UA75327C2 - Immunogenic liposomal compositions - Google Patents

Immunogenic liposomal compositions Download PDF

Info

Publication number
UA75327C2
UA75327C2 UA2001031606A UA2001031606A UA75327C2 UA 75327 C2 UA75327 C2 UA 75327C2 UA 2001031606 A UA2001031606 A UA 2001031606A UA 2001031606 A UA2001031606 A UA 2001031606A UA 75327 C2 UA75327 C2 UA 75327C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
immunogenic
antigenic
liposomal composition
hydrophobic domain
complex
Prior art date
Application number
UA2001031606A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Publication of UA75327C2 publication Critical patent/UA75327C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Опис винаходу
Історично склалося, що використання вакцин є безпечним та ефективним методом захисту великих 2 популяцій проти різноманітних інфекційних захворювань. Імунізація проти вірусних та інших мікробних організмів є звичайно безпечною та ефективною і забезпечила значну частину збільшення тривалості життя осіб у розвинутих країнах. Проте, може виявитись ряд шкідливих побічних ефектів, у залежності від природи вакцини та конкретного імуногена. Недостатня інактивація інтактного вірусу у минулому призводила до ненавмисного інфікування замість захисту після вакцинації (Тідегй, 1959, Міїйагу Мей. 124: 342). У деяких випадках 70 імунізація інтактними організмами, такими як вірус грипу, може прискорити розвиток аутоїмунних захворювань, спрямованих проти нормальних тканин, таких як синдром Гійєна-Барре | аподтиїг еї аї., 1984, 9. Ерідетіо|. 119:841). Крім власне агентів, присутність певних речовин усередині клітин чи у комплексному середовищі може створити умови для індукування тяжких алергічних реакцій на чужорідні протеїни |(Матапе апа Оетига, 1988,
Еріает, Іпї. 100: 291). Оскільки процедури ефективної вакцинації часто вимагають багатократних імунізацій, ці 72 небажані події можуть знизити ефективність вакцини і погіршити ставлення громадськості до процедури вакцинації. Нещодавно були проведені випробування сучасних молекулярно-біологічних методик з метою забезпечення поліпшених безпечності та ефективності нових препаратів вакцин. Потенційні стратегії, з яких зараз проводять дослідження, включають: вакцини, одержані з використанням методик, пов'язаних із рекомбінантними ДНК (Сопгу еї аїЇ., 1994, Сапсег Кев. 54:1164; Ни еї аї., 1988, 9. МігоІ. 62:176), одержання простих синтетичних пептидів, призначених для використання як антигени (Магаеїйй еї аЇ.,, 1992, Массіпев 8:1405; УУайагі еї аіІ.,, 1987, 9. Ехр. Мей. 165:459), і пряму ін'єкцію генетичного матеріалу до тканин з метою стимулювання захисних реакцій |(ОІтег еї аЇ.,, 1993, Зсіепсе 259:1745). Зокрема, використання антигенів на основі простих пептидів для індукування специфічних імунізаційних реакцій знаходиться у центрі уваги багатьох досліджень. Ця стратегія є привабливою, оскільки вона має потенціал щодо забезпечення імунологічної с специфічності, більш суворого контролю виробничих процесів, та усунення більшості вторинних джерел Ге) матеріалів чи забруднень, асоційованих з продукуванням імуногена.
Однак, використання очищених протеїнів чи пептидних фрагментів для вакцинації залежить від доставки матеріалу до ділянки імунізації за допомогою ефективного носія антигену. Потенційно, одним з найбезпечніших носіїв були комплекси вакцин на ліпідній/ліпосомній основі. Ліпосоми вже давно визнані як комерційно в життєздатна технологія, оскільки вони знижують токсичність лікарських засобів, збільшують час циркуляції у с кровотоці, і змінюють біорозподіл та фармакокінетику молекул лікарського засобу |Еції, 1996; Мезісіев, ей.
М.Козоїї, Магсе! ОекКег, Мем Могк, МУ, р.491). При введенні іп мімо ліпосоми циркулюють у крові й видаляються о фагоцитарною системою моноцитів/макрофагів, особливо у печінці, селезінці, лімфатичних вузлах та тканинах (|З легенів |Сіаазеп, 1996; Мевісіев, ей. М.Козоїйї, Магсе! ЮОекКег, Мем Могк, МУ, р.б49). Здатність ліпосом впливати на характер розподілу антигенів дає можливість припустити, що ліпосомальний імуноген буде - максимально експонованим для імунної системи. Досі були проведені випробування кількох систем на ліпідній основі, включаючи пептиди, кон'юговані з ліпідами (Магаеїї еї аЇ,, 1992, Массіпев 8:1405; УМУаїагі еї аї., 1987, 9. Ехр. Мей. 165:459), реконституцію цілих субодиниць протеїнів у присутності ліпідів (Могеїп апа «
Зітоп5, 1985, Массіпез 4:166; Сгедогіаді5, 1995, ТірббФесп 13:527), та асоціацію протеїнів з попередньо З утвореними ліпосомами |ППегіеп апа Зпапит, 1989, Іттипої. Гей. 22:253; АМіпд еї аї., 1985, Массіпез 4:166). с Хоч було показано, що ці методики є імунологічно активними, технічні труднощі, асоційовані з
Із» великомасштабним виробництвом протеїнів та їх ліпідних носіїв, а також вартісні обмеження роблять їх менш привабливими для промислового виробництва. Отже, для використання потенціалу, пов'язаного зі застосуванням ліпосом у розробці вакцин, потрібна вдосконалена система чи підхід до одержання протеїнових антигенів. і Цей винахід пропонує імуногенну ліпосомну композицію, яка включає везикулоутворюючі ліпіди та антигенний 4! комплекс, який включає один чи кілька антигенних детермінантів та гідрофобний домен. Кращий варіант, коли гідрофобний домен є асоційованим з мембраною ліпосомної композиції. Також добре, коли гідрофобний домен є о пептидом і, за оптимальним варіантом втілення, складається з від приблизно 15 до приблизно 500 ка 20 амінокислотних залишків, ще краще - з менш ніж приблизно 300, і найкраще - з менш ніж приблизно 50 залишків, де принаймні одна чи кілька амінокислот є обраними з групи, що складається з Аа, Азп, Сув, (зіп, СУ, Нів, "м Пе, Геим, Меї, Ре, Рго, Зег, ТАг, Тгр, Туг та Маї.
Згідно з одним із варіантів втілення цього винаходу, імуногенна ліпосомна композиція додатково включає один чи кілька ад'ювантів. Приклади придатних ад'ювантів включають ліпофільні молекули, такі як Ліпід А та 22 |інші ліпополісахариди, Оці А, 0521, МЕ59, РзСЗ5, МТР-РЕ, а також водорозчинні молекули, включаючи цитокіни,
ГФ) такі як ІІ -2, 11 -4, 11-12, інтерферони тощо. Інші приклади цитокінів наведені у Таблиці 1 нижче. юю Згідно з іншим варіантом втілення цього винаходу, антигенний комплекс додатково включає лінкерну ділянку, яка зв'язує антигенний детермінант(и) з гідрофобним доменом. За кращим варіантом втілення, лінкерна ділянка є пептидом, який складається з від 1 до приблизно 200 амінокислотних залишків. Ліпше, коли амінокислотні 60 залишки є поширеними у природі амінокислотами, такими як Аа, Агд, Азп, Авзр, Сув, Сім, Сіп, Су, Нів, Іе,
І ем, Гуз, Меї, Ре, Рго, Зег, Тпг, Тгр, Туг та/або Маї.
Крім того, цей винахід пропонує спосіб індукування імуногенної реакції у тварини-хазяїна, який включає введення імуногенно ефективної кількості описаної вище ліпосомної композиції. Хоч хазяїн може бути будь-якою твариною, включаючи домашню птицю, краще, коли тварина-хазяїн є ссавцем, і найкраще - людиною. У певних бо кращих варіантах втілення імуногенна ліпосомна композиція додатково включає один чи кілька придатних ад'ювантів.
Крім того, цей винахід пропонує касету ДНК для інсерції до вектора, який включає послідовності, що кодують імуногенний злитий протеїн, де злитий протеїн включає гідрофобний білковий домен та один чи кілька антигенних детермінантів.
Цей винахід також пропонує спосіб одержання імуногенної ліпосомної композиції, який включає: експресію гена, що кодує злитий протеїн, який включає антигенний детермінант та гідрофобний домен, розчинення ліпідів та злитого протеїну у придатному органічному розчиннику чи суміші органічних розчинників, утворення ліпідної плівки шляхом упарювання органічного розчинника, гідратації ліпідної плівки, та диспергування гідратованої 7/0. Ліпідної плівки з утворенням імуногенної ліпосомної композиції.
Крім того, цей винахід пропонує спосіб одержання імуногенної ліпосомної композиції, який включає: експресію гена, що кодує злитий протеїн, який включає антигенний детермінант та гідрофобний домен, розчинення злитого протеїну у водному буфері, гідратацію ліпідних порошків чи ліпідних плівок буфером, який містить злитий білок, і диспергування ліпідних порошків чи плівок з утворенням імуногенної ліпосомної 7/5 Композиції.
За іншим варіантом втілення, цей винахід пропонує спосіб одержання імуногенної ліпосомної композиції, який включає: експресію гена, що кодує злитий протеїн, який включає антигенний детермінант та гідрофобний домен, розчинення злитого протеїну у водному буфері, й додавання злитого протеїну до попередньо утворених ліпосом з утворенням імуногенної ліпосомної композиції.
За іншим варіантом втілення, цей винахід пропонує спосіб одержання композиції імуногенної ліпідної емульсії, який включає: експресію гена, що кодує злитий протеїн, який включає антигенний детермінант та гідрофобний домен, та виготовлення композиції імуногенної ліпідної емульсії у будь-який з описаних вище способів з використанням ліпідної дисперсії (наприклад, масла, такого як соєвої олії) замість ліпосом.
За ще іншим варіантом втілення, цей винахід пропонує спосіб одержання імуногенної ліпосомної композиції сч г чи ліпідної емульсії, який включає: хімічний синтез злитого протеїну, що включає антигенний детермінант та гідрофобний домен, і виготовлення імуногенної ліпосомної композиції чи ліпідної емульсії у будь-який з і) описаних вище способів.
У тому значенні, що використовується тут, "асоційований з мембраною" означає, що гідрофобний домен є принаймні частково зануреним до ліпосомної мембрани, і краще, коли він не є ковалентно зв'язаним з М зо везикулоутворюючими ліпідами. Гідрофобний домен може бути також зв'язаним з ліпідним "хвостом" жирної кислоти, який сам є зануреним до мембрани. с
Фіг.1 показує ефективність ліпосомної композиції за цим винаходом у створенні захисту проти НБМ2. с
Фіг.2 зображує порівняння ефективності ліпосомної композиції за цим винаходом з іншими композиціями вакцини. о
Фіг.3 показує криву виживаності мишей, що демонструє здатність ліпосомального НЗМ24(1-23)-НО викликати ї- захисну імунну реакцію.
Цей винахід пропонує систему доставки антигенів, розроблену з метою поліпшення ефективності та безпеки імунізації проти різноманітних мікробних агентів та ракових захворювань. Імуноген може бути кодованим касетою гена, яка складається з гідрофобного домену (НО), злитого зі специфічною антигенною послідовністю. Готують « плазміду, яка містить послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують НО та антигенний епітоп, таекспресують у. пев) с придатному хазяїні, такому як, наприклад, Е.соїї, Р.разіогів, клітини комах, клітини СО5-1 чи клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) |Сепеїйїс Епдіпеегіпд Мемуз, 18:17 (1998))Ї. Після експресії та очищення протеїну ;» його використовують для створення ліпосомної композиції. У присутності мембрани протеїн асоціюється з ліпідним бішаром з утворенням стабільної структури, причому гідрофобна ділянка є асоційованою з мембраною, а антигенний епітоп орієнтований до водного середовища. Може бути розроблена плазміда з рестрикційними -І сайтами у ключових положеннях, так щоб можна було легко здійснювати заміщення різних антигенних епітопів, таким чином створюючи можливість використання різних антигенних епітопів для забезпечення максимального о захисту після імунізації. Однією з унікальних ознак цієї касети є те, що протеїновий компонент може бути 2) продукованим у клітинах-хазяях у великій кількості, легсо очищеним, а потім введеним до ліпосом. Це забезпечує максимальну гнучкість при визначенні епітопу, який буде найбільш придатним для захисту від о мікробних агентів чи ракових захворювань, водночас задовольняючи кінцевим вимогам великомасштабного
І виготовлення та комерційного розповсюдження вакцини.
Отже, цей винахід має кілька переваг: (1) епітопи можуть бути легко заміщені з метою забезпечення максимальної гнучкості при розробці вакцини; (2) до молекули-носія можуть бути введені численні епітопи; (3) ов У разі потреби можуть бути включені великі антигенні послідовності (тобто, оболонкові протеїни чи рецепторні домени) чи субодиниці; та (4) експресований протеїн-носій є водорозчинним і може бути легко очищеним з (Ф, використанням стандартних методик одержання протеїнів. Синтез антигенного комплексу як водорозчинного ка злитого продукту зводить до мінімуму потенційні проблеми великомасштабного виробництва, причиною яких є гідрофобна ділянка протеїну. Отже, створення протеїну, який має гідрофобний домен для заглиблення до бор Лліпосомної мембрани, але залишається водорозчинним, буде великою перевагою. За певних обставин, під час процесу очистки може бути використана невелика кількість солюбілізуючого агента, такого як гуанідин, сечовина, додецилсульфат натрію, октилглікозид чи дезоксихолат. Цей винахід також пропонує комплекси, які включають два чи більше антигенів. Такі комплекси можуть бути представлені як:
НьЬМ - Ділянка антигену І-НО - Ділянка антигену І-СООН 65 Винахід також передбачає використання одержаних з природних чи синтетичних джерел окремих трансмембранних спіралей або пучків спіралей (2-12). Ділянки антигенів можуть знаходитись біля М- чи С-кінця,
або розташовуватися між петлями, утвореними між окремими нитками пучка.
Термін "антиген" у тому значенні, що використовується тут, стосується будь-якої речовини (включаючи протеїн чи протеїн-полісахарид, ліпополісахарид, мікробну субодиницю, патоген у цілому, або раковий маркер),
Яка, будучи чужорідною для тварини-хазяїна, при одержанні доступу до тканини такої тварини, стимулює макрофаги, антиген-презентуючі клітини та утворення антигенспецифічних антитіл, і специфічно реагує іп мімо чи іп мйго з такими антитілами. Крім того, антиген стимулює проліферацію та/або активацію Т-лімфоцитів з рецепторами для антигену та перехресно-реагуючі антигени (наприклад, природні клітини-кілери (МК-клітини), цитотоксичні Т-клітини та Т-клітини-хелпери), і може реагувати з лімфоцитами, ініціюючи ряд реакцій, які /о називають клітинно-медійованим імунітетом. Добре, коли до імуногенних композицій за цим винаходом антиген входить у кількості приблизно 0,1-20мг/мл антигену-НО. Ще краще, коли вміст антигену становить приблизно 0,5-5мг/мл антигену-НО. "Антигенний детермінант є такою частиною антигену чи антигенного комплексу, яка визначає його імунологічну специфічність. Звичайно антигенний детермінант, або сгаптен, є пептидом, протеїном чи 7/5 полісахаридом, що входить до складу поширених у природі антигенів. У штучних антигенах він може бути речовиною з низькою молекулярною вагою, такою як похідне арсанілової кислоти. Антигенний детермінант буде специфічно реагувати іп мімо чи іп міго з антитілом чи Т-лімфоцитами, індукованими антигенною формою антигенного детермінанта (наприклад, антигенного детермінанта, приєднаного до імуногенної речовини).
