CN102656267B - 耐盐生物 - Google Patents

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Abstract

在此披露了转化的非维管耐盐光合生物、在进行这样的转化中有用的核苷酸和载体、以及通过这样的转化所产生的转化菌株。

Description

耐盐生物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年9月15日提交的美国临时申请号61/242,574的权益，出于所有目的将其全部内容通过引用结合在此。本申请还要求于2010年2月5日提交的美国临时申请号61/301,735的权益，出于所有目的将其全部内容通过引用结合在此。
通过引用进行的结合
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用结合在此，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被逐一地并且单独地指明通过引用结合在此。
发明背景
藻类是高度适应性的植物，它们能够在宽范围的条件下快速生长。作为光合生物，它们具有将太阳光转化成能量的能力，该能量可以用来合成多种生物分子以用作工业酶、治疗化合物以及蛋白质、营养品、商品、或燃料产物，等。
大多数藻类种类适合生长在水性环境中，并且易于使用光作为能源生长在液体培养基中。使用阳光进行光合作用，使藻类大规模地生长在室外环境中、在池塘或其他开放的或封闭的容器中的能力增强了它们用于生物生产、环境修复、以及碳固定的效用。
发明概述
在此提供了一种非维管光合生物，包括在SEQIDNO.115、SEQIDNO.116、SEQIDNO.122、SEQIDNO.201、SEQIDNO.129、SEQIDNO.202、SEQIDNO.206、SEQIDNO.133、SEQIDNO.198、SEQIDNO.200、SEQIDNO.204、SEQIDNO.203、SEQIDNO.135、SEQIDNO.134、SEQIDNO.166、SEQIDNO.162、SEQIDNO.169、SEQIDNO.168、SEQIDNO.170、SEQIDNO.175、SEQIDNO.127、SEQIDNO.230、SEQIDNO.231、SEQIDNO.233以及SEQIDNO.234的任何之一或与在任何前述序列具有至少95％序列同一性的序列中的至少一个突变；其中该至少一个突变包括一个或多个核苷酸添加、缺失、和/或置换；并且与不具有该至少一个突变的相同生物相比较，该生物在含有大约在75mM与275mM之间的氯化钠的水性环境中具有增加的生长速率。
该至少一个突变可以位于它可能导致一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的一个编码区中。该一个或多个突变还可以位于调节区中，如5’UTR区或3’UTR区。在一个实施方案中，该至少一个突变定位在一个启动子区域中。
在一个实施方案中，与不具有该至少一个突变的蛋白质相比较，由SEQIDNO.115、SEQIDNO.116、SEQIDNO.122、SEQIDNO.201、SEQIDNO.129、SEQIDNO.202、SEQIDNO.206、SEQIDNO.133、SEQIDNO.198、SEQIDNO.200、SEQIDNO.204、SEQIDNO.203、SEQIDNO.135、SEQIDNO.134、SEQIDNO.166、SEQIDNO.162、SEQIDNO.169、SEQIDNO.168、SEQIDNO.170、SEQIDNO.175、SEQIDNO.127、SEQIDNO.230、SEQIDNO.231、SEQIDNO.233以及SEQIDNO.234的任何之一编码的蛋白质或与由前述序列的任何之一编码的蛋白质具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白质的活性由于该至少一个突变的存在而被降低。该蛋白质的活性可以降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(即，失活)。
在其他实施方案中，具有该至少一个突变的生物具有比不具有该至少一个突变的生物高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少225％、至少250％、至少275％、至少300％、至少325％、至少350％、至少375％、至少400％、至少425％、至少450％、至少475％或至少500％的生长速率。
在另外的实施方案中，与不具有该至少一个突变的相同生物中的转录相比较，该至少一个突变的存在导致前述核苷酸序列的任何之一的转录速率降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(无可检出的转录本)。在其他实施方案中，与不具有该至少一个突变的相同生物中翻译相比较，该至少一个突变的存在导致由前述核苷酸序列的任何之一编码的蛋白质的翻译降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(无可检出的翻译物)。
另一个实施方案提供了包括至少一种RNAi试剂的一种基因修饰非维管光合生物，该至少一种RNAi试剂包括一种反义核苷酸序列，该反义核苷酸序列与从SEQIDNO.115、SEQIDNO.116、SEQIDNO.122、SEQIDNO.201、SEQIDNO.129、SEQIDNO.202、SEQIDNO.206、SEQIDNO.133、SEQIDNO.198、SEQIDNO.200、SEQIDNO.204、SEQIDNO.203、SEQIDNO.135、SEQIDNO.134、SEQIDNO.166、SEQIDNO.162、SEQIDNO.169、SEQIDNO.168、SEQIDNO.170、SEQIDNO.175、SEQIDNO.127、SEQIDNO.230、SEQIDNO.231、SEQIDNO.233以及SEQIDNO.234的任何之一或与前述序列的任何之一具有至少95％序列同一性的序列转录的mRNA互补；其中与未用该至少一种RNAi试剂修饰的生物相比较，该生物在含有大约在75mM与275mM之间的氯化钠的水性环境中具有增加的生长速率。在某些实施方案中，该至少一种RNAi试剂是一种微小RNA(miRNA)或一种小干扰RNA(siRNA)。
在一个实施方案中，与未用该至少一种RNAi试剂修饰的相同生物中的蛋白质相比较，由SEQIDNO.115、SEQIDNO.116、SEQIDNO.122、SEQIDNO.201、SEQIDNO.129、SEQIDNO.202、SEQIDNO.206、SEQIDNO.133、SEQIDNO.198、SEQIDNO.200、SEQIDNO.204、SEQIDNO.203、SEQIDNO.135、SEQIDNO.134、SEQIDNO.166、SEQIDNO.162、SEQIDNO.169、SEQIDNO.168、SEQIDNO.170、SEQIDNO.175、SEQIDNO.127、SEQIDNO.230、SEQIDNO.231、SEQIDNO.233以及SEQIDNO.234的任何之一编码的蛋白质或与由前述序列的任何之一编码的蛋白质具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白质的活性被降低。在某些实施方案中，该蛋白质的活性降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(即，失活)。
在另外的实施方案中，该生物的生长速率比未用该至少一种RNAi试剂修饰的相同生物高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少225％、至少250％、至少275％、至少300％、至少325％、至少350％、至少375％、至少400％、至少425％、至少450％、至少475％或至少500％。
