KR0173364B1 - 서로 다른 기원의 펩타이드 항원이 연결된 폴리펩타이드를 함유하는 리포좀 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기원이 서로 다른 CTL(cytotoxic T lymphocytes) 유도펩타이드 항원을 연결체(linker)없이 연속적으로 연결한 폴리펩타이드를 함유한 pH에 민감한 리포좀에 관한 것이다. 본 발명의 리포좀은 펩타이드가 유래된 바이러스 또는 세균 각각에 대하여 체액성 면역 및 세포성 면역을 동시에 유도하므로, 한 번의 면역으로 여러 가지 병원성 바이러스 관련 질환 및 세균성 질환을 예방 및 치료할 수 있는 매우 효과적인 백신으로 이용될 수 있다.

Description

서로 다른 기원의 펩타이드 항원이 연결된 폴리펩타이드를 함유하는 리포좀

제1a도는 폴리펩타이드 항원을 18umole 함유한 리포좀으로 면역된 마우스에서 분리한 세포독성 T 임파세포의 표적세포 살해능을 나타내는 그래프이다.

제1b도는 폴리펩타이드 항원을 36umole 함유한 리포좀으로 면역된 마우스에서 분리한 세포독성 T 임파세포의 표적세포 살해능을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 다른 기원의 펩타이드 항원이 서로 연결된 폴리펩타이드 항원을 함유하는 리포좀 제제(liposome formulation)에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 상이한 바이러스 또는 세균에서 기인한 항원 가운데 세포성 면역을 유도할 수 있는 각 펩타이드를 연결체(linker) 없이 연속적으로 연결한 폴리펩타이드 항원을 리포좀 제제화하여, 각각의 바이러스 또는 세균을 증화할 수 있는 항체 및 전기 각 바이러스 또는 세균에 특이적인 세포독성 T 임파세포(cytotoxic T lymphocytes, 이하, 'CTL'이라 함)의 생성을 동시에 유도케함으로써, 한 번의 면역으로 여러 가지 질환의 예방 및 치료에 응용 할 수 있는 리포좀 제제에 관한 것이다.

바이러스성 질환은 끊임없이 인간을 괴롭혀 왔으나, 이에 대한 획기적인 치료법은 오늘날까지도 발견되고 있지 않다, 다만, 예방백신에 의한 보호만이 가능할 따름이나, 예방백신이 개발되어 있는 경우에도 감염 환자는 계속 발생하고 있고, 일단 발생한 바이러스 질환에 관한 근원적 치료를 할 수 있는 약물은 개발되어 있지 않다. 심지어, 백신이 개발되어 있지 않은 약물은 바이러스 질환, 예를들면, 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)나 C형 간염 바이러스(hepatitis C virus, HCV) 질환의 경우에는 감염 환자가 날로 증가하고 있으며, 이들 질환을 치료할 수 있는 백신 개발에 박차를 가하고 있으나 백신이 곧 개발되리라는 확실한 전망은 없다.

바이러스성 질환의 경우, 체내의 항체에 의해서 그 방어능력이 나타나지 않으므로 CTL을 활성화시키는 세포성 면역에 관한 연구가 1980년말부터 활발히 이루어져 왔으며 그 연구결과에 힘입어, 중화항체를 생성하는 체액성 면역보다는 바이러스에 감염된 세포를 직접 파괴할 수 있는 능력을 지닌 CTL을 유도하는 세포성 면역에 중점을 두어 바이러스성 질환을 예방 및 치료하고자 노력이 있어 왔다.

체액성 면역(humoral immunity)이란 혈청내에 존재하는 항체에 의해 이루어지는데, 그 항체가 외부 물질(항원)과 결합함으로써 그것을 제거하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 면역체계는 숙주세포밖에 있는 박테리아, 단백질이나 탄수화물과 같은 외부 물질에 대해 효과적으로 작용하나, 바이러스의 감염의 경우 바이러스가 숙주세포 내에 국한되어 활동하므로 이에 대해서는 효과적으로 작용하지 못한다.