Антигенні детермінанти, які можуть бути використані у практиці цього винаходу, можуть бути одержані, лише як приклад, з вказаних нижче антигенів:
Вірусні патогени
Вірус Антиген Посилання
Синього язика (Віпе(пдце) Структурний Мигтау апа Еаїйоп, 1996, А!йвіга!. Меї. У. 73:207 сч
Герпесу великої рогатої худоби (ІВК) Егап? еї аї., 1996, Мегїегіпі Медісіпа 41:213
Вірусної діареї великої рогатої Е2 Вгивснке еї а! , 1997, Массіпе 15: 1940 (о) худоби
Ї цдетап апа Каїг, 1994, Віоіодіса!в 22: 21
Цитомегаловірус" дрб8 УУадпег ег а!., 1992. У. Міго!. 66: 5290 рч- ов Уапа ег а!., 1996. У. Іпї. Сів. 174: 387
Поліепітоп Ад Тнпотвоп еї а!., 1996. 3). Ітпипої. 157: 822 с
РМ Еопзеса евї а!., 1994, Массіпе 12: 279 со
Е Еопзеса евї а!., 1994, Массіпе 12: 279
Е/М51 Мепидораї апа соціа, 1994, Массіпе 12: 967 о
М81/М82 Сгевеп еї! а/., 1997, Міго!. 234: 383 рч-
Оболонка В Зіттопв еї а!., 1998, Ат. У. Тгар. Мед. Нуд. 58:655 капсид типу 4 Садпоп ег а!., 1996, .). Мігої. 70: 141
Чуми (Собачої) Р/Н Рагао еї а!., 1997, Ат. У. Меї. Кев. 58: 833 «
Еболи ОР/ЧР Мападеглапаетп еї а!., 1998, Мігої. 246: 134
Епштейна-Барр ЕВМА 1,2,3,4,6 Мозв еї а!., 1992. Зет. Іттипої. 4: 97 - с Ящуру МРІ1 Ріїднегіа еї а!., 1995, Массіпе 13: 953 п Гепатиту А А/В сотро Ад Вгодоега ег! а!., 1996, Массіпе 14: 1407 к » Гепатиту В НЬБАд Тнапамаїа ег а!.. 1995, РМАЗ 92: 3358 зкеїу еї а!., 1981, Майте 290:51
Гепатиту С Е2/М51 У/еіпег еї а!., 1992. РМАБ 89: 3468 - Тапідисні еї а!., 1993, Мігої. 195:297 с М Кпидуакоу еї а!.. 1995. Мігої. 206: 666
МА Кпидуакоу еї а/!., 1995, Мігої. 206: 666 о МБ Кпидуакоу еї а!., 1995. Мігої. 206: 666 ма 70 Е! І есппегеї! а!., 1998. Мігої. 243:313
Простого герпесу | оо Г опа еї аї., 1984, Іпї. Іттип. 37: 761 "м Простого герпесу 112 ов МеОегтої еї а, 1989, Мігої. 169:244 оо І опо еї аї., 1984, Іпї. Іттип. 37: 761
Герпесу В Нипі апа Меепае?, 1969, І ар. Апітаї! Саге 19: 221 99 Собачої холери Е! мап Кі)п еї а!., 1994, .). Міго!. 68:3934 (Ф; Імунодефіциту людини НІМ Моїіесшаг Іттипоіоду багаразе ка Папіломи людини ІІ зилісн еїа!., 1995, РМАБ 92: 11553
Вівивв в! аї., 1992, РМАЗВ 89: 7871 во Еб6 Вівивв в! аї., 1992, РМАЗВ 89: 7871
ЕТ Вівивв в! аї., 1992, РМАЗВ 89: 7871
Грипу НА/ЛЯ Ї амегапа У/ерзіег, 1976, Мігої!. 69: 511
МР Мапіпоп еї а!ї., 1993, Єиг. У). Іттипої. 23: 1719
Японського енцефаліту? Е Кітига-Кигода апа мУавиї, 1988, 9. Іттипої. 141: 3606 65 Марбурга ОР Немеу егаї., 1997, Мігої. 239: 206
Хвороби Марека (домашня птиця) СА Воуїе апа Неїпе, 1993, Іттип. Сеїі Вісі. 71: 391 ов Воуїе апа Неїпе, 1993, Іттип. Сеїі Вісі. 71: 391
Кору НА Согдово еї а!., 1998, .). Мігої. 72: 2516
МР Согдово еї а!., 1998, .). Мігої. 72: 2516
Норвалка капсид 5бкД Ваї еї а!ї., 1998, у. Мігої!. 72: 1345
Ньюкасльської хвороби Е Кеаау ег аї., 1996, Массіпе 14: 469 (домашня птиця) нм Кеаау ег а!., 1996. Массіпе 14: 469
Парагрипу Р/НМ Могеїп ег а!., 1983, 9. Сеп. Мігої. 64: 1557
Парвовірус (собачий) МР2 І оре; дае Тигіво еї а/!.. 1992, .). Мігої. 66: 2748
Сказу ІЄЇ УУїКОГг еї а!., 1984, РМАБЗ 81: 7194
Респіраторно-синцитіальний Протеїн Є ГРаївзеу апа уУуаїви, 1996, Массіпе 14: 1214
Субодиниця ГО Мецтії єї а!., 1997, Массіпе 15: 525
Неттіпо еї а/ї., 1995, Сііп. Місгобріо!. Кеум. 8: 22
Чуми великої рогатої худоби НЕ Маїк еї а!.. 1997, Массіпе 15: 603
Ротавірус? УРА 7поц еї а!., 1994, у). Мігої. 68: 3955
МУР7 7поц еїга)ї.. 1994 ,у. Мігої. 68: 3955
УРб Раотьо еї а!., 1994. у). Сеп. Мігої!. 75: 2415
Краснухи Е! Тгцае! еї а!ї., 1985, У. Мігої. Мей. 12: 243
Вітряної віспи СЕ Еомег в а/., 1995, Мігої. 214: 531
Агуіп, 1996, Іпї. Сііп. Сів. М. Атег. 10: 529
Жовтої лихоманки? Е соціа еї а!.. 1986, 9). Сеп. Мігої!. 67:591
Мме1 (48кД) Зеспіезспіпдег еї а!.. 1987, у. Іттипої. 135: 2805 с а. Огляд див. у Равв, 1996. Іпт. Аа. Оів. 5: 240; Амегу, 1998, Сигг. Ор. Сагаїйо!. 13: 122. Ге) р. Усі ці віруси є флавівірусами - огляд наведений у Мепидораї! апа Сошіа, 1994, Массіпе 12: 966. с. Огляд див. у Адітога еї а!., 1994, Іпї. рів. Сііп. М. Атег. 8: 859. а. Перелік антигенів ВІЛ див. у НІМ Моіесшаг Іттипоіоду Раїабазе, рибі. Тнеогеїйса! Віоіоду апа Віорпувісв, Мем Мехісо (1995). е. Перелік антигенів ротавірусу див. у "Коїамігив Апіїдепв", Новпіпо апа Карікіап, 1994, Сигт. Тор. Місгобіої. Іттипої. 185:179. м
Бактеріальні токсини" см
Бактерія Токсин Посилання со
Васійив апіпгасів Сибірської язви І ерріа, 1982, РМАЗ 79: 852 ю
Вогаегїейа репизвів Коклюшу У/еівв апа Неулей, 1986, Апп. Кеу. Місгобіо!. 40:
Сіовігідічт роїшіпит Ботуліничний Зітрзоп, 1981, Рнаптасої. Кеу. 33: 155 -
Сіовігідішт аїйісне Дифіциле Кпоор еї! а!., 1993, Сііп. Містобріої!. Кеу. 6: 251
Сіовігідіт іеїапі Правцевий Еїдеї!5 еї а!., 1983, Місгобіої!. Кеу. 47: 596
Согупебасівегішт дірпіпегіае Дифтерії Рарреппнеїтег, 1977, Апп. Кеу. Віоспет. 46: 69 «
Езвспегісніа сої Ентеротоксин (С1ЇЇапа Кіспагазоп, 1980, У. Іпї. Сів. 141: 64
Резепйдотопах аегидіпоза Екзотоксин А ІдієемеКі апа Кабаї, 1977, РМАЗ 72: 2284 о, с Зпідейна дузепівгіає Шиги Кеивсп апа дасемісл, 1975. .). Іпї. Сів. 131: 533 з» Мівбгіо споїегає Холерний РіпКкеївівїп, 1973, Стії. Кем. Місгобіої!. 2: 553 " Загальний огляд див. у Мідаіенгоок апа Сопапа, 1984, р.199. -і
Бактеріальні патогени о Бактерія Антиген Посилання о Васійив вр РАЛ РБ/ЕГ Зіпой ега!., 1998, пт. Іттип. 66: 3447
Вогаегйеїйа зр Репасііп/Р.69 Апаегвоп еїа!., 1996, Массіпе 14: 1384 де Вогтеїа зр О5БрРА/О5рВ Маєеча!,, 1996. Массіпе 14: 1366 "І О5рС Маїіезеп еї а!., 1998, Іпт. Іппип. 66: 4073
Вгисейа вр І7112 Васнгасн еї аї!., 1994, Іпт. Іппип. 62: 5361
Отр16 Тірог еї аї., 1994, Іпт. Іптіпип. 62: 3633
Сатру!овасіег зр Отр18 Копкеї! еї а!., 1996, Іпї. ІТТ о Спіатуаіа! МОМР Зрапіпо ег а!., 1994, РМАБ5 91: 2456
Енпісніа зр Рікіпіва, 1991, Сііп. Місгобіо!. Кеум. 4: 286 їмо) Евспегіспіа зр РАГ Спеп апа Неппіпа, 1987, Єншг. У). Віоспет. 163: 73
Наеторнпйив зр РІ Ї оеб, 1987, Іпї. Іттип. 55: 2612 бо Р2 Мипзоп еї а, 1983, .. Сіїп. Іпмеві. 72: 677 р4 согееп еїа!., 1991, Іпї. Іттип. 59: 3191 рРБ Мипвоп апа Огапоїї 1985, Іпї. Іттип. 49: 544
Рб согееп еї а!ї., 1990, Іпї. Іттип. 58: 3272
Протеїн О Акксуппіи еї а!., 1996, пт. Ітти бо р15 Тпотаз е! а!., 1990, Іп'. Іттип. 58: 1909 мапа еї а!., 1998, Іпї. Іттип. 66: 3349
Протеїн 98кД Кітига еї а!., 1985, Іпї. Іттип. 47: 253
НА Ї созтоге еї а!., 1998, Іпї. Іттип. 66: 899
Неїїсобасіег руїогі Уреаза А Міснеці е! а!., 1994, Савігоепіегої. 107: 1002
Уреаза В Міснецйі еї а!., 1994, Савігоепіегої. 107: 1002 уасА Кієапіношзв еї а!., 1998, Вгії. Мед. ВиїІ. 54: 229
Каталаза Каадсійеї а!., 1997, Іпт. Іптпип. 65: 4668
І едіопеїа зр РРІА І пдмлд еї а!., 1996, Іпї. Іттип. 64: 1659
І еріозріга зр ОМА Вгомп еї а!., 1991, Іпт. Іттип. 59: 1772
Ї івіегіа зр Іш ще) Нацу апа Вемап. 1992, у). Ехр. Меа. 175: 1531
Мусобасіегіт Іергає Протеїн 35 КД Ттіссав евї а!., 1996, ті. Іттип. 64: 5171 18кДд Ваштааг еї а/!., 1996, Іпї. Іттип. 64: 2274
А985БА Ї ашпоїз евї а!., 1994, Іпт. Іпіпип. 62: 3679 715 Мусобасівегішт Шшврегсцовзит МРВ5О9 Косне еї а!., 1994, Іпї. Іттип. 62: 5319
А985БА Ї ашпоїз евї а!., 1994, Іпт. Іпіпип. 62: 3679
Мусоріазта 90 КД Егап2ово еї аї., 1993, Іпт. Іппип. 61: 1523
Меївзегіа! вр ОоММУ Апаеггоп еї а!., 1997, Массіпе 15: 1225
Рог Зрапіпа еї а!., 1994. РМАЗ 91:2456
Резепдотопаз 5р Орг Нисонез еї а/!., 1992. Іпт. Іттип. 60: 3497
Оргі Зреспівга!., 1996. Массіпе 14: 1111
О-полісахарид Наїапо апа Ріег, 1998, пт. Іттип. 66: 3719
ЗаІтопеїйа зр ОМР/Рог Ашгкагапа Капаї, 1997, Іпї. Іттип. 65: 2382
Мі Ріоїкіп апа Вошимегеї-І еСат, 1995, Агеп. Іпі. Мед. с
Згарпуіососсив вр СР Рацеп еї а!., 1996, Іпт. Іттип. 64: 1659 Ге)
КАР (З8кКД) Ваїабап еї а!., 1998, Зсіепсе 280: 438 згеріососсив вр М Веаснеу ев! а!., 1988, Массіпе 6: 192
Тгеропета раїадіиг! ТеЕОМР Зрапіпа еї а!., 1994, РМАЗ 91: 2456 м мегвіпіа 5р РМ Ї еагу ві а!., 1997, Місговріа! Раїйодеп. 23: 167 с
Ї. Огляд див. у Адітога еї аї!., 1994, Іпї. рів.Сііп.М. Атег. 8: 859. со
Грибкові патогени ю
Організм Антиген Посилання ї-
Азрегаїїї5 Кигир апа Китаг, 1991, Сііп. Містгобріої!. Кеу. 4: 439
Сапаїда Рга! зЗеїапагеч еї а!., 1998, у). Васіегіо!. 180: 282
Соссідіоіїдев5 Протеїн 48кД Кігткіапа еї а!.. 1998, Іпї. Іттип. 66:424 «
СЕ мапа еїа!., 1997, Іпї. Іттип. 65: 4068
РЕА Кігкіапа еї а/., 1998. Іпї. Іттип. 66: 3519 в) с Сгуріососсив Міїснеї| апа Регіесі, 1995, Сііп. Місгобріо!. Кеу. 8: 515
Із» Нівіоріазта Оеере. 1997, Сііп. Місгобріо!ї. Кем. 10: 585
Рагасоссідіоіїдез Бгавійепвів Вгитітег евї а!., 1993, Сііп. Місгобіо!. Кеу. 6: 89
Рпеитосувівв сагіпії СрА Сідіїоцні еї а!., 1998. Іпї. Іттип. 66: 3179 -І сл Паразитичні патогени
Організм Антиген Посилання (95) Стуріозрогідінт Ситепі апа Сагсіа, 1991, Сііп. Місгоріо!. Кеу. 4: 325 г 50 Епіатоеба Півіоууїйса ЗКЕНР (К2) Зіапіву евї а!., 1990, РМАЗ 87: 4976
Агів! Маї апа Затиеївоп, 1998. Іпї. Іттип. 66: 353 "ч 17оКД І оцегеї! а!., 1997, У. Ехр. Мей. 185: 1793 сСіагаїа Іатбііа УР Задегег аї., 1997. Іпі. У. Рагавійої. 27: 965
І еввптапіа хр дрб3 Кап! еї а!ї., 1990, Іпї. Іптіпип. 58: 3233 оо Мгатр-1 1998, ІпгІттип.66: 1910 (ФІ ТВА уУерь еї а!ї., 1998, Іпї. Іттип. 66: 3279
Ріазтодішт 5р Протеїн 27кД Сопігегаз еї а!., 1998, Іпї. Іттип. 66: 3579 о АМА-1 Апаегзоп еї а!., 1998, Массіпе 16: 240 с Магаїп еї а!., 1998, Массіпе 16: 590 60 епітопи ргої 1998, Іпб Іттип. 66:2895
Протеїн 195кД Раїагтсуо ег а!., 1987, Машге 328: 629
Протеїн 55кД Раїагтсуо ег аї!., 1987, Машге 328: 629
Протеїн ЗБ5КкД Раїагтсуо ег аї!., 1987, Машге 328: 629
Зепівіозота 5р Зт28О5тТ Ваїйопе еї а!., 1987, Майшге 326: 149 бо Тгурапозота зр Протеїн 5бкД Нагт еї а/!., 1994, Мої. Місгобіо!. 11: 261
Ракові захворювання""
Неоплазм Антиген Посилання 2 Молочної залози Мис-1 Оепюгп еї а!., 1993, Сапе. І ей. 70: 143
Товстої кишки СЕА Сопгу еї а!., 1994, Сапе. Кев. 54: 1164
Лейкемія ВСВ/АВІ. Спеп ев! а!., 1992, РМАВ 89: 1468
Лімфома зЗегАа Куак еї а!., 1992, Мем" Епо. у. Мей. 327: 1209
Меланома МАВТ-1 Камакаті е! а/., 1994, РМАВ 91: 3515 то МАСЕ-1 Тгамегзаг! еї а!., 1992, 9. Ехр. Меа. 176: 1453 ро? Ни ега|., 1988, .). Мігої. 82: 176
Яєчнику Мис-1 Удеготе еї а!., 1993, У). Іттипої. 151: 1654
Підшлункової залози МИС-1 Вавпнгога еї а!., 1993. Іпі. У). Сапе. 54: 778 "х Загальний огляд див. у Ріпп, 1993, Си. Ор. Іттипо)ї. 5: 701.
