CN105452468A - 在禽类中加速载体病毒诱导的免疫应答 - Google Patents

Abstract

向禽类疱疹病毒载体疫苗中添加作为禽类TLR21激动剂的寡脱氧核苷酸，提供了针对由所述疱疹病毒载体所表达和递送的抗原的免疫应答的加速。

Description

在禽类中加速载体病毒诱导的免疫应答

本发明涉及兽用疫苗免疫学领域，并且具体涉及包含禽类疱疹病毒载体、寡脱氧核苷酸和药学上可接受的载体的疫苗。本发明还涉及疫苗和寡脱氧核苷酸的方法及用途。

已经确定：寡脱氧核苷酸可以刺激存在于大多数脊椎动物中的先天免疫系统。Krieg等人最先报道了存在于细菌DNA中的非甲基化CpG基序（1995, Nature, vol. 374,p. 546）。在接下来的二十多年中，这一过程已被揭示为对微生物入侵的即刻应答(immediate response)的一部分，其通过识别存在于例如病毒和细菌的基因组物质中的保守结构（所谓病原体相关的分子模式）。为此，先天免疫系统采用专门的模式识别受体如Toll样受体（TLR）。

TLR是I型跨膜糖蛋白，并且激动配体的结合诱导TLR的二聚化，（对于大多数TLR而言）这导致MyD88的结合。这引发细胞信号级联，导致转录因子NFκB的激活。这继而导致1型干扰素（IFN1α和IFN1ß）以及促炎性细胞因子（白细胞介素（IL）1ß、IL6、IL8、IL10、IL12和肿瘤坏死因子α）的表达。另外，这是刺激再次、获得性免疫应答的基础。（Kawai & Akira,2010, Nature Immunol., vol. 11, p. 373）。

在哺乳动物中，用于检测非甲基化CpG基序的TLR为TLR9。然而在禽类基因组中，不存在TLR9基因；取而代之的是发现TLR21充当了哺乳动物TLR9的功能同源物（Brownlie等人，2009, Mol.Immunol., vol. 46, p. 3163；Keestra等人，2010, J. of Immunol.,vol. 185, p. 460）。TLR21并未如TLR9般经过充分研究，但是这两者共享大量的功能相似性：对非甲基化CpG基序的特异性以及细胞内定位。

已经描述了包含免疫刺激的非甲基化CpG的寡脱氧核苷酸（INO）作为疫苗佐剂的用途（Krieg, A.M., 2007, Proc.Am. Thorac.Soc., vol. 4, p. 289），以及用于兽医应用的用途。这被应用于例如家禽：在疫苗中以保护鸡免于新城疫（Newcastle Disease）（Linghua等人，2007, Vet.Immun. and Immunopath., vol. 115, p. 216）；免于传染性法氏囊病（Mahmood等人，2006, Vaccine vol. 24, p. 4838）；或禽流感（Hung等人，2011,Vaccine, vol. 29, p. 29）。有关综述，参见Dar等人（2009, Japan Poultry Science,vol. 46, p. 69）。

近来已公布了若干INO家族，参见：WO 2012/089.800（X4家族）、WO 2012/160.183（X43家族）和WO 2012/160.184（X23家族）。这些INO作为禽类TLR21的激动剂是特别有效的，在低浓度下引起高免疫调节效果。将其添加到疫苗中增强该疫苗中抗原组分的免疫原性。因此，可以减少具有此类TLR21激动剂的疫苗中抗原的量而同时达到与不含该激动剂时相同水平的免疫保护。

在哺乳动物中，TLR9在浆细胞样树突状细胞中大量表达。这些细胞是I型干扰素（其为一种强抗病毒剂）的专门生产者。因此，TLR9激动剂的一项重要活性是作为抗病毒剂，尤其是针对DNA病毒，如腺病毒或疱疹病毒，参见Tang等人（2010, Sci.China Life Sci.,vol. 53, p. 172）。这在实践中非常有效，例如，通过经诱导的TLR9活化的抗病毒作用从接种宿主中迅速清除充当基因递送载体的腺病毒（Nayak & Herzog, 2010, Gene Ther.,vol. 17, p. 295）。相似地，若干类型疱疹病毒受到先天免疫系统的有效攻击，如HSV1、HSV2、VZV和细胞巨化病毒（Yu等人，2011, Cell.Mol.Immunol., vol. 8, p. 181；Gaajetaan等人，2012, Antiviral Res., vol. 93, p. 39；Ong等人，May 2013, Blood,DOI 10.1182；Zhang等人，2013, Plos One, vol. 8, e52003；以及 Martinez-Martin的综述，2010, Frontiers in Biosc.S2, p. 718）。针对仔猪中的兽医疱疹病毒：伪狂犬病毒感染也检测到这一抗病毒效果（Linghua等人，2008, Vaccine, vol. 26, p. 224）。

综上所述：TLR9激动剂是公认的强免疫刺激剂，其诱导对病毒感染，尤其是DNA病毒如疱疹病毒的有效清除。

熟知的用于目标生物主动接种的方法是通过用载体接种；该载体通常为在目标内复制的、活的、低致病性重组微生物，并表达来自病原微生物的抗原，所述目标针对其进行接种。这是经典灭活接种的便利的替代形式，经典灭活接种通常采用大量的抗原、重复的剂量以及佐剂来加强目标的免疫系统。

作为活的并且有感染性的微生物的载体疫苗的特征为其复制能力。这种复制提供了许多优点，例如：可以相对低的量给予载体疫苗，并且载体提供了所表达抗原在目标免疫系统中长期持久的呈递。

因此在某种程度上，用活的重组载体疫苗接种靶生物与“正常”感染没有太大的不同，并且涉及通过载体建立生产性感染以及在目标中诱导免疫应答。发展针对载体本身的免疫（如果有的话）可能与发展针对载体所递送的抗原（通过表达对载体异源的基因）的免疫不太相关。此基因通常源于对目标致病性的微生物，并且编码诱导针对该致病性供体微生物的保护性免疫的蛋白抗原（或其相关部分）。

已知若干类型的载体疫苗，其基于各种各样的微生物如病毒、细菌或寄生物。这其中许多已在商业上使用，尤其是在兽医领域，其中活载体疫苗的经济性最为相关：能通过大规模接种方法向其目标施用的、相对廉价的疫苗。家禽繁育是高容量、低利润率兽医市场的突出实例。

家禽中最常用的病毒载体疫苗是基于禽类疱疹病毒如鸭肠炎病毒（DEV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）或火鸡疱疹病毒（HVT）。

DEV是α疱疹病毒，其感染来自雁形目（鸭、鹅和天鹅）的全年龄段的鸟类。其也被称为鸭疱疹病毒-1型，或鸭瘟疱疹病毒。其已被用作针对禽流感的载体疫苗（Liu等人，2011,J. of Virol., vol. 85, p. 10989）。

ILTV也被称为禽疱疹病毒1型，并在鸡和野鸡中造成严重的呼吸道感染。以减毒形式，其也已被用作针对禽流感的载体（Pavlova等人，2009, Vaccine, vol. 27, p. 773）。

HVT是来自马立克氏病（Marek's disease）病毒（MDV）的科的病毒，其为感染禽类物种的α疱疹病毒科(alphaherpesvirideae)。HVT是MDV血清3型，并也被称为：吐绶鸡疱疹病毒1型(Meleagrid Herpesvirus 1)或火鸡疱疹病毒。据发现，HVT对鸡是完全非致病性的，并且是一种常见的疫苗，例如，HVT菌株FC-126和PB1。

MDV血清2型（MDV2，也称为禽疱疹病毒3型）对鸡实际上是非致病性的。其已被用作载体和疫苗，例如菌株SB1。（Petherbridge等人，2009, J. Virol.Meth., vol. 158, p.11）。

MDV血清1型（MDV1，禽疱疹病毒2型）本来对家禽具有致病性，但已知减毒菌株如：RB1B、814和CVI-988/Rispens，其被用作疫苗或活载体（Cui等人，2013, PLoS One, 2013;8(1): e53340）。

MDV1、MDV2和HVT是全身性病毒，其可作为疫苗在早期龄时应用于鸡：在其从蛋中孵化出的那天（第一天）或甚至孵化前还在蛋中时。上述最后这种方法，所谓的“蛋中接种(in ovo vaccination)”，是胚胎接种的一种形式，其通常在胚胎发育（ED）的第18天左右（大约孵化前3天）应用。