세포성 면역(cellular immunity)이란 임파계에 속하는 몇 종류의 세포에 의해 이루어지는데, 이러한 세포는 박테리아나 바이러스에 의해 감염된 세포와 조직을 직접 파괴하는 기능을 가지고 있다. 따라서, 세포성 면역은 박테리아나 바이러스의 세포내 감염 또는 암세포 등에 효과적으로 그 기능을 발휘한다. 이러한 세포성 면역반응은 특정 펩타이드를 면역하여 유도할 수 있는데, 이를 'CTl 유도 펩타이드'라고 한다. 일반적으로, 바이러스 단백질에는 적어도 한 개 이상의 CTL 유도 펩타이드를 함유하고 있으며, 이들 펩타이드는 8 내지 10개의 아미노산으로 이루어져 있다.

본 발명에서는 상이한 바이러스 또는 세균에서 유래한 CTL 유도 펩타이드를 연결체 없이 연속적으로 연결되도록 합성하고, 그를 리포좀 제제화하여, 각각의 바이러스 또는 세균에 대한 체액성 면역 및 세포성 면역을 동시에 유도함으로써, 한 번의 면역으로 여러 가지 바이러스성 또는 세균성 질환의 예방 및 치료에 이용하고자 하였다.

일반적으로, 인지질(phospholipid)를 수중에 분산시키면 인지질의 친수성 머리부분(polar head group)은 물쪽으로 향하고, 소수성 꼬리부분(hydrophobic acyl chain)은 꼬리끼리 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의하여 화합하여, 이중분자막(bilayer)의 구형의 페쇄소포체를 형성하는데 이를 '리포좀(liposome)'이라 한다. 이러한 리포좀은 생체막의 모델로 이용되어 왔을 뿐만 아니라, 약물의 전달매체로도 널리 이용되어 왔다(참조: Lee, J.W and Kim H., Arch. Biochem. Biophys., 297:354(1992): Hahn, K.H. and Kim, H., J. Biochem., 110:635(1991): Yun, C.H. and Kim, H., J. Biochem., 105:406(1989); Kim, J. and Kim, H., Bichemistry, 25:7867(1986); Kim, J. and Kim, H., Korean Biochem. J., 18:403(1985)).

최근에는 리포좀을 면역학 분야에도 이용하여, 리포좀을 백신의 운반체(carrier)또는 면역보조제(adjuvant)로의 사용이 집중적으로 연구되어 지고 있다.(참조: Rooijen, N.V., Vaccine, 11:1170(1993)). 일반적으로, 리포좀을 정맥주사하면 혈액내에 다량으로 존재하는 대식세포(macrophage, MO)에 의해 쉽게 포획된다. MO는 항원의 면역적 프로세싱(processing)에 매우 중요할 뿐만 아니라, 리포좀 항원의 프로세싱에도 매우 중요한 역할을 한다.

또한, 최근 pH에 민감한 리포좀(pH-sensitive liposome)을 이용하여 바이러스에 선택적인 CTL 생성을 유도하는 방법(참조 : Readdy, R. et al., J. Immunol. Methods, 141:157(1991); Zhou, F. et al., J. Immunol. Methods, 145:143(1991); Nair, S. et al., J. Exp. Med., 175:609(1992); Harding, C.V. et al., J. Immunol., 147:2860(1991); Zhou, F. and Huang, L., Vaccine, 11:1139(1993))이 개발되어, 치료용 백신의 운반체 또는 면역보조제로 널리 이용되고 있다. 이와 관련하여, 본 발명자들도 항암약물의 선택적인 전달이 가능한 pH에 민감한 리포좀의 제조방법(참조 : Choi, M.J. et J. Biochem., 112:694(1992))과 그 조성에 대해서 특허를 출원한 바 있다.(참조 : 대한민국 특허출원 제 93-18389호 및 제93-18390호).

