MXPA01002973A - Composiciones de liposoma inmunogenico. - Google Patents

Abstract

Esta invencion divulga una toalla sanitaria sustancialmente plana, es decir, una toalla sanitaria colocada casi exclusivamente dentro del plano x - y, que tiene un miembro capaz de expandir ahi dentro que una vez activado por un usuario femenino, ya sea, densifica en una zona prescrita y/o expande por lo menos una porcion de la toalla sanitaria hacia fuera del plano X - Y y hacia el plano Z para crear asi la giba. Esta activacion ocurre cuando los miembros de cincho son utilizados para contraer al miembro capaz de expandir en las direcciones X y/o Y mientras que causan simultaneamente su densificacion o expansion hacia el plano Z.

Description

COMPOSICIONES D? LIPOSOMA INMUNOGENICO Campo de la invención Antecedentes de la invención El uso de vacunas históricamente ha proporcionado un método seguro y efectivo para proteger grandes poblaciones contra una amplia variedad de enfermedades infecciosas. La inmunización contra organismos virales y otros microbios generalmente es segura y efectiva, y ha sido responsable de la mayor parte del mejoramiento en longevidad experimentado por individuos dentro de las naciones desarrolladas. Sin embargo, pueden presentarse varios efectos colaterales adversos, dependiendo de la naturaleza de la vacuna y del inmunógeno específico. La inactivación inadecuada de virus intactos en el pasado ha conducido a infección no intencional en vez de protección después de la vacunación (Tigertt, 1959, Military Med. 124:342) . Ocasionalmente, la inmunización con organismos intactos, tales como influenza, puede precipitar el desarrollo de enfermedades autoinmunes dirigidas contra tejidos normales tales como el síndrome de Guillain Barre (Langmuir y colaboradores, 1984, J. Epidemiol. 119:841). Además de los mismos agentes, la presencia de sustancias dentro de las células o medios complejos pueden permitir la inducción de severas reacciones alérgicas a proteinas extrañas (Yaraane y Uemura, 1988, Epidem, Inf, 100:291). Ya que los procedimientos de vacunación efectiva frecuentemente requieren inmunizaciones múltiples, estos eventos adversos pueden reducir la efectividad de la vacuna y pueden reducir la aceptación pública del procedimiento de vacunación. Recientemente se han probado técnicas de biología molecular modernas en un intento para proporcionar seguridad y eficacia mejoradas de nuevas preparaciones de vacunas . Las estrategias potenciales actualmente bajo investigación incluyen; vacunas basadas en técnicas de ADN recombinante (Conry y colaboradores, 1994, Cáncer Res, 54:1164; Hu y colaboradores, 1988, J. Virol, 62:176), generación de péptidos sintéticos simples como antígenos (Nardelli y colaboradores, 1992, Vaccines 8:1405; atari y colaboradores, 1987, J. Exp. Med. 165:459), y la inyección directa de material genético en tejidos para estimular las respuestas protectoras (Ulmer y colaboradores, 1993, Science 259:1745). En particular, el uso de antígenos péptidos simples para inducir respuestas de inmunización específicas ha sido el foco de muchos estudios. Esta estrategia es atractiva debido a que tiene el potencial para proporcionar especificidad inmunológica, un control más estrecho de los procesos de fabricación, y eliminación de la mayoría de las fuentes secundarias de materiales o contaminantes asociados con la producción del inmunógeno. El uso de proteínas purificadas o fragmentos de péptidos para la vacunación, sin embargo, depende de la administración del material al sitio de inmunización por un portador de antígeno efectivo. Potencialmente, uno de los portadores más seguros han sido los complejos de vacuna basados en lípido/liposoma. Los liposomas desde hace tiempo se han establecido como una tecnología comercialmente viable debido a que pueden reducir las toxicidades de los fármacos, prolongar la circulación en la corriente sanguínea, y alterar la biodistribución y la farmacocinética de las moléculas de fármacos (Fujii, 1996; Vesicles, ed. M. Rosoff, Marcel Dekker, New York NY, p. 491) . Cuando se administra en vivo, los liposomas circulan en la sangre y son removidos por el sistema fagocítico de monocito/macrófago, particularmente en el hígado, bazo, ganglios linfáticos, y tejidos del pulmón (Claasen, 1996; Vesicles, ed. M. Rosoff, Marcel Dekker, ?ew York ?Y, p. 649) . La capacidad de los liposomas para dirigir el patrón de la distribución antigénica sugiere que un inmunógeno liposomal se expondría máximamente al sistema inmunológico. Hasta la fecha, se han probado varios sistemas basados en lípidos, incluyendo péptidos conjugados a lípidos (?ardelli y colaboradores, 1992, Vaccines 8:1405; Watari y colaboradores, 1987, J. Exp. Med. 165:459), la reconstitución de subunidades de proteína entera en la presencia de lípidos (Morein y Simons, 1985, Vaccines 4:166; Gregoriadis, 1995; Tibtech 13:527), y la asociación de proteínas con liposomas previamente formados (Therien y Shahum, 1989, Immunol. Lett. 22:253; Alving y colaboradores, 1985, Vaccines 4:166) . Aunque se ha demostrado que estas estrategias son inmunológicamente activas, las dificultades técnicas asociadas con la producción a gran escala de las proteínas y sus portadores lípidos, así como las restricciones de costos, las hacen menos atractivas como tecnología comercial . De este modo, se necesita un sistema mejorado o enfoque para preparar antígenos de proteínas para aprovechar el potencial ofrecido por los liposomas en el desarrollo de vacunas. Sumario de la invención La presente invención proporciona una composición de liposoma inmunogénico que comprende lípidos que forman vesículas como una construcción antigénica que comprende uno o más determinantes antigénicos y un dominio hidrofóbico. Preferiblemente, el dominio hidrofóbico se asocia con la membrana de la composición del liposoma. Preferiblemente, el dominio hidrofóbico es un péptido y de acuerdo con una modalidad preferida, consiste en desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 500 residuos de aminoácidos, más preferiblemente menos de aproximadamente 300, y más preferiblemente menos de aproximadamente 50 residuos en donde cuando menos uno o más aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la composición de liposoma inmunogénico además comprende uno o más adyuvantes. Los ejemplos de adyuvantes convenientes incluyen moléculas lipofílicas tales como Lípido A y otros lipopolisacáridos, Quil A, QS21, MF59, P3CSS, MTP-PE, así como moléculas solubles en agua, incluyendo citocinas tales como IL-2, IL-4, IL-12, los interferones, y similares. Otros ejemplos de citocinas se proporcionan en la Tabla 1 más adelante. De acuerdo con otra modalidad de la invención, la construcción antigénica además comprende una región enlazadora que enlaza el o los determinantes antigénicos con el dominio hidrofóbico. En una modalidad preferida, la región enlazadora es un péptido, que consiste de desde 1 hasta aproximadamente 200 residuos de aminoácidos. Preferiblemente, los residuos de aminoácidos se presentan naturalmente como aminoácidos tales como Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y/o Val. La presente invención además proporciona un método para inducir una respuesta inmunogénica en un animal huésped, que comprende administrar una cantidad inmunogénicamente efectiva de una composición de liposoma descrito anteriormente. Aunque el huésped puede ser cualquier animal incluyendo aves, preferiblemente, el animal huésped es un mamífero, y más preferiblemente, un humano. En ciertas modalidades preferidas, la composición de liposoma inmunogénico además comprende uno o más adyuvantes convenientes.

