BR112016001686B1 - Vacina, método para a preparação de uma vacina, composição, e, uso de uma composição - Google Patents

Abstract

VACINA, MÉTODOS PARA A PREPARAÇÃO DE UMA VACINA, PARA A VACINAÇÃO DE AVES E PARA ACELERAR A RESPOSTA IMUNE EM AVES, COMPOSIÇÃO, USOS DE UMA COMPOSIÇÃO E DE UM AGONISTA DE TLR21, E, AGONISTA DE TLR21. A adição de um oligodesoxinucleotídeo que é um agonista de TLR21 aviário em uma vacina do vetor do Herpesvírus aviário fornece uma aceleração da resposta imune contra o antígeno que é expresso e dispensado pelo vetor do Herpesvírus.

Description

[001] A presente invenção se refere ao campo de imunologia de vacina veterinária e, em particular, a uma vacina compreendendo um vetor do Herpesvírus aviário, um oligodesoxinucleotídeo e um carreador farmaceuticamente aceitável. A invenção também se refere a métodos para e usos da vacina e do oligodesoxinucleotídeo.

[002] Estabeleceu-se bem que oligodesoxinucleotídeo pode estimular o sistema imune inato presente na maioria dos vertebrados. Isto foi primeiramente reportado para os motivos de CpG não metilado presentes em DNA bacteriano por Krieg et al. (1995, Nature, vol. 374, p. 546). Nas duas décadas subsequentes este processo foi descrito como uma parte da resposta imediata à invasão de um micro-organismo, pelo reconhecimento de estruturas conservadas (assim chamadas padrões moleculares associados a patógeno) existente, por exemplo, no material genômico dos vírus e bactérias. Com esses propósitos, o sistema imune inato emprega receptores de reconhecimento padrões específicos tais como receptores tipo Toll (TLRs).

[003] TLRs são glicoproteínas de transmembrana tipo I, e a aglutinação de um ligante agonístico induz a dimerização dos TLRs que leva, para a maioria dos TLRs, à aglutinação de MyD88. Isto inicia uma cascata de sinalização celular resultando na ativação do fator de transcrição NFkappaB. Isto por sua vez leva à expressão de interferons tipo 1 (IFNlα e IFNlβ), e citocinas proinflamatórias (interleucina (IL)1 beta, IL6, IL8, IL10, IL12, e fator alfa de necrose tumoral). Além disto, é uma base para o estímulo da resposta imune adquirida secundária. (Kawai & Akira, 2010, Nature Immunol., vol. 11, p. 373).

[004] Em mamíferos, o TLR dedicado à detecção de motivos de CpG não metilado é TLR9. Entretanto, no genoma de aves, nenhum gene de TLR9 está presente; ao contrário, observou-se que TLR21 age como um homólogo funcional em TLR9 de mamífero (Brownlie et al., 2009, Mol. Immunol., vol. 46, p. 3163; Keestra et al., 2010, J. de Immunol., vol. 185, p. 460). TLR21 não foi estudado tão extensivamente quanto TLR9, mas os dois compartilham inúmeras similaridades funcionais: especificidade para motivos de CpG não metilado, e uma localização intracelular.

[005] O uso de um oligodesoxinucleotídeo contendo CpG não metilado imunoestimulador (INO), como vacina adjuvante foi descrito (Krieg, A.M., 2007, Proc. Am. Thorac. Soc., vol. 4, p. 289), também para aplicações veterinárias. Isto foi aplicado, por exemplo, para aves domésticas, em uma vacina para proteger galinhas contra Doença de Newcastle (Linghua et al., 2007, Vet. Immun. and Immunopath., vol. 115, p. 216); contra doença de bolsa infecciosa (Mahmood et al., 2006, Vaccine vol. 24, p. 4838); ou influenza aviária (Hung et al., 2011, Vaccine, vol. 29, p. 29). Para uma revisão, vide Dar et al. (2009, Japan Poultry Science, vol. 46, p. 69).

[006] Recentemente, diversas famílias de INOs foram descritas, vide: WO 2012/089,800 (família X4), WO 2012/160,183 (família X43), e WO 2012/160,184 (família X23). Esses INOs são particularmente efetivos como agonistas para TLR21 aviário, causando um alto efeito imunomodulador a baixas concentrações. Sua adição em uma vacina intensifica a imunogenicidade do componente antígeno nesta vacina. Consequentemente, a quantidade de um antígeno em uma vacina com agonista de TLR21 como esse poderia ser reduzida, obtendo ao mesmo tempo o mesmo nível de imunoproteção sem o agonista.

[007] Em mamíferos, TLR9 é abundantemente expresso nas células dendríticas plasmacitoides. Essas células são produtoras profissionais de interferons tipo I, que é um forte agente antiviral. Consequentemente, uma atividade importante de um agonista de TLR9 é como agente antiviral, em particular contra vírus de DNA, tais como Adenovírus ou Herpesvírus; vide Tang et al. (2010, Sci. China Life Sci., vol. 53, p. 172). Isto é muito efetivo na prática, por exemplo, Adenovírus que era para servir como vetor para dispensação gênica foi rapidamente depurado de um hospedeiro inoculado pelo efeito antiviral da ativação do TLR9 que foi induzido (Nayak & Herzog, 2010, Gene Ther., vol. 17, p. 295). Similarmente, diversos tipos de Herpesvírus são efetivamente atacados pelo sistema imune inato, tais como HSV1, HSV2, VZV, e Citomegalovírus (Yu et al., 2011, Cell. Mol. Imunol., vol. 8, p. 181; Gaajetaan et al., 2012, Antiviral Res., vol. 93, p. 39; Ong et al., May 2013, Blood, DOI 10.1182; Zhang et al., 2013, Plos One, vol. 8, e52003; e uma revisão por Martinez-Martin, 2010, Frontiers em Biosc. S2, p. 718). Este efeito antiviral foi também detectado para um Herpesvírus veterinário: infecção pelo vírus Pseudorabies em leitões (Linghua et al., 2008, Vaccine, vol. 26, p. 224).

[008] Conclusivamente: agonistas TLR9 são conhecidos por serem fortes imunoestimuladores, induzindo a depuração efetiva de uma infecção viral, em particular de vírus de DNA tal como Herpesvírus.

[009] Uma maneira bem conhecida para a vacinação ativa de um organismo alvo é por inoculação com um vetor; tipicamente isto é um microorganismo recombinante vivo de baixa patogenicidade que replica no alvo, e expressa um antígeno de um micro-organismo patogênico, contra o qual o alvo tem que ser vacinado. Esta é uma alternativa conveniente para uma vacinação inativada clássica que normalmente emprega grandes quantidades de antígeno, em doses repetidas, e um adjuvante para intensificar o sistema imune do alvo.

[0010] Característica para uma vacina de vetor, sendo um microorganismo vivo e infeccioso, é sua capacidade de replicar. Esta replicação fornece inúmeras vantagens, por exemplo: a vacina de vetor pode ser dada em quantidades relativamente baixas, e o vetor fornece uma apresentação de longa duração do antígeno expresso para o sistema imune do alvo.

[0011] De uma maneira, a inoculação de um organismo alvo com uma vacina de vetor recombinante vivo assim não é muito diferente de uma kpfge>«q òpqniK-cr. g gpxqnxg q guVcdgngekogpVq fg woc kpfee>«q rtqfwVkxc pelo vetor, e a indução de uma resposta imune no alvo. O desenvolvimento da imunidade contra o vetor por si mesmo (caso exista) pode não ser tão relevante quanto aquele contra o antígeno que o vetor dispensa, por expressão de um gene que é heterólogo para o vetor. Este gene é tipicamente derivado de um micro-organismo que é patogênico para o alvo, e codifica um antígeno da proteína (ou a parte relevante da mesma) que induz uma imunidade protetora contra o micro-organismo do doador patogênico.

[0012] Diversos tipos de vetores de vacina são conhecidos, com base em uma diversidade de micro-organismos tais como vírus, bactérias ou parasitas. Inúmeros destes estão sendo usados comercialmente, especialmente no campo veterinário, onde a economia de uma vacina de vetor viva é mais relevante: uma vacina relativamente barata que pode ser administrada nos seus alvos por métodos de vacinação em massa. Um exemplo excelente de um mercado veterinário de alto volume, margem baixa é criação de aves domésticas.

[0013] As vacinas de vetor viral mais usadas para aves domésticas são baseadas em Herpesvírus aviário, tais como vírus da enterite de pato (DEV), vírus de laringotraqueíte infecciosa (ILTV), ou vírus da Herpes do Peru (HVT).

[0014] DEV é um alfa-herpesvírus que infecta todas as idades de pássaros da ordem Anseriformes (patos, gansos e cisnes). É também chamado HerpesVirus-1 Anatídeo, ou Herpesvírus da peste de pato. Ele foi usado como vacina de vetor contra influenza aviária (Liu et al., 2011, J. de Virol., vol. 85, p. 10989).

[0015] ILTV é também conhecido como Herpesvírus de Gallid 1, e causa grave infecção respiratória em galinhas e faisões. Em uma forma atenuada, ele também foi usado como vetor contra influenza aviária (Pavlova et al., 2009, Vaccine, vol. 27, p. 773).

[0016] HVT é um vírus da família vírus da doença de Marek (MDV), que são Alfaherpesvirideae que infectam espécies de ave. HVT é um MDV sorotipo 3, e é também conhecido como: Herpesvírus de Meleagrid 1, ou Herpesvírus de peru. Observou-se que HVT é completamente apatogênico para galinhas, e é uma vacina comum, por exemplo, cepas de HVT FC-126 e PB1.

[0017] MDV sorotipo 2 (MDV2, também conhecido como Herpesvírus de Gallid 3), é praticamente apatogênico para galinhas. Ele foi usado como um vetor e como uma vacina, por exemplo, cepa SB1. (Petherbridge et al., 2009, J. Virol. Meth., vol. 158, p. 11).

[0018] MDV sorotipo 1 (MDV1, Herpesvírus de Gallid 2) é originalmente patogênico para aves domésticas, mas cepas atenuadas são conhecidas tais como: RB1B, 814 e CVI-988 Rispens, que são usadas como vacina ou como vetor vivo (Cui et al., 2013, PLoS One, 2013; 8(1): e53340)

[0019] MDV1, MDV2 e HVT são vírus sistêmicos que podem ser aplicados como vacinas em galinhas em uma idade precoce: no dia de sua incubação do ovo (dia um), ou mesmo antes de incubação, enquanto ainda no qxqo GuVc únvkoc cdqtfcigo. cuuko ejcocfc òxcekpc>«q pq qxqó. fi woc hqtoc de vacinação no embrião, que é comumente aplicada em torno do dia 18 do desenvolvimento embriônico (ED), cerca de 3 dias antes da incubação.