HVT已被长期用作活病毒载体疫苗（参见WO 87/04463），并用于表达和递送各种来自家禽病原体的抗原，如：新城疫病毒（NDV）融合（F）蛋白（Sondermeijer等人，1993,Vaccine, vol. 11, p. 349）；传染性法氏囊病病毒（IBDV）病毒蛋白2型（VP2）（Darteil等人，1995, Virology, vol. 211, p. 481）；禽流感病毒（AIV）血凝素（HA）蛋白（WO 2012/052.384）；以及传染性喉气管炎病毒（ILTV）gD和gI蛋白（Hein等人，2008, 43rd Natl.meeting Poultry Health & Processing, Ocean City, MD, p. 73-74）。但也已经描述了寄生物抗原的表达（Cronenberg等人，1999, Acta Virol., vol. 43, p. 192）。在更近期的发展中，HVT载体构建体已被描述为表达不止一个异源基因，例如：WO 2013/057.235中的NDV F和IBDV VP2基因，以及WO 2013/057.236中的NDV F和ILTV gD/gI基因。

因此，在商业上使用了大量的用于家禽的HVT载体疫苗，例如表达NDV F蛋白：Innovax™-ND（MSD Animal Health）和Vectormune™ HVT-NDV（Ceva）；IBDV VP2：Vaxxitek™ HVT+IBD（Merial；之前命名：Gallivac™ HVT-IBD）和Vectormune™ HVT-IBD（Ceva）；以及ILTV gD/gI：Innovax™-LT（MSD Animal Health）。

使用活疱疹病毒作为载体疫苗的一个顾虑是在产生其所需免疫上的延迟：由于其性质，活载体（如（禽类）疱疹病毒）首先需要在接种的目标生物内建立生产性感染并进行自我复制。这通常将需要约3至7天。然后才发生任何实质水平的异源基因表达，之后必须针对所表达的抗原活化目标的免疫系统；这需要2-3周。因此其可能总共需要长达4周以在目标内发展免疫应答，该免疫应答可以针对由作为异源基因供体的病原体的强烈攻击进行有效保护。当目标生物存活许多年并有足够的时间来发展和加强其免疫时，这并不是主要缺点。然而，就家禽繁育而言，目标的生命周期通常短，并且现场感染压力高。

已发现：提高禽类由载体接种获得的免疫水平的方法在于提高所插入的异源基因的表达水平，例如通过优化其启动子的强度（参见WO 2012/052.384）。然而，这并未导致更早地产生免疫。因此，在本领域中，对于改善使用活载体疫苗的禽类免疫从而尽可能早地提供保护性免疫存在持续的需求。

因此，本发明的目标是：通过在禽类中提供针对由禽类疱疹病毒载体疫苗所表达和递送的抗原的免疫的早发生，克服现有技术的缺点并解决问题。

令人惊奇地发现：此目标可通过使用作为禽类Toll样受体（TLR）21激动剂的寡脱氧核苷酸来实现。其针对由禽类疱疹病毒载体疫苗所表达的抗原，在禽类中提供了加速的免疫应答。

例如，据发现：在小鸡中，通常需要接种后3-4周以发展针对来自携带NDV-F基因的HVT载体的NDV的保护性免疫应答，然而，通过加入禽类TLR21激动剂，在接种后(p.v.)两周就已经针对强烈的NDV攻击-感染实现了有效保护。当考虑到肉鸡6周的生命周期时，这种提前1-2周产生免疫是对载体的接种效力的重要提升，并且对于商业化家禽运营的产出意义重大。

这种对载体诱导的免疫的加速不可能被预见为禽类TLR21活化的结果，因为与其在哺乳动物中的功能同源物TLR9的活性类似，对于其诱导有效的抗病毒作用这一点是已知的。因此，本发明人惊讶地发现：当加入禽类TLR21激动剂时，禽类疱疹病毒载体未被迅速清除，而是相反地，能够增殖并能够表达其异源基因。具体地讲，禽类疱疹病毒载体能够以下面的方式做到这一点：在接种后，其可与没有TLR21激动剂的免疫相比早得多地产生针对所表达抗原的有效免疫。

目前尚不清楚此现象是如何或为何发生，并且由于对禽类（先天）免疫系统的工作知之甚少，所以无法从现有技术得到解释。因此，还不清楚所观测到的TLR21激动剂的效果是否是在一定程度上更快、更强和/或更有效的免疫应答的结果。

不受可能解释这些观测结果的任何理论或模型的束缚，本发明人推测：由禽类TLR21激动剂活化禽类先天免疫系统，在目标禽类体内诱导对于禽类疱疹病毒载体的复制和由其表达出乎意料的支持性的而非有害的免疫环境。

因此，在一个方面，本发明涉及包含禽类疱疹病毒载体、寡脱氧核苷酸和药学上可接受的载体的疫苗，其中所述禽类疱疹病毒载体包含编码来自对禽类致病性的微生物的抗原的异源核苷酸序列，并且其中所述寡脱氧核苷酸为禽类Toll样受体（TLR）21激动剂。

根据本发明的疫苗针对由禽类疱疹病毒载体所表达的异源抗原，在禽类中提供了加速免疫应答。

众所周知，“疫苗”是于药学上可接受的载体中包含免疫活性化合物的组合物。“免疫活性化合物”或“抗原”是经由目标免疫系统识别并诱导免疫应答的分子。该应答可源自先天或获得性免疫系统，并且可以是细胞和/或体液类型。

此免疫应答有助于经接种的目标动物预防、改善由微生物感染所造成的疾病或病症、降低对其的敏感度、或对其治疗。此类保护是作为递送至少一种源自该微生物的抗原的结果而实现的。这将使得目标动物在由微生物引发的临床体征的数量或强度上表现出降低。这可能是降低的微生物侵染、定殖或感染率的结果，导致在损伤的数量或严重程度上以及在由微生物或目标对其的应答所造成的影响上有所降低。

确定根据本发明的疫苗针对禽类病原体的有效性完全在常规业者的技术水平内，例如通过接种后监测免疫应答，或攻击感染后例如通过监测目标的疾病临床体征、临床评分、血清学参数，或通过对病原体再分离，并且将这些结果与在模拟接种的动物中所见到的应答相比较。

下面将概述根据本发明的各种实施方案和疫苗偏好。

如本文中所用的术语“包含/包括（comprising）”（以及变形如“comprise”、“comprises”和“comprised”）是指本发明的所有要素以及可想到的任何可能组合均为使用该术语的正文部分、段落、权利要求等所覆盖或包括，甚至此类要素或组合并未被明确叙述；并且不指排除任何此类要素或组合。因此，任何此类正文部分、段落、权利要求等也可涉及一个或多个实施方案，其中术语“包含/包括”（或其变形）为术语如“由…组成（consistof）”、“由…组成（consisting of）”或“主要由…组成（consist essentially of）”所替代。

术语“禽类”涉及分类学上鸟纲的生物；优选的禽类生物为与人类或兽医科学相关的禽类，如：鸡、火鸡、鸭、鹅、鹧鸪、孔雀、鹌鹑、鸽、野鸡、珍珠鸡、雀、乌鸦、长尾鹦鹉、鹦鹉、金刚鹦鹉（ara）、金刚鹦鹉（macaw）、美冠鹦鹉、雀、隼、鹰、鸸鹋、食火鸡和鸵鸟。更优选选自以下的禽类生物：鸡、火鸡、鸭和鹅。最优选的为鸡。对于本发明，禽类可以为任何品种、类型或变种，如：蛋禽、种禽、肉禽(broiler)、组合品种或此类品种的任何一者的亲本系。优选的类型为：肉禽、种禽和蛋禽。最优选的为肉鸡。

对于本发明，没有必要使用与接种的目标相同的、与禽类疱疹病毒载体来源相同的以及与对禽类致病性的微生物的来源相同的禽类物种。这些中的一种、两种或全部可能有着不同的禽类来源。例如：基于来自火鸡的疱疹病毒载体（HVT）的鸡疫苗表达来自于分离自海鸥的禽流感病毒的HA抗原。

“疱疹病毒”是本领域中所熟知的，并且是属于疱疹病毒科的分类学上的科的病毒。优选的是α疱疹病毒亚科的疱疹病毒。最优选的是DEV、ILTV、HVT、MDV2和MDV1。甚至更优选的是HVT、MDV2和MDV1；最优选的是HVT。