La presente invención además proporciona un cásete de ADN para la inserción en un vector que comprende secuencias que codifican una proteína de fusión inmunogénica, en donde la proteína de fusión comprende un dominio de proteína hidrofóbico y uno o más determinantes antigénicos . La presente invención también proporciona un método para hacer una composición de liposoma inmunogénico que comprende: expresar un gen que codifica una proteína de fusión que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrofóbico; disolver lípidos y la proteína de fusión en un solvente orgánico conveniente o mezcla de solventes orgánicos; formar una película de lípido evaporando el solvente orgánico; hidratar la película de lípido; y dispersar la película de lípido hidratada para formar una composición de liposoma inmunogénico. La presente invención además proporciona un método para hacer una composición de liposoma inmunogénico que comprende: expresar un gen que codifica una proteína de fusión que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrofóbico; disolver la proteína de fusión en un regulador acuoso; hidratar ya sea los polvos de lípidos o las películas de lípidos con el regulador que contiene la proteína de fusión; y dispersar los polvos de lípido o películas para formar una composición de liposoma inmunogénico. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para hacer una composición de liposoma inmunogénico que comprende: expresar un gen que codifica una proteína de fusión que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrofóbico; disolver la proteína de fusión en un regulador acuoso; y añadir la proteína de fusión a liposomas previamente formados para formar una composición de liposoma inmunogénico. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para hacer una composición de emulsión de lípido inmunogénico que comprende: expresar un gen que codifica una proteína de fusión que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrofóbico; y preparar una composición de emulsión de lípido inmunogénico por cualquiera de los métodos descritos anteriormente usando una dispersión de lípido (por ejemplo, de un aceite, tal como aceite de soya) en lugar de los liposomas. En todavía otra modalidad, la presente invención proporciona un método para hacer un liposoma inmunogénico o composición de emulsión de lípido que comprende: sintetizar químicamente una proteína de fusión que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrofóbico; y preparar una composición de emulsión de liposoma o lípido inmunogénico por cualguiera de los métodos descritos anteriormente. Como se usa en la presente, "asociado con la membrana" significa que el dominio hidrofóbico cuando menos está parcialmente inmerso en la membrana de liposoma, y preferiblemente no está enlazado covalentemente con los lípidos que forman vesículas. El dominio hidrofóbico también se puede ligar a una "cola" de ácido graso lípido el cual en sí mismo está sumergido en la membrana. Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra la efectividad de una composición de liposoma de acuerdo con la presente invención para proteger contra HSV2. La Figura 2 muestra una comparación de la efectividad de una composición de liposoma de acuerdo con la presente invención con otras composiciones de vacunas. La Figura 3 muestra una curva de supervivencia de ratones que demuestra la capacidad del HSV2g (1-23) -HD liposomal para provocar una respuesta inmune protectora. Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona un sistema de administración de antígenos diseñada para mejorar la efectividad y seguridad de la inmunización contra una variedad de agentes microbianos y cánceres . El inmunógeno se puede codificar por un cásete de gen que consiste en un dominio hidrofóbico (HD) fusionado a una secuencia de antígeno específica. Un plásmido que contiene las secuencias de ácido nucleico que codifican el dominio hidrofóbico y el epítope antigénico se prepara y expresa en un huésped conveniente, tal como, por ejemplo, E. Coli , P. Pastoris, células de insectos, células COS-1 o células CHO (Genetic Engineering New, 18 : 17 (1998) ) . En cuanto la proteína ha sido expresada y purificada, se formula en un liposoma. En presencia de una membrana, la proteína se asocia con la bicapa lípida para formar una estructura estable con la porción hidrofóbica asociada con la membrana y el epítope antigénico orientado hacia el medio acuoso. El plásmido se puede diseñar técnicamente con sitios de restricción como lugares clave de manera que fácilmente se pueden sustituir diferentes epítopes antigénicos, proporcionando de este modo la capacidad para utilizar diferentes epítopes antigénicos para proporcionar la protección máxima después de la inmunización. Una de las características exclusivas de este cásete es que el componente de proteína se puede producir en las células huésped en grandes cantidades, fácilmente purificar, y luego incorporar en los liposomas. Esto proporciona flexibilidad máxima para determinar el epítope más adecuado que promueva la protección de agentes microbianos o de cánceres, al mismo tiempo que se mantiene la meta final de la preparación a gran escala y la distribución comercial de la vacuna. De este modo, la presente invención proporciona varias ventajas: (1) los epítopes fácilmente se pueden cambiar para proporcionar la máxima flexibilidad en diseño de vacunas; (2) se pueden insertar múltiples epítopes en la molécula portadora; (3) secuencias de antígenos grandes (es decir, proteínas de envoltura o dominios receptores) o subunidades se pueden incluir si se desea y; (4) la proteína portadora expresada es soluble en agua y fácilmente se puede purificar usando métodos de preparación de proteína estándares . La síntesis de la construcción antigénica como un producto de fusión soluble acuoso minimiza los problemas de producción a gran escala potenciales causados por la región hidrofóbica de la proteína. De este modo la construcción de una proteína que posea un dominio hidrofóbico para la inserción de la membrana de liposoma y que todavía sea soluble en agua, sería una ventaja importante. En algunas circunstancias, se puede usar una cantidad menor de agente solubilizante, tal como guanidina, urea, dodeciisulfato de sodio, octil glucosida o desoxicolato, durante el proceso de purificación. La presente invención también proporciona construcciones que comprenden dos o más antígenos. Estas construcciones se pueden representar como: H2N-sitio de antígeno I-HD-sitio de antígeno II - COOH La invención también contempla el uso de hélices de trasmembrana simple derivadas naturalmente o sintéticas, o haces de hélices (2-12) . Los sitios de antígeno se pueden localizar en el término ? o C o situar entre los bucles formados entre las cadenas individuales del haz . El término "antígeno" como se usa en la presente, se refiere a cualquier sustancia (incluyendo una proteína o proteína-polisacárido, lipopolisacárido, subunidad microbiana, patógeno entero, o marcadores de cáncer) que, cuando es extraña al animal huésped, y después de tener acceso al tejido de ese animal, estimula los macrófagos, las células que presentan antígeno y la formación de anticuerpos específicos de antígeno, y reacciones específicamente en vivo o in vi tro con estos anticuerpos. Más aún el antígeno estimula la proliferación y/o la activación de los linfocitos T con los receptores para el antígeno y los antígenos de reacción cruzada (por ejemplo, las células de eliminador natural (NK) , las células citotóxicas T y las células auxiliares T) , y pueden reaccionar con los linfocitos para iniciar la serie de respuestas designadas inmunidad mediada por célula. En las composiciones inmunogénicas de la presente invención se prefiere que el antígeno esté presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 a 20 miligramos/mililitro-HD. Más preferiblemente, el antígeno está presente en una cantidad de aproximadamente 0.5-5 miligramos/mililitro de antígeno-HD. Un "determinante antigénico" es la porción de un antígeno o una porción antigénica que determina su especificidad inmunológica. Comúnmente, un determinante antigénico, o hapten, es un péptido, proteína o polisacárido en antígenos que se presentan naturalmente. En antígenos artificiales, puede ser una sustancia de bajo peso molecular tal como un derivado de ácido arsanílico. Un determinante antigénico reaccionará específicamente en vivo o in vi tro con un anticuerpo o con linfocitos T inducidos por una forma antigénica del determinante antigénico (por ejemplo, el determinante antigénico unido a una sustancia inmunogénica) . Los determinantes antigénicos, que se pueden usar para practicar la presente invención, se pueden derivar de, a manera de ejemplo solamente, los antígenos presentados más adelante : Patógenos virales Virus Antígeno Referencia Lengua azul Estructural urray and Eaton, 1996, Austral. Vct. J. 73: 07 Herpes bovino (D3R) Franz et al., 1996, Veterini Medicina 4!: 2 ¡3 Diarrea de virus bovino E2 Braschke et al., 1997, Vaccipe 15: 1940 Ludeman and Katz, 1994, Biologicals 22: 21 Citomegalovirus'1 gP58 Wagner et al., 1992, J. Virol. 66: 5290 GB Wang ct a!., 1996, J. Inf. Dis. 174: 387 Poliepítope AG Thomson et al., 1996, J. Immupol. 157: ¿22 PrM Fonseca et al., 1994, Vaccine 12: 279 E Fopscca ct al., 1994, Vaccinc 12: 279 E/NSI Venugopal and Gould, 1994, Vaccine 12: 967 NS1/NS2 Green et al., 1997, Virol. 234: 383 Envoltura B Simmons et al., 1998, Am. J. Trop. Med. Hyg.58: 65 Cápsida tipo 4 Gagnon ct al., 1996, J. Virol. 70: 141 Desorden (canino) F/H L'ardo ct al., 1 97. ?m. J. Vct. 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Toxinas Bacterianas* Bacteria Toxina Referencia Bacillus anthracis Ántrax Leppla, 19S2. PNAS 79: 852 Bordadla pertussis Pertusis Weiss and Hewlett, 1986, Ann. Rev. Microbiol. 40: Clostridium botulinum Botulina Simpson, ¡ 981 , Pharmacol. Rev. 33: 155 Clostridium difficile Difícil Kpoop ct al., 1093, Clin. Microbiol. Rev. 6: 251 Clostridium tctani Tétano Eidcls ct al., 19S3, Microbiol. Rev. 47: 596 Coryncbactcrium diphtheriae Difteria Pappcnheimer, 1977, ?nn. Rev. Biochem. 46: 69 Escherichia coli Enterotoxina Gilí and Richardson, 1980, J. Inf. Dis. 141 : 64 Pseudomonas acruginosa Exotoxina A Iglcwski and Kabat, 1977, PNAS 72: 2284 Shigclla dyscnteriac Shiga Kcusch and Jaccwicz, 1975, J. Inf. Dis. 131 : S33 Vibrio cholcrac Cólera F?nkclstcín, 1973, Crit. Rev. Microbiol. 2: 553 * Para una revisión general, véase Middiebrook y Dorland. 1984. p. 199 Patógenos bacterianos Bacteria Antigeno Referencia Bacillus sp PA LF/EF Singh ct al., 1998, Inf. Immun. 66: 3447 Bordetella sp Pcrtactin P.69 Anderson et al., 1996, Vaccine 14: ¡384 Borrelia sp OspA/OspB Ma et al., 1996, Vaccine 14: 1366 OspC Mathicsen et al., 1998, Inf. Immun. 66: 4073 Brucella sp L7 L12 Bachrach et al., 1994, Inf. Immun. 62: 5361 Ompl6 Tibor et al., 1994, Inf. Immun. 62: 3633 Campylobacter sp Omp 18 Konkel et al., 1996, Inf. Imm Chlamydiaf MOMP Sparling et al., 1994, PNAS 91 : 2456 Ehrlichia sp Rikihisa, 1991, Clin. Microbiol. Rev. 4: 286 Escherichia sp PAL Chen and Henning, 1987, Eur. J. Biochem. 163: 73 Haemophilusf sp Pl Loeb, 1987, Inf. Immun. 55: 2612 P2 Munson et al, 1983, J. Clin. Invest. 72: 677 P4 . Green et al., 1991, Inf. Immun. 59: 3191 P5 Munson and GranofT 1985, Inf. Immun. 49: 544 P6 Green ct al., 1990, Inf. Immun. 58: 3272 Protein D ?kkoyunlu ct al., 1 96, Inf. Immu D 15 Tilomas ct l., 1990, Inf. Immun. 58: 1909 Yang ct al., 1998, Inf. Immun. 66: 3349 98 kD protein Kimura et al., 1985, Inf. Immun. 47: 253 HtrA Loosmore et al., 1998, Inf. Immun. 66: 899 Helicobacter pylori Urease A Michetti ct al., 1994, Gastrocnterol. 107: 1002 Urease B Michetti et al., 1994, Gastroenterol. 107: 1002 Vac A Klcanthous et al., 1998, Brit. Med. Bull. 54: 229 Catalase Radcliff et al., 1997, Inf. I mun. 65: 4668 Legionella sp PplA Ludwig et al., 1996, Inf. I mup. 64: 1659 Leptospira sp OMA Brown et al., 1991, Inf. Immun. 59: 1772 Listeria sp LLO Harty and Bevan, 1992, J. Exp. Mcd. 175: 1531 Mycobactcrium ieprae 35kD protein Triccas ct al., 1996, Inf. Itnmun. 64: 5171 l SkD Baumgart ct al., 1996, Inf. I mun. 64: 2274 Ag85? Launois et al., 1994, Inf. Immun. 62: 3679 Mycobacterium tubcrculosum MPB59 Roche et al., 1994, Inf. Immun. 62: 5319 Ag85A Launois et a!., 1994, Inf. Immup. 62: 3679 Mycoplasma 90 kD Franzoso ct al., 1993, Inf. Im un. 61: 1523 Neisscriaf sp OMV Anderson et al., 1997, Vaccine ¡5: 1225 Por Sparling ct al., 1994, PN?S 91 : 2456 Pseudomopas sp OprF Hughes et a!., 1992, Inf. Irnmun. 60: 3497 Oprl Spccht ct al., 1996, Vaccipe 14: 11 i 1 O-polysaccharide Haüino and Pier, 1998, Inf. Immun. 66: 3719 Salmonella sp OMP Por Alurkar and Kanat, 1997, Inf. ¡ mun. 65: 2382 Vi Plotkin and Bouvcrct-LcCam, 1995, Arch. Int. Med.

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Patógenos fúngales Organismo Antígeno Referencia Aspergillus Kurup and Kumar, 1991, Clin. Microbiol. Rev. 4: 439 Candida Pral Setandreu et al., 1998, J. Bacteriol. 180: 282 Coccidioides 48kD protein Kirkland et al., 1998, Inf. Immun. 66: 424 CF Yang et al., 1 97, Inf. Immun.65: 068 PRA Kirkland etal., 1998, Inf. Immun. 66: 3519 Cryptococcus Mitchell and Perfect, 1995, Clin. Microbiol. Rev.8: 515 Histoplasma Decpe, 1997, Clin. Microbiol. Rev. 10: 585 Paracoccidioides brasiliensis Brummer et al., 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6: 89 Pneumocystis carinii GpA Gigliotti et al., 1998, Inf. Immun. 66: 3179 Patógenos Parásitos Organismo Antígeno Referencia Cryptosporidium Current and Garcia, 1991, Clin. MicrobioL Rev. 4: 325 Entamoeba histolytica SREHP (K2) Stanley et al., 1990, PNAS 87: 4976 Ariel Mai and Samuelson, 1998, Inf. Immun. 66: 353 I70kD Lotter et al., 1997, J. Exp. Med. 185: 1793 Giardia lamblia VSP Stager ct al., 1997. Int. J. Parasitol.27: 965 Lcishmania sp gp63 Kahl ct al., 1990, Inf. Immun. 58: 3233 Nramp-1 1998, Inf. Immun. 66: 1910 TSA Webb et al., 1998, Inf. Immun. 66: 3279 Plasmodium sp Proteína 27 kD Contreras et al., 1998, Inf. Immun. 66: 3579 AMA-1 Anderson et al., 1998, Vaccine 16- 240 CS Nardin et al., 1998, Vaccinc 16: 590- prot epítopes 1998, Inf. I mun. 66: 2895 proteína 195 kD Patarroyo et al., 1987, Nature 328: 629 proteína 55 kD Patarroyo et al., 1987, Nature 328: 629 Schistosoma sp proteína 35 kD Patarroyo et al., 1987, Nature 328: 629 Trypanosoma sp Sm28GST Ballone et al., 1987, Nature 326: 149 proteína 56 kD Harth et al., ¡994, Mol. Microbiol. 1 1 : 261 Cánceres** Neoplasma Antígeno Referencia Pecho MUC-1 Colon Dentón et al., 1993, Canc. Lett. 70: 143 CEA Leucemia Conry ct al., 1994, Canc. Res. 54: 1264 BCR/ABL Linfoma Chen ct al., ¡992, PNAS 89: 1468. SelfAg Melanoma Kwak et al., 1992, New Eng. J. Med.327: 1209 MART- 1 Kawakami et al., 1994, PNAS 91: 15 MAGE-1 Traversari et al., 1992, J. Exp. Med. 176- 1453 p97 Ovario Hu et al., 1988, J. Virol. 62: 176 MUC-1 Pancreático Jerome et ai.. 1993, J. Im unol. 151 : 1654 MUC-1 Bashford et al., 1993, Int. J. Canc. 54: 778 Para una revisión general véase Finn, 1993, Curr. Op. Immunol. 5:701.

Ejemplos adicionales de antigenos y patógenos que se pueden usar se encuentran en Milich, 1989 (Adv. Immunol, 45:195), Hoshino y Kaplan, 1994 (Curr. Top. Microbiol. Immunol . 185:179) o Venugopal y Gould, 1994 (Vaccine 12:966). De acuerdo con una modalidad, la subunidad gp 120 del gen env y p27 del gen gag a partir del virus de inmunodeficiencia humana se usan (el virus de inmunodeficiencia humana VIH) . En otra modalidad, el determinante antigénico se puede derivar de un antigeno seleccionado de HSV gD o gB, VIH gpl20, CMV gB, HCV E2, INFV HA o NA, H. Influenza P5 ó P6„ proteína fimbrial y proteína D.

