JP3396478B2 - ワクチン - Google Patents

ワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はリポソーム、それらの調製方法およびそれら
を含有する薬剤組成物に関するものである。
各種の不活化されたウイルスはよい免疫原である一
方、ワクチンとしてそれらを使用する場合に重大な損失
を示す発熱原であることが知られている。この一つの例
が現在のインフルエンザワクチンである。これらはウイ
ルス全体からなり、卵タンパク質への感受性同様発熱性
の問題を被る。代わりのものとしてはウイルスのサブユ
ニットからなるインフルエンザワクチンを用いることで
あるが、これらは不十分な免疫原であり、生感染に比較
して不十分な防御しか促進しない。
一般に、インフルエンザワクチンへの最も不十分な応
答がインフルエンザの感染に続く併発症および死の危機
に陥った初老の患者で観察されている。これらの問題に
加えて、インフルエンザワクチンは効果がないと考えら
れており、注射の恐怖のため一般的でない。
GB−Ａ−1564500はウイロソームとして知られる多数
の単層微小水胞を含む抗原の調製を提示し、それぞれの
微小水胞はウイルス由来の抗原タンパク質が結合する表
面上に単一脂質二重層からなる。GB−Ａ−1564500は二
つの連続した米国特許US−Ａ−4196191およびUS−Ａ−4
148876に関連するものである。US−Ａ−4148876は、GB
−Ａ−1564500で提示される型の抗原ウイロソームの調
製を示しており、その中で、抗原タンパク質は疎水性結
合により結合され、ヘマグルチニンおよびミキソウイル
ス由来で、疎水性領域をもつ防御表面抗原のニューラミ
ニダーゼサブユニットである。
我々は再構築ウイルスエンベロープを含み、ニューラ
ミニダーゼを不活化する処理をされたインフルエンザウ
イロソームが鼻腔内投与されると、高度に免疫原性をも
つことを見いだした。著しいIgA応答が鼻腔内で免疫さ
れたマウスの肺洗浄液には観察されたが、非経口で免疫
された場合には観察されなかった。これらの発見は一般
応用性をもつ。したがって、本発明はヒトまたは動物の
粘膜細胞表面への結合能があるポリペプチドがその表面
に存在し、基本的に活性ニューラミニダーゼをもたない
リポソームを供給することである。リポソームは典型的
にはウイロソームである。
リポソームは三次元空間を囲まれた脂質小胞である。
エンベロープウイルスは脂質エンベローブからなる。本
発明に記載のリポソームはそれ故エンベロープウイルス
の脂質から作製される。ウイルスエンベロープは例えば
界面活性剤によりエンベロープウイルスが破壊された
後、それによりリポソームを形成するために再構築され
る。
有効なリポソームはまた、12から20個の炭素原子の一
つの脂肪酸鎖および少なくとも８個の炭素原子、例えば
12から20個の炭素原子の一つの脂肪酸鎖をもつ天然また
は合成のホスホコリンを含む脂肪から作製される。その
ような脂肪はジミリストイルホスファチジルコリン、ジ
オレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスフ
ァチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセ
ロール、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびスフィン
ゴミエリンを含む。好ましくは全脂質成分の30％（W/
W）以下として存在する、例えばコレステロールのよう
な他の脂質もまたリポソームに含まれる。脂質はさらに
正または負の電荷を供給する物質、ホスファチジン酸、
ジセチルリン酸、ホスファチジルセリンまたはホスファ
チジルイノシトールのような負の電荷を供給する物質、
または正の電荷を供給するためのステアリルアミンまた
は他の一次アミンを含む。
本発明で用いられるリポソームは単層または複層のい
ずれかで、好ましくは単層である。それらは典型的には
生物分解される。それらが構成される脂質は一般には非
抗原性である。リポソームは例えば抗体、抗原または薬
剤のような物質をカプセル化する。それらはそれ故カプ
セル化される成分の運搬システムとして用いられる。リ
ポソームは一般的な運搬システムとしても利用される。
典型的にはリポソーム内部の環境は水性環境である。
ペプチド、タンパク質またはアジュバントのような各種
の物質がリポソーム内部にカプセル化されている。物質
は免疫応答を誘導したい物質に対するものである。カプ
セル化される物質はヘルペスシンプレックスウイルス、
Ａ型肝炎ウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスのような多く
の型のウイルスから調製された抗原サブユニットを含
む。クラス１のＴ−細胞エピトープを含むタンパク質ま
たはペプチドが用いられる。この物質のウイロソーム内
へのカプセル化はそれらに対する細胞毒性Ｔ−細胞応答
をつくる助けとなる。