在另外的实施方案中，与未用该至少一种RNAi试剂修饰的相同生物相比较，前述核苷酸序列的任何之一的全长转录本的存在量(presence)降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(无可检出的全长转录本)。在其他实施方案中，与未用该至少一种RNAi试剂修饰的相同生物相比较，由前述序列的任何之一编码的蛋白质或与由前述核苷酸序列的任何之一编码的蛋白质具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白质的存在量降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(无可检出的蛋白质)。
在任何以上实施方案中，该非维管光合生物可以是一种蓝细菌或一种藻类。该藻类可以是一种微藻或一种巨藻。微藻种类的非限制性实例包括衣藻、团藻目(Volvacalessp)、杜氏藻、栅藻、小球藻、红球藻(Hematococcussp.)、团藻(Volvoxsp，)、或微绿球藻。微藻的具体实例包括但不限于：莱茵衣藻、海洋微绿球藻、盐生微绿球藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻、盐生微绿球藻、眼点拟微绿球藻或海洋单细胞绿藻(D.tertiolecta)。
在任何前述实施方案中，在水性环境中的氯化钠的浓度是大约在250mM与100mM之间、在大约200mM与100mM之间、在大约175mM与75mM之间、在大约150mM与75mM之间、在大约275mM与100mM之间、在大约275mM与150mM之间或大约275mM与200mM之间。
在此提出了非维管光合生物，例如工程化成为具有耐盐性的藻类。
通过敲低”或“敲除”编码一种或多种蛋白质的一种或多种多核苷酸“来转化如在此披露的耐盐藻类(参见“核酸和氨基酸序列”)。包括赋予耐盐性的一种或多种敲除或敲低基因的藻类可以在可能妨碍其他藻类以及在一些实施方案中的其他非藻类生物的生长的盐浓度下生长。还提供了用编码对一种或多种动物种类具有毒性的一种蛋白质的多核苷酸(如编码对昆虫具有致死性的Bt毒素的基因)转化的藻类。
在一些实施方案中，使其中一种或多种多核苷酸被敲除或敲低以证明对盐的抗性的藻类在高浓度盐存在下大规模生长，用于生产多种生物分子，例如像治疗蛋白、工业酶、营养分子、商业产物、或燃料产物。还可以使转化有对一种或多种昆虫种类具有致死性的一种或多种毒素基因的藻类大规模生长，用于生产治疗、营养、燃料、或商业产物。还可以使针对耐盐性和/或用于表达昆虫毒素而生物工程化的藻类大规模培养生长，用于化合物的净化、环境修复、或碳固定。
在一些实施方案中在此提供了一种耐盐原核藻类，该藻类被转化以敲除或敲低编码赋予盐敏感性的蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中，该藻类是蓝细菌种类。
在一些实施方案中，该转化的宿主藻类是一种真核藻类。在一些实施方案中，该宿主藻类是绿藻门的一个种类。在一些实施方案中，该藻类是一种微藻。在一些情况下，该微藻是一个衣藻属种类。通过叶绿体基因组中的一个基因的失活而具有耐盐性的转化藻类在一些实施方案中对于该失活是类似的。
在另一个实施方案中，在此提供的是一种耐盐的含非叶绿素c的真核藻类，它包括一种整合到核基因组中的外源多核苷酸，其中该外源多核苷酸包括编码赋予对除草剂的抗性的蛋白质的一个序列，其中该对除草剂的抗性是由一种单一的外源蛋白质赋予的。
在另一个实施方案中，在此提供了一种含非叶绿素c的真核藻类，它包括核基因组中的多核苷酸的敲除或敲低，其中该多核苷酸产物的缺乏或抑制赋予了对盐的抗性。
在此还提供了一种耐盐的含非叶绿素c的真核藻类，它包括一种整合到核基因组中的重组多核苷酸，其中该重组多核苷酸编码赋予对草甘膦抗性的内源或外源EPSPS蛋白。
还提供了用于用敲除或敲低基因的一种或多种核苷酸序列转化藻类从而赋予耐盐性的核酸构建体。
本披露进一步提供了一种包含编码苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素蛋白的重组多核苷酸的藻类。在一个实施方案中，该藻类包括编码Bt毒素的cry基因。可以将外源Bt毒素基因结合到该藻类的核基因组或叶绿体基因组中。外源Bt毒素基因的引入可以中断和失活编码赋予盐敏感性的蛋白质的核苷酸，因此使该藻类具有耐盐性。
本披露进一步提供了一种耐盐真核藻类，该耐盐真核藻类包括编码赋予对除草剂的抗性的蛋白质的一种或多种重组多核苷酸序列，其中这些蛋白质各自赋予对不同除草剂的抗性。在一个实施方案中，将编码赋予除草剂抗性的蛋白质的这些多核苷酸序列的至少之一整合到真核藻类的叶绿体基因组中。在一个实施方案中，将编码赋予除草剂抗性的蛋白质的这些多核苷酸序列的至少之一整合到真核藻类的核基因组中。在一个另外的实施方案中，将编码赋予除草剂抗性的蛋白质的两个或更多个多核苷酸序列的至少第一个整合到叶绿体基因组中并且将编码赋予除草剂抗性的蛋白质的两个或更多个多核苷酸序列的至少第二个整合到真核藻类的核基因组中。
在此还提供了一种含非叶绿素c的耐盐藻类，它包括将编码赋予除草剂抗性的蛋白质的一种多核苷酸以及编码不赋予除草剂抗性的蛋白质的一种外源多核苷酸，其中不赋予除草剂抗性的蛋白质是一种工业酶或治疗蛋白，或参与或促进至少一种营养、治疗、商业、或燃料产物合成的一种蛋白质，或促进至少一种营养、治疗、商业、或燃料产物分离的一种蛋白质。
在此还披露了产生一种或多种生物分子的方法，其中这些方法包括通过敲除或敲低导致耐盐性的一种或多种多核苷酸来转化藻类，使藻类在高盐浓度的存在下生长，并且从该藻类或藻类培养基中收获一种或多种生物分子。在一些实施方案中，这些方法包括分离该一种或多种生物分子。
在一些实施方案中，用至少一种除草剂抗性基因以及至少一种毒素基因进一步转化藻类，并且使其在表达毒素的条件下在至少一种除草剂的存在下生长，并且从该藻类或藻类培养基中收获一种或多种生物分子。
在此还披露了在藻类中产生生物质降解酶的方法，其中这些方法包括：1)通过敲除或敲低一个或多个多核苷酸(并且因此对该藻类赋予耐盐性)以及编码外源生物质降解酶的一个序列(它促进内源生物质降解酶的表达增加)来转化该藻类；以及2)在高盐浓度的存在下以及在允许产生生物质降解酶的条件下使该藻类生长以产生该生物质降解酶，其中该盐处于足够抑制该藻类生长的浓度，它不包括赋予耐盐性的敲除或敲低。在一些实施方案中，这些方法包括分离该生物质降解酶。
附图简要说明
通过以下说明书、随附的权利要求以及附图本披露的这些和其他特征、方面、以及优点将被更好地理解，其中：
图1显示了用于转化莱茵衣藻核基因组以便表达人工miRNA的一种示例性载体，SENuc391。潮霉素抗性基因由“Aph7”指示。它前面是莱茵衣藻β2微管蛋白启动子并且其后是莱茵衣藻rbcS2终止子。将来自莱茵衣藻rbcS2基因的第一内含子插入到Aph7”中以增加表达水平并且因此增加转化体的数量。巴龙霉素抗性基因由“AphVIII”指示。它前面是莱茵衣藻psaD启动子并且其后是莱茵衣藻psaD终止子。标记为“杂合启动子”(它由以莱茵衣藻Hsp70A启动子开始的一个融合启动子、莱茵衣藻rbcS2启动子以及来自莱茵衣藻rbcS2基因的一个第一内含子组成)的区段驱动cre-MIR1157前体支架的表达。该前体支架之后是来自莱茵衣藻rbcS2基因的终止子。
图2显示了在莱茵衣藻中发现的miRNA前体cre-MIR1157的二级结构。标记“RE位点”指示用来连接人工miRNA的限制酶切位点。
图3显示了一个代表性的miRNA*-环-miRNA片段以及用来连接到SENuc391中的BglII限制酶切位点。
图4显示了一个表达盒，其含有通过口蹄疫病毒肽2A连接的博来霉素抗性基因(ble)和木聚糖酶基因(BD12)两者的编码序列。该2A序列导致一个单个mRNA转录本，但有两个多肽。BD12转录本的RNA干扰可能导致BD12蛋白、BD12活性、以及博来霉素抗性均降低。
