WO2014192765A1 - 遺伝子発現の制御方法、目的物質の製造方法、および、それらに用いるｄｎａ配列、発現ベクター、並びに、シアノバクテリア - Google Patents

遺伝子発現の制御方法、目的物質の製造方法、および、それらに用いるｄｎａ配列、発現ベクター、並びに、シアノバクテリア Download PDF

Info

Publication number
WO2014192765A1
WO2014192765A1 PCT/JP2014/064017 JP2014064017W WO2014192765A1 WO 2014192765 A1 WO2014192765 A1 WO 2014192765A1 JP 2014064017 W JP2014064017 W JP 2014064017W WO 2014192765 A1 WO2014192765 A1 WO 2014192765A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cyanobacteria
expression
sequence
gene
target gene
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/064017
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
公一 阿部
早出　広司
Original Assignee
国立大学法人東京農工大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人東京農工大学 filed Critical 国立大学法人東京農工大学
Priority to JP2015519881A priority Critical patent/JPWO2014192765A1/ja
Publication of WO2014192765A1 publication Critical patent/WO2014192765A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling gene expression, a method for producing a target substance, and a DNA sequence, expression vector, and cyanobacteria used therefor.
  • Non-patent Document 2 As a promoter that functions in Synechosystis sp. PCC6803, a promoter inducible by Ni 2+ has been reported (Non-patent Document 2). However, since Ni 2+ is a heavy metal, it is not necessarily an appropriate inducer when aiming at large-scale culture aimed at biofuel production.
  • Cyanobacteria have a system that receives various light and controls gene expression in order to efficiently perform photosynthesis.
  • Kehoe et al. Discloses an expression control system using RcaE (sensor histidine kinase) that accepts gene expression with red and green light of Fremyella diplosiphon (Patent Document 1).
  • RcaE sensor histidine kinase
  • Patent Document 3 Reported a sensor protein CcaS (sensor histidine kinase) that accepts green light in 2008.
  • CcaS undergoes autophosphorylation by receiving green light, and transfers a phosphate group to CcaR (response regulator). It has been suggested that such phosphorylated CcaR can acquire DNA binding ability and promote the expression of a gene downstream of the cpcG2 promoter.
  • the inventors aim to construct a bioprocess using a synthetic cyanobacteria that can be controlled using a synthetic biological approach.
  • a gene expression control system is important. It is important to control gene expression when producing substances using cyanobacteria. And it is thought that ON / OFF of gene expression can be controlled at an arbitrary time by using an optical sensor protein.
  • Naturally functioning optical sensors control gene expression at a level necessary for bacterial survival, and are often unsuitable for mass production of biofuels. Moreover, even in Synechocystis sp. PCC6803, whose biochemical analysis such as metabolism is advancing as a research object, few excellent inducible promoters that control gene expression have been found.
  • Non-Patent Document 3 evaluated that GFPuv was linked as a reporter gene downstream of the cpcG2 promoter and found that the fluorescence intensity was not necessarily high. Furthermore, the gene expression level downstream of the cpcG2 promoter is extremely low compared to the P trc promoter, and in addition, CcaS is activated by green light, but not by the red light required for efficient growth. It is reported to be activated.
  • the present invention has been made to solve at least a part of the above-described problems, and can be realized as the following aspects or application examples.
  • One aspect of the method for controlling expression of a target gene according to the present invention is a method for expressing a target gene using cyanobacteria as a host, which is downstream of a base sequence that functions as a promoter, This includes inserting an expression control sequence of 12 to 50 bases upstream of the start codon of the target gene.
  • the expression of the target gene in cyanobacteria can be enhanced and / or suppressed, and the expression level of the target gene can be regulated and controlled in a wide range. Thereby, production of a useful substance (target substance) by cyanobacteria can be controlled.
  • the promoter may be a light-responsive promoter.
  • the photoresponsive promoter may have a sequence having 90% or more homology with the base sequence represented by the first to 237th positions of SEQ ID NO: 1.
  • the expression regulatory sequence is 90% of the base sequence of the 5 ′ untranslated region upstream from the start codon of phycocyanin ⁇ subunit (cpcB). You may have the above homology.
  • the expression control sequence may be a base sequence having 90% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the cyanobacteria may further hold a DNA sequence containing an exogenous gene and co-express the exogenous gene and the target gene.
  • the exogenous gene may be ccaR.
  • the cyanobacteria are Synechocystis sp. PCC6803, Nostoc punctiforme PCC 73102, Synechococcus sp. It may be at least one selected from the group consisting of BP-1 and Synechococcus sp. JA-3-3Ab.
  • the expression level of the target gene arranged on the downstream side can be greatly controlled.
  • an expression regulatory sequence of 12 to 50 bases downstream of the base sequence functioning as a promoter and upstream of the start codon of the target gene. Contains inserted sequences and is used for cyanobacteria.
  • the expression of the target gene in cyanobacteria can be enhanced and / or suppressed, and the expression level of the target gene can be regulated and controlled in a wide range. Thereby, production of a useful substance (target substance) by cyanobacteria can be controlled.
  • the expression of the target gene in the cyanobacteria can be enhanced and / or suppressed, and the expression level of the target gene can be regulated and controlled in a wide range. Thereby, production of a useful substance (target substance) by the cyanobacteria can be controlled.
  • cyanobacteria having the ability to produce the target substance are cultured in a medium by irradiation with green light and red light to produce the target substance. And collecting the target substance, wherein the cyanobacteria retain the DNA sequence described in Application Example 10, and the expression of the target gene is regulated.
  • the production amount of the target substance by cyanobacteria can be controlled by regulating the expression of the target gene of cyanobacteria.
  • the cyanobacteria may further hold a DNA sequence containing an exogenous gene and co-express the exogenous gene and the target gene.
  • the exogenous gene may be ccaR.
  • expression of a target gene in cyanobacteria can be enhanced and / or suppressed, and gene expression in cyanobacteria can be easily controlled.
  • genes in cyanobacteria can be expressed with a very high expression level.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an expression vector according to an experimental example.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the improvement of the expression level by linking the 5 ′ untranslated regions of cpcB.
  • White indicates the fluorescence intensity when cultured under red light
  • gray indicates the fluorescence intensity when cultured under red light + green light.
  • Each value was normalized with the fluorescence intensity when P cpcG2 was cultured under red light + green light as 1.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the improvement of the expression level by additional expression of CcaR.
  • White indicates the fluorescence intensity when cultured under red light
  • gray indicates the fluorescence intensity when cultured under red light + green light.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining the expression level improvement by the combination of the 5 ′ untranslated region of cpcB and CcaR additional expression.
  • White indicates the fluorescence intensity when cultured under red light
  • gray indicates the fluorescence intensity when cultured under red light + green light.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining the influence of the expression level and the distance between the 5 ′ untranslated region of cpcB and the start codon.
  • FIG. 6 is a schematic diagram for explaining an expression vector according to an experimental example.
  • FIG. 7 is a schematic diagram for explaining light irradiation during culture according to an experimental example.
  • FIG. 8 is a diagram for explaining the expression level improvement by the combination of the 5 ′ untranslated region of cpcB and CcaR additional expression.
  • White indicates the fluorescence intensity when cultured under red light, and gray indicates the fluorescence intensity when cultured under red light + green light.
  • the left side of the graph represents the result of the transformant with the vector shown in FIG. 6D, and the right side of the transformant with the vector shown in FIG. 6E.
  • the method for controlling expression of a target gene of the present embodiment is a method of expressing a target gene using cyanobacteria as a host, which is downstream of a base sequence that functions as a promoter, Inserting an expression control sequence upstream of the initiation codon of the gene.
  • Cyanobacteria are prokaryotes capable of photosynthesis and constitute a part of the eubacterial domain.
  • the method for controlling the expression of a target gene of this embodiment controls the expression of the target gene using cyanobacteria as a host.
  • cyanobacteria Synechocystis sp. PCC6803, Nostoc punctiforme PCC 73102, Synechococcus sp. NKBG15041c, Synechococcus sp. It is preferable that at least one selected. Moreover, it is more preferable that the cyanobacteria used as the host in this embodiment is Synechocystis sp. PCC6803 and / or Nostoc punctiforme PCC 73102.
  • Cyanobacteria have various genes and various promoters that regulate their expression.
  • such promoters include photoresponsive promoters.
  • Examples of the light-responsive promoter possessed by cyanobacteria include P cpcG2 and P lsiR .
  • a promoter may be indicated by adding “P” to a symbol representing a gene.
  • the host cyanobacteria are transformed by an expression vector described later.
  • the target gene in the present embodiment refers to a gene encoding a protein useful for efficiently producing a target substance by the cyanobacteria of the present embodiment.
  • the target gene is not particularly limited, and may be an endogenous gene of cyanobacteria serving as a host, or a gene introduced externally (exogenous) by transformation with a plasmid or the like.
  • the target gene has a start codon.
  • the protein encoded by the target gene is not particularly limited, and for example, an enzyme, an antibody, a lysis protein, a cell aggregation-related protein, and the like can be used.
  • the target gene may be one or more of the genes of cyanobacteria serving as the host.
  • the target gene may be an exogenous gene, or both the endogenous and exogenous genes may be used as the target gene.
  • target genes include adhE, which encodes an enzyme required for ethanol production, Acyl-ACP Reductase, which encodes a hydrocarbon synthesis-related enzyme, and Aldehyde Decarbonylase, holin, endolysin, which encodes a lytic protein, and cells.
  • adhE which encodes an enzyme required for ethanol production
  • Acyl-ACP Reductase which encodes a hydrocarbon synthesis-related enzyme
  • Aldehyde Decarbonylase holin
  • endolysin which encodes a lytic protein
  • examples include Antigen43, AIDA-I, tibA and the like encoding aggregation-related proteins.
  • exogenous is a specific gene sequence that has been introduced into an organism by molecular biological techniques and is used to distinguish it from that present in the genomic DNA of a wild-type cell or organism. . In a wild-type cell or organism, regardless of whether or not it exists in the genome, even if a sequence present in the genome is introduced by molecular biological techniques, it is regarded as an exogenous gene. Also with respect to genes, the term “endogenous” refers to gene sequences present in genomic DNA that can be found in a given wild type cell or organism.
  • Promoter A promoter is a region of DNA involved in a transcription initiation reaction, and refers to a region to which RNA polymerase or a transcription factor binds.
  • the promoter in the control method of the present embodiment can be appropriately selected according to a predetermined target gene.
  • a base sequence that functions as a promoter for a predetermined target gene may be referred to as a promoter even if a specific name is not given.