[0020] HVT foi usado como uma vacina de vetor viral vivo para um longo tempo (vide WO 87/04463), e para a expressão e dispensação de uma variedade de antígenos de patógenos de aves domésticas, tais como: a proteína de fusão do vírus da Doença de Newcastle (NDV) (Sondermeijer et al., 1993, Vaccine, vol. 11, p. 349); a proteína viral (VP2) do vírus da doença de bolsa infecciosa (IBDV) 2 (Darteil et al., 1995, Virology, vol. 211, p. 481); a proteína de hemaglutinina (HA) do vírus da influenza aviária (AIV) (WO 2012/052.384); e a proteínas gD e gI do vírus de laringotraqueíte infecciosa (ILTV) (Hein et al., 2008, 43rd Natl. meeting Poultry Health & Processing, Ocean City, MD, p. 73-74). Mas também foi descrita a expressão de um antígeno de parasita (Cronenberg et al., 1999, Acta Virol., vol. 43, p. 192). Em um desenvolvimento mais recente, construtos do vetor de HVT foram descritos que expressam mais que um gene heterólogo, por exemplo: os genes NDV F e os IBDV VP2 em WO 2013/057,235, e os genes NDV F e os ILTV gD/gI em WO 2013/057,236.

[0021] Consequentemente, inúmeros vetores de HVT de vacina para aves domésticas são usados comercialmente, por exemplo, expressando a rtqVgipc fg PFX H< Knnqxcz™-PD *OUF Cpkocn Jgcnvj+. g VgVqtowpg™ HVT-PFV *Egxc+= q KDFX VR4< XczzkVgm™ JXV-KDF *Ogtkcl= rtgxkcogpvg fgpqokpcfq< Icnnkxce™ JXV-KDF+. g Xgvqtowpg™ JXV-IBD (Ceva); e o ILTV gD/iK< Kppqxcz™-LT (MSD Animal Health).

[0022] Uma preocupação com o uso de um Herpesvírus vivo como vacina de vetor é o atraso no início de ação da imunidade que ele exige: em virtude de sua natureza, um vetor vivo, tal como um Herpesvírus (aviário), primeiro precisa estabelecer uma infecção produtiva no organismo alvo vacinado e replicar por si mesmo. Tipicamente, isto levará cerca de 3 a 7 dias. Somente então qualquer nível de expressão substancial do gene heterólogo ocorre, depois do que o sistema imune do alvo tem que ficar ativado contra o antígeno expresso; isto leva 2 a 3 semanas. No total pode levar até 4 semanas para desenvolver em um alvo uma resposta imune que pode proteger efetivamente contra um desafio grave pelo patógeno que é o doador do gene heterólogo. Esta não é uma desvantagem principal quando o organismo alvo vive por anos e tem amplo tempo para desenvolver e reforçar sua imunidade. Entretanto, no caso de criação de aves domésticas, o tempo de vida do alvo normalmente é curto, e a pressão de infecção do campo é alta.

[0023] Maneiras de aumentar o nível da imunidade em aves a partir de vacinação de vetor foram encontradas em um aumento do nível de expressão do gene heterólogo inserido, por exemplo, otimizando a força de seu promotor (vide WO 2012/052.384). Entretanto, isto não levou a um início de ação precoce da imunidade. Consequentemente, existe uma necessidade contínua no campo de uma melhoria da imunização de aves com vacinas de vetor vivo, a fim de fornecer uma imunidade protetora mais cedo possível.

[0024] Portanto, é um objetivo da presente invenção superar uma desvantagem e resolver um problema na técnica anterior, permitindo o início de ação precoce da imunidade em aves contra um antígeno que é expresso e dispensado por uma vacina do vetor do Herpesvírus aviário.

[0025] Observou-se surpreendentemente que este objetivo pode ser alcançado pelo uso de um oligodesoxinucleotídeo que é um agonista do receptor tipo Toll de ave (TLR) 21. Isto fornece uma aceleração da resposta imune em aves contra um antígeno expresso por uma vacina do vetor do Herpesvírus aviário.

[0026] Por exemplo, observou-se que, onde uma resposta imune protetora em galinhas jovens contra NDV de um vetor de HVT que carrega o gene NDV-F normalmente leva 3 a 4 semanas após a vacinação para desenvolver, entretanto, com a adição de um agonista de TLR21 aviário, uma proteção efetiva contra uma infecção do desafio de NDV grave foi obtida já nas duas semanas p.v. Quando considerado em relação ao tempo de vida de 6 semanas de um frango de corte, este início de ação precoce de 1 a 2 semanas da imunidade é uma aceleração principal da eficácia de vacinação de vetor, e é de grande relevância para a produção de uma operação de aves domésticas comercial.

[0027] Esta aceleração de imunidade induzida pelo vetor poderia não ser prevista em decorrência de ativação do TLR21 aviário, em virtude de isto ter sido conhecido para sua indução de um efeito antiviral potente, similar à atividade de seu homólogo funcional em mamíferos: TLR9. Os inventores ficaram, portanto, surpresos ao observar que, mediante a adição de um agonista de TLR21 aviário, um vetor do Herpesvírus aviário não foi depurado rapidamente, mas, ao contrário, pôde proliferar e pôde expressar seu gene heterólogo. Em particular, o vetor do Herpesvírus aviário pôde fazer isso de uma maneira que resultou em uma imunidade que foi efetiva contra o antígeno expresso muito cedo após a vacinação, quando comparado com a imunização sem um agonista de TLR21.

[0028] Atualmente não se sabe como ou porquê este fenômeno ocorre, e em virtude de pouco se conhecer do funcionamento do sistema imune de ave (inato), não existe nenhuma explicação disponível pela técnica anterior. Consequentemente, não é conhecido se o efeito observado do agonista de TLR21 é o resultado de uma resposta imune que é mais rápida, mais forte e/ou mais eficiente de algum modo.

[0029] Sem se ligar a nenhuma teoria ou modelo que explicaria essas observações, os inventores especularam que a ativação do sistema imune inato de ave por um agonista de TLR21 aviário, induz um ambiente imunológico na ave alvo que inesperadamente é de suporte, sem ser deletério, para a replicação da expressão por um vetor do Herpesvírus aviário.

[0030] Portanto, em um aspecto, a invenção se refere a uma vacina compreendendo um vetor do Herpesvírus aviário, um oligodesoxinucleotídeo, e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que o vetor do Herpesvírus aviário compreende uma sequência de nucleotídeos heterólogos que codifica um antígeno de um micro-organismo que é patogênico para aves, e em que o oligodesoxinucleotídeo é um agonista do receptor tipo Toll de ave (TLR) 21.

[0031] A vacina de acordo com a invenção proporciona uma aceleração da resposta imune em aves contra um antígeno heterólogo expresso por um vetor do Herpesvírus aviário.

[0032] Woc “xcekpc” fi dgo eqpjgekfc rqt ugt woa composição compreendendo um composto imunologicamente ativo, em um carreador hctocegwVkecogpVg cegkVáxgL Q òeqorquVq kowpqnqikecogpVg cVkxqó. qw òcpVíigpqó fi woc oqnfiewnc swg fi tgeqpjgekfc rgnq ukuVgoc kowpg fq cnxq g induz uma resposta imunológica. A resposta pode originar do sistema imune inato ou do adquirido, e pode ser do tipo celular e/ou do humoral.

[0033] Esta resposta imune ajuda o animal alvo vacinado a prevenir, melhorar, reduzir sensibilidade para, ou tratamento de uma doença ou distúrbio resultante de infecção com um micro-organismo. A proteção é obtida em decorrência de dispensação de pelo menos um antígeno derivado deste micro-organismo. Isto faria com que o animal alvo mostrasse uma redução no número, ou na intensidade, de sinais clínicos causados pelo microorganismo. Isto pode ser o resultado de uma reduzida taxa de invasão, colonização ou infecção pelo micro-organismo, levando a uma redução no número ou a gravidade das lesões e efeitos que são causados pelo microorganismo ou pela resposta do alvo a isso.

[0034] A determinação da efetividade de uma vacina de acordo com a invenção contra um patógeno aviário é bem do conhecimento dos versados na técnica, por exemplo, monitorando a resposta imunológica após a vacinação, ou depois de uma infecção de desafio, por exemplo, monitorando os sinais clínicos de doença dos alvos classificação clínica, parâmetros sorológicos, ou por reisolamento do patógeno, e comparando esses resultados com respostas observados em animais vacinados com preparação vacinal sem antígeno.

[0035] Várias modalidades e preferências de uma vacina de acordo com a invenção serão esboçadas a seguir.

[0036] Q Vgtoq “eqortggpfgpfq” *dgo eqoq xctkc>õgu Vcku eqoq “eqortggpfgo”, “eqortggpfg” g “eqortggpfkfq”+ fc ocpgktc cswk wucfc ug refere a todos os elementos, e em qualquer possível combinação concebível para a invenção, que são cobertos por ou incluídos na seção do texto, parágrafo, reivindicação, etc., nos quais este termo é usado, mesmo se tais elementos ou combinações não forem explicitamente citados; e não se refere à exclusão de qualquer dos tais elemento(s) ou combinações. Consequentemente, qualquer seção do texto, parágrafo, reivindicação, etc., como esses podem também se referir a uma ou mais modalidades em que o Vgtoq “eqmrteenfenfq” *qw uwcu xctkc>õgu) é substituído por expressões tais eqoq “eqnukuVe eo”, “eqnukuVknfq go” qw “eqnukuVe guugpekcnogpVg go”

[0037] Q Vetmq “axkátkq” ue tehete a wm qtiankumq fcu cxeu fc encuue taxonômica; organismos aviários preferidos são aves de relevância para humanos ou para ciência veterinária, tais como: galinha, peru, pato, ganso, retfkz, rax«q, eqfqmkz, rqmdq, haku«q, ianknja fóaniqna, VenVüj«q, ianq, periquito, papagaio, ara, arara, cacatua, tentilhão, falcão, gavião, emu, casuar e avestruz. Mais preferidos são organismos de ave selecionados do grupo que consiste em: galinha, peru, pato e ganso. Mais preferido é galinha. Para a invenção, uma ave pode ser de qualquer raça, tipo ou variedade, tais como: poedeiras, procriadoras, frangos de corte, raças de combinação, ou linhagens parentais de qualquer de tais raças. Tipos preferidos são: frango de corte, procriadoras e poedeiras. Mais preferidos são frangos de corte.