또한, 본 발명의 발명자들은 상기와 같이 특허출원되어 공지된 pH에 민감한 리포좀의 인지질 조성으로 각종 바이러스의 펩타이드 항원을 포획한 리포좀을 제조하여, 펩타이드 항원에 대한 체액성 면역 및 세포성 면역을 동시에 유도함을 확인하고, 그를 특허출원한 바 있다.(참조: 동일자 출원하는 B형 간염 바이러스의 펩타이드 항원을 함유하는 리포좀, C형 간염 바이러스의 펩타이드 항원을 함유하는 리포좀, 한탄 바이러스의 펩타이드 항원을 함유하는 리포좀, 인간면역결핍 바이러스의 펩타이드 혼합항원을 함유하는 리포좀).

이와 관련하여, 본 발명자들은 한 번의 면역으로 여러 가지 바이러스성 또는 세균성 질환을 예방 및 치료할 수 있는 경제적인 방법에 관하여 연구노력한 결과, 상이한 바이러스 또는 세균에서 유래한 CTL 유도 펩타이드를 연결체 없이 연속적으로 연결되도록 합성하고 그를 리포좀 제제화하면, 그 리포좀이 각각 바이러스 또는 세균의 펩타이드 항원에 대한 중화항체 및 CTL 유도를 동시에 야기시킴을 확인하였고, 또한, 각 바이러스 또는 세균 유래의 CTL 유도 펩타이드를 한꺼번에 합한 혼합항원보다는 다른 기원의 CTL 유도 펩타이드 항원이 서로 연결된 폴리펩타이드 항원을 사용하는 것이 펩타이드 합성시 등에 있어서 비용을 절감시킬 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 서로 다른 바이러스 또는 세균에서 기인한 CTL 유도 펩타이드를 연결체 없이 연속적으로 합성한 폴리펩타이드 항원을 포함하며, 각 바이러스 또는 세균에 대한 체액성 면역 및 세포성 면역을 동시에 유도하는 리포좀을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

바이러스 또는 세균 유래의 단백질 또는 펩타이드 항원을 함유한 pH에 민감한 리포좀을 제조하기 위하여, 포스파티딜에탄올아민-β-올레일-γ-팔미토일(phosphatidylethanolamine-β-oleoyl-γ-palmitoyl: POPE)과 콜레스테롤 헤미석시네이트(cholesterol hemisuccinate : CHOH)를 몰 비율로 6:4 내지 8:2, 가장 바람직하게는 7:3으로 혼합한 인지질에 1몰%의 단일 인산화 지질 A(monophosphoryl lipid A, MPL)를 첨가하여 형성된 혼합 인지질이 얇은 막을 형성하도록 한 다음, 포획시킬 단백질 또는 펩타이드 용액을 첨가하여, pH에 민감한 리포좀을 제조하였다. 이때, 단백질 또는 펩타이드 항원을 함유하는 리포좀은 단백질 또는 펩타이드와 인지질을 몰비율로 1:5 내지 1:25, 가장 바람직하게는 1:20이 되도록 혼합하여 제조한 것이다.

전기에서 제조된 바이러스 또는 세균 유래의 단일 펩타이드(예를 들면, HIV의 당단백질(gp120)에서 유래한 아미노산 서열 304-329번의 펩타이드)나 다른 기원의 펩타이드 항원이 서로 연결된 폴리펩타이드(예를 들면, LCMV(lymphocytic choriomeningitis virus)의 핵 단백질에서 기인한 아미노산 서열 119-127번의 펩타이드, 인풀루엔자 바이러스의 핵 단백질에서 기인한 아미노선 서열 147-155번의 펩타이드, HIV의 당단백질(gp120)에서 유래한 아미노산 서열 304-329번의 펩타이드(T26K)가 순서적으로 연결된 폴리펩타이드)를 함유한 pH에 민감한 리포좀으로 면역된 마우스의 체액성 면역을 확인하기 위하여, 마우스의 혈청을 분리하고 항체생성능 및 항체역가를 측정하였다. 그 결과, T26K 펩타이드를 면역한 마우스에서는 100%의 면역효과 및 4,000 정도의 항체역가를 나타내는 반면, 폴리텝타이드 항원을 면역한 마우스에서는 100%의 면역효과 및 8,000정도의 항체역가를 나타내었다. 한편, 본 발명에 의해 제조된 pH에 민감한 리포좀 백신은 체액성 면역을 유도할 수 있는 단일 인산화 지질 A(monphosphoyl lipid A), quil A, 뮤라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide) 등의 면역보조제(adjuvant)를 추가로 함유하여 사용할 수 있을 것이다.