因此，在根据本发明的疫苗的优选实施方案中，禽类疱疹病毒载体是选自以下的一种或多种：鸭肠炎病毒、传染性喉气管炎病毒、火鸡疱疹病毒、马立克氏病病毒血清2型和马立克氏病病毒血清1型。

本发明的“载体”是本领域中所熟知的，其作为活的重组载体微生物，存活于经接种的禽类目标中而不会明显危及该目标，并且表达及向目标免疫系统递送由其所包含的异源核苷酸序列所表达的抗原。对本领域技术人员将显而易见的是，载体理论上可以表达和递送不止一种由一个或多个异源基因所编码的抗原。

优选地，用于根据本发明的疫苗的疱疹病毒载体衍生自已确立的疱疹病毒载体疫苗，具有稳定并有效复制和表达异源抗原的经验证的记录。

对于构建本发明所述的禽类疱疹病毒载体，原料是疱疹病毒粒子，其为有包膜病毒颗粒，包含相对大的线性双链DNA基因组。禽类疱疹病毒具有相同并保守的基因组组织：具有独特的长区和独特的短区，由重复序列侧接。若干疱疹病毒基因组序列是公开可得的，例如来自GenBank™：DEV:EU082088、ILTV：NC_006623、HVT：AF291866、MDV2：HQ840738和MDV1：AF147806。

不同的分子生物学技术可被用于将异源核苷酸序列插入到（禽类）疱疹病毒载体中。例如对于HVT，通过使用同源重组（Sondermeijer等人，1993，同上）、粘粒再生（US 5,961,982）或杆粒（细菌人工染色体）（Baigent等人，2006, J. of Gen.Virol., vol. 87,p. 769）。优选的插入技术是通过粘粒再生，例如WO 93/25.665中所述，或通过使用杆粒，如EP 996.738中所述。这主要采用了禽类疱疹病毒载体基因组的一组大重叠亚基因组片段通过共转染至宿主细胞内来重构完整的基因组。由于粘粒之一携带表达盒，这被稳定地整合到禽类疱疹病毒载体的基因组中。

还已经描述了若干适合的、非必需的、用于将异源基因构建体插入禽类疱疹病毒基因组中的位置；例如对于HVT：在独特的短区内（EP 431.668）或在独特的长基因组区内（WO 87/04463）。优选的插入位点为Us2和Us10位点。

另外，已描述了不同的启动子用于驱动禽类疱疹病毒载体中异源核苷酸序列的表达，如：PRV gpX启动子（WO 87/04.463）、鲁斯（Rous）肉瘤病毒LTR启动子、SV40早期基因启动子、人类巨细胞病毒即刻早期1型（hCMV IE1）基因启动子（EP 719.864）和鸡ß-肌动蛋白基因启动子（EP 1.298.139）。

用于本发明的术语“异源的”是指核苷酸序列不存在于用于生成本发明的载体的亲本载体微生物中。

在本领域中，术语“核苷酸序列”已知为具有“编码”蛋白抗原的能力的核苷酸分子链。这是分子生物学中熟知的概念，并且涉及分子生物学的中心法则，其中DNA序列被转录成mRNA，而mRNA被翻译成蛋白质（或其一部分）的氨基酸序列。以这种方式，核苷酸序列“编码”蛋白质。

为了产生蛋白抗原的实际表达，核苷酸序列优选为开放阅读框（ORF），意味着其不含不期望的、将过早终止转录为mRNA的终止密码子。核苷酸序列可以是“基因”（即编码完整蛋白质的ORF）或是基因片段。其可以是天然或合成来源。核苷酸序列还需要被置于启动子序列（其启动转录过程）的控制之下。这通常称为启动子被“可操作地连接”至核苷酸序列，其中两者均连接在相同DNA上，处于有效接近内，并且它们之间没有将会干扰有效转录的信号或序列。

本发明中所用的启动子序列原则上可以是任何启动子，只要提供对异源核苷酸序列有效且持续的表达。

核苷酸序列与启动子的组合常被称为“表达盒”；可以用载体核酸（如克隆质粒）方便地构建、操纵以及克隆此类盒。这一切在本领域中都是众所周知的。

对于本发明，将异源核苷酸序列稳定插入禽类疱疹病毒基因组中可以通过任何合适的技术实现，只要所得重组疱疹病毒载体能够展现出其对异源抗原的安全、稳定及有效表达的有利作用。

本发明的核苷酸序列优选地编码完整蛋白质，但也可能编码蛋白质的一部分，例如蛋白质的成熟形式，即没有“前导”、“锚”或“信号序列”。核苷酸序列甚至可能仅编码蛋白质的特定部分，如包含免疫保护性表位的部分。

就此而言，本发明的“蛋白质”为氨基酸分子链。蛋白质可以是天然或成熟蛋白质、前蛋白或原蛋白、或蛋白质的免疫原性片段。在蛋白质的定义内尤其包括了肽、寡肽和多肽。

通常，宿主细胞（重组禽类疱疹病毒载体于其中复制）提供了驱动表达过程的生物分子机器。通过修改相关元件，抗原的表达可以在例如时机、水平或质量上优化；这一切均在技术人员的常规能力范围内。

“寡脱氧核苷酸”众所周知意指脱氧核苷酸分子链，是相对短的、大致在约5至约500个核苷酸之间的DNA。此类聚合物分子包含由磷酸二酯键连接的脱氧核糖，并且每个携带一个有机碱基：胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。

本发明中所述的寡脱氧核苷酸可包括修饰，例如磷酸二酯键至硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或脱磷酸(dephospho)键的修饰。脱磷酸键的实例有甲基羟胺、甲缩醛（formacetal）和二亚甲基砜(dimethylenesulfone)基团。

或者，本发明中所述的寡脱氧核苷酸可包括涉及天然核苷碱基被非天然核苷碱基所替换的修饰，所述非天然核苷碱基如：5-氟胞嘧啶、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤、7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、二氢尿嘧啶、5-取代的尿嘧啶、5-溴-胞嘧啶、6-取代的腺嘌呤、6-取代的胞嘧啶或N4-取代的胞嘧啶。

其它可能的修饰还涉及脱氧核糖糖单元被经修饰的糖单元例如L-2'-脱氧核糖或2'-L-阿拉伯糖所替换。

此类修饰可被应用于改变或优化寡脱氧核苷酸的药理学特征，如其生物利用度或半衰期。例如，寡脱氧核苷酸可被配制成药学上可接受的盐，或被转化成药学上可接受的酯或醚，例如在5'或3'端的羟基处。

所有这些修饰都是技术人员所熟知的，并且可仅仅使用常规方法和材料来实施。

在用作哺乳动物TLR9激动剂的寡脱氧核苷酸中，使用（二）硫代磷酸酯键被证明是有益的，改善了稳定性以及免疫刺激活性。然而，对于本发明而言，稳定性似乎并不关键，而且令人惊讶地发现：在与禽类TLR21的相互作用中，完全基于磷酸二酯键的寡脱氧核苷酸较包含（二）硫代磷酸酯键的相似的寡脱氧核苷酸有着更高的免疫刺激活性。

因此，在一个优选的实施方案中，在本发明中用作禽类TLR21激动剂的寡脱氧核苷酸为磷酸二酯形式。

“药学上可接受的载体”有助于有效施用疫苗的免疫活性化合物，而对其所施用的目标动物的健康不引起（严重的）不良反应。此类载体可以例如是无菌水、生理盐水或磷酸缓冲盐水溶液。在更复杂的形式中，载体可以例如是缓冲液，其可包含另外的添加剂，如稳定剂或防腐剂。细节和实例例如在熟知的手册中有述，如：“Remington: the science andpractice of pharmacy”（2000, Lippincot, USA, ISBN:683306472）和：“Veterinaryvaccinology”（P. Pastoret等人编写，1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681）。

例如，用于基于HVT的活病毒（载体）疫苗的标准稳定剂为：Nobilis™ DiluentCA，其中CA代表：细胞相关的；并且其在注射用水中包含：蔗糖、酪蛋白胰酶消化物、磷酸钠缓冲液和酚酞着色剂。此HVT稳定剂可以方便地被用于稀释、贮存和施用如本发明所述的禽类TLR21激动剂。其它的实例有：

本发明的“抗原”为可诱导免疫应答的蛋白质（或其免疫原性部分）。优选地，抗原具有一定的长度、氨基酸序列、结构、形式或质量使得其在接种目标体内所诱导的免疫应答具有足够的强度以针对病原性微生物是保护性的。