リポソームは好ましくは鼻腔内投与に適した形態であ
る。それ故、好ましくは粘膜細胞表面結合ポリペプチド
はリポソームに鼻腔粘膜または肺粘膜への結合能を与え
る。好ましくはリポソームの直径は５から1000nmで、例
えば10から400nm、最も好ましくは20から100nmである。
粘膜細胞表面に結合能をもつポリペプチドはグリコシ
ル化されているか、またはグリコシル化されていない。
ポリペプチドはそれ故糖タンパク質の形態である。好ま
しくはポリペプチドはリポソームに融合性を賦与するの
で、リポソームは宿主細胞膜と単に結合するというより
はむしろ融合することができる。これらの膜は外膜また
はエンドサイトーシスに続くエンドソームの膜のいずれ
かである。ポリペプチドは典型的にはウイルスエンベロ
ープポリペプチド、またはウイルスエンベロープポリペ
プチド由来のものである。全てのエンベロープウイルス
は表面結合機能をもつ。ポリペプチドはそれ故エンベロ
ープウイルスの表面に存在し、細胞表面結合能をもつリ
ポソームを供給するポリペプチドである。ウイルスはイ
ンフルエンザ、おたふくかぜまたは麻疹ウイルスのよう
にミキソウイルスである。特に、ポリペプチドは例えば
インフルエンザウイルスＡ、ＢまたはＣ型のようなイン
フルエンザウイルスエンベロープタンパク質であるか、
またはそれに由来するものである。
細胞表面に結合能のあるポリペプチドは、例えばヘマ
グルチニンである。ヘマグルチニンはミキソウイルスに
存在する、通常三つの単量体またはサブユニットからな
る不可欠な膜糖タンパク質である。宿主細胞への感染中
に、ヘマグルチニンは二つの機能を果たす。第一に、細
胞の糖タンパク質および糖脂質に存在するシアル酸残基
の結合により細胞にウイルスを接着する。第二に、細胞
エンドソームへのウイルスの内在化の後、次の酸性化が
ウイルスおよび細胞膜の融合を起こさせるヘマグルチニ
ンに立体配置の変化を誘発する。ヘマグルチニンは抗原
性で、宿主の抗体産生を促進する。
細胞表面への結合能をもつ別の型のポリペプチドはコ
レラ毒のβ−サブユニット（CTB）または大腸菌の熱不
安定性エンテロトキシンβ−サブユニット（LTB）のよ
うな細菌接着タンパク質である。これはまたヘマグルチ
ニンと組み合わせてアジュバントとして用いられる。
ニューラミニダーゼはミキソウイルスに不可欠な膜タ
ンパク質として見いだされる別の糖タンパク質である。
これはシアル酸残基を切断し、ヘマグルチニンによる宿
主細胞膜へのウイルスの不可逆的な結合を阻害するよう
に機能する。活性ニューラミニダーゼがリポソームに存
在すると、その場合は著しく低い免疫学的応答が観察さ
れる。活性ニューラミニダーゼが同様にリポソームに存
在するならば、それは不活化されるべきである。ニュー
ラミニダーゼは熱処理または2,3−デヒドロ−２−デオ
キシ−Ｎ−アセチルニューラミン酸（DDAN）のようなニ
ューラミニダーゼ阻害剤とのインキュベーションにより
不活化される。
本リポソームはヒトまたは動物の粘膜細胞表面への結
合能をもつポリペプチドがその表面に存在し、基本的に
活性ニューラミニダーゼをもたないリポソームを形成す
ることよりなる過程により調製される。
細胞表面への結合能をもつポリペプチドは、リポソー
ムの形成前、形成中または形成後に、脂質物質に添加さ
れる。あるいは、ウイロソームは必要な脂質成分を供給
するためにエンベロープウイルスのエンベロープの天然
脂質を用いて調製される。ポリペプチドが天然に脂質と
結合しないならば、サクシニミジル−４−（ｐ−マレイ
ミドフェニル）ブチレート（SMPB）のような架橋剤の利
用によりホスファチジルエタノールアミン（PE）のよう
な脂肪酸に結合される。
リポソームは例えば脂質開始物質を溶媒に溶解し、溶
媒を蒸発させることにより調製される。脂質層はその後
（小胞形成後にポリペプチドをリポソームに取り込むつ
もりならば）生理的食塩水または緩衝液に、または（ポ
リペプチド存在下で小胞を形成するつもりならば）ポリ
ペプチドの水性懸濁液に分散される。分散液はその後、
例えば超音波により撹拌される。リポソーム表面にはま
だ取り込まれていないポリペプチドが添加され、小胞は
再び撹拌される。
別の方法は脂質開始物質を水層に添加し、ゆっくり混
合液を熱処理することである。これはリポソームを形成
するために、それから撹拌される。水層はポリペプチド
を含んでいるか、または続いて添加される。
リポソームを調製するさらに別の方法は、脂質のエタ
ノール溶液の生理的食塩水または予め窒素封入された緩
衝液への急速注入を含む。得られたリポソーム調製品は
その後より大きな不均一ではないリポソームの形成を避
けるために低圧で窒素存在下、急速撹拌しながらの限外
濾過により濃縮される。エタノールは小胞画分から分析
または限外濾過膜を用いた洗浄により除去される。ポリ
ペプチドは水溶液に存在するか、または代わりとして限
外濾過後に得られるリポソーム画分がポリペプチドと共
に軽く超音波処理される。
上述のように得られたリポソーム調製品は脂質小胞の
分散液を含む。