El término "dominio hidrofóbico" (HD) como se usa en la presente, significa cualquier proteína, péptido, lípido o molécula con una región hidrofóbica o estructura que tiene un área superficial mayor de 500 2. Los ejemplos de dominios hidrofóbicos potenciales incluyen cualquier segmento de transmembrana (TM) (por ejemplo, glicoforina A; Tomita y Marchesi, 1975, Proc. Natl . Acad. Sci. EUA 72:2964), el dominio hidrofóbico del citocromo b5 (Taylor y Roseman, 1995, BBA 1278:35), el dominio T de la toxina de difteria (Choe y colaboradores, 1992, ?ature 357:216), el dominio II de Pseudomonas Exotoxina A (Allured y colaboradores, 1986, PNAS 83:1320), el haz de cuatro hélices del transductor sensor de penicilina (Hardt y colaboradores, 1997, Mol. Mocribiol . 23:935), el haz de siete hélices de bacterio-rodopsina (Henderson y Unwin, 1975, ?ature 257:28), el haz de doce hélices de permeasa lac (Kaback y colaboradores, 1997, Curr. Op., Struct. Biol. 7:537) y el dominio formador de poro de la colicina (Parker y colaboradores, 1989, ?ature 357:93). El término "vector" como se usa en la presente se refiere a un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) derivado de un plásmido, cósmido, fagémido o bacteriófago o derivado sintéticamente, en el cual los fragmentos del ácido nucleico se pueden insertar o clonar. El vector puede contener uno o más sitios de restricción únicos para este fin, y puede ser capaz de la réplica autónoma en un huésped definido u organismo de manera que se reproduzca la secuencia clonada. La molécula del vector puede conferir algún fenotipo bien definido sobre el organismo huésped que sea seleccionable o fácilmente detectado. Algunos componentes de un vector pueden ser una molécula de ADN que incorpora elementos reguladores para la transcripción, la traducción, la estabilidad y réplica de ARN, y otras secuencias de ADN . El término "cásete de AD?" como se usa en la presente se refiere a secuencias genéticas dentro del vector que pueden expresar la proteína de fusión descrita en la presente. El cásete de ácido nucleico se coloca y se orienta secuencialmente dentro del vector de manera que el ácido nucleico en el cásete se pueda transcribir en ARN, y cuando sea necesario, traducir en el producto de la proteína de fusión. Preferiblemente, el cásete tiene sus extremos 3 ' y 5 ' adaptados para la inserción fácil en un vector, por ejemplo, tiene sitios de endonucleasa de restricción en cada extremo . Aunque se prefiere que las construcciones antigénicas se produzcan usando técnicas recombinantes, se entiende que las construcciones se pueden sintetizar por cualquier medio conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, medios químicos. Esto puede ser particularmente útil cuando se va a usar un enlazador no péptido o cuando el dominio hidrofóbico comprende un residuo de aminoácidos que no se presenta naturalmente o mimético. De este modo, mientras que la modalidad principal hace uso de métodos recombinantes para producir la proteína de fusión antigénica, la presente invención también proporciona un método que comprende: preparar las construcciones antigénicas por medios sintéticos químicos o por una combinación de medios recombinantes y químicos y preparar una formulación de lípido inmunogénico como se describió anteriormente. Además del enlazador péptido preferido, se pueden usar otros enlazadores conocidos en la técnica para unir el antígeno con el dominio hidrofóbico. Los ejemplos de estos enlazadores incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicoles, polisacáridos, ácidos polisiálicos, ácido succínico, ácido butanodioico, ácido adípico, y químicos de reticulación estándares tales como SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a- (2-piridilditio) -tolueno) , DSP (Ditiobis (succinimidil-propionato) , EGS (Etilenglicol bis (succinimidilsuccinato) , SMCC (4 -succinimidiloxicarbonil-4 - (N-maleimidomet il ) ciclohexano-1-carboxilato) y SPDP (N-succinimidil-3- (2-piridilditio) -propionato) (Véase también, catálogo de Pierce, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) . De acuerdo con la presente invención, el liposoma representa una función crítica en la administración de antígeno ya que el complejo de antígeno-liposoma se presenta directamente al sistema inmune después de la remoción de la circulación por células del sistema inmune. Además, la elección de las rutas inmunoestimuladoras se puede alterar haciendo cambios a la composición de lípidos del liposoma. Por ejemplo, diferentes moléculas inmunoestimuladoras, tales como Lípido A (Asano y Kleinerman, 1993, J. Immunother. 14:286), P3CSS (Lex y colaboradores, 1986, J. Immunol . 137:2676), muramil di y tripéptido-PE (Fidler y colaboradores, 1981, PNAS 78:1680; Alving y colaboradores, 1985, Vaccines 4:166), y lípidos catiónicos (Walker y colaboradores, 1992, PNAS 89:7915) se pueden formular en el liposoma para estimular diferentes rutas inmunológicas. Otros adyuvantes tales como, por ejemplo, MF59, Quil A, QS21 o alumbre, se pueden usar junto con el complejo de antígeno-liposoma. Además, moléculas inmuno-reguladoras tales como las citocinas se pueden añadir para provocar una respuesta inmune . Los liposomas usados en la práctica de la presente invención se pueden preparar a partir de una amplia variedad de lípidos que forman vesículas incluyendo éteres y esteres fosfatidilo, tales como fosfatidiletanolamina (PE) , fosfatidilserina (PS) , fosfatidilglicerol (PG) y fosfatidilcolina (PC) ; glicéridos, tales como dioleoilglicerosuccinato; cerebrósidos; gangliósidos; esfingomielina; esteroides, tales como colesterol; y otros lípidos, así como otros excipientes tales como palmitato de Vitamina E o Vitamina C (Véase también las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 4,235,871; 4,762,720; 4,737,323; 4,789,633; 4,861,597; y 4,873,089). Los ejemplos de lípidos basados en PC incluyen, pero no se limitan a, (C-18) diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) ; (C-16) dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) ; (C-14) dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) ; y (C-18, insaturado) dioleilfosfatidilcolina (DOPC) . Se prefiere que los lípidos estén en una fase fluida a temperatura corporal (aproximadamente 38-39 °C) . Por lo tanto, los lípidos con una temperatura media por encima de la temperatura corporal, tales como DSPC y DPPC, se prefieren menos, (sin embargo, todavía son útiles) . Los lípidos que tienen una temperatura media por debajo de la temperatura corporal, tales como DMPC o DOPC, se prefieren más. Además, se prefiere que la formulación de lípido no contenga más de aproximadamente 10 por ciento de colesterol. Las composiciones de lípidos particularmente preferidas comprenden aproximada-mente 0-10 por ciento de colesterol, aproximadamente 0-15 por ciento PG y aproximadamente 0-100 por ciento PC. En ciertas modalidades preferidas, la composición adicionalmente puede comprender aproximadamente 1-10 por ciento de adyuvante (s) ; preferiblemente, un adyuvante está presente en una cantidad menor de aproximadamente 5 por ciento. La preparación de liposomas es muy conocida en la técnica anterior. En general, los liposomas han sido hechos por varias técnicas diferentes incluyendo inyección de etanol (Batzri y colaboradores, 1973, Biochem. Biphys . Acta. 298:1015); infusión de éter (Deamer y colaboradores, 1976, Biochem. Biphys . Acta. 443:629; Schieren y colaboradores, 1978, Biochem. Biophys. Acta. 542:137); remoción de detergente (Razin, 1972, Biochem. Biphys. Acta. 265:241); evaporación de solvente (Matsumato y colaboradores, 1977, J. Colloid Interface Sci. 62:149); evaporación de solventes orgánicos a partir de cloroformo en emulsiones de agua (REV) (Szoka Jr. Y colaboradores, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4194; extrusiones de MLV o EUV a través de una membrana de policarbonato de nucleoporo (Olson y colaboradores, 1979, Biochem. Biphys. Acta. 557:9); congelación y descongelación de mezclas de fosfolípidos (Pick, 1981, Archives of Biochem y Biophysics, 212:186), así como sonificación y homogeneización. Por convención, los liposomas se categorizan por tamaño, y se usa un acrónimo de tres letras para designar el tipo de liposoma que se está discutiendo. Las vesículas multilaminales generalmente se designan "MLV" . Las vesículas unilaminales pequeñas se designan "SUV" , y las vesículas unilaminales grandes se designan "LUV" . Estas designaciones frecuentemente son seguidas por la composición química del liposoma. Para una discusión de la nomenclatura y un resumen de tipos conocidos de liposomas, véase Storm y colaboradores, 1998, PSIT, 1:19-31. La presente invención contempla el uso de composiciones de liposomas con un adyuvante conveniente. Sin embargo, la presente invención también contempla el uso de la construcción antigénica, la cual no está asociada con un liposoma, en combinación con un adyuvante conveniente. De este modo, la vacuna o la composición inmunogénica está compuesta por dos componentes : un antígeno enlazado con un dominio hidrofóbico; y un sistema adyuvante conveniente. Los ejemplos de sistemas portadores potenciales farmacéuticamente aceptables que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, liposomas, emulsiones, adyuvantes de Freund (completo o incompleto) , alumbre, ISCOMS y virus envueltos. Los métodos de la invención emplearán una cantidad inmunogénicamente efectiva de la composición de liposoma, es decir, una cantidad de la composición que, en combinación con cualquier excipiente o vehículo añadido, dará como resultado una respuesta inmunogénica detectable en el huésped. Cuando la composición se use como una composición de vacuna, la cantidad efectiva será la cantidad en la cual, en combinación con cualquier excipiente o vehículo añadido, causará que el huésped produzca una respuesta inmunológica específica y suficiente para impartir protección al huésped de la exposición posterior a un microbio (vacunación profiláctica) , o impartir protección al huésped ya enfermo (vacunación terapéutica) . La invención que se está describiendo generalmente, se entenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos detallados que se proporcionan a manera de ilustración y no pretenden limitar la invención a menos que se especifique.

Ejemplos Ejemplo I- HSV2 Preparación del HSV2gD (1 -23) -TM. El segmento de 23 aminoácidos de terminal N de la proteína de envoltura gD del HSV2 se acopló con un segmento de transmembrana (TM) mediante síntesis química en un sintetizador de péptidos automatizado. El péptido sintetizado fue disociado por métodos de disociación de HF estándares y purificado por cromatografía líquida de alto rendimiento preparativo usando una columna Waters C18 y 100 por ciento de fase móvil de acetonitrilo con 0.1 por ciento TFA. El péptido se demostró que está a cuando menos 95 por ciento de pureza mediante espectrometría de masas y electroforesis capilar. Preparación de liposoma . Los liposomas se prepararon mediante sonificación de sonda de acuerdo con procedimientos descritos previamente (Fujii y colaboradores, 1997, Biochemistry 36:4959) . Brevemente, los lípidos (con o sin proteínas) se disuelven en un solvente orgánico tal como cloroformo/metanol. Las películas de lípidos se crean pipeteando alícuotas de las soluciones de lípidos en tubos de vidrio de fondo redondo, y evaporando el solvente a 65 °C bajo una corriente de gas nitrógeno. Las películas se colocan al vacío durante cuando menos ocho horas para remover solvente orgánico residual. La preparación de los liposomas se lleva a cabo hidratando las películas de lípidos con un regulador e incubando la suspensión a 65 °C durante 5-10 minutos antes de la sonificación de la sonda. Los liposomas se filtran entonces a través de un filtro de 0.22 m para esterilizar la preparación. Los liposomas se adaptan al tamaño mediante dispersión de luz dinámica y la formación de agregados seguida durante cuando menos cuatro semanas . Una formulación de HSV2gD (1-23) -TM liposomal particularmente preferida tiene una proporción molar de 15:2:3 DMPC : Chol :DMPG (dimiristoilfosfatidilcolina : colesterol : dimiristoil-fosfatidilglicerol) , con 2.5 por ciento en peso de Lípido A. Procedimientos de vacunación y pruebas para inducción de una respuesta inmune al antígeno viral . Ratones hembras BALB/c o C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de edad) se inyectaron subcutáneamente una vez por semana durante dos, tres, o cuatro semanas con la preparación de vacuna de prueba o solución de regulador. Los sitios de inyección se supervisaron para determinar reacciones adversas tales como el desarrollo de granulomas y/o formación de costras . Cuando los animales se inmunizaron con la vacuna vía la ruta intranasal, se anestesiaron con halotano, y la composición (10-20 1) administró a las fosas para inspiración usando una punta estéril sobre una micropipeta (Galuchan y colaboradores, 1993, J. Inf . Dispersantes 168:622) . A intervalos regulares durante el procedimiento de vacunación, y después de estímulo viral, se midió la respuesta inmune de los ratones al antígeno viral. La prueba de anticuerpo de neutralización viral se realiza usando placas de racimo de 24 pozos que contienen lxlO5 BHK células a las cuales se añadió diferentes diluciones de suero de ratón mezclado con virus. Después de 48-72 horas de incubación a 37 °C en un incubador de C02, se examinaron las monocapas de células para determinar la citotoxicidad, y se probó la titulación del anticuerpo neutralizante. Los anticuerpos precipitados al virus se midieron incubando diferentes diluciones de suero con 5-10 g de antígeno viral o 25-50 1 de caldo HSV2 (1x105 PFU) . Los liposomas que contenían el epítope antigénico también se usaron como objetivos para un ensayo anticuerpo/ELISA como se describió anteriormente (Tuso y colaboradores, 1993, Transplantation 55:1375) . Los resultados del ensayo último se usaron para medir el nivel de enlace y de configuración de isotipo de los anticuerpos. Un tipo retrasado de respuesta de hipersensibilidad al antígeno viral en ratones vacunados se probó usando un ensayo de pata (garra) . Los animales vacunados se anestesiaron con halotano y se inyectaron con 50 1 de HSV2 inactivado con ultravioleta en una garra y 50 1 de células no infectadas lisadas en la otra garra. Veinticuatro, cuarenta y ocho y setenta y dos horas después, se midió el grado de hinchazón de garra de los ratones usando un calibrador Vernier y comparado con mediciones de control. La actividad de células T de estos animales también se midió mediante la producción de citocinas en respuesta a la incubación de células T esplénicas con antígeno viral. Los bazos se removieron de los animales vacunados y se prepararon homogenados de bazo rompiendo suavemente los bazos con un émbolo estéril y jalando las células a través de una malla de nylon. Las suspensiones de células se enjuagan y se plaquean a lxlO6 células/pozo en una placa de microtitulación de 96 pozos. Después de la incubación de las celdas a 37 °C durante 3 ó 4 días con diferentes cantidades de antígeno viral, los sobrenadantes de los pozos se cosechan y prueban para determinar la presencia de citocinas. Se usan juegos ELISA de citocina comercialmente disponibles para definir el perfil de citocina (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-_, __-actina y TNF-a a partir de PharMingen, Inc. (San Diego, CA) ) . La detección de la proteína de citocina en los sobrenadantes de cultivo de tejidos mediante el emparedado de ELISA se realiza usando anticuerpos monoclonales (mAb) específicos para las citocinas particulares. En resumen, las placas de ELISA se cubren durante la noche con un anticuerpo monoclonal de citocina anti-ratón de rata. Las placas se bloquean con 3 por ciento de suero de becerro fetal en PBS durante 2 horas, luego se añaden alícuotas de cada muestra de prueba a cada pozo. Se añade anticuerpo monoclonal anti-ratón de rata biotinilado específico de citocina seguido por peroxidasa avidina . Se logra una reacción de color mediante la adición de sustratos colorimétricos . Las placas se leen en un espectrofotómetro ELISA y se calculan las concentraciones de citocina a partir de una curva estándar obtenida de las citocinas recombinantes de control . Modelo de encefali tis de ratón HSV2 para probar las preparaciones de vacuna liposomal . Ratones hembras BALB/c vacunadas o no vacunadas (control) (de 10 a 12 semanas de edad) se estimularon intraperitonealmente con una dosis letal (IxlO5 PFU) de HSV2 pasado por cerebro. Los ratones estimulados intravaginalmente con una dosis letal de HSV2 primero fueron tratados con estrógeno subcutáneo una semana antes de la estimulación y el día (-1) antes de la estimulación. Se anestesiaron con inyección intraperitoneal de acepromazina y cetamina. El HSV2 (10-30 1) se administra entonces intravaginalmente usando una punta estéril sobre una micropipeta después de primero frotar la vagina con un frotador seco Calgiswab (McDermott y colaboradores, 1984, J. Virol. 51:747) . Los animales se supervisaron durante 80 días después del estímulo para determinar su supervivencia (diariamente) , pérdida de peso (un día sí y un día no durante las primeras dos semanas y luego una vez por semana) , apariencia del pelo, y síntomas neurológicos (nivel de actividad disminuido, arrastre o parálisis de las extremidades) . Proliferación de células T inducidas por antígenos .

