EA018084B1 - Виросомоподобные везикулы, содержащие антигены, производные от gp41, и их применение - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к виросомоподобной везикуле, содержащей антиген, производный от gp41, который представляет собой Р1 пептид, аминокислотная последовательность которого представлена всей или частью последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3; ковалентно связан за счет своего С-конца с липидом указанной виросомоподобной везикулы; локализован на внешней поверхности указанной виросомоподобной везикулы; находится в подходящей конфигурации для того, чтобы придать указанной виросомоподобной везикуле способность вызывать иммунный ответ против белка gp41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), причем указанная везикула содержит по меньшей мере один функциональный вирусный белок слияния с мембраной, не происходящий из ВИЧ.

Description

Настоящее изобретение относится к виросомоподобной везикуле, содержащей антиген, производный от др41, который представляет собой Р1 пептид, аминокислотная последовательность которого представлена всей или частью последовательности, выбранной из 8Е(.) Ш \О: 2 или 8Е-0 Ш \О: 3; ковалентно связан за счет своего С-конца с липидом указанной виросомоподобной везикулы; локализован на внешней поверхности указанной виросомоподобной везикулы;

находится в подходящей конфигурации для того, чтобы придать указанной виросомоподобной везикуле способность вызывать иммунный ответ против белка др41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), причем указанная везикула содержит по меньшей мере один функциональный вирусный белок слияния с мембраной, не происходящий из ВИЧ.

Настоящее изобретение относится к новой виросомоподобной везикуле, подходящей для индукции иммунного ответа против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), к фармацевтическим композициям, содержащим указанные виросомоподобные везикулы, к способу лечения и к набору для индукции иммунного ответа против вируса иммунодефицита человека.

ВИЧ представляет собой ретровирус, который постепенно разрушает иммунную систему и в конечном итоге приводит к синдрому приобретенного иммунодефицита (СПИД). ВИЧ существует в виде множества отличающихся вариантов, являющихся членами крупного семейства.

В результате секвенирования вирусных геномов исследователи получили возможность картировать генеалогическое древо ВИЧ. В основании дерева существуют три группы, названные М, N и О, причем группа М ответственна за существующую в настоящее время пандемию СПИД.

Группа М расщепляется на девять генетических подтипов, также названных девятью монофилетическими группами (обозначенными А-К, без Е или I). Исходное определение монофилетических групп основано на коротких геномных последовательностях, в основном, в оболочечном белке ВИЧ (Εην: др160). Эти девять монофилетических групп обладают неоднородными картинами географического распространения. Монофилетическая группа С распространена в Южной Африке, Индии и районах Китая. Монофилетические группы А и Ό обычны для Восточной Африки, а монофилетическая группа В обычна для Северной и Южной Америки и Западной Европы. В соответствии со статистикой четыре монофилетические группы А, В, С и Ό составляют свыше 90% от всей инфекции по всему миру, а монофилетическая группа С сама по себе представляет собой преобладающий в мире ВИЧ (>60%).

До недавнего времени разработка вакцин фокусировалась на штаммах монофилетической группы В, которая эпидемически доминирует в промышленно развитых странах, но вызывает всего лишь приблизительно 12% инфекций по всему миру. Большая часть подходов с использованием вакцин против ВИЧ-1 направлена на гликопротеины вирусной оболочки (Εην), поскольку они представляют собой основные поверхностные антигены, экспрессирующиеся на вирионах и ВИЧ-1 инфицированных клетках. Нативный гликопротеин оболочки ВИЧ-1 представляет собой гетеродимер, содержащий три белка др120, нековалентно связанные стремя гликопротеинами др41.

Три наиболее сильных антитела, нейтрализующие ВИЧ-1, которые были идентифицированы до настоящего времени - Ъ12, 2012 и 2Е5, обладают высокой аффинностью в отношении нативного тримера.

Предпринимаются все более интенсивные попытки разработать рекомбинантные белки в качестве вакцин-кандидатов, которые представляют собой более хорошие антигенные имитаторы по сравнению с комплексом нативного гликопротеина оболочки, таким как др120/др41. Тем не менее, вследствие множества (по меньшей мере пятнадцати) молекулярных гомологий между др120/др41 и молекулами иммунной системы может возникать множество потенциальных случаев кросс-реактивности, которые приводят к возможным вредным аутоиммунным явлениям.

Описаны различные стратегии уменьшения кросс-реактивности для получения вакцин против ВИЧ, которые не обладают или обладают меньшей кросс-реактивностью с человеческими белками, такие как введение мутаций и/или делеций в различные части белка др41, как описано в И8 6455265 и \УО 2005/010033.

Тем не менее, все еще существует потребность в вакцине, которая позволяет индуцировать универсальный иммунный ответ против ВИЧ инфекции и, в частности, ВИЧ инфекции 1 типа. Также существует необходимость в разработке вакцины, не относящейся к монофилетической группе В, такой как, например, штаммы монофилетической группы С.

Также существует необходимость в разработке вакцины, обладающей широким ингибирующим спектром, обеспечивающим возможность ингибирования между монофилетическими группами.

Существует необходимость в вакцине, позволяющей индуцировать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ против ВИЧ инфекции.

Существует необходимость в вакцине, позволяющей индуцировать иммунный ответ против ВИЧ инфекции на уровне слизистой оболочки и на уровне крови.

Существует необходимость в вакцине, подходящей для индукции антител слизистой оболочки ЧдЛ и системных антител 1дО. способной влиять на проникновение ВИЧ через слизистую оболочку и раннюю инфекцию клеток под слизистой оболочкой.

Существует необходимость в вакцине, подходящей для ингибирования или уменьшения проникновения ВИЧ через ткани слизистой оболочки путем различных механизмов, таких как трансцитоз.

Задача изобретения заключается в том, чтобы удовлетворять все вышеупомянутые потребности.

Таким образом, в соответствии с одним из первых аспектов настоящее изобретение относится к виросомоподобной везикуле, содержащей антиген, производный от др41, который представляет собой Р1 пептид, раскрытый далее, ковалентно связанный за счет своего С-конца с липидом указанной виросомоподобной везикулы и локализованный на внешней поверхности указанной виросомоподобной везикулы; указанный пептид находится в подходящей конфигурации для того, чтобы придать указанной виросомоподобной везикуле способность вызывать иммунный ответ против белка др41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), причем указанная везикула содержит по меньшей мере один функциональный вирусный белок слияния с мембраной, не происходящий из ВИЧ. Р1 пептид представляет собой пептид, аминокис- 1 018084 лотная последовательность которого представлена всей или частью последовательности, выбранной из 8ЕО Ш N0: 2, 8Е0 Ш N0: 3 или их аналога. В частности, ВИЧ может быть типа 1.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что можно вызвать иммунный ответ на уровне слизистой оболочки, а также системный иммунный ответ путем иммунизации кроликов внутримышечно или интраназально виросомоподобными везикулами, содержащими антиген, производный от др41. присоединенный к внешней поверхности.

Более конкретно, авторы изобретения обнаружили присутствие специфических антител против белка др41 (1дА и 1дС слизистой оболочки) в секретах шейки матки и влагалища и интестинальных секретах кроликов после внутримышечной или интраназальной иммунизации. В сыворотке крови этих кроликов также были идентифицированы специфические антитела 1дС против ВИЧ. Дополнительно данные конкретные антитела способны ингибировать трансцитоз ВИЧ в различных экспериментах.

Авторы изобретения также обнаружили, что антитела против др41 (1дА и 1§С слизистой оболочки) можно получать в секретах влагалища и ректальных смывах самок макак, иммунизированных вакциной по изобретению, вводимой внутримышечно и/или интраназально.

Продемонстрировано, что эти секреты и смывы в значительной степени ингибируют трансцитоз ВИЧ различных первично монофилетических групп (В и С) в модели человеческого эпителия.

Таким образом, вакцина против ВИЧ по изобретению проявляет свойство, заключающееся в способности вызвать иммунные ответы (цитолитические Т лимфоциты и/или антитела) в крови, а также в первичном участке проникновения, представляющем собой половые пути и интестинальные/ректальные слизистые ткани.

Это свойство особенно благоприятно, поскольку ВИЧ инфекция может включать стадию трансцитоза вируса через слизистые оболочки, облегчающую перемещение вируса и распределение его в организме.

Секреты семенной жидкости и секреты шейки матки и влагалища могут, потенциально, переносить ВИЧ в желудочно-кишечный, аноректальный и мочеполовой тракты, поскольку содержат бесклеточные частицы ВИЧ и множество ВИЧ-инфицированных мононуклеарных клеток.

Также полагают, что основным местом, где происходит ранняя репликация вируса у субъектов, инфицированных ВИЧ, является тонкая кишка и другие слизистые оболочки. Основной причиной этого является тот факт, что подавляющее большинство чувствительных клеток (интестинальные СЭ4+ Тклетки) располагается в тканях слизистой оболочки и в течение первых нескольких недель после воздействия ВИЧ эти клетки разрушаются.

В значении согласно настоящему изобретению предполагают, что выражение виросомоподобная везикула обозначает везикулу, содержащую по меньшей мере в части виросомальные липиды и слитые белки или их фрагменты, где указанные фрагменты обладают активностью слияния и характеристиками полноразмерного слитого белка, по меньшей мере, в той степени, которая служит для слияния с биологической мембраной клетки-мишени.

В \У0 2004/07800 предложены виросомоподобные везикулы в качестве векторов для перекрестного связывания антигенов малярийного плазмодия с внешней поверхностью указанной везикулы.

В значении согласно изобретению предполагают, что выражение антиген, производный от др41 относится к любой части или фрагменту, а также полноразмерному белку др41, встречающемуся в природе в любом штамме ВИЧ или содержащему любую модификацию (мутация по аминокислоте или химическая модификация), которая, по существу, не влияет на его антигенные свойства.