用于本发明中的优选抗原是能够在目标中诱导针对该抗原所衍生自的微生物的保护性免疫的蛋白质。这些通常是在微生物或其宿主细胞外表达或呈递的蛋白抗原；此类蛋白质经常涉及与微生物的传染性或毒性相关的过程，如涉及相互作用、附接和/或进入宿主细胞、侵入、营养物摄取、运动性、内毒性或外毒性等等的蛋白质。

在对禽类致病性的微生物是病毒的情况下，则此类蛋白抗原为例如：病毒包膜、衣壳或基质蛋白、或允许形成病毒样颗粒的病毒蛋白质。

用于本发明的优选病毒抗原为：NDV-F或-HN（血凝素-神经氨酸酶）、ILTV-gD和-gI、IBDV-VP2、IBV-S（刺突(spike)）或-M（基质(matrix)）以及AIV-HA、-NA或-M（神经氨酸酶）。

在细菌微生物的情况下，优选的蛋白抗原为膜蛋白如外膜蛋白、肽聚糖、糖蛋白、脂蛋白、胞膜蛋白或S-层蛋白、或来自于纤毛、孔蛋白、菌毛或鞭毛的蛋白质。

抗原“来自微生物”是指作为编码该抗原的核苷酸序列来源的、并且本发明中所述的疱疹病毒载体疫苗旨在针对其提供保护的生物实体。编码抗原的核苷酸序列可以直接或间接地衍生自此类微生物。例如，通过从微生物直接分离，或可以利用来自微生物的信息合成地生成。根据用于其分离的源材料，所获得的编码核苷酸序列可以是DNA或RNA分子。对于经由禽类疱疹病毒载体的表达，核苷酸序列需要是DNA形式。技术人员很清楚从多种起始材料分离出一种或另一种类型的核酸的方法以及在需要时将一种类型传化成另一种类型的方法。

本发明中“对禽类致病性的”微生物是本领域所熟知的。这些包括所有类型的微生物：病毒、细菌、寄生物、真菌、立克次体、原生动物等。作为编码由本发明所述的疱疹病毒载体所表达的一种或多种抗原的核苷酸序列的来源的优选微生物选自：病毒、细菌、寄生物和真菌，所有这些均对禽类致病性。

在优选的实施方案中，对禽类致病性的病毒选自：传染性支气管炎病毒、NDV、禽腺病毒、禽星状病毒、禽副粘病毒、减蛋综合征病毒、鸡腺病毒（fowl adenovirus）、IBDV、鸡贫血病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡痘病毒（fowl pox virus）、火鸡鼻气管炎病毒、鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸽痘病毒、MDV、禽白血病病毒、ILTV、禽偏肺病毒、禽流感病毒、鹅细小病毒和呼肠孤病毒。

在优选的实施方案中，对禽类致病性的细菌选自下列细菌属：埃希氏菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、鸟杆菌属（Ornithobacterium）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、巴氏杆菌属（Pasteurella）、博德特氏菌属（Bordetella）、丹毒丝菌属（Erysipelothrix）、支原体属（Mycoplasma）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、包柔氏螺旋体属（Borrelia）、肠球菌属（Enterococcus）、禽杆菌属（Avibacterium）、立默氏菌属（Riemerella）、李斯特氏菌属（Listeria）、志贺氏菌属（Shigella）、链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、衣原体属（Chlamydia）和梭菌属（Clostridium）。

在优选的实施方案中，对禽类致病性的寄生物选自下列寄生物属：艾美球虫属（Eimeria）和隐孢子虫属（Cryptosporidium）。

在优选的实施方案中，对禽类致病性的真菌选自下列真菌属：曲霉菌属（Aspergillus）和念珠菌属（Candida）。

在根据本发明的疫苗的优选实施方案中，禽类疱疹病毒载体为HVT并且禽类TLR21激动剂为X4-I-minG（SEQ ID NO：1）。

在根据本发明的疫苗的优选实施方案中，禽类疱疹病毒载体为HVT并且禽类TLR21激动剂为X4-pent（SEQ ID NO：4）。

这些微生物及其疾病是本领域所熟知的，并且例如在熟知的手册中有述，如：“TheMerck veterinary manual” (第10版, 2010, C.M.Kahn编辑, ISBN:091191093X)和：“Diseases of Poultry” (第12版, 2008, Y.M.Saif编辑, ISBN-10:0813807182)。

在本发明中，本文中所用的微生物的名称（如疱疹病毒载体和对禽类致病性的微生物的名称）如其在科学文献中目前所用来呈现。因此，这些名称是指目前被归入具有那些名称的分类学组别内的微生物。本发明还包括以任何方法由此被再细分的微生物，例如作为亚种、菌株、分离物、基因型、变体或亚型等等。这些微生物与其分类学上的组成员共享特色性特征，如在其形态、基因组和生化特征上，以及其生物特征如生理、免疫或寄生行为。如领域中已知的，微生物的分类是基于此类特征的组合。

对本领域技术人员将显而易见的是：尽管作为本发明主题的微生物目前通过例如属或种被归入这些组，但是这是分类学上的归类，其可能变化，这是由于新的认识导致重新归类入新的或不同的分类学上的组。然而，由于这并不改变微生物本身或其抗原所有组成成分，而仅改变其科学名称或分类，所以此类重新分类的微生物依然在本发明的范围之内。

“禽类Toll样受体21”是本领域所熟知的，并且若干此类受体的DNA和氨基酸序列可从公共数据库得到；或是作为单独的基因或蛋白质、作为基因组序列的一部分，或是作为基因区段，其指示了与已知TLR21序列的不同之处。例如来自GenBank：对于鸡：NM_001030558和NW_003763865。还已经公开了其它禽类TLR21序列，例如分别对于雀、隼和知更鸟：GU904859、GU904941和JX502652。还公开了不同鸡的类型和品种的TLR21。作为参考，见：Ciraci & Lamont, 2011, Dev.& Comp.Immunol., vol. 35, p. 392; Alcaide &Edwards, 2011, Mol.Biol.Evol., vol. 28, p. 1703；和：Ruan等人，2012, PoultrySci., vol. 91, p. 2512。

另外，本发明人已发现可以公开得到更多的禽类TLR21序列，尽管其未注释或不正确地注释；例如火鸡TLR21的基因可在登录号XM_003209691下得到，其中其被当作“TLR13样”标记。还参见Ramasamy等人（2012, Mol.Biol.Rep., vol. 39, p. 8539）。然而，此基因显示出与鸡TLR21基因显著的同源性，并且当被克隆到HEK293细胞/pNifTy2指示系统中时，此火鸡TLR对非甲基化CpG基序高度应答。用哺乳动物TLR9激动剂“2006”和本文所述的一些禽类TLR21激动剂测试了亚克隆的火鸡TLR21：发现“2006”在此受体上的EC50为6.6 nM，这与“X4-I-minG”的相当，但是“X4-pent”的活性更高，并且其EC50为1.6 nM。

HEK293细胞/pNifTy2指示系统可被用于筛选和证明TLR21激动剂以及TLR21受体。这基于检测细胞展示的由受体（在此即禽类TLR21）活化导致的NFκB活化，其通过由显色反应检测标记基因表达。这在例如WO 2012/089.800中有述，并且其允许对数量巨大的候选激动剂分子在一定浓度范围内的方便、快速和并列比较。还描述了关于禽类TLR21活化的其它检测物系统，例如利用HD11鸡巨噬细胞细胞系（Ciraci & Lamont，同上）在CpG刺激下分泌一氧化氮。其它细胞体系可采用瞬时转染的细胞，并且体内测试同样是可能的。

因此，本领域的技术人员完全能够识别禽类TLR21基因序列和蛋白质序列，以及确认所编码的蛋白质确实是未甲基化的CpG基序的受体。

检测寡脱氧核苷酸是否是本发明的禽类TLR21“激动剂”可以相似的方式方便地实现，例如使用已确立的禽类TLR21。在本领域中，激动剂被定义为可以结合到生物受体上并触发其活化或反应的化合物。在本发明中，禽类TLR21的激动剂包含未甲基化的CpG基序。采用检测物细胞体系或体内模型，此类激动剂将刺激高于其静息、未活化状态的TLR21的活性水平。优选地，激动剂活性是从高至很高；这可使用从低至很低浓度的激动剂来建立。例如，当其在微摩尔或高纳摩尔范围内时，所熟知的标准CpG寡脱氧核苷酸如“ODN 2006”（Krug等人，2001, Eur.J. Immunol., vol. 31, p. 2154）将活化禽类TLR21；本发明的优选寡脱氧核苷酸在低纳摩尔或甚至在皮摩尔浓度范围内具有活性。

