SK287670B6 - Imunogénna lipozómová kompozícia a spôsob jej výroby - Google Patents

Abstract

Imunogénna lipozómová kompozícia obsahuje lipidy vytvárajúce vezikuly a antigénny proteínový konštrukt, ktorým je vo vode rozpustný fúzny produkt obsahujúci jeden alebo viac antigénnych determinantov a hydrofóbnu doménu, pričom hydrofóbna doména je spojená s membránou lipozómovej kompozície. Tiež je opísaný spôsob jej výroby.

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka imunogénnej lipozómovej kompozície obsahujúcej lipidy vytvárajúce vezikuly a antigénny konštrukt obsahujúci jeden alebo viac antigénnych determinantov a hydrofóbnu doménu.

Doterajší stav techniky

Použitie vakcín historicky poskytlo bezpečný a efektívny spôsob ochrany väčšiny obyvateľstva proti širokej škále infekčných ochorení. Imunizácia proti vírusovým a iným mikróbnym organizmom je vo všeobecnosti bezpečná a efektívna a bola významná pri mnohých pokrokoch pri predĺžení života v rámci výskumov na jednotlivcoch v rozvinutých krajinách. Vyskytlo sa však množstvo nepriaznivých vedľajších účinkov, v závislosti od povahy vakcíny a špecifického imunogénu. Neprimeraná inaktivácia intaktných vírusov viedla v minulosti k nežiaducej infekcii namiesto ochrany nasledovnou vakcináciou (Tigertt, 1959, Military Med. 124:342). Niekedy môže imunizácia intaktnými mikroorganizmami, ako je influenza, zrážať rozvoj autoimunitnych ochorení vedených proti bežným tkanivám, ako je Guillain Barreov syndróm (Langmuir et al., 1984, J. Epidemiol. 119:841). Popri samotných činidlách môže prítomnosť substancií v prostredí buniek alebo komplexu umožniť indukciu prudkých alergických reakcií cudzích proteínov (Yamane and Uemura, 1988, Epidem, Inf. 100:291). Keďže postup efektívnej vakcinácie často vyžaduje viacnásobnú imunizáciu, tieto nepriaznivé javy môžu redukovať efektívnosť vakcíny a môžu redukovať všeobecné akceptovanie vakcinačného postupu. Moderné molekulové biologické techniky boli nedávno testované na pokuse pre uskutočnenie zlepšenej bezpečnosti a efektívnosti nových vakcinačných prípravkov. Potenciálne stratégie aktuálne pri skúmaní obsahujú; vakcíny na báze techník rekombinantných DNA (Conry et al., 1994, Cancer Res. 54:1164; Hu et al., 1988, J. Virol. 62:176), vytvorenie jednoduchých syntetických peptidov ako antigénov (Nardelli et al., 1992, Vaccines 8:1405; Watari et al., 1987, J. Exp. Med. 165:459) a priame injektovanie genetického materiálu do tkanív pre stimulovanie obrannej odpovede (Ulmer et al., 1993, Science 259:1745). Zvlášť použitie antigénov jednoduchých peptidov na vyvolanie špecifických imunizačných odpovedí bolo zameraním mnohých štúdií. Táto stratégia je atraktívna, pretože má potenciál pre uskutočnenie imunologickej špecifickosti, tesnejšie riadenie výrobných procesov a elimináciu väčšiny sekundárnych zdrojov materiálov alebo kontaminujúcich látok súvisiacich s produkciou imunogénu.

Použitie čistených proteínov alebo peptidových fragmentov pre vakcináciu však závisí od dodania materiálu na miesto imunizácie efektívnym nosičom antigénu. Potenciálne jedným z najbezpečnejších nosičov sú vakcínové komplexy na báze lipidov/lipozómov. Lipozómy sú po dlhý čas zavedené ako komerčne realizovateľné technológie, pretože môžu redukovať toxicity liečiv, predlžovať cirkuláciu v krvnom prietoku a meniť biodistribúciu a farmakokinetiky molekúl liečiv (Fujii, 1996; Vesicles, ed. M. Rosoff, Marcel, Dekker, New York NY str. 491). Ak sú podávané lipozómy in vivo, cirkulujú v krvi a odstraňujú monocyty/makrofágy fágocytového systému, najmä v pečeni, slezine, lymfatických uzlinách a pľúcnom tkanive (Claasen, 1996; Vesicles, ed. M. Rosoff, Marcel, Dekker, New York NY, str. 649). Schopnosť lipozómov usmerniť model antigénovej distribúcie naznačuje, že lipozomálny imunogén bude maximálne vystavený imunitného systému. Doteraz bolo testovaných niekoľko systémov na báze lipidov, vrátane peptidov konjugovaných s lipidmi (Nardelli et al., 1992, Vaccines 8:1405; Watari et al., 1987, J. Exp. Med. 165:459), rekonštrukty celých proteínovýh podjednotiek v prítomnosti lipidov (Morein and Šimon, 1985, Vaccines 4:166; Gregoriadis, 1995, Tibtech 13:527) a väzobné oblasti proteínov s preformovanými lipozómami (Therien and Shahum, 1989, Immunol. Lett. 22:253; Alving et al., 1985, Vaccines 4:166). Ak keď sa tieto stratégie ukázali ako imunologický aktívne, technické problémy spojené s veľkým rozsahom produkcie proteínov a ich lipidových nosičov, ako aj tlaky na náklady, ich robia menej atraktívnymi pre komerčné technológie. Teda zlepšený systém alebo metóda pre prípravu proteínových antigénov vo vývoji vakcín vyžaduje, aby mali výhodu, ktorá je potenciálne ponúkaná lipozómami.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka imunogénnej lipozómovej kompozície, obsahujúca lipidy vytvárajúce vezikuly; a antigénny proteínový konštrukt, ktorým je vo vode rozpustný fuzny produkt obsahujúci jeden alebo viac antigénnych determinantov a hydrofóbnu doménu, pričom hydrofóbna doména je spojená s membránou lipozómovej kompozície.

Prednostne je hydrofóbnou doménou peptid a v súlade s prednostným uskutočnením obsahuje od asi 15 do asi 500 aminokyselinových zvyškov, prednostnejšie menej než asi 300, a najprednostnejšie menej než asi 50 zvyškov, kde aspoň jedna alebo viac aminokyselín je vybraných zo skupiny skladajúcej sa z Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, íle, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr a Val.

Podľa jedného uskutočnenia tohto vynálezu imunogénna lipozómová kompozícia ďalej obsahuje jeden alebo viac pomocných látok. Príklady vhodných pomocných látok zahŕňajú lipofilné molekuly, ako sú Lipid A a iné lipopolysacharidy, Quil A, QS21, MF59, P₃CSS, MTP-PE, ako aj vo vode rozpustné molekuly, vrátane cytokínov, ako je IL-2, IL-4, IL-12, interferóny a podobne. Iné príklady cytokínov sú uvedené v tabuľke 1.

Podľa ďalšieho uskutočnenia tohto vynálezu antigénny konštrukt ďalej obsahuje väzobná oblasť spájajúcu antigénny determinant (determinanty) s hydrofóbnou doménou. V prednostnom uskutočnení je väzobnou oblasťou peptid obsahujúci od 1 do asi 200 aminokyselinových zvyškov. Prednostne sú aminokyselinovými zvyškami prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny, ako je Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, íle, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr a/alebo Val.

Predložený vynález ďalej uskutočňuje spôsob vyvolania imunogénnej odpovede u hostiteľského živočícha, zahrnujúci podávanie imunogénne efektívneho množstva opísanej lipozómovej kompozície. Hoci hostiteľom môže byť akékoľvek zviera vrátane hydiny, prednostne je hostiteľským živočíchom cicavec, a prednostnej šie človek. V určitých prednostných uskutočneniach imunogénna lipozómová kompozícia ďalej obsahuje jeden alebo viac vhodných pomocných látok.

Predložený vynález ďalej opisuje DNA kazetu pre včlenenie do vektora obsahujúceho sekvencie, ktorá kóduje imunogénny fúzny proteín, kde fuzny proteín obsahuje hydrofóbnu proteínovú doménu a jeden alebo viac antigénnych determinantov.

Predložený vynález tiež uskutočňuje spôsob vytvorenia imunogénnej lipozómovej kompozície obsahujúci: expresiu génu, ktorý kóduje fuzny proteín obsahujúci antigénny determinant a hydrofóbnu doménu; rozpustenie lipidov a fúzneho proteínu vo vhodnom organickom rozpúšťadle alebo zmesi organických rozpúšťadiel; vytvorenie lipidového filmu odparením organického rozpúšťadla; hydratáciu lipidového filmu a disperziu hydratovaného lipidového filmu na vytvorenie imunogénnej lipozómovej kompozície.

Predložený vynález ďalej uskutočňuje spôsob vytvorenia imunogénnej lipozómovej kompozície obsahujúci: expresiu génu, ktorý kóduje fuzny proteín obsahujúci antigénny determinant a hydrofóbnu doménu; rozpustenie fuzneho proteínu vo vodnom pufri; hydratáciu buď lipidových práškov, alebo lipidového filmu pufrom obsahujúcim fúzny proteí; a disperziu lipidových práškov alebo filmov na vytvorenie imunogénnej lipozómovej kompozície.

V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu výroby imunogénnej lipozómovej kompozície, ktorý obsahuje:

expresiu génu, ktorý kóduje vo vode rozpustný fúzny proteín obsahujúci antigénny determinant a hydrofóbnu doménu; a

a) rozpustenie lipidov vytvárajúcich vezikulu a fuzneho proteínu vo vhodnom organickom rozpúšťadle; vytvorenie lipidového filmu alebo sprejovo sušeného prášku odparením organického rozpúšťadla; hydratovanie lipidového filmu alebo prášku; a dispergovanie hydratovaného lipidového filmu alebo prášku na vytvorenie imunogénnej lipozómovej kompozície; alebo

b) rozpustenie fúzneho proteínu vo vodnom pufri;

hydratovanie buď lipidového prášku, alebo lipidového filmu pufrom obsahujúcim fúzny proteín; a dispergovanie lipidového prášku alebo filmu na vytvorenie imunogénnej lipozómovej kompozície; alebo

c) rozpustenie fúzneho proteínu vo vodnom pufri; a pridanie fúzneho proteínu k vopred vytvoreným lipozómom na vytvorenie imunogénnej lipozómovej kompozície.

Ako tu bol použitý pojem „spojená s membránou“ znamená, že hydrofóbna doména je aspoň čiastočne vložená v lipozómovej membráne, a prednostne nie je kovalentne spojená s lipidmi vytvárajúcimi vezikulu. Hydrofóbna doména môže byť viazaná aj k mastným kyselinám lipidov „zakončením“, ktoré je samo vložené v membráne.

Predložený vynález uskutočňuje antigénny dodávací systém navrhnutý na zlepšenie efektívnosti a bezpečnosti imunizácie proti množstvu mikrobiálnych činidiel a karcinómov. Imunogén môže byť kódovaný génovou kazetou, ktorá obsahuje hydrofóbnu doménu (HD) zlúčenú so špecifickou antigénnou sekvenciou. Plazmid obsahujúci sekvencie nukleovej kyseliny kódujúci HD a antigénny epitop sa pripraví a uskutoční sa jeho expresia vo vhodnom hostiteľovi, ako je napríklad E.coli, P.pastoris, bunky hmyzu, COS-1 bunky alebo CHO bunky (Genetic Engineering News, 18:17 (1998)). Po expresii a čistení je proteín formulovaný do lipozómu. V prítomnosti membrány sa proteín spája s lipidovou dvojvrstvou na vytvorenie stabilnej štruktúry s hydrofóbnym dielom spojeným s membránou a antigénnym epitopom orientovaným k vodnému prostrediu. Plazmid môže byť zostrojený s reštrikčnými miestami v kľúčových umiestneniach tak, že môžu byť rôzne antigénne epitopy ľahko substituované, teda uskutočnením schopnosti využiť rôzne antigénne epitopy na uskutočnenie maximálnej ochrany nasledujúcej imunizáce. Jeden z jedinečných znakov tejto kazety je to, že proteínová zložka môže byť produkovaná v hostiteľských bunkách vo veľkých množstvách, ľahko čistená a potom začlenená do lipozómov. Toto poskytuje maximálnu flexibilitu pre determinovanie najvhodnejšieho epitopu, ktorý podporuje ochranu pred mikrobiálnymi činidlami alebo karcinómami, pri udržiavaní výsledného cieľa veľkej škály prípravy a komerčnej distribúcie vakcíny.

Teda predložený vynález poskytuje niekoľko výhod: (1) epitopy môžu byť ľahko zmenené pre uskutočnenie maximálnej flexibility v návrhu vakcíny; (2) viacnásobné epitopy môžu byť včlenené do molekuly nosiča; (3) veľké antigénne sekvencie (t. j. obalené proteíny alebo receptorové domény) alebo podjednotky môžu byť obsiahnuté, ak je to žiaduce, a (4) protein expresného nosiča je vo vode rozpustný a môže byť ľahko čistený použitím štandardných spôsobov prípravy proteínov. Syntéza antigénneho konštruktu ako vo vode rozpustného fúzneho produkt minimalizuje potenciálne problémy veľkovýroby spôsobené hydrofóbnou oblasťou proteínu. Teda konštrukt proteínu majúceho hydrofóbnu doménu pre včlenenie lipozómovej membrány a ešte je stále vo vode rozpustného, je hlavnou výhodou. V niektorých situáciách môže byť malé množstvo rozpúšťajúceho činidla, ako je quanidín, močovina, dodecylsulfát sodný, oktylglukozid alebo deoxycholát, použité v priebehu procesu čistenia. Predložený vynález tiež poskytuje konštrukt zahrnujúci dva alebo viac antigénov. Také konštrukty môžu byť predstavované ako:

H₂N - antigénové miesto I - HD - antigénové miesto II - COOH

Vynález tiež rozoberá použitie prirodzene odvodených alebo syntetických samostatných transmembránových špirálok alebo špirálových zväzkov (2-12). Antigénne miesta môžu byť umiestnené na konci N- alebo C-, alebo môžu byť situované medzi vytvorené slučkami medzi jednotlivými prepojeniami zväzkov.

Pojem „antigén“, ako je tu použitý, zodpovedá akejkoľvek látke (vrátane proteínu alebo proteín-polysacharidu, lipopolysacharidu, mikrobiálnej podjednotky, úplného patogénu alebo karcinómového markeru), ktorá, keď je vzdialená od hostiteľského živočícha, a po získaní prístupu k tkanivu takého živočícha, stimuluje makrofágy, antigén predstavujúce bunky a vytvorenie antigénnych špecifických protilátok, a reaguje špecificky in vivo alebo in vitro s takýmito protilátkami. Navyše, antigén stimuluje proliferáciu a/alebo aktiváciu T-lymfocytov s receptormi pri antigéne a krížové reagovanie antigénu, napr. prirodzené ničiace bunky, cytotoxické T bunky a T pomocné bunky, a môže reagovať s lymfocytmi pre iniciáciu sérií odpovedí označených bunkou sprostredkovaná imunita. V imunogénnych kompozíciách podľa predloženého vynálezu je preferované, že antigén je prítomný v množstve asi 0,1 - 20 mg/ml antigénu-HD. Prednostnejšie je antigén prítomný v množstve asi 0,5 - 5 mg/ml antigénu-HD.