Антигенные свойства виросомоподобных везикул по изобретению являются следствием подходящей конфигурации антигена др41, инкапсулированного внутри и/или локализованного на поверхности указанной везикулы.

В \У0 2004/045582 описано приготовление виросомоподобных везикул, которые могут включать белок др41/др120, но которые не влияют на антигенные свойства этого белка, а только его свойство слияния.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей виросомоподобные везикулы по изобретению.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к применению по меньшей мере одной виросомоподобной везикулы по настоящему изобретению для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для того, чтобы вызывать адаптивный иммунный ответ и/или врожденный иммунный ответ, направленный против белка др41 вируса иммунодефицита человека.

В соответствии с одним воплощением задача изобретения заключается в том, чтобы индуцировать 1дС и 1дА слизистой оболочки. 1дА слизистой оболочки могут представлять собой смесь 1дА и секреторных 1дА.

В соответствии с еще одним воплощением задача изобретения заключается в том, чтобы ингибировать или уменьшить трансцитоз ВИЧ, в частности на уровне слизистой оболочки.

В значении согласно настоящему изобретению предполагают, что адаптивный иммунный ответ относится к иммунному ответу, основанному на активации компонента иммунной системы, приводящего к специфичности и памяти в отношении антигена или патогена.

- 2 018084

Такой ответ может быть высокоспецифичным в отношении антигена или патогена и более эффективным при втором и последующем столкновении с антигеном или патогеном. Такой адаптивный иммунный ответ может быть основан на активации лимфоцитов, таких как Т-клетки или В-клетки.

В значении по изобретению предполагают, что выражение врожденный иммунный ответ относится к ответу, основанному на неспецифической системе распознавания и не меняющемуся при последующем столкновении с антигеном или патогеном. Такая система может быть основана на иммунных клетках, таких как, например, моноциты, макрофаги или естественные киллеры (ΝΚ - иа1ига1 кШегк).

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики ВИЧ-инфекции, включающему стадию введения индивиду, нуждающемуся в этом, эффективного количества виросомоподобных везикул по изобретению.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится набору для индукции иммунного ответа против белка др41 вируса иммунодефицита человека, содержащему виросомоподобную везикулу по изобретению, содержащую пептид Р1, представленный последовательностью, выбранной из 8ЕО ΙΌ N0: 2 или 8ЕС ΙΌ N0: 3, и виросомоподобную везикулу, содержащую антиген, производный от др41, представленный последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 1.

Виросомоподобная везикула

Виросомоподобная везикула, подходящая для настоящего изобретения, содержит, по меньшей мере, виросомальные липиды и демонстрирует свойства слияния с мембраной.

В соответствии с воплощением виросомоподобная везикула по изобретению может включать моноламеллярный липидный бислой.

В соответствии с воплощением виросомоподобная везикула по изобретению может представлять собой би- или мультиламеллярную везикулу.

В соответствии с одним воплощением виросомоподобная везикула может иметь диаметр, как правило, находящийся в диапазоне от 100 до 600 нм, и, в частности, диаметр от 100 до 300 нм и, в частности, от 200 до 400 нм.

Виросомоподобные везикулы по изобретению могут представлять собой сферические моноламеллярные везикулы, имеющие средний диаметр приблизительно 150 нм.

Виросомоподобные везикулы содержат включенные в липидный бислой слитые белки или их фрагменты.

Предполагается, что выражение слитые белки или их фрагменты относится к белкам или их фрагментам, способным вызывать и/или способствовать реакции слияния мембраны виросомоподобной везикулы и биологической мембраны клетки-мишени.

Например, слитые белки могут представлять собой мембранные гликопротеины вируса гриппа, такие как гемагглютинин (ГА).

В соответствии с воплощением, могут использовать по меньшей мере два различных слитых белка или их фрагмента, которые могут демонстрировать различные характеристики слияния.

В соответствии с еще одним воплощением, отличительные характеристики слияния могут представлять собой, например, отличающуюся чувствительность к температуре, к концентрации ионов, к кислотности, к типу клеток и к специфичности типа ткани.

В соответствии с воплощением виросомоподобная везикула может содержать слитые белки, которые опосредуют слияние при двух отличающихся температурах.

В соответствии с еще одним воплощением отличающиеся слитые белки с вирусным гемагглютинином (ГА) могут быть использованы для конструирования виросомоподобной везикулы.

В качестве примера молекулы НА вирионов Х-31 и РК.8/34 могут быть способны катализировать две различные реакции слияния при отличающихся температурах.

Слитые белки с отличающимися характеристиками слияния могут происходить из различных штаммов вируса гриппа, а также других вирусов, таких как белок Е1 вируса везикулярного стоматита (ВВС), белок Е1 вируса 8е11к1 Еогек! (8ЕУ) или белок Е вируса Сендай.

Специфический механизм слияния виросомоподобных везикул дает возможность целевого взаимодействия с классом I (МНС I) или классом II (МНС II главного комплекса) гистосовместимости.

Антиген, локализованный на внешней поверхности виросомоподобной везикулы, может разрушаться при слиянии с эндосомой в эндосоме и может быть презентирован рецепторам МНС II класса иммунной системы.

Антиген, инкапсулированный внутри виросомоподобной везикулы, может быть доставлен в цитозоль при слиянии и может войти в путь МНС I класса.

Таким образом, виросомоподобная везикула может быть способна вызывать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ. В частности, виросомоподобная везикула может обладать способностью индуцировать ^Л, такой как секреторный [дЛ. а также !дС.

Протоколы получения хорошо известны специалистам в данной области техники. Подходящие протоколы для изобретения описаны, например, в \У0 2004/045582 или ЕР 0538437, которые включены здесь путем ссылки.

- 3 018084

В соответствии с одним из воплощений виросомоподобную везикулу по изобретению могут получать из самой виросомальной везикулы или из везикулы, возникающей в результате слияния виросомальной везикулы с липосомальной везикулой.

Изготовление виросомальных везикул могут осуществлять при помощи любого способа, известного специалисту в данной области техники, такого как описанный в Вгоп е! а1., Мебюбк Επζνιηοΐ. 22 0: 313331, 30 19 93, включенной здесь путем ссылки.

Виросомальные везикулы, например, могут восстанавливать из исходных липидов мембраны вируса и введенных гликопротеинов после солюбилизации, например интактного вируса гриппа с монододецильным эфиром октаэтиленгликоля, осаждения нуклеокапсида (вирусные гликопротеины и липиды остаются в супернатанте) и удаления детергента в супернатанте с использованием гидрофобной смолы (В1д-Веабк 8М2) (8!едтапп е! а1., ТгаГПс 1: 598-604, 1987).

Получение виросомальных везикул, содержащих Г А различных штаммов вирусов, могут осуществлять с равными количествами белков вирусов, солюбилизированных в неионном детергенте - монододецильном эфире октаэтиленгликоля. После удаления детергента с использованием Вю-Веабк 8М2, могут быть образованы виросомоподобные везикулы, содержащие различные типы слитых белков.

В соответствии с одним из аспектов виросомоподобную везикулу по изобретению могут получать путем слияния виросомальной везикулы с липосомальной везикулой.

Таким образом, в соответствии с одним из воплощений виросомоподобная везикула по изобретению может включать виросомальные и липосомальные липиды.

В соответствии с одним из воплощений виросомоподобная везикула по изобретению может включать липидный бислой, содержащий липиды, выбранные из катионных липидов, синтетических липидов, гликолипидов, фосфолипидов, глицерофосфолипидов, гликосфинголипидов, таких как галактозилцерамид, сфинголипиды, холестерин и их производные.

Такие липиды могут использовать для того, чтобы лучше имитировать вирусную мембрану и микродомен тай с целью благоприятствовать оптимальным олигомерам др41, таким как ди-, три- или тетрамеры.

В соответствии с еще одним воплощением виросомоподобные везикулы по изобретению могут включать липиды, способствующие фолдингу др41-производного антигена для того, чтобы более эффективно имитировать природный фолдинг указанного антигена.

Фосфолипиды могут включать, в частности, фосфатидилхолин, сфингомиелин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерол, фосфатидную кислоту, кардиолипин и фосфатидилинозит с варьирующими композициями жирного ацила.

Катионные липиды могут быть выбраны из ΌΘΤΜΆ (Н-|1-(2.3-диолеилокси)пропил|-Ы.Н.Нтриметиламмония хлорида), ΌΘΤΆΡ (М-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-М,М,И-триметиламмония хлорида, ΌΘΌΛΟ (М,М-диолеил-Ы,М-диметиламмония хлорида), ДДАБ (дидодецилдиметиламмония бромида) и стеариламина или других алифатических аминов и т.д.

Липиды, используемые согласно изобретению, могут получать в виде небольших моноламеллярных липосом в смеси с ДОФЭ (диолеоилфосфатидилэтаноламином), который широко используется в качестве вспомогательного липида для облегчения разрушения эндосомальной мембраны.

В соответствии с воплощением липосомальные липиды липосом могут включать РОРС/ДДАБ.

В соответствии с еще одним воплощением также может быть использован агент, способствующий эмульгации, для улучшения жесткости и/или закрывания везикул.

В качестве примера агента, способствующего эмульгации, можно упомянуть холестерин и его производные, такие как, например, сложный эфир холестерина, заряженный или нейтральный в виде сульфата холестерина; производное стерольной цепи, такое как, например, производное растительного происхождения, такое как фитостерол (ситостерол, сигмастерол); церамиды и их смеси.

Антиген, производный от др41, может быть заключен в липосомальные везикулы перед слиянием с виросомами.

Инкапсуляцию по меньшей мере одного антигена и/или адъюванта, как указано ниже, в липосомы могут осуществлять при помощи любого способа, известного в области техники, включающего способы, описанные в Моппагб е! а1., ВюсЫт. Вюрйук.; Ас!а 1329: 39-50; 1997, в Уадпег е! а1., 1. Ырокоте Век., 12(3) 271-283, 2002 или в ОЬегйокег е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а 1416: 57-681 1999, в числе многих других хорошо известных способов.