Додаткові приклади антигенів та патогенів, які можуть бути використані, наведені (У МіїїсР, 1989 (Аду.
Іпттипої. 45: 195), Нозпіпо апа Каріап, 1994 (Си. Тор. МісгоріоЇ. Іттипої. 185: 179) або Мепидора! апа
Соцід, 1994 (Массіпе 12: 966)). Згідно з одним із варіантів втілення, використовують субодиниці одр120 гена епум та р27 гена дад з вірусу імунодефіциту людини (НІМ). За іншим варіантом втілення, антигенний детермінант може бути виділений з антигену, обраного з НОМ дО чи о98, НІМ орі20, СММ 98, НСМ Е2, ІМЕМ НА чи МА, Н. іпїчепгае РБ5 чи Рб, фімбріального протеїну та Протеїну 0.
У тому значенні, що використовується тут, термін "гідрофобний домен" (НО) означає будь-який протеїн, пептид, ліпід чи молекулу з гідрофобною ділянкою чи структурою, яка має площу поверхні більш ніж 500 2, с
Приклади потенційних НО включають будь-який трансмембранний (ТМ) сегмент Інаприклад, глікофорин А, Ге)
Тотіа апа Магснезі, 1975, Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА 72: 29641, гідрофобний домен цитохрому Бо |Тауїог апа
Козетап, 1995, ВВА 1278: 35), Т-домен токсину дифтерії (Спое еї аїЇ., 1992, Маїйшге 357:216), домен ІІ екзотоксину А Рвзецйдотопаз (АїЇїшгей еї аЇ,, 1986, РМАБ 83:1320), 4-спіральний лучок пеніцилінчутливого рецептора ІНагаї еї аіІ., 1997, Мої. Місгобіої. 23: 935), 7-спіральний пучок бактеріородопсину (|Непдеггзоп апа -
Опм/іп, 1975, Майте 257: 28), 12-спіральний пучок пермеази Іас (Караск еї аЇ.,, 1997, Сит. Ор. Бігисі. Віоїї су 7: 537) та пороутворюючий домен коліцину ГРагкег еї а!., 1989, Майшге 357: 93).
Термін "вектор'у тому значенні, що використовується тут, стосується нуклеїнової кислоти (наприклад, о
ДНК), виділеної з плазміди, косміди, фагміди чи бактеріофага або одержаний синтетично, до якого можуть бути ю вставлені чи клоновані фрагменти нуклеїнової кислоти. Для цього вектор може містити один чи кілька унікальних
Зо рестрикційних сайтів, І може бути здатним для аутономічної реплікації у певному хазяїні чи організмі таким - чином, щоб відбувалось репродукування клонованої послідовності. Молекула вектора може надавати організму-хазяїну певний добре визначений фенотип, який є придатним для селекції або таким, що легко виявляється. Деякі компоненти вектора можуть бути молекулою ДНК, яка включає регуляторні елементи для « забезпечення транскрипції, трансляції, стабільності РНК та реплікації, й іншими ДНК-послідовностями. - 70 Термін "ДНК-касета" у тому значенні, що використовується тут, стосується генетичних послідовностей с усередині вектора, який може експресувати описаний тут злитий протеїн. Касета нуклеїнової кислоти є з» орієнтованою усередині вектора за положенням та нуклеотидною послідовністю таким чином, що нуклеїнова кислота у касеті може бути транскрибована у РНК і, у разі потреби, трансльована у продукт злитого протеїну.
Краще, коли 3- та 5-кінці касети є придатними для легкої інсерції до вектора, наприклад, вона має з обох кінців сайти ендонуклеази рестрикції. і Хоч антигенні комплекси краще продукують з використанням методів рекомбінації, вважається, що комплекси ос можуть бути синтезовані будь-якими засобами, відомими у цій галузі, такими як, наприклад, хімічними. Це може бути особливо корисним у тих випадках, коли треба використати непептидний лінкер, або коли гідрофобний
Мамі домен включає залишок амінокислоти, яка не є поширеною у природі, чи аналог. Отже, хоч у кращому варіанті ка 20 втілення для продукування антигенного злитого протеїну використовуються рекомбінантні методи, цей винахід . пропонує також спосіб, який включає: одержання антигенних комплексів з використанням засобів хімічного в синтезу або шляхом поєднання рекомбінантних та хімічних засобів та виготовлення імуногенної ліпідної композиції, як описано вище.
На додаток до кращого пептидного лінкера, для приєднання антигену до гідрофобного домену можуть бути використані інші лінкери, відомі у цій галузі. Приклади таких лінкерів включають, без обмеження ними,
ГФ) поліетиленгліколі, полісахариди, полісіалові кислоти, бурштинову кислоту, бутандикислоту, адипінову кислоту та стандартні хімічні засоби для зшивання, такі як ЗМРТ (4-сукцинімідилоксикарбоніл-а-метил-а-(2-піридилдитіо)-толуол), ОР (дитіобіс-(сукцинімідилпропіонат)), ЕС (етиленглі коль-біс(сукцинімідилсукцинат)), зЗМос 60 (4-сукцинімідилоксикарбоніл-4-(М-малеіїмідометил)циклогексан-1-карбоксилат) та ЗРОР (М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат) (див. також каталог Ріегсе, Ріегсе Спетіса! Со., КосКога, І.
Згідно з цим винаходом, ліпосома відіграє критичну роль у доставці антигену, оскільки комплекс антиген-ліпосома безпосередньо презентується до імунної системи після виведення з циркуляції клітинами імунної системи. Крім того, вибір імуностимуляторних шляхів може бути змінений через внесення змін до бо ліпідної композиції ліпосом. Наприклад, для стимулювання різних імунологічних шляхів у композиції ліпосом можуть бути використані різні імуностимуляторні молекули, такі як Ліпід А |(Азапо апа КіІеїіпегтап, 1993, ..
Іттипоїйпег. 14: 286), РзС5З (ех еї аї., 1986, 9. Іттипої! 137: 2676), мурамілди та трипептид-РЕ (РіаІег еї аі.,, 1981, РМАБ 78:1680; Аміпд еї аіЇ., 1985, Массіпез 4: 166), та катіонні ліпіди (М/аЇКег еї аЇ.,, 1992, РМА5 89: 7915). Разом із комплексом антиген-ліпосоми можуть бути використані інші ад'юванти, такі як, наприклад,
МЕ59, Оці А, 20521 чи галун. Крім того, для викликання імунної реакції можуть бути додані імунорегуляторні молекули, такі як цитокіни.
Ліпосоми, що використовуються у практиці цього винаходу, можуть бути одержані з різноманітних везикулоутворюючих ліпідів, включаючи фосфатидильні прості та складні ефіри, такі як фосфатидилетаноламін 7/0 ХРЕ), фосфатидилсерин (Р), фосфатидилгліцерин (РО) та фосфатидилхолін (РС), гліцериди, такі як діолеоїлгліцеросукцинат, цереброзиди, гангліозиди, сфінгомієлін, стероїди, такі як холестерин, та інші ліпіди, а також інші ексципієнти, такі як вітамін Е чи вітамін С пальмітат |див. також пат США МоМо4235871, 4762720, 4737323, 4789633, 4861597 та 4873089). Приклади ліпідів на основі РОС включають, без обмеження ними, (С-18) дистеароїлросфатидилхолін (О5РС), (0-16) дипальмітоїлросфатидилхолін (ОРРС), (С-14) 7/5 диміристоїлфосфатидилхолін (ОМРС) та (С-18, ненасичений) діолеоїлфосфатидилхолін (ОРОС). Краще, коли ліпіди знаходяться у рідкій фазі при температурі тіла (приблизно 38-392С). Отже, ліпіди з Тлдд вище температури тіла, такі як ОБРС та ОРРС, є відносно менш корисними (але проте ще можуть бути придатними). Ліпідам, які мають Тдрдл нижче температури тіла, такі як ОМРС чи СОРС, надається більша перевага. Крім того, краще, щоб ліпідна композиція містила не більш ніж приблизно 1095 холестерину. Особливо кращі ліпідні композиції
Включають приблизно 0-1095 холестерину, приблизно 0-1596 РО та приблизно 0-10095 РОС. У певних кращих варіантах втілення композиція може додатково включати приблизно 1-1095 ад'юванта (ад'ювантів), краще, коли вміст ад'юванта становить менш ніж приблизно 5905.
Препарати ліпосом є добре відомими на сучасному рівні техніки. Загалом, ліпосоми одержували з використанням ряду різних методик, включаючи етанольну ін'єкцію ІВаїсті еї аіІ., 1973, Віоспет. Віорпуз. Асіа. с 298: 1015), ефірну інфузію (Оеєатег еї аї., 1976, Віоспет. Віорпуз. Асіа. 443: 629; Зснієтеп еї аї., 1978,
Віоспет. Віорпуз. Асіа. 542: 137), видалення детергента |Кагіп, 1972, Віоспет. Віорпуз. Асіа. 265: 241), о випарювання розчинника |Маївитаїйо еї аїі., 1977, 9У. СоПоід Іпіепасе Зсі. 62: 149), випарювання органічних розчинників із хлороформу у водних емульсіях (КЕМ'в) |З2оКа г. еї аіІ., 1978, Ргос. Май. Асад. Зсі. О5БА, 75: 4194), екструзію МІМ чи ЕОМ скрізь нуклеопористу полікарбонатну мембрану |Оівоп еї аі)., 1979, Віоспет. ра зо Віорнуз. Асіа. 557: 9), заморожування та відтаювання фосфоліпідних сумішей |Ріск, 1981, Агспімез ої Віоспет. апа Віорнузісв, 212: 186), а також озвучування та гомогенізація. с
Умовно, ліпосоми категоризують за розміром, використовуючи З-буквений акронім для позначення типу со ліпосом, що обговорюються. Мультиламелярні везикули загалом позначають "МІ У". Малі уніламелярні везикули позначають "ЗОМ", а великі уніламелярні везикули позначають "М". Слід за цими позначеннями інколи о
З5 наводиться хімічний склад ліпосоми. Обговорення номенклатури та стислий опис відомих типів ліпосом ї- наведений Ту Зіогт еї а!., 1998, РБІТ, 1: 19-311.
Цей винахід передбачає використання ліпосомних композицій з придатним ад'ювантом. Однак цей винахід також передбачає використання антигенного комплексу, який не є асоційованим з ліпосомою, у комбінації з придатним ад'ювантом. Отже, вакцина чи імуногенна композиція складається з двох компонентів: антигену, « зв'язаного з гідрофобним доменом, і придатної системи ад'юванта. Приклади потенційних фармацевтично шщ с прийнятних систем носіїв, що можуть бути використані, включають, без обмеження ними, ліпосоми, емульсії, й ад'ювант Фрейнда (повний чи неповний), ІЗСОМЗ та віруси в оболонці. «» У способах за винаходом використовується імуногенно ефективна кількість ліпосомної композиції, тобто, кількість композиції, яка, у комбінації з будь-якими доданими ексципієнтами чи носіями, викличе помітну імуногенну реакцію у хазяїна. У тих випадках, коли композиція використовується у вигляді композиції вакцини, -і ефективною кількістю буде кількість, яка, у комбінації з будь-якими доданими ексципієнтами чи носіями, спричинить виникнення у хазяїна специфічної та достатньої імунологічної реакції, яка забезпечує захист іні хазяїна від наступної дії мікробів (профілактична вакцинація) або забезпечує захист вже захворілого хазяїна
Ге) (терапевтична вакцинація).