La sensibilización del huésped al antígeno gD se midió usando un ensayo de proliferación de células T inducido por antígenos. Se prepararon homogenados de bazo rompiendo suavemente los bazos con un émbolo estéril y empujando las células a través de una malla de nylon. Las células se suspendieron en medio RPMI 1640 que contenía 10 por ciento de suero de becerro fetal (FCS) , 10 mM de regulador Hepes, L-glutamina (2 mM) , penicilina (25 Ul/ml) , y estreptomicina (25 g/ml) . Las células se cultivaron a una concentración de 1 x 106 células/ml con o sin gD (5-20 g/ml) en placas de fondo en U de 96 pozos durante 4 días en 5 por ciento de C02. Los cultivos se pulsaron con 20 µl de tinte de resazurina durante 3 horas y luego se midió la fluorescencia en un Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc., Farmington, MA) . Análisis de ARNm específico para ci tocina. Las células T a partir de animales inmunizados y no inmunizados se examinaron para determinar los niveles de ARNm específicos para citocina para las principales citocinas que pueden reflejar la sensibilización asociada con la inmunización, incluyendo IL-2, IFN-_, IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10. Las células T se obtuvieron de bazos como se describió previamente. El ARN total se aisló usando una modificación (Cosenza y colaboradores, 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16) de un método descrito por Chomczynsky y Sacchi (Chomcz nsky y colaboradores, 1987, Analy . Biochem. 162:156) . Células frescas o congeladas (2 x 106) se desintegraron en un mililitro de solución desnaturalizante (4 mM de tiocianato de guanidinio, 25 mM de citrato de sodio (pH 7.0), 0.5 por ciento de sarcosilo, y 0.1 mM 2 -mercaptoetanol) . El ARN se precipitó incubando con un volumen de isopropanol durante la noche a -20 °C. La concentración de ARN total se ajustó a 260 nM y las muestras se almacenaron a -80 °C hasta que se analizaron. El análisis de citocina se llevó a cabo usando la modificación de un método descrito por Cosenza y colaboradores, (Cosenza y colaboradores, 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16) . Se preparó AD?c de una sola cadena mediante la transcripción de 2 g de ARN total en 20 1 de la mezcla de la reacción total usando transcriptasa inversa de virus de mieloblastosis de ave (Boehringer Mannheim, Indianapolis, I?) . Se usaron cebadores de oligonucleótidos específicos de secuencia para citocinas murinas (Tabla 1) para amplificar los fragmentos de AD? de tamaño predeterminado para cada uno de los genes de citocina de interés .

Tabla 1. Cebadores de oligonucleótidos usados para el análisis semicuantitativo de citocinas para los ratones* Oligonucleótido Secuencia de Tamaño objetivo ácidos nucleicos esperado IL-2 5 TGATGGGACCTACAGGAGC rCCTGAG (SEQ ID NO. 1) 167 bp 3' GAGTCAAATCCAGAACATGCCGCAG (SEO ID NO 2) p.-) 5- CGAAGAACACCACAGAGAGTGAGCT (SEO tD NO. 3) 180 bp 3' GACTCATTCATGGTGCAGCITATCG (SEQ ID NO. 4) IL-5 5- ATGACTGTGCCrCTOTGCCTGsAGC (SEQ ID NO. 5) 242 bp 3' CTG1 1 1 ? CCGGGAGT???CTGGGG (SEQ ID NO 6) D -6 5' TGGAGTCACAGAAGGAGTGCCTA?G (SEQ ID NO 7) 154 bp 3' TCGGACCACAGTG?GGAATGTCCAC (SEQ ID NO 8) I -10 5' TCAAAC?AAGGACCAGCTGGACAACATACTGC fSEQ D O 9) 426 bp 3- CTGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA (SEQ ID NO 10) IL-12 5' TCGCAGC?AAGCAAOATGTG (SEQ ED NO 11) 315 bp 3' GAGCAGCAGATGTGAGTGGC (SEQ ID NO. 12) sN 5" AGCGGCTGACTGAACTCAGATrGtAG (SEQ ID NO. 13) 843 bp 3' GTCACAGT?TCAGCTGTATAGGG (SEQ ID O. 14) TNF-a 5- GGCAGsTCTACTTr K3AGTCATrGC (SEQ ID NO. 15) 307 bp 3' ACATTCGAGGCTCCAGTGAATrCGG (SEQ ID O. 16) D-actin 51 TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC (SEQ ID NO. 17) 348 bp 3- TA?AACGCAGCTCAGTA?CAGTCCG (SEQ ID NO. IS) La mezcla de reacción de cadena de polimerasa consiste en 1 1 de ADNc, 2.5 1 de PCR lOx regulador, 1 1 de cada cebador 5' y 3', 2.5 1 de lOx dNTPs (2 mmol/L) y 0.125 1 de T. Aqua ti cus polimerasa de ADN termoestable (Boehringer Mannheim) en un volumen final de 25 1. Los cebadores de actina específicos se usan para amplificar un fragmento de 548 pares de base con un control interno. La mezcla de PCR se cubre con aceite mineral y la amplificación se lleva a cabo después de la incubación de la mezcla durante 7 minutos a 94 °C, 38 ciclos con 30 segundos de desnaturalización a 94°C, 45 segundos de recocido de cebador a 60 °C, extensión de 60 segundos a 72 °C, y una incubación de 7 minutos a 72 °C. Los productos de PCR se separan en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Las bandas se visualizan bajo luz ultravioleta, se fotografían, y se cuantifican densitométricamente a partir de la fotografía usando el paquete de software Molecular Analyst (Bio-Rad, Richmond CA) . Medición de ci tocina mediante ELISA . Se usan juegos comercíalmente disponibles de ELISA para citocina para definir el perfil de citocina secretado por células T CD4+ esplénicas aisladas a partir de animales inmunizados y no inmunizados. La detección de la proteína de citocina en sobrenadantes de cultivo de tejido a partir de células T esplénicas mediante emparedado ELISA se realiza usando anticuerpos monoclonales (mAb) específicos para las citocinas particulares. Brevemente, las placas ELISA se recubren durante la noche con un anticuerpo monoclonal de citocina anti-ratón de rata. Las placas se bloquean con 3 por ciento FCS en PBS durante 2 horas, luego se añaden alícuotas de cada muestra a cada pozo. El anticuerpo monoclonal anti-ratón de rata biotinilado específico de citocina se añade a cada pozo seguido por peroxidasa de avidina. Se logra una reacción de color mediante la adición de sustratos colorimétricos . Las placas se leen en un espectrofotómetro ELISA y se calculan las concentraciones de citocina a partir de una curva estándar obtenida de las citocinas recombinantes de control . Respuestas anti -HSV2 CTL . Después de la vacunación, la presencia de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno (CTL) en células T esplénicas se valoró. Los linfocitos esplénicos se obtienen como se describió previamente. Los linfocitos para cada grupo de tratamiento se depositaron (n=5) y luego se cultivaron durante 3 días sin antígeno a 107 células/pozo en placas de cultivo de 12 pozos. Las células objetivo EL-4 (H2b) (ATTC) se incubaron con un péptido correspondiente al epítope HSV2 gB CTL localizado entre los residuos 495-505 (Hanke y colaboradores, 1991, J. Virol. 65: 1177) para células restringidas R2b y se incubaron durante 4 horas a 37 "C. Los objetivos se lavaron, y se añadieron titulaciones de 100 microlitros que contenían 1 x 104 células a cada pozo. Los linfocitos efectores se lavaron, se añadieron a los pozos a varias concentraciones y se cultivaron durante 4 horas a 37 °C. Usando el juego CytoTox 96 (Promega, Madison Wl) , se calculó el porcentaje específico de lisis a partir de la deshidrogenasa de lactato sobrenadante (LDH) medida en un lector de placa ELISA estándar (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San José, CA) registrando la absorbancia a 490 nm. La determinación de la lisis específica de antígeno HSV2 se hizo de acuerdo con criterios estándares. Los datos se expresaron como lisis específica porcentual = 100 x [(experimental - efector espontáneo - objetivo espontáneo) / (máximo objetivo - espontáneo objetivo)]. Resultados La curva de supervivencia presentada en la Figura 1 demostró la efectividad del péptido liposomal para proteger a los ratones contra el estímulo sistémico con una dosis letal de HSV2 así como establecer el número de inoculaciones requeridas para lograr el 100 por ciento de protección. La Figura 1 muestra el número de dosis de vacuna HSV2gD (1-23) -TM liposomal requerida para proteger a los ratones BALB/c de una estimulación letal con HSV2. A grupos de 7 ratones se les vieron 2, 3, ó 4 inmunizaciones antes de estimularlas con una dosis letal de HSV2. Con cuatro vacunaciones, ninguno de los animales inmunizados con la vacuna liposomal exhibió complicaciones neurológicas asociadas con infección por HSV2, ni hubo ningún otro signo de infección detectado en todo el estudio. De manera más importante, todos los ratones sobrevivieron el estímulo letal con HSV2. Con dos o tres inmunizaciones semanales, menos del 100 por ciento de los ratones quedaron protegidos. En cambio, los ratones con cuatro vacunaciones de placebo (es decir, solución reguladora) no se protegieron del estímulo HSV2. Se probó el HSV2gD (1-23) -TM liposomal en tres grupos de ratones C57BL/6 y se encontró que provoca efectos protectores similares comparables a los resultados obtenidos con los ratones BLB/c. La Tabla 2 resume estos resultados.

Los ratones del grupo 1 se vacunaron en las semanas 1 y 4 subcutáneamente; los ratones del grupo 2 se vacunaron a la semana 1 subcutáneamente y a la semana 4 intra-rectalmente; y los ratones del grupo 3 (grupo de control) no recibieron vacunaciones. Una semana después de la última vacunación (en la semana 4) , los ratones fueron estimulados intraperitonealmente con una dosis letal de HSV2, y se supervisaron durante 3 semanas para determinar la morbilidad y mortalidad. Como con los ratones BALB/c, los grupos de ratones que recibieron vacunaciones con HSV2gD (1-23) -TM liposomal tuvieron un número significativo de sobrevivientes cuando se vacunaron ya sea mediante inyección subcutánea o cuando se les dio una dosis de cebador subcutáneo seguido por refuerzos mucosales . Tabla 2. Resumen de los resultados comparando la supervivencia de ratones C57BL/6 para varios tratamientos de vacunación con HSV2gD (1-23) -TM liposomal. Grupo tratamiento vacunación Supervivencia (n=7) 1 Semana 1-subcutánea 6/7 (86%) Semana 4-subcutánea 2 Semana 1-subcutánea 5/7 (71%) Semana 4-intra-rectal 3 control (sin vacunación) 1/7 (14%) La Figura 2 muestra una comparación del HSV2gD (1-23) -TM liposomal con otros métodos de presentación de antígenos.