В конкретном воплощении высокой эффективности липосомальной инкапсуляции могут достигать при помощи способа замораживания/оттаивания, используемого для приготовления чистых липидных везикул.

В соответствии с одним из аспектов изобретения продукты реакции слияния виросом и липосом могут подвергать стадии нуклеопоровой экструзии для уменьшения размера.

В качестве примера экструзия через поры 200 нм может позволить получить везикулы, имеющие размер, составляющий приблизительно половину от исходного.

Большая часть частиц может находиться в диапазоне от 100 до 300 нм.

После изменения размера продукты слияния липосом и виросом могут представлять собой виросо

- 4 018084 моподобные везикулы, которые могут включать антиген, производный от др41. в своей внутренней полости и могут быть способны претерпевать вторую стадию слияния с биологическими мембранами в различных условиях для доставки указанного антигена.

Антиген, производный от др41, может быть локализованным на внешней поверхности и/или быть инкапсулированым внутри везикулы по изобретению, как описано ниже.

В соответствии с одним из аспектов виросомоподобная везикула по изобретению дополнительно может содержать нацеливающую группировку, которая нацеливает указанную везикулу на специфическую клетку или ткань.

Подходящая нацеливающая группировка может быть выбрана из рецептора клеточной поверхности, хемокина, цитокина, фактора роста, антитела или фрагмента антитела, пептидной последовательности, имеющей специфичность или специфический заряд, комплементарный молекуле адгезии, такой как интегрин.

Нацеливающая группировка может быть включена в или присоединена к липидному бислою указанной везикулы при помощи любого из способов, известных специалистам в данной области техники.

В соответствии с еще одним воплощением виросомоподобная везикула по изобретению дополнительно может содержать дополнительный антиген.

В соответствии с одним из воплощений виросомоподобная везикула по изобретению дополнительно может содержать от одного до десяти дополнительных антигенов и, в частности, от 2 до 4 дополнительных антигенов.

Дополнительные антигены могут быть выбраны из пептидов, происходящих из ВИЧ, и, в частности, пептидов, происходящих из структурных белков, кодируемых генами епу (др120, др41). дад (р9, р17, р24) и ро1 (р66, р32), и регуляторных белков, кодируемых генами пе£, геу или 1а1. и их смесей.

Антиген, производный от др41

Антиген, производный от др41, подходящий для настоящего изобретения, может представлять собой любую часть белка др41, а также полноразмерного белка др41 и его аналогов.

В значении по изобретению предполагается, что выражение его аналог в отношении антигена, производного от др41, относится к пептиду, имеющему, по существу (по меньшей мере 85%, в частности по меньшей мере 90% и конкретней по меньшей мере 95%), идентичности или гомологии аминокислотной последовательности (т.е. аминокислотный остаток замещен, например, аминокислотным остатком того же самого семейства, похожей полярности или заряда) с аминокислотной последовательностью указанного антигена, производного от др41, и который обладает похожими или консервативными биологическими свойствами, в частности, в отношении связывания фрагмента антигена с иммуноглобулином, нацеленным на белок др41.

В соответствии с одним из воплощений антиген, производный от др41, подходящий для изобретения, может быть лишен свойства слияния в отношении клеточной мембраны.

В соответствии с одним из воплощений пептид, производный от др41, локализованный на внешней поверхности виросомоподобной везикулы по изобретению, может быть ковалентно связан с липидом указанной виросомоподобной везикулы или внедрен в липидный бислой указанной виросомоподобной везикулы при помощи трансмембранного домена пептида, отличающегося от пептидного трансмембранного домена дикого типа белка др41 дикого типа.

Соответственно, ковалентно связанный антиген, производный от др41, может включать любую модификацию, требующуюся для локализации указанного антигена, производного от др41, на внешней поверхности виросомоподобной везикулы по изобретению.

Модификации др41-антигена, подходящего для изобретения, и способы перекрестного связывания указанного модифицированного др41-антигена с внешней поверхностью виросомоподобной везикулы могут быть такими, как описаны в νΟ 2004/078099.

В соответствии с одним из воплощений антиген, производный от др41, может быть ковалентно связан с внешней поверхностью виросомоподобной везикулы путем перекрестного связывания с липидом или фосфолипидом.

В соответствии с еще одним воплощением антиген, производный от др41, может быть ковалентно связан с внешней поверхностью виросомоподобной везикулы путем перекрестного связывания с углеводом.

В соответствии с одним воплощением ковалентно связанный Р1 пептид может включать по меньшей мере один остаток, образующий ковалентную связь, расположенный С-конце.

Например, остаток, образующий перекрестную связь, может быть выбран из цистеина (Сук) или лизина (Ьу8).

В соответствии с еще одним воплощением ковалентно связанный Р1 пептид дополнительно может включать по меньшей мере один разделяющий остаток между указанными остатками, образующими ковалентную связь, расположенными на С-конце, и Р1 петидом.

Подходящий разделяющий остаток может быть выбран, например, из остатков С1у (глицин), А1а (аланин), 8ег (серин), Акр (аспартат), Ьук (лизин), С1п (глутамин), Ηίκ (гистидин), Не (изолейцин) и Ьеи

- 5 018084 (лейцин).

От 2 до 12, в частности от 3 до 10 и конкретней от 4 до 8 разделяющих остатков могут быть связаны с образованием разделяющих последовательностей.

Подходящие разделяющие последовательности могут быть выбраны, например, из 01у-01у или ЬузО1у.

Ковалентное связывание антигена, производного от др41, с поверхностью виросомоподобной везикулы, например, могут осуществлять с применением амфифильных производных полиэтиленгликоля (ПЭГ), фосфатидилэтаноламина (ПЭ), фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилсерина, холестерина или их смеси, легко включенных в липидный бислой.

Ковалентное связывание антигена, производного от др41, с липидом виросомоподобной везикулы по изобретению могут осуществлять при помощи любого способа, известного специалистам в данной области техники.

Ковалентное связывание могут осуществлять в липидном растворе, и липид-пептидный конъюгат могут затем включать в виросомоподобную везикулу.

В соответствии с воплощением изобретения Р1 пептид может быть связан с липидом везикулы по изобретению, например, при помощи бифункционального сукцинатного линкера, в частности γмалеимидомасляной кислоты Ν-гидроксисукцинимидного эфира или Ν-γ-малеимидобутирилоксисукцинимидного-эфира.

В соответствии с воплощением антиген, производный от др41, и, конкретней, интеркалированный антиген, производный от др41, может не иметь пептидного трансмембранного домена.

Пептидный трансмембранный домен подходящего интеркалированного др41-производного антигена может быть замещен отличающимся трансмембранным пептидным доменом.

Такой модифицированный антиген, производный от др41, может представлять собой химерный белок.

В значении по изобретению выражение химерный белок относится к белку, который может содержать одну или более чем одну область белка и одну или более чем одну область одного или более чем одного отличающегося белка.

Для задачи по изобретению любой трансмембранный домен любого белка может подходить для встраивания антигена, производного от др41, в липидный бислой виросомоподобной везикулы по изобретению.

В соответствии с одним из воплощений можно использовать трансмембранные домены, которые могут способствовать олигомеризации (для получения димеров, тримеров или тетрамеров), такие как трансмембранные домены рецепторов факторов роста или оболочечных белков вирусов.

В качестве примера трансмембранного домена, который может быть подходящим согласно настоящему изобретению, можно упомянуть трансмембранный домен, полученный из рецептора клеточной поверхности, такого как рецептор СЭ4 (например, как показано на 8ЕО ΙΌ N0: 5), цитокинового рецептора, как, например, рецептора 1Б-1, рецептора эпидермального фактора роста (БОГ - Ер1бегта1 Сго\\111 ЕасЮг), рецептора фактора роста эндотелия сосудов (УЕОЕ - Уазси1аг Епбо1йе1шт Сго\\И1 ЕасЮг), любых рецепторов, связанных с О-белком, любых тирозинкиназных рецепторов, вирусный трансмембранный домен, происходящий из оболочечных белков вирусов, таких как вирусы семейства рабдовирусов или семейства поксвирусов. Подходящий для изобретения вирусный белок может представлять собой, например, белок О вируса везикулярного стоматита (ВВС-О).

Такие трансмембранные домены хорошо известны в области техники и легко могут быть идентифицированы специалистом в данной области техники.

Химерный белок, подходящий для настоящего изобретения, могут получать при помощи любого из способов генетической инженерии, известных специалистам в данной области техники, таких как описанные в Мо1еси1аг С1ошпд - А ЬаЬогаФгу Мапиа1 (2⁶ Еб.) 8апЬгоок е1 а1., 1990, Со1бзргшд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1бзргшд НагЬог Ргезз Ν.Υ. (8апЬгоок).

В соответствии с еще одним воплощением антиген, производный др41, может быть доставлен к внешней поверхности виросомоподобной везикулы в моно-, ди-, три- и, конкретней, в тетрамерной форме и их смесях.

Таким образом, количество антигена, производного от др41, используемого для изготовления виросомоподобной везикулы по изобретению, может быть скорректировано при помощи любого из стандартных протоколов, известных специалистам в данной области техники для получения желаемой моно- или мультимерной формы.

В соответствии с одним из воплощений др41-производный антиген может быть присоединен к внешней поверхности при помощи его С-конца.

В соответствии с воплощением др41-производный антиген может быть инкапсулирован внутри виросомоподобной везикулы по изобретению.

др41-производный антиген может быть инкапсулирован в виросоме при помощи способов, хорошо известных в области техники.

- 6 018084

Например, раствор очищенного вируса гриппа А/сингапурского гемагглютинина, полученного, как описано ранее 1.1. 8кейе и С.С. 8сЫ1б (ТНе роКрерйбе сотрокйюп οί тПиспха А уиикек. У1го1оду 44 (1971) 396-408), могут готовить путем растворения осадка гемагглютинина после центрифугирования в растворе ФБР-ОЭГ (фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), растворенные в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (ФБР), содержащем октанэтиленгликольмонодециловый эфир (ОЭГ).