„Antigénny determinant“ je taký diel antigénu alebo antigénneho konštruktu, ktorý determinuje jeho imunologickú špecifickosť. Obvykle je antigénnym determinantom alebo hapténom peptid, protein alebo polysacharid v prirodzene sa vyskytujúcich antigénoch. V umelých antigénoch to môže byť látka s nízkou molekulovou hmotnosťou, ako je derivát arzanilovej kyseliny. Antigénny determinant bude špecificky reagovať in vivo alebo in vitro s protilátkou alebo T lymfocytmi vyvolanými antigénnou formou antigénneho determinanta (napr. antigénny determinant pripojený k imunogénnej látke).

Antigénne determinanty, ktoré môžu byť použité pri vykonávaní predloženého vynálezu, môžu byť odvo-

dené, iba pre príklad, od uvedených antigénov:
Vírusové patogény Vírus	Antigén	Referencia
Bluetongue	štruktúrny	Murray and Eaton, 1996, Austral. Vet. J. 73:207
Bovine herpes (IBR) Bovine Vírus Diarrhea	E2	Franz et al., 1996 veterini medicína 41:213 Bruschke et al., 1997, vaccine 15:1940
Cytomegalovírus3	gp58	Ludeman a katz, 1994 Biologicals, 22:21 Wagner et al., 1992 J. Virol. 66:5290
Distemper (carine)	GB Polyepitop Ag PrM E E/NS1 NS1/NS2 Obal B Typ 4 capsid F/H	Wang et al., 1996, J. Inf. Dis. 174:387 Thompson et al., 1996, J. Immunol. 157:822 Flonseca et al., 1994, vaccine 12:279 Flonseca et al., 1994, Vaccine 12:279 Venugopal and Gould, 1994, vaccine 12:967 Green et al., 1997, Virol. 234:383 Simmons et al., 1998, Am. J. trop. Med. Hyg. 58:655 Gagnon et al., 1996, J. Virol. 70:141 Pardo etal., 1997 Am. J. vet. Res. 58:833
Ebola	GP/NP	Vanderzanden et al., 1998, virol. 246:134
Epsteŕn-barr	EBNA 1,2,3,4,6	Moss et al., 1992, Sem. Immunol. 4:97
Foot and Mouth Disease	VPI	Filgueria et al., 1998, Vaccine 13:953
Hepatitis A	A/B combo Ag	Bruguera et al., 1996, vaccine 14:1407
Hepatitis B	HbsAg	Thanavala et al., 1995, PNAS 92:3358
Hepatitis C	E2/NS1	Skelly et al., 1981, náture 290:51 Weiner et al., 1992, PNAS 89:3468
	NS3 NS4	Taniguchi et al., 1993, Virol. 195:297 Khudyakov et al., 1995, Virol. 206:666 Khudyakov et al., 1995, Virol. 206:666

Herpes Simplex I	NS5 El GD
Herpes Simplex IIC	GB
Herpes B Hog Cholera	GD El
Human Immunodeficiencyd Human papilloma	L1
Influenza	E6 E7 HA/N
Japanese Encephalitisb	NP E
Marburg	GP
Marek's Disease (poultry)	GA
Measles	GB HA
Norwalk	NP 56kD capsid
Newcastle Disease (poultry) F
Parainfluenza	HN F/HN
Parvovirus (Canine)	VP2
Rabies	G
Respirátory Syncytial	F proteín
Rinderpes	FG podjednotka H/F
Rotavirusc	VP4
Rubella	VP7 VP6 El
Varicella-Zoster	GE
Yellow Feverb	E
	NS1 (48kD)

Khudyakov et al., 1995, Virol. 206:666

Lechner et al., 1998, Virol. 243:313

Long et al., 1984, Inf. Immunol. 37:761

Mc Dermott et al., 1989, Virol. 169:244

Long et al., 1984, Inf. Immunol. 37:761

Hunt and Melendez, 1969, Lab. Animal čare 19:221 van Riijn et al., 1994, J. virol. 68:3934

HIV Molecular Immunology database

Suzichetal., 1995, PNAS 92:11553

Stauss et al., 1992, PNAS, 89:7871

Stauss et al., 1992, PNAS, 89:7871

Stauss et al., 1992, PNAS, 89:7871

La ver and Webster, 1976, Virol. 69:511

Martinon et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23:1719

Kimura-Kuroda and Yasui, 1988, J. Immunol. 141:3606

Hevey et al., 1997, Virol. 239:206

Boile and Heine, 1993, Immun. Celí Biol. 71:391

Boile and Heine, 1993, Immun. Celí Biol. 71:391

Cordoso et al., 1998, J. Virol. 72:2516

Cordoso et al., 1998, J. Virol. 72:2516

Balí et al., 1998, J. Virol. 72:1345

Reddy et al., 1996, Vaccine 14:469

Reddy et al., 1996, Vaccine 14:469

Morein et al., 1983, J. gen. Virol. 64:1557

Lopez de Turiso et al., 1992, J. Virol. 66:2748

Wiktor et al.„ 1984, PNAS 81:7194

Falsey and Walsch, 1996, Vaccine 14:1214

Neužil et al., 1997, Vaccine 14:1214

Hemming et al., 1995, Clin. Microbiol. Rev. 8:22

Naiket al., 1997, Vaccine 15:603

Zhou et al., 1994, J. Virol. 68:3955

Zhou etal., 1994, J. Virol. 68:3955

Palombo et al., 1994, J. Gen. Virol. 75:2415

Trudel et al., 1985, J. Virol. Meth. 12:243

Fowleret al., 1995, Virol. 241:531

Arwin, 1996, Inf. Clin. Dis. N. Amer. 10:529

Gould et al., 1986, J. gen. Virol. 67:591

Schleschinger et al., 1987, J. Immunol. 135:2805

a. Pre prehľad pozri Pass, 1996, Inf. Ag. Dis. 5:240; Avery, 1998, Curr. Op. Cardiol. 13:122

b. Tieto vírusy sú všetky flavivírusy - prehľad vo Venugopal a Gould, 1994, Vaccine 12:966.

c. Pre prehľad pozri Adimora et al., 1994, Inf. Dis. Clin. N. Amer. 8:859.

d. Pre zoznam HIV antigénov pozri HIV Molecular Immunology Database, publ. Theoretical Biology and Biophysics, new Mexico (1995).

e. Pre zoznam Rotavírus antigénov pozri „Rotavirus Antigens“, Hoshino and Kapikian, 1994, Curr. Top.

Microbiol. Immunol. 185:179.

Bakteriálne toxíny*
Baktéria	Toxín
Bacillus anthracis	Anthrax
Bordetella pertussis	Pertussis
Clostridium botulinum	Botulinum
Clostridium diffícile	Diffícile
Clostridium tetani	Tetanus
Corynebacterium diphtheriae	Diphtheria
Escherichia coli	Enterotoxín
Pseudomonas aeruginosa	Exotoxín A
Shigella dysentheriae	Shiga
Vibrio cholerae	Cholera

Referencia

Leppla, 1982, PNAS 79:852

Weiss and Hewlett, 1986, Ann. Rev. Microbiol. 40: Simpson, 1981, Pharmacol. Rev. 33:155 Knoop etal., 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6:251 Eidels et al., 1983, Microbiol. Rev. 47:596 Pappenheimer, 1977, Ann. Rev. Biochem. 46:69 Gill and Richardson, 1980, J. Inf. Dis. 141:64 Iglewski and Kabat, 1977, PNAS 72:2284 Keusch and Jacewicz, 1975, J. Inf. Dis. 131:533 Finkelsteín, 1973, Crit. Rev. Microbiol. 2:553 * Pre všeobecný prehľad pozri Middlebrook a Dorland, 1984, str. 199.

Bakteriálne patogény
Baktéria	Antigén	Referencia
Bacillus sp		Singh et al., 1998, Inf. Immun. 66:3447
Bordetella sp	Pertractin/P.69	Anderson et al., 1996, Vaccine 14:1384
Boreelia sp	OspA/OspB OspC	Maetal., 1996 Vaccine 14:1366 Mathiesen et al., 1998, Inf. Immun. 66:4073
Brucella sp	L7/L12 Ompló	Bachrach et al., 1994, Inf. Immun. 62:5361 Tibor et al., 1994, Inf. Immunol. 62:3633
Campylobacter sp	0mpl8	Konkel et al., 1996, Inf. Imm.
Chlamydiaf Ehrlichia sp	MOMP	Sparling et al., 1994, PNAS 91:2456 Rikihisa, 1991, Clin. Microbiol. Rev. 4:286
Escherichia sp	PAL	Chen and Hennig, 1987, Eur. J. Bichem. 163:73
Haemophilus sp	PI P2 P4 P5 P6 Proteín D D15 98 kD proteín HtrA	Loeb, 1987, Inf. Immun. 55:2612 Munson et al., 1983, J. Clin. Invest 72:677 Green et al., 1991, Inf. Immun. 59:3191 Munson and Granoff, 1985, Inf. Immun. 49:54 Green et al., 1990, Inf. Immun. 58:3272 Akkoyunlu et al., 1996, Inf. Immun. Thomas et al., 1990, Inf. Immun. 58:1909 Yang et al., 1998, Inf. Immun. 66:3349 Kimura et al., 1985, Inf. Immun. 47:253 Loosmore et al., 1998, Inf. Immun. 66:899
Helicobacter pylori	Urease A Urease B Vac A Catalase	Mitchetti et al., 1994, gastroeterol. 107:1002 Mitchetti etal., 1994, Gastroenterol. 107:1002 Kleanthous et al., 1998, Brit. med. Bull. 54:229 Radcliff et al., 1997, Inf. Immun. 65:4668
Legionella sp	PplA	Ludwig et al., 1996, Inf. Immun. 64:1659
Leptospira sp	OMA	Brown et al., 1991, Inf. Immun. 59:1772
Listeria sp	LLO	Harty a Bevan, 1992, J. Exp. Med. 175:1531
Mycobacterium leprae	35 kD proteín 18kD Ag85A	Triccas et al., 1996, Inf. Immun. 64:5171 Baumgart et al., 1996, Inf. Immun. 64:2274 Launois et al., 1994, Inf. Immun. 62:3679
Mycobacterium tuberculosumMPB59 Ag85A	Roche et al., 1994, Inf. Immun. 62:5319 Franzoso et al., 1993, Inf. Immun. 61:1523
Mycoplasma	90 kD	Anderson et al., 1997, Vaccine 15:1225
Neisseriaf sp	OMV Por	Sparling et al., 1994, PNAS 91:2456 Hughes et al., 1992, Inf. Immun. 60:3497
Pseudomonas sp	OprF Opri O-polysacharid	Specht et al., 1996, Vaccine 14:1111 Hatano and Pier, 1998, Inf. Immun. 66:3719 Alurkar and Kanat, 1997, Inf. Immun. 65:2382
Salmonella sp	OMP/Por Vi	Plotkin and Bouveret-LeClam, 1995, árch. Int. Med. Fatton et al., 1996, Inf. Immun. 64:1659
Staphylococcus sp	CP RAP (38kD)	Balaban et al., 1998, Science 280:438 Beachley et al., 1988, Vaccine 6:192
Streptococcus sp	M	Sparling et al., 1994, PNAS 91:2456
Trepomená palladiumf	TROMP	Leary et al., 1997, Microbial Pathogen. 23:167

Yersinia sp Fl/V

f. Pre prehľad pozri Adimora et al., 1994, Inf. Dis. Clin. N. Amer. 8:859.

Hubové patogény
Organizmus	Antigén	Referencia
Aspergillus		Kurup and Kumar, 1991, Clin. Microbiol. Rev. 4:439
Candida	Pral	Setandreu et al., 1998, J. bacteriol. 180:282
Coccidioides	48 kD proteín	Kirkland et al., 1998, Inf. Immun. 66:424
	CF	Yang et al., 1997, Inf. Immun. 65:4068
	PRA	Kirkland et al., 1998, Inf. Immun. 66:3519
Cryptococcus		Mitchell and Perfect, 1995, Clin. Microbiol. Rev. 8:51

Histoplasma Deepe, 1997, Clin. Microbiol. Rev. 10:585

Paracoccidioides brasiliensis Brummer et al., 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6:89

Pneumocystis carinii	GpA	Gigliotti et al., 1998, Inf. Immun. 66:3179
Parazitické patogény
Vírus	Antigén	Referencia
Cryptosporidium Entamoeba histolytica	SREHP (K2)	Current and Garcia, 1991, Clin. Microbiol. Rev. 4:325 Stanley et al., 1990, PNAS 87:4976
Giardia lamblia	Ariel 170 kD VSP	Mai and Samuelsdon, 1998, Inf. Immun. 66:353 Lotter et al., 1997, J. Exp. Med. 185:1793 Stager et al., 1997, Int. J. Parasitol. 27:965
Leishmania sp	gp63	Kahl et al., 1990, Inf. Immun. 58:3233
Plasmodium sp	Nramp-1 TSA 27 kD proteín	1998, Inf. Immun. 66:1910 Webb et al., 1998, Inf. Immun. 66:3279 Contreras et al., 1998, Inf. Immun. 66:3579
Schistosoma sp	AMA-1 CS prot epitopy 195 kD proteín 55 kD proteín 35 kD proteín Sm28GST	Anderson et al., 1998, Vaccine 16:590 Nardin et al., 1998, vaccine, 16:590 1998, Inf. Immun. 66:2895 Patairoyo et al., 1987, Náture 328:629 Patarroyo et al., 1987, Náture 328:629 Patarroyo et al., 1987, Náture 328:629 Ballone et al., 1987, Náture 326:149
Trypanosoma sp	56 kD proteín	Harth et ak, 1994, Mol. Microbiol. 11:261
Karcinómy**
Neoplazma	Antigén	Referencia
hrudníka	MUC-1	Denton et al., 1993, Canc. Lett. 70:143
hrubého čreva	CEA	Conry et al. 1994, canc. Res. 54:1164
leukémia	BCR/ABL	Chen et al., 1992, PNAS 89:1468
lymfóm	Self Ag	Kwak et al., 1992, New Eng. J. Med. 327:1209
melanóm	MART-1	Kawakami et al., 1994, PNAS 91:3515
vaječníkov	MAGE-1 p-97 MUC-1	Traversari et al., 1992, J. Exp. Med. 176:1453 Hu et al., 1988, J. Virol. 62:176 Jerome et al., 1993, J. Immunol. 151:1654
pankresu	MUC-1	Bashford et al., 1993, Int. J. canc. 54:778

** Pre prehľad pozri Finn, 1993, Curr. Op. Immunol. 5:701.

Ďalšie príklady antigénov a patogénov, ktoré môžu byť použité, možno nájsť u Milich, 1989 (Adv. Immunol. 45:195), Hoshino a Kaplan, 1994 (Cur.. Top. Microbiol. Immunol. 185:179) alebo Venugopal a Gould, 1994 (Vaccine 12:966). Podľa jedného uskutočnenia sú použité podjednotka gpl20 env génu a p27 gag génu z Human Immunodeficiency Vírus (HIV). V ďalšom uskutočnení môže byť antigénny determinant odvodený z antigénu vybraného z HSV gD alebo gB, HIV gpl20, CMV gB, HCV E2, INFV HA alebo NA, H.influenzae P5 alebo P6, fhnbriálneho proteínu a Proteínu D.