Після закінчення загального опису винаходу він буде краще пояснений з посиланням на наведені далі о докладно приклади, які подані для ілюстрації й не мають обмежувати винахід, якщо це не зазначено окремо. "І Приклади
Приклад 1 - НБМ2
Одержання НЗМ290(1-23)-ТМ. М-кінцевий сегмент з 23 амінокислот оболонкового протеїну 90 Н5М2 приєднували до трансмембранного (ТМ) сегмента шляхом хімічного синтезу в автоматизованому пептидному синтезаторі. Синтезований пептид відщеплювали за стандартним методом розщеплення НЕ і очищали іФ) препаративною високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ) з використанням колонки У/а(егв С18 та ко 10095 ацетонітрилу з 0,195 трифтороцтової кислоти (ТРА) як рухомої фази. Методами мас-спектрометрії та капілярного електрофорезу було продемонстровано, що чистота пептиду становить принаймні 95905. во Одержання ліпосом. Ліпосоми готували шляхом озвучення проб згідно з раніше описаними методиками (Еції еї а, 1997, Віоспетізігу 36: 4959). Стисло, ліпіди (з протеїном чи без нього) розчиняють в органічному розчиннику, такому як хлороформ/метанол. Тонкі ліпідні плівки одержують шляхом внесення піпеткою аліквот ліпідних розчинів до круглодонних скляних пробірок та випарювання розчинника при 65 2С у тоці газоподібного азоту. Плівки поміщали під вакуум принаймні на вісім годин для видалення залишкового органічного розчинника. 65 Одержання ліпосом здійснювали шляхом гідратації ліпідних плівок буфером та інкубування суспензії при 65 С протягом 5-10 хвилин перед озвученням проби. Потім ліпосоми фільтрували скрізь фільтр 0,22мкм для стерилізації препарату. Розмір ліпосом визначали методом динамічного світлорозсіяння, і утворення агрегатів відстежували протягом принаймні чотирьох тижнів.
Особливо краща ліпосомальна композиція НЗМ290(1-23)-ТМ має молярне співвідношення 15:2:3
ОМРСО:Спо:ОМРО (диміристоїлфосфатидилхолін : холестерин : диміристоїлфосфатидилгліцерин), з 2,595 мас.
Ліпіду А.
Процедури вакцинації та випробувань індукування імунної реакції на вірусний антиген. Самицям мишей
ВАГ В/с чи С57ВІ/6 (у віці 6-8 тижнів) робили підшкірні ін'єкції раз на тиждень протягом двох, трьох чи чотирьох тижнів дослідним препаратом вакцини чи буфером. Місця ін'єкцій контролювали на вияви небажаних 70 реакцій, таких як розвиток гранульом та/або утворення струпів. Якщо тварин імунізували вакциною інтраназальним шляхом, то їх анестезували галотаном, і композицію (10-20мкл) вводили до ніздрів для вдихання за допомогою стерильної насадки на мікропіпетці ІСаїїснап еї а!., 1993, 9. Іпї. Оів. 168: 622).
Через регулярні проміжки часу під час процедури вакцинації та після вірусного зараження вимірювали імунну реакцію мишей на вірусний антиген. Тест на нейтралізацію вірусного антитіла здійснювали з використанням 75 24-пункових планшетів, що містили 1х109 клітин ВНК, до яких додавали змішану з вірусом мишачу сироватку з різними ступенями розведення. Після 48-72 годин інкубування при 37 С у СО5-інкубаторі моношари клітин досліджували на цитотоксичність і визначали їх титр нейтралізації антитіла. Преципітувальні антитіла до вірусу вимірювали шляхом інкубування сироватки з різними ступенями розведення з 5-10мкг вірусного антигену чи 25-50мкл маточної суспензії НЗМ2 (1х105 колонієутворюючих одиниць (КУС)). Ліпосоми, які містять антигенний епітоп, також використовували як мішені для проведення аналізу антитіло/ЕГ ІЗА, як було описано раніше |Гиво еї аї., 1993, Тгаперіапіайоп 55:1375)|. Результати останнього аналізу будуть використані для вимірювання рівня зв'язування та ізотипового складу антитіл.
Випробування на алергічну реакцію уповільненого типу на вірусний антиген у вакцинованих мишей проводили за методикою аналізу ножних подушечок. Вакцинованих тварин анестезували галотаном і робили С ін'єкції ЗОмкл інактивованого ультрафіолетом НБМ2 до подушечки однієї задньої лапи та 5Омкл лізованих о неінфікованих клітин до подушечки другої задньої лапи. Через двадцять чотири, сорок вісім та сімдесят дві години вимірювали ступень розпухання ножної подушечки мишей за допомогою штангенциркуля з ноніусом і порівнювали з вихідними значеннями. Вимірювали також активність Т-клітин у цих тварин за продукуванням цитокінів у відповідь на інкубування Т-клітин селезінки з вірусним антигеном. Селезінки видаляли з - вакцинованих тварин і гомогенати селезінки готували шляхом обережного розбивання селезінок стерильним сч штоком та продавлювання клітин скрізь нейлонове сито. Суспензії клітин промивають і висівають при 1 х109 клітин/лунку на 96-лункові планшети для мікротитрування. Після інкубування клітин при 37 "С протягом 3-4 днів. (О з різними кількостями вірусного антигену збирали надосадну рідину з лунок і аналізували на присутність ю цитокінів. Для визначення цитокінового профілю використовували комерційно доступні набори для аналізу на
Зо цитокіни методом ЕГІБА (1-2, 11/-4, 11 -6, 11-10, 11-12, ІЄМ-, -актин та ТМЕ-А виробництва РНагМіпдеп, Іпс. в. (Зап Оіедо, СА)). Детектування цитокінового протеїну у надосадній рідині культур тканин методом сендвіч-ЕЇ ІЗА здійснювали з використанням моноклональних антитіл (птАбБ), специфічних до конкретних цитокінів. Стисло, на планшети для ЕГІ5А протягом ночі наносили покриття з тАбБ антимишачого цитокіну щура. Планшети блокували «
З9о сироватки плоду корови у фосфатно-сольовому буфері (РВ5) протягом 2 годин, а потім до кожної лунки додавали аліквоти кожного дослідного зразка. До кожної лунки додавали цитокін-специфічне біотиніловане З с антимишаче тАБр щура, а потім авідинпероксидазу. Проводили кольорову реакцію шляхом додавання "» колориметричних субстратів. Планшети зчитували у спектрофотометрі для проведення аналізів ЕГІ5А і " концентрації цитокінів обчислювали зі стандартної кривої, одержаної для контрольних рекомбінантних цитокінів.
Модель мишачого енцефаліту НЗМ2 для випробування ліпосомальних препаратів вакцини. Вакцинованих чи невакцинованих (контрольних) самиць мишей ВАЇВ/с (у віці 10-12 тижнів) інтраперитонеально заражали і летальною дозою (1х107 КУО) мозок-пасивованого Н5ЗМ2. Миші, яких заражали інтравагінально летальною 4! дозою НОМ2, попередньо одержували естроген підшкірно за тиждень до зараження та у день (-1) перед зараженням. Потім їх анестезували інтраперитонеальною ін'єкцією ацепромазину та кетаміну. Потім вводили о інтравагінально Н5ОМ2 (10-З3Омкл) з використанням стерильного ковпачка мікропіпетки після того, як спочатку ка 20 брали піхвовий мазок сухим Саїдізумар |МсОегтой еї аїЇ., 1984, 9. МігоЇї. 51: 747). Тварин спостерігали протягом 80 днів після зараження на виживання (щоденно), втрату ваги (через день протягом перших двох тм тижнів, а потім раз на тиждень), зовнішній вигляд шерстного покриву та неврологічні симптоми (знижений рівень активності, волочіння чи параліч кінцівок).
Антиген-індукована проліферація Т-клітин. Сенсибілізацію хазяїна до 90О-антигену визначали з 29 використанням методу аналізу на антиген-індуковану проліферацію Т-клітин. Гомогенати селезінки готували
ГФ) шляхом обережного розбивання селезінок стерильним штоком та продавлювання клітин скрізь нейлонове сито. кю Клітини суспендували у середовищі КРМ11640, яке містить 1095 сироватки плоду корови (ЕС5), 10ММ буфера
Нерез, І -глутамін (2мМ) пеніцилін (25МО/мл) та стрептоміцин (25мкг/мл). Клітини культивують при концентрації 1х105 клітин/мл з дО (5-20мкг/мл) чи без нього у 9б-лункових планшетах з О-подібним дном бо протягом 4 днів у атмосфері з 595 СО». Культури пульс-мітили 20мкл барвником ресазурином протягом З годин, а потім вимірювали флуоресценцію за допомогою приладу Суйюїиог ІІ (Регзресіїме Віозузіетв, Іпс., Раптіпдіюп,
МА).
Аналіз цитокін-специфічної мРНК. Т-клітини від імунізованих та неімунізованих тварин аналізували на рівні цитокін-специфічної МРНК для важливих цитокінів, які можуть відображати сенсибілізацію, асоційовану з бо імунізацією, включаючи 1/-2, ІЕМ-О, 1-4, 1-5, 1-6, та І/-10. Т-клітини одержували з селезінок, як описано вище. Ізолювали загальну РНК з використанням модифікації (Созепга еї аї!., 1995, І їмег Тгапері. Зига. 1: 16) методу, описаного СпотсгупзКу апа Засспі |СпотсгупеКу еї аї., 1987, Апаїуї. Віоспет. 162: 156). Свіжі чи заморожені клітини (2х109) подрібнювали у їмл денатурувального розчину (4ММ тіоціанату гуанідінію, 25мММ цитрату натрію (рН7,0), 0,590 саркозилу та 0,1мМ 2-меркаптоетанолу). РНК осаджували шляхом інкубування з одним об'ємом ізопропанолу протягом ночі при -202С. Концентрацію загальної РНК доводили до 26б0ОНМ і зразки зберігали при -802С до проведення аналізу.
Аналіз цитокінів проводили з використанням модифікації методу, описаного Созеплга еї а!. |Созепга еї аї, 1995, І мег Тгапері. Зи!игао. 1: 16). Однониткову КДНК одержували шляхом транскрипції 2мкг загальної РНК у 20мкл 70 загальної реакційної суміші з використанням зворотної транскриптази вірусу мієлобластозу птиці (Воепгіпдег
Мапппеїт, Іпаіапароїїз, ІМ). Для ампліфікації фрагментів ДНК попередньо визначеного розміру кожного з генів цитокінів, що становлять інтерес, використовували послідовність-специфічні олігонуклеотидні слідовність, яка поєднує три епітопи (СТІ, Т-клітин-помічників та В-клітин) (КОПЯІММУОЕМОКАМУАСТАРМУМКАКККІНІСРОКАРУТТК (БО ІО МО.19)), і виділяли з цієї протеїнової 75 послідовності з використанням кодонових преференцій Е.соїї (І оотап еї аї., 1987.ЕМВО 4. 6: 2489). Синтетичний ген, що кодує послідовність НІМ, збирають шляхом синтезу, гібридизації, РСК та лігування перекривних олігонуклеотидів. Зібраний непроцесований ген, який кодує фрагменти НІМ, ампліфікують методом РСК, а потім лігують до плазміди експресії. Кінцеві гени аналізують методом секвенування ДНК.
Плазміди рТгсНів, що містять НІМ-НО, трансформують до Е.соїї. Бактерії інкубують у середовищі ІВ з ампіциліном (5Омкг/мл) при 372С до фази середнього логарифмічного росту. У цей час додавали ІРТО для індукування гібридного промотора ігр/ас. Проводили виміри кожну годину для визначення оптимальної післяіндукційної експресії протеїнів НІМ-НО. У момент оптимальної експресії клітини збирали центрифугуванням.
Осади клітин піддавали лізису і центрифугували. Лізат аналізували на присутність протеїну. Протеїни НІМ-НО очищали методом селективної схожості до нікелю, зв'язаного з твердою основою. У разі потреби, Ге використовували ексклюзійну, іонообмінну чи гідрофобну хроматографію для додаткової очистки НІМ-НО. о
Виготовлення ліпосом. Ліпосоми готують шляхом озвучування проб згідно з раніше описаними методиками
ІЕчій ек аї,, 1997, Віоспетівігу 36: 4959)|. Стисло, ліпіди (з протеїном чи без нього) розчиняють в органічному розчиннику, такому як хлороформ/метанол. Тонкі ліпідні плівки одержують шляхом внесення піпеткою аліквот ліпідних розчинів до круглодонних скляних пробірок та випарювання розчинника при 659С у її тоці газоподібного азоту. Плівки поміщали під вакуум принаймні на вісім годин для видалення залишкового с органічного розчинника. Одержання ліпосом здійснювали шляхом гідратації ліпідних плівок буфером та інкубування суспензії при 6592 протягом 5-10 хвилин перед озвученням проби. Потім ліпосоми фільтрували о скрізь фільтр 0,22мкм для стерилізації препарату. Розмір ліпосом визначали методом динамічного ю світлорозсіяння, і утворення агрегатів відстежували протягом принаймні чотирьох тижнів.
Зо Процедури вакцинації та випробувань індукування імунної реакції на вірусний антиген. Самицям мишей ї-
ВАЇ В/с (у віці 6-8 тижнів) робили підшкірні ін'єкції раз на тижнях 1, 4 та 8 дослідним препаратом вакцини чи буфером. Місця ін'єкцій контролювали на вияви небажаних реакцій, таких як розвиток гранульом та/або утворення струпів. Якщо тварин імунізували вакциною інтраназальним шляхом, то їх анестезували галотаном, і « дослідну композицію (10-20мкл) вводили до ніздрів для вдихання за допомогою стерильної насадки на мікропіпетці ІСаїїснап еї! а!., 1993, У. Іпї. Оів. 168:6221. З с Кількісні виміри гуморальної імунної відповіді методом ЕГІЗА. Через регулярні проміжки часу протягом "» процедури вакцинації (наприклад, 1 раз на тиждень) вимірювали імунну реакцію мишей на вірусний антиген. " Ліпосоми, які містять антигенний епітоп, також використовували як мішені для проведення аналізу антитіло/?ЕІЗА, як було описано раніше |Гизо еї аї., 1993, Тгаперіапіайоп 55:1375). Результати останнього аналізу використовують для вимірювання рівня зв'язування та ізотипового складу антитіл. ш- Аналіз на алергічну реакцію уповільненого типу (ОТН). ОТН-реакцію на вірусний антиген у вакцинованих с мишей проводили за методом виміру ножних подушечок. Вакцинованих тварин анестезували галотаном і робили ін'єкції по 5Омкл ліпосомального антигену чи вільного антигену до подушечки однієї задньої лапи та 5Омкл о буферу до подушечки другої задньої лапи. Через двадцять чотири, сорок вісім та сімдесят дві години
ГІ 20 вимірювали ступень розпухання ножної подушечки мишей за допомогою штангенциркуля з ноніусом і порівнювали з вихідними значеннями. "М Аналіз цитокінспецифічної мРНК. Т-клітини від імунізованих та неімунізованих тварин аналізували на рівні цитокінспецифічної МРНК для важливих цитокінів, які можуть відображати сенсибілізацію, асоційовану з імунізацією, включаючи 1-2, ІРМ-Ю, 1/-4, 1-5, 1/-6, та 1-10. Т-клітини селезінки ізолювали, як описано 22 вище, на 1 та 4 тижні після імунізації. Загальну РНК ізолювали з використанням модифікації |Созепга еї аї.,
ГФ) 1995, Іімег Тгапері. Зигд. 1: 16)| методу, описаного |СпотсгупеКу еї аї., 1987, Апаїуї. Віоспет. 162: 1561).