[0038] Para a invenção, não é necessário ter as mesmas espécies de ave do alvo para vacinação que a origem do vetor do Herpesvírus aviário e que a origem do micro-organismo que é patogênico para aves. Um, dois ou todos esses podem ser de diferente origem de ave. Por exemplo: uma vacina para galinhas, baseada em um vetor do Herpesvírus de perus (HVT), expressando um antígeno HA do vírus da influenza aviária isolado de uma gaivota.

[0039] Wm “Jetreuxírau” fi dem eqnheekfq na vfienkea, e fi wm xítwu que pertence à família taxonômica do Herpesviridae. Preferidos são Herpesvírus da subfamília Alphaherpesvirinae. Mais preferidos são DEV, ILTV, HVT, MDV2 e MDV1. Ainda mais preferidos são HVT, MDV2 e MDV1; mais preferido é HVT.

[0040] Portanto, em uma modalidade preferida de uma vacina de acordo com a invenção, o vetor do Herpesvírus aviário são um ou mais selecionados de: vírus da enterite de pato, vírus de laringotraqueíte infecciosa, Herpesvírus de perus, vírus da doença de Marek sorotipo 2, e vírus da doença de Marek sorotipo 1.

[0041] Wo “xgVqt” rctc c kpxgp>«q fi dgo eqpjgekfq pc vfiepkec. eqoq um micro-organismo do carreador recombinante vivo que sobrevive em uma ave alvo inoculada sem dano aparente para o alvo, e expressa e dispensa no sistema imune do alvo um antígeno expresso de uma sequência de nucleotídeos heterólogos que ele compreende. Como ficará aparente aos versados na técnica, um vetor em princípio pode expressar e dispensar mais que um antígeno, codificado por um ou mais gene(s) heterólogo(s).

[0042] Preferivelmente, o vetor do Herpesvírus para a vacina de acordo com a invenção é derivado de uma vacina do vetor do Herpesvírus estabelecida, com um registro provado de replicação e expressão estáveis e efetivas do antígeno heterólogo.

[0043] Para a construção de um vetor do Herpesvírus aviário como descrito para a invenção, o material de partida é o virion da Herpes, que é uma partícula do vírus envelopado, contendo um genoma relativamente grande de DNA de fita dupla linear. Os Herpesvírus aviário têm uma organização de genoma comum e conservada com regiões longas exclusivas e curtas exclusivas, flanqueadas por repetições. Diversas sequências genômicas Herpeuxktcku u«q rwdnkecogpVg fkurqpixgku, rqt gzgornq. rgnc IgnDcnm™< DEV: EU082088, ILTV: NC_006623, HVT: AF291866, MDV2: HQ840738, e MDV1: AF147806.

[0044] Diferentes técnicas biológicas moleculares podem ser usadas para a inserção de uma sequência de nucleotídeos heterólogos em vetores do Herpesvírus (aviário). Por exemplo, para HVT, usando recombinação homóloga (Sondermeijer et al., 1993, supra), regeneração de cosmídeo (US 5.961.982), ou bacmídeos (cromossomos artificiais bacterianos) (Baigent et al., 2006, J. de Gen. Virol., vol. 87, p. 769). As técnicas de inserção preferidas são por regeneração de cosmídeo, por exemplo, como descrito em WO 93/25.665, ou usando bacmídeos, como descrito em EP 996,738. Isto essencialmente emprega um conjunto de fragmentos subgenômicos de sobreposição grandes do genoma do vetor do Herpesvírus aviário para reconstruir um genoma completo por cotransfecção nas células hospedeiras. Como um dos cosmídeos carrega um cassete de expressão, este fica estavelmente integrado no genoma do vetor do Herpesvírus aviário.

[0045] Também, diversos locais não essenciais adequados para a inserção de um construto de gene heterólogo em um genoma do Herpesvírus aviário foram descritos; por exemplo, para HVT: na região curta exclusiva (EP 431,668), ou na região longa exclusiva do genoma (WO 87/04463). Locais de inserção preferidos são os locais Us2 e Us10.

[0046] Além do mais, diferentes promotores foram descritos para acionar a expressão de uma sequência de nucleotídeos heterólogos em vetor do Herpesvírus aviário, tais como: o promotor gpX de PRV (WO 87/04.463), o promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous, o promotor do gene precoce SV40, o promotor do gene imediato precoce de citomegalovírus de humano (hCMV IE1) (EP 719.864), e o promotor do gene beta-actina de galinha (EP 1.298.139).

[0047] Q Vgtoq “jgVgt„nqiq” rctc c kpxgp>«q. kpfkec swg c ugswêpekc de nucleotídeos não está presente no micro-organismo vetor parental que foi usado para gerar o vetor para a invenção.

[0048] C gzrtguu«q “ugswêpekc fg pwengqvifgqu” fi eqpjgekfc pc técnica como uma cadeia molecular de nucleotídeos, com a capacidade de ÒeqfkhkectÓ wo cpviigpq fc rtqvgipc0 Guvg fi wo eqpegkvq dgo eqpjgekfq go biologia molecular e se refere ao dogma central de biologia molecular em que uma sequência de DNA é transcrita no RNAm, e o RNAm é traduzido na sequência de aminoácidos de (uma parte de) uma proteína. Dessa maneira, woc ugswêpekc fg pwengqvífgqu guVá “eqfkfiecpfq” woc rtqVgíPCo

[0049] Para resultar na expressão real de um antígeno da proteína, a sequência de nucleotídeos é preferivelmente um quadro de leitura aberto (ORF), indicando que ela não contém códons de parada indesejados que terminariam prematuramente a transcrição no RNAm. A sequência de pwengqvífgqu rqfg ugt wo ÒigpgÓ *kuvq fi. wo QTH swg eqfkhkec woc rtqvgípc completa), ou ser um fragmento do gene. Ela pode ser de origem natural ou sintética. Também, a sequência de nucleotídeos precisa estar sob o controle de uma sequência promotora, que inicia o processo de transcrição. Isto é eqowogpVg tghetkfq eqoq q rtqoqVqt ugpfq “qretcekqpcnoepVe nkicfq” pc sequência de nucleotídeos, onde ambos são conectados no mesmo DNA, em proximidade efetiva, e sem sinais ou sequências entre eles que interfeririam em uma transcrição efetiva.

[0050] Para a invenção, a sequência promotora usada pode em princípio ser qualquer promotor, desde que uma expressão efetiva e sustentada da sequência de nucleotídeos heterólogos seja fornecida.

[0051] A combinação de sequência de nucleotídeos e promotor é htgswgpvgogpvg fgpqokpcfc wo Òecuugvg fg gzrtguu«qÓ= wo ecuugvg eqmo esse pode convenientemente ser construído, manipulado e clonado usando um ácido nucleico carreador, tal como um plasmídeo de clonagem. Tudo isso é bem conhecido na técnica.

[0052] Para a invenção, a inserção estável da sequência de nucleotídeos heterólogos no genoma de um Herpesvírus aviário pode ser feita por qualquer técnica adequada, desde que o vetor do Herpesvírus recombinante resultante seja capaz de exibir seus efeitos favoráveis de expressão segura, estável e efetiva do antígeno heterólogo.

[0053] A sequência de nucleotídeos para a invenção preferivelmente codifica uma proteína completa, mas pode também codificar uma seção de uma proteína, por exemplo, a forma madura de uma proteína, isto é, sem uma “sequência líder, âncora ou de sipcT’. A sequência de nucleotídeos pode ainda codificar somente uma seção específica de uma proteína, tal como a seção compreendendo um epítopo imunoprotetor.

[0054] Uqd guug aurgeVq, woa “rtqVgípa” rata a kpxgp>«q fi woa cadeia molecular de aminoácidos. A proteína pode ser uma proteína nativa ou uma madura, uma pré- ou pró-proteína, ou um fragmento imunogênico de uma proteína. Entre outros: peptídeos, oligopeptídeos e polipeptídeos estão incluídos na definição de proteína.

[0055] Tipicamente, a célula hospedeira na qual o vetor do Herpesvírus recombinante aviário replica fornece o maquinário biomolecular que aciona o processo da expressão. Modificando os elementos relevantes, a expressão de um antígeno pode ser otimizada, por exemplo, em cronometragem, nível e qualidade; tudo isso está na capacidade de rotina dos versados na técnica.

[0056] Sabe-ug dgo swg wo “qnkiqdesoxinucleqvífgq” ukipkhkea woa cadeia molecular de desoxinucleotídeos, um DNA que é relativamente curto, aproximadamente entre cerca de 5 e cerca de 500 nucleotídeos. Uma molécula de polímero como essa compreende desoxirriboses que são ligadas por ligações de fosfodiéster, e cada qual carrega uma base orgânica: citosina, timina, adenina ou guanina.

[0057] Um oligodesoxinucleotídeo como descrito para a invenção pode compreender modificações, por exemplo, uma modificação de uma ligação de fosfodiéster em um fosforotioato, um fosforoditioato, ou uma ligação de defosfo. Exemplos de ligações de defosfo são grupos metil- hidroxilamina, formacetal e dimetilenossulfona.

[0058] Alternativamente, um oligodesoxinucleotídeo como descrito para a invenção pode compreender uma modificação concernente à substituição de uma base de nucleosídeo natural por uma base de nucleosídeo não natural tais como: 5-fluorcitosina, guanina 7-deaza-7-substituída, guanina 7-deaza-8-substituída, uracila, 2-tiouracila, di-hidrouracila, uracila 5- substituída, 5-bromo-citosina, adenina 6-substituída, citosina 6-substituída, ou citosina N4-substituída.

[0059] Novamente, outras possíveis modificações referem-se à substituição da unidade de açúcar desoxirribose por uma unidade de açúcar modificado, por exemplo, um L-4Ó-desoxirribose qw"4Ó-L-arabinose.

[0060] Tais modificações podem ser aplicadas para modificar ou otimizar as características farmacológicas do oligodesoxinucleotídeo, tal como sua disponibilidade biológica ou meia vida. Por exemplo, o oligodesoxinucleotídeo pode ser formulado como um sal farmaceuticamente aceitável, ou ser convertido em um éster ou éter farmaceuticamente aceitável, rqt"gzgornq."pq"itwrq"jkftqzknc"fc"gzvtgokfcfg"7Ó"qw"pc"50"

[0061] Todas essas modificações são bem conhecidas pelos versados na técnica, e podem ser aplicadas usando nada além de métodos e materiais de rotina.

[0062] Em oligodesoxinucleotídeos usados como agonistas TLR9 de mamífero, o uso de ligações de fosforo(di)tioato mostrou ser benéfico, melhorando tanto a estabilidade bem como a atividade imunoestimulante. Entretanto, para a presente invenção, a estabilidade não parece crítica, e observou-se surpreendentemente que na interação com TLR21 aviário, um oligodesoxinucleotídeo que foi baseado totalmente nas ligações de fosfodiéster, teve uma atividade imunoestimulante maior que um similar, compreendendo ligações de fosforo(di)tioato.