Cada grupo de 7 ratones obtuvo 4 inmunizaciones antes del estímulo con una dosis letal de HSV2. De nuevo, cuatro inoculaciones con la vacuna de HSV2gD (1-23) -TM liposomal dio como resultado 100 por ciento de protección de los ratones de una dosis letal de HSV2. Cuatro inmunizaciones con HSV2gD(l-23) -TM no liposomal, o liposoma sin HSV2gD (1-23) -TM no son capaces de proporcionar protección significativa del estímulo letal con HSV2. Esto claramente demuestra que tanto los componentes del liposoma y la proteína diseñada técnicamente deben asociarse entre sí con el fin de lograr una respuesta inmune efectiva. De particular significado es el hallazgo de que la vacuna HSV2gD (1-23) -TM liposomal proporciona una protección mucho mejor que las inmunizaciones con virus inactivado por calor debido a que las vacunas basadas en virus generalmente se cree que proporcionan un buen estímulo para una respuesta inmune (Desrosiers, 1992, AIDS Res, Hum. Retrovir. 8:1457) . Al final del estudio, los ratones se sacrificaron y se recolectó el suero para caracterizar la naturaleza de la respuesta inmune en ese momento. El suero de los ratones vacunados se encontró que contenía titulaciones altas de anticuerpos (1:100) que específicamente reconocían al péptido usado para estimular la respuesta inmune y además, causó precipitación de virus activo, lo que sugiere que los anticuerpos reconocieron un epítope sobre la superficie del virus. Los anticuerpos también precipitaron liposomas HSV2gD (1-23) -TM y no los liposomas sin el péptido, lo que sugiere que reconocieron el epítope gD de HSV2 específicamente. La Tabla 3 más adelante proporciona un resumen de los ensayos inmunológicos que demuestran que el HSV2gD (1-23) -TM liposomal dado subcutáneamente una vez por semana durante cuatro semanas genera una respuesta inmune más fuerte en comparación con adyuvantes estándares . La vacunación con antígeno mezclado con adyuvante de Freund incompleto o alumbre fueron incapaces de proporcionar a los ratones protección de un estímulo viral . Los datos obtenidos de la prueba de anticuerpo neutralizante y la respuesta de hipersensibilidad retrasada paralela a los datos de supervivencia con una titulación de anticuerpo más alta (respuesta de células B) y la mayor cantidad de hinchazón de las patas (respuestas de células T) observadas para el grupo HSV2gD (1-23) -TM liposomal. Otra ventaja importante asociada con el tratamiento HSV2gD (1-23) -TM liposomal fue que, a diferencia de los resultados en los ratones a los que se les dio adyuvante de Freund incompleto con el antígeno, no hubo irritación ni inflamación en el sitio de la inyección en ninguno de los ratones (17/17 experimentaron enrojecimiento en el sitio de la inyección con adyuvante de Freund incompleto contra 0/17 para el HSV2gD (1-23) -TM liposomal. Cuando se usó alumbre, 17/17 ratones desarrollaron granulomas palpables en el sitio de la inyección. En cambio, el HSV2gD(l-23) -TM liposomal no causó la formación de granulomas en ninguno de los ratones. En resumen, estos resultados sugieren que las respuestas de las células B y/o T (como se juzga neutralizando las titulaciones de anticuerpos y el grado de hinchazón de pata) contribuyen a la respuesta inmune provocada por HSV2gD (1-23) -TM liposomal en ratones contra una dosis letal de HSV2. Tabla 3. Sumario de resultados que compara las respuestas inmunológicas de HSV2gD (1-23) -TM liposomal, adyuvante de Freund incompleto mezclado con HSV2gD (1-23) -TM, alumbre mezclado con HSV2gD (1-23) -TM, y un grupo de control inyectado con PBS solamente. Tratamiento de Ratones Titulación de % de vacuna sobrevivient acoplamiento hinchazón de es/# de neutralizante pata relativo ratones en vía de a los ratones el grupo estímulo de control HSV2gD(l-23) -TM 5/7 1:1638 8% liposomal Adyuvante de 0/7 1:717 3% Freund incompleto con antígeno HSV2gD(l-23) -TM Alumbre mezclado 0/7 1:1024 5% con HSV2gD(l-23) -TM Salina regulada 0/7 1:486 0% de fosfato Ejemplo II - HSV2 Preparación de HSV2gD (1 -23) -HD. Una construcción de gen que codifica HSV2gD (1-23) -HD se generó usando oligonucleótidos de traslape que codifican el epítope gD enlazado a un dominio hidrofóbico de 45 aminoácidos. La construcción se construyó mediante el alargamiento sucesivo y la amplificación de la región de codificación del gen. El gen se ligó en un vector de expresión pTrcHis y se verificó mediante análisis de secuencias. Un estudio de expresión a pequeña escala se inició mediante la inducción con 1 mM IPTG y fue confirmado por análisis de manchado Western usando los anticuerpos de ratón generados en estudios de vacunación con HSV2gD (1-23) -TM liposomal. La proteína también se analizó mediante SDS-PAGE y se encontró una banda que correspondió con el peso molecular esperado (aproximadamente 6kD) juzgado mediante manchado Coomassie. Habiendo demostrado que la proteína esperada se expresó a una pequeña escala, se completó un lote de diez litros de fermentación de E. coli que contenía la construcción pTrcHis/HSV2gD (1-23) -HD el cual produjo aproximadamente 60 gramos de pasta celular. Después de la inducción, se verificó la expresión del HSV2gD (1-23) -HD mediante manchado Western del curso de tiempo de fermentación. Las bacterias de aproximadamente 30 gramos de la pasta celular se lisaron mediante Prensa Francesa en un regulador que contenía 1 por ciento de desoxicolato y 5 mM de imidazol . Después de la centrifugación hasta granular el desperdicio celular, se encontró el HSV2gD(l-23) -HD predominantemente en el sobrenadante soluble acuoso. La purificación se logró pasando el sobrenadante que contenía la proteína HSV2gD (1-23) -HD soluble sobre una columna Sefarosa quelante cargada de níquel. La columna se lavó sucesivamente con soluciones que contenían 5 mM de imidazol, 200 mM de imidazol, y luego 5 mM de imidazol con 1 por ciento de desoxicolato para remover todas las proteínas residuales. La proteína HSV2gD (1-23) -HD finalmente se eluyó con una solución de 200 mM de imidazol, 1 por ciento de desoxicolato. Las fracciones picos se identificaron mediante SDS-PAGE manchado por Coomassie y por manchado Western. Todas las fracciones pico que contenían HSV2gD (1-23) -HD se depositaron y concentraron usando un concentrador Millipore Ultraprep. El concentrado final demostró contener HSV2gD (1-23) -HD puro, juzgado por la presencia de una sola banda sobre un gel de SDS-PAGE manchado por Coomassie. A partir de esta primera corrida, aproximadamente 2-3 miligramos de HSV2gD (1-23) -HD se obtuvo para la formulación de liposoma y los estudios de vacunación.