リポソームがニューラミニダーゼを含むならば、その
後不活化される。これは活性ニューラミニダーゼを含む
リポソームの分散液を、例え30から60℃、例えば50から
60℃、より好ましくは53から58℃、最も好ましくは約55
℃の温度での熱処理により行われる。ニューラミニダー
ゼ不活化に必要な時間の長さはウイルス株および温度に
依存するが、典型的には５分から５時間、例えば15分か
ら３時間である。低温、例えば30℃では、より長い時間
の熱処理が必要であるが、より高い温度ではより短い時
間が必要とされる。我々はインフルエンザウイルスにつ
いて、最適効果を得るために55℃での熱処理は120分ま
たはそれ以上、例えば180分までであることを見いだし
た。しかし、56℃では熱処理の最適時間は６から10分、
例えば約８分である。
あるいは、活性ニューラミニダーゼはDDANのようなニ
ューラミニダーゼ阻害剤とリポソームをインキュベーシ
ョンすることにより不活化される。さらに代わるものと
して、活性ニューラミニダーゼはリポソームへの取込み
の前に熱処理またはニューラミニダーゼ阻害剤とのイン
キュベーションにより不活化される。
リポソームを調製する適当な方法は、（ａ）ミキソウ
イルスを破壊し、ウイルスゲノムおよび内部ウイルスタ
ンパク質を除去すること、（ｂ）残りの物質、特にエン
ベロープタンパク質存在下でリポソームを形成するこ
と、および（ｃ）このように形成されたリポソームに存
在するニューラミニダーゼを不活化することからなる。
段階（ａ）は界面活性剤によるウイルス粒子の可溶化
および内部ウイルスタンパク質およびRNAの除去により
達成される。リポソームを調製する別の方法で、細胞表
面結合ポリペプチドは組換えDNA技術により調製され
る。必ずニューラミニダーゼをもたないように準備され
るので、基本的に活性ニューラミニダーゼをもたないリ
ポソームが必ず得られる。
本発明のリポソームは、さらに適当な薬学的に、また
は獣医学的に受容可能な運搬体または希釈剤を含む薬学
あるいは獣医学的組成物の形態で投与される。成分は鼻
腔内投与に適している。
成分は好ましくは滅菌された形で供給される。それら
は噴霧剤の形をとる。成分はさらに必要ならば、防腐
剤、安定化剤および他の慣例的なワクチン賦形剤からな
る。
リポソームの投与量は各種因子に依存して変化する。
これらには細胞表面結合タンパク質の性質、患者（ヒト
または動物）、予防接種の計画、および調製により与え
られる補助性の程度が含まれる。一般に、リポソームの
投与は単一の単位として、または時間をかけた繰り返し
の再投与により鼻腔内へ行われる。典型的にはヒトへの
鼻腔内投与の単位は２から500μｇである。
我々はまた基本的に不活性なニューラミニダーゼをも
たない不活化されたインフルエンザウイルスは鼻腔内に
投与されると、高度な免疫原性をもつことを見いだい
た。この発見はまた一般に応用可能である。それ故、発
明はさらに、インフルエンザウイルスとして用いるため
の、感染性のない、基本的に活性ニューラミニダーゼを
もたないインフルエンザウイルスおよびインフルエンザ
ワクチンとして用いるたの医薬品の調製における感染性
のない、基本的に活性ニューラミニダーゼをもたないイ
ンフルエンザウイルスの使用を供給する。
インフルエンザウイルスはいずれかのインフルエンザ
ウイルス、例えばＡ、ＢまたはＣ型である。ウイルスは
予防接種したいものに対するウイルスである。ニューラ
ミニダーゼは熱処理または特異的阻害剤により不活化さ
れる。ウイルスの水溶液は熱処理される。熱処理は例え
ば30から60℃、より好ましくは53から58℃およびさらに
好ましくは約55℃の温度で行われる。
ニューラミニダーゼの不活化を確実にするために行わ
れる熱処理の時間の長さはウイルスの株および温度に依
存するが、典型的には５分から５時間、例えば15分から
３時間である。低温、例えば30℃では、より高温の場合
より、より長い熱処理が必要とされる。我々は最適効果
を達成するために、55℃での熱処理は120分以上、例え
ば180分までであることを見いだした。しかし、56℃で
の熱処理の最適時間は６から10分、例えば８分である。
インフルエンザウイルスは不活化される。特に、ウイ
ルスの感染性は不活化される。これはニューラミニダー
ゼを不活化するための熱処理により達成される。しか
し、典型的には絶対安全な不活化方法を供給する紫外線
照射により達成される。これはニューラミニダーゼを不
活化するための処理前、同時にまたは処理後に実施され
る。照射は例えば240から250nmの短波長で、400μW/c
m2、少なくとも５分間、例えば５から60分行われる。紫
外線不活化および熱処理されたウイルスは２から３日間
胚含有ニワトリ卵の尿膜液中で生育、回収され、ショ糖
勾配で精製される。
基本的に活性ニューラミニダーゼをもたない不活化イ
ンフルエンザウイルスはさらに適当な薬学的に受容可能
な運搬体または希釈剤を含む薬学的成分の形態で投与さ
れる。成分は鼻腔内投与に適している。
成分は好ましくは滅菌された形態で供給される。それ