[0063] Portanto, em uma modalidade preferida, o oligodesoxinucleotídeo para uso na invenção como um agonista de TLR21 aviário é em forma de fosfodiéster.

[0064] Wo “ecttgcfqt I'crmcegwtkecmgntg cegktavgT' fi wo cwzklkct pc administração efetiva do composto imunoativo de uma vacina, sem causar efeitos adversos (graves) para a saúde do animal alvo em que é administrada. Um carreador como esse pode, por exemplo, ser água estéril, sal fisiológico, ou soluções de salina tamponada com fosfato. Em uma forma mais complexa, o carreador pode, por exemplo, ser um tampão, que pode compreender aditivos adicionais, tais como estabilizadores ou conservantes. Detalhes e exemplos são, por exemplo, descritos em manuais bem conhecidos tais como: “TgokPiVqp< Vjg ueigpeg cpf rtceVieg qh rjatmae{” *4222. NirripeqV. WUC. KUDP< 8:5528694+. g< “XgVgtipaiy xaeeipqnqgy” *Ro RcuVqtgV gV al. gfo. 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).

[0065] Por exemplo, o estabilizador padrão para vacinas do vírus vivo *xgVqt+ a dcug fg JXV fi< PqdiLiu™ FiLwgpV EC. qpfg EC uiipihiec efiLwLc associada; e que compreende em água para injeção: sacarose, uma digestão de caseína pancreática, um tampão fosfato de sódio e um colorante de fenolftaleína. Este estabilizador de HVT pode convenientemente ser usado para a diluição, armazenamento e administração de um agonista de TLR21 aviário como descrito para a invenção. Outros exemplos são:

[0066] Uo “cpViigpq” rata a ipxgp>«q fi woc rtqVgipc *qw woc rcrtg imunogênica desta) que pode induzir uma resposta imune. Preferivelmente, o antígeno é de um comprimento, sequência de aminoácidos, estrutura, forma ou qualidade de maneira tal que a resposta imune que ele induz no alvo vacinado é de força suficiente para ser protetor contra um micro-organismo patogênico.

[0067] Um antígeno preferido para uso na invenção é uma proteína que é capaz de induzir em um alvo uma imunidade protetora contra os microorganismos dos quais aquele antígeno foi derivado. Tipicamente, esses são antígenos de proteína que são expressos ou apresentados no lado de fora do micro-organismo ou sua célula hospedeira; frequentemente, tais proteínas são envolvidas em processos que envolvem a infectividade, ou virulência dos micro-organismos, tais como proteínas envolvidas em interação, anexação, e/ou entrada de células hospedeiras, invasão, captação de nutriente, motilidade, endo- ou exo-toxicidade, etc.

[0068] No caso, o micro-organismo patogênico para aves é um vírus, um antígeno da proteína como esse é, por exemplo: um envelope viral, capsídeo, ou proteína de matriz, ou uma proteína viral que permite a formação de partículas tipo vírus.

[0069] Antígenos virais preferidos para uso na invenção são NDV-F ou -HN (hemaglutinina-neuraminidase), ILTV-gD e -gI, IBDV-VP2, IBV-S (espigão) ou -M (matriz), e AIV-HA, -NA, ou -M (neuraminidase).

[0070] No caso de um micro-organismo bacteriano, um antígeno preferido da proteína é uma proteína da membrana tais como uma proteína da membrana externa, peptidoglicano, glicoproteína, lipoproteína, proteína da membrana periplásmica, ou proteína de camada S, ou uma proteína de um pelo, porina, fímbria ou flagelo.

[0071] Wo cpViigpq ugpfq “fg wo oketq-qticpkuoq” ug tgfetg § entidade biológica que é a origem da sequência de nucleotídeos que codifica o antígeno, e contra a qual a vacina do vetor do Herpesvírus descrito para a invenção deve proteger. A sequência de nucleotídeos que codifica o antígeno pode ser derivada de tal micro-organismo, tanto direta quanto indiretamente. Por exemplo, por isolamento direto do micro-organismo, ou pode ser gerada sinteticamente, usando informação do micro-organismo. A sequência de nucleotídeos de codificação obtida pode ser uma molécula de DNA ou um RNA, dependendo do material da fonte usado para seu isolamento. Para expressão por um vetor do Herpesvírus aviário, a sequência de nucleotídeos precisa ser em forma de DNA. Versados na técnica estão bem cientes de métodos para isolar um ou o outro tipo de ácido nucleico de uma variedade de materiais de partida, e de métodos para converter um tipo no outro quando necessário.

[0072] Micro-qticpkuoqu swg u«q “rcVqiêpkequ rctc cxgu” rctc c invenção são bem conhecidos na técnica. Esses incluem todos os tipos de micro-organismos: vírus, bactérias, parasitas, fungos, riquétsias, protozoários, etc. Um micro-organismo preferido para servir como a origem da sequência de nucleotídeos que codifica um ou mais antígenos expressos pelo vetor do Herpesvírus, como descrito para a invenção, são selecionados de: um vírus, uma bactéria, um parasita e um fungo, todos aqueles que são patogênicos para aves.

[0073] Em uma modalidade preferida, o vírus patogênico para aves é selecionado de: vírus da bronquite infecciosa, NDV, Adenovírus de ave, Astrovírus de ave, paramixovírus de ave, vírus da síndrome da queda de postura, Adenovírus de galinha, IBDV, vírus da anemia de galinha, vírus de encefalomielite de ave, vírus da varíola de galinha, vírus de rinotraqueíte de peru, vírus da peste de pato, pato vírus da hepatite viral, vírus da varíola de pombo, MDV, vírus da leucose de ave, ILTV, metapneumovírus de ave, vírus da influenza em ave, parvovírus de ganso, e Reovírus.

[0074] Em uma modalidade preferida, a bactéria patogênica para aves é selecionada dos gêneros bacterianos: Escherichia, Salmonella, Ornithobacterium, Haemophilus, Pasteurella, Bordetella, Erysipelothrix, Mycoplasma, Campylobacter, Borrelia, Enterococcus, Avibacterium, Riemerella, Listeria, Shigella, Streptococcus, Staphylococcus, Mycobacterium, Chlamydia e Clostridium.

[0075] Em uma modalidade preferida, o parasita patogênico para aves é selecionado dos gêneros parasitas: Eimeria e Cryptosporidium.

[0076] Em uma modalidade preferida, o fungo patogênico para aves é selecionado do gênero fúngico: Aspergillus e Candida.

[0077] Em uma modalidade preferida da vacina de acordo com a invenção, o vetor do Herpesvírus aviário é HVT e o agonista de TLR21 aviário é X4-I-minG (SEQ ID NO: 1).

[0078] Em uma modalidade preferida da vacina de acordo com a invenção, o vetor do Herpesvírus aviário é HVT e o agonista de TLR21 aviário é X4-pent (SEQ ID NO: 4).

[0079] Esses micro-organismos e suas doenças são bem conhecidos na técnica, e são, por exemplo, descritos em manuais bem conhecidos, como: “Vjg Ogtem xeVetkpciy ocpwcn” *32Vj gfo. 4232. E0O0 Mcjp gfVo. KUDP< 0913;32;5Z+. g< “Fkuecueu qh Rqwnviy” *34Vj edo. 422:. YO Uckh edto, KUDP- 10: 0813807182).

[0080] Para a invenção, os nomes dos micro-organismos usados aqui, tais como do vetor do Herpesvírus e dos micro-organismos patogênico para aves, estão apresentados aqui da maneira que eles são atualmente usados na literatura científica. Consequentemente, esses nomes se referem aos microorganismos que são atualmente classificados nos grupos taxonômicos com esses nomes. A invenção inclui também micro-organismos que são subclassificados destes de qualquer modo, por exemplo, como uma subespécie, cepa, isolado, genótipo, variante ou subtipo e similares. Esses micro-organismos compartilham os recursos de caracterização de seus membros do grupo taxonômico tais como em suas características morfológica, genômica e bioquímica, bem como suas características biológicas tal como comportamento fisiológico, imunológico ou parasítico. Como é conhecido no campo, a classificação de micro-organismos é baseada em uma combinação de tais recursos.

[0081] Ficará aparente aos versados na técnica que, embora os microorganismos que são o objetivo da presente invenção sejam atualmente classificados nesses grupos, por exemplo, por gênero ou espécie, esta é uma classificação taxonômica que poderia mudar à medida que novos critérios levaram a reclassificação em um grupo taxonômico novo ou diferente. Entretanto, como isto não muda os micro-organismos por si mesmos, ou seu, repertório de antígeno, mas somente seu nome científico ou classificação, tais micro-organismos reclassificados permanecem no escopo da invenção.

[0082] Wo “recgptor Vkrq Vqnn fg cxg 43” fi dgo eqpjgekfq nc Vfienkec, e o DNA e sequências de aminoácidos de diversos receptores como esses são disponíveis a partir das bases de dados públicas; tanto como um gene separado ou proteína, como parte de uma sequência genômica, quanto como uma seção do gene, indicando diferenças nas sequências de TLR21 conhecidas. Por exemplo, pela GenBank: para galinha: NM_001030558 e NW_003763865. Outras sequências de TLR21 aviário também foram descritas, por exemplo, para tentilhão, falcão e tordo europeu, respectivamente: GU904859, GU904941, e JX502652. Também o TLR21 de diferentes tipos e raças de galinha foram descritos. Para referência, vide: Ciraci & Lamont, 2011, Dev. & Comp. Imunol., vol. 35, p. 392; Alcaide & Edwards, 2011, Mol. Biol. Evol., vol. 28, p. 1703; e: Ruan et al., 2012, Poultry Sci., vol. 91, p. 2512.

[0083] Além do mais, os inventores observaram que sequências de TLR21 aviário adicionais são publicamente disponíveis, apesar de não anotadas ou incorretamente anotadas, por exemplo, o gene para um TLR21 de peru é disponível com o no. de acesso XM_003209691, onde é rotulado como “Vkrq VNT35” Xkfg Vcodfio Tcocuco{ gV cL *4234. OqL DkqL Rg^, xqL 5;. p. 8539). No entanto, gene do éster exibiu homologia significante para um gene de TLR21 de galinha e, quando clonado no sistema indicador da célula HEK293/pNifTy2, esse TLR de peru foi altamente responsivo aos motivos de CpG não metilado. O TLR21 de peru subclonado foi testado com um agonista fg VNT; fg ocmífetq Ò4228Ó g eqo alguiiu fqu ciqnkuVcu VNR23 cxkátkq descritos aqui: observou-ug swg Ò4228Ó Vgo wo GE72 pguVg tgegrVqt fg 8.8 nO. swg hqk eqorctáxgn §swgng rctc ÒZ6-I-oknIÓ. ocu ÒZ6-rgnVÓ hqk ocku ativo, e teve um EC50 de 1,6 nM.