전기의 폴리펩타이드 항원을 함유한 pH에 민감한 리포좀으로 면역된 마우스의 세포성 면역을 확인하기 위하여, 폴리펩타이드 항원의 근육주사로 면역된 마우스의 비장에서 분리한 T 임파세포가 방사능 원소로 표지된 표적세포(target cell)를 인지하여 살해(lysis)하는 능력을 측정한 결과, 각 바이러스에 특이적인 CTL 생성을 유도하며, 폴리펩타이드의 투여용량과 비례하여 살해농도 증가함을 확인하였다.

본 발명의 리포좀 백신은 다른 바이러스 또는 세균 유래의 CTL 유도 펩타이드 항원이 서로 연결된 폴리펩타이드를 함유하고 있고, 각 바이러스 또는 세균의 펩타이드 항원에 대한 중화항체 및 특이적인 CTL 생성을 동시에 야기시키므로, 한 번의 면역으로 여러 가지 질환을 예방 및 치료할 수 있는 매우 효과적인 백신으로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

펩타이드의 합성

본 발명에서 사용한 펩타이드는 주조직 적합분자(major histocompatibility complex, MHC) 제1군과 결합할 수 있는 펩타이드로서, 이미 세포독성 T 임파세포(CTL)를 유도한다고 보고된 바 있는 것을 사용하였다. 즉, 인풀루엔자 바이러스의 핵 단백질에서 기인한 아미노산 서열 147-155번의 펩타이드, LCMV(lymphocytic choriomeningitis virus)의 핵 단백질에서 기인한 아미노산 서열 119-127번의 펩타이드, 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)의 당단백질(gp120)에서 유래한 아미노산 서열 304-329번의 펩타이드를 각각 합성하였고, 또한 전기 세가지 펩타이드를 LCMV, 인풀루엔자, HIV 순으로 연결체 없이 연결된 폴리펩타이드(44mer)를 합성하였다(참조 : 표 1). 이때, 펩타이드들은 자동 펩타이드 합성기(automatic peptide synthesizer, ABI431, USA)를 사용하여 합성하였으며, 합성된 펩타이드는 고속액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatograpy, HPLC)를 사용하여 정제한 다음, 동결건조시켜 분말상태로 제조하여 하기의 실시예에 사용하였다.

[실시예 2]

펩타이드 항원을 함유한 pH에 민감한 리포좀의 제조

POPE/CHOH(7:3몰 비율)으로 된 인지질에 1몰% 단일 인산화 지질A를 함유한 혼합 인지질을 유리병(glass vial)에 넣어 유기용매에 용해시킨 후, 질소가스를 불어 넣어 유리병 내에 얇은 막을 형성시켰다. 그런 다음, 실시예 1에서 제조한 단일 펩타이드 또는 폴리펩타이드 항원을 용해시킨 PBS 완충용액(pH8.0)을 첨가하여 충분히 수화시킨 후, 강하게 교반하여 중첩된 다층막 리포좀(multilamellar vesicle, MLV)을 제조하고, 이를 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 소형 단층막 리포좀(small unilamellar vesicle, SUV)를 제조하였다. 이렇게하여 제조된 SUV를 상온에서 2 내지 12시간 방치한 다음, 액체질소로 급격히 냉동시키고 다시 상온에서 천천히 해동시키는 과정을 3내지 4회 반복하여 펩타이들르 함유한 리포좀을 제조하였다. 펩타이드 항원을 함유한 리포좀의 경우, 제조된 리포좀이 인지질과 펩타이드의 몰비율을 1:20으로 되도록 혼합한 것이며, 리포좀내에 들어가지 않은 펩타이드 항원은 세파덱스 G-50 칼럼(1×20cm)을 통과시켜 제거하고, 리포좀 용액만을 모아서 하기의 실시예를 이용하였다.