La preparación liposomal y los procedimientos de vacunación, la prueba de inducción de respuesta inmune, el modelo de encefalitis de ratón HSV2 , la proliferación de células T inducidos por antígeno, el análisis de ARNm específico de citocina, las mediciones de citocina por ELISA, y las respuestas anti-HSV2 CTL fueron esencialmente como se describen en el Ejemplo I. Resul tados . La curva de supervivencia presentada en la Figura 3 muestra la capacidad del HSV2gD (1-23) -HD para provocar una respuesta inmune protectora. El porcentaje de supervivencia con esta formulación particular se observó que es de 40 por ciento. En comparación, los animales de control tratados con solución regulada no mostraron supervivencia, mientras que el grupo de control HSV2gD (1-23) -TM tuvo una supervivencia de 100 por ciento. EJEMPLO III - VIH Preparación de VIH (gpl20-HD) y VIH (? gpl20-HD) en células COS-1. Para el estudio de epítope conformacional, se obtiene la secuencia gpl20 a partir del plásmido pHXB2-env que contiene el gen gpl60 (NIH AIDS Research y Reagent Program, Rockville, MD) amplificando el ADN del plásmido mediante reacción de cadena de polimerasa y subclonando el producto de 1536 pares de base para secuenciar mediante el método de dideoxi nucleótido. Usando un cebador (sentido) 5' correspondiente a las primeras 21 pares de base del gen HIVgpl20 ATGAGAGTGAAGGAGAAATAT y un cebador (antisentido) 3' correspondiente a los nucleótidos 1515 a 1536 TGCTCTTTTTTCTCTCTGCAC , eliminando la proteína de HIV gp41, el segmento gpl20 se clona y amplifica mediante reacción de cadena de polimerasa. Además, cada cebador es flanqueado con sitios de enzima de restricción convenientes para coincidir con los sitios de clonación múltiples del vector de expresión pcDNA4-His. El producto de la reacción de cadena de polimerasa se liga en el pcDNA4-His que contiene el dominio hidrofóbico como un plásmido de cásete (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) . Los mutantes de supresión se hacen mediante amplificación de reacción de cadena de polimerasa usando dos pares de cebador 5' y 3 ' que excluyen los nucleótidos que codifican residuos de proteína gpl20; estos incluyen ?136-151gpl20 , ?128-194gpl20 y ?123-203gpl20. Los cebadores contienen secuencias de enzima de restricción convenientes que permiten la ligación de los dos productos de gen. Cada mutación por lo tanto se reemplaza con dos aminoácidos codificados por el sitio de restricción específico de interés. Los genes finales se verificaron secuenciando el ADN usando el protocolo y los reactivos a partir del juego AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y los resultados corrieron en un juego ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) aparato de secuenciamiento y se analizaron con software AM v.3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . Los plásmidos se transfectaron en células C0S-1 (ATCC, Rockville, MD) usando un reactivo de DEAE dextrano. Se seleccionaron transfectantes estables usando Zeocin (Invitrogen Inc., San Diego, CA) y se clonaron mediante dilución limitante. Las proteínas gpl20-HD se purificaron por afinidad selectiva a níquel pegado a un soporte sólido. Las clonas que producen altos niveles de proteína se valoraron mediante análisis de manchado Western o análisis FACS. El enlazador de histidina de HIV(gpl20) -HD, HIV?136-151gpl20, HIV?128-194gpl20 y HIV?123-203gpl20 se removieron mediante disociación de enteroquinasa después de que la purificación se completa. Si es necesario, se realiza exclusión de tamaño, intercambio de iones, o cromatografía de interacción hidrofóbica para purificar adicionalmente las proteínas HIVgpl20-HD y HIV?gpl20-HD. Preparación de HIV-HD. La secuencia de nucleótidos que combinan tres epítopes (CTL, célula auxiliar T y célula B) se seleccionan de secuencias descubiertas en diferentes proteínas VIH (KQIINMWQEVGKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK (SEQ ID NO .19)) y se derivan de esta secuencia de proteínas usando preferencias de codones de E. coli (Looman y colaboradores, 1987, EMBO J. 6:2489). El gen sintético que codifica la secuencia del VIH se ensambla mediante síntesis, hibridización, reacción de cadena de polimerasa, y ligación de oligonucleótidos traslapantes. El gen de longitud completa ensamblado que codifica los fragmentos del VIH se amplifica mediante reacción de cadena de polimerasa y luego se liga en un plásmido de expresión. Los genes finales se verifican mediante secuenciamiento de1 ADN. El HIV-HD que contiene los plásmidos pTrcHis se transforman en E. coli . las bacterias se incuban en medio LB con amplicilina (50 g/ml) a 37°C hasta la fase de medio-log. En este momento, se añade IPTG para inducir el promotor híbrido trp/lac. Se examinaron puntos horarios en el tiempo para determinar la expresión postinducción óptima de las proteínas HIV-HD. En el momento de expresión óptima, las células se cosecharon mediante centrifugación. Las aglomeraciones celulares se lisaron y centrifugaron. El lisado se probó para determinar la presencia de proteína. Las proteínas HIV-HD se purificaron mediante afinidad selectiva al enlace de níquel con un soporte sólido. Si es necesario, se puede hacer cromatografía por exclusión de tamaño intercambio de ion o interacción hidrofóbica para purificar adicionalmente el HIV-HD. Preparación de liposoma . Los liposomas se prepararan mediante sonificación de sonda de acuerdo con los procedimientos descritos previamente (Fujii y colaboradores, 1997, Biochemistry 36:4959). Brevemente, los lípidos (con o sin proteína) se disuelven en un solvente orgánico tal como cloroformo/metanol. Se crean películas de lípidos delgadas tipeteando alícuotas de la solución de lípidos en tubos de vidrio de fondo redondo, y evaporando el solvente a 65 °C bajo una corriente de gas nitrógeno. Las películas se colocan al vacío durante cuando menos ocho horas para remover el solvente orgánico residual. La preparación de los liposomas se lleva a cabo hidratando las películas de lípidos con regulador e incubando la suspensión a 65°C durante 5-10 minutos antes de la sonificación de sonda. Los liposomas se filtran entonces a través de un filtro de 0.22 m para esterilizar la preparación. Los liposomas se adaptan al tamaño mediante dispersión de luz dinámica y la formación de agregados seguida durante cuando menos cuatro semanas . Procedimientos de vacunación y pruebas para la inducción de respuesta inmune a un antígeno viral . Los ratones hembras BALB/c (de 6 a 8 semanas de edad) se vacunaron subcutáneamente a las semanas 1, 4 y 8 con la preparación de vacuna de prueba o regulador. Los sitios de inyección se supervisaron para determinar reacciones adversas tales como el desarrollo de granulomas y/o formación de costra. Cuando los animales se inmunizaron con la vacuna vía la ruta intranasal, se anestesiaron con halotano y el artículo probado (10-20 1) administrado en las fosas para inspiración usando una punta estéril de una micropipeta (Galuchan y colaboradores, 1993, J. Inf . Dis. 168:622) . Medición de respuestas de anticuerpo mediante ELISA. A intervalos regulares durante el procedimiento de vacunación, (por ejemplo, 1 x por semana) , la respuesta inmune de los ratones al antígeno viral se midió. Los liposomas que contienen el epítope antigénico también se usaron como objetivos para un ensayo de anticuerpo/ELISA como se describió anteriormente (Tuso y colaboradores, 1993, Transplantation 55:1375). Los resultados del último ensayo se usaron para medir el nivel de enlace y la configuración de isotipo de los anticuerpos . Ensayo de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH) . Una respuesta DTH al antígeno viral en ratones vacunados se probó usando un ensayo de pata. Los animales vacunados se anestesiaron con halotano y se inyectaron con 50 1 ya sea de antígeno liposomal o antígeno libre en una pata y 50 1 de regulador en la otra garra de pata. Veinticuatro, cuarenta y ocho y setenta y dos horas después, se midió el grado de hinchazón de la garra de los ratones usando u calibrador Vernier y se comparó con mediciones de control. Análisis de ARNm específico para ci tocina . Las células T a partir de animales inmunizados y no inmunizados se examinaron para determinar los niveles de ARNm específicos de citocina para las principales citocinas que pueden reflejar sensibilización asociado con la inmunización, incluyendo IL-2, IF?- , IL-4, IL-5, IL6, e IL-10. Células T esplénicas se aislaron como se describió previamente a las semanas 1 y 4 después de la inmunización. El ARN total se aisló usando una modificación (Cosenza y colaboradores, 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16) de un método descrito por Chomczynsky y colaboradores, 1987, Analyt . Biochem. 162:156. Células frescas o congeladas (2 x 106) se rompieron en un 1 mililitro de solución desnaturalizante (4 mM tiocianato de guanidinio, 25 mM de citrato de sodio (pH 7.0), 0.5 por ciento de sarcosilo, y 0.1 mM 2 -mercaptoetanol) . El ARN se precipitó incubando con un volumen de isopropanol durante la noche a -20 °C. La concentración de AR? total se ajustó a 260 nM y las muestras se almacenaron a -80 °C hasta que se analizaron. Se llevó a cabo análisis de citocina usando una modificación (Cosenza y colaboradores, 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16) de un método descrito por Chomczynsky y colaboradores, 1987, Analyt. Biochem. 162:156. El AD?c de una sola cadena se preparó mediante la transcripción de 2 g de AR? total en 20 1 de la mezcla de la reacción total usando transcriptasa inversa de virus de mieloblastosis aviaria (Boehringer Mannheim, Indianapolis, I?) . Los cebadores de oligonucleótidos específicos de la secuencia para citocinas murinas (Tabla 1) se usaron para amplificar fragmentos de AD? de tamaño predeterminado para cada uno de los genes de citocina de interés. La mezcla de reacción de cadena de polimerasa consistió en 1 1 de ADNc , 2.5 1 de PCR lOx regulador, 1 1 de cada uno de los cebadores 5' y 3', 2.5 1 de lOx d?TPs (2 mmol/L) y 0.125 1 de T. Aquaticus polimerasa de AD? termoestable (Boehringer Mannheim) en un volumen final de 25 1. Se usaron cebadores específicos de -actina para amplificar un fragmento de 548 pares de base como un control interno. La mezcla de reacción de cadena de polimerasa se cubrió con aceite mineral y se llevó a cabo la amplificación después de la incubación de la mezcla durante 7 minutos a 94 °C, 38 ciclos con 30 segundos de desnaturalización a 94 °C, 45 segundos de recocido de cebador a 60°C, 60 segundos de extensón a 72 °C, y una incubación de 7 minutos a 72 °C. Los productos de la reacción de cadena de polimerasa se separaron en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Las bandas se visualizaron bajo luz ultra violeta, se fotografiaron, y se cuantificaron densitométricamente a partir de la fotografía usando el paquete de software Molecular Analyst (Bio-Rad, Richmond CA) . Medición de ci tocina mediante ELISA en células T esplénicas . La actividad de células T de estos animales también se midió mediante la producción de citocinas como respuesta a la incubación de células T esplénicas con antígeno viral. Los bazos se removieron a partir de los animales vacunados y los homogenados de bazos se prepararon rompiendo suavemente los bazos con un émbolo estéril y empujando las células a través de una malla de nylon. Las suspensiones celulares se enjuagaron y se plaquearon a lxlO5 células/pozo en una placa de microtitulación de 96 pozos. Después de la incubación de las células a 37°C durante 3 a 4 días con diferentes cantidades de antígeno viral, se cosecharon los sobrenadantes de los pozos y se probaron para determinar la presencia de citocinas. Los juegos ELISA de citocina comercialmente disponibles se usaron para definir el perfil de citocina. La detección de la proteína de citocina en sobrenadantes de cultivo de tejido mediante ELISA en emparedado se realizaron usando anticuerpos monoclonales (mAb) específicos para las citocinas particulares. Previamente, las placas de ELISA se recubrieron durante la noche con un anticuerpo monoclonal de citocina anti-ratón de rata. Las placas se bloquearon con 3 por ciento de suero de becerro fetal en PBS durante 2 horas, luego se añadieron alícuotas de cada muestra de prueba a cada pozo. Se añadió anticuerpo monoclonal anti-ratón de rata biotinilado específico para citocina seguido por peroxidasa de avidina. Se logró una reacción de color mediante la adición de sustratos colorimétricos. Las placas se leyeron en un espectrofotómetro ELISA y se calcularon las concentraciones de citocina a partir de una curva estándar obtenida a partir de citocinas recombinantes de control. Todos los juegos ELISA de citocina (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN- , y TNF-a) se compraron en PharMingen, Inc. (San Diego, CA) . Proliferación de células T inducidas por antígeno . La sensibilización del huésped a los antígenos del VIH se midió usando proliferación de células T inducidas por antígenos. Los homogenados de bazo se aislaron como se describió anteriormente. Las células se suspendieron en medio RPMI 1640 que contenía 10 por ciento de FCS, 10 M de regulador hepes, L-glutamina (2 mM) , penicilina (25 Ul/ml) , estreptomicina (25 g/ml) , y gentamicina (80 g/ml) . Las células se cultivaron a una concentración de 1 x 106 células/mililitro con o sin el péptido HIV-HD (5 g/ml) en placas con fondo en U de 96 pozos durante 3-4 días en 5 por ciento de C02. Los cultivos se pulsaron con 20 1 de colorante de resazurina durante 3 horas y luego se midió la fluorescencia en un Citofluor II (Perseptive Biosystems, Inc., Farmington, MA) . Respuestas anti -HIV CTL . Después de la vacunación, se valoró la presencia de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno (CTL) en células T esplénicas. Los linfocitos esplénicos se obtuvieron como se describió previamente. Los linfocitos de cada grupo de tratamiento se depositaron (n=5) y luego se cultivaron durante 3 días con antígeno a 107 células/pozo en placas de cultivo de 12 pozos. Las células objetivo (H2d) de linfoma L5198Y (ATTC) se incubaron con un péptido correspondiente al epítope HIV CTL para células H2d restringidas e incubadas durante 4 horas a 37 °C. Los objetivos se lavaron, y se añadieron 100 µl de titulaciones que contenían 1 x 104 células a cada pozo. Los linfocitos efectores se lavaron, se añadieron a los pozos a varias concentraciones y se cultivaron durante 4 horas a 37 °C. Usando el juego CytoTox 96 (Promega, Madison Wl) , se calculó el porcentaje específico de lisis a partir de la deshidrogenasa de lactato de sobrenadante (LDH) medido en un vector de placa ELISA estándar (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San José, CA) registrando la absorbancia a 490 nm. La determinación de la lisis específica del antígeno HSV2 se hizo de acuerdo con criteros estándares. Los datos se expresan como porcentaje de lisis específica = 100 x [(criterio experimental - efector espontáneo - objetivo espontáneo) / (máximo objetivo - espontáneo objetivo)]. Ejemplo IV - Virus Influenza (INFV) Preparación del INFV-HD. La secuencia de nucleótidos de los epítopes elegidos se deriva de la secuencia de proteínas usando preferencias de codones de E.coli (Looman y colaboradores, 1987, EMBO J. 6:2489). La o las secuencias de antígenos insertadas en el cásete de gen corresponde a los epítopes de NP (147-161, TYQRTRALVRTGMDP; 55-69 (SEQ ID NO.20), RLIQNSLTIERMVLS (SEQ ID NO.21)) y HA (91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASL (SEQ ID NO.22)) . Una vacuna de combinación de epítopes se puede construir que consiste en un epítope T-B como se reportó por Brumeanu y colaboradores, 1997 (HA 110-120/HA 150-159, SFERFEIPKEGGWLTEKEGYSP (SEQ ID NO.23)) (Brumeanu y colaboradores, 1997, J. Virol. 71:5473) . En cuanto se obtiene la o las secuencias apropiadas, un gen sintético que codifica al INF-HD se ensambla mediante síntesis, hibridización, reacción de cadena de polimerasa, y ligación de oligonucleótidos traslapantes. El gen de longitud completa ensamblado que codifica los fragmentos INFV se amplifica mediante reacción de cadena de polimerasa y se liga en un plásmido de expresión. Los genes finales se verifican secuenciando el ADN. El INFV-HD que contiene plásmidos se transforma en E. coli . Las bacterias se incuban en medio LB con ampicilina (50 g/ml) a 37°C hasta la fase de medio-log. En este momento, se añade IPTG para inducir el promotor híbrido trp/lac . Se examinan puntos d etiempo horariamente para determinar la expresión postinducción óptima de las proteínas INFV-HD. En el momento de la expresión óptima, las células se cosechan mediante centrifugación. Los aglomerados de células se lisan y centrifugan. El lisado se prueba para determinar la presencia de proteína. Las proteínas INFV-HD se purifican mediante afinidad selectiva al enlace níquel con un soporte sólido. Si es necesario, se realizan cromatografía por exclusión de tamaño, intercambio de iones o cromatografía de interacción hidrofóbica para purificar adicionalmente al INFV-HD. Modelo de infección viral . La cepa de INFV usada para demostrar la eficacia de la vacuna es una reclasificación del virus A/PR/8/34 llamado PR8. El virus se cultiva en huevo de gallina embrionados de 10 ó 12 días de edad mediante inoculación alantoica, seguido por incubación a 37 °C en un mecedor durante 40-48 horas y 20-24 horas a 4°C, y luego se recuperan del fluido alantoico. Un ensayo de hemaglutinación viral con glóbulos rojos de pollo 0.5 por ciento se lleva a cabo en placas de microtitulación de 96 pozos para determinar las unidades de hemaglutinación (HAU) /ml del caldo viral. En el modelo de ratón BALB/c, se demostró que 1200 HAU de la cepa PR8, administradas intranasalmente con una punta estéril de una micropipeta a ratones anestesiados con metofano (20 1) , produjo síntomas pronunciados de infección en el día 4, incluyendo movilidad disminuida, falta de aparej amiento, una pérdida del 20 por ciento de peso corporal y muerte en dos semanas. Después de un análisis de citolisis MDCK llevado a cabo en placas de microtitulación de 96 pozos con un punto final de 50 por ciento, una titulación más alta de virus infeccioso se en?ontró presente en los homogenados de pulmón preparados 4 días después de la infección. Procedimientos de vacunación prueba para la inducción de respuesta inmune al antígeno viral . Ratones hembras BALB/c (6-8 semanas de edad) se inyectaron subcutáneamente en las semanas 1, 4 y 8 con la preparación de vacuna o solución reguladora. Los sitios de inyección se supervisaron para determinar reacciones adversas tales como el desarrollo de granulomas. Cuando los animales se inmunizaron con la vacuna vía la ruta intranasal, se anestesiaron con metofano, y el artículo de prueba (10-20 1) administrado a las fosas para inspiración usando una punta estéril sobre una micropipeta (Galuchan y colaboradores, 1993, J. Inf . Dis. 168:622). Detección de RT-PCR de INFV RNA en tejido de pulmón. La detección mediante RT-PCR de INFV RNA se llevó a cabo en los pulmones de animales experimentales tomados cuatro días después del estímulo viral para establecer la efectividad de la inmunización para evitar la infección viral. Muestras de pulmón tomadas de los ratones se congelaron, molieron y el polvo congelado se almacenó a -70 °C hasta que se procesó para la evaluación. El aislamiento de AR? y el análisis de RT-PCR para el AR? viral se llevó a cabo usando una modificación de las técnicas previamente descritas (Chomczynsky y colaboradores, 1987, Analyt. Biochem. 162:156; Shirwan y colaboradores, 1993, J. Immunol . 151:5228; Lakeman y Whitley, 1995, J. Inf . Dis. 171:857) . Los cebadores que se van a usar son específicos para el gen de matriz (segmento 7) del virus de influenza A (Atmar y colaboradores, 1996, J. Clin. Microbiol. 34:2604). El ensayo RT-PCR se llevó a cabo usando el sistema de RT-PCR Titán One Tube (Boehringer Mannheim, Indianapolis, I?) reactivos y protocolo. Brevemente, 1 pg a l g total de plantilla de AR? se incuba en la presencia de 0.2 mM d?TPs, 0.4 M de cebador antisentido FAM1 (5 ' -CAGAGACTTGAAGATGTCTTTGC-3 ' (SEQ ID ?0.24)), 0.4 M de cebador sentido, FAM2 (5'- GCTCTGTCCATGTTATTTGGA-3 ' (SEQ ID ?0.25)), 5 mM DTT, 5 U R?asa inhibidor, 1.5 mM MgCl2, y enzimas AMV/Expansor de alta fidelidad bajo las siguientes condiciones: un ciclo de 60 °C durante 30 minutos; 94 °C durante 2 minutos; diez ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 45 segundos; veinticinco ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 45 segundos aumentando la extensión de cinco segundos para cada ciclo; seguido por un ciclo de 68 °C durante 7 minutos. Un resultado positivo se basa en una banda visible de 212 pares de base en un gel de NuSieve-agarosa 1.5 por ciento (FMC Bioproducts, Rockland, ME) manchado con bromuro de etidio y fotografiado con transiluminador ultravioleta (BioRad Gel Doc 1000) . Este método se ha demostrado que es sensible y muy específico para medir la presencia de ADN "viral (Lakeman y Whitley, 1995, J. Inf . Dis. 171:857) . Secuencia del dominio HAI . La secuencia del dominio HAI (segmento 4) se puede elucidar amplificando el dominio HAI a partir de ARN viral en una reacción RT-PCR, entonces el producto de 1100 pares de base subclonado para secuenciamiento, y secuenciado usando el método de terminación- de didesoxy-nucleótido. El ensayo RT-PCR se condujo usando el sistema RTPCR Titán One Tube como se notó anteriormente con las siguientes diferencias; los cebadores de amplificación son el cebador de AD?c (5 ' -AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAAC-3 ' (SEQ ID ?0.26)) y el cebador PCR (5 ' -CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3 ' (SEQ ID ?0.27)) (Pyhala y colaboradores, 1995 J. Gen. Virol. 76:205), las condiciones serán un ciclo de 60 °C durante 30 minutos; 94 °C durante 2 minutos; diez ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos, 68°C durante 45 segundos; veinticinco ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 45 segundos aumentando la extensión cinco segundos por cada ciclo; seguido por un ciclo de 68 °C durante 7 minutos. El producto de 1100 pares de base se subclonó en el vector de clonación TA PCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para secuenciamiento posterior. El secuenciamiento se lleva a cabo usando el protocolo y los reactivos del juego AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y los resultados corren sobre un aparato de secuenciamiento de juego ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y se analizaron con software AM v.3.02kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . Medición de respuestas de anticuerpos mediante ELISA. A intervalos regulares durante el procedimiento de vacunación, la respuesta inmune de los ratones al antígeno viral se midió. Liposomas que contenían el epítope antigénico también se usaron como objetivos para un ensayo de anticuerpo/ELISA como se describió anteriormente (Tuso y colaboradores, 1993, Transplantation 55:1375). Los resultados del último ensayo se usaron para medir el nivel de enlace y la configuración de isotipo de los anticuerpos. Proliferación de células T inducidas para antígeno .