  • the promoter may be an endogenous promoter that is endogenous to the host cyanobacteria, or may be a promoter introduced from the outside (exogenous).
  • the number of promoters is not particularly limited, and may be the same as or different from the number of target genes.
  • the promoter examples include a light-responsive promoter and a promoter capable of inducing the expression of a target gene arranged downstream thereof by stress such as high temperature, low temperature, and salt.
  • a light-responsive promoter is more preferable from the viewpoint that an endogenous promoter of cyanobacteria can be used.
  • an exogenous photoresponsive promoter may be introduced into the host.
  • promoters that can be used in the control method of the present embodiment include P cpcG2 .
  • the promoter is P cpcG2 (the first to 237th base sequence of SEQ ID NO: 1) and 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably It is more preferable to use a base sequence having a homology of 98% or more from the viewpoint of green induction. If such a promoter is selected, expression of a target gene in cyanobacteria can be controlled using light that is not important for photosynthesis.
  • homology refers to sequence identity or similarity between two DNAs.
  • “Homology” is determined by comparing two sequences that are optimally aligned over the region of the sequence to be compared.
  • the DNA to be compared may have an addition or a deletion (for example, a gap) in the optimal alignment of the two sequences.
  • Such homology can be calculated, for example, by creating an alignment using the ClustalW algorithm (Nucleic Acid Res., 22 (22): 4673-4680 (1994)) using Vector NTI.
  • the homology is measured using sequence analysis software, specifically, analysis tools provided by Vector NTI, GENETYX, and public databases, etc.
  • the public databases are also generally used by those skilled in the art. Is possible.
  • Expression control sequence is inserted downstream of the base sequence functioning as the promoter described above and upstream of the start codon of the target gene.
  • the expression regulatory sequence has a base sequence with a length of 12 to 50 bases.
  • the length of the expression control sequence is more preferably from 13 to 40 bases, more preferably from 14 to 35 bases, further preferably from 15 to 30 bases, particularly preferably from 18 to 25 bases.
  • the expression level of the target gene can be regulated and controlled in a wide range in the control method of the present embodiment. That is, for example, when the expression level of the target gene increases because the expression regulatory sequence has a base sequence having a length of 12 bases or more and 50 bases or less, the range of the expression level of the target gene with respect to the operating amount of the promoter Can be bigger. In addition, for example, when the expression level of the target gene decreases due to the expression regulatory sequence having a base sequence having a length of 12 bases to 50 bases, the range of the expression level of the target gene with respect to the operating amount of the promoter is increased. Can be small. Thereby, for example, the production amount of a useful substance (target substance) by the host cyanobacteria can be controlled.
  • target substance target substance
  • the expression regulatory sequence can be inserted downstream of the base sequence functioning as the promoter described above and upstream of the start codon of the target gene according to a standard method in the art.
  • the expression regulatory sequence may be a specific DNA sequence.
  • the expression control sequence can be the base sequence of the 5 'untranslated region upstream of the start codon of a specific gene.
  • the expression level of the target gene can be increased by using the expression regulatory sequence as the base sequence of the 5 'untranslated region of a specific gene.
  • Such a gene is arbitrary as long as the host cyanobacteria can survive by introduction, and examples thereof include cpcB and psbAI.
  • the expression level of the target gene may be increased.
  • examples of such a gene include cpcB, psbAI, and the like.
  • a base sequence having a homology of at least% can be used as an expression regulatory sequence.
  • the expression level of the target gene can be increased.
  • the strains of cyanobacteria from which the expression regulatory sequence is derived include Synechocystis sp. PCC6803, Synechococcus sp. NKBG15041c, Synechococcus sp.
  • it is at least one selected from the group consisting of 3Ab, Nostococsp. PCC 7120, and Synechococcus sp. CC9311, more preferably Synechococcus sp. NKBG15041c, Synechococcus sp. PCC7002, Synechococcus sp. JA-3- 3Ab, Synechococcus sp. CC9311, particularly preferably Synechococcus sp. BGBG15041c.
  • Table 1 shows the base sequence of about 20 bases in the 5 'untranslated region upstream from the start codon of cpcB of the main strains exemplified above.
  • 20 bases in the 5 'untranslated region upstream from the start codon of Synechococcus sp. BGBG15041c are SEQ ID NO: 2.
  • 20 bases in the 5 'untranslated region upstream from the start codon of Synechococcus sp. PCC7002 are represented by SEQ ID NO: 32 (TATAAGTAGGAGATAAAAAC).
  • the distance (spacer) from the start codon of the target gene to the consensus may be preferably shorter in the group.
  • the consensus is AGGAGA.
  • Synechococcus sp. NKBG15041c is selected.
  • an exogenous gene in addition to inserting the above-mentioned expression regulatory sequence, an exogenous gene may be co-expressed. When the exogenous gene is co-expressed, the expression level of the target gene may be increased.
  • the exogenous gene to be coexpressed is arbitrary as long as the host cyanobacteria can survive by introduction, and examples thereof include ccaR and ccaS.
  • the selection of the exogenous gene to be co-expressed can be based on, for example, the technical idea of enhancing factors necessary for transcription from the promoter and the transcription amount.
  • the exogenous genes to be co-expressed may be introduced into the host by the same expression vector, or may be introduced into the host by separate expression vectors. Any method can control the expression level of the target gene, but it is preferable to introduce the plasmid into the host using the same expression vector because the plasmid can be introduced stably in a stable manner.
  • Synechocystis sp. CcaR may be introduced.
  • the method for controlling expression of a target gene of the present embodiment may have the following configuration in addition to inserting the above-described expression regulatory sequence.
  • the genetic engineering technique used in the control method of this embodiment is, for example, J. Sambrook, E .; , F.A. , Frisch, T. , Maniatis, Molecular Cloning 2nd Edition (Molecular Cloning 2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Issue (Cold Spring Harbor Laboratory Press), 1989, and D.C. , M.M. , Glover, DNA Cloning, published by IRL, 1985, and the like.
  • the method for controlling the expression of a target gene of the present embodiment may include constructing an expression vector that uses cyanobacteria as a host.
  • An expression vector refers to DNA that carries a gene to host cyanobacteria, in other words, vector DNA that can express the gene in a host cell.
  • the vector DNA is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and is appropriately selected depending on the type of host and intended use.
  • the vector DNA may be a vector DNA obtained by extracting naturally occurring DNA or a vector DNA in which a part of DNA other than a part necessary for replication is missing. Examples of typical vector DNA include plasmid, bacteriophage and virus-derived vector DNA.
  • vectors used in the present embodiment include pKT230, pBBR122, and the like.
  • an appropriate restriction enzyme can be used, and steps such as PCR, inverse PCR, cloning, phosphorylation, dephosphorylation, double-strand treatment, ligation, and transformation of Escherichia coli are appropriately performed. Can be included.
  • the method for controlling expression of a target gene of the present embodiment may include transforming cyanobacteria serving as a host using the above-described expression vector. Transformation can be performed according to a conventional method such as electroporation.
  • the method for controlling expression of the target gene of the present embodiment may include culturing cyanobacteria (the transformant) serving as a host.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as cyanobacteria can survive, and are appropriately selected according to the cyanobacteria. There is no restriction
  • the culture conditions are not particularly limited, and can be in accordance with known conditions.
  • the method for controlling expression of a target gene of the present embodiment may include activating a promoter to induce expression of the target gene.
  • a promoter for example, medium temperature, medium concentration, composition may be changed or light may be irradiated during culture.
  • a photoresponsive promoter when used as the promoter, it may be irradiated with light in a wavelength range according to the characteristics, or may be irradiated with light in a plurality of different wavelength ranges. Good.
  • the expression regulatory sequence is inserted downstream of the base sequence that functions as a promoter and upstream of the start codon of the target gene.
  • the expression of the target gene can be easily controlled.
  • the target gene can be expressed with a very high expression level.
  • P cpcG2 which is a photoresponsive promoter, is selected, expression of a target gene in cyanobacteria can be controlled using light that is not important for photosynthesis.
  • DNA sequence The specific DNA sequence from the promoter to the expression control sequence, which is located upstream of the start codon of the target gene, is the sequence represented by the 1st to 237th (underlined) sequences below (SEQ ID NO: 1) Is mentioned.
  • the DNA sequence of the present embodiment has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more with the sequence represented by the first to 237th positions of SEQ ID NO: 1. It is a sequence having sex. In particular, the 105th to 126th sequences of SEQ ID NO: 1 and the 238th to 257th sequences are important.
  • the DNA sequence of this embodiment is more preferably a sequence having homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more with the sequence represented by the 105th to 126th positions of SEQ ID NO: 1. . Further, a sequence having a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more with the sequence represented by the 238th to 257th is more preferable.
  • the expression level of the target gene arranged on the downstream side can be greatly increased.
  • the expression vector of the present embodiment is an expression vector constructed as described in the section “1.6.1. Expression vector”. Specifically, such an expression vector includes a sequence downstream of a base sequence functioning as a promoter and having an expression regulatory sequence of 12 to 50 bases inserted upstream of the start codon of the target gene. Used for cyanobacteria.
  • the expression level of the target gene can be regulated and controlled in a wide range. Thereby, production of a useful substance (target substance) by cyanobacteria can be controlled.
  • the promoter, target gene, expression regulatory sequence, exogenous gene, etc. in the expression vector are as described in “1. Control method of target gene expression”, and any of these methods can be applied.
  • Cyanobacteria The cyanobacteria according to this embodiment is a cyanobacteria described in the section “1.1. Cyanobacteria”, which is downstream of the base sequence that functions as a promoter and upstream of the start codon of the target gene. On the side, a sequence having the above-described expression regulatory sequence inserted therein is retained.
  • Such a cyanobacteria can regulate and control the expression level of the target gene in a wide range. Thereby, production of a useful substance (target substance) by cyanobacteria can be controlled.
  • the promoter, target gene, expression regulatory sequence, exogenous gene, etc. are as described in “1. Control method of target gene expression”, and any of these methods can be applied. Yes.