Свіжі чи заморожені клітини (2х109) подрібнювали у їмл денатурувального розчину (4мММ тіоціанату гуанідінію, по 25ММ цитрату натрію (рН7,0), 0,590 саркозилу та 0,1мММ 2-меркаптоетанолу) РНК осаджували шляхом інкубування з одним об'ємом ізопропанолу протягом ночі при -202С. Концентрацію загальної РНК доводили до 60 2вонмі зразки зберігали при -802С до проведення аналізу.
Аналіз цитокінів проводили з використанням модифікації методу, описаного |СпотсгупеКу еї аї., 1987,
Апаїм. Віоспет. 162: 156). Однониткову КДНК одержували шляхом транскрипції 2мкг загальної РНК у 20Омкл загальної реакційної суміші з використанням зворотної транскриптази вірусу мієлобластозу птиці (Военгіпдег
Мапппеїт, Іпаіапароїїз, ІМ). Для ампліфікації фрагментів ДНК попередньо визначеного розміру кожного з генів 65 цитокінів, що становлять інтерес, використовували послідовність-специфічні олігонуклеотидні праймери для мишачих цитокінів (Таблиця 1). Суміш для полімеразної ланцюгової реакції (РСК) складається з їмкл кДНК, 2,5мкл буфера для РСК 10х, по мкл кожного з 5- та 3-праймерів, 2,5мкл 10х аМмтТР (2ммоль/л) та 0,125мкл термостабільної ДНК-полімерази Т.адцаїйсиз (Воейгіпдег Маппеїт) у кінцевому об'ємі 25мкл. Для ампліфікації фрагмента 548п.н., узятого як внутрішній контроль, використовували специфічні праймери О-актину. Суміш для
РСК покривали мінеральним маслом і проводили ампліфікацію після інкубування суміші протягом 7 хвилин при 942, 38 циклів з денатурацією протягом 30 секунд при 942С, відпалюванням праймерів протягом 45 секунд при 602С і нарощуванням ланцюга протягом 6О секунд при 72 С, та інкубування протягом 7 хвилин при 72 260.
Продукти РСК розділяли на агарозному гелі у присутності броміду етидію. Смуги розглядали під УФ-світлом, 70 фотографували і проводили кількісний денситометричний аналіз фотографій з використанням пакету прикладних програм МоіІесціаг Апаїузі (Віо-Кад, Кісптопа СА).
Кількісний аналіз цитокінів методом ЕГІЗБА у Т-клітинах селезінки. Визначали також Т-клітинну активність цих тварин шляхом вимірювання продукування цитокінів у відповідь на інкубування Т-клітин селезінки з вірусним антигеном. Селезінки видаляли у вакцинованих тварин і гомогенати селезінки готували шляхом обережного 75 розбивання селезінок стерильним штоком та продавлювання клітин скрізь нейлонове сито. Суспензії клітин промивали і висівали при 1х10?9 клітин/лунку на 96-лункові планшети для мікротитрування. Після інкубування клітин при 372С протягом 3-4 днів з різними кількостями вірусного антигену збирали надосадну рідину з лунок і аналізували на присутність цитокінів. Для визначення цитокінового профілю використовували комерційно доступні набори для аналізу цитокінів методом ЕГІЗА. Детектування цитокінового протеїну у надосадній рідині 20 культур тканин методом сендвіч-ЕГІЗА здійснювали з використанням моноклональних антитіл (тАБ), специфічних до конкретних цитокінів. Стисло, на планшети для ЕГІЗА протягом ночі наносили покриття з тАб антимишачого цитокіну щура. Планшети блокували 395 сироватки плоду корови у фосфатно-сольовому буфері (РВ5) протягом 2 годин, а потім до кожної лунки додавали аліквоти кожного дослідного зразка. До кожної лунки додавали цитокін-специфічне біотиніловане антимишаче тАБ щура, а потім авідинпероксидазу. Проводили СМ 29 кольорову реакцію шляхом додавання колориметричних субстратів. Планшети зчитували у спектрофотометрі о для проведення аналізів ЕГ ІЗА і концентрації цитокінів обчислювали зі стандартної кривої, одержаної для контрольних рекомбінантних цитокінів. Усі набори для аналізу цитокінів методом ЕГІЗА (1-2, 1-4, 1-6,
І-/-10, 1-12, ІЕМ- та ТМЕ-А) були придбані у Рпагміпдеп, Іпс. (Зап Оіедо, СА)).
Антиген-індукована проліферація Т-клітин. Сенсибілізацію хазяїна до антигенів НІМ визначали методом в. 30 антиген-індукованої проліферації Т-клітин. Гомогенати селезінки ізолювали, як описано раніше. Клітини с суспендували у середовищі КРМІ 1640, яке містить 1095 сироватки плоду корови (ЕС5), 10ММ буфера Нерез,
І -глутамін (2мМ), пеніцилін (25МО/мл), стрептоміцин (25мкг/мл) та гентаміцин (8Омкг/мл). Клітини культивують «ФО при концентрації їх1059 клітин/імл з пептидом НІМ-НО (Бмкг/мл) чи без нього у 9б-лункових планшетах з ю
М-подібним дном протягом 3-4 днів у атмосфері з 596 СО». Культури пульс-мітили 20мкл барвника ресазурину 35 протягом З годин, а потім вимірювали флуоресценцію за допомогою приладу Суйоїоог ІІ (Регересіїме Віозувіетв, -
Іпс., Раптпіпдіюп, МА).
Анти-НІМ СтТі -реакції. Після вакцинації оцінювали присутність антиген-специфічних цитотоксичних
Т-лімфоцитів (СТІ) у Т-клітинах селезінки. Лімфоцити селезінки одержували, як описано вище. Лімфоцити з « кожної дослідної групи розбивали на групи (п-5), а потім культивували протягом З днів без антигену при З7З 10"клітин/лунку у культуральних 12-лункових планшетах. Клітини-мішені лімфоми 15198 (Н29) (АТТС) с інкубували з пептидом, який відповідав епітопу НІМ СТІ для Н2 94 рестриктованих клітин, протягом 4 годин при :з» 372. Мішені промивали і до кожної лунки додавали 100мкл титрів, що містять 1 х107 клітин. Ефекторні лімфоцити промивали, додаючи до лунок у різних концентраціях, і культивували протягом 4 годин при 37 20.
Відсоток специфічного лізису обчислювали за результатами вимірів лактатдегідрогенази (ІОН) у надосадній -І рідині з використанням набору СуїТох 96 (Рготеда, Мадізоп МУ!) на стандартному планшет-рідері для ЕГІЗА (НТ 7000- ВіоАззау Кеадег, Регкіп ЕІтег, Зап дозе, СА) шляхом реєстрації оптичної густини при 49Онм. о Визначення НЗУ2-антигенспецифічного лізису здійснювали за стандартними критеріями. Дані виражали як 2) відсоток специфічного лізису - -100х експериментальні - ефектор-спонтанні - мішень-спонтанні) / (мішень-максимальні - мішень-спонтанні))|. де Приклад М - Вірус грипу (ІМЕМ) "І Одержання ІМЕМ-НО. Нуклеотидну послідовність обраних епітопів виділяли з протеїнової послідовності з використанням кодонових преференцій Е.соїї (І оотап еї а!., 1987, ЕМВО .. 6: 2489). Антигенна послідовність (послідовності), вставлені до генної касети, відповідають епітопам з МР (147-161, ТХОКТКАЇ МКТОМОР (ЗЕО ІЮ МО.20), 55-69, КПОМЗІЛІЕКММІ 5 (ЗЕО ІЮ МО.21)) та НА (91-108, ЗКАЕЗМСУРМОМРОМАВІ (5ЕО ІЮ МО.22)).
Можна сконструювати вакцину з комбінованими епітопами, яка складається з Т-В-епітопу, як описано |З гГитеапи іФ) еї аї., 1997) (НА 110-120/НА 150-159, БРЕКЕЕІРКЕОСУМІ ТЕКЕСУ5Р (ЗЕО ІЮО МО.23)) |ВгГитеапи еї аї., 1997, 3. ко Мігоії. 71: 5473). Після одержання відповідної послідовності (послідовностей), синтетичний ген, що кодує
ІМЕМ-НО, збирають синтезом, гібридизацією, РСК та лігуванням перекривних олігонуклеотидів. Зібраний бо непроцесований ген, що кодує фрагменти ІМЕМ, ампліфікують методом РОК та лігують до плазміди експресії.
Кінцеві гени аналізують методом секвенування ДНК.
Плазміди, що містять ІМЕМ-НО, трансформують до Е.соїї. Бактерії інкубують у середовищі І В з ампіциліном (5БОмкг/мл) при 372С до фази середнього логарифмічного росту. У цей час додавали ІРТО для індукування гібридного промотора ігр/Лас. Виміри проводили кожної години для визначення оптимальної післяіндукційної 65 експресії протеїнів ІМЕМ-НО. У момент оптимальної експресії клітини збирали центрифугуванням. Осади клітин піддавали лізису і центрифугували. Лізат аналізували на присутність протеїну. Протеїни ІМЕМ-НО очищали методом селективної схожості до нікелю, зв'язаного з твердою основою. У разі потреби, використовували ексклюзійну, іонообмінну чи гідрофобну хроматографію для додаткової очистки ІМЕМ-НО.
Модель вірусної інфекції. Штам ІМЕМ, використаний для того, щоб продемонструвати ефективність вакцини, є рекомбінантом вірусу А/РРУ/8/34, що називається РК8. Вірус культивують у курячих яйцях з ембріонами у віці 10-12 днів шляхом алантоїнової інокуляції з подальшим інкубуванням при 37 2С у качалці протягом 40-48 годин та 20-24 годин при 42С, а потім - видаленням з алантоїнової рідини. Аналіз на гемаглютинацію вірусу з 0,590 червоних кров'яних клітин курчати буде проводитись у 9б-лункових мікротитрувальних планшетах для визначення кількості гемаглютинуючих одиниць (НАШумл маточної суспензії вірусу.
Для мишачої моделі ВАЇ В/с було показано, що 1200 НАШ штаму РКВ8 при введенні інтраназально за допомогою стерильної насадки автоматичної мікропіпетки анестезованим метофаном мишам (2Омкл) викликали виражені симптоми інфекції на 4 день, включаючи знижену рухомість, відсутність чистки, 2095-ву втрату ваги тіла та смерть протягом двох тижнів. Методом цитолізу МОСК, проведеним у 96б-лункових мікротитрувальних планшетах з кінцевою точкою 50905, було виявлено присутність високого титру інфекційного вірусу у гомогенатах 75 легенів, виготовлених на 4 день після інфікування.
Процедури вакцинації та випробувань індукування імунної реакції на вірусний антиген. Самицям мишей
ВАЇ В/с (у віці 6-8 тижнів) робили підшкірні ін'єкції на 1-му, 4-му та 8-му тижнях дослідним препаратом вакцини чи буфером. Місця ін'єкцій контролювали на вияви небажаних реакцій, таких як розвиток гранульом та/або утворення струпів. Якщо тварин імунізували вакциною інтраназальним шляхом, то їх анестезували метофаном, і дослідну композицію (10-20мкл) вводили до ніздрів для вдихання за допомогою стерильної насадки на автоматичній мікропіпетці (Саїйснап еї а/!., 1993, 9. Іпї. Оів. 168: 6221.
Виявлення РНК ІМЕМ у тканині легенів методом КТ-РСК. Детектування РНК ІМЕМ методом КТ-РСК проводили на легенях дослідних тварин, узятих через 4 дня після вірусного зараження для визначення ефективності імунізації з метою профілактики вірусної інфекції. Зразки легенів, узятих у мишей, миттєво Га заморожували, розмелювали і заморожений порошок зберігали при -709С до проведення аналізів. Ізоляцію загальної РНК та аналіз методом КТ-РСК на вірусну РНК проводять з використанням модифікації раніше о описаних методик |СпотсгупекКу еї аї., 1987, Апаїмї. Віоспет. 162: 156; Зпіплап еї аї., 1993, 9. Іттипої. 151: 5228; | акетап апа М/нпШеу, 1995, 9. Ії. Оів. 171: 857). Використовуються праймери, які є специфічними для матричного гена (сегмент 7) вірусу грипу А |Айтаг еї аї., 1996, 9. Сііп. МісгоріоІї. 34:2604)|. Аніліз методом /їЇч-ч КтТ-РСК проводять з використанням реагентів та протоколу системи Тіап Опе Тире КТ-РСК 5Бувіет (Воепйгіпдег
Маппвеїт, Іпаіапароїїв, ІМ). Стисло, від їпг до мкг загальної матричної РНК інкубують у присутності 0,2ММ см аМТР», 0,4мМкМ антисмислового праймера ЕГАМІ1 (5-САСВАСАСТТОААСАТОТСТТТОС-3! (ЗБОЮ МО/24)3), Фо 0,4мМкМ смислового праймера БАМ2 (5-ССТСТОТССАТОТТАТТТОСА-У (5ЕБЕО ІЮ МО.25)), 5ММ ОТ, 5од. ю інгібітора Рнази, 1,5мМ Мосі» та ензими АММ/Ехрапа Нідп Рїдеїйу за таких умов: один цикл з витримуванням при 3з5 60С протягом 30 хвилин, 942С протягом 2 хвилин, десять циклів при 942С протягом ЗО секунд, 552С протягом 30 секунд, 682С протягом 45 секунд, двадцять п'ять циклів при 942 протягом ЗО секунд, 55923 протягом 30 секунд, 682С протягом 45 секунд зі збільшенням часу нарощування ланцюга на п'ять секунд для кожного циклу, з наступним одним циклом при 682С протягом 7 хвилин. Позитивний результат підтверджується видимою смугою «4, 212п.н. у 1,595 гелі МибЗіеме-агароза (ЕМС Вургодисів, КосКіапа, МЕ), забарвленому бромідом етидію та З т0 сфотографованому за допомогою УФ-трансілюмінатора (Віокад Се! бос 1000). Було показано, що цей метод є с чутливим та високоспецифічним при вимірюванні присутності вірусної ДНК (І акетап апа М/пШеу, 1995, У. Ії. з» Оів. 171:857).
Послідовність домену НАТ1. Послідовність домену НА! (сегмент 4) може бути визначена шляхом ампліфікації домену НАТ7 з вірусної РНК за реакцією КТ-РСК з наступним субклонуванням продукту 17100п.н. для секвенування та секвенування з використанням дидезоксинуклеотидного методу термінації. Аналіз методом
КТ-РСК проводять з використанням системи Тіап Опе Тире КТ-РСК Зувіет, як описано вище, з такими с відмінностями: праймерами ампліфікації є праймер кДдНК (5-АвСААДААССАСОООААААТАААААС-З! (5ЕО ІЮ
МО.26)) та праймер РСК (5-СААТОАДААССООСААТООСТОСС-3 (ЗЕО І МО.27)) |РУуНаїа еї аї., 1995 9. Сеп. Мігої.