[0084] O sistema indicador da célula HEK293/pNifTy2 pode ser usado para classificar e qualificar agonistas do TLR21, bem como receptores de TLR21. Ele é baseado em detecção da ativação de NFkappaB resultante da ativação de um receptor, aqui TLR21 aviário, que as células se apresentam através da detecção de uma expressão do gene marcador por reação de cor. Isto é, por exemplo, descrito em WO 2012/089.800, e permite comparação conveniente, rápida e lado a lado de grandes números de moléculas de agonista candidatas em uma faixa de concentrações. Outros sistemas de detector para ativação do TLR21 aviário também foram descritos, por exemplo, usando a linhagem celular de macrófago de galinha HD11 (Ciraci & Lamont, supra), excretando monóxido de nitrogênio mediante estímulo de CpG. Outros sistemas celulares podem empregar células transientemente transfectadas, e testes in vivo são igualmente possíveis.

[0085] Consequentemente, versados na técnica são bem capazes de identificar sequências do gene e proteína do TLR21 aviário, bem como confirmar que a proteína codificada é certamente um receptor para motivos de CpG não metilado.

[0086] De uma maneira similar, a detecção se um oligodesoxinucleqVífgq fi wo VNT43 cxkátkq “ciqpkuVc” rctc c kpxgp>«q rqfg convenientemente ser feita, por exemplo, usando um TLR21 aviário estabelecido. Um agonista é definido na técnica como um composto que pode aglutinar a um receptor biológico e disparar sua ativação ou resposta. Para a invenção, um agonista para um TLR21 aviário compreende um motivo de CpG não metilado. Usando um sistema celular de detector, ou um modelo in vivo, um agonista como esse estimulará um nível de atividade do TLR21 que é acima de seu estado de repouso, não ativado. Preferivelmente, a atividade do agonista é alta a muito alta; isto pode ser estabelecido usando concentrações baixas a muito baixas do agonista. Por exemplo, onde um oligodesoxinucleqvífgq fg ErI rcft«q dgo eqpjgekfq vcn eqoq ÒQFP 4228Ó (Krug et al., 2001, Eur. J. Imunol., vol. 31, p. 2154) ativará um TLR21 aviário quando na faixa micromolar ou alto nanomolar; um oligodesoxinucleotídeo preferido para a invenção é ativo na faixa de concentração baixo nanomolar, ou mesmo em picomolar.

[0087] Uma maneira conveniente de estabelecer e comparar a atividade agonista de um agonista de TLR21 aviário para a invenção, é determinando seu valor EC50, por exemplo, no sistema indicador da célula HEK293/pNifTy2 expressando um TLR21 aviário, como descrito em WO 2012/089.800. O valor EC50 é a concentração efetiva meio maximal, e representa a concentração de oligodesoxinucleotídeo que é necessária para induzir uma quantidade da enzima repórter SEAP no sistema de célula repórter usado, que dá uma absorção meio maximal. Agonistas do TLR21 preferidos para uso na invenção têm um valor EC50 na faixa nanomolar, ou mesmo picomolar.

[0088] Portanto, para a invenção, um agonista de TLR21 aviário preferido tem um valor EC50 abaixo de 1 mM, mais preferivelmente abaixo de 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM, ou ainda abaixo de 50 pM, na ordem de preferência de aumento.

[0089] Tais agonistas TLR21 aviário altamente ativos foram descritos na técnica anterior, por exemplo, as famílias de X4 (WO 2012/089.800), X43 (WO 2012/160.183) e X23 (WO 2012/160.184) de compostos. Esses compostos são fortes agonistas do TLR21, que ativam um TLR21 aviário mesmo quando em concentrações muito baixas.

[0090] Portanto, em uma modalidade preferida de uma vacina de acordo com a invenção, o agonista de TLR21 aviário é selecionado da família X4, X43 ou X23.

[0091] Não precisa dizer que a vacina de acordo com a invenção pode também compreender mais que um agonista de TLR21, e esses podem ser selecionados de uma, duas ou todas as três dessas famílias do composto.

[0092] A família X4 de agonistas do TLR21 é descrita em WO 2012/089,800; sua descrição está por meio disso incorporada pela referência na sua íntegra.

[0093] Portanto, em uma modalidade preferida de uma vacina de acordo com a invenção, o agonista de TLR21 aviário tem a fórmula geral: 5'- [N1]x [N7]r {N3 [N4]p C G [N5]q N6}n [N8]s [N2]z -3', em que: N1 = C ou G; N2 = C ou G; N3 = T, C ou G; N4 = C ou T, fornecida quando N3 = C, então N4 = T; N5 = C ou T; N6 = A, T, G ou C; N7 = A, T, C ou G; N8 = A, T, C ou G; x = 3 a 10; n = 2 a 100; z = 0 a 10; r = 0 a 8, fornecida quando N7 = T, então r = 1 a 25; p = 1 a 6, fornecida quando N4 = T, então p = 1 a 25; q = 1 a 6, fornecida quando N5 = T, então q = 1 a 25; e s = 0 a 8, fornecida quando N8 = T, então s = 1 a 25.

[0094] A família X43 de agonistas do TLR21 é descrita em WO 2012/160,183; sua descrição está por meio disso incorporada pela referência na sua íntegra.

[0095] Portanto, em uma modalidade preferida de uma vacina de acordo com a invenção, o agonista de TLR21 aviário tem a fórmula geral: 5'- [G]x {[T]p T T C G T C [T]q }n [G]z -3', em que: p = 1 a 15; q = 1 a 15; n = 2 a 100; x = 3 a 10; e z = 0 a 10.

[0096] A família X23 de agonistas do TLR21 é descrita em WO 2012/160.184; sua descrição está por meio disso incorporada pela referência na sua íntegra.

[0097] Portanto, em uma modalidade preferida de uma vacina de acordo com a invenção, o agonista de TLR21 aviário tem a fórmula geral: 5'- [G]x { T C G T C G}n T C G [G]z -3', em que: x = 3 a 20; z = 0 a 10; e n = 2 a 100.

[0098] Agonistas do TLR21 como descrito para a invenção podem ser produzidos em diferentes maneiras, todas conhecidas na técnica. (Ellington & Pollard, 2001, em: Synthesis and purification of oligonucleotides. Current Protocols in Molecular Biology, unit 2.11, p. 1 a 25; J. Wiley & sons Inc.). Além do mais, muitos fornecedores comerciais oferecem síntese customizada de um oligodesoxinucleotídeo, com modificações como desejado, em qualquer escala. Por exemplo: BioSpring (Frankfurt A. M., Alemanha), e Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemanha).

[0099] Durante a exploração da presente invenção, observou-se que os agonistas do TLR21 como descrito para a invenção em geral têm uma atividade agonista muito forte quando eles são maiores; especialmente oligonucleotídeos acima de 100 nucleotídeos de comprimento são altamente ativos. Entretanto, tais oligodesoxinucleotídeos longos ficam cada vez mais difíceis de sintetizar e purificar confiavelmente. Também para aplicações veterinárias, oligodesoxinucleotídeos maiores rapidamente ficam muito caros. Portanto, um agonista de TLR21 para uso em uma vacina de acordo com a invenção é preferivelmente entre cerca de 20 e cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente entre 22 e 60, entre 25 e 50, entre 30 e 45, ou ainda entre cerca de 30 e cerca de 40 nucleotídeos, na ordem de preferência de aumento.

[00100] Similarmente, observou-se que os agonistas de TLR21 como descrito para a invenção são mais ativos como agonistas TLR21 aviário swcpfq q Vtgejq fg pwengqvifgqu I cVfi c gzVtgokfcfg 3’ *kuVq fi. a jusante) do motivo de CpG é mais curto, ou mesmo ausente, e o trecho de nucleotídeos G cvfi c gzvtgokfcfg 7Ó *kuvq fi. a montante) do motivo de CpG é maior.

[00101] Isto foi inesperado, e uma diferença entre TLR21 aviário e TLR9 de mamífero, já que os inventores observaram que para agonistas TLR9 fg ocoifetq c cVkxkfcfg fi ockqt eqo wo Vtgejq I 7óewtVq1cwugpVg g wo vtgejq I5Ó nqpiq0

[00102] Portanto, em uma modalidade preferida de um agonista de TLR21 da família X4: s = 0, e z = 0. Tabela 1: Agonistas TLR21 aviários adicionalmente preferidos para uso na invenção

[00103] Em uma modalidade preferida de um agonista de TLR21 da família X43: z = 0.

[00104] E, em uma modalidade preferida de um agonista de TLR21 da família X23: z = 0.

[00105] Modalidades preferidas adicionais de um agonista de TLR21 da família X4 são onde: N1 = G; N7 = G; r = 3-8 (preferivelmente r=5); N3 =T; N4 = T; p = 2-6; N5 = T; N6 = T; q = 2-6; e n = 3 a 10 (preferivelmente n= 3 a 5).

[00106] Um agonista de TLR21 mais preferido da família X4 é onde: {N3 [N4]p C G [N5]q N6} = TTCGTT, ou TTTCGTTT, por exemplo, os oligonucleotídeos X4-pent e X4-I-minG, respectivamente, como esses fornecem um bom compromisso entre atividade versus tamanho e custo.

[00107] Agonistas do TLR21 preferidos adicionais de todas as três famílias do composto descrito para uso em uma vacina de acordo com a invenção são representados na Tabela 1. O valor EC50 indicado foi determinado usando o sistema indicador da célula HEK293/pNifTy2 expressando um TLR21 de galinha.

[00108] A vacina de acordo com a invenção pode em princípio ser de constituição bem simples: o oligodesoxinucleotídeo, dependendo de sua formulação, pode simplesmente ser dissolvido em um tampão aquoso, e o vetor do Herpesvírus aviário pode ser contido em uma solução compreendendo o vírus e um tampão que estabiliza sua viabilidade. Quando misturado com o carreador farmaceuticamente aceitável para a invenção, isto resulta na vacina de acordo com a invenção.

[00109] Portanto, em um aspecto adicional, a invenção se refere a um método para a preparação de uma vacina de acordo com a invenção, compreendendo a mistura de um vetor do Herpesvírus aviário, um agonista de TLR21 aviário, ambos como descrito para a invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00110] O produto resultante deste método é a vacina de acordo com a invenção, que acelera a resposta imune em aves contra um antígeno expresso por um vetor do Herpesvírus aviário.