  • cyanobacteria having the ability to produce a target substance are cultured in a medium by irradiation with green light and red light to produce the target substance, This includes collecting the target substance.
  • target substances produced by the production method of the present embodiment include biofuel-related compounds (hydrogen, ethanol, cellulose, 2,3 butanediol, isobutyraldehyde, alkanes, alkenes, fatty acids, triglycerides, etc.), bioplastics ( Polyhydroxybutyric acid, etc.), enzymes (glucose dehydrogenase, luciferase, etc.), foreign protein products (cell aggregation-related proteins, lysis-related proteins, etc.), amino acids, nucleosides, nucleotides, vitamins and the like.
  • the target substance may be a protein or the like generated by expression of the target gene, or a substance generated by a reaction catalyzed by a protein (enzyme or the like) generated by expression of the target gene.
  • the cyanobacteria, light, culture, exogenous gene, etc. in the production method of the present embodiment are as described above. That is, the promoter, target gene, expression regulatory sequence, exogenous gene, etc. in the production method of the present embodiment are as described in “1. Method for controlling expression of target gene”, and any of these methods can be applied. sell.
  • the expression of the target gene of cyanobacteria may be enhanced. is there. Further, for example, in the production method of the present embodiment, if ccaR is selected as the exogenous gene, the expression of the target gene of cyanobacteria may be enhanced.
  • the collection of the target substance from the culture such as microbial cells and culture solution can be usually carried out by a combination of ion exchange resin method, precipitation method and other known methods.
  • the production amount of the target substance by cyanobacteria can be controlled by regulating the expression of the target gene of cyanobacteria.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an expression vector according to an experimental example.
  • a fragment containing ccaS and PcpcG2-GFPuv, ccaR and PcpcG2-GFPuv, and PcpcG2-GFPuv was amplified using the following primers, cloned into a broad host range vector pKT230 using restriction enzyme PstI, and pKT230-PcpcG2- GFPuv (FIG. 1 (a)), pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaS, and pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaR were constructed.
  • the PcpcG2-GFPuv fragment was introduced into pGEM-T-Easy (Promega) after PCR, and the plasmid was cleaved with PstI and cloned into pKT230, which is a broad host range vector.
  • Primer Fw (pKT230-PcpcG2-GFPuv): AACTGCAGTCCTCCACTAAAAGAATTCTCATAG (SEQ ID NO: 14) Primer Rev (pKT230-PcpcG2-GFPuv): ATATTAGCGAATCCCAGTAGAAAAACCTTAC (SEQ ID NO: 15) Primer Fw (pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaS): 5'-AACTGCAGTCCTCCACTAAAAGAATTCTCATAG-3 '(SEQ ID NO: 16) Primer Rev (pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaS): GTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO: 17) Primer Fw (pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaR): 5'-AACTGCAGATATTAGCGAATCCCAGTAGAAAAACC-3 '(SEQ ID NO: 18) Primer Rev (
  • PcpcG2-cpcB-GFPuv can be constructed by cutting or adding PcpcB sequences and constructing 5 'untranslated region and length (spacer) of cpcB between 6, 8 and 9 bases between different species.
  • Inverse PCR was carried out using the following primers phosphorylated 5 ′ in advance as a template, purified and ligated after inverse PCR, DH5 ⁇ was transformed, and the target plasmid was constructed.
  • Primer Fw (6 bases): 5'-ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG-3 '(SEQ ID NO: 22)
  • Primer Rev (6 bases): 5'-TTTTATCTCCTACTTATATGTAAAGTTAGTAATTAAAC-3 '(SEQ ID NO: 23)
  • Primer Fw (8 bases): 5'-AATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • Primer Rev (8 bases): 5'-ATTTTTATCTCCTACTTATATGTAAAGTTAGTAATTAAAC-3 '(SEQ ID NO: 25)
  • Primer Fw (9 bases): 5′-AAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG-3 ′ (SEQ ID NO: 26)
  • Primer Rev (9 bases): 5'-ATTTTTATCTCCTACTTATATGTAAAGTTAGTAATTAAAC-3 '(SEQ ID NO: 27)
  • Table 2 The sequence of the plasmid obtained in this
  • Synechocystis sp. PCC6803 was transformed by electroporation using the plasmid vector constructed in ⁇ 1> to ⁇ 7>.
  • transformation for example, using a red LED substrate made by Panasonic, which contains a red color around 660 nm, was cultured for about a week using a BG11 solid medium having the composition shown below under light irradiation.
  • transformants were selected using 50 ⁇ g / mL streptomycin.
  • the obtained colonies were inoculated in BG11 (composition is shown below) containing 25 ⁇ g / mL streptomycin and statically cultured for 1 week under red light.
  • shaking culture was performed using BR-42FL manufactured by TAITEC or the like until the OD730 reached a value of about 0.5 to 1 under red irradiation.
  • ⁇ BG11 solid medium > NaNO 3 18mM K 2 HPO 4 ⁇ 3H 2 O 30mg / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 75mg / L CaCl 2 ⁇ 2H 2 O 36mg / L Citric acid 6mg / L Ferric ammonium citrate 6mg / L Na 2 EDTA 1mg / L Na 2 CO 3 20mg / L Vitamin B 12 0.01mg / L Trace mix astro 1mL 1 M TES-KOH (pH7.4) 5 mL Sodium thiosulfate 3g / L Agar 15g / L Make up to 1 liter with distilled water
  • the composition of Trace mix astro used at this time is as follows. H 3 BO 4 286mg MnCl 2 ⁇ 4H 2 O 181mg ZnSO4 ⁇ 7H 2 O 22.2mg Na 2 MgO 4 ⁇ 2H 2 O 39mg CuSO 4 ⁇ 5H 2 O 7.9mg Co (NO 3 ) 2 ⁇ 6H 2 O 4.94mg Make up to 100 mL with distilled water
  • ⁇ BG11 liquid medium > NaNO 3 18mM K 2 HPO 4 ⁇ 3H 2 O 30mg / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 75mg / L CaCl 2 ⁇ 2H 2 O 36mg / L Citric acid 6mg / L Ferric ammonium citrate 6mg / L Na 2 EDTA 1mg / L Na 2 CO 3 20mg / L Vitamin B 12 0.01mg / L Trace mix astro 1mL 1 M TES-KOH (pH7.4) 20 mL Make up to 1 liter with distilled water
  • the obtained transformant was cultured under red light irradiation or green light irradiation using, for example, a 3 in 1 LED lighting unit manufactured by Nippon Medical Chemical Co., Ltd., which contains light at around 525 nm. In this case, when green light was irradiated, red light was simultaneously irradiated.
  • gfpmut3b is a GFP mutant, similar to the above-described GFPuv, and GFPuv is specialized for excitation by UV light, and gfpmut3b is one that has enhanced the fluorescence intensity of GFP.
  • a flow cytometer was used, so gfpmut3b was used to facilitate excitation with a blue light laser.
  • the nucleotide sequences of GFPuv and gfpmut3b are shown in SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34, respectively.
  • each transformant was inoculated into 50 mL of BG11 (100 mL Erlenmeyer flask) and cultured under red light until OD730 was close to 0.5.
  • green light (center wavelength: 520 nm) was irradiated from below and red light (center wavelength: 660 nm) was irradiated from above, and culture was performed.
  • the cells were washed with a phosphate buffer.
  • the washed cells were diluted to 10 5 to 10 6 cells / mL, and fluorescence of 10,000 cells was measured with a BD Accuri TM C6 flow cytometer (NJ, US, manufactured by Becton Dickinson & Company).
  • a blue light laser was used, and an FL1 filter (533 ⁇ 15 nm) was used.
  • the green light sensor is derived from Synechocystis sp. PCC6803 and is a two-component control system composed of two types of proteins, CcaS and CcaR.
  • CcaS accepts green light and is autophosphorylated.
  • CcaR receives a phosphate group from self-phosphorylated CcaS and becomes active. The active CcaR acquires DNA binding ability, binds upstream of cpcG2, and promotes CpcG2 expression.
  • ⁇ CcaS is activated by green light and inactivated by red light.
  • red is important for photosynthesis
  • red and green were irradiated together to evaluate the expression level of GFP.
  • higher expression of GFP was confirmed as compared with that under red irradiation.
  • the expression level was insufficient. Since the red light is important light for photosynthesis, the inventors need to irradiate both the red light and the green light, and the induction by the green light becomes relatively small. It is thought that the gene expression was insufficient.
  • GFPuv (SEQ ID NO: 33) was linked as a reporter gene downstream of the cpcG2 promoter (P cpcG2 ), introduced into a broad host range vector, and Synechocystis sp. PCC6803 was transformed.
  • the 5 ′ untranslated region of cpcB highly expressed in cyanobacteria was linked to the same promoter (P cpcG2 -cpcB).
  • the 5 'untranslated region around the start codon is important for protein translation.
  • the 5 ′ untranslated region was selected from the start codon of the cpcB gene in the Synechococcus sp. The sequence was subjected to evaluation.
  • GFPuv was similarly ligated downstream of P cpcG2 -cpcB and introduced into a broad host range vector.
  • CcaR a transcription factor
  • FIG. 3 When FIG. 3 was seen, it turned out that the expression level of GFPuv increased by introduce
  • FIG. 6 (e) is constructed such that CcaR is expressed together with the target gene (gfpmut3b) in the promoter (P cpcG2 ) of the green light sensor system. ) And a plasmid vector (constructed so that CcaR is expressed by a natural promoter). That is, in the transformant of Synechocystis sp. PCC6803 by the plasmid vector shown in FIG. 6 (e), CcaR expression is constant.
  • FIG. 6 (d) the expression level of gfpmut3b in the case where CcaR was not introduced was examined, and these results are also shown in FIG.
  • the present invention includes substantially the same configuration (for example, a configuration having the same function, method and result, or a configuration having the same purpose and effect) as the configuration described in the embodiment.
  • the invention includes a configuration in which a non-essential part of the configuration described in the embodiment is replaced.
  • the present invention includes a configuration that exhibits the same operational effects as the configuration described in the embodiment or a configuration that can achieve the same object.
  • the invention includes a configuration in which a known technique is added to the configuration described in the embodiment.
  • Cyanobacteria have an excellent ability to produce biofuel-related compounds in addition to their ability to fix carbonic acid, and are therefore attractive hosts for producing biofuel-related compounds.
  • the present invention provides a light-regulated promoter that can be highly expressed in Synechocystis sp. PCC6803, and can be expected to be used for various biofuel production. It can also be applied to recombinant protein production using cyanobacteria.
  • a green light inducible promoter capable of high expression has been developed, and the strength of this promoter is extremely high.
  • the expression level is predicted to be easily adjustable by the intensity of green light, it can be expected to be a useful tool for biofuel production.
  • SEQ ID NO: 1 is the sequence of the cpcG2 promoter and expression regulatory sequence.
  • SEQ ID NO: 12 is the sequence of the forward primer.
  • SEQ ID NO: 13 is the reverse primer sequence.
  • SEQ ID NO: 14 is the sequence of the pKT230-PcpcG2-GFPuv forward primer.
  • SEQ ID NO: 15 is the sequence of the pKT230-PcpcG2-GFPuv reverse primer.
  • SEQ ID NO: 16 is the sequence of pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaS forward primer.
  • Sequence number 17 is the arrangement
  • SEQ ID NO: 18 is the sequence of the pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaR forward primer.
  • SEQ ID NO: 19 is the sequence of the pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaR reverse primer.
  • SEQ ID NO: 20 is the sequence of DNA1.
  • SEQ ID NO: 21 is the sequence of DNA2.
  • SEQ ID NO: 22 is the sequence of the 6nt forward primer.
  • SEQ ID NO: 23 is the sequence of the 6 nt reverse primer.
  • SEQ ID NO: 24 is the sequence of the 8nt forward primer.
  • SEQ ID NO: 25 is the sequence of the 8 nt reverse primer.
  • SEQ ID NO: 26 is the sequence of the 9nt forward primer.
  • SEQ ID NO: 27 is the sequence of the 9nt reverse primer.
  • SEQ ID NO: 28 is a 7 nt sequence.
  • SEQ ID NO: 29 is the 6nt mutant sequence.
  • SEQ ID NO: 30 is an 8 nt mutant sequence.
  • SEQ ID NO: 31 is the 9 nt mutant sequence.
  • SEQ ID NO: 33 is the sequence of GFPuv (mutant).
  • SEQ ID NO: 34 is the sequence of gfpmut3b (mutant).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化および／または抑制することのできる制御方法を提供すること。　本発明に係る目的遺伝子の発現の制御方法の一態様は、シアノバクテリアを宿主として目的遺伝子を発現する方法であって、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、前記目的遺伝子の開始コドンの上流側に、１２塩基以上５０塩基以下の発現調節配列を挿入することを含む。