Ako je tu použitý pojem „hydrofóbna doména“ (HD), znamená ktorýkoľvek proteín, peptid, lipid alebo molekulu s hydrofóbnou oblasťou alebo štruktúrou majúce povrchovú plochu väčšiu než 500 pm². Príklady potenciálnych hydrofóbnych domén zahŕňajú ktorýkoľvek transmembránový (TM) segment (napr. glykoforín A; Tomita a Marchesi, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:2964), hydrofóbnu doménu cytochrómu b_s (Taylor a Roseman, 1995, BBA 1278:35), T doménu diftéria toxínu (Choe et al., 1992, Náture 357:216), doménu II Pseudomonas Axotoxin A (Allured et al., 1986, PNAS 83:1320), 4-špirálové zväzky penicilínového senzorového tranduktora (Hardt et al., 1997, Mol. Microbiol. 23:935), 7-špirálový zväzok baktériorodopsínu (Henderson a Unwin, 1975, Náture 257:28), 12-špirálový zväzok šelakovej permeázy (Kaback et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:537) a prieduchy vytvárajúce kolicínové domény (Parker et al., 1989, Náture 357:93).

Pojem „vektor“, ako je tu použitý, zodpovedá nukleovej kyseline (napr. DNA) odvodenej od plazmidu, kozmidu, fagmidu alebo baktériofágu, alebo synteticky odvodenej, do ktorej môžu byť fragmenty nukleovej kyseliny včlenené alebo klonované. Vektor môže obsahovať jeden alebo viac jedinečných reštrikčných miest na tento účel, a môže byť schopný autonómnej replikácie v definovanom hostiteľovi alebo organizme tak, že je reprodukovaná klonovaná sekvencia. Vektorová molekula môže udeľovať v hostiteľskom organizme niektorý dobre definovaný fenotyp, ktorý je buď selektovateľný, alebo ihneď zistený. Niektoré zložky vektora môžu byť DNA molekuly začleňujúce regulačné elementy pre transkripciu, transláciu, stabilitu RNA a replikáciu a iné DNA sekvencie.

Pojem „DNA kazeta“, ako je tu použitý, zodpovedá genetickej sekvencii vo vektore, ktorá môže špecifikovať fúzny proteín tu opísaný. Kazeta nukleovej kyseliny je polohovo a sekvenčne orientovaná vo vektore tak, že nukleová kyselina v kazete môže byť transkripčne prenesená do RNA, a ak je to potrebné, preložená do produktu fúzneho proteínu. Prednostne má kazeta svoje 3' a 5' konce prispôsobené na rýchle včlenenie do vektora, napr. má reštrikčné endonukleázové miesta na každom konci.

Keďže je preferované, že antigénne konštrukty sú produkované použitím rekombinantných techník, rozumie sa tým, že konštrukty môžu byť syntetizované ktorýmikoľvek prostriedkami známymi v stave techniky, ako sú napríklad, chemické prostriedky. Toto môže byť zvlášť užitočné, keď je použitá nepeptidová väzobná oblasť alebo hydrofóbna doména obsahuje neprirodzene sa vyskytujúce rezíduum aminokyselín alebo mimetické. Teda, zatiaľ čo prednostné uskutočnenie vytvára použitie rekombinantných spôsobov pre produkovanie antigénneho fúzneho proteínu, predložený vynález tiež uskutočňuje spôsob obsahujúci: prípravu antigénnych konštruktov chemickými syntetickými prostriedkami alebo kombináciou rekombinantných alebo chemických prostriedkov a prípravu imunogénnej lipidovej formulácie, ako bolo opísané.

Popri prednostnej peptidovej väzobnej oblasti aj iné väzbové oblasti známe v stave techniky môžu byť použité na pripojenie antigénu k hydrofóbnej doméne. Príklady takých väzobných oblastí zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, polyetylénové glykoly, polysacharidy, polysialické kyseliny, jantárovú kyselinu, butándiovú kyselinu, kyselinu adipovú a štandardné sieťovacie činidlá, ako je SMPT (4-sukcínimidyloxykarbonyl-a-metyl-cc-(2-pyridylditio)-toluén), DSP (ditio-bis(sukcín-imidylpropionát), EGS (etylénglykol-bis(sukcínimidylsukcinát), SMCC (4-sukcínimidylkarbonyl-4-(N-maleimidometyl)cyklohexán-l-karboxylát) a SPDP (N-sukcínimidyl-3-(2-pyridyl-ditio)propionát (pozri tiež Pierce Catalog, Pierce Chemical Co., Rockford IL.).

Podľa predloženého vynálezu zohrávajú lipozómy kritickú úlohu pri dodávaní antigénu, keďže antigénlipozómový komplex je priamo prítomný v imunitnom systéme po odstránení z cirkulácie bunkami imunitného systému. Navyše, výber imunostimulačných ciest môže byť menený vytvorením zmien do lipidovej kompozície lipozómu. Napríklad, rôzne imunostimulačné molekuly, ako je Lipid A (Asano and Kleinerman, 1993, J. Immunother. 14:286), P₃CSS (Lex et al., 1986, J. Immunol. 137:2676), muramyl di- a tripeptid-PE (Fidler et al., 1981, PNAS 78:1680; Alving et al., 1985, Vaccines 4:166) a katiónové lipidy (Walker et al., 1992, PNAS 89:7915) môžu byť formulované v lipozómoch na stimulovanie rôznych imunologických ciest. Iné pomocné látky, ako je napríklad MF59, Quil A, QS21 alebo kamenec, môžu byť použité v spojení s antigén-lipozómovým komplexom. Navyše, imunorelulačné molekuly, ako sú cytokíny, môžu byť pridané na vyvolanie imunitnej odpovede.

Lipozómy požité v praxi podľa predloženého vynálezu môžu byť pripravené zo širokej škály vezikuly vytvárajúcich lipidov zahrnujúcich fosfatidylétery a estery, ako je fosfatidyletanolamín (PE), fosfatidylserín (PS), fosfatidylglycerol (PG) a fosfatidylcholín (PC); glyceridy, ako je dioleoylglycerosukcinát; cerebrozidy, cerebrozidy; ganglozidy; spingomyelíny; steroidy, ako je cholesterol; a iné lipidy, ako aj iné excipienty, ako je vitamín E alebo vitamín C palmitát (pozri tiež US patenty č. 4 235 871; 4 762 720; 4 737 323; 4 789 633; 4 861 597; a 4 873 089). Príklady lipidov na báze fosfatidylcholínu zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, (C-18)distearoylfosfatidylcholín (DSPC); (C-16)dipalitoylfosfatidylcholín (DPPC); (C-14)dimyristoylfosfatidylcholín (DMPC) a (C-18, nenasýtený)dioleylfosfatidylcholín (DOPC). Je preferované, že lipidy sú v kvapalnej fáze pri telesnej teplote (približne 38 - 39 °C). Potom lipidy s T_m nad telesnou teplotou, ako je DSPC a DPPC, sú menej preferované (ale stále ešte môžu byť užitočné). Lipidy majúce T_m pod telesnou teplotou, ako je DMPC alebo DOPC, sú viac preferované. Navyše, je preferované, že lipidová formulácia neobsahuje viac než 10 % cholesterolu. Zvlášť preferované lipidové kompozície obsahujú asi 0 - 10 % cholesterolu, asi 0 až 15 % PG a asi 0 - 100 % PC. V určitých prednostných uskutočneniach môže kompozícia ďalej obsahovať asi 1-10 % pomocných látok; prednostne je pomocná látka prítomná v množstve menšom než asi 5 %.

Príprava lipozómov je dobre známa v doterajšom stave techniky. Vo všeobecnosti boli lipozómy vytvorené veľkým počtom rôznych techník zahrnujúcich injektovanie etanolu (Bartzi et al., 1973, Biochem. Biophys. Acta. 298:1015); infúziu éteru (Deamer et al., 1976, Biochem. Biophys. Acta. 443:629; Schieren et al., 1978, Biochem. Biophys. Acta. 452:137); odstránenie detergenta (Razin, 1972, Biochem. Biophys. Acta. 265:241); odparenie rozpúšťadla (Matsumato et al., 1977, J. Colloid Interface Sci. 62:149); odparenie organických rozpúšťadiel z chloroformu vo vodnej emulzii (REV's) (Szoka Jr. et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4194); etrúziu MLV's alebo EUV's cez nukleoprieduchovú polykarbonátovú membránu (Olson et al., 1979, Biochem. Biophys. Acta. 557:9); zmrazenie a roztopenie fosfolipidových zmesí (Pick, 1981, Archives of Biochem. And Biophyssics, 212:186), ako aj vírenie ultrazvuku a homogenizáciu.

Konvenčné sú lipozómy kategorizované podľa veľkosti a 3-písmenová skratka je použitá na označenie typu lipozómu, o ktorom sa hovorí. Mnoholameláme vezikuly sú vo všeobecnosti označené „MLV“. Malé jednolameláme vezikuly sú označené „SUV“ a veľké unilameláme vezikuly sú označené „LUV“. Tieto označenia sú niekedy podľa chemickej kompozície lipozómu. Na prejednanie nomenklatúry a súhrnu známych typov lipozómov pozri Storm et al., 1998, PSIT, 1:19-31.

Predložený vynález sleduje použite lipozómov s vhodnou pomocnou látkou. Predložený vynález však tiež sleduje použitie antigénnych konštruktov, ktoré nie sú spojené s lipozómom, v kombinácii s vhodnou pomocnou látkou. Teda, vakcína alebo imunogénna kompozícia je zložená z dvoch zložiek: antigénu spojeného s hydrofóbnou doménou a z vhodného systému pomocných látok. Príklady potenciálnych farmaceutický prijateľných nosičových systémov, ktoré môžu byť použité, zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, lipozómy, emulzie, Freundova pomocná látka (úplne alebo čiastočne), mastenec, ISCOMS a obalené vírusy.

Spôsoby podľa vynálezu budú používať imunogénne efektívne množstvo lipozómovej kompozície, t. j. množstvo kompozície, ktorá v kombinácii s ktorýmikoľvek pridanými expicientmi alebo nosičmi bude vyúsťovať do zistiteľnej imunogénnej odpovede u hostiteľa. Keď bude kompozícia použitá ako vakcínová kompozícia, efektívne množstvo bude také množstvo, ktoré v kombinácii s ktorýmikoľvek pridanými expicientmi alebo nosičmi spôsobí u hostiteľa produkciu špecifickej alebo dostatočnej imunologickej odpovede tak, aby sa dodala ochrana hostiteľovi pri neskoršom vystavení mikróbu (profylaktická vakcinácia), alebo sa dodala ochrana hostiteľovi s už prepuknutým ochorením (terapeutická vakcinácia).

Vynález teraz bude všeobecne opísaný, rovnako bude lepšie pochopená referencia na nasledujúce podrobné príklady, ktoré sú uskutočnené spôsobom ilustrácie a nie sú zamerané na obmedzenie vynálezu, pokiaľ nie sú takto špecifikované.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje efektívnosť lipozómovej kompozície podľa predloženého vynálezu pri ochrane proti HSV2.

Obr. 2 ukazuje porovnanie efektívnosti lipozómovej kompozície podľa predloženého vynálezu s inými vakcínovými kompozíciami.

Obr. 3 ukazuje krivku prežitia myší ukazujúc schopnosť lipozomálneho HSV2g(l-23)-HD pre vyvolanie obrannej imunitnej odpovede.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad I - HSV2

Príprava HSV2gD(l-23)-TM

N-koncový 23-aminokyselinový segment z gD obalového proteínu HSV2 bol spárený s transmembránovým (TM) segmentom chemickou syntézou na automatizovanom peptidovom syntetizátore. Syntetizovaný peptid bol rozštiepený štandardnými HF štiepacími spôsobmi a čistený preparatívnou HPLC použitím vodnej 08 stĺpcovej kolóny a 100 % acetonitrilovej mobilnej fázy s 0,1 % TFA. Peptid sa pri hmotnostnej spektrometru a kapilárnej elektroforéze ukázal aspoň s 95 % čistotou.

Príprava lipozómov

Lipozómy boli pripravené prienikom vírenia ultrazvuku podľa v predošlom opísaných postupov (Fujii et al., 1997, Biochemistry 36:4959). Stručne, lipidy (s alebo bez proteínu) sú rozpustené v organickom rozpúšťadle, ako je chlóroform/metanol. Tenké lipidové filmy sú vytvorené pipetovaním podielov lipidových roztokov do sklených trubíc s guľatým dnom, a odparením rozpúšťadla pri 65 °C v prúde dusíka. Filmy sú umiestnené vo vákuu po aspoň dobu ôsmich hodín pre odstránenie zvyškového organického rozpúšťadla. Príprava lipozómov je uskutočnená hydratáciou lipidových filmov pufrom a inkubovaním suspenzie pri 65 °C počas 5 až 10 minút pred prienikom vírenia ultrazvuku. Lipozómy sú potom filtrované cez 0,22 pm filter pre sterilizáciu prípravku. Lipozómy sú veľkosťou dynamicky jemne rozptýlené a po minimálne štyroch týždňoch nasleduje vytvorenie agregátov.

Zvlášť preferovaná lipozomálna HSV2gD(l-23)-TM formulácia má molámy pomer 15:2:3 DMPC :

: Chol : DMPG (dimyristoylfosfatidylcholín : cholesterol : dimyristoyl-fosfatidylglycerol), s 2,5 hmotn. % Lipidu A.

Pakcinačné postupy a testovanie pre vyvolanie imunitnej odpovede na vírusový antigén

BALB/c alebo C57BL/6 samice myší (6-8 týždňové) sú subkutánne injektované raz za týždeň, dva týždne, tri týždne alebo štyri týždne prípravkom testovacej vakcíny alebo pufra. Miesta injektovania sú monitorované na nepriaznivé reakcie, ako je vývoj granulómov a/alebo vytvorenie svrabu/oparu. Keď sú zvieratá imunizované vakcínou cez intranasálnu cestu, sú anestetizované halotánom a kompozícia (10 - 20 μΐ) podá9 vaná do nosných dierok napríklad použitím sterilnej špičky mikropipetora (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis. 168:622).