[00111] O vetor do Herpesvírus para uso na vacina de acordo com a invenção é preparado usando procedimentos padrões de cultivar vírus. Após a produção em animais hospedeiros, a proliferação em cultura in vitro em células hospedeiras adequadas é preferida, por exemplo, em células primárias tais como fibroblastos do embrião de galinha (CEF) (para HVT e MDV), ou em uma linhagem celular estabelecida tais como células do hepatoma masculino de Leghorn (LMH) (para ILTV). Tais métodos são bem conhecidos, e são facilmente aplicáveis pelos versados na técnica. Por exemplo: o vetor do Herpesvírus para a invenção é construído por transfecção e recombinação e o vírus recombinante desejado é selecionado. Em seguida, os vírus do vetor são produzidos industrialmente em maiores volumes. A partir de tais culturas, uma suspensão compreendendo o vírus é colhida, tanto como células totais infectadas quanto como um sonicado celular, esta suspensão é formulada em uma vacina e o produto do vetor do vírus é empacotado e armazenado até o uso adicional.

[00112] Para preparar a vacina de acordo com a invenção, a mistura de oligodesoxinucleotídeo, vetor e carreador podem ser feitos de diferentes maneiras, e em uma diferente ordem; por exemplo, dois desses três constituintes podem ser pré-misturado uns com os outros, antes de o terceiro constituinte ser adicionado. Isto pode ser benéfico por inúmeros motivos econômicos ou práticos, por exemplo, para controle de qualidade, redução de custo e mão-de-obra, ou armazenamento e motivos logísticos. Deste modo, um produto intermediário pode ser preparado e armazenado, e a vacina completa final é somente preparada logo antes do embarque, ou mesmo logo antes do uso.

[00113] Depois de teste extensivo quanto à qualidade, quantidade e esterilidade, a vacina pode então ser liberada para venda.

[00114] Técnicas e considerações gerais que se aplicam para a preparação de vacinas são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, em regulamentos governamentais (Pharmacopoeia) e em manuais Vcku eqoq< “XgVgtkpciy véceekiiqlqgy" g< “TgoiPiVqp” *codqu uwrtc+o

[00115] Em uma modalidade preferida, o vetor do Herpesvírus para a invenção é um produto de vacina comercial existente, consequentemente, é necessário apenas misturar o oligonucleotídeo como descrito para a invenção, para preparar a vacina de acordo com a invenção. Isto pode ser feito pelo produtor, em condições controladas, ou simplesmente por versados na técnica da vacinação. Neste último caso, a vacina de acordo com qualquer uma das modalidades da invenção pode ser preparada como um kit de partes, compreendendo o vetor do Herpesvírus aviário e o oligodesoxinucleotídeo em recipientes separados.

[00116] Alternativamente, o vetor do Herpesvírus e o oligodesoxinucleotídeo, ambos como descrito para a invenção, podem ser misturados em uma composição que é um produto intermediário para a vacina de acordo com a invenção, tal como uma mistura em um estabilizador ou diluente. Similar aos outros produtos intermediários concebíveis, isto pode ser vantajoso em termos de qualidade ou economia na preparação de uma composição em um modo como esse.

[00117] Portanto, em aspectos adicionais, a invenção se refere a: - uma composição compreendendo um vetor do Herpesvírus aviário e um oligodesoxinucleotídeo, ambos como descrito para a invenção; - uma vacina para aves compreendendo uma composição de acordo com a invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável; - um método para a preparação de uma vacina de acordo com a invenção, compreendendo a mistura de uma composição de acordo com a invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável; - o uso de uma composição de acordo com a invenção para a fabricação de uma vacina para aves.

[00118] A vacina de acordo com qualquer uma das modalidades da invenção pode compreender um estabilizador, por exemplo, para proteger componentes sensíveis de ser degradados, aumentar o prazo de validade da vacina e/ou melhorar a eficiência de armazenamento, tal como para congelamento, ou liofilização. Geralmente, estabilizadores são moléculas grandes de alto peso molecular, tais como lipídios, carboidratos ou proteínas; por exemplo, leite em pó, gelatina, albumina de soro, sorbitol, trealose, espermidina, Dextrano ou polivinil pirrolidona, e tampões, tais como fosfatos de metal alcalino.

[00119] Preferivelmente, o estabilizador é livre de compostos de origem animal, ou ainda quimicamente definido, como descrito em WO 2006/094.974.

[00120] Também, conservantes podem ser adicionados, por exemplo, timerosal, mertiolate, compostos fenólicos e/ou gentamicina.

[00121] Não precisa dizer que mistura de outros compostos, tais como carreadores, diluentes, emulsões, e similares em uma vacina de acordo com a invenção está também no escopo da invenção. Tais aditivos são descritos em ocpwcku dgo eqpjgekfqu Vcku eqoq< "ITgpikngtqn”. g “Xgtgtknaiy Xceekpqnqi{” *codqu uwrtc+o Gpttgtantq, ngnhwo fqu eqnstituintes de vacina deve interferir na viabilidade ou no estabelecimento de uma infecção produtiva pelo vetor do Herpesvírus aviário, ou na aceleração da resposta imune de ave pelo agonista de TLR21 aviário.

[00122] Isto também se aplica à formulação da vacina de acordo com a invenção como um produto liofilizado, que pode permitir armazenamento prolongado nas temperaturas acima de zero °C, por exemplo, a 4°C. Entretanto, se isso é vantajoso em um caso específico depende das características do vetor do Herpesvírus aviário usado para a invenção, já que alguns Herpesvírus, por exemplo, MDV1, não sobrevivem bem a liofilização.

[00123] A vacina de acordo com a invenção pode adicionalmente compreender um assim chamado "veículo"; este pode fornecer um suporte para os constituintes da vacina para aderir sem ser covalentemente ligado nele. Tais veículos são, entre outros, biomicrocápsulas, microalginatos, lipossomos, macrossóis, hidróxido de alumínio, fosfato, sulfato ou óxido, uínkec. Ecwnko™. g DgpVqpkVc™. Vqfqu eqpjgekfqu pc vfienica.

[00124] Um exemplo é um veículo no qual o antígeno é parcialmente embutido em um complexo imune-guvkowncpvg. q cuuko ejcocfq KUEQO™ (vide EP 109.942).

[00125] Além do mais, a vacina de acordo com a invenção pode compreender um ou mais compostos ou emulsificantes de superfície ativa cfgswcfqu. rqt gzgornq. wo eqorqpgpvg fc hcoínkc Urcp™ qw Vyggp™0

[00126] Versados na técnica percebem que todo e qualquer aditivo deve ser verificado e testado quanto à compatibilidade com o vetor do Herpesvírus aviário e o oligodesoxinucleotídeo para a invenção.

[00127] A quantidade do vetor do Herpesvírus aviário por dose aviária da vacina de acordo com a invenção não é tão crítica quanto seria para uma vacina do tipo inativado. Isto é em virtude de que o vetor do Herpesvírus aviário replicará por si mesmo e assim multiplicará na ave alvo até um nível de viremia que é biologicamente sustentável. No entanto, uma dose mínima fgxg ugt fcfc rctc qdvgt woc ÒvqocfcÓ ghgvkxc fc xcekpc fg xgvqt0 C guvg respeito, existem diferentes maneiras de quantificar um Herpesvírus vivo; conveniente é uma que conta as partículas do vírus viáveis reais, tal como um ensaio em placa em uma camada da célula suscetível. Quantidades do vetor do Herpesvírus aviário para a invenção podem então ser expressas como inúmeras unidades de formação de placa (pfu). Qual dose constitui uma dose do inóculo efetivo depende da viabilidade e intensidade replicativa do Herpesvírus particular que é usado como vetor para a invenção.

[00128] Uma quantidade preferida do vetor do Herpesvírus aviário para a invenção, na vacina de acordo com a invenção é entre cerca de 10 e cerca de 1x10A7 pfu do vetor do Herpesvirus aviário por dose, mais preferivelmente entre 1x10A2 e 1x10A6, entre 1x10A3 e 1x10A5, entre 1x10A3 e 1x10A4, e ainda entre 1.000 e 5.000 pfu/dose, na ordem de aumento de preferência.

[00129] No caso de o vetor do Herpesvírus aviário para a invenção ser um vírus ligado em célula, tal como pode aplicar em HVT ou MDV, o vetor pode ser administrado em forma associada com a célula. Neste caso, uma dose para ave compreende entre 100 e 10.000 células hospedeiras infectadas por dose, preferivelmente entre 100 a 5.000 células infectadas, mais preferivelmente entre 200 a 2.000 células hospedeiras infectadas por dose.

[00130] À parte da proteção imune acelerada que a vacina de acordo com a invenção já fornece, pode ser vantajoso adicionar um ou mais componentes imunoativos adicionais. Um componente como esse pode ser um antígeno, um INO adicional, uma substância imunointensificadora, uma citocina e/ou uma vacina para criar uma vacina de combinação. Isto fornece vantagens em termos de custo, eficiência e bem-estar do animal. Alternativamente, a vacina de acordo com a invenção pode por si mesma ser adicionada a uma vacina.

[00131] A vacina de acordo com a invenção em princípio pode ser administrada em aves alvos por diferentes vias de aplicação, e em diferentes pontos em sua existência, desde que o vetor do Herpesvírus recombinante inoculado em ave possa estabelecer uma infecção protetora contra o antígeno heterólogo. Em princípio, isto é indiferente da idade, peso, sexo, estado imunológico, etc. da ave alvo, embora seja evidentemente favorável vacinar alvos saudáveis, e vacinar o mais cedo possível para resistir à pressão de infecção do campo, por exemplo, de MDV, NDV ou IBDV. Portanto, é vantajoso aplicar a vacina de acordo com a invenção o mais cedo possível, preferivelmente no dia da incubação (dia 1), ou ainda no ovo, por exemplo, nos 18 dias ED. Equipamento adequado para injeção automatizada no ovo em escala industrial é comercialmente disponível. Isto fornece a proteção mais o cedo possível, minimizando ao mesmo tempo o custo de mão-de-obra.

[00132] Portanto, em uma modalidade preferida, a vacina de acordo com a invenção é administrada no ovo.

[00133] Diferentes vias de inoculação no ovo são conhecidas, tais como no saco vitelino, no embrião, ou na cavidade do fluido alantoico; essas podem ser otimizadas como necessário.

[00134] Alternativamente, uma inoculação parenteral de aves individuais pode ser aplicada. Isto é preferivelmente aplicado de forma intramuscular ou subcutâneo. Outras vias de imunização benéficas são por via alimentar, intestinal ou mucosal; por exemplo, por via oral, nasal, oronasal ou ocular. Isto pode ser obtido por qualquer método de vacinação por gota ou pulverização. Um exemplo adicional dessas vias de administração é a conveniência e economia da aplicação em massa.