图5显示了含有BD12沉默盒的12个转化体的分析，其后是标记“21gr”的一个野生型对照以及一个无BD12盒的含BD12的菌株。进行了BD12基因筛选对照(A行)；蛋白质印迹(B行)；对固体TAP培养基+10μg/mL博来霉素(C行)的敏感性；以及对固体TAP培养基+40μg/mL博来霉素(D行)的敏感性，以证明作为单独的转化事件的产物的敲低变异数。当BD12表达沉默时，BD12蛋白水平降低，同时对博来霉素的敏感性增加。
图6显示了含有BD12沉默盒的12个转化体的溶解产物和cDNA制备物的分析，其后是标记“21gr”的一个野生型对照以及一个无BD12沉默盒的含BD12的菌株。左边的y轴是针对标记“BD12+”的对照归一化的转录本水平，右边的y轴是木聚糖酶活性(单位/s)；x轴表示这12个转化体的每一个(包括阳性和阴性对照)。这些条表示如通过定量PCR确定的BD12相对转录本丰度；并且实线表示木聚糖酶活性。当BD12表达沉默时，BD12转录本水平降低，同时木聚糖酶活性降低。
图7显示了通过PCR从莱茵衣藻CC-1690(mt+)基因组DNA扩增的cre-MIR1157核苷酸序列。通过“多个盒”来指示内源miRNA*-环-miRNA序列的位置。
图8显示了用于转化莱茵衣藻核基因组以产生基因中断文库(genedisruptionlibrary)的一个示例性载体SENuc146。该潮霉素抗性基因由“Aph7”指示。它前面是莱茵衣藻β2微管蛋白启动子并且其后是莱茵衣藻rbcS2终止子。将来自莱茵衣藻rbcS2基因的第一内含子插入到Aph7”中以增加表达水平并且因此增加转化体的数量。在rbcS2终止子之后是标记“杂合启动子”的区段，该杂合启动子由一个以莱茵衣藻Hsp70A启动子开始的融合启动子、莱茵衣藻rbcS2启动子、以及来自莱茵衣藻rbcS2基因的第一内含子组成。
图9显示了用于转化莱茵衣藻核基因组以产生基因中断文库的一个示例性载体SENuc140。巴龙霉素抗性基因由“AphVIII”指示。它前面是莱茵衣藻psaD启动子并且其后是莱茵衣藻psaD终止子。在psaD终止子之后是标记“杂合启动子”的区段，该杂合启动子由一个以莱茵衣藻Hsp70A启动子开始的融合启动子、莱茵衣藻rbcS2启动子、以及来自莱茵衣藻rbcS2基因的第一内含子组成。
图10显示了S7敲低克隆。Y轴是S7基因的相对转录本丰度并且x轴表示5个单独的克隆(S7-1、S7-2、S7-3、S7-4、以及S7-5)、野生型莱茵衣藻(21gr)、以及S7基因中断菌株(S7KO)。并且，分离的耐盐菌株具有降低的转录本水平。
图11显示了S16敲低克隆。Y轴是S16基因的相对转录本丰度并且x轴表示5个单独的克隆(S16-1、S16-2、S16-3、S16-4、以及S16-5)、野生型莱茵衣藻(21gr)、以及S16基因中断菌株(S16KO)。并且，分离的耐盐菌株具有降低的转录本水平。
图12显示了在从0mM至200mM氯化钠的梯度平板上的两个靶向S7的人工miRNA转化(行2和3)。野生型莱茵衣藻(21gr)被铺板于顶行上。靶向S7的人工miRNA的转化体被表征为具有增加的耐盐性。
图13显示了在从0mM至200mM氯化钠的梯度平板上两个靶向S7的人工miRNA转化(行2和3)。野生型莱茵衣藻(21gr)被铺板于顶行上。初始的并且标记“SH7(S7)敲除”的S7基因中断菌株(通过产生文库而获得)被铺板于底行上。靶向S7的人工miRNA转化体和初始S7基因中断菌株被表征为具有增加的耐盐性。
图14显示了在从0mM至200mM氯化钠的梯度平板上的两个靶向S16的人工miRNA转化(行2和3)。野生型莱茵衣藻(21gr)被铺板于顶行上。靶向S16的人工miRNA转化体被表征为具有增加的耐盐性。
图15显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S65的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S65”是指平板ID#S65、菌株编号S65、以及Augustusv.5蛋白质ID：517886。参见表1。
图16显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S1659的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S59”是指平板ID#S59、菌株编号S1659、以及蛋白质ID：178706。参见表1。
图17显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S77的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S77”是指平板ID#S77、菌株编号S77、以及Augustusv.5蛋白质ID：522165。参见表1。
图18显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S1666的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S66”是指平板ID#S66、菌株编号S1666、以及Augustusv.5蛋白质ID：514721。参见表1。
图19显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S1704的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S109”是指平板ID#S109、菌株编号S1704、以及蛋白质ID：77062。参见表1。
图20显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S105的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S105”是指平板ID#S105、菌株编号S105、以及Augustusv.5蛋白质ID：524679。参见表1。
图21显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S1612的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S12”是指平板ID#S12、菌株编号S1612、以及蛋白质ID：103075。参见表1。
图22显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S1644的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S44”是指平板ID#S44、菌株编号S1644，以及蛋白质ID：331285。参见表1。
图23显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S1693的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S120”是指平板ID#S120、菌株编号S1693、以及蛋白质ID：188114。参见表1。
图24显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S1687的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S114”是指平板ID#S114、菌株编号S1687、以及蛋白质ID：291633。参见表1。
图25显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S129的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S129”是指平板ID#S129、菌株编号S129、以及Augustusv.5蛋白质ID：510051。参见表1。
图26显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S123的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S123”是指平板ID#S123、菌株编号S123、以及Augustusv.5蛋白质ID：519822。参见表1。