Description

遺伝子発現の制御方法、目的物質の製造方法、および、それらに用いるＤＮＡ配列、発現ベクター、並びに、シアノバクテリア
　本発明は、遺伝子発現の制御方法、目的物質の製造方法、および、それらに用いるＤＮＡ配列、発現ベクター、並びに、シアノバクテリアに関する。
　近年、生物により、持続的なエネルギー供給を目指したバイオ燃料関連化合物等の有用な物質生産を行うシステムが注目されている。シアノバクテリア等の光合成を行う原核生物は、このようなシステムにおける宿主生物として有用と目され、研究が盛んである。特に、シアノバクテリアのうち、Synechocystis sp. PCC6803なる株は、早期（５番目）にゲノムが解析された生物であり、その生化学的解析が進んでいるため、多くの研究者がバイオ燃料生産用の宿主として注目している。
　宿主として大腸菌を利用する場合には、プロモーターとして、ラクトースで誘導可能なlacプロモーター（Plac）、アラビノース誘導型のaraBADプロモーター等が用いられる。一方、Synechocystis sp. PCC6803等のシアノバクテリアを宿主として利用する場合には、プロモーターの選択の幅は制限される。例えば、Huangらによって、通常大腸菌で使われるプロモーターである、Placプロモーター、Ptetプロモーター、PRプロモーターは、シアノバクテリアであるSynechocystis sp. PCC6803中では機能しないことが示されている（非特許文献１）。
　また同文献においてHuangらは、誘導プロモーターPtrcプロモーターがシアノバクテリア中で機能することを見出しているが、誘導剤非存在下での発現レベルが高いことを問題として挙げている。さらにシアノバクテリアは、ラクトース、IPTG（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）、アラビノース等の糖または糖の誘導体をほとんど取り込まないため、非誘導時と比べた際の誘導時の発現レベルも低いことが示唆されている。
　Synechosystis sp. PCC6803中で機能するプロモーターとしては、Ni2+によって誘導可能なプロモーターが報告されている（非特許文献２）。しかし、Ni2+は重金属であるため、バイオ燃料生産を指向した大規模な培養を目標とする場合には、必ずしも適切な誘導剤とは言えない。
　シアノバクテリアは光合成を効率的に行うために、様々な光を受容し、遺伝子発現制御を行うシステムを有している。KehoeらはFremyella diplosiphonが有する赤色と緑色の光で遺伝子発現を受容するRcaE（センサーヒスチジンキナーゼ）を利用した発現制御システムを開示している（特許文献１）。また、Synechocystis sp. PCC6803中でも、多くの光センサータンパク質が報告されており、Hiroseらによって２００８年に緑色光を受容するセンサータンパク質CcaS（センサーヒスチジンキナーゼ）が報告されている（非特許文献３）。同文献では、CcaSは、緑色光を受容することで自己リン酸化し、CcaR（レスポンスレギュレーター）にリン酸基を転移させる。そして、係るリン酸化されたCcaRがDNA結合能を獲得し、cpcG2のプロモーターの下流の遺伝子の発現を促すことができる旨示唆されている。
　この出願は、平成２３年度、独立行政法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業「藻類・水圏微生物の機能解明と制御によるバイオエネルギー創成のための基盤技術の創出」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願である。
米国特許出願公開第２０１０／００９３０５１明細書
Huang et al. Nucleic Acids Res. 2010, 38(8) 2577-2593 Lopez-Maury et al. Mol. Microbiol. 2002, 43(1) 247-256 Hirose et al. PNAS 2008, 105(28) 9528-9533
　発明者らは、合成生物学的アプローチを用い、光制御可能な合成藍藻（シアノバクテリア）を用いたバイオプロセスの構築を目指している。効率的なバイオ燃料生産を実現するためには、遺伝子の発現制御系が重要である。シアノバクテリアを利用して物質生産を行う上では、遺伝子発現制御を行うことは重要である。そして、光センサータンパク質を利用することで、任意の時間に遺伝子の発現のON/OFFをコントロールすることが出来ると考えられる。
　天然で機能している光センサーは、バクテリアの生存に必要なレベルで遺伝子発現をコントロールしているため、バイオ燃料を大量生産するには不向きな場合が多い。また、研究対象として、その代謝等の生化学的解析が進んでいるSynechocystis sp. PCC6803においてでさえ、遺伝子発現を制御する誘導型のプロモーターとして優れているものはほとんど見出されていない。
　一方、シアノバクテリアの遺伝子発現を行うためには、効率的な光合成に必要な赤色光以外の光を利用することが望ましいと考えられる。上記特許文献１のKehoeらによって開示されているRcaEは、赤色光を受容することで下流の遺伝子の発現を活性下する。またKehoeらが用いているF. diplosiphonでは、他の緑色光センシング系が知られているものの、詳細はわかっておらず、異種株では使用することが難しいと考えられる。
　発明者らは、上記非特許文献３に関し、cpcG2のプロモーターの下流にGFPuvをレポーター遺伝子として連結し評価したところ、その蛍光強度は、必ずしも高くないとの知見を得た。さらに、cpcG2のプロモーターの下流の遺伝子発現量は、Ptrcのプロモーターと比較して極端に低く、その上、CcaSは緑色光で活性化されるものの、効率的な増殖に必要な赤色光では不活化されることが報告されている。
　本発明の幾つかの態様に係る目的の１つは、シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化および／または抑制することのできる制御方法を提供することにある。また、本発明の幾つかの態様に係る目的の１つは、シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化または抑制することのできる発現ベクターを提供することにある。さらに、本発明の幾つかの態様に係る目的の１つは、そのようなＤＮＡ配列を保持するシアノバクテリア、および該シアノバクテリアによる目的物質の製造方法を提供することにある。
　本発明は上述の課題の少なくとも一部を解決するために為されたものであり、以下の態様または適用例として実現することができる。
　［適用例１］本発明に係る目的遺伝子の発現の制御方法の一態様は、シアノバクテリアを宿主として目的遺伝子を発現する方法であって、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、前記目的遺伝子の開始コドンの上流側に、１２塩基以上５０塩基以下の発現調節配列を挿入することを含む。
　本適用例の制御方法によれば、シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化および／または抑制することができ、目的遺伝子の発現量を広いレンジで調節・制御することができる。また、これにより、シアノバクテリアによる有用物質（目的物質）の生産を制御することができる。
　［適用例２］適用例１において、前記プロモーターは、光応答性プロモーターであってもよい。
　［適用例３］適用例２において、前記光応答性プロモーターが、配列番号１の１番目～２３７番目で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する配列を有してもよい。
　［適用例４］適用例１～適用例３のいずれか１例において、前記発現調節配列は、フィコシアニンβサブユニット（ｃｐｃＢ）の開始コドンから上流の５'非翻訳領域の塩基配列と、９０％以上の相同性を有してもよい。
　［適用例５］適用例４において、前記発現調節配列は、配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列であってもよい。
　［適用例６］適用例４または適用例５において、前記シアノバクテリアが、さらに、外因性遺伝子を含むＤＮＡ配列を保持し、前記外因性遺伝子、および、前記目的遺伝子を共発現させてもよい。
　［適用例７］適用例６において、前記外因性遺伝子は、ｃｃａＲであってもよい。
　［適用例８］適用例１～適用例７のいずれか１例において、前記シアノバクテリアは、Synechocystis sp. PCC6803、Nostoc punctiforme PCC 73102、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermosynechococcus elongatus BP-1、およびSynechococcus sp. JA-3-3Abからなる群より選択される少なくとも１種であってもよい。
　［適用例９］本発明に係るＤＮＡ配列の一態様は、配列番号１で表される。
　本適用例のＤＮＡ配列によれば、下流側に配置された目的遺伝子の発現量を大幅に制御することができる。
　［適用例１０］本発明に係る発現ベクターの一態様は、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、目的遺伝子の開始コドンの上流側に、１２塩基以上５０塩基以下の発現調節配列が挿入された配列を含み、シアノバクテリアに用いられる。
　本適用例の発現ベクターによれば、シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化および／または抑制することができ、目的遺伝子の発現量を広いレンジで調節・制御することができる。また、これにより、シアノバクテリアによる有用物質（目的物質）の生産を制御することができる。
　［適用例１１］本発明に係るシアノバクテリアの一態様は、適用例１０に記載の発現ベクターで形質転換されたものである。
　本適用例のシアノバクテリアによれば、シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化および／または抑制することができ、目的遺伝子の発現量を広いレンジで調節・制御することができる。また、これにより、当該シアノバクテリアによる有用物質（目的物質）の生産を制御することができる。
　［適用例１２］本発明に係る目的物質の製造方法の一態様は、目的物質を産生する能力を有するシアノバクテリアを培地中に、緑色光および赤色光の照射により培養し、当該目的物質を生成させ、当該目的物質を採取することを含む、当該目的物質の製造方法であって、前記シアノバクテリアが、適用例１０に記載のＤＮＡ配列を保持し、前記目的遺伝子の発現が調節される。
　本適用例の製造方法によれば、シアノバクテリアの目的遺伝子の発現が調節されることにより、シアノバクテリアによる目的物質の生産量を制御することができる。
　［適用例１３］適用例１２において、前記シアノバクテリアが、さらに、外因性遺伝子を含むＤＮＡ配列を保持し、前記外因性遺伝子、および、前記目的遺伝子を共発現させてもよい。
　［適用例１４］適用例１３において、前記外因性遺伝子は、ｃｃａＲであってもよい。
　本発明によれば、シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化および／または抑制することができ、シアノバクテリア中の遺伝子の発現を容易に制御することができる。また、本発明によれば、シアノバクテリア中の遺伝子を非常に高い発現量で発現させることができる。さらに、本発明によれば、光合成に重要でない光を用いて、シアノバクテリア中の遺伝子発現を制御することができる。
図１は、実験例に係る発現ベクターを説明する模式図である。 図２は、cpcBの5'非翻訳領域を連結したことによる発現量向上を説明する図である。白は赤色光下で培養した際の蛍光強度、グレーは赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を示す。それぞれの値は、PcpcG2を赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を１として標準化した。 図３は、CcaR追加発現による発現量向上を説明する図である。白は赤色光下で培養した際の蛍光強度、グレーは赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を示す。それぞれの値は、PcpcG2を赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を１とし標準化した。 図４は、cpcBの5'非翻訳領域とCcaR追加発現の組み合わせによる発現量向上を説明する図である。白は赤色光下で培養した際の蛍光強度、グレーは赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を示す。それぞれの値は、PcpcG2を赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を１とし標準化した。 図５は、cpcBの5'非翻訳領域と開始コドンの間の距離と発現量の影響を説明する図である。白は赤色光下で培養した際の蛍光強度、グレーは赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を示す。それぞれの値は、PcpcG2を赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を１とし標準化した。 図６は、実験例に係る発現ベクターを説明する模式図である。 図７は、実験例に係る培養の際の光の照射を説明する概略図である。 図８は、cpcBの5'非翻訳領域とCcaR追加発現の組み合わせによる発現量向上を説明する図である。白は赤色光下で培養した際の蛍光強度、グレーは赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を示す。グラフ中の左側は、図６の（ｄ）に示すベクターによる形質転換体、右側は、図６の（ｅ）に示すベクターによる形質転換体の結果を表す。
　以下に本発明のいくつかの実施形態について説明する。以下に説明する実施形態は、本発明を例示的に説明するものであって、本発明は以下の実施形態になんら限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形形態も含む。なお以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要素であるとは限らない。