らは噴霧液の形態をとる。成分はさらに必要ならば、防
腐剤、安定化剤およびその他の慣例適な賦形剤を含む。
不活化ウイルスの投与量は各種の因子に依存して変化
する。基本的に活性ニューラミニダーゼをもたない効果
的な量の不活化インフルエンザウイルスは予防接種が必
要な、特に前記ウイルスに対する予防接種が必要な人に
投与される。投与量を評価するために考慮すべき因子は
供与体の年齢、予防接種の計画および調製により付与さ
れるアジュバント性の程度を含む。一般に、服用は単一
ユニットとして、または一定時間の多重再投与として鼻
腔内に投与される。典型的には鼻腔内投与のためのユニ
ット投与量は２から500μｇである。
発明のワクチンは現在のインフルエンザワクチン以上
の利点を示す。これらは免疫原性、鼻腔内投与の簡便さ
および局部的な粘膜の免疫を生産を含む。
発明はさらに以下の例により示される。添付の図にお
いて、 図1Aは熱および酸処理したウイロソームまたはウイル
スで鼻腔内（i.n.）免疫されたBalb/cマウスの血清中の
X31インフルエンザウイルスに対するELISAの力価を示
す。
図1Bは熱および酸処理したウイロソームまたはウイル
スでi.n.免疫されたBalb/cマウスの血清中の変性ウイル
スに対するELISAの力価を示す。
図1Cは熱および酸処理したウイロソームまたはウイル
スでi.n.免疫されたマウスの血清の中和力価を示す。
図1Dは熱および酸処理したウイロソームまたはウイル
スでi.n.免疫されたマウスの血清中のウイルスに対する
HAIの力価を示す。
図2Aは熱および酸処理したウイルスでi.n.免疫された
マウスの血清中のウイルスに対するELISAの力価を示
す。
図2Bは熱および酸処理したウイルスでi.n.免疫された
マウスの血清中のウイルスに対する中和力価を示す。
図3Aは熱および酸処理したウイロソームでi.n.免疫さ
れたマウスの血清中のウイルスに対するELISAの力価を
示す。
図3Bは熱および酸処理したウイロソームでi.n.免疫さ
れたマウスの血清中のウイルスに対する中和力価を示
す。
図4Aは内部タンパク質およびRNAをカプセルで被った
熱および酸処理したウイロソーム（ウイロソームコア）
でi.n.免疫されたマウスの血清中のウイルスに対するEL
ISAの力価を示す。
図4Bは熱および酸処理したウイロソームコアでi.n.免
疫されたマウスの血清中のウイルスに対する中和力価を
示す。
図５はオブアルブミンをカプセルで被った熱および酸
処理したウイロソーム（オバウイロソーム）でi.n.免疫
されたマウスの血清中のウイルスに対するELISAの力価
を示す。
図5Bは熱および酸処理したオバウイロソームでi.n.免
疫されたマウスの血清中のウイルスに対する中和力価を
示す。
図6Aは熱および酸処理したウイルスでi.n.免疫された
マウスの血清（採血２日後）中のウイルスに対する個々
のELISAの力価を示す。
図6Bは熱および酸処理したウイルスでi.n.免疫された
マウスの血清（採血２日後）のウイルスに対する個々の
中和力価を示す。
図7Aは熱および酸処理したウイロソームでi.n.免疫さ
れたマウスの血清（採血２日後）中のウイルスに対する
個々のELISAの力価を示す。
図7Bは熱および酸処理したウイロソームでi.n.免疫さ
れたマウスの血清（採血２日後）中のウイルスに対する
個々の中和力価を示す。
図8Aは熱および酸処理したウイロソームコアでi.n.免
疫されたマウスの血清（採血２日後）中のウイルスに対
する個々のELISAの力価を示す。
図8Bは熱および酸処理したウイロソームコアでi.n.免
疫されたマウスの血清（採血２日後）中のウイルスに対
する個々の中和力価を示す。
図9Aは熱および酸処理したオバウイロソームでi.n.免
疫されたマウスの血清（採血２日後）中のウイルスに対
する個々のELISAの力価を示す。
図9Bは熱および酸処理したオバウイロソームでi.n.免
疫されたマウスの血清（採血２日後）中のウイルスに対
する個々の中和力価を示す。
図10Aはi.n.投与されたウイロソームの免疫原性に対
する熱処理の効果を示すELISAの力価を示す。
図10Bはi.n.投与されたウイロソームの免疫原性に対
する熱処理の効果を示す中和力価を示す。
図11は熱処理されたウイロソームで免疫した後の抗ウ
イルスおよび中和抗体の応答を比較している。
図12Aはi.n.投与されるウイロソームの免疫原性に対
する55℃での熱処理の効果を示す。
図12Bはi.n.投与されるウイロソームの免疫原性に対
する55℃での熱処理の効果を示す。
図13はi.n.投与されるウイロソームの免疫原性に対す
るガングリオシドでのウイロソームまたはマウスの前処
理の効果を示す。
図14Aは異なる投与量のインフルエンザウイロソーム
でi.n.免疫されたマウスの０日および43日の血清のELIS
Aの結果を示す。
図14Bは異なる投与量のインフルエンザウイロソーム
でi.n.免疫されたマウスの０日および43日の血清の中和
の結果を示す。
例 1.方法 ウイロソームの調製 再構築ウイルスエンベロープを作るための方法はMets