图27显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S289的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S289”是指平板ID#S289、菌株编号S289、以及Augustusv.5蛋白质ID：518128。参见表1。
图28显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S276的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S276”是指平板ID#S276、菌株编号S276、以及Augustusv.5蛋白质ID：512487。参见表1。
图29显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S292的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S292”是指平板ID#S292、菌株编号S292、以及Augustusv.5蛋白质ID：524030。参见表1。
图30显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S291的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S291”是指平板ID#S291、菌株编号S291、以及Augustusv.5蛋白质ID：516191。参见表1。
图31显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S294的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S294”是指平板ID#S294、菌株编号S294、以及Augustusv.5蛋白质ID：522637。参见表1。
图32显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S338的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S338”是指平板ID#S338、菌株编号S338、以及Augustusv.5蛋白质ID：512361。参见表1。
图33显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S74的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S74”是指平板ID#S74、菌株编号S74、以及Augustusv.5蛋白质ID：520845。参见表1。
图34显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S1613的42个敲低集落(左至右)。图像标记“S1613”是指平板ID#S1613、菌株编号S1613、以及Augustusv.5蛋白质ID：174261。参见表1。
图35显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S1621的42个集落(左至右)。图像标记“S1621”是指平板ID#S1621、菌株编号S1621、以及蛋白质ID：206559。参见表1。
图36显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S1623的42个集落(左至右)。图像标记“S1623”是指平板ID#S1623、菌株编号S1623、以及蛋白质ID：116145。参见表1。
图37显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S1638的42个集落(左至右)。图像标记“S1638”是指平板ID#S1638、菌株编号S1638、以及蛋白质ID：418706。参见表1。
图38显示了以75mM、100mM、125mM氯化钠为对照的针对S1655的42个集落(左至右)。图像标记“S1655”是指平板ID#S1655、菌株编号S1655、以及Augustusv.5蛋白质ID：525078。参见表1。
图39显示了S77敲低克隆。Y轴是S77基因的相对转录本丰度并且x轴表示6个单独的克隆(S77-1、S77-2、S77-3、S77-4、S77-5以及S77-6)、野生型莱茵衣藻(21gr)、以及S77基因中断菌株(S77KO)。该图的下半部显示6个单独的敲低克隆、野生型莱茵衣藻(21gr)、以及S77基因中断菌株对NaCl的敏感性(对应地左至右)。降低水平的转录本(菌株S77-1、S77-2、和S77-3)相应于增加的NaCl耐受性。较高水平的转录本(菌株S77-4、S77-5、和S77-6)相应于增加的NaCl敏感性。顶部行是75mMNaCl、中部行是100mMNaCl、并且底部行是125mMNaCl。
图40显示了S338敲低克隆。Y轴是S338基因的相对转录本丰度并且x轴表示6个单独的克隆(S338-1、S338-2、S338-3、S338-4、S338-5以及S338-6)、野生型莱茵衣藻(21gr)、以及S338基因中断菌株(S338KO)。该图的下半部显示6个单独的敲低克隆、野生型莱茵衣藻(21gr)、以及S338基因中断菌株对NaCl的敏感性(对应地左至右)。降低的转录本水平(菌株S338-1、S338-2、S338-3、S338-5、以及S338-6)相应于增加的NaCl抗性。顶行是75mMNaCl、中行是100mMNaCl、并且底行是125mMNaCl。
图41显示了5株抗潮霉素和5株对潮霉素敏感的针对菌株S7的分离分析结果。这5个抗潮霉素的株也对液体G0培养基+75mMNaCl耐受，而这5个对潮霉素敏感的株在液体G0培养基+75mMNaCl中不生长。这些结果表明表型(耐盐性)是与该抗生素选择标记或基因中断基因连锁的。
详细说明
提供以下详细说明以帮助本领域的技术人员实践本披露。即使这样，本详细说明不应当解释为不适当地限制本披露，因为本领域普通技术人员可以在在此讨论的实施方案中做出多种修改和变化，而不偏离本披露的精神或范围。
如在本说明书以及随附的权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个”、以及“该”包括复数指代。
内源的
如在此所述的一种内源核酸、核苷酸、多肽、或蛋白质是根据与宿主生物的关系而定义的。一种内源核酸、核苷酸、多肽、或蛋白质是天然发生在宿主生物中的那些。
外源的
如在此所述的一种外源核酸、核苷酸、多肽、或蛋白质是根据与宿主生物的关系而定义的。一种外源核酸、核苷酸、多肽、或蛋白质是并非天然发生在宿主生物中或处于宿主生物中的不同位置的那些。
耐盐性
在盐度存在下的非维管光合生物的相对生长被称为它的耐盐性。耐盐性是与未修饰的生物相比较，修饰的非维管光合生物对于细胞外和/或细胞内盐浓度(包括但不限于Na+、Li+和K+)的增加显示出改进的反应的能力。增加的耐盐性可以由多种表型特征来证明，包括，例如当经受盐浓度增加时，与未修饰的生物相比较，植物的更长的生存期、增加的生长速率、增加的生产率、表观正常生长以及功能、和/或降低的坏死水平。
可以通过本领域的技术人员已知的方法来测量耐盐性，例如如Inan等人(2004年7月)《植物生理学》(PlantPhysiol.)135：1718中说明的方法，包括但不限于，NaCl休克暴露或NaCl浓度的逐渐增加。
敲低
当将外源核酸转化到宿主生物中以产生导致RNA干扰/沉默的RNA分子(例如miRNA、siRNA)时，则认为转录本水平被敲低了。
敲除
当将一个外源核酸转化到宿主生物中(例如，通过随机插入或同源重组)导致基因中断(例如，通过缺失、插入)时，一个基因被认为是敲除了。
核酸和氨基酸序列