Ср41-производные антигены и фосфолипиды могут добавлять к гемагглютининовому раствору, смешивать, подвергать ультразвуковому воздействию, затем центрифугировать. Затем могут сформировать виросомы, как обсуждалось ранее, путем удаления детергента, например, с использованием ВюЯаб 8М Вю-Веабк.

В соответствии с еще одним примером антиген, производный от др41. может быть инкапсулирован в липосомы с использованием способов, таких как описанные ранее или описанные в Сйпйобоийбек е! а1., М1сгоЫо1оду 144:3027-3037 (1998), перед слиянием указанных липосомальных везикул с виросомальными везикулами.

В соответствии с еще одним воплощением при инкапсуляции в виросомоподобной везикуле по изобретению др41-производный антиген также могут использовать в моно- или мультимерной форме, как указано ранее.

В соответствии с воплощением антиген, производный от др41, который может быть использован в настоящем изобретении, могут выбирать из любой монофилетической группы ВИЧ.

Подходящие для изобретения монофилетические группы ВИЧ могут представлять собой, например, ВИЧ монофилетических групп А, В, С или Ό.

Конкретней, антиген, производный от др41, может относится к монофилетической группе ВИЧ типа С.

Подходящий антиген, производный от др41, может включать, в частности, любую консервативную аминокислотную замену (и/или вставку, и/или делецию) и/или химическую модификацию (такую как циклизацию) в отношении встречающегося в природе антигена, производного от др41, включение которой может быть основано на стандартных навыках специалистов в данной области техники.

В соответствии с одним из воплощений антиген, производный от др41, который может подходить для осуществления настоящего изобретения, может представлять собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную полностью или частично последовательностью 8ЕЦ Ш N0: 1, полученной из штамма ВИЧ-1 НхВ2 или его аналога.

В одном из воплощений антиген, производный от др41, может представлять собой рекомбинантные петлевые пептиды др41, происходящие из аминокислотных последовательностей гликопротеинов ВИЧ др41 дикого типа.

В качестве примера антигенов, производных от др41, которые могут быть пригодны для осуществления настоящего изобретения, можно упомянуть антигены, производные от др41, полученные путем введения в иммунодоминантные области некоторых мутаций (делеции, замены и/или вставки) для уменьшения гомологии с человеческим интерлейкином-2 (1Ь-2) для того, чтобы избежать или уменьшать риск запуска аутоиммунной реакции. Такие антигены, производные от др41, в частности, описаны в \У0 2005/010033, включенной здесь путем ссылки.

В настоящей заявке на изобретение мутация относится к любой модификации области (возможно, уменьшенной на один аминокислотный остаток) полипептида при помощи физических средств, химических средств (ковалентная или нековалентная модификация) и/или биологических средств (мутации путем замены, делеции и/или вставки одной или более аминокислоты), приводящей к модификации функциональных потенциалов составляющих аминокислот указанной области, названной мутировавшая область. В качестве примера можно осуществлять мутации, приводящие к модификации аминокислоты Ь серии в Ό серию, устранение, приобретение и/или модуляцию свойств дисульфидных мостиков, водородных связей, электростатических взаимодействий и/или гидрофобных взаимодействий, модификации способности белка образовывать гетерокомплекс, или альтернативно, в случае олигомерного белка, модификацию состояния олигомеризации или стабильности олигомера.

Модификация иммунодоминирующих областей может привести в результате к введению в петлю, или замещению части петли гидрофильным и неиммуногенным или слабо иммуногенным гибким линкером и возможно ведению мутации(ий).

Кроме того, др41-производный антиген может включать по меньшей мере одну мутацию в его иммунодоминирующей области, которая приводит ίη уйго к кросс-реакции В типа и/или Т типа с белком хозяина и, в частности, с 1Ь-2.

Некоторые мутации, которые являются решающими в отношении влияния этого изменения на антигенность, раскрыты в И8 6455265 и \У0 2005/010033, которые включены здесь полностью путем ссылки.

В соответствии с воплощением антиген, производный от др41, подходящий для настоящего изобретения, может представлять собой пептид, названный Р1, и может представлять собой пептид, аминокислотная последовательность которого представлена всей или частью последовательности, выбранной из

- 7 018084

8ЕЦ ΙΌ N0: 2, 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 или их аналога.

Пептид Р1 соответствует аминокислотной последовательности, представленной в эктодомене оболочечного белка ВИЧ др41, который локализован на поверхности вирусных частиц перед взаимодействием вирусов с клетками-мишенями. В качестве примера в штамме ВИЧ-1 НхВ2 эта последовательность заключена между аминокислотами с 649 по 683 белка др41 дикого типа.

др41-Производный антиген, пригодный согласно изобретению, также может включать модификации, такие как усечение части аминокислотной последовательности по Ν- или С-концу или добавление пептидной последовательности с получением химерного белка, описанного в АО 2005/010033, или как описано ранее.

В качестве примера антигена производного от др41, подходящего для изобретения, можно представить последовательность Р1, содержащую добавление разделителя Ьук-С1у-Сук по С-концу, например, как показано в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4.

Адъюванты

В соответствии с одним воплощением иммуностимулирующее действие виросомоподобных везикул по изобретению может быть дополнительно увеличено путем ассоциации этих виросомоподобных везикул по меньшей мере с одним адъювантом.

Указанный адъювант может быть инкапсулирован внутри, и/или включен в липидный бислой, и/или свободно комбинирован с указанной везикулой.

В соответствии с одним из воплощений виросомоподобная везикула дополнительно может содержать по меньшей мере один адъювант, усиливающий и/или опосредующий иммунный ответ, выбранный из врожденного иммунного ответа и/или адаптивного иммунного ответа.

Адаптивный иммунный ответ может быть выбран из Т_Н1 и/или Т_Н2 иммунного ответа. Используемые адъюванты могут усиливать иммунологический ответ путем активации антигенпрезентирующих клеток (АПК), макрофагов и/или стимулирующих специфических наборов лимфоцитов.

Адъювант, который может быть подходящим согласно настоящему изобретению, может представлять собой любой лиганд, подходящий для активации рецептора, распознающего патоген (РЕВ - раШодеп гесодшйоп гееер!ог), экспрессирующегося в и на дендритных клетках (ДК) или других антигенпрезентирующих клетках.

Лиганды, активирующие То11-подобные рецепторы (ТЬВ - 1о11-11ке гесер!огк), также могут быть подходящими для задач изобретения. Эти рецепторы представляют собой члены семейства РВВ и широко экспрессируются множеством клеток врожденного иммунитета, включающих ДК, макрофаги, тучные клетки и нейтрофилы.

В качестве примера лигандов, активирующих ТЬВ, можно упомянуть для ТЕВ4 липополисахариды (ЛПС) Е. со11, таксол, слитой белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ), и белки теплового шока 60 и 70, для ТЬВ2 пептидогликан 81арйу1ососсик аигеик, липопротеины М. 1иЬегси1ок1к, и зимозан 8асйаготусек сегеу1К1ае, и высокочистые ЛПС Р. дшдгуайк, для ТЬВ3 дцРНК, для ТЬВ5 флагеллин, для ТЕВ7 синтетические соединения имидазохинолины и для ТЕВ9 некоторые типы СрС-обогащенной ДНК.

Другие полезные адъюванты для изобретения могут представлять собой эпитопы Т-хелпера. Эпитоп Т-хелпера представляет собой пептид, обычно происходящий из экзогенных белков, которые претерпевают протеолитическое расщепление и процессинг в пути эндоцитоза антигенпрезентирующих клеток (АПК). В этих клетках главный комплекс гистосовместимости ΙΙ класса (МНС ΙΙ) переносится в эндосомы путей эндоцитоза, ассоциированных с этими пептидами. Этот комплекс, который переносится на поверхность АПК, может взаимодействовать со специфическим Т-клеточным рецептором СЭ4' Тлимфоцитов, приводя к их активации.

В зависимости от хелперного эпитопа Т-клеточный ответ может представлять собой ответ ТН1 и/или ТН2 типа. В области техники известны ТН1 эпитопы, способствующие ответу цитотоксических-Тлимфоцитов, и ТН2 эпитопы, способствующие гуморальному ответу.

В качестве примера эпитопа ТН1-ориентированного ответа можно упомянуть эпитоп, состоящий из пептидов-производных меллитина, идентифицированных в АО 2005/049647. В качестве примера эпитопа Т_Н2-ориентированного ответа можно упомянуть пан эпитоп ИВ хелперной Т-клетки (РАЭВЕ - Рап ИВ ерйоре). Этот эпитоп сконструирован таким образом, что связывается с наиболее обычными молекулами НЬА-ЭВ с высокой аффинностью и действует в качестве сильного иммуногена. Показано, что эпитоп РАЭВЕ НТЬ увеличивает силу вакцин, разработанных для стимуляции клеточного иммунного ответа (А1ехапйег 1. е! а1., 1шшипо1 Век. 1998;18(2):79-92).

В соответствии с воплощением адъювант, который может быть использован с виросомоподобными везикулами по настоящему изобретению, может быть выбран из солей алюминия, алюминийфосфатных гелей, микобактерий, таких как ВСС, М. уассае, или СогупеЬас1ег1иш ратуиш, пептидов, гемоцианина лимфы улитки, дипептидных и трипептидных производных мурамила, монофосфориллипида А, интерлейкина-2 (1Ь-2), 1Ь-12, колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (СМ-С8Е дгапи1осу1е-шасгорйаде со1опу к11ши1айпд Гас1ог), лигандов хемокинового семейства, таких как ВАЭТЕ8 (регулируемый при активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками - Веди1а1еб ироп АсДуайоп №гша1 Т се11 Ехргеккеб апй 8есге1еб), липопротеина грамположительных бактерий, ком

- 8 018084 понента клеточной стенки дрожжей, двухцепочечной РНК, липополисахарида грамотрицательных бактерий, флагеллина, И-обогащенной одноцепочечной вирусной РНК, СрО содержащей ДНК, сурессирующей цитокиновый сигнальный путь малой интерферирующей РНК (8ОС8 κίΚΝΆ - 8ирргекког оГ СуФкзие 81диаШид кта11 1п(егГег1пд ΚΝΆ), пептидов-производных меллитина, пан ΌΚ эпитопа (ΡΆΌΒΕ) и их смесей.