Мамі 76: 205), за умов проведення одного циклу з 602 протягом ЗО хвилин, 942 протягом 2 хвилин, десяти циклів з ко 50 9422 протягом ЗО секунд, 602 протягом 30 секунд, 682С протягом 45 секунд, двадцяти п'яти циклів з 94 сс -Ч протягом ЗО секунд, 602С протягом ЗО секунд, 682С протягом 45 секунд зі збільшенням часу нарощування ланцюга на п'ять секунд для кожного циклу, з наступним одним циклом при 682С протягом 7 хвилин. Продукт 1100п.н. субклонують до вектора клонування ТА РСК 2.1 (Іпмйгодеп, Сагізрад, СА) для подальшого секвенування. Секвенування здійснюють з використанням протоколу та реагентів з набору АйціоСусіе (Атетгзпат
Ріпагтасіа Віоїесі, Різсаїамжау, МУ), а результати одержували на апараті для секвенування набору АЇ РЕхргезз (Ф. (Атегепат РпНагтасіа Віоїесп, Різсаїаулау, М), і аналізували за допомогою набору прикладних програм АМ ко м.3.02 (Атетгепат РІагтасіа Віоїесі, Різсагамжау, МУ).
Кількісні виміри гуморальної імунної реакції методом ЕГІЗА. Через регулярні інтервали під час процедури во вакцинації вимірювали імунну реакцію мишей на вірусний антиген. Ліпосоми, які містять антигенний епітоп, також використовували як мішені для проведення аналізу антитіло/ЕЇ! ІЗА, як було описано раніше |Тизо еї аї., 1993, Тгаперіапіайоп 55: 1375). Результати останнього аналізу використовують для вимірювання рівня зв'язування та ізотипового складу антитіл.
Антиген-індукована проліферація Т-клітин. Сенсибілізацію хазяїна до антигену ІМЕМ визначали з б5 використанням антиген-індукованої проліферації Т-клітин. Селезінки видаляли у вакцинованих мишей і гомогенати готували шляхом обережного розбивання селезінок стерильним штоком та продавлювання клітин скрізь нейлонове сито. Клітини суспендували у середовищі КРМІ 1640, яке містить 1095 сироватки плоду корови (ЕС5), 10ММ буфера Нерез, І-глутамін (2мММ), пеніцилін (25МО/мл), стрептоміцин (25мкг/мл) та гентаміцин (ВОмкг/мл). Клітини культивують при концентрації їх1Обклітин/мл з хімічно синтезованими пептидами, що
Відповідають антигенам (5мкг/мл), чи без них, у 96-лункових планшетах з О-подібним дном протягом 3-4 днів у 596 СО». Культури пульс-мітили 2Омкл барвника ресазурину протягом З годин, а потім вимірювали флуоресценцію за допомогою приладу Суфойоог ІІ (Регзеріїме Віозувіетв, Іпс., Раптіпдіоп, МА).
Анти-ІМЕМ СТІ -реакіці. Після вакцинації оцінювали присутність антиген-специфічних цитотоксичних
Т-лімфоцитів (СТІ) у Т-клітинах селезінки. Лімфоцити селезінки одержували, як описано вище. Лімфоцити з 70 кожної дослідної групи розбивали на групи (п-5), а потім культивували протягом З днів без антигену при ""клітин/лунку у культуральних 12-лункових планшетах. Клітини-мішені мастоцитоми РВ815 чи лімфоми 15178 (Н29) (АТТС) інкубували з пептидом, який відповідав епітопу ІМЕМ МР СТІ (амінокислоти 147-158) для
Н2гЗ-рестриктованих клітин, протягом 4 годин при 372С. Мішені промивали і до кожної лунки додавали 100мкл титрів, що містять 1х107 клітин. Ефекторні лімфоцити промивали, додаючи до лунок у різних концентраціях, і т культивували протягом 4 годин при 372С. Відсоток специфічного лізису обчислювали за результатами вимірів лактатдегідрогенази (ІОН) у надосадній рідині з використанням набору СуїоТох 96 (Рготеда, Мадізоп УМ!) на стандартному планшет-рідері для ЕГІЗА (НТ 7000- ВіоАззау Кеадег, Регкіп ЕІтег, Зап дозе, СА) шляхом реєстрації оптичної густини при 49Онм. Визначення НеМ2-антигенспецифічного лізису здійснювали за стандартними критеріями. Дані виражали як відсоток специфічного лізису -100 х Кекспериментальні - 720 ефектор-спонтанні - мішень-спонтанні) / (мішень-максимальні - мішень-спонтанні)|.
Приклад М - Нетипований Н.іпіцепгае (МТНІ) та Н.іпїцепгае типу Б (НІіБ)
Клонування протеїнів МТНі. Повну генну послідовність, що кодує Рб, одержують зі штаму МТНі шляхом ампліфікації методом КТ-РСК мРНК Рб |Оеїсп еї аї, 1988, 9. Васіегіої. 170: 489; Меївоп еї аї., 1988, Іпї. сч
Іттип. 56: 128; І осотап еї аї!., 1987, ЕМВО .). 6: 2489). Ампліфікацію проводять з використанням протоколу та реагентів системи Тіап Опе Тире КТ-РСК Зузіет (Воепгіпдег Мапппеїт, Іпаіапароїїв, ІМ). Стисло, бактерії (о) інкубують у присутності 0 2мММ актР», О4мМкМ антисмислового праймера Н-ІпомМРбАВ (Б-САСТССОСТОСТСТАССААС -3 (5БО 10 МО.28), 04мМкМ смисового праймера / Н-ІпміІРб5 (5-ААТТТССАОСТТООТСТОСА -3 (5ЕО ІЮ МО.29)), 5мМ ОТ, 5Бод. інгібітора РНази, 1.51М МосСі» та ензимів їм
АММУ/Ехрапа Нідн ГРіадеїйу за таких умов: один цикл з витримуванням при 602С протягом 30 хвилин, 942 протягом 2 хвилин, десять циклів при 9492 протягом ЗО секунд, 5592 протягом ЗО секунд, 682С протягом 45 секунд, с двадцять п'ять циклів при 94 С протягом ЗО секунд, 5592С протягом ЗО секунд, 682С протягом 45 секунд зі с збільшенням часу нарощування ланцюга на п'ять секунд для кожного циклу, з наступним одним циклом при 682С протягом 7 хвилин. Позитивний результат підтверджується видимою смугою 867п.н. у 1,090 гелі Мизіеме-агароза юю (ЕМО Вургодисів, КосКіІапа, МЕ), забарвленому бромідом етидію та сфотографованому за допомогою /-|че
УфФ-трансілюмінатора (Віокад, Се! бос 2000). Продукт РСК субклонують з метою секвенування до вектора ТА 2.1 з використанням реагентів та протоколу набору ТА Сіопіпд (Іпийгодеп, Сагізрад, СА). Лабораторне одержання плазміди здійснювали з використанням стандартного методу лужного лізису |Мапіаїйіз, 1989 МоіІесшаг «
Сіопіпд: А І арогаїюгу МапиаїЇ, 2па Еа., ЗатрбгоокК, Егіїзсп, Мапіаїйів, Со Зргіпд Нагрог І арогаїогу Ргезв, МУ. 40. р.125). Вставку РСВ-продукту секвенували звичайним методом дидезокси-термінації з використанням протоколу с та реагентів набору АціоСусіе (Атегепат РнНагтасіа Віоїесі, Різсаїажшау, М), а результати одержували на ц апараті для секвенування набору АЇ РЕхргезз ІІ (Атегзпат РНагтасіа Віоїесн, Різсаіїаулау, М), і аналізували за "» допомогою набору прикладних програм АІМ/іп м.2.0 (Атегепат РІагтасіа Віоїеси, Різсагамжау, М).
Одержання МТНІ(Рб6)-НО. Після одержання гена, що кодує Рб, синтетичний ген, який кодує МТНІ(Рб)-НО,
Збирають шляхом синтезу, гібридизації РСК та лігування перекривних олігонуклеотидів. Сегмент НО -І приєднують до М- чи С-кінця протеїну за допомогою лінкера, що складається з гліцину та серину. Це дає нам можливість дослідити вплив відносного положення НО стосовно антигену на процесинг імунною системою.
Мн Зібраний непроцесований ген, який кодує фрагмент МТНІ(Рб6)-НО, ампліфікують методом РСК та лігують до о плазміди експресії. Кінцевий ген аналізують секвенуванням ДНК.
Плазміду, що містить МТНІ(Рб6)НО, трансформують до Е.соїї. Бактерії інкубують у середовищі ІВ з о ампіциліном (5Омкг/мл) при 372 до фази середини логарифмічного росту. У цей час додавали ІРТО для що індукування гібридного промотора і(гр/ас. Результати щогодинних вимірів використовують для визначення оптимальної післяіндукційної експресії протеїну МТНІ(Рб6)-НО. У момент оптимальної експресії клітини збирали центрифугуванням. Осади клітин піддавали лізису і центрифугували. Лізат та клітинний осад аналізували на присутність протеїну. Для екстракції протеїну МТНІ(Рб6)-НО з лізованих осадів клітин використовували 1-290 розчин дезоксихолату натрію. Потім МТНІ(Рб)-НО очищали методом селективної схожості до нікеля, зв'язаного з о твердою основою. У разі потреби, використовували ексклюзійну, іонообмінну чи гідрофобну хроматографію для ко додаткової очистки МТНІ(Рб)-НО.
Одержання ліпосом. Існує три загальних підходи до одержання стабільних ліпосом МТНІ(Рб)-НО. За першим, 60 композицію ліпосом складають таким чином, щоб протеїн та ліпіди розчинялись разом у органічному розчиннику (хлороформ/метанол), а потім висушувались до тонкої плівки. Після ресуспендування у водному буфері ліпіди та протеїн збираються у великі двошарові структури. Суспензію потім озвучують з одержанням малих уніламелярних везикул (ЗИМ). У разі малих протеїнів цей метод працює добре. Однак, у цих експериментах може бути небажаним піддавати протеїн суровим умовам у розчиннику внаслідок можливості денатурації 65 протеїну. Отже, щоб уникнути небажаних конформаційних змін, може використовуватися другий метод, який включає солюбілізацію МТНІ(РбЄ)-НО у буфері для ресуспендування перед гідратацією ліпідної плівки. Після гідратації ліпідів протеїн спонтанно асоціює з новоутвореною мембраною і проникає до бішару БОМ під час озвучування. Третій метод включає одержання ліпосом без протеїну МТНІ(Рб)-НО з його наступним додаванням до вже сформованих ЗИМ, що дає НО можливість інтегруватись до ліпідного бішару. Ліпосоми готують шляхом озвучування проб згідно з раніше описаними процедурами (ції еї аї., 1997, Віоспетівігу 36: 4959). Стисло, ліпіди (з протеїном чи без нього) розчиняють в органічному розчиннику, такому як хлороформ/метанол. Тонкі ліпідні плівки утворюють шляхом внесення піпеткою аліквот ліпідних розчинів до круглодонних скляних пробірок та випарювання розчинника при 652 у тоці газоподібного азоту. Плівки поміщали під вакуум принаймні на вісім годин для видалення залишкового органічного розчинника. Одержання ліпосом здійснювали шляхом 70 гідратації ліпідних плівок буфером та інкубування суспензії при 65923 протягом 5-10 хвилин перед озвученням проби. Потім ліпосоми фільтрують скрізь фільтр 0,22 мкм для стерилізації препарату. Розмір ліпосом визначали методом динамічного світлорозсіяння, і утворення агрегатів відстежували протягом принаймні чотирьох тижнів.
Можливо, може виникнути потреба у збереженні конформації протеїну МТНІ(РбЄ)-НО. Тому ми передбачаємо, що з трьох підходів, які можуть бути використані для виготовлення ліпосом, кращими можуть виявитись додавання 75 протеїну як компоненту до гідратуючого розчину або додавання до ліпосом після того, як вони вже будуть утворені.
Бактеріальні штами. Штами МТНІі 9333 (ізолят цереброспинальної рідини), 35056 (ізолят інфекції верхніх дихальних шляхів), 43095 (ізолят отитного середовища), 49766 (ізолят абсцесу легенів, еталонний штам для досліджень на антимікробну сприйнятливість) (АТСС) та штам Нір 51654 (АТСС) були використані для демонстрації ефективності у моделі бактеріальної інфекції. Перед використанням заморожений матеріал організму субкультивували у свіжому мозково-серцевому бульйоні з додаванням МАЮ (2мкг/мл) та гему (1Омкг/мл), та інкубували протягом 24 годин при 372С у атмосфері з 1095 діоксиду карбону. Для регулювання інокуляту бактерій, потрібного для проведення бактерицидних аналізів чи інтраперитонеального введення дози для зараження, використовують стандартну криву для кожного організму, що складається з відношення Ге! колонієутворюючих одиниць до щільності при 48Онм. о
Процедури вакцинації та випробувань індукування імунної реакції на бактеріальний антиген. Групи новонароджених щурів (п-6 на групу) імунізували у дні після народження 5, 12, 19 та 26, або у дні 5 та 26 дослідним препаратом вакцини чи буфером. Системну вакцинацію щурів здійснювали шляхом підшкірної ін'єкції ліпосомальних вакцин. Якщо тварин імунізували вакциною інтраназальним шляхом, то їх анестезували ї- метофаном, і дослідну композицію (2Омкл) вводили за допомогою стерильної насадки на мікропіпетці (Саїйснап еї аї.,, 1993, 9. Ін. Оів. 168: 622). Малят щурів поміщали разом з їх матерями-годувальницями, і контролювали см на появу небажаних реакцій, таких як утворення гранульом, почервоніння чи утворення струпів у місці Го) інокуляції. Через один тиждень після останньої вакцинації малят щурів анестезували галотаном і збирали кров серцевою пункцією, а слизові шляхи промивали сольовим розчином для збирання мукозальної секреції. Тварин о піддавали евтаназії діоксидом карбону. Титри бактерицидних антитіл сироватки та мукозальної рідини ч- вимірювали, як описано далі.
У дослідженнях з інтраперитонеального зараження малят щурів (у віці 26 днів) заражали бактеріями і контролювали бактеріальне навантаження у їх крові та спинномозковій рідині (С5Е) порівняно з « невакцинованими щурами. Відбір зразків крові та С5Е для аналізу на бактерію через два дні після зараження показав, що у тварин існує істотне бактеріальне навантаження (тобто, 1 х10"КОУ/мл крові, 1хХ107КОУ/МЛ. С5Б). ші с Сироватки вакцинованих щурів у віці 26 днів, що містили високі титри бактерицидних антитіл, вводили "» внутрішньовенно щурам у віці 6 днів. Наступного дня малята щурів (п-10) одержували інтраперитонеально дозу " МТНІ, як описано далі. Потім малят щурів спостерігали на захворюваність та смертність, тих, що вижили, піддавали евтаназії після 26 днів, а кров і СЗЕ збирали та культивували на присутність МТНІ.