以下说明的序列位置命名是来自http://genome.jgi-psf.org/Chlre4/Chlre4.home.html(Merchant等人，《科学》(Science)，318：245-250(2007))。
SEQIDNO：1染色体_6：1409923-1420881-523016
SEQIDNO：2染色体_12：1410423-141626-512725蛋白激酶，核心
SEQIDNO：3染色体_2：7302492-7305976-519629-犰狳型折叠
SEQIDNO：4支架_23：64157-70065-520112
SEQIDNO：5染色体_2：7871590-7907018-519707-磷脂酰肌醇3-和4-激酶，催化的
SEQIDNO：6染色体_1：5106386-5121015-511373和511374-钙结合EF手型和蛋白激酶，核心
SEQIDNO：7511374
SEQIDNO：8染色体_17：5617386-5620810-517886和517887-富含亮氨酸重复
SEQIDNO：9517887
SEQIDNO：10染色体_6：6885194-6896388-524003
SEQIDNO：11染色体_14：1451054-1454952-515336和515337-钙结合EF手
SEQIDNO：12515337
SEQIDNO：1374-染色体_3：2741639-2747917-520845和520844-蛋白激酶，核心
SEQIDNO：14520844
SEQIDNO：15染色体_4：2134368-2137486-522165-Longin样
SEQIDNO：16染色体_10：3147531-3149275-510079-锌指，环型
SEQIDNO：17染色体_7：5889191-5892195-525104
SEQIDNO：18染色体_16：1660154-1676212-516251
SEQIDNO：19染色体_7：3216450-3222618-524679
SEQIDNO：20染色体_2：8790481-8811695-519822-NSF附着蛋白
SEQIDNO：21染色体_10：2994349-2997683-510051
SEQIDNO：22染色体_10：5445553-5448591-510417
SEQIDNO：23染色体_3：1215915-1220466-基因目录-175772
SEQIDNO：24染色体_10：1283278-1284432-509766和509765-抑制蛋白/变应原
SEQIDNO：25509765
SEQIDNO：26支架_22：53087-55615-520043
SEQIDNO：27染色体_9：1628082-1634270-526026-主要协助转运蛋白超家族。
SEQIDNO：28染色体_2：2611537-2615015-518848和518847-硫氧还蛋白样以及烷基氢过氧化物还原酶/硫醇特异性抗氧化剂/Mal变应原
SEQIDNO：29518847
SEQIDNO：30染色体_1：1574300-1583068-510801-蛋白激酶，核心
SEQIDNO：31染色体_7：61977-65285-524187-线粒体底物载体
SEQIDNO：32染色体_12：7667470-7670704-513869
SEQIDNO：33染色体_2：3580095-3582359-518990
SEQIDNO：34染色体_3：6643095-6648853-521592和521593
SEQIDNO：35521593
SEQIDNO：36染色体_9：1237497-1242515-525958-GTP环水解酶II
SEQIDNO：37染色体_3：5568689-5570263-521411
SEQIDNO：38染色体_16：282424-288402-516007和516008-PumilioRNA-结合区
SEQIDNO：39516008
SEQIDNO：40染色体_4：1572817-1574661-522081
SEQIDNO：41染色体_6：1447962-1450436-523024
SEQIDNO：42染色体_16：1504475-1506533-516221-细胞色素b5
SEQIDNO：43染色体_1：2870207-2876411-510991和510992-锌指，环型
SEQIDNO：44510992
SEQIDNO：45染色体_11：96916-101650-512152
SEQIDNO：46染色体_10：2157223-2160721-509900
SEQIDNO：47染色体_9：2397180-2401234-526112
SEQIDNO：48染色体_12：5837-34345-512487-Dysferlin，N-端
SEQIDNO：49染色体_5：3158380-3168988-522712
SEQIDNO：50染色体_3：7372589-7375277-521690和521691
SEQIDNO：51521691
SEQIDNO：52支架_18：812020-814034-518128和518129
SEQIDNO：53518129
SEQIDNO：54染色体_16：1333947-1337621-516191-NUDIX水解酶，核心
SEQIDNO：55染色体_6：7046193-7049187-524030
SEQIDNO：56染色体_5：2598236-2603160-522637
SEQIDNO：57染色体_12：5998066-6000934-513600-ARF/SAR超家族。
SEQIDNO：58染色体_12：6007846-6015554-513603和513602-ATP酶，P型，K/Mg/Cd/Cu/Zn/Na/Ca/Na/H-转运蛋白
SEQIDNO：59513602
SEQIDNO：60染色体_5：599204-604348-522399-蛋白激酶，核心
SEQIDNO：61染色体_11：1798315-1801943-512361-Plexin-样折叠
SEQIDNO：62染色体_1：1644920-1653379-510810和510811-抑制基因Mra1和蛋白激酶，核心
SEQIDNO：63510811
SEQIDNO：64染色体_11：1635862-1641291-512347
SEQIDNO：65染色体_3：1573144-1573807-520646-脯氨酰基4-羟化酶，α亚基
SEQIDNO：66染色体_16：1279888-1286957-516181
SEQIDNO：67染色体_16：4386264-4397213-516652-蛋白酶抑制剂I4，丝氨酸蛋白酶抑制剂
SEQIDNO：68染色体_1：3599000-3604849-511112-Nonaspanin(TM9SF)
SEQIDNO：69染色体_13：2255306-2255882-514509
SEQIDNO：70染色体_10：1448801-1450093-509796-蛋白激酶，核心
SEQIDNO：71染色体_3：4748750-4749429-521248-ATP酶，F1复合体，δ/ε亚基
SEQIDNO：72染色体_5：3179410-3179973-522714
SEQIDNO：73染色体_3：4767136-4768060-521254-DNA/RNA螺旋酶，C-端
SEQIDNO：74染色体_1：3081958-3091707-511033
SEQIDNO：75染色体_3：1280615-1281216-520594-吡咯并喹啉奎宁(quinolinequinine)
SEQIDNO：76染色体_10：6550769-6551325-510601
SEQIDNO：77染色体_1：9020623-9021459-511987
SEQIDNO：78染色体_6：1607759-1608312-523055-腺苷酸环化酶类别-3/4/鸟苷酰环化酶
SEQIDNO：79染色体_13：3805266-3813325-514736
SEQIDNO：80染色体_6：1189613-1199472-522979-14-3-3蛋白