建立和比较本发明的禽类TLR21激动剂的激动剂活性的一个便利的方式，是通过确定其EC50值，例如在表达禽类TLR21的HEK293细胞/pNifTy2指示系统中，如WO 2012/089.800中所述。EC50值是半最大有效浓度，并且代表在所使用的受体细胞体系中诱导一定量的受体酶SEAP所必需的寡脱氧核苷酸浓度，其产生了半最大吸收。用于本发明的优选TLR21激动剂的EC50值在纳摩尔或甚至在皮摩尔范围内。

因此，在本发明中，优选的禽类TLR21激动剂的EC50值低于1 mM、更优选地低于500nM、100 nM、10 nM、1 nM、500 pM、100 pM或甚至低于50 pM（以渐增的优先次序）。

在现有技术中已经描述了此类高活性的禽类TLR21激动剂，例如X4（WO 2012/089.800）、X43（WO 2012/160.183）和X23（WO 2012/160.184）家族的化合物。 这些化合物是强TLR21激动剂，甚至当在很低浓度下时也可活化禽类TLR21。

因此，在根据本发明的疫苗的优选实施方案中，禽类TLR21激动剂选自X4、X43或X23家族。

毫无疑问，根据本发明的疫苗还可以包含不止一种TLR21激动剂，并且这些激动剂可以选自一个、两个或选自全部三个这些化合物家族。

WO 2012/089.800中公开了X4家族的TLR21激动剂；其公开内容据此全文通过引用并入。

因此，在根据本发明的疫苗的优选实施方案中，该禽类TLR21激动剂具有通式：5'-[N1]x [N7]r {N3 [N4]p C G [N5]q N6}n [N8]s [N2]z -3'，其中：N1 = C或G；N2 = C或G；N3 = T、C或G；N4 = C或T，如果当N3 = C，那么N4 = T；

N5 = C或T；N6 = A、T、G或C；N7 = A、T、C或G；N8 = A、T、C或G；x = 3-10；n = 2-100；z= 0-10；r = 0-8，如果当N7 = T，那么r = 1-25；p = 1-6，如果当N4 = T，那么p = 1-25；q= 1-6，如果当N5 = T，那么q = 1-25；并且s = 0-8，如果当N8 = T，那么s = 1-25。

WO 2012/160.183中公开了X43家族的TLR21激动剂；其公开内容据此全文通过引用并入。

因此，在根据本发明的疫苗的优选实施方案中，该禽类TLR21激动剂具有通式：5'-[G]x {[T]p T T C G T C [T]q }n [G]z -3'，其中：p = 1-15；q = 1-15；n = 2-100；x =3-10；并且z = 0-10。

WO 2012/160.184中公开了X23家族的TLR21激动剂；其公开内容据此全文通过引用并入。

因此，在根据本发明的疫苗的优选实施方案中，该禽类TLR21激动剂具有通式：5'-[G]x { T C G T C G}n T C G [G]z -3'，其中：x = 3-20；

z = 0-10；并且n = 2-100。

本发明所述的TLR21激动剂可以本领域中均已知的不同方式产生。（Ellington &Pollard, 2001,于:Synthesis and purification of oligonucleotides.CurrentProtocols in Molecular Biology, unit 2.11, p. 1-25; J. Wiley & sons Inc.）。此外，许多商业供应商提供寡脱氧核苷酸的定制合成（具有所需的修饰、以任何规模）。例如：BioSpring（Frankfurt a. M., Germany）和Eurofins MWG Operon （Ebersberg,Germany）。

在探究本发明时发现：如本发明所述的TLR21激动剂，当其更长时，通常具有更强的激动剂活性；尤其是，长度超过100个核苷酸的寡核苷酸是高活性的。然而，如此长的寡脱氧核苷酸变得愈发难以可靠地合成以及纯化。同样对于兽医应用而言，更长的寡脱氧核苷酸迅速变得过于昂贵。因此，用于根据本发明的疫苗中的TLR21激动剂的长度优选地为约20至约70个核苷酸，更优选22至60、25至50、30至45或甚至约30至约40个核苷酸（以渐增的优先次序）。

类似地，据发现：当一段G核苷酸在CpG基序3'（即下游）端更短或甚至不存在并且一段G核苷酸在CpG基序5'（即上游）端更长时，如本发明所述的TLR21激动剂作为禽类TLR21激动剂的活性更高。

这是出乎意料的并且是禽类TLR21与哺乳动物TLR9之间的差异，因为本发明人观测到对于哺乳动物TLR9激动剂而言，具有短/不存在的5'G段(stretch)和长的3'G段的活性更高。

因此，在来自X4家族的TLR21激动剂的优选实施方案中：s = 0并且z = 0。

在来自X43家族的TLR21激动剂的优选实施方案中：z = 0。

并且，在来自X23家族的TLR21激动剂的优选实施方案中：z = 0。

来自X4家族的TLR21激动剂的进一步优选实施方案为，其中：N1 = G；N7 = G；r =3-8（优选地 r=5）；N3 =T；N4 = T；p = 2-6；N5 = T；N6 = T；q = 2-6；并且n = 3-10（优选地 n= 3-5）。

来自X4家族的更优选的TLR21激动剂为，其中：{N3 [N4]p C G [N5]q N6} =TTCGTT或TTTCGTTT，例如分别为寡核苷酸X4-pent和X4-I-minG，因为其在活性与大小及成本之间提供了良好的折衷。

用于根据本发明的疫苗中的来自所述全部三个化合物家族的进一步优选的TLR21激动剂示于表1。所标示的EC50值是用表达鸡TLR21的HEK293细胞/pNifTy2指示体系测定的。

根据本发明的疫苗原则上可以是相当简单的组成：寡脱氧核苷酸（根据其制剂，可以简单地溶于水性缓冲液中）和禽类疱疹病毒载体（可以被包含在含有病毒的溶液中）以及稳定其活力的缓冲液。当与本发明的药学上可接受的载体混合时，即得到根据本发明的疫苗。

因此，在另外的方面，本发明涉及制备根据本发明的疫苗的方法，其包括混合禽类疱疹病毒载体、禽类TLR21激动剂（二者均如本发明所述）和药学上可接受的载体。

此方法所得的产品即为根据本发明的疫苗，其在禽类中加速针对由禽类疱疹病毒载体所表达的抗原的免疫应答。

用于根据本发明的疫苗中的疱疹病毒载体是采用病毒培养的标准程序制备的。在宿主动物中生产前，优选在合适的宿主细胞的体外培养物中增殖，例如：在原代细胞如鸡胚成纤维细胞（CEF）（对于HVT和MDV）中或在已确立的细胞系如来航鸡雄性肝癌（Leghornmale hepatoma，LMH）细胞（对于ILTV）中。此类方法是本领域技术人员所熟知并且容易适用的。例如：通过转染和重组来构建本发明的疱疹病毒载体并选择所需的重组病毒。接着，以更大的量工业化生产载体病毒。从此类培养物中，收获包含病毒的悬浮液（以受感染的全细胞或细胞超声破碎物），将此悬浮液配制到疫苗中并将病毒载体产品包装及贮存直到进一步使用。

为制备根据本发明的疫苗，可以不同的方式和不同的顺序混合寡脱氧核苷酸、载体（vector）和载体（carrier）；例如，这三种组分中的两种可以互相预混合，然后加入第三种组分。出于大量经济或实际原因，这可能是有益的，例如出于质量控制、降低成本和劳力、或贮存和物流的原因。通过这种方式，可以制备和贮存中间产品，并且仅在装运前不久或甚至在使用前不久制备最终完整的疫苗。

在对质量、数量和消毒进行充分测试后，疫苗可随后准予销售。

应用于疫苗制备的普通技术和考量是本领域所熟知的并且在例如政府规制（药典）中以及手册如：“Veterinary vaccinology”和：“Remington”中（均同上）有述。