[00135] Formulações da vacina de acordo com a invenção adequadas para injeção são, por exemplo, uma suspensão, solução, dispersão ou emulsão.

[00136] Dependendo da via de aplicação da vacina de acordo com a invenção, pode ser necessário adaptar a composição da vacina. Isto é bem da capacidade dos versados na técnica, e geralmente envolve o ajuste fino da eficácia ou da segurança da vacina. Isto pode ser feito adaptando a dose, quantidade, frequência, via da vacina, usando a vacina em uma outra forma ou formulação, ou adaptando ou adicionando outros constituintes da vacina (por exemplo, um estabilizador ou um adjuvante).

[00137] Por exemplo, para ser adequada para aplicação em ovo, é necessário que a composição da vacina seja muito branda, a fim de não reduzir a capacidade de incubação dos ovos. Entretanto, até mesmo uma certa redução na capacidade de incubação pode ainda ocorrer, por exemplo, resultante de dano mecânico no embrião pela inoculação por si mesmo, uma infecção, etc.

[00138] Os inventores estabeleceram que um oligodesoxinucleotídeo como descrito para a invenção pode ser aplicado em galinhas no ovo, em pelo menos 10 μg por dose, sem induzir uma reação patológica manifesta. Entretanto, uma quantidade como essa pode não ser economicamente viável. Também, os inventores observaram que um agonista de TLR21 específico pode ter uma dose efetiva ideal, de maneira tal que uma maior ou menor quantidade dê um menor efeito de aceleração imune; por exemplo, em um experimento em animal, uma dose do agonista de TLR21 aviário de 0,1 μg por pintinho foi melhor que doses de 0,01 μg ou 1 μg por pintinho. Versados na técnica percebem que isso pode depender de uma variedade de parâmetros tais como: a atividade específica do oligodesoxinucleotídeo usado, as espécies de ave alvo, a formulação, a via de administração, etc., e poderão otimizar tais condições por experimentação de rotina.

[00139] A quantificação de um oligodesoxinucleotídeo para uso na invenção pode convenientemente ser feita de inúmeras maneiras, por exemplo, por cromatografia em coluna com detecção por meio de espectrofotometria de absorção de UV no coeficiente de extinção calculado do oligodesoxinucleotídeo específico a ser testado, tipicamente na faixa de cerca de 250 a 280 nm.

[00140] Portanto, para a invenção, a quantidade preferida do oligodesoxinucleotídeo como descrito para a invenção por dose para ave é entre 0,1 ng e 1 mg, mais preferido entre 1 ng e 100 μg, ainda mais preferido entre cerca de 10 ng e cerca de 10 μg por dose para ave, e mais preferido entre cerca de 30 ng e 3 μg por dose para ave.

[00141] A vacina de acordo com a invenção pode igualmente ser usada como tratamento profilático e como terapêutico, e interfere tanto no estabelecimento e/quanto na progressão de um patógeno aviário, na infecção, ou seus sinais clínicos de doença.

[00142] Também, a vacina de acordo com a invenção pode efetivamente servir como uma vacinação inicial, que pode mais tarde ser seguida e amplificada por uma vacinação de reforço, tanto com uma vacina de acordo com a invenção, quanto com uma vacina inativada para aves.

[00143] O esquema de dosagem para a administração da vacina de acordo com a invenção na ave alvo pode ser em doses únicas ou múltipla, que podem ser dadas ao mesmo tempo ou sequencialmente, de uma maneira compatível com a dosagem e formulação exigidas da vacina, e em uma quantidade como essa que será imunologicamente efetiva para a ave alvo.

[00144] O protocolo para a administração da vacina de acordo com a invenção idealmente é integrado nas tabelas de vacinação existentes de outras vacinas para esta ave alvo.

[00145] Preferivelmente, a vacina de acordo com a invenção é aplicada somente uma vez, tanto no dia da incubação, quanto no dia 18 ED. Entretanto, dependendo do tipo de ave a ser vacinada e sua programação de procriação, a ave pode precisar ser revacinada uma vez, diversas vezes, ou ainda periodicamente.

[00146] O volume por dose para ave da vacina de acordo com a invenção pode ser otimizado de acordo com a via de aplicação planejada: inoculação no ovo é comumente aplicada com um volume entre cerca de 0,05 e 0,5 mL/ovo, e injeção parenteral é comumente feita com um volume entre cerca de 0,1 e 1 mL/ave. A otimização do volume de dose da vacina está na capacidade dos versados na técnica.

[00147] A vacina de acordo com a inven>«q go efekVq fi woc òxcekpc octecfqtcÓ"rctc"q"oketq-organismo contra o qual o gene heterólogo expresso do vetor protege, em virtude de a imunidade que ele gera ser somente direcionada contra uma (ou algumas) proteínas deste micro-organismo. Isto permite a "clilcrgneicçàq fg cnkocku knfceVcfqu g xcekpcfqu”. c cuuko ejcocfc cdqtfcieo ‘FIXC’. KuVq rqfg eqnxenkgnVgognVg uet tecnkzcfq rqt um ensaio sorológico tal como um ELISA ou ensaio de imunofluorescência.

[00148] O efeito vantajoso da invenção: a aceleração da resposta imune em aves contra um antígeno expresso e dispensado por um vetor do Herpesvírus aviário é obtida mediante a administração do vetor do Herpesvírus aviário e do oligodesoxinucleotídeo, ambos como descrito para a invenção, em aves. Existem diversas maneiras em que esta administração pode ser feita, e o efeito vantajoso é obtido. Essas levam a diferentes aspectos e modalidades da invenção. Em particular, aves podem ser imunizadas com uma vacina de acordo com uma das modalidades da invenção, ou com os constituintes separados de uma vacina como essa. Detalhes dessas várias modalidades são descritos e exemplificados aqui.

[00149] Por exemplo, o vetor do Herpesvírus aviário e o oligodesoxinucleotídeo, ambos como descritos para a invenção, podem ser combinados em uma vacina, tanto de componentes separados, quanto de uma composição intermediária como descrito. Alternativamente, aves podem ser inoculadas com o vetor e o oligodesoxinucleotídeo separadamente, por exemplo, quando o vetor já é formulado como uma vacina, então o oligodesoxinucleotídeo pode ser adicionado nesta vacina ou administrado separadamente. Quando dado como inoculações separadas, então preferivelmente as inoculações do vetor do Herpesvírus aviário e do oligodesoxinucleotídeo, ambos como descritos para a invenção, em uma ave alvo não são espaçadas mais que 3 dias. Isto é exemplificado a seguir, onde é descrito que a administração separada de um oligodesoxinucleotídeo como descrito para a invenção, até três dias depois da administração de um vetor do Herpesvírus aviário, foi ainda efetiva em acelerar a resposta imune.

[00150] Consequentemente, para a invenção, o vetor do Herpesvírus aviário e o oligodesoxinucleotídeo, ambos como descritos para a invenção, podem ser administrados em aves em uma administração única, ou dupla; a administração única é quando ambas são combinadas em uma única formulação; a administração dupla pode ser por administração em diferentes vezes, ou simultâneas, mas então em diferentes locais no corpo, por diferentes vias, ou por diferentes métodos. Quando administrados separadamente, o vetor e o oligodesoxinucleotídeo são administrados nas aves alvo não mais que 3 dias espaçados, pelo qual qualquer um pode ser dado primeiro.

[00151] Portanto, em um aspecto adicional, a invenção se refere a um método para a vacinação de aves, compreendendo a administração em aves de um vetor do Herpesvírus aviário como descrito para a invenção, e de um oligodesoxinucleotídeo como descrito para a invenção.

[00152] A administração pode ser combinada, ou separada por local, via ou método. Versados na técnica são capazes de testar variações dessas possíveis maneiras de administração para chegar a um protocolo que é ideal para uma certa espécie de ave, ou uma proteção imune desejada.

[00153] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um agonista de TLR21 como descrito para a invenção para uso na aceleração da resposta imune em aves contra um antígeno expresso por um vetor do Herpesvírus aviário como descrito para a invenção.

[00154] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um agonista de TLR21 como descrito para a invenção, para uso em um método de vacinação de aves, para acelerar a resposta imune em aves contra um antígeno expresso por um vetor do Herpesvírus aviário como descrito para a invenção.

[00155] Em um aspecto adicional, a invenção se refere ao uso de um agonista de TLR21 como descrito para a invenção para a fabricação de uma vacina para aves, para acelerar a resposta imune em aves contra um antígeno expresso por um vetor do Herpesvírus aviário como descrito para a invenção.

[00156] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um método para acelerar a resposta imune em aves contra um antígeno expresso por um vetor do Herpesvírus aviário como descrito para a invenção, compreendendo a administração em aves de um agonista de TLR21 como descrito para a invenção.

[00157] A invenção será agora adicionalmente descrita pelos exemplos não limitantes seguintes.

Exemplos Exemplo 1: Síntese e purificação de agonistas do TLR21

[00158] Oligodesoxinucleotídeos para uso em experimentos para a presente invenção foram encomendados da BioSpring (Frankfurt A. M., Alemanha) e foram recebidos purificados e liofilizados em uma quantidade indicada. Esses foram diluídos em um tampão adequado, dependendo do uso experimental. A concentração foi verificada ocasionalmente por cromatografia de exclusão de tamanho combinada com monitoramento UV, mas observou-se estar correta em todos os casos.

Exemplo 2: Vetor do Herpesvírus aviário:

[00159] O vetor do Herpesvírus aviário usado para alguns dos experimentos, HVT-F-VP2, foi baseado em HVT, e compreendeu o gene F de NDV, bem como o gene VP2 de IBDV, ambos inseridos na região Us2. Construção do vetor, produção nas células, quantificação, etc. foram todos como descrito em WO 2013/057,235.

Exemplo 3: Testes in vitro de atividade do agonista de TLR21 aviário:

[00160] O uso da linhagem celular de HEK293 transformada com um receptor de TLR21 de galinha para o teste e qualificação de candidatos do agonista de TLR21 aviário foi descrito, por exemplo, em WO 2012/089.800. Entretanto, resumidamente: células HEK293 foram transfectadas com um plasmídeo repórter de ativação de NFkappaB: pNiFty2-SEAP (InvivoGen, San Diego, CA, USA). Linhagens celulares clonais foram selecionadas e usadas para a transfecção com um gene de TLR21 de galinha. Novamente, linhagens celulares clonais foram selecionadas. Essas foram usadas para a detecção de ativação de NFkappaB mediante incubação com diferentes concentrações de oligodesoxinucleotídeos agonísticos de TLR21 aviário. Leitura foi por detecção colorimétrica da atividade de SEAP secretado (fosfatase alcalina embriônica secretada), por espectrofotometria OD 405 nm. Isto foi colocado em gráfico como mOD405nm/minuto em função de um gradiente da concentração do agonista. Os resultados relevantes foram aqueles com uma alta taxa de formação de cor, a uma concentração do agonista relativamente baixa.