ikkoら（EMBO J.、第５巻、3429から3435ページ、1986
年）およびStegmannら（EMBO J.、第６巻、2651から265
9ページ、1987年）により記述されたものに類似したも
のである。X31インフルエンザウイルスのペレット（5m
g）が透析緩衝液（145mM NaCl、5mM Hepes、pH7.4）に
溶解した100mMオクタエチレングリコールモノドデシル
エーテル（C12E8）の0.7mlに20分間室温で溶解された。
混合液は内部タンパク質およびRNAを除去するために17
0,000gで30分間遠心分離に付された。0.56mlの上清が16
0mgの湿ったBio−Beads SM−２に添加され、室温で１時
間回転台で振盪された（約400rpm）。上清はビーズから
1mlシリンジに付けた23g針を用いて取り出され、80mgの
湿ったBio−Beads SM−２に添加され、回転台で８分間
振盪され（約500から600rpm）、濁った懸濁液が得られ
た。上清が23g針とシリンジを用いて取り出された。ウ
イロソームは170,000gで90分間遠心される不連続なショ
糖勾配（40％/5％または40％/20％/5％）により取り込
まれないタンパク質から分離された。ウイロソームの形
態はリンタングステン酸の逆染色を用いた電子顕微鏡に
より解析された。
被膜タンパク質、例えばオブアルブミンを含むウイロ
ソーム（ウイロソーム＋卵）は100μｌの200mg/mlオブ
アルブミンがSM−２ビーズに添加される前に添加される
ことを除いて上述のように作製された。ウイロソームコ
アは内部タンパク質およびRNAが遠心分離により除去さ
れないことを除いて上述のように作製された。
ELISA法 予防接種されたマウスの血清中の抗ウイルス抗体はEL
ISA（酵素免疫吸着法）により測定される。ウイルス抗
原は炭酸コーティング緩衝液、pH9.5で、ウイルスを接
種されたニワトリ卵の洗浄液または１μg/mlの精製され
た卵で生育したウイルスが1/50に希釈された。マイクロ
タイタープレートは抗原でコートされ、37℃で１時間、
さらに４℃で一晩放置された。プレートを３回0.05％Tw
een20を含むPBSで洗浄した後、１％ BSAが100μｌ添加
され、プレートをブロックするために37℃で１時間放置
された。試験される抗血清は１％ BSAを含むPBSで倍々
にまたは半対数的にプレートで希釈され、４℃で一晩放
置された。プレートは１％ BSAを含むPBSで1/500から1/
1000に希釈した酵素結合二次抗体を添加する前に洗浄さ
れた。プレートは37℃で２時間放置され、Tween/PBSで
洗浄された。0.01％ H2O2を含むクエン酸緩衝液に溶解
した基質であるｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリ
ド（OPD）がプレートに添加され、反応は硫酸で止めら
れた。プレートは492nmでマイクロプレートリーダーで
読まれた。力価は、対照の正常血清の1/10希釈で得られ
る平均OD値＋２標準偏差に等しいOD値をとる力価により
決定される端点の力価であった。
試験管内中和法 我々はMDCK細胞でのマイクロタイタープレートを用い
た中和法を確立した。連続的に希釈した抗体は37℃で１
時間２対数のウイルスとインキュベートされた。これら
は無血清MEM培地中で70から90％融合したMDCK細胞の入
ったマイクロタイタープレートに移された。37℃で１時
間のインキュベーションの後、上清が除去され、10μg/
mlのトリプシンを含む新鮮なMEMが添加された。プレー
トは48から72時間後に染色され、中和力価が目で読まれ
た。
HAI−血球凝集反応阻害アッセイ 血球凝集反応および血球凝集反応阻害アッセイはFaze
kas de St.GrothおよびWebserにより記述されたように
行なわれた（J.Exp.Med.、第124巻、331から345ペー
ジ、1966年）。
実験 実験は以下のように、図に参照されるように行なわれ
た。
図１ 投与量−i.n.投与で30μｌの容量中にマウスあたり５
μｇのX31ウイルス／ウイロソーム 全てのウイロソームは５分間（400μW/cm2）UV不活化さ
れた。
熱処理−熱処理は20分間55℃で行われた。
酸処理−1/100容の3M酢酸緩衝液、pH4.8がウイロソーム
に添加された。1M Tris、pH7.5で酸を中和する前に、こ
れらは37℃で15分間放置された。
二次免疫−６週 採血試験−12週 図２から５ 投与量−i.n.投与で30μｌの容量中にマウスあたり５
μｇのX31ウイルス／ウイロソーム ウイロソームは５分間（400μW/cm2）UV不活化された。
熱処理−熱処理は20分間55℃で行われた。
酸処理−1/100容の3M酢酸緩衝液、pH4.8がウイロソーム
に添加された。1M Tris、pH7.5で酸を中和する前に、こ
れらは37℃で15分間放置された。
二次免疫−６週 図６から９ 投与量−i.n.投与で30μｌの容量中にマウスあたり５