La sensibilización del huésped a los antígenos INFV se miden usando proliferación de células T inducidos por antígeno. Se removieron los bazos de ratones vacunados y los homogenados se prepararon rompiendo suavemente los bazos con un émbolo estéril y empujando las células a través de una malla de nylon. Las células se suspendieron en medio RPMI 1640 que contenía 10 por ciento de FCS, 10 mM regulador Hepes, L-glutamina (2mM) , penicilina (25 Ul/ml) , estreptomicina (25 g/ml) y gentamicina (80 g/ml) . Las células se cultivaron a concentraciones de 1 x 106 células/mililitro con o sin péptidos sintetizados químicamente correspondientes a los antígenos (5 g/ml) en placas de fondo en U de 96 pozos durante 3-4 días en 5 por ciento de C02. Los cultivos se pulsaron con 20 1 de colorante de resazurin durante 3 horas y luego se midió la fluorescencia sobre el Cytofluor II (Perseptive Biosystems, Inc., Farmington, MA) . Respuestas anti -INFV CTL . Después de la vacunación, se valoró la presencia de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno (CTL) en células T esplénicas. Los linfocitos esplénicos se obtuvieron como se describió anteriormente. Linfocitos de cada grupo de tratamiento se depositaron (n=5) y luego se cultivaron durante 3 días sin antígeno a 107 células/pozo en placas de cultivo de 12 pozos. Las células objetivo (ATTC) P815 mastocitoma o L5178 linfoma (H2d) se incubaron con un péptido correspondiente al epítope INFV NP CTL ( aminoácidos 147-158) para células restringidas H2 y se incubaron durante 4 horas a 37 °C. Los objetivos se lavaron, titulaciones de 100 µl que contenían 1 x 104 células se añadieron a cada pozo. Los linfocitos efectores se lavaron, se añadieron a los pozos a varias concentraciones y se cultivaron durante 4 horas a 37 °C. Usando el juego CytoTox 96 (Promega, Madison Wl) , se calculó la lisis específica porcentual a partir de la deshidrogenasa lactato sobrenadante (LDH) medida en vector de placa ELISA estándar (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San José, CA) registrando la absorbancia a 490 nm. La determinación de la lisis específica de antígeno HSV2 se hace de acuerdo con criterios estándares . Los datos se expresan como por ciento de lisis específica = 100 x [(experimental - efector espontáneo - objetivo espontáneo) / (objetivo máximo - objetivo espontáneo)]. Ejemplo V - H. influenzae ( THi) no tipificable y H. influenzas tipo b (Hib) Clonación de las proteínas NTHi . La secuencia de gen de longitud completa que codifica P6 se obtiene a partir de una cepa de NTHi mediante amplificación RT-PCR del ARNm P6 (Deich y colaboradores, 1988, J. Bacteriol. 170:489; Nelson y colaboradores, 1988, Inf . Immun. 56:128; Looman y colaboradores, 1987, EMBO J. 6:2489) . La amplificación se lleva a cabo usando los reactivos y protocolos del sistema de RT-PCR Titán One Tube (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) .

Brevemente, las bacterias se incuban en presencia de 0.2 mM dNTPs , 0.4 M cebador antisentido H-InvfP6AS (5'-GAGTCCGCTGCTCTACCAAC-3 ' (SEQ ID ?0.28)) , 0.4 M cebador sentido, H-InvfP6S (5'-AATTTCCAGCTTGGTCTCCA-3' (SEQ ID ?0.29)), 5 mM DTT, 5 Ú R?asa inhibidor, 1.5 mM MgCl2, y enzimas AMV/Expansión de alta fidelidad bajo las siguientes condiciones: un ciclo de 60°C durante 30 minutos; 94°C durante 2 minutos; diez ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 45 segundos; veinticinco ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos. 68 °C durante 45 segundos, aumentando la extensión de cinco segundos por cada ciclo; seguido por un ciclo de 68°C durante 7 minutos. Un resultado positivo se basa en la banda visible de 867 pares de base en un gel de NuSieve-agarosa 1.0 por ciento (FMC Bioproducts, Rockland, ME) manchado con bromuro de etidio y fotografiado usando un sistema de imagen digital con transiluminador ultravioleta (BioRad, Gel Doc 2000) . El producto de la reacción de cadena de polimerasa se subclona para fines de secuenciamiento en el vector TA2.1 usando el juego de clonación Ta (Invitrogen, Carlsbad, CA) reactivos y protocolo. Se realiza una preparación de plásmido a pequeña escala usando el método de lisis alcalino estándar (Maniatis, 1989 Molecular Clonina: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Y, p.125) . El inserto de producto de reacción de cadena de polimerasa se secuencia mediante el método de terminación didesoxi convencional usando el protocolo y los reactivos a partir del juego AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y los resultados corren sobre un aparato de secuenciamiento ALFExpress II (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y se analizaron con software Analizador de Secuencia AlfWin v.2.0 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . Preparación de NTHi (P6) -HD. En cuanto se obtiene el gen que codifica P6, se ensambla un gen sintético que codifica el THi(P6)-HD mediante síntesis, hibridización, reacción de cadena de polimerasa, y ligación de los oligonucleótidos traslapantes . El segmento HD se añade ya sea al término N o C de la proteína vía un enlazador compuesto de lisina y serina. Esto nos permite probar el efecto de la localización relativa de HD con respecto al antígeno tiene en procesar por el sistema inmune. El gen de longitud completa ensamblada que codifica NTHi (p6) -HD fragmentos se amplifican mediante reacción de cadena de polimerasa y se liga en un plásmido de expresión. El gen final se verifica secuenciando el AD?. El plásmido que contiene NTHi (P6) -HD se transforma en E. coli . La bacteria se incuba en medio LB con ampicilina (50 g/ml) a 37 °C hasta la mitad de la fase log. En este momento se añade IPTG para inducir el promotor híbrido trp/lac. Se examinan puntos en el tiempo cada hora para determinar la expresión postinducción óptima de la proteína ?THi(P6)-HD. En el momento de expresión óptima, las células se cosechan mediante centrifugación. Los aglomerados de células se lisan y centrifugan. El lisado y los aglomerados de células se prueban para determinar la presencia de proteína. Una solución de 1-2 por ciento de desoxicolato de sodio se usa para extraer la proteína NTHi (P6) -HD del aglomerado de células lisado. El NTHi(P6)-HD se purifica entonces mediante afinidad selectiva a enlace níquel con un soporte sólido. Si es necesario, se puede hacer exclusión de tamaño, intercambio de ion, o cromatografía de interacción hidrofóbica para purificar adicionalmente el HTHi(P6) -HD. Preparación de liposoma . Hay tres enfoques generales para preparar liposomas NTHi (P6) -HD estables. En el primero, los liposomas se formulan de manera que la proteína y los lípidos se disuelven juntos en -el solvente orgánico (cloroformo/metanol) y luego se secan hasta una película delgada. Después de la resuspensión en regulador acuoso, los lípidos y las proteínas se ensamblan en estructuras bicapas mayores. La suspensión se sonifica entonces para hacer vesículas unilaminales pequeñas (SUV) . Para los diseños de proteínas más pequeñas, este método trabaja bien. Sin embargo, para estos experimentos, puede no ser deseable exponer la proteína a condiciones de solvente agresivo debido al potencial para desnaturalizar la proteína. De este modo, para evitar cambios conformacionales indeseables, se puede usar un segundo método que implici solubilizar NTHi(P6)-HD en el regulador de resuspensión antes de la hidratación de la película del lípido. Después de la hidratación con los lípidos la proteína espontáneamente se asocia con la membrana recientemente formada y se incorpora en la bicapa de las vesículas unilaminales pequeñas durante la sonificación. El tercer método implica preparar los liposomas sin la proteína NTHi (P6) -HD y luego añadirla a las vesículas unilaminales pequeñas ya formadas, permitiendo que el dominio hidrofóbico se integre en la bicapa de lípido. ,Los liposomas se preparan mediante sonificación de sonda de acuerdo con procedimientos descritos previamente (Fujii y colaboradores, 1997, Biochemistry 36:4959) .