[실시예 3]

항체의 역가 측정

상기 실시예 2에서 제조한 리포좀으로 마우스를 면역시켰다. 즉, 5 내지 6주령의 마우스(Balb/C mouse)에 근육주사 방식으로 50내지 100ul의 리포좀 용액(펩타이드 18 umole 내지 36 umole)을 주사하여 면역하였다. 1주 후 같은 리포좀으로 처음 면역한 양의 절반을 추가접종(boosting)하여 면역을 완료하였다.

이렇게 면역된 마우스로부터 혈청을 얻어서 간접면역표시 흡착 분석법으로 항체형성능과 항체역가를 확인하였다. 즉, 탄산염(carbonate) 완충용액(pH 9.6)에 폴리펩타이드 2.5mg/ml로 녹이고 96 공(well) 플레이트에 각 공당 100ul씩 분주하여 37℃에서 2시간동안 방치하였다. 0.02% 트윈 20(Tween 20)을 함유한 인산 완충용액(이하, '세척용액'이라 함)으로 3번 세척한 다음, 1% 우혈청알부민(BSA) 용액 400ul씩 넣고 37℃에서 1 시간 방치하였다. 세척용액으로 3번 세척한 후, T26K 펩타이드를 함유한 리포좀으로 면역한 생쥐의 혈청을 얻어서 32 배부터 두배 계대 희석(2 fold dilution)하여 100 ul씩 넣고 37℃에서 45분간 반응시켰다. 상기 세척용액으로 3번 세척한 후, 호스라디쉬 퍼록시다제(horse raddish peroxidase : HRPO)가 표지된 anti-mouse IgG를 500배 희석하여 100ul씩 넣고 37℃에서 45분간 반응시켰다. 다시 한 번 세척용액으로 세척한 후, ABTS(2.2'-azinobis(3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid)와 과산화수소 기질 용액을 1:1로 섞어 100ul씩 넣고, 실온에서 15분간 방치 후 405nm에서 흡광도 측정으로 항체의 역가를 결정하였다.

그 결과, T26K와 폴리펩타이드(44mer) 항원을 면역한 마우스에서는 100% 면역효과를 나타내었고, 그 평균역가가 4,000 내지 8,000 정도의 높은 값을 나타내었다.(참조 : 표 2)

[실시예 4]

펩타이드와 CTL 간의 인지도 측정

전기 실시예 2에서 제조한 pH에 민감한 리포좀으로 면역된 마우스의 세포성 면역을 확인하기 위하여, 펩타이드 항원으로 면역된 마우스로부터 분리한 T 임파세포가 Cr 로 표지된 표적세포를 인지하여 살해하는 능력을 측정하였다.

폴리펩타이드를 함유한 pH에 민감한 리포좀으로 면역하여 추가접종 2주후, 마우스(Balb/C mouse)의 비장을 절취하여 60mm 철망에 갈아서 단일세포로 분산시켰다. 분산시킨 세포들을 15ml 튜브에 수거하고 원심분리하여 그 상동액은 버리고, 침전물에 0.83% 염화암모늄 용액을 2ml 처리하여 37℃에서 2분간 정치하여 적혈구를 용해시켰으며, 용해된 적혈구는 원심 분리하여 그 상동액을 버림으로써 제거하였으며, 그 침전물에 남아있는 잔존의 암모늄을 제거하기 위해서 RPMI 세포배양 배지로 3회 세척하였다. T 임파세포가 1ml당 5×10 이 되게하여 24공 플레이트에 3그룹으로 나누어 분주한 다음, INE NP, LCMV NP, T26K 펩타이드 항원을 2 uM이 되도록 첨가하고, 7일간 37℃에서 5%의 이산화탄소를 함유하고 있는 배양기(COincubator)에서 T 임파세포를 배양하여 효과세포(effector cell)로 이용하였다. 한편, 표적세포로는 Balb/C 마우스와 같은 주조직 적합분자 제1군(class I)을 가지는 p815 세포를 표적세포로 이용하였다.

