８９頁）。遺伝子カセットに挿入する抗原配列は、ＮＰ（１４７−１６１，ＴＹＱＲＴＲＡＬＶＲＴＧＭＤＰ、５５−６９，ＲＬＩＱＮＳＬＴＩＥＲＭＶＬＳ）およびＨＡ（９１−１０８，ＳＫＡＦＳＮＣＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬ）からのエピトープに対応する。適当な配列が得られたところで、適
当な制限部位によって平滑にされたＨＣＶ−ＨＤをコードする遺伝子を、重複オ
リゴヌクレオチドの合成、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションによっ
て会合させる。簡単に説明すると、断片同士の会合は６５℃まで加熱し、オリゴ
ヌクレオチドをそれらが室温に戻る際にアニールさせることによって達成される
。氷上で２分間保持した後、それらの断片をＤＮＡリガーゼによってライゲーシ
ョンする。会合したＨＣＶ断片をコードする全長遺伝子はＰＣＲで増幅し、制限
酵素によって切断し、ゲル電気泳動によって単離する。そしてＨＣＶ遺伝子を、
同様に切断されたＨＤ遺伝子を含む発現プラスミド（たとえばＰＴｒｃＨｉｓま
たはｐＱＥ３０）内にライゲーションする。最終遺伝子はＤＮＡ配列決定により
確認する。

【００８８】ＨＣＶ−ＨＤを含むｐＴｒｃＨｉｓプラスミドを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）を形質転換する。細菌をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地
中、３７℃で対数中期まで培養する。この時点でＩＰＴＧを加えてｔｒｐ／ｌａ
ｃハイブリッドプロモーターを誘導する。ＨＣＶ−ＨＤタンパク質の最適な誘導
後発現を決定するために、１時間ごとに経時変化を調べる。最適な発現が認めら
れた時点で、遠心分離によって細胞を集菌する。細胞ペレットを溶菌し、遠心分
離する。溶菌液中にタンパク質が存在するかどうかを検定する。ＨＣＶ−ＨＤタ
ンパク質は、固体支持体に結合されたニッケルへの選択的親和性によって精製す
る。必要であれば、サイズ排除、イオン交換または疎水的相互作用クロマトグラ
フィーを用いて、ＨＣＶ−ＨＤをさらに精製することもできる。

【００８９】リポソームの調製とワクチン接種処置、免疫反応誘導試験、ＥＬＩＳＡ抗体反
応測定、ＤＴＨ検定、サイトカイン特異的ｍＲＮＡ分析、ＥＬＩＳＡサイトカイ
ン測定、抗原誘導性Ｔ細胞増殖、および抗ＨＩＶＣＴＲ反応は、本質的に上記
実施例３における記載と同様である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＳＶ２に対する防御における本発明のリポソーム組成物の有効
性を示す図。

【図２】本発明のリポソーム組成物の有効性を他のワクチン組成物と比較
した図。

【図３】リポソームＨＳＶ２ｇ（１−２３）−ＨＤの防御免疫反応誘起能
を実証するマウス生存曲線。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者クラマー、ドナルドブィ．アメリカ合衆国 91301 カリフォルニア州アグワラヒルズロボキャニオンロード 31115 (72)発明者アーンスト、ウィリアムエイ．アメリカ合衆国 90025 カリフォルニア州ウェストロサンゼルスバトラーアベニュー 1844 ナンバー14 (72)発明者アドラー−ムーア、ジルアメリカ合衆国 91001 カリフォルニア州アルタデーナイーストロマアルタドライブ 1221 (72)発明者ペリー、エル．ジーンアメリカ合衆国 90046 カリフォルニア州ロサンゼルスティアナロード 8128 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 BB11 CC35 EE41 4C085 AA03 CC21 DD86