　１．目的遺伝子の発現の制御方法
　本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、シアノバクテリアを宿主として目的遺伝子を発現する方法であって、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、前記目的遺伝子の開始コドンの上流側に、発現調節配列を挿入することを含む。
　１．１．シアノバクテリア
　シアノバクテリアは、光合成を行うことができる原核生物であり、真正細菌ドメインの一門を構成する。本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、シアノバクテリアを宿主として該目的遺伝子の発現を制御する。
　本実施形態において宿主として使用するシアノバクテリアとしては、Synechocystis sp. PCC6803、Nostoc punctiforme PCC 73102、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermosynechococcus elongatusBP-1、Synechococcus sp. JA-3-3Ab、Chroococcacae、Stigonematacae、Mastigocladacae、Oscillatroriacae、Mastigocladus、Phormidium、Symploca、Aphanocapsa、Fisherella、等を例示することができる。
　これらのシアノバクテリアのうち、Synechocystis sp. PCC6803、Nostoc punctiforme PCC 73102、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermosynechococcus elongatus BP-1、およびSynechococcus sp.JA-3-3Abからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。また、本実施形態で宿主として使用するシアノバクテリアは、Synechocystis sp. PCC6803、および／またはNostoc punctiforme PCC 73102であることがより好ましい。
　シアノバクテリアは、各種の遺伝子と、その発現を調節する各種のプロモーターを有している。シアノバクテリアにおいては、そのようなプロモーターには、光応答性プロモーターが含まれる。シアノバクテリアが有する光応答性プロモーターとしては、例えば、ＰｃｐｃＧ２、ＰｌｓｉＲ、等がある。なお、本明細書では、プロモーターを、「Ｐ」に遺伝子を表す記号の添字を付して表記することがある。
　本実施形態の制御方法では、宿主のシアノバクテリアは、後述する発現ベクターによって形質転換されたものである。
　１．２．目的遺伝子
　本実施形態における目的遺伝子とは、本実施形態のシアノバクテリアによって目的物質を効率的に生産するために有用なタンパク質をコードする遺伝子のことをいう。目的遺伝子は、特に限定されず、宿主となるシアノバクテリアの内在性遺伝子であってもよいし、プラスミド等による形質転換で外部から導入された（外因性）遺伝子であってもよい。なお目的遺伝子には、開始コドンが存在する。
　また、目的遺伝子がコードするタンパク質についても、特に限定されず、例えば、酵素、抗体、溶菌タンパク質、細胞凝集関連タンパク質等とすることができる。
　本実施形態の制御方法では、目的遺伝子は、宿主となるシアノバクテリアの遺伝子の１種であってもよいし、複数種であってもよい。また、目的遺伝子は、外因性の遺伝子であってもよいし、内在性および外因性の遺伝子の両者を目的遺伝子としてもよい。
　目的遺伝子の具体的な例としては、エタノールの生産に必要な酵素をコードするadhE、炭化水素合成関連酵素をコードするAcyl-ACP Reductase、およびAldehyde Decarbonylase、溶菌タンパク質をコードするホーリン、エンドライシン、細胞凝集関連タンパク質をコードするAntigen43、AIDA-I、tibA等を挙げることができる。
　本明細書において、用語「外因性」とは、分子生物学的技法によって生物に導入した特定の遺伝子配列であり、野生型の細胞または生物のゲノムＤＮＡ中に存在するものと区別するために用いる。野生型の細胞または生物において、ゲノム中に存在するか否かを問わず、ゲノム中に存在する配列を、分子生物学的技法により導入した場合においても、外因性遺伝子とする。また遺伝子に関して、用語「内在性」は、所定の野生型の細胞または生物中に見つかり得る、ゲノムＤＮＡ中に存在する遺伝子配列をいう。
　１．３．プロモーター
　プロモーターとは、転写開始反応に関与するＤＮＡの領域であって、ＲＮＡポリメラーゼや転写因子が結合する領域のことをいう。本実施形態の制御方法におけるプロモーターとしては、所定の目的遺伝子に応じて適宜選択することができる。また、本明細書では、所定の目的遺伝子に対して、プロモーターとして機能する塩基配列であれば、特定の名称が与えられていなくてもプロモーターと称することがある。
　プロモーターは、宿主となるシアノバクテリアに内在する、内在性プロモーターであってもよいし、外部から導入される（外因性）プロモーターであってもよい。また、形質転換されたシアノバクテリアにおいて、プロモーターの数は特に制限されず、目的遺伝子の数と同じであっても異なっていてもよい。
　プロモーターとしては、例えば、光応答性プロモーターや、高温、低温、塩等のストレスによって、その下流側に配置された目的遺伝子の発現を誘導し得るプロモーターが挙げられる。これらのうち、本実施形態の制御方法では、シアノバクテリアの内在性のプロモーターを利用できる観点から、光応答性プロモーターがより好ましい。なお、光応答性プロモーターを用いる場合には、外因性の光応答性プロモーターを宿主に導入してもよい。
　本実施形態の制御方法に使用しうるプロモーターの具体例としては、ＰｃｐｃＧ２等が挙げられる。
　本実施形態の制御方法においては、プロモーターとしては、ＰｃｐｃＧ２（配列番号１の１番目から２３７番目の塩基配列）と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列を使用することが、緑色誘導の観点から、より好ましい。このようなプロモーターを選択すれば、光合成に重要でない光を用いて、シアノバクテリア中の目的遺伝子発現を制御することができる。
　ここで「相同性」とは、２つのＤＮＡ間の配列の同一性または類似性をいう。「相同性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡは、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような相同性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ　ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３－４６８０（１９９４）を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。なお、相同性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ　ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベース等についても当業者には一般的に利用可能である。
　１．４．発現調節配列
　発現調節配列は、上述のプロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、上述の目的遺伝子の開始コドンの上流側に、挿入される。
　発現調節配列は、１２塩基以上５０塩基以下の長さの塩基配列を有する。発現調節配列の長さは、１３塩基以上４０塩基以下がより好ましく、１４塩基以上３５塩基以下がさらに好ましく、１５塩基以上３０塩基以下がさらに好ましく、１８塩基以上２５塩基以下が特に好ましい。
　発現調節配列が、１２塩基以上５０塩基以下の長さの塩基配列を有することにより、本実施形態の制御方法において、目的遺伝子の発現量を広いレンジで調節・制御することができる。すなわち、例えば、発現調節配列が、１２塩基以上５０塩基以下の長さの塩基配列を有することにより目的遺伝子の発現量が増大する場合には、プロモーターの作動量に対する目的遺伝子の発現量の幅を大きくすることができる。また、例えば、発現調節配列が、１２塩基以上５０塩基以下の長さの塩基配列を有することにより目的遺伝子の発現量が減少する場合には、プロモーターの作動量に対する目的遺伝子の発現量の幅を小さくすることができる。これにより、例えば、宿主のシアノバクテリアによる有用物質（目的物質）の生産量を制御することができる。
　発現調節配列は、上述のプロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、上述の目的遺伝子の開始コドンの上流側に、当分野の定法により、挿入されることができる。
　発現調節配列は、特定のＤＮＡ配列としてもよい。例えば、発現調節配列は、特定の遺伝子の開始コドンの上流の５’非翻訳領域の塩基配列とすることができる。発現調節配列を特定の遺伝子の５’非翻訳領域の塩基配列とすることにより、目的遺伝子の発現量を増大させることができる場合がある。このような遺伝子としては、導入することによって宿主のシアノバクテリアが生存できる限り任意であるが、例えば、ｃｐｃＢ、ｐｓｂＡＩ等が挙げられる。
　また、この場合、前記特定の遺伝子として、シアノバクテリアにおける発現量の大きい遺伝子を選ぶと、目的遺伝子の発現量を増大させることができる場合がある。そのような遺伝子としては、ｃｐｃＢ、ｐｓｂＡＩ等が挙げられ、その開始コドンから上流の５’非翻訳領域の塩基配列、または、当該塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を発現調節配列とすることができる。さらに、発現調節配列として、フィコシアニンβサブユニットをコードするｃｐｃＢの開始コドンから上流の５’非翻訳領域を選択すると目的遺伝子の発現量を増大させることができる。さらにこの場合、当該発現調節配列が由来するシアノバクテリアの株としては、Synechocystis sp. PCC6803、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermosynechococcus elongatus BP-1、Synechococcus sp. JA-3-3Ab、Nostoc sp. PCC 7120、およびSynechococcus sp. CC9311からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、より好ましくは、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus sp. JA-3-3Ab、Synechococcus sp. CC9311、特に好ましくは、Synechococcus sp. NKBG15041c、である。
　表１に、上記例示した株の主なもののｃｐｃＢの開始コドンから上流の５’非翻訳領域の２０塩基程度の塩基配列を示す。なお、Synechococcus sp. NKBG15041cの開始コドンから上流の５’非翻訳領域の２０塩基は、表１中、配列番号２である。また、Synechococcus sp. PCC7002の開始コドンから上流の５’非翻訳領域の２０塩基は、配列番号３２（TATAAGTAGGAGATAAAAAC）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１をみると、８種の株において、ｃｐｃＢの開始コドンから上流の５’非翻訳領域の２０塩基程度の塩基配列の中央付近に共通する配列（以下これをコンセンサスという場合がある。）が存在している。上記８種の株に限らず、このようなコンセンサスが存在する株の群がある場合で、特定の株に由来する発現調節配列をその中から選択する場合には、目的遺伝子の開始コドンからコンセンサスまでの距離（塩基数）を指標としてもよい。また、本明細書では、目的遺伝子の開始コドンからコンセンサスまでの配列を「スペーサー」と称する場合がある。
　この場合には、目的遺伝子の開始コドンからコンセンサスまでの距離（スペーサー）は、当該群においてより短いことが好ましい場合がある。例えば、表１の上段より７種の株を１群とした場合にはそのコンセンサスはAGGAGAであり、当該７種の株からこのような指標によって特定の株を選択する場合には、Synechococcus sp. NKBG15041cが選択される。
　１．５．外因性遺伝子の共発現
　本実施形態の目的遺伝子の発現制御方法において、上述の発現調節配列を挿入することに加えて、外因性遺伝子を共発現させてもよい。外因性遺伝子を共発現させると、目的遺伝子の発現量を増大させることができる場合がある。
　共発現させる外因性遺伝子としては、導入することによって宿主のシアノバクテリアが生存できる限り任意であるが、例えば、ｃｃａＲ、ｃｃａＳ等が挙げられる。また、共発現させる外因性遺伝子の選択にあたっては、例えば、プロモーターからの転写に必要な因子、転写量を増強するという技術思想に基づくことができる。
　共発現させる外因性遺伝子は、同一の発現ベクターによって宿主に導入されてもよいし、それぞれ別個の発現ベクターによって宿主に導入されてもよい。いずれの方法であっても目的遺伝子の発現量を制御することができるが、同一の発現ベクターによって宿主に導入する場合は、プラスミドを安定的に導入しやすいため、好ましい。
　また、例えば、Synechocystis sp. PCC6803とNostoc punctiforme PCC 73102は、CcaSおよびCcaR（PcpcG2の制御を行う遺伝子）を有しているが、そのような遺伝子を有さない他のシアノバクテリアに対してCcaSおよびCcaRを導入するようにしてもよい。
　１．６．その他の構成
　本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、上述の発現調節配列を挿入すること以外に、以下の構成を有してもよい。