Інтраперитонеальне зараження МТНІ. Культуру пасивованих іп мімо МТНІ у віці 24 годин доводили до - 5Х107-5Х109КОУ/мл і 100мкл цієї культури вводили інтраперитонеальною ін'єкцією щурам у віці 5-10 днів 1 ІЇЗтйй еї аї., 1973, Ійї. Іттип. 8: 278) Заражені малята щурів залишались після інокуляції з їх с матерями-годувальницями. Протягом 18-96 годин після зараження принаймні 9095 малят щурів вмирало від цієї дози пасивованих бактерій. ко 20 Вимірювання антигенспецифічної гуморальної імунної відповіді методом ЕГІЗА. Сироватку та зразки -ч мукозальної рідини кожного щура аналізували на антитіла дО та ІдА, специфічні до антигену Рб. До відповідно оброблених 96-лункових планшетів додавали клонований нативний Рб або протеїн МТНІ(Рб)-НО, та інкубували протягом ночі при кімнатній температурі. Планшети блокували 195 бичачого сироваточного альбуміну у бікарбонатному буфері, рНе,б, протягом ЗО хвилин при 3720. Потім планшети промивали 0,0595 Твін 20/РВ5.
Серійно розведені зразки кожної сироватки та мукозальної рідини додавали до покритих антигеном планшетів з (Ф) подальшим інкубуванням протягом 2 годин при 372С та промиванням буфером Твін/РВ5 наприкінці інкубування.
ГІ До лунок додавали на одну годину при 372С з'єднані з лужною фосфатазою моноклональні антитіла, специфічні до дб чи ІДА щура. Потім лунки промивали буфером Твін/РВ5 і до лунок додавали субстрат РМРР у 60 діетаноламіновому буфері, рНО,5, для ініціювання колориметричної реакції. Реакції зупиняли 0,75Н гідроксидом натрію і зчитували при 405нм за допомогою приладу Зресігатах для зчитування планшетів ЕЇГІЗА. Концентрації
Ід та ІА щурів обчислювали за стандартною кривою, одержаною для контрольних зразків з відомою концентрацією щурячого дос чи ІдА, нанесених на 96-лункові планшети, оброблені, як описано вище.
Аналіз на бактерицидні антитіла. Зразки крові для проведення аналізів на присутність бактерицидних 65 антитіл інкубували при 562 протягом 30 хвилин для інактивації комплементу. Потім робили серійне розведення дослідних сироваток у фосфатно-сольовому буфері (РВ5). Бактеріальну культуру у віці 24 годин доводили до
5х105КОУ/мл у стерильному РСМ-буфері, що складається з РВ5 з 0.15п7М СасСіо та 1птМ МосСі» і містить бичачий сироваточний альбумін (В5А). Сироватки невакцинованих малят щурів використовують як джерело комплементу. Ці сироватки об'єднують, відбирають аліквоти і зберігають при -702С до використання. До кожної лунки 9б-лункових планшетів додають бактерії (2О0мкл), серійно розведену сироватку (20мкл), комплемент (20мкл) та 40мкл 195 ВБА у РСОМ-буфері. Для визначення вихідних концентрацій бактерій аліквоти 1Омкл суміші зразка висівали у час нуль на чашки зі свіжим агаром ВНІ, який містить живильний агар з домішками МАО та гему. Після інкубування реакційних сумішей при 37 С протягом однієї години в атмосфері з 1095 діоксиду карбону зі струшуванням, їОмкл зразка з кожної лунки висівали на чашки у двох паралельних дослідах та 70 інкубували протягом ночі при 372С для визначення кількості КУО/лунку. Контрольні групи включали лунку без сироватки для підтвердження того, що самий лише комплемент не вбиває бактерій, та лунку з дослідною сироваткою, але без комплементу, щоб впевнитись у тому, що комплемент сироватки у дослідному зразку дійсно був інактивований. Усі аналізи роблять з трьома паралельними дослідами, а розведення, які спричинюють загибель 50905 бактерій, використовують для порівняння активності різних сироваток.
Приклад МІ - Вірус гепатиту С
Одержання НСМ(Е2/М51)-НО та НСМ(Е2/ЯЗИОНМК1)-НО у клітинах СНО. Нуклеотидну послідовність протеїну
НСМ Е2/М51 виділяють шляхом ампліфікації методом РСК штаму НСМ, як описано далі. Використовують 5-праймер, що відповідає першим 21п.н. гена Е2/Я51 СААДАССАТОАТСОСССАСОСА, та 3-праймер, що відповідає залишкам з 622 по 628, СААСТТОАСАСТОСАСОООСТА, видаляючи трансмембранний домен |Сосдиегеї, Ї. еї аї., 1998, 9. МігоЇ. 72(3): 2183-91). Крім того, кожен праймер є фланкованим зручним сайтом рестрикції. Продукт РСК лігують до рсОМАЗ.1Нів, що містить НО-домен як плазміду генної касети (Іпмйгодеп,
Іпс., Зап Оіедо, СА). НСМ(Е2/М5ТАНМК1)-НО конструюють шляхом делеції НМК1 гена Е2/М51, що відповідає першим 27 амінокислотам від залишку 384 до залишку 410. Делеційний мутант одержують методом
РОСЕ-ампліфікації з використанням 5-праймера СААСТСАТСААСАССААТООС та того самого З-праймера, що С використовувався для контрольної групи дикого типу. Кінцеві гени аналізували методом секвенування ДНК. о
Плазміди трансфекували до клітин СНО |Оееп, К. С. еї аіІ., 1988, Майте 331: 82) (АТСС, КоскКмійе, МО) з використанням реагенту для ліпофекції (І іротесіатіпе, Сірсо/ВкІ, СайПпегериго, МО) згідно з рекомендованим виробником протоколом. Відбирають стабільних трансфектантів за допомогою (3418 ((ірсо/ВКІ, (зайПпегзрига,
МО) і клонують методом обмеженого розведення. Ідентифікацію клонів, що продукують високі рівні протеїну, в. роблять методом вестерн-блотування. Протеїни НСМ(Е2/М51)-НО та НСМ(Е2/М51 АНМК1)-НО очищають за сч методом селективної схожості до нікеля, зв'язаного з твердою основою. Гістидиновий лінкер видаляють ентерокіназним гідролізом після завершення очистки. У разі потреби, використовували ексклюзійну, іонообмінну і) чи гідрофобну хроматографію для додаткової очистки протеїнів НСМ(Е2/М51)-НО та НСМ(Е2/Я51АНМК1)-НО. ю
Одержання протеїнів НСМ(НМК1)-НО та НСМ(С)-НО у Е.соїї. Нуклеотидні послідовності обраних епітопів 3о одержують з послідовностей протеїнів з використанням кодонових преференцій Е.соїї (І оотанп еї а!., 1987, ЕМВО -
У. 6: 2489). Послідовність антигену (антигенів) для вставки до генної касети відповідає епітопам з МР (147-161. ТМОКТКА!Ї МКТОМОР: 55-69. КІЛОМ5І ТІЕКММІ 5) та НА (91-108, БКАЕЗМСУРМОМРОМАБИ. Після одержання відповідної послідовності (послідовностей) синтетичний ген, що кодує НСМ-НО, фланкований « зручними сайтами рестрикції, збирають шляхом синтезу, гібридизації та лігування перекривних олігонуклеотидів.
Стисло, зборку фрагментів здійснюють шляхом нагріву до 652С та відпалювання олігонуклеотидів, коли вони З с остигають до кімнатної температури. Після інкубування на льоду протягом 2 хвилин фрагменти лігують
Із» ДНЕК-лігазою. Зібраний непроцесований ген, що кодує фрагменти НСУ, ампліфікують методом РСК, гідролізують рестриктазами та ізолюють електрофорезом на гелі. Потім ген НСМ лігують до аналогічно гідролізованої плазміди експресії, яка містить ген НО (наприклад, рТгсНіз чи рОЕЗ0). Кінцеві гени аналізують методом секвенування ДНК. і Плазміди, що містять НСМ-НО, трансформують до Е.соїї. Бактерії інкубують у середовищі І В з ампіциліном 4! (5Омкг/мл) при 372С до середньої логарифмічної фази росту. У цей момент часу додавали ІРТО для індукування гібридного промотора ігр/Лас. Виміри проводили кожної години для визначення оптимальної післяіндукційної о експресії протеїнів НСМ-НО. У момент оптимальної експресії клітини збирали центрифугуванням. Осади клітин ко 50 піддавали лізису і центрифугували. Лізат аналізували на присутність протеїну. Протеїни НСМ-НО очищали . методом селективної схожості до нікеля, зв'язаного з твердою основою. У разі потреби, використовували і ексклюзійну, іонообмінну чи гідрофобну хроматографію для додаткової очистки НСМ-НО.
Ліпосомальні препарати та процедури вакцинації, випробування з індукування імунної відповіді, кількісні виміри гуморальної імунної відповіді методом ЕЇГ ІЗА, аналізи ОТН, аналізи на цитокінспецифічну мРНК, кількісні 22 аналізи цитокінів методом ЕГІЗА, проліферація антиген-індукованих Т-клітин та визначення анти-НІМ СТІ -реакції
ГФ) по суті не відрізнялись від тих, що описані у Прикладі ІІЇ вище. іме)

Claims (61)

Формула винаходу
1. Імуногенна уніламелярна ліпосомна композиція, яка включає везикулоутворюючі ліпіди та антигенний комплекс, що одержаний шляхом злиття одного чи кількох антигенних детермінантів та гідрофобного домену, при цьому гідрофобний домен має площу поверхні більше 500 ангстрем2 і є асоційованим з мембраною вищезгаданої уніламелярної ліпосомної композиції, причому імуногенна композиція індукує формування антитіл 65 або викликає реакцію, пов'язану з клітинно-медійованим імунітетом іп мімо.
2. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що додатково включає один чи кілька ад'ювантів.
З. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс є хімічно бинтезованим.
4. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен є пептидом.
5. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 4, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен складається з від приблизно 15 до приблизно 500 амінокислотних залишків.
6. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 5, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен включає одну чи 70 кілька амінокислот, вибраних з групи, що складається з Аа, Азп, Сув, СіІп, СУ, Нів, Пе, Геи, Меї, Рпе, Рго, зЗег, ТНг, Тгр, Туг та Маї.
7. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що антигенний детермінант виділяють з антигену, вибраного з групи, що складається з НБМ 98, НЗМ дб, НІМ др120, СММ 98, НСМ Е2, ІМЕМ НА, ІМЕМ МА,
Н. іпїцепгає Рб, Н. Іпїцепгае Р5, фімбріального протеїну і протеїну 0.
8. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс додатково включає лінкерну ділянку, яка з'єднує антигенні детермінанти з гідрофобним доменом.
9. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 8, яка відрізняється тим, що лінкерна ділянка є пептидом.
10. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 9, яка відрізняється тим, що лінкерна ділянка складається з від 1 до приблизно 200 амінокислотних залишків.
11. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що амінокислотні залишки вибирають з групи, що складається з Аа, Аг9, Азп, Авзр, Сувз, Сім, Сіп, Су, Нів, Пе, Гей, ув, Меї, Рпе, Рго, Зег, ТНг, Тгр, Туг та Ма.
12. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс є злитим протеїном. сч
13. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 9, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс є злитим о протеїном.
14. Спосіб індукування імуногенної реакції у тварини-хазяїна, який включає введення імуногенно ефективної кількості композиції за п. 1.
15. Спосіб індукування імуногенної реакції у тварини-хазяїна, який включає введення імуногенно ефективної М Зо Кількості композиції за п. 2.
16. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що тварина-хазяїн є ссавцем. с
17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що ссавець є людиною. с
18. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що тварина є птицею.
19. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що антигенний детермінант вибирають з групи, що складається з о НМ 98, НМ 90, НІМ ор1і20, СММ 98, НСМ Е2, ІМЕМ НА, ІМЕМ МА, Н. іпйцеплае Рб, Н. іпйсепгае Р5, ї- фімбріального протеїну і протеїну ОЮ.
20. Композиція вакцини, яка включає ефективну кількість композиції за п. 1 та фармацевтично прийнятний носій.
21. Композиція вакцини за п. 20, яка відрізняється тим, що додатково включає один чи кілька ад'ювантів. «
22. Касета ДНК для вставки до вектора експресії, яка включає послідовності, що кодують імуногенний злитий з с протеїн, при цьому вказаний протеїн включає гідрофобний домен, що має площу поверхні більше 500 й ангстрем 7, та антигенний комплекс, який включає один чи кілька антигенних детермінантів. и"?
23. Касета ДНК за п. 22, яка відрізняється тим, що антигенний детермінант виділяють з антигену, вибраного з групи, що складається з НБМ 98, Н5М 90, НІМ ар120, СММ 98, НСМ Е2, ІМЕМ НА, ІМЕМ МА, Н. іпїчепгаєе Рб, Н. іпічепгае РБ5, фімбріального протеїну і протеїну 0. -І
24. Касета ДНК за п. 22, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен є пептидом, який складається з від приблизно 15 до приблизно 500 амінокислотних залишків. іні
25. Касета ДНК за п. 24, яка відрізняється тим, що пептид включає одну чи кілька амінокислот, вибраних з оз групи, що складається з Аа, Авп, Сув, Сп, Су, Нів, Пе, І ей, Меї, РНе, Рго, Зег, ТНАг, Тгр, Туг та Ма).
26. Касета ДНК за п. 22, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс додатково включає лінкерну ділянку, де яка з'єднує антигенний детермінант та гідрофобний домен. "І
27. Касета ДНК за п. 26, яка відрізняється тим, що лінкерна ділянка складається з від 1 до приблизно 200 амінокислотних залишків.
28. Касета ДНК за п. 27, яка відрізняється тим, що амінокислотні залишки вибирають з групи, що складається З Аа, Аго, Авп, Авр, Сув, Сім, Сп, СУ, Нів, Пе, Гени, Гуз, Меї, Ре, Рго, зег, ТНг, Тгр, Туг та Ма).
29. Вектор, який включає касету ДНК за п. 22. Ф,
30. Спосіб одержання імуногенної ліпосомної композиції, який включає експресію гена, що кодує антигенний ко комплекс за п. 1, розчинення везикулоутворюючих ліпідів та антигенного комплексу за п. 1 у придатному органічному розчиннику, во утворення ліпідної плівки чи висушеного розпилюванням порошку шляхом випарювання органічного розчинника, гідратацію ліпідної плівки чи порошку та диспергування гідратованої ліпідної плівки чи порошку з утворенням імуногенної ліпосомної композиції.