SEQIDNO：81支架_22：71878-72579-520045-AAA+ATP酶，核心
SEQIDNO：82染色体_10：5505341-5513220-510431-ATP酶，P型，K/Mg/Cd/Cu/Zn/Na/Ca/Na/H-转运蛋白
SEQIDNO：83染色体_6：6387040-638749-523923
SEQIDNO：84具有UTR的S7转录本
SEQIDNO：85无UTR的S7转录本。
SEQIDNO：86S7蛋白序列。
SEQIDNO：87显示了包括来自莱茵衣藻CC-1690(mt+)的cre-MIR1157茎环的一个336bpDNA片段。
SEQIDNO：88显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：89显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：90显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：91显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：92显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：93显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：94显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：95显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：96显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：97显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：98显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：99显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：100显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：101显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：102显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：103显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：104显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：105显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：106显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：107显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：108显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：109显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：110显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：111显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：112显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：113显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：114显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：115S7-Augustusv.5ID：523016
SEQIDNO：116S16-蛋白质ID：195781，Augustusv.5ID：512725
SEQIDNO：117蛋白质ID：103782，Augustusv.5ID：519629
SEQIDNO：118蛋白质ID：206633，Augustusv.5ID：520112
SEQIDNO：119蛋白质ID：174337，Augustusv.5ID：519707
SEQIDNO：120蛋白质ID：146649，Augustusv.5ID：511373
SEQIDNO：121Augustusv.5ID：511374
SEQIDNO：122S65-蛋白质ID：410325，Augustusv.5ID：517886
SEQIDNO：123Augustusv.5ID：517887
SEQIDNO：124蛋白质ID：144919，Augustusv.5ID：524003
SEQIDNO：125蛋白质ID：340425，Augustusv.5ID：515336
SEQIDNO：126蛋白质ID：381008，Augustusv.5ID：515337
SEQIDNO：127S74-Augustusv.5ID：520845
SEQIDNO：128蛋白质ID：343410，Augustusv.5ID：520844
SEQIDNO：129S77-蛋白质ID：136188，Augustusv.5ID：522165
SEQIDNO：130Augustusv.5ID：510079
SEQIDNO：131蛋白质ID：393353，Augustusv.5ID：525104
SEQIDNO：132蛋白质ID：176993，Augustusv.5ID：516251
SEQIDNO：133S105-蛋白质ID：24421，Augustusv.5ID：524679
SEQIDNO：134S123-蛋白质ID：151044，Augustusv.5ID：519822
SEQIDNO：135S129-蛋白质ID：182890，Augustusv.5ID：510051
SEQIDNO：136Augustusv.5ID：510417
SEQIDNO：137蛋白质ID：175772
SEQIDNO：138蛋白质ID：186281，Augustusv.5ID：509766
SEQIDNO：139Augustusv.5ID：509765
SEQIDNO：140Augustusv.5ID：520043
SEQIDNO：141蛋白质ID：205891，Augustusv.5ID：526026
SEQIDNO：142蛋白质ID：141568，Augustusv.5ID：518848
SEQIDNO：143蛋白质ID：182094，Augustusv.5ID：518847
SEQIDNO：144蛋白质ID：406326，Augustusv.5ID：510801
SEQIDNO：145蛋白质ID：142644，Augustusv.5ID：524187
SEQIDNO：146蛋白质ID：173319，Augustusv.5ID：513869
SEQIDNO：147Augustusv.5ID：518990
SEQIDNO：148Augustusv.5ID：521592
SEQIDNO：149蛋白质ID：293419，Augustusv.5ID：521593
SEQIDNO：150蛋白质ID：163238，Augustusv.5ID：525958
SEQIDNO：151蛋白ID：137074，Augustusv.5ID：521411
SEQIDNO：152蛋白ID：396325，Augustusv.5ID：516007
SEQIDNO：153蛋白ID：35759，Augustusv.5ID：516008