V pravidelných intervaloch počas vakcinačného postupu a po vírusovom podnete bola meraná imunitná odpoveď myší na vírusový antigén. Test neutralizácie vírusovej protilátky bol vykonaný použitím 24-jamkových klasterových dosiek obsahujúcich 1 x 10⁵ BHK buniek, ku ktorým boli pridané rôzne riedidlá myšieho séra zmiešaného s vírusom. Nasledujúcich 48 - 72 hodín inkubácie pri 37 °C v CO₂ inkubátore boli monovrstvy buniek skúmané na cytotoxicitu a analyzovaný bol titer neutralizujúcej protilátky. Zrazenie protilátok na vírus bolo merané inkubovaním rôznymi riedidlami séra s 5 - 10 pg vírusového antigénu alebo 25-50 μΐ rodu HSV2 (1 x 10⁵ PFU). Lipozómy obsahujúce antigénny epitop sú tiež použité ako terče pre protilátku/ELISA analýzu, ako bola skôr opísaná (Tuso et al., 1993, Transplantation 55:1375). Výsledky posledne uvedenej analýzy budú použité na meranie hladiny viazania a izotypovej konfigurácie protilátok.

Oneskorený typ hypersenzitívnej odpovede na vírusový antigén pri vakcinovaných myšiach je testovaný použitím analýzy zadnej laby. Vakcinované zvieratá sú anestetizované halotánom a injektované 50 μΐ ultrafialového inaktivovaného HSV2 do jednej zadnej laby a 50 μΐ rozložených neinfikovaných buniek do druhej zadnej laby. Dvadsaťštyri, štyridsaťosem a sedemdesiatdva hodín neskôr bol meraný stupeň opuchnutia myšej laby použitím Vemierovho meradla a porovnaný so základnými meraniami. Aktivita T buniek týchto zvierat je tiež meraná podľa produkcie cytokínov v odpovedi na inkubáciu slezinových T buniek vírusovým antigénom. Sleziny z vakcinovaných zvierat sa odoberú a slezinový homogenát je pripravený jemným rozložením slezín sterilným plunžerom a pretlačením buniek cez nylonovú mriežkovú sieťovinu. Suspenzie buniek sú prepláchnuté a rozložené pri 1 x 10⁶ buniek/jamka na 96-jamkovej mikrotitrovej doske. Nasledovala inkubácia buniek pri 37 °C počas 3 až 4 dní s rôznym množstvom vírusového antigénu, supematanty z jamiek sú zozbierané a testované na prítomnosť cytokínov. Komerčne dostupné cytokínové súpravy ELISA sú použité na definovanie cytokínového profilu (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-α, a-aktín a TNF-α z PharmMingen, Inc. (San Diego, CA)). Zisťovanie cytokínového proteínu v supematantoch tkanivovej kultúry vložením ELISA je vykonané použitím monoklonálnych protilátok (mAb) špecifických pre jednotlivé cytokíny. Stručne, ELISA dosky sú potiahnuté cez noc potkaním antimyším cytokínom mAb. Dosky sú blokované 3 % fetálnym teľacím sérom v PBS počas dvoch hodín, potom sú podiely každej testovanej vzorky pridané do každej jamky. Cytokínový špecifický biotinylovaný potkaní antimyší mAb je pridaný do každej jamky s následným pridaním avidínperoxidázy. Farebná reakcia je dosiahnutá pridaním kolorimetrických substrátov. Dosky sú odčítané v ELISA spektrofotometri a koncentrácie cytokínov sú vypočítané zo štandardnej krivky získanej z kontrolných rekombinantov cytokínov.

Model myšej H S V encefalitídy pre testovanie prípravku lipozómovej vakcíny

Vakcinované a ne vakcinované (kontrolné) BALB/c samice myší (10 - 12 týždňové) sú intraperitoneálne podnietené letálnou dávkou (1 x 10⁵ PFU) HSV2 pretekajúceho mozgom. Tieto myši intravaginálne podnietené letálnou dávkou HSV2 sú najprv preliečené subkutánne estrogénom jeden týždeň pred testom a deň (-1) pred testovaním. Potom sú anestetizované intraperitoneálnym injektovaním acepromazínu a ketamínu. HSV2 (10-30 μΐ) je potom podaný intravaginálne použitím sterilnej špičky na mikropipetore po vytretí vagíny suchým Calgi-tampónom (McDermott et al., 1984, J. Virol. 51:747). Zvieratá sú monitorované počas 80 dní po teste na prežitie (denne), stratu hmotnosti (každý ďalší deň počas prvých dvoch týždňov a potom raz za týždeň), vzhľad kožušiny a neurologické symptómy (znížená úroveň aktivity, vlečenie alebo paralýza končatín). Antigénom vyvolaná proliferácia T buniek

Senzibilizácia hostiteľa na gD antigén je meraná použitím analýzy antigénom vyvolanej proliferácie T buniek. Slezinové homogenáty sú pripravené jemným rozložením slezín sterilným plunžerom a pretlačením buniek cez nylonovú mriežkovú sieťovinu. Bunky sú suspendované v prostredí RPMI 1640 obsahujúcom 10 % fetálne teľacie sérum (FCS), 10 mM Hepes pufor, L-glutamín (2mM), penicilín (25 IU/ml) a streptomycín (25 pg/ml). Bunky sú kultivované pri koncentrácii 1 x 10⁶ buniek/ml s alebo bez gD (5-20 pg/ml) na 96-jamkovej doske s dnom v tvare U počas 4 dní v 5 % CO₂. Kultúry sú pulzované 20 μΐ rezazurínového farbiva počas 3 hodín a potom je meraná fluorescencia na Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc. Farmington, MA).

Analýza pre cytokíny špecifickej mRNA

T bunky z imunizovaných a neimunizovaných zvierat sú skúmané pre cytokíny špecifickými mRNA hladinami pri väčšine cytokínov, ktoré môžu odrážať senzibilizáciu spojenú s imunizáciou, vrátane IL-2, IFN-a, IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10. T bunky sú získané zo sleziny, ako bolo opísané. Celková RNA je izolovaná použitím modifikácie (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16) spôsobu opísaného Chomczynskym a Sacchim (Chomczynsky et al., 1987, Analyt. Biochem. 162:156). Čerstvé a zmrazené bunky (2 x 10⁶) sú rozložené v 1 ml denaturovaného roztoku (4 mM guanidín tiokyanát, 25 mM citrát sodný (pH 7,0), 0,5 % sarkozyl a 0,1 mM 2-merkaptoetynol). RNA je zrážaná inkubovaním jedným objemom izopropanolu cez noc pri -20 °C. Koncentrácia celkovej RNA je upravená na 260 nM a vzorky sú uložené do analýzy pri -80 °C.

Analýza cytokínov je vykonaná použitím modifikácie spôsobu opísaného Cosenzom et al. (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16). Jednoreťazcová cDNA je pripravená transkripciou 2 pg celkovej RNA v 20 μΐ celkovej reakčnej zmesi použitím reverznej transkriptázy vírusu avian myeloblastosis (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Sekvenčné špecifické oligonukleotidové priméry pri murín cytokínoch (tabuľka 1) sú použité na amplifikáciu DNA fragmentov predeterminovanej veľkosti pre každý z uvažovaných cytokínových génov.

Tabuľka 1

Oligonukleotidové priméry použité na polokvantitatívnu analýzu cytokínov z myší*

Sekvencia nukleovej kyseliny

Očakávaná terčová veľkosť

IL-2	5'	TGATGGGACCTACAGGAGCTCCTGAG (SEQ ID NO.l)	167 bp
	3'	GAGTCAAATCCAGAACATGCCGCAG (SEQ ID NO.2)
IL-4	5' 3'	CGSSGAACACCACAGAGAGTGAGCT (SEQ ID NO.3) GACTCATTCATGGTGCAGCTTATCG (SEQ ID NO. 4)	180bp
IL-5	5' 3'	ATGACTGTGCCTCTGTGCCTGGAGC (SEQ ID NO. 5) CTGTTTTTCCTGGAGTAAACTGGGG (SEQ ID NO. 6)	242 bp
IL-6	5' 3'	TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG (SEQ ID NO. 7) TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC (SEQ ID NO. 8)	154 bp
IL-10	5' 3'	TCAAACAAAGGACCAGCTGGACAACATACTGC (SEQ ID NO. 9) CTGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA (SEQ ID NO. 10)	426 bp
IL-12	5' 3'	TCGCAGCAAAGCAAGATGTG (SEQ ID NO. 11) GAGCAGCAGATGTGAGTGGC (SEQ ID No. 12)	315 bp
IFN	5' 3'	AGCGGCTGACTGAACTCAGATTGTAG (SEQ ID NO. 13) GTCACAGTTTTCAGCTGTATAGGG (SEQ ID NO. 14)	843 bp
TNF-a	5' 3'	GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGC (SEQ ID NO. 15) ACATTCGAGGCTCCAGTGAATTCGG (SEQ ID NO. 16)	307 bp
□-aktín 5'	TGGAATCCTGTGTGGCATCCATGAAAC (SEQ ID NO. 17) 3' TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG (SEG ID NO. 18)	348 bp

PCR zmes obsahuje 1 μΐ cDNA, 2,5 μΐ PCR 10 x pufor, 1 μΐ každého z 5' a 3' primérov, 2,5 μΐ 10 x dNTP (2 mmol/1 a 0,125 μΐ T. aquaticus termostabilnej DNA polymerázy (Boehringer Mannheim) v konečnom objeme 25 μΐ. Špecifické a-aktín priméry sú použité na amplifikáciu 548 bp fragmentu ako vnútorná kontrola. PCR zmes je potiahnutá minerálnym olejom a amplifikácia vykonaná nasledujúcou inkubáciou zmesi počas 7 minút pri 94 °C, 38 cyklami s 30 sekundovou denaturáciou pri 94 °C, 45 sekundovým chladením primérov pri 60 °C, 60 sekundovým natiahnutím pri 72 °C a 7 minútovou inkubáciou pri 72 °C. PCR produkty sú separované na agarózovom géli v prítomnosti etídiumbromidu. Pásy sú vizualizované pod UV svetlom, fotografované a denzitometricky kvantifikované z fotografie použitím softvérového balíka molekulového analyzátora (Bio-Rad, Richmond CA).

Cytokínové merania pomocou ELISA

Komerčne dostupné cytokínové súpravy ELISA sú použité na definovanie cytokínového profilu vylučovaného slezinovými CD4⁺ T bunkami izolovanými z imunizovaných a neimunizovaných zvierat. Zisťovanie cytokínového proteínu v supematantoch tkanivovej kultúry zo slezinových T buniek vložením ELISA je vykonané použitím monoklonálnych protilátok (mAb) špecifických pre jednotlivé cytokíny. Stručne, ELISA dosky sú potiahnuté cez noc potkaním antimyším cytokínom mAb. Dosky sú blokované 3 % fetálnym teľacím sérom v PBS počas dvoch hodín, potom sú podiely každej testovanej vzorky pridané do každej jamky. Cytokínový špecifický biotinylovaný potkaní antimyší mAb je pridaný do každej jamky s následným pridaním avidínperoxidázy. Farebná reakcia je dosiahnutá pridaním kolorimetrických substrátov. Dosky sú odčítané v ELISA spektrofotometri a koncentrácie cytokínov sú vypočítané zo štandardnej krivky získanej z kontrolných rekombinantov cytokínov.

Anti-HSV2 CTL odpovede

Po vakcinácii je stanovená prítomnosť pre antigén špecifických cytotoxických T lymfocytov (CTL) v slezinových T bunkách. Slezinové lymfocyty sú získané, ako bolo už opísané. Lymfocyty z každej liečenej skupiny sú zložené (n=5) a potom kultivované počas 3 dní bez antigénu pri 10⁷ buniek/jamka na 12-jamkovej kultivovacej doske. EL-4 (H2^Ä) terčové bunky (ATTC) sú inkubované peptidom zodpovedajúcim HSV2 gB CTL epitopu umiestnenému medzi rezíduami 495 - 505 (Hanke et al., 1991, J. Virol. 65:1177) pre H2^A reš11 trikčné bunky a inkubované počas 4 hodín pri 37 °C. Terče sú premyté a 100 μΐ titre obsahujúce 1 x 10⁴ buniek sú pridané do každej jamky. Efektorové lymfocyty sú premyté, pridané do jamiek pri rôznych koncentráciách a kultivované počas 4 hodín pri 37 °C. Použitím súpravy CytoTox 96 (Promega, Madison WI) je vypočítaná percentuálna špecifická lýza zo supematantu laktát dehydrogenázy (LDH) meraná v štandardnom ELISA doskovom odčítači (HTS 7000+ Bio Assay Reader, Perkin Elmer, San Jose, CA) zaznamenaním absorbancie pri 490 nm. Určenie HSV2-antigén špecifickej lýzy je urobené podľa štandamých kritérií. Údaje sú vyjadrené ako percentá špecifickej lýzy = 100 x [(experimentálna - efektorová spontánna - terčová spontánna)/(terčová maximum - terčová spontánna)].

Výsledky

Krivka prežitia nachádzajúca sa na obr. 1 ukazuje efektívnosť lipozómového peptidu pri ochrane myší proti systematickému podnetu s letálnou dávkou HSV2, ako aj stanovenie počtu očkovaní potrebných na dosiahnutie 100 % ochrany. Obr. 1 ukazuje počet dávok lipozómovej HSV2gD(l-23)-TM vakcíny potrebnej pre ochranu BALB/c myší proti letálnemu podnetu s HSV2. Skupinám 7 myší boli dané dve, tri alebo štyri imunizácie pred podnetom letálnou dávkou HSV2. So štyrmi vakcináciami žiadne zo zvierat imunizovaných lipozómovou vakcínou nemalo neurologické komplikácie spojené s infekciou HSV2, ani nejavili nejaké iné známky infekcie zistenej pri štúdii. Najdôležitejšie, všetky z myší prežili letálny podnet s HSV2. S dvoma alebo troma imunizáciami za týždeň bolo chránených menej než 100 % myší. Naopak myši, ktorým boli dané štyri vakcinácie placebo (t. j. pufor), neboli chránené od podnetu s HSV2.