Фармацевтические препараты

В соответствии с воплощением виросомоподобные везикулы по изобретению могут быть использованы для изготовления фармацевтической композиции, предназначенной для индукции адаптивного иммунного ответа и/или врожденного иммунного ответа, направленного против белка др41 вируса иммунодефицита человека.

Такая фармацевтическая композиция может включать раствор виросомоподобных везикул, суспендированных в фармацевтически приемлемом носителе, например водном носителе.

Могут использовать множество водных носителей, например воду, забуференную воду, 0,4% солевой раствор, 0,3% глицин, гиалуроновую кислоту и т.д. Фармацевтическую композицию могут стерилизовать при помощи обычных хорошо известных способов стерилизации или могут подвергать стерильной фильтрации.

Получающиеся в результате водные растворы могут упаковывать для применения, как они есть, или лиофилизировать, причем лиофилизированный препарат комбинируют перед введением со стерильным раствором.

Фармацевтическая композиция также может содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, требующиеся для обеспечения условий, приближенных к физиологическим, такие как агенты, регулирующие рН, и буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, увлажнители и т.п, например ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитанмонолаурат, триэтаноламинолеат и многие другие.

Такие препараты обычно могут содержать фармацевтически приемлемые концентрации соли, буферных агентов, антиоксидантов, консервантов, совместимых носителей, ранее описанных адъювантов и возможно других терапевтических агентов.

Виросомоподобные везикулы по изобретению и, в частности, содержащие их фармацевтические композиции могут вводить путем инъекции, или через слизистую оболочку, или с помощью комбинации этих путей.

Путь инъекции может быть, например, интраперитонеальным, внутрикожным, подкожным, внутрисосудистым или внутримышечным путем.

Могут использовать любой путь введения через слизистую оболочку, например мочеполовой путь, такой как, например, влагалищный путь, желудочно-кишечный путь, аноректальный путь, респираторный путь, через слизистые оболочки верхних дыхательных путей или назально-ротовой путь и их смеси.

В одном из воплощений фармацевтическая композиция по изобретению может быть представлена в виде лекарственных форм для перорального введения, таких как таблетки, капсулы (каждая из которых включает препараты с рассчитанным по времени высвобождением и препараты с замедленным высвобождением), пилюли, порошки, гранулы, эликсиры, настойки, растворы, суспензии, сиропы и эмульсии.

Все эти формы хорошо известны специалистам в фармацевтической области техники.

В одном из воплощений для приготовления фармацевтической композиции для введения в форме вакцины могут использовать виросомоподобные везикулы. Могут использовать любые протоколы иммунизации, стандартные для данной области техники.

В соответствии с одним из воплощений фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно содержать везикулы, включающие Р1 пептид, инкапсулированный внутри указанной везикулы, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при иммунотерапии.

В соответствии с еще одним воплощением фармацевтическая композиция по изобретению может включать дополнительные виросомоподобные везикулы, содержащие антиген иной, чем указанный антиген, производный от др41, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в иммунотерапии.

Указанный иной антиген может представлять собой ранее описанный антиген.

Фармацевтическая композиция по изобретению может включать виросомоподобные везикулы по изобретению в эффективном количестве.

Эффективное количество представляет собой такое количество виросомоподобных везикул, которое само по себе или вместе с дополнительными дозами может стимулировать желаемый ответ. Эффективное количество может зависеть от множества факторов, таких как путь введения, введение в виде разовой или дробных доз, и параметров конкретного пациента, включающих возраст, физическое состояние, размер, массу и стадию заболевания. Эти факторы хорошо известны специалистам в данной области техники и могут быть адресованы не более чем к стандартным экспериментам.

Таким образом, в соответствии с воплощением, фармацевтическая композиция может содержать виросомоподобные везикулы по изобретению сами по себе или в комбинации по меньшей мере с одним

- 9 018084 адъювантом, как описано ранее.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики ВИЧ инфекции, включающему, по меньшей мере, стадию введения индивиду, нуждающемуся в таком введении, эффективного количества виросомоподобных везикул по настоящему изобретению.

В соответствии с одним из воплощений виросомоподобные везикулы по изобретению могут вводить путем инъекции, или через слизистую оболочку, или путем комбинации указанных путей, как указано ранее.

В соответствии с еще одним воплощением виросомоподобные везикулы, которые могут использовать согласно настоящему изобретению, могут представлять собой виросомоподобные везикулы, содержащие антиген, производный от др41, локализованный на внешней поверхности, и виросомоподобные везикулы, содержащие антиген, производный от др41. инкапсулированный внутри указанных везикул, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в иммунотерапии.

В соответствии с еще одним воплощением виросомоподобную везикулу, которую могут использовать в способе по изобретению, могут вводить в комбинации с дополнительным антигеном, отличным от указанного др41-производного антигена.

В качестве примера дополнительного антигена, который может быть подходящим согласно настоящему изобретению, можно упомянуть указанные ранее отличные антигены.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к набору для индукции иммунного ответа против белка др41 вируса иммунодефицита человека, содержащему виросомоподобную везикулу по изобретению, содержащую пептид Р1, представленный последовательностью, выбранной из 8ЕО 1И N0: 2 или 8Е0 1И N0: 3, и виросомоподобную везикулу, содержащую антиген, производный от др41, представленный последовательностью 8Е0 1И N0: 1.

Настоящее изобретение будет более понятно при рассмотрении следующих примеров, которые приведены в целях иллюстрации, и их не следует интерпретировать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Различные аспекты настоящего изобретения дополнительно проиллюстрированы следующими примерами, которые в любом случае не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Описание графических материалов

На фиг. 1 показаны последовательности антигена, производного от др41, вируса НхВ2 монофилетической группы В (8Е0 1И N0: 1, 8Е0 ГО N0: 3, 8Е0 ГО N0: 4) и ВИЧ-монофилетической группы С (8Е0 ГО N0: 2);

на фиг. 2 - последовательности трансмембранного домена молекулы СИ4⁺ (8Е0 ГО N0: 5);

на фиг. 3 - доза тотальных антител, 1дО и к1дА, в секретах шейки матки и влагалища кроликов, иммунизированных виросомоподобными везикулами-Р1 примера 1 без адъюванта (36 и 37, внутримышечный путь), ЙКАНТЕ8 (61, интраназальный путь) или термолабильным токсином (64 и 65, интраназальный путь) на 0, 14, 18, 23 и 28 неделю;

на фиг. 4 - доза тотальных антител, 1дО и 1дЛ, в сыворотках крови кроликов, иммунизированных виросомоподобными везикулами-Р1 примера 1 без адъюванта (36 и 37, внутримышечный путь), №АИТЕ8 (61, интраназальный путь) или термолабильным токсином (64 и 65, интраназальный путь) на 0, 14, 18, 23 и 28 неделю;

на фиг. 5 - ингибирование трансцитоза ВИЧ-1 через клетки НТ-29 с использованием мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), инфицированных первичными вирусами и секретами шейки матки и влагалища (разведение 1/50), достигнутое, как описано в примере 2 (недели 14, 18 и 23), виросомоподобными везикулами-Р1 без адъюванта 36 и 37, внутримышечным путем, №АИТЕ8 61 и 63, интраназальным путем или термолабильным токсином 64 и 65, интраназальный путь);

на фиг. 6 - доза 1дО согласно иммуноферментныму анализу (ИФА) в секретах влагалища самок макак, вакцинированных виросомоподобными везикулами Р1 согласно примеру 1 в количестве 40 мкг/дозу на 0, 4, 12 и 24 неделю;

на фиг. 7 - доза 1дА согласно ИФА в секретах влагалища самок макак, вакцинированных виросомоподобными везикулами Р1 примера 1 в количестве 40 мкг/дозу на 0, 4, 12 и 24 неделю;

на фиг. 8 - доза 1дА согласно ИФА в ректальных смывах самок макак, вакцинированных виросомоподобными везикулами Р1 примера 1 в количестве 40 мкг/дозу на 0, 4, 12 и 24 неделю;

на фиг. 9 - ингибирование штаммов К.5 ВИЧ (У29 первичный ВИЧ - монофилетическая группа В из Национального института здравоохранения (N14 - N3110031 1икйи1е οί Неа11й) или У25 первичный ВИЧ монофилетическая группа С из №Н) через клетки НТ-29 с использованием МКПК, инфицированных У29 или У25 - секретами влагалища на 25 неделе (разведение 1/25), полученными, как описано в примере 4;

фиг. 10 - ингибирование штаммов К5 ВИЧ (У29 первичный ВИЧ - монофилетическая группа В из Национального института здравоохранения (N14) или У25 первичный ВИЧ - монофилетическая группа

- 10 018084

С из ΝΙΗ) через клетки НТ-29 с использованием МКПК, инфицированных У29 или У25 - ректальными смывами на 25 неделе (разведение 1/25), полученными, как описано в примере 4.

Примеры

Пример 1. Получение виросомоподобных везикул, содержащих антиген, производный от др-41, локализованный на внешней поверхности.

Виросомоподобные везикулы готовили, как описано в νΟ 2004/045582.