在优选的实施方案中，本发明的疱疹病毒载体为现有的商用疫苗产品，所以技术人员只需要混合如本发明所述的寡核苷酸，以制备根据本发明的疫苗。这可以在受控制的条件下，由生产者或仅由有资质的人在接种的现场完成。在最后这种情况下，根据本发明的任何实施方案的疫苗可以被制备为部件试剂盒，其包含在单独容器中的禽类疱疹病毒载体和寡脱氧核苷酸。

可选地，可将均如本发明所述的疱疹病毒载体和寡脱氧核苷酸混合成组合物，所述组合物是根据本发明的疫苗的中间产品，如在稳定剂或稀释剂中的混合物。与其它可想到的中间产品类似，就质量或经济而言，以此类方式制备组合物可以是有利的。

因此，在另外的方面，本发明涉及：

- 包含均如本发明所述的禽类疱疹病毒载体和寡脱氧核苷酸的组合物；

- 包含根据本发明的组合物和药学上可接受的载体的用于禽类的疫苗；

- 制备根据本发明的疫苗的方法，其包括混合根据本发明的组合物和药学上可接受的载体；

- 根据本发明的组合物在制造用于禽类的疫苗上的用途。

根据本发明的任何实施方案的疫苗可包含稳定剂，以例如保护敏感组分免于降解、延长疫苗的保质期和/或改善贮存效率（如对于冷冻或冷冻干燥而言）。通常，稳定剂是具有高分子量的大分子，如脂质、碳水化合物或蛋白质；例如奶粉、明胶、血清白蛋白、山梨醇、海藻糖、亚精胺、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮和缓冲剂如碱金属磷酸盐。

优选地，稳定剂不含动物来源的化合物，乃至：如WO 2006/094.974中所公开的，是化学上确定的。

还可加入防腐剂，例如：硫柳汞（thimerosal）、硫柳汞（merthiolate）、酚类化合物和/或庆大霉素。

毫无疑问，将其它化合物（如载体、稀释剂、乳状液等）混合到根据本发明的疫苗中也是在本发明的范围之内。此类添加剂在熟知的手册中有述，如：“Remington”和“Veterinary Vaccinology”（均同上）。然而，任何疫苗成分均不应干扰由禽类疱疹病毒载体的生产性感染的活力或建立，或干扰由禽类TLR21激动剂的对禽类免疫应答的加速。

这同样适用于根据本发明的疫苗作为冷冻干燥产品的制剂，其可允许在高于0℃的温度（例如4℃）下延长的储存。然而，这在具体情况下是否是有利的，则取决于用于本发明的禽类疱疹病毒载体的特征，因为一些疱疹病毒（例如MDV1）经受不了冷冻干燥。

根据本发明的疫苗可额外包含所谓的“媒介物”；其可为疫苗组分提供支持，使之以非共价键合的方式粘附其上。此类媒介物理论上(i.a.)为生物微胶囊、微海藻酸盐(micro-alginates)、脂质体、macrosols、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝或氧化铝(aluminium-hydroxide,phosphate, sulphate or -oxide)、二氧化硅、Kaolin™和Bentonite™（均为本领域已知的）。

实例是其中抗原部分嵌入免疫刺激复合物中的媒介物，所谓的ISCOM™（参见EP109.942）。

此外，根据本发明的疫苗可包含一种或多种合适的表面活性化合物或乳化剂，例如来自Span™或Tween™家族的组分。

本领域技术人员将认识到：需要核实和测试任何以及所有的添加剂与本发明的禽类疱疹病毒载体和寡脱氧核苷酸的相容性。

根据本发明的疫苗的每个禽类剂量的禽类疱疹病毒载体的量并不像其在灭活型疫苗中那么关键。这是因为禽类疱疹病毒载体将自我复制并因而在目标禽类体内倍增最高至生物可承受的病毒血症的水平。不过，必须给予最小剂量以实现对载体疫苗的有效“摄取”。在这方面，有不同的方式来对活的疱疹病毒定量；一种便利的方式是对实际活的病毒颗粒计数，如在易感细胞层上的空斑测定法。本发明的禽类疱疹病毒载体的量随即可表示为空斑形成单位（pfu）的数量。哪一剂量构成有效的接种量取决于在本发明中用作载体的具体疱疹病毒的活力和复制强度。

在根据本发明的疫苗中，本发明的禽类疱疹病毒载体的优选量为约10至约1x10^7pfu 禽类疱疹病毒载体/剂量，更优选为1x10^2至1x10^6、1x10^3至1x10^5、1x10^3至1x10^4以及甚至为1000至5000 pfu/剂量（以渐增的优先次序）。

如果本发明的禽类疱疹病毒载体为细胞结合病毒（如可适用于HVT或MDV），那么该载体可以细胞结合形式(cell-associated form)施用。在这种情况下，一个禽类剂量包含100至10000个受感染的宿主细胞/剂量，优选100-5000个受感染细胞，更优选200-2000个受感染的宿主细胞/剂量。

除了根据本发明的疫苗已经提供的加速的免疫保护之外，其还可有利于加入一种或多种另外的免疫活性组分。此类组分可以是抗原、另外的INO、免疫增强物质、细胞因子和/或疫苗，以产生联合疫苗。这在成本、效率和动物福利方面提供了优势。可选地，可以将根据本发明的疫苗本身加入到疫苗中。

根据本发明的疫苗原则上可以通过不同的施用途径并且在其有效期的不同时间点向目标禽类施用，前提是接种的重组禽类疱疹病毒载体可以建立起针对异源抗原的保护性感染。原则上，这与禽类目标的年龄、重量、性别、免疫状况等无关，尽管为健康的目标接种并且尽可能早地接种以抵御来自例如MDV、NDV或IBDV的现场感染压力显然是有利的。因此，尽可能早地应用根据本发明的疫苗是有利的，优选在孵化当天（第1天）或甚至在蛋内，例如在ED 18天。用于以工业规模向蛋内自动注射的合适的设备可商购获得。这在使人力成本最小化的同时，提供了最早的可能的保护。

因此，在优选的实施方案中，在蛋内施用根据本发明的疫苗。

已知不同的蛋内接种途径，如进入到卵黄囊、胚胎或尿囊液腔中；这些可以根据需要而优化。

或者，可对个别禽类施以肠胃外接种。其优选的是肌内或皮下应用。其它有益的免疫途径为通过消化途径、肠途径或粘膜途径；例如通过口腔、鼻、口鼻或眼部途径。这可以通过滴或喷雾接种的任何方法来实现。这些施用途径的另外的实例是大规模应用的便利性和经济性。

适用于注射的根据本发明的疫苗的制剂为例如悬浮液、溶液、分散液或乳状液。

取决于根据本发明的疫苗的应用途径，可能有必要调整疫苗的组成。这完全在本领域技术人员的能力之内，并且通常涉及对疫苗功效或安全性的微调。这可以通过调整疫苗剂量、数量、频率、途径，通过使用另一种形式或制剂的疫苗，或通过调整或添加其它的疫苗成分（例如稳定剂或佐剂）来实现。

例如，为了适于在蛋内应用，疫苗组成需要很温和，以免降低蛋的孵化率。然而，即使这样，孵化率仍然可能出现一些降低，例如由接种本身对胚胎的机械损伤、感染等所造成。

本发明人已经确定：如本发明所述的寡脱氧核苷酸可以向鸡蛋内应用至至少10 µg/剂量，而不诱导明显的病理反应。然而，此量可能在经济上不可行。本发明人还已经观测到：特定的TLR21激动剂可以具有最佳有效剂量，使得更高或更低的量得到更低的免疫加速效果；例如在一项动物实验中，0.1 µg/鸡的剂量的禽类TLR21激动剂优于0.01 µg或1 µg/鸡的剂量。技术人员将认识到这可能取决于多项参数如：所使用的寡脱氧核苷酸的比活性、禽类目标的物种、制剂、施用途径等，并且他/她将能够通过常规实验方法来优化此类条件。

可以多种方式便利地对用于本发明中的寡脱氧核苷酸进行定量，例如通过具有经UV吸收光谱法在待测试的特定寡脱氧核苷酸（通常在约250-280 nm的范围内）的经计算的消光系数来检测的柱层析。

因此，在本发明中，如本发明所述的寡脱氧核苷酸的优选的量/禽类剂量为0.1 ng至1 mg，更优选为1 ng至100 µg，甚至更优选为约10 ng至约10 µg/禽类剂量，并且最优选为约30 ng至3 µg/禽类剂量。