　本実施形態の制御方法等で用いられる遺伝子工学的技術は、例えば、Ｊ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．，Ｆ．，Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎ ｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年、及びＤ．，Ｍ．，Ｇｌｏｖｅｒ著、ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ＩＲＬ発行、１９８５年等に記載されている通常の方法に準じて行うことができる。
　１．６．１．発現ベクター
　本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、シアノバクテリアを宿主として用いられる発現ベクターを構築することを含んでもよい。発現ベクターは、宿主シアノバクテリアに遺伝子を運搬するＤＮＡ、言い換えればベクターＤＮＡであって、宿主細胞中で当該遺伝子を発現させ得るＤＮＡをいう。ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡでもよい。代表的なベクターＤＮＡとしては例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを挙げることができる。本実施形態で使用するベクターの具体例としては、例えば、ｐＫＴ２３０、ｐＢＢＲ１２２等が挙げられる。また、プラスミドベクターの構築にあたっては、適宜の制限酵素を用いることができ、ＰＣＲ、インバースＰＣＲ、クローニング、リン酸化、脱リン酸化、二本鎖処理、ライゲーション、大腸菌等の形質転換等の工程を適宜含むことができる。
　１．６．２．形質転換体
　本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、上述の発現ベクターを用いて宿主となるシアノバクテリアを形質転換することを含んでもよい。形質転換は、エレクトロポレーション等の定法にしたがって行うことができる。
　１．６．３．培養
　本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、宿主となるシアノバクテリア（上記形質転換体）を培養することを含んでもよい。培養の条件としては、シアノバクテリアが生存できる条件であれば特に制限されず、シアノバクテリアに合わせて適宜選択される。培地についても特に制限はなく、固形培地、液体培地等を使用することができる。培養の条件についても特に制限されず、公知の条件にしたがうことができる。
　１．６．４．誘導
　本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、プロモーターを活性化させ、目的遺伝子の発現を誘導することを含んでもよい。プロモーターの種類に応じて、例えば、培養の際、培地温度、培地濃度、組成を変化させたり、光を照射したりすることを含んでもよい。また、本実施形態において、プロモーターとして、光応答性プロモーターを使用する場合には、その特性に応じた波長域の光を照射してもよく、複数の互いに異なる波長域の光を照射してもよい。また、本実施形態において、プロモーターとして、光応答性プロモーターを使用する場合には、誘導との関連を問わず、例えばシアノバクテリアの増殖に適した波長域の光を照射してもよい。
　１．７．作用効果
　本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法によれば、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、目的遺伝子の開始コドンの上流側に、発現調節配列が挿入されることにより、目的遺伝子の発現を容易に制御することができる。また、目的遺伝子を非常に高い発現量で発現させることができる。さらに、光応答性プロモーターである、ＰｃｐｃＧ２を選択すれば、光合成に重要でない光を用いて、シアノバクテリア中の目的遺伝子発現を制御することができる。
　２．ＤＮＡ配列
　目的遺伝子の開始コドンの上流に配置される、プロモーターから発現調節配列までの具体的なＤＮＡ配列としては、下記配列（配列番号１）の１番目～２３７番目（下線）で表される配列が挙げられる。
AGCCCATTGTGCTTTTCTCTATCAACCTCAGCTTACCTGAAGGGGTGAACAGGTCTGGGTTAATTCATGTTGCGAAATGTAACAGTTTTAGTCGCATCAGCTAACTTTCCGATTTCTTTACGATTTTCTCCCCCTTTTCTTCAATTTTACTTTGTTAGGATCGCATTTTTAATGCCAACACATACCAGTTATTGGCTGGACATTAAACAACTTTTAAGTTTAATTACTAACTTTACATATAAGTAGGAGATAAAAAT
　また、係るＤＮＡ配列は、目的遺伝子の発現に支障がない限り、塩基の変更、付加、または欠失が存在してもよい。したがって本実施形態のＤＮＡ配列としては、配列番号１の１番目～２３７番目で表される配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有する配列である。また特に、配列番号１の１０５番目から１２６番目の配列、２３８番目から２５７番目が重要である。したがって本実施形態のＤＮＡ配列としては、配列番号１の１０５番目～１２６番目で表される配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する配列がさらに好ましい。また、２３８番目～２５７番目で表される配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する配列がさらに好ましい。
　このようなＤＮＡ配列によれば、下流側に配置された目的遺伝子の発現量を大幅に増大させることができる。
　３．発現ベクター
　本実施形態の発現ベクターは、「１．６．１．発現ベクター」の項で述べたように構築された発現ベクターである。係る発現ベクターは、具体的には、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、目的遺伝子の開始コドンの上流側に、１２塩基以上５０塩基以下の発現調節配列が挿入された配列を含み、シアノバクテリアに用いられる。
　このような発現ベクターによってシアノバクテリアを形質転換すれば、目的遺伝子の発現量を広いレンジで調節・制御することができる。また、これにより、シアノバクテリアによる有用物質（目的物質）の生産を制御することができる。
　なお、発現ベクターにおける、プロモーター、目的遺伝子、発現調節配列、外因性遺伝子等は、「１．目的遺伝子の発現の制御方法」で説明したとおりであり、それらいずれの手法も適用しうる。
　４．シアノバクテリア
　本実施形態に係るシアノバクテリアは、「１．１．シアノバクテリア」の項で述べたシアノバクテリアであって、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、目的遺伝子の開始コドンの上流側に、上述の発現調節配列が挿入された配列を保持したものである。
　このようなシアノバクテリアによれば、目的遺伝子の発現量を広いレンジで調節・制御することができる。また、これにより、シアノバクテリアによる有用物質（目的物質）の生産を制御することができる。
　なお、本実施形態に係るシアノバクテリアにおける、プロモーター、目的遺伝子、発現調節配列、外因性遺伝子等は、「１．目的遺伝子の発現の制御方法」で説明したとおりであり、それらいずれの手法も適用しうる。
　５．目的物質の製造方法
　本実施形態の目的物質の製造方法は、目的物質を産生する能力を有するシアノバクテリアを培地中に、緑色光および赤色光の照射により培養し、当該目的物質を生成させ、当該目的物質を採取することを含む。
　本実施形態の製造方法によって製造される目的物質としては、バイオ燃料に関連する化合物（水素、エタノール、セルロース、２，３ブタンジオール、イソブチルアルデヒド、アルカン、アルケン、脂肪酸、トリグリセリド等）、バイオプラスチック（ポリヒドロキシ酪酸等）、酵素（グルコース脱水素酵素、ルシフェラーゼ等）、外来タンパク質産物（細胞凝集関連タンパク質、溶菌関連タンパク質等）、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ビタミン等が挙げられる。また、目的物質は、目的遺伝子の発現によって生じるタンパク質等であってもよいし、目的遺伝子の発現によって生じるタンパク質（酵素等）が触媒する反応等によって生じる物質であってもよい。
　本実施形態の製造方法における、シアノバクテリア、光、培養、外因性遺伝子等については、既に述べた通りである。すなわち、本実施形態の製造方法における、プロモーター、目的遺伝子、発現調節配列、外因性遺伝子等は、「１．目的遺伝子の発現の制御方法」で説明したとおりであり、それらいずれの手法も適用しうる。例えば、本実施形態の製造方法において、シアノバクテリアに外因性遺伝子を含むＤＮＡ配列を導入し、外因性遺伝子および目的遺伝子を共発現させれば、シアノバクテリアの目的遺伝子の発現が増強される場合がある。また、例えば、本実施形態の製造方法において、当該外因性遺伝子としてｃｃａＲを選択すれば、シアノバクテリアの目的遺伝子の発現が増強される場合がある。
　菌体や培養液等の培養物からの目的物質の採取は、通常には、イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施することができる。
　本実施形態の製造方法によれば、シアノバクテリアの目的遺伝子の発現が調節されることにより、シアノバクテリアによる目的物質の生産量を制御することができる。
　６．実験例
　以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実験例に何ら限定されるものではない。
　６．１．プロトコル
　以下に本実験例のシアノバクテリア（形質転換体）の作成、培養および評価に関するプロトコルを記載する。図１は、実験例に係る発現ベクターを説明する模式図である。
＜１＞
　Synechocystis sp. PCC6803から
5'-TTTGAGCTCCTAAGCTCGAGGCAAATGG-3'（配列番号１０）、
5'-TTTAAGCTTCTAGTTTTTCCCTTGGCAC-3'（配列番号１１）
を用いて、ccaS-cpcG2-ccaRをpUC18ベクターにクローニングした。その後、SacIとHindIIIを用いて、cpcG2をGFPuvに置換し、pUC18-PccaR-ccaR-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaSを構築した。ccaSとccaRのプロモーターはSynechocystis sp. PCC6803由来のものである。
＜２＞
　転写終結因子を導入するため、下記プライマーを用いて増幅し、PstIとH indIIIを用いてpTrc99Aに導入した。
Primer Fw: 5'-GACCTGCAGGCGAAAAAACCCCGCCGAAGCGGGGTTTTTTGCGCTAAGCTCGAGGCAAATGGTTATAG-3'（配列番号１２）
Primer Rev: 5'-GCCAAGCTTCTAGTTTTTCCCTTGGCACAAAG-3'（配列番号１３）
＜３＞
　ccaSとPcpcG2-GFPuv、ccaRとPcpcG2-GFPuv、およびPcpcG2-GFPuvを含む断片を下記のプライマーを用いて増幅し、制限酵素PstIを用いて広宿主域ベクターであるpKT230にクローニングし、pKT230-PcpcG2-GFPuv（図１（ａ））, pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaS, pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaRを構築した。PcpcG2-GFPuvの断片は、P CR後pGEM-T-Easy (Promega)に導入し、同プラスミドをPstIで切断後、広宿主域ベクターであるpKT230にクローニングした。
＜４＞
　Primer Fw (pKT230-PcpcG2-GFPuv)：AACTGCAGTCCTCCACTAAAAGAATTCTCATAG（配列番号１４）
　Primer Rev (pKT230-PcpcG2-GFPuv)：ATATTAGCGAATCCCAGTAGAAAAACCTTAC（配列番号１５）
　Primer Fw (pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaS): 5'-AACTGCAGTCCTCCACTAAAAGAATTCTCATAG-3'（配列番号１６）
　Primer Rev (pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaS)： GTAAAACGACGGCCAGT（配列番号１７）
　Primer Fw (pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaR)：5'-AACTGCAGATATTAGCGAATCCCAGTAGAAAAACC-3'（配列番号１８）
　Primer Rev (pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaR)：CAGGAAACAGCTATGAC（配列番号１９）
＜５＞
　PcpcG2-GFPuvのGFPの開始コドンの上流に合成したcpcBの5'側の非翻訳領域20塩基を以下の合成DNAと制限酵素NdeIを用いて導入した(PcpcG2-cpcB-GFPuv)（図１（ｂ））。合成DNAをリン酸化した後に、熱処理および徐冷によって二本鎖を形成させた。NdeIで切断したpKT230-PcpcG2-GFPを脱リン酸化した後に、二本鎖処理した合成DNAと混合し、ライゲーション、およびDH5αの形質転換を行い、目的のプラスミドを構築した。
　合成DNA1: 5'-TATAAGTAGGAGATAAAAA-3'（配列番号２０）
　合成DNA2：5'-TATTTTTATCTCCTACTTA-3'（配列番号２１）
＜６＞
　pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaRのGFPuvの開始コドンの上流に合成したPcpcBの5'側の非翻訳領域を上記の合成DNAを用いて導入した（図１（ｃ））。
＜７＞