Кратко, 32 мг яичного фосфатидилхолина (ФХ) и 8 мг фосфатидилэтаноламина (ФЭ) растворяли в 2 мл ФБР, содержащего 100 мМ октаэтиленгликольмонодециловый эфир (ОЭГ) (ФБР/ОЭГ).

Вирус гриппа А/сингапурский гемагглютинин (ГА) очищали, как описано (8ке11е1 аиб 8еЫ1б, νίτοίоду 44:396-408, 1971), в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (ФБР) 4 мг гемагглютинина (ГА) центрифугировали при 100000хд в течение 30 мин и осадок растворяли в 1,33 мл ФБР, содержащего 100 мМ ОЭГ.

Модифицированный антиген, производный от др41, (Р1) с разделителем С1у-Ьу5-Су5 на С-конце (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4) конъюгировали через сукцинатную связку на Ν-конце с региоизомером фосфатидилэтаноламина (ФЭ) в соответствии со следующим.

Фосфатидилэтаноламин (ФЭ) растворяли в метаноле и добавляли 0,1% (об./об.) триэтиламина. Раствор затем смешивали с гетеробифункциональным перекрестным линкером Ν-γ-малеимидобутирилоксисукцинимидным эфиром (ГМБС), (Р1егее Сйет1еа1 Сотрапу, ВоекРогб, 1Ь) (отношение ФЭ: ГМБС = 5:1), который ранее растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) (20 мкл). После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре растворители упаривали в течение 1 ч в вакууме в центрифуге 8реебVас. ГМБС-ФЭ затем растворяли в 1 мл ФБР, содержащего 100 те октаэтиленгликоля (ОЭГ) (Р1ике СйеткаН, 8\\'Ц/ег1апб), (РВ8-ОЕС) и добавляли модифицированный антиген, производный от др41, Р1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4) (отношение ФЭ-ГМБС:пептид = 5:1). На этой стадии фосфатидилэтаноламин-ГМБС реагирует со свободным С-концевым цистеином модифицированного пептида Р1. Спустя 30 мин инкубации добавляли свободный цистеин для инактивации свободного ГМБС (отношение цистеин:ГМБС = 10:1).

Конъюгаты пептид Р1-фосфатидилэтаноламин (4 мг), фосфатидилхолин (32 мг; Ыро1б, ЬибАдзйаРеп, Сегтапу) и фосфатидилэтаноламин (6 мг) растворяли в общем объеме 2,66 мл ФБР-ОЭГ. Растворы фосфолипида и гемагглютинина смешивали и подвергали ультразвуковой обработке в течение 1 мин.

Этот раствор центрифугировали в течение 1 ч при 100000 д и супернатант стерилизовали путем фильтрации. Виросомы образовывались в результате удаления детергента (8М ВюВеабз, ВюВаб, С1айЬгиед, 8\\й/ег1апб).

Пример 2. Иммунизация кроликов композицией вакцины, содержащей виросомоподобную везикулу, содержащую др-41-производный антигенный пептид Р1, локализованный на внешней поверхности.

Готовили три группы самок новозеландских белых кроликов для получения виросомоподобных везикул, приготовленных, как описано в примере 1.

Виросомоподобную везикулу без какого-либо адъюванта вводили внутримышечно (кролики 36 и 37), или вводили интраназально с ΗΒΛΝΤΕ8 (кролики 61 и 63), или вводили интраназально с термолабильным токсином (ТЛТ) (кролики 64 и 65). Применяли следующую схему введения.

За четыре недели до первого введения препаратов кроликам внутримышечно вводили инъекции инактивированного вируса гриппа А (100 мкл инактивированного вируса гриппа А, 0,01 мг/мл).

Затем кроликам вводили виросомоподобные везикулы (20 мкг, 100 мкл) на 0, 4 и 12 неделю и внутримышечно осуществляли бустерную иммунизацию (10 мкг) на 16 и 22 неделю.

Животных умерщвляли на 28 неделю и для исследования функций ответа на антитело собирали различные образцы.

В качестве контроля использовали образцы перед иммунизацией (отобранные перед моментом времени 0).

Образцы крови и секретов влагалища отбирали на 14, 18, 23 и 28 неделю. Кроликов, вакцинированных виросомоподобными везикулами с ТЛТ, использовали в качестве контроля по отношению к кроликам, вакцинированным 11Κ.ΑΝΤΕ8 виросомоподобными везикулами.

Измеряли уровни общих антител, 1дС и 1дА, в соответствии со следующим протоколом ИФА.

Пептид Р1 (100 нг/100 мкл/лунки, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3) в бикарбонатном буфере 50 мМ, рН 9,6 использовали для покрытия планшетов Νιιπο в течение ночи при 4°С.

Планшеты насыщали бычьим сывороточным альбумином (БСА) 3% или молоком 5% в течение 2 ч/37°С, затем промывали 0,5% буфером ФБР-Т\гееп.

Образцы сыворотки крови, разведенные 1/1000 с использованием 3% БСА, или секреты шейки матки и влагалища, разведенные 1/50 с 3% БСА, инкубировали в течение 2 ч при 37°С.

Планшеты отмывали с использованием 0,5% буфера ФБР-Т\гееп и инкубировали с первичными антителами.

Для обнаружения общего количества антител использовали общие козьи 1д против кроличьих антител, меченные пероксидазой хрена (ПХ) (1/4000).

Для обнаружения кроличьего 1дА использовали козьи 1дС против кроличьих антител Аее1ог,

- 11 018084

Ргапсе) (1/20 000) с последующей инкубацией с стрептавидином-ПХ (1тшипо1есй), разведенным в 1/50000.

Для обнаружения кроличьего 1дС использовали козьи 1дЛ против кроличьих антител (81дта) (1/20000) с последующей инкубацией с меченным биотином антителом против козьих антител (Уес1ог) (1/1000) и выявляли при помощи стрептавидина-ПХ (1/50000).

Моноклональное антитело 2Р5-1д0 использовали в качестве положительного контроля с последующей инкубацией с меченным биотином козьим РаЬ'₂ против человеческого 1дА (1/5000) (СаЙад) и выявляли при помощи стрептавидина-ПХ (1/50000).

Моноклональное антитело 2Р5-1дА использовали в качестве положительного контроля с последующей инкубацией с козьим РаЬ'₂ против человеческого 1дС (1/20000) и выявляли при помощи стрептавидина-ПХ (1/50000). Антитела инкубировали в течение 1 ч при 37°С.

Колориметрические реакции запускали путем добавления субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) и останавливали путем добавления 1М Н₂РО₄. Оптическую плотность (ОП) считывали при 450 нм.

Полученные результаты проиллюстрированы на фиг. 3 (секрет шейки матки и влагалища) и фиг. 4 (сыворотка крови).

Присутствие антител обнаружено в секрете шейки матки и влагалища и сыворотке крови неиммунизированных кроликов с максимальным уровнем на 14 или 18 недели в соответствии с условиями иммунизации.

Пример 3. Ингибирование трансцитоза ВИЧ секретами шейки матки и влагалища, полученными у иммунизированных кроликов согласно примеру 2.

Трансцитоз ВИЧ-1 через эпителиальные клетки и нейтрализацию трансцитоза антителами осуществляли на линии эпителиальных клеток НТ-29, выращиваемых в виде плотного поляризованного монослоя в течение 7 суток на проницаемой фильтровальной подложке (размер пор 0,45 мкм) с образованием интерфейса между двумя независимыми камерами, где верхняя омывает апикальную (просвет) поверхность эпителиального монослоя, а нижняя омывает базолатеральную (серозную) поверхность.

Прежде всего, получали МКПК и готовили их, как описано в Ьадауе е1 а1., (1. У1го1, 2001, 75:4780). Затем МКПК активировали при помощи фитогемагглютинина (ФГ А) в течение 48 ч, инокулировали первичной ВИЧ-1 монофилетической группой С и использовали на 7 сутки после инфекции.

Секреты шейки матки и влагалища (разведение 1/50), полученные, как описано в примере 2 (14, 18 и 23 неделя, виросомоподобные везикулы-Р1 без адъюванта 36 и 37 в.м., с ΚΚΑΝΤΕδ 61 и 63 и.н. или термолабильным токсином 64 и 65 и.н.), содержащие антитела, инкубировали при 18°С в течение 1 ч с 1-10⁶ ВИЧ-1 + МКПК.

Для инициации трансцитоза вируса 2-10⁶ ВИЧ-1 + МКПК с антителами добавляли в апикальную камеру. Контакт между ВИЧ-1 + МКПК и эпителиальным клеточным монослоем привел в результате к быстрой активной репликации вирионов ВИЧ-1 с последующим их трансцитозом из апикального в базолатеральное поле эпителиальных клеток.

Через 2 ч ингибирование трансцитоза антителом определяли путем обнаружения белка р24 ВИЧ в базолатеральной среде при помощи ИФА (СоиЙег, Ргапсе или РА8ТЕИК. 8ΑΝΟΡΙ, РКАИСЕ). Уровень р24 в отсутствие секретов влагалища или в присутствии Р1 не специфического РаЬ или в присутствии контрольного 1дА 2Р5 измеряли, соответственно, как отрицательный и положительный контроль. Значение для отрицательного контроля взято при 100% трансцитозе и использовано для представления результатов.

Эксперименты проводили, по меньшей мере, дважды.

Полученные результаты представлены на фиг. 5.

Результаты указывают на то, что секреты шейки матки и влагалища кроликов, иммунизированных виросомоподобными везикулами-Р1 без адъюванта (36 и 37), или с человеческим КАИТЕ8 (61 и 63), или с термолабильным токсином (ТЛТ) (64 и 65), полученные, как описано в примере 2, способны сдерживать трансцитоз ВИЧ-1 монофилетической группы С через клетки НТ-29.

Без адъюванта и с ТЛТ обнаружено ингибирование от 70 до 90% при использовании секрета шейки матки и влагалища, отобранного на 18 неделю.

С 11К.АИТЕ8 обнаружено ингибирование от 85 до более чем 90% при использовании секрета шейки матки и влагалища, отобранного на 23 неделю.