根据本发明的疫苗可以同样用作预防性治疗和治疗性治疗，并且干预禽类病原体、感染或其疾病的临床体征的确立和/或进展二者。

根据本发明的疫苗还可以有效地用作引发接种，其可随后为（用根据本发明的疫苗或灭活的用于禽类的疫苗）加强接种并通过其增强。

向目标禽类施用根据本发明的疫苗的剂量方案可以是单剂量或是多剂量，其可在同一时间或依序给予，以与疫苗的所需剂量和制剂相容的方式并且以将对目标禽类是免疫有效的量。

理想情况下，将根据本发明的疫苗的施用方案整合进现有的、用于该目标禽类的其它疫苗的接种程序表中。

优选地，根据本发明的疫苗仅在孵化当天或在ED第18天于蛋内应用一次。然而，取决于所接种的禽类的类型及其繁育时间表，可能需要对该禽类进行一次、若干次或甚至周期性再接种。

根据本发明的疫苗的体积/禽类剂量可以根据预期的应用途径进行优化：蛋内接种通常采用的体积为约0.05至0.5 ml/蛋，而肠胃外注射通常采用体积为约0.1至1 ml/禽类来完成。对疫苗剂量体积的优化完全在本领域技术人员的能力之内。

根据本发明的疫苗实际上是针对其载体所表达的异源基因提供保护的微生物的“标记疫苗”，因为其产生的免疫仅仅针对来自此微生物的一种（或几种）蛋白质。这允许了“区分受感染的和经过接种的动物”，所谓的“DIVA”方法。这可以通过血清学测定（如ELISA或免疫荧光测定）方便地进行。

本发明的有利效果：在禽类中加速针对禽类疱疹病毒载体所表达和递送的抗原的免疫应答，是在向禽类施用如本发明所述的禽类疱疹病毒载体和寡脱氧核苷酸时而实现的。有若干种方式，其中可以实现此施用并且获得所述有利效果。这些导致了本发明的不同方面和实施方案。具体而言：可以使用根据本发明的实施方案之一的疫苗或使用此类疫苗的单独的成分对禽类实施免疫。在本文中描述并举例说明了这些各种实施方案的细节。

例如，可以将来自单独的组分或来自所述中间组合物的如本发明所述的禽类疱疹病毒载体和寡脱氧核苷酸组合到一种疫苗中。或者，可以分别用载体和寡脱氧核苷酸为禽类接种，例如当载体已被配制成疫苗时，则可将寡脱氧核苷酸添加到该疫苗中，或是分别施用。当作为分别接种给予时，则优选地，向目标禽类接种如本文所述的禽类疱疹病毒载体和寡脱氧核苷酸间隔不超过３天。如下举例说明，其中描述了施用禽类疱疹病毒载体后最长达三天，单独施用如本发明所述的寡脱氧核苷酸对于加速免疫应答仍然有效。

因此，在本发明中，如本发明所述的禽类疱疹病毒载体和寡脱氧核苷酸可以单次或双次施用的方式向禽类施用；当二者组合在单一制剂中时为单次施用；双次施用可以通过在不同的时间、或同时但于身体的不同部位、通过不同途径或通过不同方法施用。当分别施用时，向目标禽类施用载体和寡脱氧核苷酸间隔不超过３天，其中可以在先施用任一者。

因此，在另外的方面，本发明涉及禽类接种的方法，其包括向禽类施用如本发明所述的禽类疱疹病毒载体以及如本发明所述的寡脱氧核苷酸。

施用可以是组合的或通过部位、途径或方法而分开的。技术人员能够测试这些可能的施用方式的改变，以获得对于某一禽类物种最佳的方案或所需的免疫保护。

在另外的方面，本发明涉及如本发明所述的TLR21激动剂，其用于在禽类中加速针对由如本发明所述的禽类疱疹病毒载体所表达的抗原的免疫应答。

在另外的方面，本发明涉及如本发明所述的TLR21激动剂，其用于禽类接种的方法，以在禽类中加速针对由如本发明所述的禽类疱疹病毒载体所表达的抗原的免疫应答。

在另外的方面，本发明涉及如本发明所述的TLR21激动剂的用途，其用于制造用于禽类的疫苗，以在禽类中加速针对由如本发明所述的禽类疱疹病毒载体所表达的抗原的免疫应答。

在另外的方面，本发明涉及在禽类中加速针对由如本发明所述的禽类疱疹病毒载体所表达的抗原的免疫应答的方法，其包括向禽类施用如本发明所述的TLR21激动剂。

现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1：合成与纯化TLR21激动剂

用于本发明的实验中的寡脱氧核苷酸订购自BioSpring（Frankfurt a. M., Germany）并收到经纯化和冻干的指定量。根据实验用途，将这些稀释于合适的缓冲液中。通过组合UV监测的尺寸排阻层析偶尔对浓度进行检查，但在所有情况下均发现是正确的。

实施例2：禽类疱疹病毒载体：

用于一些实验的禽类疱疹病毒载体，HVT-F-VP2，基于HVT并且包含来自NDV的F基因以及来自IBDV的VP2基因（二者均被插入Us2区域）。构建载体、细胞上生产、定量等均在WO2013/057.235中有述。

实施例3：禽类TLR21激动剂活性的体外测试：

已经在例如WO 2012/089.800中描述了用鸡TLR21受体转化的HEK293细胞系在测试和定量禽类TLR21激动剂候选物中的用途。然而，简而言之：用NFκB活化报告质粒：pNiFty2-SEAP（InvivoGen, San Diego, CA, USA）转染HEK293细胞。选择克隆细胞系并用于使用鸡TLR21基因的转染。再次选择克隆细胞系。这些被用于检测当与不同浓度的禽类TLR21激动寡脱氧核苷酸温育时NFκB活化。读出通过比色（通过OD 405 nm 分光光度法）检测所分泌的SEAP（分泌型胚胎碱性磷酸酶）的活性。将其作为激动剂浓度梯度的函数绘制成mOD405nm/min。相关结果为在相对低激动剂浓度下具有高颜色形成速率的那些。

实施例4：就禽类疱疹病毒载体诱导的免疫体内测试禽类TLR21激动剂活性：

4.1 引言

此实验设计用于测试TLR21激动剂：X4-I-minG（EC50 = 1.9 nM）对禽类疱疹病毒载体在鸡中诱导的免疫的体内影响。对于一种量的激动剂，测试了向经载体接种的鸡(birds)施用TLR21激动剂的不同时间点。

4.2材料和方法

4.2.1 实验设计

七（7）组1天龄的SPF白色来航（White Leghorn）鸡（n=25/组）在颈基部用HVT-F-VP2载体（表达NDV-F和IBDV-VP2抗原）皮下(s.c.)接种一次：组3-9。组2仅在T=0时皮下注射了TLR21激动剂，而组1是未经接种的攻击对照。

在接种后的若干个时间点，根据分组和给药的治疗时间表在颈基部皮下注射TLR21激动剂。在接种（T=0）前，从20只孵化同伴（hatchmate）中通过放血采集血样，并且在T=接种后2周时，从组2-9中5只随机抽取的经接种/注射的鸡采集血样，然后将这40只动物从实验中移除从而形成新的n=20/组。血浆被用于确定抗NDV和抗IBDV抗体滴度。在血液采样后，将25只未经接种的对照动物（组1）随机分配至8个经接种/注射的组，即在每组中放入3只对照动物（n=23/组；1组为n=24）。随后，通过肌内注射（i.m.）途径用0.2 ml（6.0 log10EID50）NDV Herts 33/56菌株对所有动物进行攻击。

4.2.2 生物安全性

将鸡安置在隔离室中、负压下并具有Hepa过滤的空气进/出，以包含经基因改造的载体和剧毒的攻击病毒。

4.2.3 试验材料

禽类TLR21激动剂： X4-I-minG

载体疫苗： HVT-F-VP2，第6代。

攻击材料： 活的NDV Herts 33/56，滴度为：9.6 log10 EID50/ml。

剂量： 1剂量等于0.2 ml。以0.1 µg/剂量注射TLR21激动剂。

4.2.4 试验动物：

白色来航鸡，无特定病原体、性别混合、于实验开始时为1天龄。用翅膀标签为鸡单独编号。用不同颜色的标签为组1的25只对照鸡编号。

4.2.5 食物和水

动物可自由进食和饮水。

4.2.6 分组和给药

4.2.7 接种

来自组3-9的动物在1天龄时，在颈基部用0.2 ml载体疫苗皮下接种。在T=0时，为组2注射仅0.1 ml TLR21激动剂。

在接种后的若干个时间点，根据“分组和给药”表在组5-9的动物中颈基部皮下注射0.1 ml TLR21激动剂。来自组1的25只对照动物（其具有不同颜色的编号标签）不接种。