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫原性リポソーム組成物であって、小胞形成脂質と、１つ以上の抗原決定基および疎水性ドメインを含む抗原構成物とを含み、疎水
性ドメインが前記リポソーム組成物の膜に結合していることを特徴とする免疫原
性リポソーム組成物。
【請求項２】１つ以上のアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求
項１に記載の免疫原性リポソーム組成物。
【請求項３】抗原構成物は化学的に合成されることを特徴とする請求項１
に記載の免疫原性リポソーム組成物。
【請求項４】疎水性ドメインはペプチドであることを特徴とする請求項１
に記載の免疫原性リポソーム組成物。
【請求項５】疎水性ドメインは約１５個〜約５００個のアミノ酸残基から
成ることを特徴とする請求項４に記載の免疫原性リポソーム組成物。
【請求項６】疎水性ドメインは、Ａｌａ，Ａｓｎ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌ
ｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒ
ｐ，ＴｙｒおよびＶａｌからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むこ
とを特徴とする請求項５に記載の免疫原性リポソーム組成物。
【請求項７】抗原決定基は、ＨＳＶｇＢまたはｇＤ，ＨＩＶｇｐ１２
０，ＣＭＶｇＢ，ＨＣＶＥ２，ＩＮＦＶＨＡまたはＮＡ、およびＨ．ｉｎ
ｆｌｕｅｎｚａｅＰ６からなる群より選択される抗原に由来することを特徴と
する請求項１に記載の免疫原性リポソーム組成物。
【請求項８】抗原構成物は、抗原決定基を疎水性ドメインに連結するリン
カー領域をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の免疫原性リポソーム組
成物。
【請求項９】リンカー領域はペプチドであることを特徴とする請求項８に
記載の免疫原性リポソーム組成物。
【請求項１０】リンカー領域は１個〜約２００個のアミノ酸残基から成る
ことを特徴とする請求項９に記載の免疫原性リポソーム組成物。
【請求項１１】アミノ酸残基は、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｃｙ
ｓ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈ
ｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶａｌからなる群より選択
されることを特徴とする請求項１０に記載の免疫原性リポソーム組成物。
【請求項１２】抗原構成物は融合タンパク質であることを特徴とする請求
項１に記載の免疫原性リポソーム組成物。
【請求項１３】抗原構成物は融合タンパク質であることを特徴とする請求
項９に記載の免疫原性リポソーム組成物。
【請求項１４】免疫原として有効な量の請求項１の組成物を投与すること
を含む、宿主動物内における免疫原反応の誘導方法。
【請求項１５】免疫原として有効な量の請求項２の組成物を投与すること
を含む、宿主動物内における免疫原反応の誘導方法。
【請求項１６】宿主動物は哺乳動物であることを特徴とする請求項１４に
記載の方法。
【請求項１７】哺乳動物はヒトであることを特徴とする請求項１６に記載
の方法。
【請求項１８】宿主動物はトリであることを特徴とする請求項１４に記載
の方法。
【請求項１９】抗原決定基は、ＨＳＶｇＢまたはｇＤ，ＨＩＶｇｐ１
２０，ＣＭＶｇＢ，ＨＣＶＥ２，ＩＮＦＶＨＡまたはＮＡ、およびＨ．ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅＰ６からなる群より選択されることを特徴とする請求項１
７に記載の方法。
【請求項２０】有効量の請求項１の組成物と、薬学的に許容される担体と
を含むワクチン組成物。
【請求項２１】１つ以上のアジュバントをさらに含む請求項２０に記載の
ワクチン組成物。
【請求項２２】免疫原性融合タンパク質をコードする配列を含む発現ベク
ター挿入用ＤＮＡカセットであって、前記タンパク質は、疎水性タンパク質ドメインと、１つ以上の抗原決定基とを含むことを特徴とす
るＤＮＡカセット。
【請求項２３】抗原決定基は、ＨＳＶｇＢまたはｇＤ，ＨＩＶｇｐ１
２０，ＣＭＶｇＢ，ＨＣＶＥ２，ＩＮＦＶＨＡまたはＮＡ、およびＨ．ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅＰ６からなる群より選択される抗原に由来することを特徴
とする請求項２２に記載のＤＮＡカセット。
【請求項２４】疎水性ドメインは約１５個〜約５００個のアミノ酸残基か
ら成るペプチドであることを特徴とする請求項２２に記載のＤＮＡカセット。
【請求項２５】ペプチドは、Ａｌａ，Ａｓｎ，Ｃｙｓ，Ｇｉｎ，Ｇｌｙ，
Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，
ＴｙｒおよびＶａｌからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むことを
特徴とする請求項２４に記載のＤＮＡカセット。
【請求項２６】融合タンパク質は、抗原決定基を疎水性ドメインに連結す
るリンカー領域をさらに含むことを特徴とする請求項２２に記載のＤＮＡカセッ
ト。
【請求項２７】リンカー領域は１個〜約２００個のアミノ酸残基から成る
ことを特徴とする請求項２６に記載のＤＮＡカセット。
【請求項２８】アミノ酸残基は、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｃｙ
ｓ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈ
ｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶａｌからなる群より選択
されることを特徴とする請求項２７に記載のＤＮＡカセット。
【請求項２９】請求項２２のＤＮＡカセットを含むベクター。
【請求項３０】免疫原性リポソーム組成物の製造方法であって、抗原決定基と疎水性ドメインとを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を発
現させることと、小胞形成脂質と融合タンパク質とを適切な有機溶媒中に溶解することと、有機溶媒を蒸発させることによって脂質フィルムまたは噴霧乾燥粉末を形成す
ることと、脂質フィルムまたは粉末を水和させることと、水和した脂質フィルムまたは粉末を分散させて、免疫原性リポソーム組成物を
形成することとを含む方法。
【請求項３１】免疫原性リポソーム組成物の製造方法であって、抗原決定基と疎水性ドメインとを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を発
現させることと、融合タンパク質を水性緩衝液中に溶解することと、脂質粉末または脂質フィル
ムのいずれかを融合タンパク質を含む緩衝液と水和させることと、脂質粉末またはフィルムを分散させて、免疫原性リポソーム組成物を形成する
こととを含む方法。
【請求項３２】免疫原性リポソーム組成物の製造方法であって、抗原決定基と疎水性ドメインとを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を発
現させることと、融合タンパク質を水性緩衝液中に溶解することと、融合タンパク質を予め形成されたリポソームに加えて免疫原性リポソーム組成
物を形成することとを含む方法。
【請求項３３】１つ以上の抗原決定基および疎水性ドメインを含む抗原構
成物と、薬学的に許容される担体とを含む免疫原性組成物。
【請求項３４】抗原構成物は、抗原決定基を疎水性ドメインに連結するリ
ンカー領域をさらに含むことを特徴とする請求項３３に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】１つ以上のアジュバントをさらに含むことを特徴とする請
求項３３に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】小胞形成脂質と、１つ以上の抗原決定基および疎水性ドメインを含む抗原構成物とを含む免疫原
性エマルション組成物。
【請求項３７】抗原構成物が融合タンパク質であることを特徴とする請求
項３６に記載の組成物。