전기의 표적세포에 INF NP, LCMV, NP, T26K 펩타이드를 100uM씩 넣고 37℃에서 16시간 반응시킨 후 RPMI 세포배양 배지로 2회 세척한 다음, 방사능을 가진 소디움크로메이트(Cr )를 첨가하고 37℃의 CO배양기에서 2시간동안 반응시켰다. 반응이 끝나면, RPMI 세포배양 배지로 충분히 세척하여 미반응한 소디움크로메이트를 제저하고, 인산완충용액으로 세척한 효과세포와 일정한 비율로 혼합하여 37℃의 CO배양기에서 4시간동안 반응시켰다. 반응한 배양액을 수거하여 감마선의 세기를 측정함으로써, 효과세포가 표적세포를 살해하는 능력을 측정할 수 있었다(참조 : 제1a도 및 1b도).

제1a도 및 제1b도는 폴리펩타이드를 18umole 및 36umole 함유한 리포좀으로 각각 면역된 마우스의 비장에서 분리한 효과세포가 표적세포를 인지하여 살해하는 정도를 나타낸다. 제1a도 및 제1b도에서 보듯이, 폴리펩타이드 항원의 근육주사로 면역된 마우스의 비장에서 분리한 효과세포가 각 표적세포를 살해하는데, 폴리펩타이드의 투여용량과 비례하여 살해농도 증가함을 알 수 있었다. 아울러, pH에 민감한 리포좀을 이용하여 CTL 생성을 유도하는 펩타이드 항원을 면역시켰을 때, 각 바이러스에 특이적인 CTL을 유도하여 세포성 면역을 야기함을 확인하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 pH에 민감한 리포좀을 다른 바이러스 또는 세균 유래의 CTL 유도 펩타이드가 연속적으로 연결된 폴리펩타이드 항원의 운반체로 사용함으로써, 각각의 바이러스 또는 세균에 대한 체액성 면역 및 세포성 면역을 동시에 유도할 수 있는 리포좀을 제공한다. 이러한 리포좀은 한 번의 면역으로 여러 가지 병원성 바이러스 관련 질환 및 세균성 질환을 예방 및 치료할 수 있는 매우 효과적인 백신으로 이용될 수 있다.

Claims (1)

1. (i) 포스파티딜에탄올아민-β-올레일-γ-팔미토일(phosphatidyl-ethanolamine-β-oleoyl-γ-palmitoyl)과 콜레스테롤 헤미석시네이트(cholesterol hemisu ccinate)를 6:4 내지 8:2의 몰비율로 혼합한 인지질; 및, (ii) 전기 인지질에 대하여, 중화항체 및 세포독성 T 임파구의 생성을 유도하는 폴리펩타이드 항원의 함유량이 5:1 내지 25:1의 몰비율이 되도록, LCMV(lymphocytic chriomeningitis virus)의 핵 단백질에서 기인한 아미노산 서열 119-127번의 펩타이드, 인풀루엔자 바이러스의 핵 단백질에서 기인한 아미노산 서열 147-155번의 펩타이드 및 인간면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)의 당단백질(gp120)에서 유래한 연결된 하기와 같은 서열의 폴리펩타이드 항원을 함유하는 pH에 민감한 리포좀: PQASGVYMGTYQ RTRALVTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGK 상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC -IUB의 명명법에 따라 기재하였다.