SEQIDNO：154蛋白ID：183391，Augustusv.5ID：522081
SEQIDNO：155蛋白质ID：182345，Augustusv.5ID：523024
SEQIDNO：156蛋白质ID：131692，Augustusv.5ID：516221
SEQIDNO：157蛋白质ID：146316，Augustusv.5ID：510991
SEQIDNO：158蛋白质ID：404865，Augustusv.5ID：510992
SEQIDNO：159蛋白质ID：394374，Augustusv.5ID：512152
SEQIDNO：160蛋白质ID：421582，Augustusv.5ID：509900
SEQIDNO：161蛋白质ID：184523，Augustusv.5ID：526112
SEQIDNO：162S276-Augustusv.5ID：512487
SEQIDNO：163Augustusv.5ID：522712
SEQIDNO：164Augustusv.5ID：521690
SEQIDNO：165Augustusv.5ID：521691
SEQIDNO：166S289-蛋白质ID：411672，Augustusv.5ID：518128
SEQIDNO：167蛋白质ID：185219，Augustusv.5ID：518129
SEQIDNO：168S291-蛋白质ID：395916，Augustusv.5ID：516191
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SEQIDNO：178蛋白质ID：151147，Augustusv.5ID：512347
SEQIDNO：179蛋白质ID：417522，Augustusv.5ID：520646
SEQIDNO：180蛋白质ID：195665，Augustusv.5ID：516181
SEQIDNO：181蛋白质ID：288478，Augustusv.5ID：516652
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SEQIDNO：184蛋白质ID：206095，Augustusv.5ID：509796
SEQIDNO：185蛋白质ID：136002，Augustusv.5ID：521248
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SEQIDNO：187蛋白质ID：136100，Augustusv.5ID：521254
SEQIDNO：188蛋白质ID：342157，Augustusv.5ID：511033
SEQIDNO：189蛋白质ID：206488，Augustusv.5ID：520594
SEQIDNO：190蛋白质ID：205974，Augustusv.5ID：510601
SEQIDNO：191蛋白质ID：130473，Augustusv.5ID：511987
SEQIDNO：192Augustusv.5ID：523055
SEQIDNO：193蛋白质ID：331285，Augustusv.5ID：514736
SEQIDNO：194蛋白质ID：187228，Augustusv.5ID：522979
SEQIDNO：195蛋白质ID：132213，Augustusv.5ID：520045
SEQIDNO：196蛋白ID：182602，Augustusv.5ID：510431
SEQIDNO：197Augustusv.5ID：523923
SEQIDNO：198S1612-蛋白质ID：103075，Augustusv.5ID：513845
SEQIDNO：199S1625-蛋白质ID：186846
SEQIDNO：200S1644-蛋白质ID：331285，Augustusv.5ID：514736
SEQIDNO：201S1659-蛋白质ID：178706
SEQIDNO：202S1666-Augustusv.5ID：514721
SEQIDNO：203S1687-蛋白质ID：291633
SEQIDNO：204S1693-蛋白质ID：188114
SEQIDNO：205S1702-蛋白质ID：536097
SEQIDNO：206S1704-蛋白质ID：77062
SEQIDNO：207S7amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：208S16amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：209S65amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：210S77amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：211S105amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：212S123amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：213S129amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：214S276amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：215S289amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：216S291amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：217S292amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：218S294amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：219S303amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：220S338amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：221S1612amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：222S1644amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：223S1659amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：224S1666amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：225S1687amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：226S1693amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：227S1704amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：228BD11序列
SEQIDNO：229用来产生双链amiRNA克隆片段的BD113’引物。
SEQIDNO：230S1613-蛋白质ID：174261，Augustusv.5ID：519617
SEQIDNO：231S1621-蛋白质ID：206559
SEQIDNO：232S1623-蛋白质ID：116145，Augustusv.5ID：511331
SEQIDNO：233S1638-蛋白质ID：418706，Augustusv.5ID：521355
SEQIDNO：234S1655-Augustusv.5ID：525078