Lipozómové HSV2gD(l-23)-TM bolo tiež testované v troch skupinách C57BL/6 myší a zisťované na vyvolanie ochranných účinkov porovnateľných s výsledkami získanými s BALB/c myšami. Tabuľka 2 sumarizuje tieto výsledky. Skupina 1 myší bola vakcinovaná v týždni 1 a 4 subkutánne; skupina 2 myší bola vakcinovaná v týždni 1 subkutánne a v týždni 4 intrarektálne; a skupina 3 (kontrolná skupina) nedostala žiadnu vakcináciu. Jeden týždeň po poslednej vakcinácii (v týždni 4) boli myši podnietené intraperitoneálne s letálnou dávkou HSV2 a boli monitorované počas 3 týždňov na morbiditu a mortalitu. Ako pri myšiach s BALB/c, skupiny myší, ktoré dostali vakcináciu lipozómovou HSV2gD(l-23)-TM, mali výrazné počty prežitia, keď boli vakcinované buď subkutánnym injektovaním, alebo im bola daná subkutánne hlavná dávka nasledovaná mukozálnymi revakcináciami.

Tabuľka 2

Súhrn výsledkov porovnávajúci prežitie C57BL/6 myší pri rôznych vakcinačných liečeniach lipozómovým HSV2gD(l-23)-TM

Skupina_Vakcinačná liečba_Prežitie (n=7)

1	Týždeň 1- subkutánne Týždeň 4 - subkutánne	6/7 (86 %)
2	Týždeň 1 - subkutánne Týždeň 4 - intrarektálne	5/7 (71 %)
3	Kontrolné (bez vakcinácie)	1/7 (14 %)

Obr. 2 ukazuje porovnanie HSV2gD(l-23)-TM s inými spôsobmi antigénovej prezentácie. Každej zo 7 myší boli dané 4 imunizácie pred podnetom s letálnou dávkou HSV2. Znovu, štyri očkovania lipozómovou HSV2gD(l-23)-TM vakcínou vyústilu do 100 % ochrany myší vplyvom letálnej dávky HSV2. Štyri imunizácie s nelipozómovým HSV2gD(l-23)-TM alebo lipozómami s HSV2gD(l-23)-TM neboli schopné zabezpečiť výraznú ochranu pred vplyvom letálneho HSV2 podnetu. Toto jasne ukazuje, že lipozóm aj konštrukty proteínových zložiek musia byť spojené navzájom na dosiahnutie efektívne imunitnej odpovede. Zvláštny význam má zistenie, že lipozómová HSV2gD(l-23)-TM vakcína zabezpečuje oveľa väčšiu ochranu než imunizácia teplom inaktivovaným vírusom, pretože vakcíny na báze vírusov vo všeobecnosti uskutočňujú dobrý stimul pre imunitnú odpoveď (Desrosiers, 1992, AIDS Res. Hum. Retrovir. 8:1457).

Na konci štúdie boli myši usmrtené a sérum zozbierané pre charakterizovanie podstaty imunitnej odpovede v tomto čase. Sérum vakcinovaných myší bolo zisťované na vysoké titre protilátok (1 : 100), ktoré špecificky rozoznali peptid použitý na stimuláciu imunitnej odpovede a ďalej, spôsobili zrazenie aktívneho vírusu, poukazujúc na to, že protilátky rozoznali epitop na povrchu vírusu. Protilátky tiež zrážajú HSV2(l-23)-TM lipozómy a nie lipozómy bez peptidu, poukazujúc na to, že špecificky rozoznávajú gD epitop HSV2.

Tabuľka 3 uskutočňuje súhrn imunologických analýz ukazujúcich, že lipozómový HSV2(l-23)-TM podaný subkutánne raz za týždeň počas štyroch týždňov vytvára silnejšiu imunitnú odpoveď v porovnaní so štandardnými pomocnými látkami. Vakcinácia antigénom zmiešaným s neúplnými Freundovými pomocnými látkami alebo kamencom nezabezpečuje myšiam ochranu pred vírusovým podnetom. Údaje získané testom neutralizovania protilátky a oneskorenej hypersenzitívnej odpovede sú paralelné s údajmi prežitia s najvyšším titrom protilátky (B bunková odpoveď) a najväčším opuchnutím laby (T bunková odpoveď) pozorovanými pri lipozómovej HSV2gD(l-23)-TM skupine. Ďalšia dôležitá výhoda spojená s lipozómovou HSV2gD(l12

-23)-TM liečbou bola taká, na rozdiel od výsledkov pri myšiach, ktorým sa podala neúplná Freundova pomocná látka s antigénom, že na mieste injekcie neboli pri žiadnej z myší (17/17 zistené sčervenania na mieste injekcie s neúplnou Freundovou pomocnou látku proti 0/17 pri lipozómovom HSV2gD(l-23)-TM) skúmaných žiadne podráždenie alebo zápal. Keď bol použitý kamenec, pri 17/17 myšiach sa vytvorili na mieste injekcie palpačné granulómy. Naopak, lipozómový HSV2gD(l-23)-TM nespôsobil vytvorenie granulómov pri žiadnej z myší. V súhrne tieto výsledky uvádzajú, že B a/alebo T bunkové odpovede (ako bolo vyšetrené neutralizovaním titrov protilátky a stupeň opuchnutia laby) prispievajú k obrannej imunitnej odpovedi vyvolanej lipozómovým HSV2gD(l-23)-TM pri myšiach proti letálnej dávke HSV2.

Tabuľka 3

Súhrn výsledkov porovnávajúcich imunologické odpovede lipozómového HSV2gD(l-23)-TM, neúplnej Freundovej pomocnej látky zmiešanej s HSV2gD(l-23)-TM, mastenca zmiešaného s HSV2gD(l-23)-TM a kontrolnej skupiny injektovanej samotným PBS

Vakcínová liečba Prežívajúce myší / # mvší v skupine	Neutralizovanie titra protilátky % opuchu laby
deň podnetu	vzhľadom na kontrolné mvši
Lipozomálny HSV2gD(l- 5/7 23)-TM	1:1638	8%
Neúplný Freundov 0/7 Pomocná látka s HSV2gD(l23)-TM antigénom	1:717	3%
Kamenec zmiešaný s 0/7 HSV2gD(l-23)-TM	1:1024	5 %
Fosfátový pufŕový soľný roztok 0/7 Príklad II - HSV2 Príprava HSV2gD(l-23)-HD	1:486	0%

Génový konštrukt kódujúci HSV2gD(l-23)-HD bol vytvorený použitím prekrývania oligonukleotidov kódujúcich gD epitop spojený s 45-aminokyselinovou hydrofóbnou doménou (HD). Konštrukt bol vytvorený postupným predĺžením kódovacej oblasti génu. Gén bol potom ligovaný do pTrcHis expresného vektora a overený sekvenčnou analýzou. Štúdia malorozmerovej expresie bola iniciovaná indukciou lmM IPTG a potvrdená škvmovou analýzou Western použitím myšacích protilátok vytvorených vo vakcinačných štúdiách s lipozomálnymi HSV2gD(l-23)-TM. Proteín bol tiež analyzovaný pomocou SDS-PAGR a pás zistil, že zodpovedal očakávanej molekulovej hmotnosti (=6kD), ako bolo vyhodnotené Coomassie zafarbením. Majúc ukázané, že sa uskutočnila expresia očakávaného malorozmerového proteínu, desaťlitrová fermentačná šarža E. coli obsahujúca pTrcHis/HSV2gD(l-23)-HD konštrukt bola ukončená s výťažkom približne 60 gramov bunkovej pasty. Po indukcii bola expresia HSV2gd(l-23)-HD overená škvrnou Western časového priebehu fermentácie. Baktérie z približne 30 gramov bunkovej pasty boli rozložené pomocou French Press v pufri obsahujúcom 1 % deoxycholátu a 5 mM imidazolu. Po centrifugácii na pelety boli zistené bunkové úlomky, HSV2gD(l-23)-HD prevažne vo vodnom rozpustnom supematante.

Čistenie bolo dosiahnuté prechodom supematantu obsahujúceho rozpustný HSV2gD(l-23)-HD proteín cez niklom naplnenú chelátovaciu Sepharose kolónu. Kolóna bola premytá za sebou roztokmi obsahujúcimi 5 mM imidazolu, 200 mM imidazolu a potom 5 mM imidazolu s 1 % deoxycholátom na odstránenie všetkých zvyškových proteínov. HSV2gD(l-23)-HD proteín bol nakoniec eluovaný 200 mM imidazolom, 1 % deoxycholátovým roztokom. Vrcholy frakcií boli identifikované Coomassie zafarbeným SDS-PAGE a škvrnou Western. Všetky vrcholy frakcií obsahujúce HSV2gD(l-23)-HD boli spojené a koncentrované použitím Millipore Utratrep koncentrátom. Konečná koncentrácia bola ukázaná na obsah čistého HSV2gD(l-23)-HD, ako bolo vyhodnotené prítomnosťou jedného pásu na Coomassie zafarbenom SDS-PAGE géli. Z tohto prvého pokusu boli získané približne 2-3 mg HSV2gD(l-23)-HD pri lipozómovej formulácii a vakcinačných štúdiách.

Lipozomálny prípravok a vakcinačné postupy, testovanie vyvolania imunitnej odpovede, HSV2 myší encefalitický model, antigénom vyvolaná proliferácia T buniek, pre cytokíny špecifická mRNA analýza, ELISA cytokínové merania a anti-HSV2 CTL odpovede boli v podstate také, ako boli opísané v príklade 1.

Výsledky

Krivka prežitia zobrazená na obr. 3 ukazuje schopnosť HSV2gD(l-23)-HD vyvolať obrannú imunitnú odpoveď. % prežitia s touto významnou formuláciou boli pozorované ako 40 %. V porovnaní s pufrom liečené kontrolné zvieratá neukázali žiadne prežitie, zatiaľ čo kontrolná skupina HSV2gD(l-23)-TM mala 100 % prežitie.

Príklad III - HIV

Príprava HIV (gp!20-HD) a HIV (Δ gpl20-HD) v COS-1 bunkách

Pri prispôsobovanej epitopovej štúdii je sekvencia gpl20 zísaná z pHXB2-env plazmidu obsahujúceho gpl60 gén (NIH AIDS Research and Reagent Program, Rockville, MD) amplifikáciou plazmidu DNA s PCR a subklonovaním 1536-bp produktu sekvencovanie dideoxynukleotidovým spôsobom. Použitím 5' (zmysel) priméru zodpovedajúcemu prvému 21-bp HIVgpl20 génu ATGAGAGTGAAGGAGAAATAT a 3' (protizmysel) priméru zodpovedajúcemu nukleotidom 1515 až 1536 TGCTCTTTTTTCTCTCTGCAC, eliminovaním HIV go41 proteínu, je klonovaný gpl20 segment a amplifikovaný PCR. Navyše, každý primér je zboku chránený vhodnými reštrikčnými enzýmovanými miestami pre prispôsobenie viacnásobným klonovacím miestam pcDNA4-His expresného vektora. PCR produkt je ligovaný do pcDNA4-His obsahujúceho HD doménu ako plazmid s génovou kazetou (Invitrogen, Inc., San Diego, CA). Vyradené mutanty sú vytvorené PCR amplifikáciou použitím dvoch 5 'a 3' primérových párov, ktoré vylučujú nukleotidy kódujúc rezíduá v gpl20 proteíne; tieto zahŕňajú Δ136-151 gpl20, A128-194gpl20 a A123-203gpl20. Tieto priméry obsahujú vhodné reštrikčné enzýmové sekvencie umožňujúce ligáciu dvoch génových produktov. Každá mutácia je potom nahradená dvoma aminokyselinami kódovanými na určenom špecifickom reštrikčnom mieste. Výsledné gény sú overené sekvencovaním DNA použitím postupu a reagentov podľa súpravy AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a výsledky prebehli na súprave ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) sekvencovacieho zariadenia a boh analyzované súpravou AM Software v.3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Plazmidy sú transfekované do COS-1 buniek (ATCC, Rockville, MD) použitím DEAE-dextrán reagentu. Stabilné transfektanty sú selektované použitím Zeocin (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) a klonované limitujúcim roztokom. gP120-HD proteíny sú čistené podľa selektívnej afinity na niklovú väzbu na podklade z pevnej látky. Klony, ktoré produkujú vysoké hodnoty proteínu, sú stanovené škvmovou analýzou Western alebo FACS analýzou. Histidínová väzobná oblasť HIV(gpl20)-HD, HIV A136-151gpl20, HIV A128-194gpl20 a HIV A123-203gpl20 je odstránený enterokinázovým štiepením po ukončení čistenia. Ak je to nutné, pre ďalšie čistenie HIVgpl20 a HIV Agpl20-HD je vykonané veľkostné vylúčenie, iónová výmena alebo hydrofóbna interakčná chromatografia.

Príprava HIV-HD

Nukleotidová sekvencia kombinujúca tri epitopy (CTL, T nápomocná bunka a B bunka) je selektovaná zo sekvencii zistených v rôznych HIV proteinoch (KQDNMWQEVGKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK (SEQ ID NO. 19) a sú odvodené z tohto proteínu použitím E. coli kodónových preferencií (Looman et al., 1987, EMBO J. 6:2489). Syntetický gén kódujúci HIV sekvenciu je zložený syntézou, hybridizáciu, PCR a ligáciou prekrývajúcich sa oligonukleotidov. Zložený gén s úplnou dĺžkou kódujúci HIV fragmenty je amplifikovaný PCR a potom je ligovaný do expresného plazmidu. Výsledné gény sú overené sekvecovaním DNA.

HIV-HD obsahujúce pTrsHis plazmidy sú transformované do E.coli. Baktérie sú inkubované v prostredí LB ampicilínom (50 pg/ml) pri 37 °C až po medzikmeňovú fázu. Vtedy je pridané IPTG na vyvolanie trp/lac hybridového promótora. Sú skúmané časové body po hodinách pre určenie optimálnej poindukčnej expresie HIV-CD proteínov. V čase optimálnej expresie sú bunky zozbierané centriíugovaním. Bunkové pelety sú rozložené a centrifugované. Lyzát je stanovený na prítomnosť proteínu. HIV-HD proteíny sú čistené selektívnou afinitou na niklovú väzbu na podklade z pevnej látky. Ak je to nutné, pre ďalšie čistenie HIV-HD môže byť vykonané veľkostné vylúčenie, iónová výmena, alebo hydrofóbna interakčná chromatografia. Lipozómový preparát

Lipozómy sú pripravené prienikom ultrazvuku podľa už opísaných postupov (Fujii et al., 1997, Biochemistry 36:4959). Stručne, lipidy (s alebo bez proteínu) sú rozpustené v organickom rozpúšťadle, ako je chloroform/metanol. Tenké lipidové filmy sú vytvorené pipetovaním podielov lipidových roztokov do sklených trubíc s guľatým dnom a odparením rozpúšťadla pri 65 °C pod prúdom dusíka. Filmy sú umiestnené vo vákuu počas aspoň šiestich hodín na odstránenie zvyškového organického rozpúšťadla. Príprava lipozómov je uskutočnená hydratáciou lipidových filmov pufrom a inkubovanim suspenzie pri 65 °C počas 5-10 minút pred prienikom vibrácie ultrazvuku. Lipozómy sú podľa veľkosti dynamicky jemne rozptýlené, nasleduje vytvorenie agregátov po minimálne štyroch týždňoch.