μｇのX31ウイルス／ウイロソーム ウイロソームは５分間（400μW/cm2）UV不活化された。
熱処理−熱処理は20分間55℃で行われた。
酸処理−1/100容の3M酢酸緩衝液、pH4.8がウイロソーム
に添加された。1M Tris、pH7.5で酸を中和する前に、こ
れらは37℃で15分間放置された。
二次免疫−６週 採血試験−12週 図10 投与量−i.n.投与で30μｌの容量中にマウスあたり３
μｇのX31ウイロソーム ウイロソームは５分間（400μW/cm2）UV不活化された。
熱処理−熱処理は特定の時間55℃で行われた。
二次免疫−６週 図11 投与量−i.n.投与で30μｌの容量中にマウスあたり３
μｇのX31ウイロソーム ウイロソームは５分間（400μW/cm2）UV不活化された。
熱処理−熱処理は特定の時間55℃で行われた。
二次免疫−６週 採血試験−８週 図12 投与量−i.n.投与で30μｌの容量中にマウスあたり３
μｇのX31ウイロソーム ウイロソームは５分間（400μW/cm2）UV不活化された。
熱処理−熱処理は指定された時間55℃で行われた。
二次免疫−６週 採血試験−12週 図13 ガングリオシドおよび抗体を用いた前処理 ウイロソームはHepes緩衝液（145mM NaCl、5mM Hepe
s、pH7.4および3mM EDTA）で透析された。これらのウイ
ロソームは55℃で１時間熱処理された。
投与量−30μｌでマウスあたり３μｇ ガングリオシドとのインキュベーション−ウイロソーム
はウイルスのヘマグルチニンに対して12M過剰のガング
リオシドとともに37℃で１時間、さらに４℃で一晩イン
キュベートされた。
ガングリオシドでのマウスの前処理−ウイルスへのヘマ
グルチニンに対して100M過剰のガングリオシド 抗体とのインキュベーション−20μｇのウイロソームが
40μｇの精製HC2抗体または20μｇのHC2のFab断片と２
時間37℃でインキュベートされた。
CTBとウイロソームの投与 それぞれのマウスに対して、２μｇのCTB（コレラ毒
のβ−サブユニット）が３μｇのウイロソームと共に投
与された。
二次免疫−６週 採血試験−12週 DDANでの処理 20μｇのウイロソームが1mM DDANと共に１時間37℃
で、さらに４℃で一晩インキュベートされた。
マウスあたりの投与量＝i.n.で30μｌ中３μｇ 二次免疫−６週 採血試験−12週 図14（投与量に対する応答） 投与量−30μｌの容量で各種の量のX31ウイロソームが
i.n.で与えられる ウイロソームは５分間（400μW/cm2）UV不活化された。
熱処理−熱処理は指定された時間55℃で行われた。
二次免疫−６週 2.結果 ウイルスおよびウイロソームの免疫原性に対する酸処理
の効果 インフルエンザウイルス、インフルエンザウイロソー
ムまたはコア（HBcAg）あるいはオブアルブミンを含む
インフルエンザウイロソームは30分間37℃で酸処理され
た（pH4.8）。ウイルスまたはウイロソームの酸処理は
生ウイルスに対する血清ELISAの力価による測定の場
合、鼻腔内経路で与えられたウイルスまたはウイロソー
ムの免疫原性を劇的に減少させた（図1Aおよび図2Aから
5A）。血清がSDSで変性されたウイルスに対して試験さ
れた場合に、より低い応答がまた観察されたので（図1
B）、これは酸がヘマグルチニン上のいくつかの中和エ
ピトープを破壊するという事実によるものではなかっ
た。さらに、誘導される中和抗体のレベルは接種物が酸
処理されているならば、かなり減少した（図1Cおよび図
2Bから5B）。
コアを含むウイロソームの酸による不活化に対する防
御があると思われたが、これは二回目の接種の不十分な
酸性化によるものではない（図4AおよびＢを参照せ
よ）。個々の動物の応答が解析された場合、ウイルスま
たはウイロソームが酸処理されているならば、応答に一
定の減少があった（図６から９）。我々はまた血清の血
球凝集反応阻害（HI）活性を観察したところ（図1D）、
接種前にウイロソームが酸処理されると促進される抗体
の力価が減少することが示された。
ウイルスの酸処理（pH4.8）はウイルスの接着は影響
されないにもかかわらず、ウイルスの細胞への融合能を
なくす。これは通常では被われたピット内へのウイルス
の取込みの後にエンドソーム内に起きるヘマグルチニン
の立体配置の不可逆的な立体配置シフトによるものであ
る。これらの結果はウイルスまたはウイロソームが粘膜
表面に結合するだけでなく、最適な応答を促進するため
に上皮細胞と融合しなければならないことを示唆する。
ウイルスの免疫原性に対する55℃での熱処理の効果 20分間熱処理されたX31インフルエンザウイルスを鼻
腔内に接種されたマウスは非熱処理ウイルスを接種され
たマウスよりも著しく大きな血清ELISA、HAIまたは中和
抗体力価を示した（図1AからＤ）。生ウイルスに対する
ELISAの力価および中和力価は感染ウイルスの同一投与
量で免疫した後に観察される力価に達した（図２）。さ
らに別の実験では、ウイルスは８分間だけ熱処理れ、再