Exemplo 4: Teste in vivo de atividade do agonista de TLR21 aviário em imunidade induzida pelo vetor do Herpesvirus aviário: 4.1 Introdução

[00161] Este experimento foi projetado para testar o efeito in vivo de um agonista de TLR21: X4-I-minG (EC50 = 1,9 nM) em imunidade induzida por vetor Herpesviral aviário em galinhas. Diferentes pontos de tempo para a administração do agonista de TLR21 em vetor de pássaros vacinados foram testados, para uma quantidade do agonista.

4.2 Materiais e métodos 4.2.1 Projeto experimental

[00162] Sete (7) grupos de pintinhos SPF White Leghorn de 1 dia de idade (n=25/grupo) foram vacinados uma vez s.c. na base do pescoço com vetor HVT-F-VP2 (expressando os antígenos NDV-F e os IBDV-VP2): grupos 3 a 9. Grupo 2 foi somente injetado s.c. com agonista de TLR21 a T=0, e grupo 1 foi o controle de desafio não vacinado.

[00163] Em diversos pontos de tempo após a vacinação, um agonista de TLR21 foi injetado s.c. na base do pescoço de acordo com a tabela de tratamento para agrupamento e dosagem. Amostras de sangue foram tiradas antes da vacinação (T=0) dos 20 pintinhos por meio de sangria, e a T=2 semanas pós-vacinação de 5 aleatoriamente pássaros vacinados/injetados escolhidos dos grupos 2 a 9 depois do que esses 40 animais foram tirados do experimento, e formaram um novo n=20/grupo. Soros foram usados para determinar os tituladores de anticorpo anti-NDV e anti-IBDV. Depois da coleta de sangue os 25 animais de controle não vacinados (grupo 1) foram divididos aleatoriamente nos 8 grupos vacinados/injetados, isto é, 3 animais de controle foram colocados em cada grupo (n=23/grupo; 1 grupo com n=24). Subsequentemente, todos os animais foram desafiados por meio da via intramuscular (i.m.) com 0,2 mL (6,0 log10 EID50) da cepa NDV Herts 33/56.

4.2 Biossegurança

[00164] Galinhas foram mantidas em isolantes, sob pressão negativa, e com ar filtrado Hepa em/out, para conter os vetores geneticamente modificados e o vírus de desafio virulento. 4.2.3 Materiais de teste Agonista de TLR21 aviário: Vacina de vetor: Material de desafio: titulador de: 9,6 log10 EID50 por mL. Dosagem: de TLR21 foi injetado a 0,1 μg por dose.

4.2.4 Animais de teste:

[00165] Galinha White Leghorn, misturado, 1 dia de idade no início numerados individualmente marcando a asa. As 25 galinhas de controle do grupo 1, foram numeradas com uma diferente marca colorida.

Alimento e Água

[00166] Alimento e água foram disponíveis para os animais à vontade. 4.2.6 Agrupamento e dosagem

4.2.7 Vacinação

[00167] Os animais dos grupos 3 a 9, foram vacinados s.c. com 0,2 mL da vacina de vetor na base de pescoço com 1 dia de idade. Grupo 2 foi injetado somente com 0,1 mL do agonista de TLR21 a T=0.

[00168] Em diversos pontos de tempo após a vacinação, 0,1 mL do agonista de TLR21 foi injetado s.c. na base do pescoço nos animais dos grupos 7 c ; fg ceqtfq eqo c Vcdgnc fg “CitwrcogpVq g fqucigo” Qu 47 animais de controle do grupo 1, que tiveram uma diferentemente marca de número colorido, não foram vacinados.

4.2.8 Desafio

[00169] Nas 2 semanas após a vacinação todos os animais remanescentes em cada grupo foram infectados com desafio por meio da injeção de 0,2 mL de Live NDV Herts 33/56 (6,0 log10 EID50 por galinha) por meio da via i.m. no músculo da perna direita.

4.2.9 Coleta de sangue

[00170] Amostras de sangue para sorologia foram tiradas antes da vacinação (T=0) dos 20 pintinhos por meio de sangria, e a T=2 semanas pós- vacinação de 5 pássaros vacinados/injetados escolhidos aleatoriamente de todos os grupos vacinados/injetados. Depois da coleta de sangue, esses 40 animais (8 grupos de 5 animais) foram tirados do experimento. Todas as amostras de sangue foram transportadas para um laboratório para processamento e análise.

[00171] Depois da coleta de sangue, mas antes do desafio, os 25 animais de controle não vacinados foram divididos aleatoriamente nos 8 grupos vacinados/injetados, isto é, 3 animais de controle foram colocados em cada grupo (n=23/grupo, deixando um grupo com n=24) para servir como sentinelas.

4.2.10 Observação quanto aos sinais clínicos. Pré-desafio:

[00172] Galinhas foram observadas diariamente quanto a presença de sinais clínicos de doença ou outras anormalidades, por versados na técnica. Galinhas apresentando dor ou desconforto, que foram consideradas não transientes em natureza ou prováveis de tornar mais grave, foram sacrificadas por motivos de bem-estar do animal. Galinhas que morreram ou foram sacrificadas pré-desafio não foram submetidas a exame pós-morte, já não ocorreu nenhuma mortalidade alta ou inesperada.

Pós-desafio:

[00173] Por 14 dias pós-desafio todas as galinhas em todos os grupos foram contadas diariamente quanto a ocorrência de evidência clínica de infecção por NDV ou mortalidade. Dados foram registrados por animal em formas especiais. O sistema de contagem seguinte foi usado: 0. Nenhuma ocorrência de evidência clínica de Doença de Newcastle. 1. Ocorrência de evidência clínica de Doença de Newcastle, com sinais nervosos centrais como: espasmo clônico, tremores musculares, torcicolo, opistótono, ou paralisia das pernas ou asas. 2. Mortalidade causada por desafio de NDV. Caso animais tenham sido sacrificados por motivos de bem-estar do animal isto foi indicado no formulário. 4.3 Resultados

4.4 Conclusões:

[00174] A administração de um agonista de TLR21 aviário, simultaneamente ou logo depois da administração de um vetor do Herpesvírus aviário forneceu uma aceleração significante da resposta imune contra o antígeno heterólogo que foi expresso e dispensado pelo vetor. Isto é demonstrado pela porcentagem de sobreviventes de uma infecção pelo desafio de NDV grave, que foi dado muito no início, a saber, nas duas semanas depois da vacinação de vetor.

[00175] Enquanto nenhuma das galinhas que não foram vacinadas (grupo 1) ou receberam somente agonista (grupo 2) sobreviveu, e somente 20% das vacinadas com vetor (grupo 3) sobreviveram, a sobrevivência das vacinadas que receberam tanto vetor quanto agonista foi basicamente maior, dando 30, 35 e mesmo 45% de sobreviventes do desafio (grupos 4, 6, e 7). A sobrevivência de 20% no grupo que recebeu o agonista no 2° dia p.v. (grupo 5) é provavelmente o resultado de uma variabilidade no experimento. Depois de 8 dias p.v. o agonista poderia não mais acelerar a resposta imune ao antígeno heterólogo expresso pelo vetor (grupo 9).

[00176] Consequentemente, o agonista sozinho poderia não induzir uma proteção imune. Também, no momento inicial após a vacinação, a vacina de vetor sozinha somente estabeleceu uma imunidade modesta contra o antígeno F de NDV. Entretanto, com a administração combinada de vetor e agonista, um início de ação precoce da imunidade poderia ser obtido, resultando em uma taxa de sobrevivência ao desafio mais que dobrada.

Exemplo 5: Teste in vivo adicional de atividade do agonista de TLR21 aviário em imunidade induzida pelo vetor do Herpesvirus aviário:

[00177] Um experimento animal adicional em galinhas foi realizado, essencialmente da mesma maneira descrita no Exemplo 4, mas com algumas modificações: a diferença principal sendo que todas as vacinações compreenderam tanto o vetor do Herpesvírus aviário quanto o oligodesoxinucleotídeo na mesma inoculação, e essas foram assim administradas ao mesmo tempo (dia 0).

[00178] Outras variações do protocolo do Exemplo 4 foram que um outro agonista de TLR21 aviário foi usado: X4-pent (SEQ ID NO: 4) (EC50 = 430 pM), e que este agonista foi testado em três diferentes quantidades/dose. 5.1 Resultados:

5.2 Conclusões:

[00179] Novamente, a adição de um agonista de TLR21 aviário demonstrou aceleração significante da resposta imune contra o antígeno heterólogo expresso e dispensado pelo vetor do Herpesvírus aviário: nas duas semanas após a vacinação, até 45% de vacinados que receberam tanto a vacina de vetor quanto o agonista (grupo 3) foram protegidos contra uma infecção pelo desafio de NDV grave. Enquanto que nenhuma das galinhas não vacinadas foi protegida (grupo 1), e somente 10% das vacinadas receberam somente a vacina de vetor (grupo 2).

[00180] Notavelmente: as maiores quantidades do agonista por dose (1 ou 20 μg - grupos 4 e 5) não melhorou a aceleração imune, já que ambos forneceram menos aceleração imune do que a quantidade menor de 0,1 μg por dose de animal (grupo 3).

Claims (7)

1. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor do Herpesvírus aviário, um oligodesoxinucleotídeo e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que o vetor do Herpesvírus aviário compreende uma sequência de nucleotídeos heterólogos que codifica um antígeno de um micro-organismo que é patogênico para aves, e em que o oligodesoxinucleotídeo é um agonista do receptor tipo Toll de ave (TLR) 21, e em que o agonista de TLR21 aviário tem a SEQ ID NO: 1 ou 4.

2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vetor do Herpesvírus aviário é um ou mais selecionados de: vírus da enterite de pato, vírus de laringotraqueíte infecciosa, Herpesvírus de perus, vírus da doença de Marek sorotipo 2, e vírus da doença de Marek sorotipo 1.

3. Método para a preparação de uma vacina como definida na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende a mistura de um vetor do Herpesvírus aviário e um agonista de TLR21 como definido na reivindicação 1 ou 2 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

4. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor do Herpesvírus aviário e um agonista de TLR21 como definido na reivindicação 1 ou 2.

5. Vacina para aves, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição como definida na reivindicação 4 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

6. Método para a preparação de uma vacina como definida na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende a mistura de uma composição como definida na reivindicação 4 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

7. Uso de uma composição como definida na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina para aves.