Пример 4. Иммунизация макак композицией вакцины, содержащей виросомоподобную везикулу с антигенным пептидом, производным от др-41, Р1, локализованным на внешней поверхности.

Три группы от 5 до 6 самок макак в возрасте приблизительно 5 лет подготовили для получения виросомоподобных везикул, приготовленных, как изложено в примере 1.

Виросомоподобную везикулу вводили или внутримышечно (макаки с 01.1 по С1.5), или вводили интраназально (макаки с 02.1 по С2.5), или вводили внутримышечно и интраназально (макаки с 03.1 по 03.6).

Применяли следующую схему введения.

За четыре недели до первого введения препаратов макакам внутримышечно вводили инъекции

- 12 018084 инактивированного вируса гриппа А (100 мкл инактивированного вируса гриппа А, 0,01 мг/мл).

Затем макакам вводили виросомоподобные везикулы (40 мкг, 100 мкл) на 0, 4 и 12 неделю.

Образцы ректальных смывов и секретов влагалища отбирали на 25 и 26 недели. Уровень общих антител, 1дС и 1дЛ, измеряли в соответствии со следующим протоколом ИФА.

Пептид Р1 (100 нг/100 мкл/лунки, 8ЕО ГО N0: 3) в бикарбонатном буфере 50 мМ, рН 9,6 использовали для покрытия планшетов Νιιηο в течение ночи при 4°С.

Планшеты насыщали 2% БСА/0,1% ФБРТ (ФБР + Т\тееп) в течение 1 ч при 30/37°С, затем промывали 0,1% буфером ФБР-Т\тееп.

Образцы ректальных смывов, не разбавленные, или секреты влагалища, разбавленные 1/2 0,1% ФБРТ, инкубировали в течение ночи при 4°С.

Планшеты затем промывали 0,1% буфером ФБР-Тгееп и инкубировали с первичными антителами, разбавленными в 2% БСА/0,1% ФБРТ.

Для обнаружения 1§С макак использовали козье антитело против 1§С макак (Коск1апб) (1/15000) с последующей инкубацией со стрептавидином-ПХ (1ттипо1есй), разбавленным 1/50000.

Для обнаружения 1дА макак использовали козье антитело против 1дА макак (Коск1апб) (1/15000) с последующей инкубацией со стрептавидином-ПХ (1ттипо1есй), разбавленным 1/50000.

Моноклональное антитело 2Р5-1дА использовали в качестве положительного контроля с последующей инкубацией с меченным биотином козьим РаЪ'₂ против человеческого 1дА (конечная концентрация 0,14 мкг/мл) (Са11ад Н 14015) и выявляли при помощи стрептавидина-Х (1/50000).

Моноклональное антитело 2Р5-1дС использовали в качестве положительного контроля с последующей инкубацией с меченным биотином козьим РаЪ'₂ против человеческого 1дС (конечная концентрация 0,1 мкг/мл) (Коск1апб 609106123) и выявляли при помощи стрептавидина-ПХ (1/50000).

Антитела инкубировали в течение 1 ч при 37°С.

Колориметрическую реакцию запускали, добавляя субстрат тетраметилбензол, и останавливали, добавляя 1М Н₂РО₄.

Оптическую плотность (ОП) регистрировали при 450 нм.

Полученные результаты представлены на фиг. 6 и 7 (1дС и 1дА секреты влагалища) и фиг. 8 (ректальные смывы).

Результаты демонстрируют, что от 90 до 95% самок макак имеют хорошие уровни специфических антител 1дС и 1дА против др41 в генитальных секретах и более чем 95% имеют специфические антитела 1дА против др41 в ректальных смывах.

В заключение, присутствие антител 1дС, а также 1дА обнаружено в вагинальных секретах и ректальных смывах иммунизированных самок макак.

Результаты выявили, что с использованием вакцины по изобретению может быть получен иммунный ответ с антителами слизистой оболочки.

Дополнительно обнаружено, что антитела 1дА и 1§С могут перераспределяться в генитальных и интестинальных компартментах даже после вакцинации путем внутримышечной инъекции при отсутствии мукозального адъюванта.

Пример 5. Ингибирование трансцитоза ВИЧ секретами влагалища и ректальными смывами, полученными у иммунизированных макак по примеру 4.

Для штаммов К5 ВИЧ-1 (У29 первичный ВИЧ - монофилетическая группа В из ΝΙΗ и У25 первичный ВИЧ - монофилетическая группа С из ΝΙΗ) трансцитоз через эпителиальные клетки и нейтрализацию трансцитоза антителами осуществляли на линии эпителиальных клеток НТ-29, выращиваемых в виде плотного поляризованного монослоя в течение 7 суток на проницаемой фильтровальной подложке (размер пор 0,45 мкм) с образованием интерфейса между двумя независимыми камерами, где верхняя омывает апикальную (просвет) поверхность эпителиального монослоя, а нижняя омывает базолатеральную (серозную) поверхность.

Прежде всего, получали МКПК и готовили как описано в Ьадауе е1 а1., (I. У1то1, 2001, 75:4780). Затем МКПК активировали при помощи фитогемагглютинина (ФГА) в течение 48 ч и инокулировали первичным ВИЧ-1 - монофилетической группой В (У29) или первичным ВИЧ-1 монофилетической группой С (У25) и использовали на 7 сутки после инфекции.

Секреты влагалища (разведение 1/25) или ректальные смывы (разведение 1/25), полученные, как описано в примере 4, на 25 неделю, содержащие антитела, инкубировали при 18°С в течение 1 ч с 1 -10⁶ ВИЧ-1+ МКПК.

Для инициации трансцитоза вируса 2-10⁶ ВИЧ-1 + МКПК (У29 или У25) с антителами добавляли в апикальную камеру. Контакт между ВИЧ-1 + МКПК и эпителиальным клеточным монослоем привел в результате к быстрой активной репликации вирионов ВИЧ-1 с последующим их трансцитозом из апикального в базолатеральное поле эпителиальных клеток.

Спустя 2 ч ингибирование трансцитоза антителом определяли путем обнаружения белка р24 ВИЧ в базолатеральной среде при помощи ИФА (СоиНет, Ртапсе или РА8ТЕИК 8ΛΝ0ΕΙ, ΡΚАNСΕ). Уровень р24 в отсутствие секретов влагалища или в присутствии не специфичного к Р1 РаЪ или в присутствии

- 13 018084 контрольного 1дА 2Р5 измеряли, соответственно, в качестве отрицательного и положительного контроля. Значение для отрицательного контроля было взято при 100% трансцитозе и использовано для представления результатов.

Эксперименты проводили, по меньшей мере, дважды.

Полученные результаты представлены на фиг. 9 (секреты влагалища) и на фиг. 10 (ректальные смывы).

Результаты свидетельствуют о том, что антитела способны предотвращать по меньшей мере 60% проникновения ВИЧ через слизистый эпителий в человеческой модели ίη νίΐτο и до 98% у двух из шестнадцати животных.

Таким образом, вакцина по изобретению способна запускать иммунный ответ в виде 1дС. а также 1дА слизистой оболочки. Иммунный ответ слизистой оболочки способен значительно уменьшить трансцитоз ВИЧ через слизистую оболочку для различных монофилетических групп ВИЧ.

Перечень последовательностей <110> МАЙМЕТИКС КОРПОРЕЙШН

ИНСТИТУТ НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛА САНТ ЭТ ДЕ ЛА РЕШЕРШ МЕДИКАЛЬ (ИНСЭРМ)

ПЕВИОН БИОТЕХЛТД.

<120> Виросомоподобные везикулы, содержащие антигены, производные от др41.

<130> ΙΝ-16224/ΕΑ-ΝΡ/ΡΟΤ <150> РСТ/1В2006/000466 <151 > 2006-03-03 <160> 5 <170> Ра1еп11п νβΓβίοη 3.1 <210=* 1 <211> 143 <212= белок <213> Ното зар|епз <400> 1

С!п А1а Агд ΘΙη 1_еи Ьеи Зег С1у Не Уа1 ΘΙη ΘΙη ΘΙη Азп Азп Ьеи

5 1015

Ьеи Агд А1а Не О1и А1а 6Ιη С1п Ηί3 Ьеи Ьеи ΘΙη Ьеи ТЬг Уа1 Тгр

2530 <31у Не Ьуз ΘΙη Ьеи ΘΙπ А1а Агд Не Ьеи А1а Уа1 С1и Агд Туг Ьеи

4045

Ьуз Азр ΘΙη ОIп Ьеи Ьеи 61у Не Тгр 61у Суз Зег 61у Ьеи Не Суз

5550

ТНг ТЬг А1а Уа1 Рго Тгр Азп А1а Зег Тгр Зег Азп Ьуз Зег Ьеи 61и

70 7580

ΘΙη Не Тгр Азп Юз ТНг ТКг Тгр Ме1 С1и Тгр Азр Агд С!и Не Азп

9095

- 14 018084

Азп Туг ТЬг бег	Ьеи Не Н1з	бег	Ьеи	Не С1и ΘΙυ бег ΘΙη Азп ΘΙη
100			105		110
ΘΙη С!и Ьуз Азп	ΘΙυ ΘΙη ΘΙυ	Ьеи	Ьеи	С1и	Ьеи Азр Ьуз Тгр А1а бег
115		120			125
Ьеи Тгр Азп Тгр	РЬе Азп Не	ТЬг	Азп	Тгр	Ьеи Тгр Туг Не Ьуз
130	135				140

<210>	2
<211>	35
<212>	белок
<213>	Ното зар1епз
<400>	2

бег ΘΙη ТЬг ΘΙη ΘΙη ΘΙυ Ьуз Азп С1и ΘΙη ΘΙυ Ьеи Ьеи О1и Ьеи Азр 15 10 15

Ьуз Тгр А1а бег Ьеи Тгр Азп Тгр РЬе Азр Не ТЬг Азп Тгр Ьеи Тгр 20 25 30

Туг Не Ьуз <210> 3 <211> 35 <212> белок <213> Ното зар|епз <400> 3 бег ΘΙη ТЬг ΘΙη ΘΙη ΘΙυ Ьуз Азп ΘΙυ ΘΙη С1и Ьеи Ьеи А!а Ьеи Азр 15 10 15 бег Тгр Ьуз Азп Ьеи Тгр Азп Тгр РЬе бег Не ТЬг Азп Тгр Ьеи Тгр

25 30

Туг Не Ьуз <211> 38 <212> белок <213> Нотозар1еп$ <400> 4

Зег ΘΙη ТЬг ΘΙη ΘΙη ΘΙιι Ьуе Азп Θ 1и ΘΙη С1и Ьеи Ьеи А1а Ьеи Азр 15 1015

Зег Тгр Ьу® Аеп Ьеи Тгр Азп Тгр РЬе Зег Не ТЬгАзп Тгр Ьеи Тгр 20 2530

Туг Не Ьуз Ьеи 61у Суз

<210>	5
<211>	26
<212>	белок
<213>	Ното зар!епз
<400>	5

ΘΙη Рго Ме1 А1а Ьеи Не Х/а1 Ьеи О1у С1у νβΙ А1а С1у Ьеи Ьеи Ьеи 15 1015

РЬе Не С1у Ьеи С1у Не РЬе РЬе Суз Уа!