Vakcinačné postupy a testovanie na vyvolanie imunitnej odpovede na vírusový antigén

BALB/c samice myší (6-8 týždňové) sú subkutánne vakcinované v prvom, štvrtom a ôsmom týždni prípravkom testovacej vakcíny alebo pufrom. Miesta injektovania sú monitorované na nepriaznivé reakcie, ako je vývoj granulómov a/alebo vytvorenie svrabu/oparu. Po imunizácii zvierat vakcínou cez intranazálnu cestu sú zvieratá anestetizované halotánom a testovacia látka (10 - 20 μΐ) je podávaná do nosných dierok na vdychovanie použitím sterilnej špičky na mikropipetore (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis. 168:622).

Meranie odpovedi protilátok pomocou ELISA

V pravidelných intervaloch počas vakcinačného postupu (napr. 1 x za týždeň) je meraná imunitná odpoveď myší na vírusový antigén. Lipozómy obsahujúce antigénny epitop sú použité tiež ako terče u protilátky/ELISA skúšky, ako už bolo opísané (Tuso et al., 1993, Transplantation 55:1375). Výsledky posledne uvedených skúšok sú použité na meranie úrovne viazania a izotopovej konfigurácie protilátok.

Skúška oneskoreného typu hypersenzitivity (DTH)

DTH odpoveď na vírusový antigén pri vakcinovaných myšiach je testovaná použitím skúšky na zadnej labe. Vakcinované zvieratá sú anestetizované halotánom a injektované do jednej zadnej laby 50 μΐ buď lipozomálneho antigénu, alebo antigénu bez lipozómu. Po dvadsiatich štyroch, štyridsiatich ôsmich a sedemdesiatich dvoch hodinách je meraný stupeň opuchu pri myšiach použitím Vemierovho hmatadla a porovnaný so základnými meraniami.

Analýza pre cytokiny špecifickej mRNA

T bunky imunizovaných a neimunizovaných zvierat sa skúmajú na hladiny na cytokiny špecifickej mR-NA pri väčšine cytokínov, ktoré môžu odrážať senzibilizáciu spojenú s imunizáciou vrátane IL-2, IFN-a, IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10. Slezinové T bunky sú izolované, ako už bolo opísané, 1 a 4 týždne po imunizácii. Celková RNA je izolovaná použitím modifikácie (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16) spôsobu opísaného Chomczynskym et al., 1987 Analyt. Biochem. 162:156. Čerstvé a zmrazené bunky (2 x 10⁶) sú rozrušené v 1 ml denaturovan roztoku (4 mM guanidín tiokyanát, 25 mM citrát sodný (pH 7,0), 0,5 % sarkozyl a 0,1 mM 2-merkaptoetanol). Koncentrácia celkovej RNA je upravená na 260 nM a vzorky sú uložené pri -80 °C do analýzy.

Analýza cytokínov je vykonaná použitím modifikácie (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16) spôsobu opísaného Chomczynskym et al., 1987 Analyt. Biochem. 162:156. Jednoreťazcová cDNA je pripravená transkripciou 2 pg celkovej RNA v 20 pl celkovej reakčnej zmesi použitím reverznej transkriptázy vírusu avian myeloblastosis (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Sekvenčné špecifické oligonukleotidové priméry pri murín cytokínoch (tabuľka 1) sú použité na amplifikáciu DNA fragmentov predeterminovanej veľkosti pre každý z uvažovaných cytokínových génov. PCR zmes obsahuje 1 pl cDNA, 2,5 pl PCR 10 x pufor, 1 pl každého z 5' a 3' primárov, 2,5 pl 10 x dNTP (2 mmol/1 a 0,125 pl T. aquaticus termostabilnej DNA polymerázy (Boehringer Mannheim) v konečnom objeme 25 pl. Špecifické α-aktín priméry sú použité na amplifikáciu 548 bp fragmentu ako vnútorná kontrola. PCR zmes je potiahnutá minerálnym olejom a amplifikácia vykonaná nasledujúcou inkubáciou zmesi počas 7 minút pri 94 °C, 38 cyklami s 30 sekundovou denaturáciou pri 94 °C, 45 sekundovým chladením primérov pri 60 °C, 60 sekundovým natiahnutím pri 72 °C a 7 minútovou inkubáciou pri 72 °C. PCR produkty sú separované na agarózovom geli v prítomnosti etídiabromidu. Pásy sú vizualizované pod UV svetlom, fotografované a denzitometricky kvantifikované z fotografie použitím softvérového balíka molekulového analyzátora (Bio-Rad, Richmond CA).

Cytokinové merania pomocou ELISA na slezinových T bunkách

Aktivita T buniek týchto zvierat je tiež meraná produkciou cytokínov v odpovedi na inkubáciu slezinových T buniek s vírusovým antigénom. Sleziny z vakcinovaných zvierat sú odobraté a slezinové homogenáty sú pripravené jemným rozložením slezín sterilným plunžerom a pretlačením buniek cez nylonovú mriežkovú sieťovinu. Suspenzie buniek sú prepláchnuté a rozložené pri 1 x 10⁵ buniek/jamka na 96-jamkovej mikrotitrovej doske. Nasledovala inkubácia buniek pri 37 °C počas 3 až 4 dní s rôznym množstvom vírusového antigénu, supematanty z jamiek sú zozbierané a testované na prítomnosť cytokínov. Komerčne dostupné cytokínové súpravy ELISA sú použité na definovanie cytokínového profilu. Zisťovanie proteínu cytokínu v supernatantoch tkanivovej kultúry vložením ELISA je vykonané použitím monoklonálnych protilátok (mAb) špecifických pre jednotlivé cytokiny. Stručne, ELISA dosky sú potiahnuté cez noc potkaním antimyším cytokínom mAb. Dosky sú blokované 3 % fetálnym teľacím sérom v PBS počas dvoch hodín, potom sú podiely každej testovanej vzorky pridané do každej jamky. Cytokinový špecifický biotinylovaný potkaní antimyší mAb je pridaný do každej jamky s následným pridaním avidínperoxidázy. Farebná reakcia je dosiahnutá pridaním kolorimetrických substrátov. Dosky sú odčítané v ELISA spektrofotometri a koncentrácie cytokínov sú vypočítané zo štandardnej krivky získanej z kontrolných rekombinantov cytokínov. Všetky cytokinové súpravy ELISA (IL-2 , IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-α a TNF-α sú zakúpené od PharmMingen, Inc. (San Diego, CA).

Antigénom vyvolaná proliferácia T buniek

Senzibilizácia hostiteľa na HIV antigény je meraná použitím antigénom vyvolanej proliferácie T buniek. Slezinové homogenáty sú izolované, ako už bolo opísané. Bunky sú suspendované v prostredí RPMI 1640 obsahujúcom 10 % fetálne teľacie sérum (FCS), 10 mM Hepes pufor, L-glutamín (2mM), penicilín (25 IU/ml), streptomycín (25 pg/ml) a gentamycín (80 pg/1). Bunky sú kultivované pri koncentrácii 1 x 10⁶ bu15 niek/ml s alebo bez H1V-HD peptidu (5 pg/ml) na 96-jamkovej doske s dnom v tvare U počas 3-4 dní v 5 % CO₂. Kultúry sú pulzované 20 μΐ rezazurínového farbiva počas 3 hodín a potom je meraná fluorescencia na Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc. Farmington, MA).

Anti-HIV CTL odpovede

Po vakcinácii je stanovená prítomnosť pre antigén špecifických cytotoxických T lymfocytov (CTL) v slezinových T bunkách. Slezinové lymfocyty sú získané, ako už bolo opísané. Lymfocyty z každej liečenej skupiny sú zložené (n=5) a potom kultivované počas 3 dní bez antigénu pri 10⁷ buniek/jamka na 12-jamkovej kultivovacej doske. L5198Y lymfóm (H2^ŕ/) terčové bunky (ATTC) sú inkubované peptidom zodpovedajúcim HIV CTL epitopu pre H2^rf reštrikčné bunky a inkubované počas 4 hodín pri 37 °C. Terče sú premyté a 100 μΐ titre obsahujúce 1 x 10⁴ buniek sú pridané do každej jamky. Efektorové lymfocyty sú premyté, pridané do jamiek pri rôznych koncentráciách a kultivované počas 4 hodín pri 37 °C. Použitím súpravy CytoTox 96 (Promega, Madison WI) je vypočítaná percentuálna špecifická lýza zo supematantu laktát dehydrogenázy (LDH) meraná v štandardnom ELISA doskovom odčítači (HTS 7000+ Bio Assay Reader, perkin Elmer, San Jose, CA) zaznamenaním absorbancie pri 490 nm. Určenie HSV2-antigén špecifickej lýzy je urobené podľa štandamých kritérií. Údaje sú vyjadrené ako percentá špecifickej lýzy = 100 x [(experimentálna - efektorová spontánna - terčová spontánna)/(terčová maximum - terčová spontánna)].

Príklad IV - Influenza vírus (INFV)

Príprava INFV-HD

Nukleotidová sekvencia vybraných epitopov je odvodená od proteínovej sekvencie použitím E.coli kodónových preferencií (Looman et al., 1987, EMBO J. 6:2489). Antigénna sekvencia (sekvencie) včlenená do génovej kazety zodpovedá epitopom z NP (147-161, TYQRTRALVRTGMDP; 55-69 (SEQ ID NO.20), RLIQNSLTIERMVLS (SEQ ID NO.21) a HA (91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASL (SEQ ID NO.22)). Kombinačná epitopová vakcína môže byť konštruovaná zložením z T-B epitopu, ako je zaznamenané u Brumeanu et al., 1997 (HA 110-120/HA 150-159, SFERFEIPKEGGWLTEKEGYSP (SEQ ID NO.23)) (Brumeanu et al., 1997, J. Virol. 71:5473). Po získaní príslušnej sekvencie (sekvencii) je syntetický gén kódujúci INFV-HD zložený syntézou, hybridizáciu, PCR a ligáciou prekrývajúcich sa oligonukleotidov. Zložený gén s úplnou dĺžkou kódujúci INFV fragmenty je amplifikovaný PCR a potom je ligovaný do expresného plazmidu. Výsledné gény sú overené sekvecovaním DNA.

INFV-HD obsahujúce pTrsHis plazmidy sú transformované do E. coli. Baktérie sú inkubované v prostredí LB ampicilínom (50 pg/ml) pri 37 °C až po medzikmeňovú fázu. Vtedy je pridané IPTG na vyvolanie trp/lac hybridového promótora. Sú skúmané časové body po hodinách na určenie optimálnej poindukčnej expresie INFV-HD proteínov. V čase optimálnej expresie sú bunky zozbierané centrifugovanim. Bunkové pelety sú rozložené a centrifugované. Lyzát je stanovený na prítomnosť proteínu. INFV-HD proteíny sú čistené selektívnou afinitou na niklovú väzbu na podklade z pevnej látky. Ak je to nutné, na ďalšie čistenie INFVHD môže byť vykonané veľkostné vylúčenie, iónová výmena, alebo hydrofóbna interakčná chromatografia. Model vírusovej infekcie INFV kmeň použitý na ukázanie efektívnosti vakcíny je preusporiadač A/PR/8/34 vírusu nazvaný PR8. Vírus je kultivovaný v 10 až 12-dňových embryonovaných kuracích vajciach alantoinovým očkovaním, po čom nasleduje inkubácia pri 37 °C vo váhadle počas 40 - 48 hodín a 20 - 24 hodín pri 4 °C a potom je získaný späť z alanotinovej kvapaliny. Vírusová hemoglutinačná analýza s 0,5 % červených rviniek kuriatok bude vykonaná na 96-jamkových mikrotitrových miskách na určenie hemoglutinačných jednotiek (HAU)/ml vírusového rodu.

Na BALB/c myšieho modelu bolo ukázané, že 1200 HAU z kmeňa PR8, podávané nazálne sterilnou špičkou mikropipetora metafánom anestetizovaným myšiam (20 μΐ), produkovalo vyložené symptómy infekcie na štvrtý deň, znižovalo mobilitu, bez úpravy bola strata 20 % telesnej hmotnosti a smrť do dvoch týždňov. Použitím MDCK cytolýznej analýzy vykonanej na 96-jamkových mikrotitrových miskách s 50 % koncovým bodom bol zistený vysoký titer infekčného vírusu, ktorý bol prítomný v pľúcnych homogenátoch, pripravený štyri dni po infekcii.

Vakcinačné postupy a testovanie na vyvolanie imunitnej odpovede na vírusový antigén

BALB/c alebo C57BL/6 samice myší (6-8 týždňové) sú subkutánne injektované v prvom, štvrtom a ôsmom týždni prípravkom testovacej vakcíny alebo pufra. Miesta injektovania sú monitorované na nepriaznivé reakcie, ako je vývoj granulómov a/alebo vytvorenie svrabu/oparu. Keď sú zvieratá imunizované vakcínou cez intranazálnu cestu, sú anestetizované halotánom a kompozícia (10 - 20 μΐ) je podávaná do nosných dierok napríklad použitím sterilnej špičky mikropipetora (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis. 168:622).

RP-PCR zisťovanie INFV RNA v pľúcnom tkanive

RT-PCR zisťovanie INFV RNA je vykonané na pľúcach experimentálnych zvierat odobratých štyri dni po vírusovom podnete na stanovenie účinnosti imunizácie na prevenciu vírusovej infekcie. Pľúcne vzorky odobraté z myší sú rýchle zmrazené, rozomleté a zmrazený prášok je uložený pri -70 °C do spracovania na vyhodnotenie. Izolovanie celkovej RNA a RT-PCR analýza na vírusové RNA je vykonaná použitím modifikácie už opísaných techník (Chomczynsky et al., 1987, Analyt. Biochem. 162:156; Shirwan et al., 1993, J. Immunol. 151:5228, Lakeman a Whitley, 1995, J. Inf. Dis. 171:857). Použité priméry sú špecifické pre matrixový gén (segment 7) influenza vírusu A (Atmar et al., 1996, J. Clin. Microbiol. 34:2604). RT-PCR analýza je vykonaná použitím reagentov a postupu Titan One Tube RT-PCR systému (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Stručne, 1 pg až 1 pg chemického vzoru celkovej RNA je inkubovaný v prítomnosti 0,2 mM dNTP, 0,4 μΜ protizmyslového priméru FAM1 (5 -CAGAGACTTGAAGATGTCTTTGC-3 '(SEQ ID NO.24)), 0,4 μΜ zmyslového priméru, FAM2 (5 '-GCTCTGTCCATGTTATTTGGA-3 '(SEQ ID NO.25)), 5 mM DTT, 5 U Rnase inhibítora, 1,5 mM MgCl₂, a AMV/Expand High Fidelity enzýmov pri nasledujúcich podmienkach: jeden cyklus pri 60 °C počas 30 minút; pri 94 °C počas 2 minút; desať cyklov pri 94 °C počas 30 sekúnd; pri 55 °C počas 30 sekúnd; pri 68 °C počas 45 sekúnd; dvadsaťpäť cyklov pri 94 °C počas 30 sekúnd; pri 55 °C počas 30 sekúnd; pri 68 °C počas 45 sekúnd zvyšovaním po piatich sekundách pri každom cykle; po čom nasledoval jeden cyklus pri 68 °C počas 7 minút. Pozitívny výsledok je založený na viditeľnom páse 212 bp v 1,5 % NiSieve-agaróza géli (FMC Bioproducts, Rocjkland, ME) zafarbenom etidium bromidom a fotografovaným UV transiluminátorom (BioRad Gel Doc 1000). Tento spôsob bol ukázaný ako senzitívny a vysoko špecifický na meranie prítomnosti vírusového DNA (Lakeman and Whitley, 1995, J. Inf. Dis. 171:857).