　PcpcBの配列を削るまたは付加し、異なる種間にあるcpcBの5'非翻訳領域と長さ（スペーサー）を 6、8、9塩基に合わせたものを構築するために、PcpcG2-cpcB-GFPuvを鋳型とし、前もって5'をリン酸化した下記のプライマーを用いてインバースPCRを行い、インバースPCR後に精製、ライゲーションし、DH5αを形質転換し、目的のプラスミドを構築した。
Primer Fw (6塩基): 5'-ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG-3'（配列番号２２）
Primer Rev (6塩基):5'- TTTTTATCTCCTACTTATATGTAAAGTTAGTAATTAAAC-3'（配列番号２３）
Primer Fw (8塩基): 5'-AATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG-3'（配列番号２４）
Primer Rev (8塩基):5'- ATTTTTATCTCCTACTTATATGTAAAGTTAGTAATTAAAC-3'（配列番号２５）
Primer Fw (9塩基):5'- AAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG-3'（配列番号２６）
Pri mer Rev (9塩基): 5'- ATTTTTATCTCCTACTTATATGTAAAGTTAGTAATTAAAC-3'（配列番号２７）
　この工程で得られたプラスミドの配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜８＞
　＜１＞～＜７＞で構築したプラスミドベクターを用いて、Synechocystis sp. PCC6803をエレクトロポレーション法により形質転換した。形質転換後、660nm付近の赤色を含む、例えばPanasonic社製赤色LED基盤を用いて、光照射下で1週間程度、下記に示す組成のBG11固形培地を用いて培養を行った。この際に、50μg/mLのストレプトマイシンを用いて形質転換体を選択してある。得られたコロニーは25μg/mLのストレプトマイシンを含むBG11（組成は下記に示す）中に播種し、赤色光下で１週間静置培養した。その後、同様に赤色照射下でOD730が0.5～1程度の値になるまでTAITEC社製のBR-42FL等を用いて振盪培養を行った。
＜BG11固形培地＞
NaNO3　　　　　18mM
K2HPO4・3H2O　　30mg/L
MgSO4・7H2O　　　75mg/L
CaCl2・2H2O　　　36mg/L
Citric acid　　　6mg/L
Ferric ammonium citrate　　6mg/L
Na2EDTA　　　1mg/L
Na2CO3　　　　20mg/L
Vitamin B12　　　0.01mg/L
Trace mix astro　　1mL
1 M TES-KOH(pH7.4)　　5 mL
チオ硫酸ナトリウム　　3g/L
寒天　　15g/L
蒸留水で1Lにメスアップ
　オートクレーブで滅菌後、滅菌シャーレに注ぎ、固形培地とした。この際に用いているTrace mix astroの組成は下記の通りである。
H3BO4　　　286mg
MnCl2・4H2O　　181mg
ZnSO4・7H2O　22.2mg
Na2MgO4・2H2O　39mg
CuSO4・5H2O　7.9mg
Co(NO3)2・6H2O　4.94mg
蒸留水で100mLにメスアップ
＜BG11液体培地＞
NaNO3　18mM
K2HPO4・3H2O　30mg/L
MgSO4・7H2O　75mg/L
CaCl2・2H2O　36mg/L
Citric acid　6mg/L
Ferric ammonium citrate　6mg/L
Na2EDTA　1mg/L
Na2CO3　　20mg/L
Vitamin B12　0.01mg/L
Trace mix astro　1mL
1 M TES-KOH(pH7.4)　20 mL
蒸留水で1Lにメスアップ
＜９＞
　得られた形質転換体を、赤色照射下または、525nm付近の光を含む、例えば、日本医化器械製作所製の3in1LED照明ユニットを用い、緑色の光照射下で培養を行った。この際に緑色光照射する場合には赤色光を同時に照射した。
＜１０＞
　緑色光下で培養後、1 mLの培養液を13000g、5分の遠心分離により集菌した。集菌した菌体をBG11またはPBSで洗浄した後に、プレートリーダー(Varioskan Flash Multimode Reader, Thermo scientific) を用いて、蛍光強度を測定した。この際の励起光は395nm、蛍光は509nmとした。
＜１１＞
　また、(d) PcpcG2-cpcB（発現調節配列）-gfpmut3b, および(e) PcpcG2-cpcB（発現調節配列）-gfpmut3b-ccaR（非翻訳領域を56bp含む）のベクター（図６（ｄ）、図６（ｅ）参照）を構築し、Synechocystis sp. PCC 6803にエレクトロポレーションによって導入した。
　ここで、gfpmut3bは、上述のGFPuvと同様に、GFPの変異体であり、UV光による励起に特化したものがGFPuvであり、GFPの蛍光強度を高めたものがgfpmut3bである。また、この実験ではフローサイトメーターを利用するため、青色光レーザーで励起しやすくするためにgfpmut3bを用いた。GFPuv及びgfpmut3bの塩基配列は、それぞれ、配列番号３３及び配列番号３４に示した。
　導入後、BG11培地で赤色光下で培養した。培養後、50 mLのBG11 （100mLの三角フラスコ）にそれぞれの形質転換体について植菌を行い、赤色光下でOD730が0.5付近になるまで培養した。
　その後、図７に示すように、緑色光（中心波長５２０ｎｍ）を下方から、赤色光（中心波長６６０ｎｍ）を上方から照射し、培養を行った。
　適宜サンプリングし、遠心分離後、菌体をリン酸バッファーで洗浄した。洗浄後の菌体を１０５～１０６cells/mLに希釈後、BD AccuriTM C6 フローサイトメーター（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー製、NJ、US）にて10000cellsの蛍光を測定した。測定時には青色光レーザーを用い、FL1フィルター（533±15 nm）を用いた。
　６．２．実験例の説明
　緑色光センサーは、Synechocystis sp. PCC6803由来のものであり、CcaSとCcaRの二種のタンパク質によって構成される二成分制御系である。CcaSは緑色光を受容し、自己リン酸化する。CcaRは自己リン酸化されたCcaSからリン酸基を受け取り、活性型となる。活性型CcaRはDNA結合能を獲得し、cpcG2の上流に結合し、CpcG2の発現を促す。
　CcaSは緑色光で活性化し、赤色光で不活化する。しかし赤色は光合成に重要であるため、赤色と緑色を供に照射し、GFPの発現量を評価した。その結果、赤色照射下と比較し、高いGFPの発現が確認された。しかしその発現量は不十分であった。発明者らは、赤色光が光合成に重要な光であることから、赤色光と緑色光の両方を照射する必要があり、相対的に緑色光による誘導が僅かなものになったことによって、このような不十分な遺伝子発現となったものと考えている。
　プロモーターからの発現を評価するために、cpcG2のプロモーター(PcpcG2)の下流にレポーター遺伝子としてGFPuv（配列番号３３）を連結し、広宿主域ベクターに導入し、Synechocystis sp. PCC6803を形質転換した。
　また、同プロモーターに対し、シアノバクテリア中で高発現しているcpcBの5'非翻訳領域を連結した(PcpcG2-cpcB)。開始コドン周辺の5'非翻訳領域はタンパク質の翻訳に重要である。この際の5'非翻訳領域はSynechococcus sp. NKBG15041c株中のcpcB遺伝子の開始コドンから上流20bpの配列(TATAAGTAGGAGATAAAAAC)（配列番号２）を選択し、末尾のＣをＴに変更した配列番号２８の配列を評価に供した。PcpcG2-cpcBの下流に同様にGFPuvを連結し、広宿主域ベクターに導入した。
　それぞれの形質転換体を赤色光下で培養した。CcaSは赤色光で不活化されるために、PcpcG2からの漏出発現を抑制できる。ある程度増殖したところで緑色光および赤色光の二色の光を同時に照射し、経時的にGFPuvの蛍光強度を測定した。
　24時間後の蛍光強度の測定結果を図２に示す。PcpcG２単独でのGFPuvの蛍光を１とした場合に、Pcpc G2-cpcBは15～25倍もの値を示し、その発現量は大幅に向上することが判明した。
　次に、転写量増強のために、転写因子であるCcaRをプラスミドベクターを用いてSynechocystis sp. PCC6803に導入し、先と同様に評価した(PcpcG2-cpcB+CcaR)。この評価結果を図３に示す。
　図３をみると、CcaRを導入することで、GFPuvの発現量が上昇したことがわかった。転写因子量を増強することで、転写量を上昇させられると考えられる。さらに、PcpcG2-cpcBを持つプラスミドベクターに対して、CcaRを導入したところ、その効果は相乗的であり、PcpcG2と比較して４０倍もの発現量向上をすることが判明した（図４）。
　更に、複数種のcpcBの5'非翻訳領域の配列を比較したところ、保存されているAGGAGAと開始コドンの距離（スペーサー）に違いが見られたため(表１、２参照)、長さの検討を試みたところ、７、８、９塩基（配列番号２６、２８、２９）の場合と比較し、６塩基（配列番号２７）の場合が一番高いことが判明した（図５）。
　更に、プラスミドベクター中のCcaRの導入位置による、GFP（変異体）の発現量の変化を確認した。すなわち、図４のPcpcG2-cpcB+CcaRは、図１（ｃ）に示すように、CcaRがPcpcG2の上流側に位置するプラスミドベクターによって形質転換されているが、これと比較するために、図６（ｅ）に示すように、CcaRがPcpcG2の下流側に位置するプラスミドベクターによって形質転換した場合について、gfpmut3b（変異体）（配列番号３４）の発現量の変化を調べた。図６（ｅ）に示すプラスミドベクターは、緑色光のセンサーシステムのプロモーター（PcpcG2）に、標的遺伝子（gfpmut3b）と一緒にCcaRが発現されるように構築されている点で、図１（ｃ）に示すプラスミドベクター（天然のプロモーターによってCcaRが発現されるように構築されている）と異なる。すなわち、図６（ｅ）に示すプラスミドベクターによるSynechocystis sp. PCC6803の形質転換体は、CcaRの発現が恒常的となっている。また、同時に図６（ｄ）に示すように、CcaRを導入しない場合のgfpmut3bの発現量を調べ、これらの結果を図８に併載した。
　図８をみると、緑色光および赤色光の照射で、CcaRがPcpcG2の下流側に導入された場合には、導入されない場合に比較してgfpmut3bの発現量が３倍程度向上することが判明した。さらに、赤色光の照射では、CcaRがPcpcG2の下流側に導入された場合には、導入されない場合に比較してgfpmut3bの発現量がほとんど増加しなかった。一方、CcaRがPcpcG2の上流側に位置するプラスミドベクターによって形質転換された場合（図４参照）には、赤色光の照射で、導入されない場合に比較してGFPuvの発現量が増加している。したがって、CcaRがPcpcG2の下流側に導入された場合には、赤色光の照射による目的遺伝子の発現量を抑えつつ、緑色光での発現量を向上できることが判明した。
　以上のように、本発明に係るプロモーターを用いることで、緑色を用いた有用物質生産コントロールまたは凝集・溶菌コントロール等を行うことができる可能性があることが判明した。
　本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
　シアノバクテリアは、炭酸固定能に加え、優れたバイオ燃料関連化合物生産能力を有しているため、バイオ燃料関連化合物生産を行ううえで魅力的な宿主である。本発明はSynechocystis sp. PCC6803中で高発現可能な光制御型のプロモーターを提供するものであり、様々なバイオ燃料生産を行うために利用されることが期待できる。また、シアノバクテリアを利用した組み換えタンパク質生産にも応用が期待できる。本発明では、高発現可能な緑色光誘導型のプロモーターを開発しており、本プロモーターの強度は極めて高い。また、その発現量は緑色光の強度で容易に調節可能と予測されることから、バイオ燃料生産を行ううえで、有用なツールになることが期待できる。
　配列番号１は、ｃｐｃＧ２プロモーターおよび発現調節配列の配列である。
　配列番号１２は、フォワードプライマーの配列である。
　配列番号１３は、リバースプライマーの配列である。
　配列番号１４は、pKT230-PcpcG2-GFPuvフォワードプライマーの配列である。
　配列番号１５は、pKT230-PcpcG2-GFPuvリバースプライマーの配列である。
　配列番号１６は、pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaSフォワードプライマーの配列である。
　配列番号１７は、pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaSリバースプライマーの配列である。
　配列番号１８は、pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaRフォワードプライマーの配列である。
　配列番号１９は、pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaRリバースプライマーの配列である。
　配列番号２０は、DNA1の配列である。
　配列番号２１は、DNA2の配列である。
　配列番号２２は、6ntフォワードプライマーの配列である。
　配列番号２３は、6ntリバースプライマーの配列である。
　配列番号２４は、8ntフォワードプライマーの配列である。
　配列番号２５は、8ntリバースプライマーの配列である。
　配列番号２６は、9ntフォワードプライマーの配列である。
　配列番号２７は、9ntリバースプライマーの配列である。
　配列番号２８は、7ntの配列である。
　配列番号２９は、6ntミュータントの配列である。
　配列番号３０は、8ntミュータントの配列である。
　配列番号３１は、9ntミュータントの配列である。
　配列番号３３は、GFPuv（ミュータント）の配列である。
　配列番号３４は、gfpmut3b（ミュータント）の配列である。