Claims (27)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Виросомоподобная везикула, содержащая антиген, производный от др41, который представляет собой Р1 пептид, раскрытый в описании;

   ковалентно связан за счет своего С-конца с липидом указанной виросомоподобной везикулы; локализован на внешней поверхности указанной виросомоподобной везикулы;

   находится в подходящей конфигурации для того, чтобы придать указанной виросомоподобной везикуле способность вызывать иммунный ответ против белка др41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), причем указанная везикула содержит по меньшей мере один функциональный вирусный белок слияния с мембраной, не происходящий из ВИЧ.
2. 2. Виросомоподобная везикула по п.1, где указанный Р1 пептид включает по меньшей мере один расположенный на С-конце образующий ковалентную связь аминокислотный остаток.
3. 3. Виросомоподобная везикула по п.2, где указанный аминокислотный остаток выбран из Сук или Бук.
4. 4. Виросомоподобная везикула по п.2 или 3, где указанный Р1 пептид дополнительно содержит по меньшей мере один разделяющий остаток между указанными остатками, образующими ковалентную связь, расположенными на С-конце, и Р1 пептидом.
5. 5. Виросомоподобная везикула по п.4, где указанный разделяющий остаток выбран из остатков О1у, А1а, 8ег, Акр, Бук, О1и, Н1к, Не и Беи.
6. 6. Виросомоподобная везикула по любому из пп.1-5, где указанный липид выбран из амфифильных производных полиэтиленгликоля (ПЭГ), фосфатидилэтаноламина (ФЭ), фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилсерина, холестерина или их смеси.
7. 7. Виросомоподобная везикула по п.6, где указанный Р1 пептид связан с указанным липидом при помощи бифункционального сукцинатного линкера, в частности γ-малеимидомасляной кислоты Νгидроксисукцинимидного эфира или Ν-γ-малеимидобутирилоксисукцинимидного эфира.
8. 8. Виросомоподобная везикула по любому из пп.1-7, где указанный Р1 пептид находится в форме моно-, ди-, три- или тетрамера и их смесей.
9. 9. Виросомоподобная везикула по любому из пп.1-8, где указанный Р1 пептид выбран из монофилетических групп ВИЧ типа А, В, С или Б.
10. 10. Виросомоподобная везикула по любому из пп.1-9, где Р1 пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕО ГО N0: 2 и 8Е0 ГО N0: 3.
11. 11. Виросомоподобная везикула по любому из пп.1-10, которая включает липидный бислой, содержащий липиды, выбранные из катионных липидов, синтетических липидов, гликолипидов, фосфолипидов, глицерофосфолипидов, гликосфинголипидов, сфинголипидов, холестерина и их производных.
12. 12. Виросомоподобная везикула по любому из пп.1-11, дополнительно включающая по меньшей мере один адъювант, усиливающий и/или опосредующий иммунный ответ, выбранный из врожденного иммунного ответа или адаптивного иммунного ответа.
13. 13. Виросомоподобная везикула по п.12, где адаптивный иммунный ответ выбран из Т_Н1 и/или Т_Н2 иммунного ответа.
14. 14. Виросомоподобная везикула по п.12 или 13, где указанный адъювант выбран из солей алюминия, алюминийфосфатных гелей, микобактерий, таких как ВСО, М. уассае, или СогуиеЬас1егшш рагуит, пептидов, гемоцианина моллюска фиссурелы, дипептидных и трипептидных производных мурамила, монофосфориллипида А, интерлейкина-2 (ГБ-2), ГБ-12, колониестимулирующего фактора гранулоцитовмакрофагов (0М-С8Б), лигандов хемокинового семейства, таких как КАЫТЕ8 (регулируемый при активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками), липопротеина грамположительных бактерий, компонента клеточной стенки дрожжей, двухцепочечной РНК, липополисахарида грамотрицательных бактерий, флагеллина, И-обогащенной одноцепочечной вирусной РНК, СрО-содержащей ДНК, супрессирующей цитокиновый сигнальный путь малой интерферирующей РНК (80С8 к|КУА), пептидов-производных меллитина, пан БК эпитопа (РАБКЕ) и их смесей.
15. 15. Виросомоподобная везикула по любому из пп.12-14, где указанный адъювант инкапсулирован внутри указанной везикулы, и/или включен в липидный бислой указанной везикулы, и/или свободно комбинирован с указанной везикулой.
16. 16. Виросомоподобная везикула по любому из пп.1-15, дополнительно содержащая нацеливающую группу, специфичную в отношении ткани или клетки, выбранную из рецептора клеточной поверхности, хемокина, цитокина, фактора роста, антитела или фрагмента антитела, пептидной последовательности, имеющей специфичность или специфический заряд, комплементарные молекуле адгезии.
17. 17. Виросомоподобная везикула по п.16, где указанная нацеливающая группа, специфичная в отношении ткани или клетки, включена в или присоединена к липидному бислою указанной везикулы.
18. 18. Фармацевтическая композиция, содержащая виросомоподобные везикулы по любому из пп.117.
19. 19. Фармацевтическая композиция по п.18, дополнительно содержащая везикулы, включающие Р1 пептид, инкапсулированный внутри указанной везикулы, в виде комбинированного препарата для одно

    - 16 018084 временного, раздельного или последовательного применения при иммунотерапии.
20. 20. Фармацевтическая композиция по п.18 или 19, содержащая также дополнительные виросомоподобные везикулы, содержащие антиген, отличающийся от указанного пептида Р1, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в иммунотерапии.
21. 21. Применение по меньшей мере одной виросомоподобной везикулы по любому из пп.1-17 для изготовления фармацевтической композиции, предназначенной для того, чтобы вызывать адаптивный иммунный ответ и врожденный иммунный ответ, направленный против белка др41 вируса иммунодефицита человека.
22. 22. Способ лечения и/или профилактики ВИЧ-инфекции, включающий стадию введения индивиду, нуждающемуся в этом, эффективного количества виросомоподобных везикул по любому из пп.1-17.
23. 23. Способ по п.22, где указанные виросомоподобные везикулы вводят путем инъекции, или через слизистую оболочку, или с помощью комбинации этих путей.
24. 24. Способ по п.23, где указанный путь через слизистую оболочку выбран из мочеполового пути, желудочно-кишечного пути, аноректального пути, респираторного пути введения, через слизистые оболочки верхних дыхательных путей или назально-ротового пути и их комбинаций.
25. 25. Способ по любому из пп.22-24, где дополнительно по отношению к указанным виросомоподобным везикулам вводят везикулы, содержащие Р1 пептид, инкапсулированный внутри указанных везикул.
26. 26. Способ по любому из пп.22-25, где указанные виросомоподобные везикулы вводят в комбинации с дополнительным антигеном, отличающимся от указанного пептида Р1.
27. 27. Набор для индукции иммунного ответа против белка др41 вируса иммунодефицита человека, содержащий виросомоподобную везикулу по любому из пп.1-17, содержащую пептид Р1, представленный последовательностью, выбранной из 8ЕО ΙΌ N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 3, и виросомоподобную везикулу, содержащую антиген, производный от др41, представленный последовательностью 8Е0 ГО N0: 1.

    8ΕΟΙΡΝΟ1:

    р ΑΚρίΧδΟίνί} ρςΝΝΙΧΒΑΙΕ Ας^ΗΕΕ^ΕΤν ХУСЕКХЗЕрАШ ЬАУЕКУтХ} рььепуосзо КЫСТТАУР\У ИАЗУУЗЖЗЬЕ φΠνΝΗΤΤννΜΕ УУОКЕПШУТЗ ЫНЗЫЕЕЗр Νζ)<3ΕΚΝΕζ>ΕΕ ЬЕЬИКЖАЗЫУ Ν\νΕΝΙΤΝν/Ε\ν ΥΙΚ

    8ΕΟΙΡΝΟ2:

    8ф ΤΟφΕΚΝΕρΕΕ ЬЕ1Х>КЖА81Л¥ ЭТИОГПЛУЬУУ ΎΊΚ

    8Е0 Ю N0 3:

    ΚρΤρΟΕΚΝΕρΕΕΚΜΟδντεΝΕνΛΛνΡδΙΤΝνιΤνΓϊΈζ

    3Ε0ΙΡΝΟ4:

    80Τς0ΕΚΝΕςΕΕΕΑΕΟ5ν^34Εν,Τ<ν7Ε8Ι1^ΛνΕ^^ΥΙΚΕΟ0