Brevemente, los lípidos (con o sin proteína) se disuelven en un solvente orgánico tal como cloroformo/metanol. Las películas de lípidos se crean pipeteando alícuotas de las soluciones de lípidos en tubos de vidrio de fondo redondo, y evaporando el solvente a 65 °C bajo una corriente de gas nitrógeno. Las películas se colocan al vacío durante cuando menos ocho horas para remover solvente orgánico residual. Alternativamente,, los polvos de lípidos de la composición deseada se pueden preparar mediante una técnica tal como secado por aspersión y luego usarse en vez de las películas de lípidos. La preparación de los liposomas se acompaña hidratando las películas de lípidos o polvos en regulador e incubando la suspensión a 65 °C durante 5-10 minutos antes de la sonificación de la sonda. Los liposomas se filtran a través de un filtro de 0.22 m para esterilizar la preparación. Los liposomas se adaptaron al tamaño mediante dispersión de luz dinámica y la formación de agregados seguido por cuando menos cuatro semanas . Es"p"osible que la conformación de la proteína NTHi (P6) -HD pueda necesitar ser conservada. Por lo tanto, de los tres enfoques que se pueden usar para preparar liposomas, anticipamos que la adición de proteína como un componente de la solución hidratante o la adición de los liposomas después de que han sido formados ya se puede preferir. Cepas bacterianas . Las cepas NTHi 9333 (aislado de fluido espinal) , 35056 (aislado de infección respiratoria superior) , 43095 (aislado de otitis media) , 49766 (aislado de abceso de pulmón, cepa de referencia para prueba de susceptibilidad antimicrobiana) (ATCC) y la cepa Hib 51654 (ATCC) se usaron para demostrar la eficacia en el modelo de infección bacteriana. Antes del uso, un material congelado del organismo se subcultivó en caldo de infusión de corazón cerebro fresco suplementado con NAD (2 g/ml) y heme (10 g/ml) , y se incubaron durante 24 horas a 37 °C con 10 por ciento de dióxido de carbono. Una curva estándar para cada organismo consistente en unidades que forman colonia contra turbidez a 480 nm se usó para ajustar el inoculo de bacteria necesaria ya sea para los ensayos, bactericidas o la dosis de estímulo intraperitoneal . Procedimientos de vacunación y pruebas para la inducción de respuesta inmune al antígeno bacteriano. Grupos de ratas bebés (n=6 por grupo) se inmunizaron en los días postnacimiento 5, 12, 19, y 26 o en los días 5 y 26 con la preparación de vacuna de prueba o solución reguladora. La vacunación sistémica de las ratas se hizo mediante inyección subcutánea de las vacunas liposomales. Cuando los animales se inmunizaron con la vacuna vía la ruta intranasal, se anestesiaron con metofano, y el artículo de prueba (20 1) se administró usando una punta estéril en una micropipeta (Galuchan y colaboradores, 1993, J. Inf . Dis. 168:622). Las ratas bebés se alojaron con sus madres lactantes y se supervisaron para determinar reacciones adversas al procedimiento de vacunación, tal como la formación de granulomas, enrojecimiento o costras del sitio de inoculación. Una semana después de la última vacunación, las ratas bebés se anestesiaron con halotano y la sangre se recolectó mediante punción cardiaca y los pasajes mucosales se lavaged con salina para recolectar las secreciones mucosales. Los animales se eutanizaron con dióxido de carbono. Las titulaciones de anticuerpo bactericida del suero y de fluido mucosal se midió como se describió anteriormente . Para el estudio de estímulo intraperitoneal, las ratas bebés (26 días de edad) se estimularon con bacterias y su sangre y fluido cerebro espinal se supervisó para determinar la carga bacteriana en comparación con ratas no vacunadas. El muestreo de la sangre y del fluido cerebro espinal para las bacterias sucias después del estímulo indica que hay una carga bacteriana significativa en los animales (es decir, 1 x 104 CFU/ml sangre; 1 x 104 CFU/ml CSF) . El suero de las ratas vacunadas de 26 días de edad que contienen altas titulaciones de anticuerpos bactericidas se administra intravenosamente a ratas de 6 días de edad. Al día siguiente, las ratas bebés (n=10) reciben una dosis intraperitoneal de NTHi como se describió anteriormente. Las ratas bebés se supervisan para determinar la morbilidad y la mortalidad, las sobrevivientes se eutanizan después de 26 días, y la sangre y el fluido cerebro espinal se recolecta y se cultiva para determinar la presencia de NTHi. Estímulo intraperi toneal con NTHi . Un cultivo de 24 horas de edad de NTHi pasado en vivo se ajusta a 5 x l07 - 5 x 109 CFU/ml y 100 µl de este cultivo se inyectan intraperitonealmente en ratas de 5-10 días de edad (Smith y colaboradores, 1973, Inf . Immun. 8:278) . Las ratas bebés estimuladas siguen con sus madres lactantes después de la inoculación. Dentro de 18-96 horas después del estímulo, cuando menos 90 por ciento de las ratas bebés mueren usando esta dosis de bacterias pasadas. Medición de respuestas de anticuerpos específicos de antígeno mediante ELISA . Muestras de suero y de mucosa de cada rata se probaron para determinar los anticuerpos IgG e IgA específicos para el antígeno P6. Ya sea el P6 natural clonado o la proteína NTHi(P6)-HD se añadió a placas de 96 pozos adecuadamente tratadas para la incubación durante la noche a temperatura ambiente. Las placas se bloquearon con 1 por ciento de albúmina de suero bovino en regulador de bicarbonato, pH 9.6 durante 30 minutos a 37°C. Las placas se enjuagaron con 0.05 por ciento Tween 20/PBS. Las diluciones de cada muestra de suero y de mucosa se añadieron a las placas recubiertas con antígeno seguidas por incubación durante 2 horas a 37 °C y se enjuagaron con regulador Tween/PBS al final de la incubación. Los anticuerpos monoclonales enlazados con fosfatasa alcalina específicos para IgG o IgA de rata se añadieron a los pozos durante una hora a 37 °C. Los pozos se enjuagaron con regulador Tween/PBS y sustrato PNPP en regulador de dietanolamina, pH 9.5, añadido a los pozos para iniciar - la reacción colorimétrica. Las reacciones se detuvieron con 0.75N de hidróxido de sodio y se leyeron a 405 nm en el lector de placa ELISA Espectramax. Se calcularon las concentraciones de IgG y de IgA de rata a partir de la curva estándar obtenida de muestras de control de concentraciones conocidas de IgG o IgA de rata recubierta en placas de 96 pozos y tratadas como se describió anteriormente. Ensayo de anticuerpo bactericida . Muestras de suero que se probaron para determinar la presencia de anticuerpos bactericidas se incubaron a 56 °C durante 30 minutos para inactivar el complemento. El suero de prueba se diluyó serialmente en fluego en salina regulada de fosfato (PBS) . Un cultivo bacteriano 24 horas se ajustó a 5 x 104 CFU/ml en regulador PCM compuesto con PBS con 0.15 mM CaCl2 y 1 mM MgCl2 que contenía albúmina de suero bovino (BSA) . El suero de ratas bebés no vacunadas se usó como la fuente de complemento. Este suero se recolectó, se dividió y se almacenó a -70 °C hasta su uso. Las bacterias (20 1), el suero diluido serialmente (20 1) , el complemento (20 1) y 40 1 de 1 por ciento BSA en regulador PCM se añadió a cada pozo de una placa en racimo de 96 pozos. Para determinar la concentración bacteriana inicial, alícuotas de 10 1 de una mezcla de la muestra se plaqueó en el tiempo cero sobre placas de agar BHI frescas que contenían agar nutriente y suplementadas con NAD y heme . Después de la incubación de las mezclas de la reacción a 37 °C con 10 por ciento de dióxido de carbono durante una hora, con agitación, 10 1 de cada pozo se plaqueó en duplicado y se incubó durante la noche a 37 °C en presencia de 10 por ciento de dióxido de carbono para determinar el CFU/pozo. Los controles incluyen un pozo sin suero para asegurar que el complemento solo no está matando a las bacterias, y un pozo con suero de prueba, pero sin complemento para asegurarse de que el complemento del suero en la muestra de prueba se ha inactivado con éxito. Todos los ensayos se hicieron por triplicado y las diluciones que produjeron 50 por ciento de eliminación de las bacterias se usaron para comparar la actividad entre diferentes sueros. Ejemplo VI - Virus de hepatitis C Preparación de HCV (E2/NS1) -HD y HCV (E2/NS1?HVR1) -HD en células CHO. La secuencia de nucleótidos de la proteína HCV E2/NS1 se derivó de amplificación de reacción de cadena de polimerasa de una cepa de HCV obtenida como se describe más adelante . Usando un cebador 5 ' correspondiente a las primeras 21 pares de base del gen E2/NS1 CAAACCATGATCGCCCACGGA y un cebador 3' correspondiente a los residuos 622 a 628, GAAGTTGACAGTGCAGGGGTA, eliminando el dominio de transmembrana (Cocquerel, L., y colaboradores, 1998, J. Virol. 72(3):2183-91) . Además, cada cebador se flanqueó con sitios de restricción convenientes. El producto de la reacción de reacción de cadena de polimerasa se ligó en el pcDNA3. lHis que contenía el dominio HD como un plásmido de cásete (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) . El HCV/E2/NS1?HVR1) -HD se construyó suprimiendo el HVR1 del gen E2/NS1 correspondiente a los primeros 27 aminoácidos del residuo 384 al residuo 410. El mutante de supresión se hizo mediante amplificación de reacción de cadena de polimerasa usando un cebador 5' CAACTCATCAACACCAATGGC y el mismo cebador 3 ' usado para el control tipo natural . Los genes finales se verificaron secuenciando el ADN. Los plásmidos se transfectaron en células CHO (Deen, K. C. Y colaboradores, 1988, Nature 331:82) (ATCC, Rockville, MD) usando el reactivo de lipofección (Lipofectamina, Gibco/BRL Gaithersburg, MD) mediante el protocolo recomendado por el fabricante. Los transfectantes estables se seleccionaron usando G418 (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) y se clonaron limitando la dilución. La identificación de clonas que producen altos niveles de proteínas se valoró mediante análisis de manchado Western. Las proteínas HCV(E2/NS1) -HD y HCV(E2/NS1?HVR1) -HD se purificaron mediante afinidad selectiva a enlace de níquel con un soporte sólido. El enlazador histidina se removió mediante disociación de enteroquinasa después de que la purificación se completó. Si es necesario, la exclusión por tamaño, el intercambio de iones, y/o la cromatografía de interacción hidrofóbica se realizaron para purificar adicionalmente las proteínas HCV(E2/NS1) -HD y HCV(E2/NS1?HVR1) -HD. Preparación de proteínas HCV(HVRl) -HD y HCV (C) -HD en E. coli . las secuencias de nucleótidos de los epítopes elegidos se derivan de la secuencia de proteínas usando preferencias de codones de E. coli (Looman y colaboradores, 1987, EMBO J. 6:2489) . La o las secuencias de antígenos para ser insertadas en el cásete del gen corresponde a los epítopes de NP (147-161, TYQRTRALVRTGMD ; 55-69, RLIONSLTIERMVLS) v HA (91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASL) . En cuanto la o las secuencias adecuadas se obtienen, un gen sintético que codifica el HCV-HD, flanqueado por sitios de restricción convenientes, se ensamblan mediante síntesis, hibridización, y ligación de oligonucleótidos traslapantes. Brevemente, el ensamble de los fragmentos se logra calentando a 65 °C y recociendo los oligonucleótidos conforme regresan a la temperatura ambiente. Después de la incubación durante 2 minutos en hielo, los fragmentos se ligan con ligasa ADN. El gen de longitud completa ensamblado que codifican los fragmentos HCV se amplifican mediante reacción de cadena de polimerasa, se disocia mediante enzimas de restricción y se aisla mediante electroforesis en gel. El gen HCV se liga entonces en el plásmido de expresión disociado similarmente que contiene el gen HD (por ejemplo, pTrcHis, o pQE30) . Los genes finales se verificaron secuenciando el ADN. Los plásmidos que contienen HCV-HD se transforman en E. coli . Las bacterias se incuban en medio LB con ampicilina (50 µg/ml) a 37°C hasta la mitad de la fase log. En este momento, se añade IPTG para inducir el promotor híbrido trp /lac. Puntos del tiempo se examinan cada hora para determinar la expresión postinducción óptima de las proteínas HCV-HD. En el momento de la expresión óptima, las células se cosechan mediante centrifugación. Los aglomerados de células se lisan y centrifugan. El lisado se prueba para determinar la presencia de proteína. Las proteínas HCV-HD se purifican mediante afinidad selectiva al enlace de níquel con un soporte sólido. El enlazador histidina se remueve mediante disociación de enteroquinasa después de que la purificación se completa. Si es necesario, exclusión por tamaño, intercambio de iones, o cromatografía de interacción hidrofóbica se realizan para purificar adicionalmente el HCV-HD. La preparación liposomal y los procedimientos de vacunación, la prueba de inducción de respuesta inmune, las mediciones de respuesta de anticuerpos por ELISA, el ensayo DTH, el análisis de ARNm específico para citocina, las mediciones de citocina por ELISA, la proliferación de células T inducida por antígenos, y las respuestas anti-HIV CTL se describen esencialmente en el Ejemplo III anterior.

Claims (37)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención que antecede, se considera como una novedad y por lo tanto se declara como propiedad lo contenido en las siguientes : REIVINDICACIONES 1. Una composición de liposoma inmunogénico que comprende: lípidos que forman vesículas; y una construcción antigénica que comprende uno o más determinantes antigénicos y un dominio hidrofóbico, en donde el dominio hidrofóbico se asocia con la membrana de dicha composición de liposoma.
2. 2. La composición de liposoma inmunogénico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizada porgue además comprende uno o más adyuvantes .
3. 3. La composición de liposoma inmunogénico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizada porque la construcción antigénica está químicamente sintetizada.
4. 4. La composición de liposoma inmunogénico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio hidrofóbico es un péptido.
5. 5. La composición de liposoma inmunogénico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 4, caracterizada porque el dominio hidrofóbico consiste en desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 500 residuos de aminoácidos.
6. 6. La composición de liposoma inmunogénico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 5, caracterizada porque el dominio hidrofóbico comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
7. 7. La composición de liposoma inmunogénico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizada porque el determinante antigénico se deriva de un antígeno seleccionado de un grupo que consiste en HSV gB o gD, HIV gpl20, CMV gB, HCV E2 , INFV HA o NA, y H. influenzae P6.
8. 8. La composición de liposoma inmunogénico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizada porque la construcción antigénica además comprende una región enlazadora que enlaza los determinantes antigénicos con el dominio hidrofóbico.
9. 9. La composición de liposoma inmunogénico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 8, caracterizada porque la región enlazadora es un péptido.
10. 10. La composición de liposoma inmunogénico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 9, caracterizada porgue la región enlazadora consiste en de 1 a aproximadamente 200 residuos de aminoácidos.
11. 11. La composición de liposoma inmunogénico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 10, caracterizada porque los residuos de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
12. 12. La composición de liposoma inmunogénico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizada porque la construcción antigénica es una proteína de fusión.
13. 13. La composición de liposoma inmunogénico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 9, caracterizada porgue la construcción antigénica es una proteína de fusión.
14. 14. Un método para inducir una respuesta inmunogénica en un animal huésped, que comprende administrar una cantidad inmunogénicamenté efectiva de la composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1.
15. 15. Un método para inducir una respuesta inmunogénica en un animal huésped, que comprende administrar una cantidad inmunogénicamenté efectiva de la composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2.
16. 16. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 14, caracterizado porque el animal huésped es un mamífero .
17. 17. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 16, caracterizado porque el mamífero es un humano .
18. 18. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 14, caracterizado porque el animal es un pájaro.
19. 19. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 17, caracterizado porque el determinante antigénico se selecciona del grupo que consiste en HSV gB o gD, HIV gpl20, CMV gB, HCV E2 , INFV HA o NA, y H. influenzae P6.
20. 20. Una composición de vacuna que comprende una cantidad efectiva de una composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente, aceptable.
21. 21. La composición de vacuna de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20 caracterizada porque además comprende uno o más adyuvantes .
22. 22. Un cásete de ADN para la inserción en un vector de expresión que comprende secuencias las cuales codifican una proteína de fusión inmunogénica, comprendiendo dicha proteína: un dominio de proteína hidrofóbico, y uno o más determinantes antigénicos.
23. 23. El cásete de ADN de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 22, caracterizado porque el determinante antigénico se deriva de un antígeno seleccionado del grupo que consiste en HSV gB o gD, HIV gpl20, CMV gB, HCV E2 , INFV HA o NA, y H. influenzae P6.
24. 24. Un cásete de ADN de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 22, caracterizado porque el dominio hidrofóbico es un péptido que consiste entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 500 residuos de aminoácidos.
25. 25. El cásete de ADN de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 24, caracterizado porque el péptido comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
26. 26. El cásete de ADN de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 22, caracterizado porque la proteína de fusión además comprende una región de enlace que une el determinante antigénico y un dominio hidrofóbico.
27. 27. El cásete de ADN de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 26, caracterizado porque la región de enlace consiste en de 1 a aproximadamente 200 residuos de aminoácidos .
28. 28. El cásete de ADN de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 27, caracterizado porque los residuos de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
29. 29. Un vector que comprende el cásete de ADN de la reivindicación 22.
30. 30. Un método para hacer una composición de liposoma inmunogénico que comprende: expresar un gen que codifica una proteína de fusión que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrofóbico; disolver los lípidos que forman vesículas y la proteína de fusión en un solvente orgánico conveniente; formar una película de lípido o polvo seco por aspersión evaporando el solvente orgánico; hidratar la película o polvo de lípido; y dispersar la película o polvo de lípido hidratado para formar una composición de liposoma inmunogénico.
31. 31. Un método para hacer una composición de liposoma inmunogénico que comprende: expresar un gen que codifica una proteína de fusión que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrofóbico; disolver la proteína de fusión en un regulador acuoso; hidratar los polvos lípidos o películas lípidas con el regulador que contiene la proteína de fusión; y dispersar los polvos o películas de lípidos para formar una composición de liposoma inmunogénico.
32. 32. Un método para hacer una composición de liposoma inmunogénico que comprende: expresar un gen que codifica una proteína de fusión que comprende un determinante antigénico y un dominio hidrofóbico; disolver la proteína de fusión en un regulador acuoso; y añadir la proteína de fusión a liposomas preformados para formar una composición de liposoma inmunogénico .
33. 33. Una composición inmunogénica que comprende una construcción antigénica que comprende uno o más determinantes antigénicos y un dominio hidrofóbico; y un portador farmacéuticamente aceptable.
34. 34. La composición inmunogénica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 33 caracterizada porque la construcción antigénica además comprende una región enlazadora que enlaza los determinantes antigénicos con el dominio hidrofóbico.
35. 35. La composición inmunogénica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 33 que además comprende uno o más adyuvantes .
36. 36. Una composición de emulsión inmunogénica que comprende lípidos que forman vesícula; y una construcción antigénica que comprende uno o más determinantes antigénicos y un dominio hidrofóbico.
37. 37. La composición de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 36 donde la construcción antigénica es una proteína de fusión.