Sekvencia HA1 domény

HA1 doménová (segment 4) sekvencia môže byť objasnená amplifíkáciou HA1 domény z vírusovej RNA v RT-PCR reakcii, potom bol 1 100 bp produkt subklonovaný pre sekvencovanie a sekvencovaný použitím spôsobu dideoxynukleotidovej terminácie. RT-PCR analýza je vykonaná použitím Titan One Tube RT-PCT systému, ako bol uvedený s nasledujúcimi rozdielmi; amplifíkačné priméry sú cDNA primér (5'-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAAG3') (SEQ ID NO26)) a PCR pnrrér (5'-CAATGAAACCGGCAATGGCICC-3') (SEQ1DNO27)) (Pylala et al., 1995 J. Gen. Virol. 76:205), tieto podmienky budú jeden cyklus pri 60 °C počas 30 minút; pri 94 °C počas 2 minút; desať cyklov pri 94 °C počas 30 sekúnd; pri 60 °C počas 30 sekúnd; pri 68 °C počas 45 sekúnd; dvadsaťpäť cyklov pri 94 °C počas 30 sekúnd; pri 60 °C počas 30 sekúnd; pri 68 °C počas 45 sekúnd zvyšovaním po piatich sekundách pri každom cykle; po čom nasledoval jeden cyklus pri 68 °C počas 7 minút. 1100 bp produkt je subklonovaný do TA PCR 2,1 klonovacieho vektora (Invitrogen, Carlsbad, CA) pre nasledujúce sekvencovanie. Sekvencovanie je vykonané použitím postupu a reagentov zo súpravy AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) sekvencovacieho zariadenia a boli analyzované súpravou AM Software v.3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Meranie odpovede protilátok pomocou ELISA

V pravidelných intervaloch počas vakcinačného postupu je meraná imunitná odpoveď myší na vírusový antigén. Lipozómy obsahujúce antigénny epitop sú použité tiež ako terče u protilátky/ELI SA skúšky, ako už boli opísané (Tuso et al., 1993, Transplantation 55:1375). Výsledky posledne uvedených skúšok sú použité na meranie úrovne viazania a izotopovej konfigurácie protilátok.

Antigénom vyvolaná proliferácia T buniek

Senzibilizácia hostiteľa na INF V antigény je meraná použitím antigénom vyvolanej proliferácie T buniek. Sleziny sú odobraté z vakcinovaných myší a homogenáty sú pripravené jemným rozložením slezín sterilným plunžerom a pretlačením buniek cez nylonovú mriežkovú sieťovinu. Bunky sú suspendované v prostredí RPMI 1640 obsahujúcom 10 % fetálne teľacie sérum (FCS), 10 mM Hepes pufor, L-glutamín (2mM), penicilín (25 IU/ml), streptomycín (25 pg/ml) a gemtamycín (80 pg/ml). Bunky sú kultivované pri koncentrácii 1 x 10⁶ buniek/ml s alebo bez chemicky syntetizovaných peptidov zodpovedajúcich antigénu (5 pg/ml) na 96-jamkovej doske s dnom v tvare U počas 4 dní v 5 % CO₂. Kultúry sú pulzované 20 μΐ rezazurínového farbiva počas 3 hodín a potom je meraná fluorescencia na Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc. Farmington, MA).

Anti-INFV CTL odpovede

Po vakcinácii je stanovená prítomnosť pre antigén špecifických cytotoxických T lymfocytov (CTL) v slezinových T bunkách. Slezinové lymfocyty sú získané, ako už bolo opísané. Lymfocyty z každej liečenej skupiny sú zložené (n=5) a potom kultivované počas 3 dní bez antigénu pri 10' buniek/jamka na 12-jamkovej kultivovacej doske. P815 mastocytóm alebo L5178 lymfóm (H2^Ä) terčové bunky (ATTC) sú inkubované peptidom zodpovedajúcim INFV NPCTL epitopu (aminokyseliny 147-158) pre H2^Ŕ reštrikčné bunky a inkubované počas 4 hodín pri 37 °C. Terče sú premyté a 100 μΐ titre obsahujúce 1 x 10⁴ buniek sú pridané do každej jamky. Efektorové lymfocyty sú premyté, pridané do jamiek pri rôznych koncentráciách a kultivované počas hodín pri 37 °C. Použitím súpravy CytoTox 96 (Promega, Madison WI) je vypočítaná percentuálna špecifická lýza zo supematantu laktát dehydrogenázy (LDH) meraná v štandardnom ELISA doskovom odčítači (HTS 7000+ Bio Assay Reader, perkin Elmer, San Jose, CA) zaznamenaním absorbancie pri 490 nm. Určenie HSV2-antigén špecifickej lýzy je urobené podľa štandamých kritérií. Údaje sú vyjadrené ako percentá špecifickej lýzy = 100 x [(experimentálna - efektorová spontánna - terčová spontánna)/(terčová maximum - terčová spontánna)].

Príklad V - netypická H. influenzae (NTHi) a H. influenzae typu b (Hib)

Klonovanie NTHi proteínov

Úplná dĺžka génovej sekvencie kódujúca P6 je získaná z kmeňa NTHi pomocou RT-PCR amplifikácie P6 mRNA (Deich et al., 1988, J. Bacteriol. 170:489; Nelson et al., 1988, Inf. Immun. 56:128, Looman et al., 1987, EMBO J. 6:2489). Amplifikácia je vykonaná použitím reagentov a postupu systému Titan One Tube RT-PCR (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Stručne, baktérie sú inkubované v prítomnosti 0,2 mM dNTP, 0,4 μΜ protizmyslového priméru H-InvíP6AS (5 '-GAGTCCGCTGCTCTACCAAC-3 (SEQ ID NO.28)), 0,4 μΜ zmyslového priméru H-InvfP6S (5'-AATTTCCAGCTTGGTCTCCA-3'(SEQ ID NO.29)), mM DTT, 5 U Rnase inhibítora, 1,5 mM MgCl₂, a AMV/Expand High Fidelity enzýmov pri nasledujúcich podmienkach: jeden cyklus pri 60 °C počas 30 minút; pri 94 °C počas 2 minút; desať cyklov pri 94 °C počas 30 sekúnd; pri 55 °C počas 30 sekúnd; pri 68 °C počas 45 sekúnd; dvadsaťpäť cyklov pri 94 °C počas 30 sekúnd; pri 55 °C počas 30 sekúnd; pri 68 °C počas 45 sekúnd zvyšovaním po piatich sekundách pri každom cykle; po čom nasledoval jeden cyklus pri 68 °C počas 7 minút. Pozitívny výsledok je založený na viditeľnom páse 867 bp v 1,5 % NiSieve-agaróza géli (FMC Bioproducts, Rocjkland, ME) zafarbenom etidium bromidom a fotografovaným UV transiluminátorom (BioRad Gel Doc 1000). PCR produkt je subklonovaný pre sekvencovanie do TA 2,1 vektora použitím reagentov a postupu TA Klonovacej súpravy (Invitrogen, Carlsbad, CA). Malorozmerová príprava plazmidu je vykonaná použitím spôsobu štandardnej alkalickej lýzy (Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Sambrook, Fritsch, maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, s. 125). Vložka PCR produktu je sekvencovaná podľa konvenčného spôsobu dideoxynukleotidovej terminácie použitím postupu a reagentov zo súpravy AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a výsledky prebehli na ALFExpress II (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) sekvencovacieho zariadenia a boli analyzované s AlfWin Sequence Analyser softwarom 2,0 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Príprava NTHi(P6)-HD

Po získaní kódujúceho génu P6 je syntetický gén kódujúci NTHi(P6)-HD zložený syntézou, hybridizáciu, PCR a ligáciou prekrývajúcich sa oligonukleotidov. HD segment je pridaný na konci buď N-, alebo C-proteínu prostredníctvom väzobnej oblasti zloženého z glycínu a serínu. Toto nám umožňuje testovať účinok, ktorý má toto umiestnenie HD vo vzťahu k antigénu na vývoj imunitného systému. Zložený gén s úplnou dĺžkou kódujúci NTHi(P6)-HD fragment je amplifikovaný PCT a ligovaný do expresného plazmidu. Výsledný gén je overený sekvencovaním DNA.

NTHi(P6)-HD obsahujúci plazmid je transformovaný do E. coli

Baktérie sú inkubované v prostredí LB ampicilínom (50 pg/ml) pri 37 °C až po medzikmeňovú fázu. Vtedy je pridané IPTG na vyvolanie trp/lac hybridového promótora. Sú skúmané časové body po hodinách pre určenie optimálnej poindukčnej expresie NTHi(P6)-HD proteínov. V čase optimálnej expresie sú bunky zozbierané centrifugovaním. Bunkové pelety sú rozložené a centrifugované. Lyzát je stanovený na prítomnosť proteínu. 1 - 2 % roztok roztoku deoxycholátu sodného je použitý na extrakciu NTHi(P6)-HD proteínu z lyzovanej bunkovej pelety. NTHi(P6)-HD je potom čistený selektívnou afinitou na niklovú väzbu na podklade z pevnej látky. Ak je to nutné, pre ďalšie čistenie NTHi(P6)-HD môže byť vykonané veľkostné vylúčenie, iónová výmena alebo hydrofóbna interakčná chromatografia.

Príprava lipozómov

Vo všeobecnosti existujú tri prístupy na prípravu stabilných NTHi(P6)-HD lipozómov. V prvom, sú formulované lipozómy tak, že protein a lipidy sú spolu rozpustené v organickom rozpúšťadle (chloroform/metanol) a potom sušené na tenký film. Po resuspendácii vo vodnom pufrí sú lipidy a protein zložené do dvojvrstvových štruktúr. Suspenzia je potom vibrovaná utrazvukom pre vytvorenie malých unilamelámych vezikúl (SUV). Pri menších proteínových jednotkách tento spôsob pracuje veľmi dobre. Ale pre tieto experimenty môže byť nežiaduce vystaviť protein tvrdým podmienkam rozpúšťadla kvôli potenciálu denaturácie proteínu. Teda, pre zabránenie štruktúrnym zmenám môže byť použitý druhý spôsob, ktorý zahrnuje rozpustenie NTHi(P6)-HD v resuspenzačnom pufri pre hydratáciou lipidového filmu. Po hydratácii lipidmi, sa protein spontánne spája s novo vytvorenou membránou a začleňuje sa do dvojvrstvy SUV počas vibrácie ultrazvukom. Tretí spôsob zahrnuje pripravenie lipozómov bez NTHi(P6)-HD proteínu a potom ich pridanie do už vytvoreného SUV, umožňujúc HD integrovať sa do lipidovej dvojvrstvy. Lipozómy sú pripravené prienikom ultrazvuku podľa v predošlom opísaných postupov (Fujii et al., 1997, Biochemistry 36:4959). Stručne, lipidy (s alebo bez proteínu) sú rozpustené v organickom rozpúšťadle, ako je chloroform/metanol. Tenké lipidové filmy sú vytvorené pipetovaním podielov lipidových roztokov do sklených trubíc s guľatým dnom a odparením rozpúšťadla pri 65 °C v prúde dusíka. Filmy sú umiestnené vo vákuu po aspoň dobu ôsmich hodín pre odstránenie zvyškového organického rozpúšťadla. Alternatívne, lipidové prášky žiaducej koncentrácie môžu byť pripravené technikou tak, že sú sprejovo sušené a potom použité namiesto lipidových filmov. Príprava lipozómov je uskutočnená hydratáciou lipidových filmov alebo práškov v pufri a inkubovaním suspenzie pri 65 °C počas 5-10 minút pred prienikom vibrácie ultrazvuku. Lipozómy sú potom filtrované cez 0,22 pm filter pre sterilizáciu prípravku. Lipozómy sú podľa veľkosti dynamicky jemne rozptýlené a po minimálne štyroch týždňoch nasleduje vytvorenie agregátov. Je možné, že vytvorenie štruktúry NTHi(P6)-HD proteínu vyžaduje jeho udržovanie. Potom z troch prístupov, ktoré môžu byť použité na prípravu lipozómov, navrhujeme, že preferovaným môže byť buď pridanie proteínu ako zložky hydratačného roztoku, alebo pridanie lipozómov po ich vytvorení.

Bakteriálne kmene

NTHi kmene 9333 (fluidný izolát chrbticového výbežku), 35056 (izolát infekcie horných dýchacích ciest), 43095 (izolát zápalu ucha), 49766 (izolát abscesu pľúc, referenčný kmeň pre testovanie antimikróbnej citlivosti) (ATCC) a Hib kmeň 51654 (ATCC) boli použité na ukázanie efektívnosti pri bakteriálnom infekčnom modeli. Pred použitím je zmrazený rod organizmu subkultivovaný v čerstvej živnej pôde Brain Heart Infusion dodanej s NAD (2pg/ml) a hémou (10 pg/ml) a inkubovaný počas 24 hodín pri 37 °C s 10 % oxidom uhličitým. Štandardná krivka pre každý organizmus skladajúca sa z kolónie vytvárajpúcej jednotky proti zakaleniu pri 480 nm je použitá na úpravu očkovacej látky baktérii vyžadovaných pri buď baktericídnych analýzach, alebo podnete intraperitoneálnou dávkou.