び鼻腔内接種に続く応答に増加が見られた（表１）。
熱処理された、または感染ウイルスに対する応答は不
活化されたウイルスに対する応答の少なくとも21日前に
観察された。個々の動物の応答が試験された場合、ウイ
ルスが熱処理されたときに応答に増加があり、ELISAの
力価は中和力価と平行であった（図６）。しかし、おそ
らく接種効率のためにかなりの変動があった。
ウイロソームの免疫原性に対する55℃での熱処理の効果 予備実験で、マウスは20分間熱処理されたウイロソー
ムまたはコアあるいはオブアルブミンを含むウイロソー
ムを鼻腔内に接種された。これらの熱処理されたウイロ
ソームは非熱処理のウイロソームを接種されたマウスと
同様あるいはそれ以上の血清ELISAまたは中和力価を促
進した（図１から５）。図４はウイルスコアを含むUV不
活化および熱処理されたウイロソームがUV不活化または
酸処理されたウイロソームよりもかなり初期の応答を促
進することを示している。さらに、個々の動物の応答が
試験された場合、動物群内の変動は殆どなかった（図
７）。中和力価はより大きな変動を示したが、ELISAの
力価とは平行であった。これらのウイロソームが４℃で
保存されていたことは注目すべきことで、そのためにニ
ューラミニダーゼ活性の多くが失われた可能性がある。
マウスは50％グリセロール中で、−20℃で保存された
新鮮なウイロソームで免疫された。ウイロソームが128
分までの熱処理をされた場合、免疫原性に劇的な増加が
観察された（図10Aおよび図11、表１）。中和抗体のレ
ベルは熱処理の時間を増加するにつれてより劇的な増加
を示した（図10Bおよび11）。非熱処理のウイロソーム
で免疫された動物は中和抗体が検出できないレベルで、
これは非熱処理のウイロソームを用いた前の実験で観察
された高い応答は４℃での保存中のニューラミニダーゼ
活性の部分的な不活化のためであることを示唆してい
る。さらに、個々のマウスの血清を解析した場合、ELIS
Aおよび中和抗体力価の著しい増加が、時間を増加した
熱処理をしたウイロソームを接種されたマウスの血清で
観察された（表２、図12）。
鼻腔内に与えられたウイロソームの免疫原性に対するニ
ューラミニダーゼの特異的不活化の効果 我々はウイロソームの熱処理で観察された免疫原性の
増加がニューラミニダーゼ（NA）の阻害によるものであ
るかを決定するための実験を行なった。それ故、ウイロ
ソーム中のNAは特異的にニューラミン酸類似体であるDD
ANで不活化された。DDAN処理されたウイロソームは未処
理のウイロソームより大きな応答を促進し（log 力価
2.2cf 1.6）、これはニューラミニダーゼの阻害により
鼻腔内投与されたウイロソームの免疫原性が増加するこ
とを示している。
鼻腔内投与されたウイロソームの免疫原性に対するガン
グリオシドでの前処理によるウイロソーム接着の特異的
阻止の効果 鼻腔内投与されたウイロソームの免疫原性に対するウ
イロソーム接着の阻止効果を研究するために、我々は各
種のシアル酸を含むガングリオシド中でウイロソームを
前処理した。鼻腔内（i.n.）投与されたインフルエンザ
ウイロソームの免疫原性は、GM1またはGD1aがガングリ
オシドでウイロソームを前処理することにより部分的に
なくなるが、GT1bまたはガングリオシド混合液での前処
理ではなくならない（図13）。同様に、我々はウイロソ
ームが仲介する血球凝集反応がGM1およびGB1aガングリ
オシドだけにより部分的に阻害されることを見いだし
た。これらの実験はウイロソームのシアル酸受容体への
結合がその免疫原性に危急のものであることを示してい
る。
鼻腔内に与えられたウイロソームに対するマウスの応答
に対するガングリオシドで前処理されたマウスの効果 我々は各種のガングリオシドでマウスを鼻腔内で前処
理することにより、ウイロソームに対する応答に対する
呼吸系粘膜表面にウイルス受容体が増加することについ
ての効果について研究した（図13）。おそらく受容体の
密度の増加またはウイロソームのより大きな結合および
取込みを促進する粘膜表面のより高い親和性をもつ受容
体に置き換わったために、GD1a、GT1bまたはガングリオ
シド混合物ではなく、GM1ガングリオシドによる前処理
により応答の増加がもたらされた。
鼻腔内に与えられたウイロソームの免疫原性に対する中
和単クローン抗体前処理によるウイロソーム接着の特異
的阻止の効果 中和単クローン抗体（全体またはFab断片）とウイロ
ソームの前処理は完全に血球凝集反応を阻害した。しか
し、ウイロソームの免疫原性は抗体全体またはFab断片
でのウイロソームの前処理または未処理のウイロソーム
接種２時間後のFab断片のi.n.接種により影響されなか
った。この結果は驚くべきことで、いくつかの中和抗体
はウイルスの結合または粘膜上皮への進入ではなく、そ
の後の出来事（例えば、第二のアンコーティング）を阻
害しないことを示している。抗体処理したウイルスまた
はウイロソームの運命を研究することは、気管における
体液免疫の機構についての見識を提供する。さらに、ヒ