4.2.8 攻击

在接种后2周时，每组中所有剩余动物经肌内途径在右腿肌肉中经注射0.2 ml 活的NDV Herts 33/56（6.0 log10 EID50/鸡）进行攻击感染。

4.2.9 血液采样

用于血清学的血样于接种前（T=0）从20只孵化同伴通过放血采集，并且在T=接种后2周时，从来自所有经接种/注射的组中5只随机抽取经接种/注射的鸡采集血样。在血液采样后，将这40只动物（8组，各5只动物）从实验中移除。将所有血样运送到实验室中进行处理和分析。

在血液采样后，但于攻击前，将25只未经接种的对照动物随机分配至8个经接种/注射的组，即在每组中放入3只对照动物（n=23/组；余下一组为n=24）以充当标记(sentinels)。

4.2.10 观测临床体征。

攻击前：

由有资质的人员每日观测鸡是否存在疾病的临床体征或其它异常。表现出疼痛或不适的鸡（认为其是性质上非暂时的或有可能变得更严重的）出于动物福利原因进行处死。由于未出现高的或意外的死亡，所以未将攻击前死亡或处死的鸡交予尸检。

攻击后：

攻击后的14天中，每日为所有组的所有鸡就NDV感染或死亡的临床证据的发生进行评分。将每只动物的数据记录在专门的表格中。采用了如下评分系统：

0. 无新城疫的临床证据发生。

1. 发生新城疫的临床证据，伴随中枢神经体征如：阵发性痉挛、肌肉震颤、斜颈、角弓反张或腿部或翅膀瘫痪。

2. 由NDV攻击造成的死亡。如果动物是出于动物福利原因被处死，其在表格中被标示出。

4.3 结果

4.4 结论：

在施用禽类疱疹病毒载体的同时或在其之后不久施用禽类TLR21激动剂，为针对由该载体所表达和递送的异源抗原的免疫应答提供了显著的加速。这通过严重的NDV攻击感染的幸存者的百分比证实，所述攻击在载体接种后很早（即在两周时）给予。

虽然未经接种（组1）或仅接受了激动剂（组2）的鸡无一存活，并且载体接种者（组3）仅有20%存活，但是同时接受了载体和激动剂的接种者的存活率大部分更高，产生30、35以及甚至45%的攻击幸存者（组4、6和7）。在接种后2天时接受激动剂的组（组5）中20%的存活率可能是试验中变异性的结果。在接种后8天后，激动剂不再能够加速针对载体所表达的异源抗原的免疫应答（组9）。

因此，单独激动剂不能诱导免疫保护。同样，在接种后的这一早期，单独载体疫苗仅建立了针对NDV-F抗原的适度的免疫。然而，将载体和激动剂结合施用，可以实现免疫的早发，导致超过两倍的攻击存活率。

实施例5：就禽类疱疹病毒载体诱导的免疫进一步体内测试禽类TLR21激动剂活 性：

对鸡进行了另外的动物试验，其方式与实施例4中所述基本上相同，但有一些改动：主要的不同在于所有的接种均在同一接种中同时包含禽类疱疹病毒载体和寡脱氧核苷酸，并因此将其同一时间（第0天）施用。

来自实施例4的方案的其它变化在于使用了另一种禽类TLR21激动剂：X4-pent（SEQ ID NO:4）（EC50 = 430 pM），并且以三种不同的量/剂量测试了此激动剂。

5.1 结果：

组	数量	载体疫苗	X4-pent的量	在接种后2周的%存活
					1	20	无	无	无
2	20	HVT-F-VP2	无	10
					3	20	HVT-F-VP2	0.1 µg	45
4	20	HVT-F-VP2	1.0 µg	20
					5	20	HVT-F-VP2	20 µg	20

5.2 结论：

再一次地，添加禽类TLR21激动剂证实针对由禽类疱疹病毒载体所表达和递送的异源抗原的免疫应答的显著加速：在接种后两周时，保护了高达45%的同时接受了载体疫苗和激动剂的接种者（组3）免受严重的NDV攻击感染。而未经接种的鸡无一受到保护（组1），并且仅接受了载体疫苗的接种者仅有10%受到保护（组2）。

值得注意的是：更高的激动剂的量/剂量（1或20 µg - 组4和5）并未改善免疫加速，因为与0.1 µg/动物剂量（组3）的最低量相比，二者均提供了更弱的免疫加速。

Claims (15)

1.疫苗，其包含活的禽类疱疹病毒载体、寡脱氧核苷酸和药学上可接受的载体，其中所述活的禽类疱疹病毒载体包含编码来自对禽类致病性的微生物的抗原的异源核苷酸序列，并且其中所述寡脱氧核苷酸为禽类Toll样受体（TLR）21激动剂。

2.根据权利要求1的疫苗，其中所述活的禽类疱疹病毒载体为选自以下的一种或多种：鸭肠炎病毒、传染性喉气管炎病毒、火鸡疱疹病毒、马立克氏病病毒血清2型和马立克氏病病毒血清1型。

3.根据权利要求1或2中任一项的疫苗，其中所述禽类TLR21激动剂具有通式：5'- [N1]x [N7]r {N3 [N4]p C G [N5]q N6}n [N8]s [N2]z -3'，其中：

N1 = C或G，

N2 = C或G，

N3 = T、C或G，

N4 = C或T，如果当N3 = C，那么N4 = T，

N5 = C或T，

N6 = A、T、G或C，

N7 = A、T、C或G，

N8 = A、T、C或G，

x = 3-10，

n = 2-100，

z = 0-10，

r = 0-8，如果当N7 = T，那么r = 1-25，

p = 1-6，如果当N4 = T，那么p = 1-25，

q = 1-6，如果当N5 = T，那么q = 1-25，并且

s = 0-8，如果当N8 = T，那么s = 1-25。

4.根据权利要求1或2中任一项的疫苗，其中所述禽类TLR21激动剂具有通式：5'- [G]x{[T]p T T C G T C [T]q }n [G]z -3'，其中：

p = 1-15，

q = 1-15，

n = 2-100，

x = 3-10，并且

z = 0-10。

5.根据权利要求1或2中任一项的疫苗，其中所述禽类TLR21激动剂具有通式：5'- [G]x{ T C G T C G}n T C G [G]z -3'，其中：

x = 3-20，

z = 0-10，并且

n = 2-100。

6.制备根据权利要求1-5中任一项的疫苗的方法，其包括将如权利要求1或2中任一项中所述的活的禽类疱疹病毒载体、如权利要求3-5中任一项中所述的TLR21激动剂以及药学上可接受的载体混合。

7.组合物，其包含如权利要求1或2中任一项中所述的活的禽类疱疹病毒载体和如权利要求3-5中任一项中所述的TLR21激动剂。

8.用于禽类的疫苗，其包含根据权利要求7的组合物以及药学上可接受的载体。

9.制备根据权利要求8的疫苗的方法，其包括将根据权利要求7的组合物与药学上可接受的载体混合。

10.根据权利要求7的组合物在制造用于禽类的疫苗中的用途。

11.接种禽类的方法，其包括向禽类施用如权利要求1或2中任一项中所述的活的禽类疱疹病毒载体和如权利要求3-5中任一项中所述的TLR21激动剂。

12.如权利要求3-5中任一项中所述的TLR21激动剂，其用于在禽类中加速针对由如权利要求1或2中任一项中所述的活的禽类疱疹病毒载体所表达的抗原的免疫应答。

13.如权利要求3-5中任一项中所述的TLR21激动剂，其用于接种禽类的方法，以在禽类中加速针对由如权利要求1或2中任一项中所述的活的禽类疱疹病毒载体所表达的抗原的免疫应答。

14.如权利要求3-5中任一项中所述的TLR21激动剂在制造用于禽类的疫苗中的用途，以在禽类中加速针对由如权利要求1或2中任一项中所述的活的禽类疱疹病毒载体所表达的抗原的免疫应答。

15.用于在禽类中加速针对由如权利要求1或2中任一项中所述的活的禽类疱疹病毒载体所表达的抗原的免疫应答的方法，其包括向禽类施用如权利要求3-5中任一项中所述的TLR21激动剂。