Vakcinačné postupy a testovanie na vyvolanie imunitnej odpovede na vírusový antigén

Skupiny nedospelých myší (n=6 na skupinu) sú imunizované na piaty, dvanásty, devätnásty a dvadsiaty šiesty postnatálny deň alebo piaty a dvadsiaty šiesty postnatályn deň prípravkom testovacej vakcíny alebo pufra. Systemická vakcinácia potkanov je urobená subkutánnym injektovaním lipozomálnych vakcín. Keď sú zvieratá imunizované vakcínou cez intranazálnu cestu, sú anestetizované metofánom a testovacia kompozícia (20 pl) je podávaná použitím sterilnej špičky na mikropipetore (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis. 168:622). Nedospelé potkany sú umiestnené so svojimi opatrujúcimi matkami a monitorované na nepriaznivé reakcie vakcinačnej procedúry, ako je vytvorenie granulómov, oparu alebo svrabu na mieste očkovania. Jeden týždeň po poslednej vakcinácii sú nedospelé potkany anestetizované halotánom a krv je zozbieraná kardiotickým prepichnutím a mukozálne cesty premyté soľou pre zozbieranie mukozálnych sekrétov. Zvieratá sú eutanázované oxidom uhličitým. Titre baktericídnej protilátky v sére a mukozálnom fluide sú merané, ako bude opísané.

Na štúdiu intraperitoneálneho podnetu sú nedospelým potkanom (26-dňové) podané baktérie a ich krv a CSF sú monitorované na bakteriálnu záťaž v porovnaní s nevakcinovanými potkanmi. Vzorkovanie krvi a CSF na baktérie dva dni po podnete uvádza, že pri zvieratách je výrazná bakteriálna záťaž (t. j. 1 x 10⁴CFU/ml krvi; 1 x 10⁴CFU/ml CSF). Sérum z vakcinovaných 26-dňových potkanov obsahujúce vysoké titre baktericídnych protilátok je podávané intravenózne 6-dňovým potkanom. Nasledujúci deň dostanú nedospelé potkany (n=10) intraperitoneálnu dávku NTHi, ako bude opísané. Nedospelé potkany sú potom monitorované na morbiditu a mortalitu, prežijúce sú eutanázované po 26 dňoch a krv a CSF sú zozbierané a kultivované na prítomnosť NTHi.

Intraperitoneálny podnet s NTHi hodín stará kultúra in vivo preniknutá NTHi je upravená na 5 x 10⁷ - 5 x 10⁹ CFU/tnl a 100 pl tejto kultúry je injektované intraperitoneálne 5-10 dňovým potkanom (Smith et al., 1973, Inf. Immun. 8:278). Injektované nedospelé potkany ostanú po očkovaní so svojimi ošetrujúcimi matkami. Do 18-96 hodín po podnete zomiera minimálne 90 % týchto nedospelých potkanov použitím dávky s prienikom baktérií.

Meranie odpovedí protilátky špecifickej pre antigén pomocou ELISA

Vzorky séra a mukozálne vzorky z každého potkana sú testované na IgG a IgA protilátky špecifické pre P6 antigén. P6 pochádzajúci z klonovania alebo NTHi(p6)-HD proteín je pridaný na príslušne upravené 96-jamkové dosky na inkubáciu cez noc pri izbovej teplote. Dosky sú blokované 1 % bovínovým sérom albumínu v diuhličitanovom pufri, pH 9,6 počas 30 minút pri 37 °C. Dosky sú potom premyté 0,05 % Tween 20/PBS. Riedidlo každého séra a mukozálna vzorka sú pridané do antigénom potiahnutých dosiek, po čom nasleduje inkubácia počas 2 hodín pri 37 °C a premytie Tween/PBS pufrom na konci tejto inkubácie. Alkalickou fosfatázou viazané monoklonálne protilátky špecifické pre potkanie IgG alebo IgA sú pridané do ja19 miek počas jednej hodiny pri 37 °C. Jamky sú potom premyté Tween/PBS pufrom a PNPP substrátom v dietanolamínovom pufri, pH 9,5 pridaným do jamiek pre iniciovanie kolorimetrickej reakcie. Reakcie sú zastavené 0,75 N hydroxidom sodným a odčítané pri 405 nm v Spectramax ELISA doskovom odčítači. Koncentrácie IgG a IgA potkanov sú vypočítané zo štandardnej krivky získanej z kontrolných vzoriek známych koncentrácií potkaních IgG a IgA potiahnutých na 96-jamkových doskách a liečených, ako už bolo opísané. Analýza baktericídnych protilátok

Sérum vzoriek, ktoré je testované na prítomnosť baktericídnych protilátok, je inkubované pri 56 °C počas 30 minút na inaktiváciu komplementu. Testovacie séra sú potom viacnásobne riedené vo fosfátovej pufrovej soli (PBS). 24-hodinová pufrová kultúra je upravená na 5 x 10⁴CFU/ml v sterilnom PCM pufri zloženom z PBS s 0,15 mM CaCl₂ a 1 mM MgCl₂ obsahujúcom bovínové sérum albumínu (BSA). Séra nevakcinovaných nedospelých potkanov sú použité ako zdroj komplementu. Toto sérum je zložené, rozdelené do podielov a uložené pri -70 °C do použitia. Baktérie (20 μΐ), viacnásobne riedené sérum (20 μΐ), komplement (20 μΐ) a 40 μΐ 1 % BSA v PCM pufri je pridané do každej jamky 96-jamkovej klasterocej dosky. Na zistenie počiatočnej bakteriálnej koncentrácie je 10 μΐ podielov vzorkovej zmesi potiahnuté v čase nula na čestvé BHI agarové dosky obsahujúce nutričný agar a doplnené NAD a hémou. Po inkubácii reakčnej zmesi pri 37 °C s 10 % oxidom uhličitým počas jednej hodiny s trepaním je 10 μΐ z každej jamky potiahnuté v dvoch vyhotoveniach a inkubované cez noc pri 37 °C v prítomnosti 10 % oxidu uhličitého pre určenie CFU/jamka. Kontrolné zahrnujú jamku bez séra na zaistenie toho, že samostatný komplement nezabíja baktérie, a jamka s testovacím sérom, ale bez komplementu, zaisťuje, že sérový komplement v testovacej vzorke bol úspešne inaktivovaný. Všetky analýzy sú urobené v troch vyhotoveniach a tieto riedidlá produkujúce 50 % zabitie baktérií sú použité na porovnanie aktivity medzi rôznymi sérami.

Príklad VI - vírus hepatitídy C

Príprava HCV(E2/NS1)-HD a HCV(E2/NS1AHVR1)-HD v CHO bunkách

Nukleotidová sekvencia HCV E2/NS1 proteín je odvodená z PCR amplifikácie kmeňa HCV získaného, ako už bolo opísané. Použitím 5' priméru zodpovedajúcemu prvým 21 bp z E2/NS1 génu CAAACCATGATCGCCCACGGA a 3'priméru zodpovedajúcemu rezíduám 622 až 628, GAAGTTGACAGTGCAGGGGTA eliminujúcim transmembránovú doménu (Coquerel, L. et al., 1998, J. Virol. 72(3):2183:91). PCR produkt je ligovaný do pcDNA3,lHis obsahujúceho HD doménu ako plazmid s génovou kazetou (Invitrogen, Inc., San diego, CA). HCV(E2/NS1AHVR1)-HD je konštruovaný zrušením HVR1 z E2/NS1 génu zodpovedajúcemu prvým 27 aminokyselinám z rezídua 384 až rezíua 410. Zrušenie mutanta je vytvorené pomocou PCR amplifikácie použitím 5'priméru CAACTCATCAACACCAATGGC a rovnakého 3 'priméru použitého pre neviazaný typ kontroly. Výsledné gény sú overené sekvencovaním DNA. Plazmidy sú transfekované do CHO buniek (Deen, K. C. et al., 1988, náture 331:82) (ATCC, Rockville, MD) použitím lipofekčného reagenty (Lipofectamine, Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) podľa výrobcom odporúčaného postupu. Stabilné transfektanty sú selektované použitím G418 (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) a klonované limitujúcim riedidlom. Identifikácia klonov, ktoré produkujú vysoké hladiny proteínu, sú stanovené škvmovou analýzou Western. HCV (E2/NS1)-HD a HCV(E2/NS1AHVR1)-HD proteíny sú čistené selektívnou afinitou na niklovú väzbu na podklade z pevnej látky. Histidínová väzobná oblasť je odstránená enterokinázovým štiepením po ukončení čistenia. Ak je to nutné, pre ďalšie čistenie HCV(E2/NS1)-HD a HCV(E2/NS1AHVR1)-HD proteínov je vykonané veľkostné vylúčenie, iónová výmena alebo hydrofóbna interakčná chromatografia.

Príprava HCV(HVR1)-HD a HCV©-HDproteínov v E.coli

Nukleotidové sekvencie vybraných epitopov sú odvodené z proteínovej sekvencie použitím E. coli kodónových preferencií (Looman et al., 1987, EMBO J. 6:2489). Antigénna sekvencia (sekvencie) včlenená do génovej kazety zodpovedá epitopom z NP (147-161, TYQRTRALVRTGMDP; 55-69, RUQNSLTIERMVLS) a HA (91-108, SKAFSNCYPYDVPDYAS). Po získaní príslušnej sekvencie (sekvencii) je syntetický gén kódujúci HCV-HD, obklopený vhodnými reštrikčnými miestami, zložený syntézou, hybridizáciu, PCR a ligáciou prekrývajúcich sa oligonukleotidov. Stručne, zloženie fragmentov je dosiahnuté zohriatím na 65 °C a ochladením oligonukleotidov na izbovú teplotu. Po inkubácii počas 2 minút na ľade sú fragmenty ligované s DNA ligázou. Zložený gén s úplnou dĺžkou kódujúci HCV fragmenty je amplifikovaný PCR, rozštiepený reštrikčnými enzýmami a izolovaný gélovou elektroforézou. HCV gén je potom ligovaný do podobne rozštiepeného expresného plazmidu obsahujúceho HD gén (napr. pTrcHis alebo pQE30). Výsledné gény sú overené sekvencovaním DNA.

HCV-HD obsahujúce plazmidy sú transformované do E. coli, baktérie sú ikubované v prostredí LB ampicilínom (50 pg/ml) pri 37 °C až po medzikmeňovú fázu. Vtedy je pridané IPTG na vyvolanie trp/lac hybridového promótora. Sú skúmané časové body po hodinách na určenie optimálnej poindukčnej expresie HCV-HD proteínov. V čase optimálnej expresie sú bunky zozbierané centrifugovaním. Bunkové pelety sú rozlo20 žené a centrifugované. Lyzát je stanovený na prítomnosť proteínu. HCV-HD proteíny sú čistené selektívnou afinitou na niklovú väzbu na podklade z pevnej látky. Ak je to nutné, pre ďalšie čistenie HCV-HD môže byť vykonané veľkostné vylúčenie, iónová výmena alebo hydrofóbna interakčná chromatografia

Lipozomálna preparácia a vakcinačné postupy, testovanie vyvolania imunitnej odpovede, ELISA merania odpovede protilátky, DTH analýzy, analýza pre cytokín špecifickej mRNA, ELISA merania cytokínov, antigénom vyvolaná proliferácia T buniek a anti HIV-CTL odpovede sú v podstate také, ako boli opísané v príklade III.

Claims (22)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Imunogénna lipozómová kompozícia obsahujúca lipidy vytvárajúce vezikuly a antigénny proteínový konštrukt, vyznačujúci sa tým, že antigénny proteínový konštrukt je vo vode rozpustný fuzny produkt obsahujúci jeden alebo viac antigénnych determinantov a hydrofóbnu doménu, pričom hydrofóbna doména je spojená s membránou lipozómovej kompozície.
2. 2. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje jednu alebo viac pomocných látok.
3. 3. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že antigénny konštrukt je chemicky syntetizovaný.
4. 4. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že hydrofóbnou doménou je peptid.
5. 5. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že hydrofóbna doména pozostáva z asi 15 až asi 500 aminokyselinových zvyškov.
6. 6. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že hydrofóbna doména obsahuje jednu alebo viac aminokyselín vybraných zo skupiny pozostávajúcej z Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, íle, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tpr, Tyr a Val.
7. 7. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že antigénny determinant je odvodený z antigénu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z HSV gB alebo gD, HIV gpl20, CMV gB, HCV E2, INFV HA alebo NA a H. influenzae P6.
8. 8. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že antigénny konštrukt ďalej obsahuje väzobnú oblasť spájajúcu antigénne determinanty s hydrofóbnou doménou.
9. 9. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým, že väzobnou oblasťou je peptid.
10. 10. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že väzobná oblasť pozostáva z 1 až asi 200 aminokyselinových zvyškov.
11. 11. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že aminokyselinové zvyšky sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, íle, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr a Val.
12. 12. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje antigénny konštrukt obsahujúci jeden alebo viac antigénnych determinantov a hydrofóbnu doménu a farmaceutický prijateľný nosič.
13. 13. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že antigénny konštrukt ďalej obsahuje väzobnú oblasť spájajúcu jeden alebo viac antigénnych determinantov s hydrofóbnou doménou.
14. 14. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje jednu alebo viac pomocných látok.
15. 15. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že jeden alebo viac antigénnych determinantov je antigénny determinant z bakteriálneho patogénnu alebo toxínu, vírusového patogénnu, plesňového patogénnu alebo parazitálneho patogénnu.
16. 16. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov na použitie na imunizáciu hostiteľského zvieraťa.
17. 17. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov na použitie na vyvolanie imunogénnej odpovede u hostiteľského zvieraťa.
18. 18. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 16 alebo 17, kde hostiteľským zvieraťom je cicavec.
19. 19. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 18, kde hostiteľským cicavcom je človek.
20. 20. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 19, vyznačujúca sa tým, že antigénny determinant je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z HSV gB alebo gD, HIV gpl20, CMV gB, HCV E2, INFV HA alebo NA a H. influenzae P6.
21. 21. Imunogénna lipozómová kompozícia podľa nároku 16 alebo 17, kde hostiteľským zvieraťom je vták.
22. 22. Spôsob výroby imunogénnej lipozómovej kompozície podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:

    expresiu génu, ktorý kóduje vo vode rozpustný fúzny protein obsahujúci antigénny determinant a hydrofóbnu doménu; a

    5 a) rozpustenie lipidov vytvárajúcich vezikulu a fuzneho proteínu vo vhodnom organickom rozpúšťadle;

    vytvorenie lipidového filmu alebo sprejovo sušeného prášku odparením organického rozpúšťadla; hydratovanie lipidového filmu alebo prášku; a dispergovanie hydratovaného lipidového filmu alebo prášku na vytvorenie imunogénnej lipozómovej kompozície; alebo

    10 b) rozpustenie fúzneho proteínu vo vodnom pufri;

    hydratovanie buď lipidového prášku, alebo lipidového filmu pufrom obsahujúcim fúzny protein a dispergovanie lipidového prášku alebo filmu na vytvorenie imunogénnej lipozómovej kompozície; alebo c) rozpustenie fúzneho proteínu vo vodnom pufri a pridanie fuzneho proteínu k vopred vytvoreným lipozómom na vytvorenie imunogénnej lipozómovej

    15 kompozície.