トの鼻腔内予防接種に関して、部分的な中和抗体の存在
が鼻腔内投与されたウイロソームの免疫原性を減少させ
ないならば、励みになるものである。
ウイロソームの免疫原性に対するウイロソームと共に鼻
腔内にコレラ毒のＢ−サブユニット（CT−Ｂ）を投与し
た場合の効果 我々はCTBが鼻腔内に投与されたウイロソームに対し
ての応答を促進するかを調べた。図13はCTBが与えられ
た場合、ウイロソームに対する応答に劇的な増加（10
倍）があったことを示している。
鼻腔内投与されたウイロソームの投与量に対する応答の
研究 我々は鼻腔内投与されたウイロソームの投与量の範囲
に対する応答について研究した。これらのウイロソーム
は熱処理されず、新鮮であったので、抗体の応答は比較
的低い。明かな投与量に対する応答の効果は最小免疫原
投与量である１μｇで観察された（図14）。我々はさら
により免疫原性をもつと予想される熱処理されたウイロ
ソームを用いてこの実験を繰り返した。
感染に対しての防御 ウイルスまたはウイロソームの鼻腔内免疫を受けた全
ての動物は生ウイルスを感染され、２日後に肺が摘出さ
れた。予備感染した肺の力価は、酸処理されていないウ
イルスまたはウイロソームで免疫された動物は完全に感
染から防御されたことを示している。
フロントページの続き (56)参考文献 ＨＯＳＡＫＡ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，ＨＥ ＭＯＬＹＳＩＳ ＡＮＤ ＦＵＳＩＯＮ ＢＹ ＩＮＦＬＵＥＮＺＡ ＶＩＲＵ ＳＥＳ ＷＩＴＨ ＨＥＡＴ−ＩＮＡＣ ＴＩＶＡＴＥＤ ＮＥＵＲＡＭＩＮＩＤ ＡＳＥ ＡＣＴＩＶＩＴＹ，ＢＩＫＥＮ ＪＯＵＲＮＡＬ，1982年，Ｖｏｌ. 25，ｐ．51−62 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 9/00 A61K 47/00 A61K 39/00 A61P 31/00

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒトまたは動物の粘膜細胞表面に結合する
    ことができ、リポソームに融合性を賦与するポリペプチ
    ドがその表面に存在するリポソームであって、実質的に
    活性ニューラミニダーゼ、ウイルスゲノム及び内部ウイ
    ルスタンパク質をもたないリポソーム。
  2. 【請求項２】ポリペプチドがミキソウイルスのヘマグル
    チニンである請求項１に記載のリポソーム。
  3. 【請求項３】ミキソウイルスがインフルエンザ、おたふ
    くかぜ、または麻疹ウイルスである請求項２に記載のリ
    ポソーム。
  4. 【請求項４】ポリペプチドが細菌の接着ポリペプチドで
    ある請求項１に記載のリポソーム。
  5. 【請求項５】生理学的に活性のある物質をカプセルで被
    った請求項１〜４のいずれかに記載のリポソーム。
  6. 【請求項６】請求項５に記載のリポソームであって、物
    質がペプチド、タンパク質またはアジュバントであるリ
    ポソーム。
  7. 【請求項７】請求項２又は３に記載のリポソームの調製
    方法であって、（ａ）ミキソウイルスを破壊し、ウイル
    スゲノムおよび内部ウイルスタンパク質（単数又は複
    数）を除去すること、（ｂ）残留物質存在下でリポソー
    ムを形成すること、及び（ｃ）このように形成されたリ
    ポソームに存在するニューラミニダーゼを不活化するこ
    とを含む上記方法。
  8. 【請求項８】請求項７に記載の方法であって、ニューラ
    ミニダーゼが熱またはニューラミニダーゼ阻害剤とのイ
    ンキュベーションにより不活化される方法。
  9. 【請求項９】請求項８に記載の方法であって、不活化が
    50から60℃の温度の加熱、または2,3−デヒドロ−２−
    デオキシ−Ｎ−アセチルニューラミン酸とのインキュベ
    ーションにより行なわれる方法。
  10. 【請求項１０】薬学的に許容可能な担体または希釈剤と
    ともに、請求項１から６のいずれかに記載のリポソーム
    を含む薬剤組成物。
  11. 【請求項１１】鼻腔内投与に適した形態の請求項10に記
    載の組成物。
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ＨＯＳＡＫＡ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，ＨＥＭＯＬＹＳＩＳ ＡＮＤ ＦＵＳＩＯＮ ＢＹ ＩＮＦＬＵＥＮＺＡ ＶＩＲＵＳＥＳ ＷＩＴＨ ＨＥＡＴ−ＩＮＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＮＥＵＲＡＭＩＮＩＤＡＳＥ ＡＣＴＩＶＩＴＹ，ＢＩＫＥＮ ＪＯＵＲＮＡＬ，１９８２年，Ｖｏｌ．２５，ｐ．５１−６２

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