31. Спосіб одержання імуногенної ліпосомної композиції, який включає експресію гена, що кодує антигенний комплекс за п. 1, розчинення антигенного комплексу за п. 1 у водному буфері, гідратацію ліпідних порошків чи 65 ліпідних плівок буфером, який містить антигенний комплекс за п. 1, та диспергування ліпідних порошків чи плівок з утворенням імуногенної ліпосомної композиції.
32. Спосіб одержання імуногенної ліпосомної композиції, який включає експресію гена, що кодує антигенний комплекс за п. 1, розчинення антигенного комплексу за п. 1 у водному буфері та додавання антигенного комплексу за п. 1 до попередньо сформованих ліпосом з утворенням імуногенної ліпосомної композиції.
33. Імуногенна композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що додатково включає фармацевтично прийнятний носій.
34. Імуногенна композиція за п. 33, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс додатково включає лінкерну ділянку, що з'єднує антигенні детермінанти з гідрофобним доменом.
35. Імуногенна композиція за п. 33, яка відрізняється тим, що додатково включає один чи кілька ад'ювантів. 70
36. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка включає олію, везикулоутворюючі ліпіди, що знаходяться у рідкій фазі при температурі тіла, та антигенний комплекс за п. 1.
37. Композиція за п. 36, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс є злитим протеїном.
38. Імуногенна ліпосомна композиція, де вищезгадані ліпосоми складаються з уніламелярних везикул, що складається з везикулоутворюючих ліпідів та антигенного комплексу, що одержаний шляхом злиття одного чи 7/5 Кількох антигенних детермінантів та гідрофобного домену, при цьому гідрофобний домен має площу поверхні більше 500 ангстрем? і є асоційованим з мембраною вищезгаданих уніламелярних везикул, причому імуногенна композиція індукує формування антитіл або викликає реакцію, пов'язану з клітинно-медійованим імунітетом іп мімо.
39. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 38, яка відрізняється тим, що додатково включає один чи кілька 2о адоювантів.
40. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 38, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс є хімічно синтезованим.
41. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 38, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен є пептидом.
42. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 41, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен складається з від Га приблизно 15 до приблизно 500 амінокислотних залишків. о
43. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 41, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен включає одну чи декілька амінокислот, які вибирають з групи, що складається з Аа, Азп, Сувз, Сп, СІУ, Нів, Пе, Геци, Меї, Ре, Рго, Зег, ТНг, Тгр, Туг та Маї.
44. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 38, яка відрізняється тим, що антигенний детермінант виділяють з рч- антигену, вибраного з групи, що складається з Н5М оВ, НМ 90, НІМ ар120, СММ 98, НСМ Е2, ІМЕМ НА, ІМЕМ МА,
Н. іпїцепгає Рб, Н. іпїшепгае Р5, фімбріального протеїну і протеїну 0. с
45. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 38, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс додатково с включає пептидну лінкерну ділянку, яка з'єднує антигенні детермінанти з гідрофобним доменом.
46. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 45, яка відрізняється тим, що пептидна лінкерна ділянка о складається з від 1 до приблизно 200 амінокислотних залишків. -
47. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 46, яка відрізняється тим, що амінокислотні залишки вибирають з групи, що складається з Аа, Аг9, Азп, Авзр, Сувз, Сім, Сіп, Су, Нів, Пе, Гей, ув, Меї, Рпе, Рго, Зег, ТНг, Тгр, Туг та Ма. «
48. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 38, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс є злитим протеїном. - с
49. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка включає олію, везикулоутворюючі ліпіди і антигенний й комплекс, що одержаний шляхом злиття одного чи кількох антигенних детермінантів та пептидного гідрофобного "» домену, що має площу поверхні більше 500 ангстрем?.
50. Імуногенна уніламелярна ліпосомна композиція, яка включає везикулоутворюючі ліпіди і антигенний Комплекс, що одержаний шляхом злиття одного чи кількох вірусних антигенних детермінантів та гідрофобного - домену, при цьому гідрофобний домен має площу поверхні більше 500 ангстрем? і є асоційованим з мембраною с вищезгаданої уніламелярної ліпосомної композиції, причому імуногенна композиція індукує формування антитіл або викликає реакцію, пов'язану з клітинно-медійованим імунітетом іп мімо. о
51. Імуногенна уніламелярна ліпосомна композиція, яка включає везикулоутворюючі ліпіди і антигенний ГФ 20 комплекс, що одержаний шляхом злиття одного чи кількох бактеріальних антигенних детермінантів та гідрофобного домену, при цьому гідрофобний домен має площу поверхні більше 500 ангстрем2 і є "М асоційованим з мембраною вищезгаданої уніламелярної ліпосомної композиції, причому імуногенна композиція індукує формування антитіл або викликає реакцію, пов'язану з клітинно-медійованим імунітетом іп мімо.
52. Імуногенна уніламелярна ліпосомна композиція, яка включає везикулоутворюючі ліпіди і антигенний 595 комплекс, що одержаний шляхом злиття одного чи кількох грибкових антигенних детермінантів та гідрофобного ГФ) домену, при цьому гідрофобний домен має площу поверхні більше 500 ангстрем? і є асоційованим з мембраною вищезгаданої уніламелярної ліпосомної композиції, причому імуногенна композиція індукує формування антитіл о або викликає реакцію, пов'язану з клітинно-медійованим імунітетом іп мімо.
53. Імуногенна уніламелярна ліпосомна композиція, яка включає везикулоутворюючі ліпіди і антигенний 60 комплекс, що одержаний шляхом злиття одного чи кількох паразитних антигенних детермінантів та гідрофобного домену, при цьому гідрофобний домен має площу поверхні більше 500 ангстрем? і є асоційованим з мембраною вищезгаданої уніламелярної ліпосомної композиції, причому імуногенна композиція індукує формування антитіл або викликає реакцію, пов'язану з клітинно-медійованим імунітетом іп мімо.
54. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка включає олію, везикулоутворюючі ліпіди, що знаходяться бо у рідкій фазі при температурі тіла, та антигенний комплекс, який одержаний шляхом злиття одного чи кількох вірусних антигенних детермінантів та гідрофобного домену, що має площу поверхні більше 500 ангстрем, причому імуногенна композиція індукує формування антитіл або викликає реакцію, пов'язану з клітинно-медійованим імунітетом іп мімо.
55. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка включає олію, везикулоутворюючі ліпіди, що знаходяться у рідкій фазі при температурі тіла, та антигенний комплекс, який одержаний шляхом злиття одного чи кількох бактеріальних антигенних детермінантів та гідрофобного домену, що має площу поверхні більше 500 ангстрем?, причому імуногенна композиція індукує формування антитіл або викликає реакцію, пов'язану з клітинно-медійованим імунітетом іп мімо. 70
56. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка включає олію, везикулоутворюючі ліпіди та антигенний комплекс, який одержаний шляхом злиття одного чи кількох вірусних антигенних детермінантів та пептидного гідрофобного домену, що має площу поверхні більше 500 ангстрем7.
57. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка включає олію, везикулоутворюючі ліпіди та антигенний комплекс, який одержаний шляхом злиття одного чи кількох бактеріальних антигенних детермінантів та 75 пептидного гідрофобного домену, що має площу поверхні більше 500 ангстрем.
58. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка включає олію, везикулоутворюючі ліпіди, що знаходяться у рідкій фазі при температурі тіла, та антигенний комплекс, який одержаний шляхом злиття одного чи кількох грибкових антигенних детермінантів та гідрофобного домену, що має площу поверхні більше 500 ангстрем.
59. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка включає олію, везикулоутворюючі ліпіди, що знаходяться у рідкій фазі при температурі тіла, та антигенний комплекс, який одержаний шляхом злиття одного чи кількох паразитних антигенних детермінантів та гідрофобного домену, що має площу поверхні більше 500 ангстрем7.
60. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка включає олію, везикулоутворюючі ліпіди та антигенний комплекс, який одержаний шляхом злиття одного чи кількох грибкових антигенних детермінантів та пептидного сч гідрофобного домену, що має площу поверхні більше 500 ангстрем7.
61. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка включає олію, везикулоутворюючі ліпіди та антигенний (о) комплекс, який одержаний шляхом злиття одного чи кількох паразитних антигенних детермінантів та пептидного гідрофобного домену, що має площу поверхні більше 500 ангстрем7. у с (зе) ів) і -
-
. и? -і 1 (95) іме) що іме) 60 б5
UA2001031606A 1998-09-22 1999-09-22 Immunogenic liposomal compositions UA75327C2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10135198P 1998-09-22 1998-09-22
US40072399A 1999-09-21 1999-09-21
PCT/US1999/020880 WO2000016746A2 (en) 1998-09-22 1999-09-22 Immunogenic liposome compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA75327C2 true UA75327C2 (en) 2006-04-17

Family

ID=26798150

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2001031606A UA75327C2 (en) 1998-09-22 1999-09-22 Immunogenic liposomal compositions

Country Status (31)

Country Link
EP (1) EP1115382B1 (uk)
JP (1) JP2002526436A (uk)
KR (1) KR100592825B1 (uk)
CN (1) CN1555254A (uk)
AP (1) AP2010A (uk)
AT (1) ATE468108T1 (uk)
AU (1) AU766772B2 (uk)
BG (1) BG65675B1 (uk)
BR (1) BR9914004A (uk)
CA (1) CA2344173C (uk)
CY (1) CY1110718T1 (uk)
CZ (1) CZ20011013A3 (uk)
DE (1) DE69942393D1 (uk)
DK (1) DK1115382T3 (uk)
EA (1) EA004797B1 (uk)
EE (1) EE200100168A (uk)
ES (1) ES2345695T3 (uk)
GE (1) GEP20053444B (uk)
HK (1) HK1039064A1 (uk)
HU (1) HUP0105391A3 (uk)
ID (1) ID29082A (uk)
IL (2) IL141675A0 (uk)
MX (1) MXPA01002973A (uk)
NO (1) NO330685B1 (uk)
NZ (2) NZ528055A (uk)
OA (1) OA11657A (uk)
PL (1) PL206260B1 (uk)
SK (1) SK287670B6 (uk)
UA (1) UA75327C2 (uk)
WO (1) WO2000016746A2 (uk)
ZA (1) ZA200101829B (uk)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200726479A (en) 2005-04-12 2007-07-16 Univ Duke Method of inducing neutralizing antibodies to human immunodeficiency virus
KR102185682B1 (ko) 2009-06-04 2020-12-11 고쿠리츠칸센쇼켄쿠죠 마이코플라즈마 감염증용 백신
CA2834349A1 (en) 2011-04-26 2012-11-01 Molecular Express, Inc. Liposomal formulations
WO2015048635A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Duke University Mper-liposome conjugates and uses thereof
CA3057715A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 Avidea Technologies, Inc. Peptide-based vaccines, methods of manufacturing, and uses thereof for inducing an immune response
KR20240033309A (ko) * 2022-09-05 2024-03-12 주식회사 차백신연구소 에멀전 제형의 면역증강제 조성물 및 이의 제조 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8405493D0 (sv) * 1984-11-01 1984-11-01 Bror Morein Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel
US5374548A (en) * 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
SE462375B (sv) * 1985-10-15 1990-06-18 Morgaardshammar Ab Centro Traadblock
US4861597A (en) * 1986-05-20 1989-08-29 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Novel functionallized liposomes and a process for production thereof
FR2754543B1 (fr) * 1996-10-11 1998-12-31 Pasteur Institut Souche de bordetella deficiente dans la production de toxine et exprimant une proteine hydride, liposomes comprenant de la fha et leurs utilisations comme vaccins, et utilisation de la fha pour stimuler les reponses immunitaires

Also Published As

Publication number Publication date
OA11657A (en) 2004-12-08
KR100592825B1 (ko) 2006-06-23
NO330685B1 (no) 2011-06-06
CA2344173A1 (en) 2000-03-30
AU6035199A (en) 2000-04-10
ZA200101829B (en) 2002-06-05
EP1115382A2 (en) 2001-07-18
PL206260B1 (pl) 2010-07-30
IL141675A (en) 2007-06-17
EP1115382B1 (en) 2010-05-19
AU766772B2 (en) 2003-10-23
WO2000016746A3 (en) 2000-11-23
NZ528055A (en) 2005-01-28
KR20010075261A (ko) 2001-08-09
BR9914004A (pt) 2001-07-24
CN1555254A (zh) 2004-12-15
HUP0105391A3 (en) 2006-02-28
WO2000016746A9 (en) 2000-09-21
DE69942393D1 (de) 2010-07-01
HUP0105391A2 (hu) 2002-05-29
NO20011406L (no) 2001-04-24
DK1115382T3 (da) 2010-09-06
MXPA01002973A (es) 2003-03-27
HK1039064A1 (en) 2002-04-12
BG65675B1 (bg) 2009-06-30
NO20011406D0 (no) 2001-03-20
AP2010A (en) 2009-06-29
NZ510442A (en) 2003-10-31
SK287670B6 (sk) 2011-05-06
EE200100168A (et) 2002-06-17
WO2000016746A2 (en) 2000-03-30
CY1110718T1 (el) 2015-06-10
EA200100269A1 (ru) 2001-12-24
AP2001002096A0 (en) 2001-03-31
ID29082A (id) 2001-07-26
JP2002526436A (ja) 2002-08-20
IL141675A0 (en) 2002-03-10
ATE468108T1 (de) 2010-06-15
SK3222001A3 (en) 2001-09-11
EA004797B1 (ru) 2004-08-26
WO2000016746A8 (en) 2000-08-10
GEP20053444B (en) 2005-02-25
CA2344173C (en) 2010-02-23
PL348604A1 (en) 2002-06-03
BG105372A (en) 2001-10-31
ES2345695T3 (es) 2010-09-29
CZ20011013A3 (cs) 2002-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3288692B2 (ja) レスピラトリイ・シンシチアル・ウイルス：ワクチンおよび診断法
JP4301415B2 (ja) ライム病組み合せ組成物とその使用
EP0639081A1 (en) Vaccine compositions for mucosal delivery
UA75327C2 (en) Immunogenic liposomal compositions
JP2002509421A (ja) グラム陽性菌の表面上のハイブリッド表面タンパク質の供給及び発現
MXPA01012787A (es) Polinucleotidos microbianos expresados durante la infeccion de un huesped..
JP4530317B2 (ja) 減毒化トキシンを含むワクチン製剤
JP3396478B2 (ja) ワクチン
JP2777894B2 (ja) コレラワクチン
CA2271699A1 (en) Chimeric ltb vaccines
EP0555333A1 (en) ARTIFICIAL VIRUS CASES.
KR0173364B1 (ko) 서로 다른 기원의 펩타이드 항원이 연결된 폴리펩타이드를 함유하는 리포좀
CN117721150A (zh) 一种狂犬病mRNA疫苗、其制备及应用
KR0154576B1 (ko) 펩타이드 항원을 함유하는 리포좀
Green The development and use of antigen-antibody-LTB (Ag-MAb-LTB) complexes as immunogens
US20050048065A1 (en) Methods and compositions containing antigens having a targeting moiety specific for antigen presenting cells for intranasal immunization