Claims (14)

  1. 　シアノバクテリアを宿主として目的遺伝子を発現する方法であって、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、前記目的遺伝子の開始コドンの上流側に、１２塩基以上５０塩基以下の発現調節配列を挿入することを含む、前記目的遺伝子の発現の制御方法。
  2. 　請求項１において、
    　前記プロモーターは、光応答性プロモーターである、制御方法。
  3. 　請求項２において、
    　前記光応答性プロモーターが、配列番号１の１番目～２３７番目で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する配列を有する、制御方法。
  4. 　請求項１～請求項３のいずれか１項において、
    　前記発現調節配列は、フィコシアニンβサブユニット（ｃｐｃＢ）の開始コドンから上流の５'非翻訳領域の塩基配列と、９０％以上の相同性を有する、制御方法。
  5. 　請求項４において、
    　前記発現調節配列は、配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列である、制御方法。
  6. 　請求項４または請求項５において、
    　前記シアノバクテリアが、さらに、外因性遺伝子を含むＤＮＡ配列を保持し、
    　前記外因性遺伝子、および、前記目的遺伝子を共発現させる、制御方法。
  7. 　請求項６において、
    　前記外因性遺伝子は、ｃｃａＲである、制御方法。
  8. 　請求項１～請求項７のいずれか１項において、
    　前記シアノバクテリアは、Synechocystis sp. PCC6803、Nostoc punctiforme PCC 73102、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermosynechococcus elongatus BP-1、およびSynechococcus sp. JA-3-3Abからなる群より選択される少なくとも１種である、制御方法。
  9. 　配列番号１で表される、ＤＮＡ配列。
  10. 　プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、目的遺伝子の開始コドンの上流側に、１２塩基以上５０塩基以下の発現調節配列が挿入された配列を含み、シアノバクテリアに用いられる、発現ベクター。
  11. 　請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換されたシアノバクテリア。
  12. 　目的物質を産生する能力を有するシアノバクテリアを培地中に、緑色光および赤色光の照射により培養し、当該目的物質を生成させ、当該目的物質を採取することを含む、当該目的物質の製造方法であって、
    　前記シアノバクテリアが、請求項１０に記載のＤＮＡ配列を保持し、
    　前記目的遺伝子の発現が調節される、製造方法。
  13. 　請求項１２において、
    　前記シアノバクテリアが、さらに、外因性遺伝子を含むＤＮＡ配列を保持し、
    　前記外因性遺伝子、および、前記目的遺伝子を共発現させる、製造方法。
  14. 　請求項１３において、
    　前記外因性遺伝子は、ｃｃａＲである、製造方法。
PCT/JP2014/064017 2013-05-31 2014-05-27 遺伝子発現の制御方法、目的物質の製造方法、および、それらに用いるｄｎａ配列、発現ベクター、並びに、シアノバクテリア WO2014192765A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015519881A JPWO2014192765A1 (ja) 2013-05-31 2014-05-27 遺伝子発現の制御方法、目的物質の製造方法、および、それらに用いるｄｎａ配列、発現ベクター、並びに、シアノバクテリア

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013115822 2013-05-31
JP2013-115822 2013-05-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014192765A1 true WO2014192765A1 (ja) 2014-12-04

Family

ID=51988793

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/064017 WO2014192765A1 (ja) 2013-05-31 2014-05-27 遺伝子発現の制御方法、目的物質の製造方法、および、それらに用いるｄｎａ配列、発現ベクター、並びに、シアノバクテリア

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2014192765A1 (ja)
WO (1) WO2014192765A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112469830A (zh) * 2018-03-02 2021-03-09 剑桥大学名誉校长和学者委员会 用于控制基因表达的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000516441A (ja) * 1995-12-06 2000-12-12 クイーンズ ユニバーシティー アット キングストン 光合成生物におけるタンパク質レベル増大用構築物および方法
JP2010538616A (ja) * 2007-09-11 2010-12-16 サファイア エナジー，インコーポレイティド 光合成生物による分子生成

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000516441A (ja) * 1995-12-06 2000-12-12 クイーンズ ユニバーシティー アット キングストン 光合成生物におけるタンパク質レベル増大用構築物および方法
JP2010538616A (ja) * 2007-09-11 2010-12-16 サファイア エナジー，インコーポレイティド 光合成生物による分子生成

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOICHI ABE ET AL., MICROBIAL BIOTECHNOLOGY, vol. 7, no. ISSUE., 12 December 2013 (2013-12-12), pages 177 - 183, Retrieved from the Internet <URL:http://onlinelibrary.wiley.com> *
YONGZHONG LU ET AL., ELECTRONIC JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 8, no. 1, 15 April 2005 (2005-04-15), Retrieved from the Internet <URL:http://ejb.ucv.cl/index.php/ejbiotechnology/article/view/v8nl-9/434> *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112469830A (zh) * 2018-03-02 2021-03-09 剑桥大学名誉校长和学者委员会 用于控制基因表达的方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2014192765A1 (ja) 2017-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6125493B2 (ja) 転写終結配列
Klähn et al. Alkane biosynthesis genes in cyanobacteria and their transcriptional organization
US10351880B2 (en) Drimenol synthases I
Diao et al. Genetic engineering of Crypthecodinium cohnii to increase growth and lipid accumulation
CA3104848A1 (en) Enzymes of luciferin biosynthesis and use thereof
JP6622220B2 (ja) ドリメノールシンターゼ及びドリメノールの製造方法
JP7222916B2 (ja) ドリメノール及びそれらの混合物の製造のためのセスキテルペンシンターゼ
WO2014192765A1 (ja) 遺伝子発現の制御方法、目的物質の製造方法、および、それらに用いるｄｎａ配列、発現ベクター、並びに、シアノバクテリア
CN107849586B (zh) 芳香化合物的生产
KR102358538B1 (ko) 유전자 총법을 이용한 미세조류의 교정 방법
CA3220078A1 (en) Prenyltransferase variants with increased thermostability
KR102211740B1 (ko) 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)의 신규 프로모터 HASP1와 이의 신호 펩타이드 및 이의 용도
KR101534221B1 (ko) (a) ｗａｂＧ 유전자가 불활성화 되어 있고 (b) ｂｕｄＲ 유전자가 과발현된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 균주
RU2668176C1 (ru) Микроорганизм с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма
EP3847252A1 (en) The gene therapy dna vector gdtt1.8nas12 and the method for obtaining thereof
JP2018143117A (ja) 核酸分子およびこれを用いたタンパク質の製造方法
JP2022554070A (ja) 高収量生産のための巨大ベクターおよび方法
JP5947470B2 (ja) 微生物の物質生産性を向上させる方法および該方法に用いるキット
KR101684489B1 (ko) 신규한 프로모터 및 이를 이용한 수소 생산 방법
WO2021081325A1 (en) Compositions, systems, and methods for high level expression of recombinant protein
JP2009045043A (ja) 組換えタンパク質発現用ベクター、組換え微生物、および組換えタンパク質の製造方法
Shang et al. Molecular cloning and characterization analysis of pyruvate phosphate dikinase gene from Dunaliella parva
Nies Transformation of the filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna Electroporation versus Natural Transformation

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14803704

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015519881

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14803704

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1