SEQIDNO：235S74amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：236S1613amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：237S1621amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：238S1623amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：239S1638amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：240S1655amiRNA克隆片段。
SEQIDNO：241显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：242显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：243显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：244显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：245显示了一个PCR引物。参见表3。
SEQIDNO：246显示了一个PCR引物。参见表3。
表1
序列表编号 蛋白质ID编号 菌株编号 平板ID#
SEQ ID NO：115 523016(aug5) S7 S7
SEQ ID NO：116 195781 S16 S16
SEQ ID NO：122 517886(aug5) S65 S65
SEQ ID NO：201 178706 S1659 S59
SEQ ID NO：129 522165(aug5) S77 S77
SEQ ID NO：202 514721(aug5) S1666 S66
SEQ ID NO：206 77062 S1704 S109
SEQ ID NO：133 524679(aug5) S105 S105
SEQ ID NO：198 103075 S1612 S12
SEQ ID NO：200 331285 S1644 S44
SEQ ID NO：204 188114 S1693 S120
SEQ ID NO：203 291633 S1687 S114
SEQ ID NO：135 510051(aug5) S129 S129
SEQ ID NO：134 519822(aug5) S123 S123
SEQ ID NO：166 518128(aug5) S289 S289
SEQ ID NO：162 512487(aug5) S276 S276
SEQ ID NO：169 524030(aug5) S292 S292
SEQ ID NO：168 516191(aug5) S291 S291
SEQ ID NO：170 522637(aug5) S294 S294
SEQ ID NO：175 512361(aug5) S338 S338
SEQ ID NO：127 520845(aug5) S74 S74
SEQ ID NO：230 174261 S1613 S1613
SEQ ID NO：231 206559 S1621 S1621
SEQ ID NO：232 116145 S1623 S1623
SEQ ID NO：233 418706 S1638 S1638
SEQ ID NO：234 525078(aug5) S1655 S1655
*aug5是指Augustusv.5蛋白质ID数据库。使用这些是因为莱茵衣藻基因组的标准注释不包括这些基因。Augustusv.5是通过一种基因预测算法产生的。
RNA沉默
莱茵衣藻是一种单细胞绿藻，它是一种理想的用于研究一些生物学过程的模型系统。它的最近测序基因组促进了我们对于真核祖细胞的了解并且揭示了许多以前未知的基因，这些基因可能与光合功能和鞭毛功能相关联(例如，如Merchant，S.S等人(2007)《自然》(Science)，318，245-250中说明的)。该基因组的分析需要一个方便的用于逆向遗传分析的系统。
在开花植物中转座子标签、插入诱变以及tilling已经是高度成功的反向遗传学工具(例如，如Alonso，J.M.以及Ecker，J.R.(2006)《遗传学自然评论》(Nat.Rev.Genet.)，7，524-536说明的)，但是在衣藻中还没有被完全开发。用这些方法饱和全基因组需要非常大的突变体群体，并且可能受突变靶向的选择性的限制。基因功能高通量分析的替代方法是基于RNA沉默。他们利用保守的细胞机制，该机制可能是作为对抗病毒和转座子的一种防御策略而进化的并且在多种真核生物中可以采用用于内源基因调节(例如，如Baulcombe，D.(2006)《短沉默RNA：遗传学的暗物质？》(ShortSilencingRNA：TheDarkMatterofGenetics？)定量生物学冷泉港论文集(ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol.)，LXXI，13-20中说明的)。小RNAs(21-24个核苷酸(nt))是这种方法中的中心部件，它们提供了针对沉默元件(silencingmachinery)的效应物复合体的序列特异性。
在RNA沉默中存在两种主要类型的微小RNA：小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)。siRNA是通过RNaseIII样酶(Dicer或Dicer样)从完全双链(ds)RNA上产生的，释放出具有两个核苷酸3’突出的长度大约21nt的数个双链中间体(例如，如Elbashir，S.M.，等人(2001)《基因和发育》(GenesDev.)，15，188-200中说明的)。相反，miRNA中间体是由Dicer作为21-24-ntRNA双链体的形式从不完全匹配的折回RNA的部分双链区域释放的(例如，如Ambros，V.(2001)《细胞》(Cell)，107，823-826中说明的)。每个miRNA前体典型地产生一个主要的21-24ntRNA双链体，而这种分子的多种形式是从siRNA前体产生的。
在miRNA和siRNA两种途径中，短dsRNA被类似地加工。在其5’端具有较低热力学稳定性的链通过被5’核苷酸影响的一种机制(例如，如Mi，S.，等人(2008)《细胞》(Cell)，133，116-127中说明的)被Argonaute(AGO)蛋白稳定地保持(例如，Khvorova，A.，等人(2003)《细胞》(Cell)，115，209-216；以及Schwarz，D.S.，等人(2003)《细胞》(Cell)，115，199-208如中说明的)。生成的AGO核糖核蛋白是沉默的效应物，通过与结合的微小RNA进行沃森-克里克碱基配对将该效应物引导至它的靶核酸上。未结合到Argonaute中的小RNA链称为过客链或miRNA*，并且被快速降解。
这些靶向机制涉及靶序列的转录和转录后调节。转录沉默机制还未完全理解并且它未曾用于基因组序列的功能性分析的方法中。相反地，转录后机制被更好地详细理解并且已经被广泛应用。它们涉及通过mRNA失稳或者miRNA引导的切割进行翻译阻止或靶向RNA降解(例如，如Bartel，D.P.(2004)《细胞》(Cell)，116，281-297中说明的)；显示与靶RNA部分互补的小RNA典型地引起翻译抑制，而完全匹配或接近完全匹配的那些更可能引导mRNA切割。动物体内的miRNA通常在一个短种子区(位置2至8)中与它们的靶标互补，这允许每个miRNA靶向多个(通常是数百个)mRNA(例如，如Brennecke，J.，等人(2005)《PloS生物学》(PloSBiology)，3，e85；Farh，K.K.，等人(2005)《科学》(Science)，310，1817-1821；Lewis，B.P.，等人(2005)《细胞》(Cell)，120，15-20；以及Lim，L.P.，等人(2005)《自然》(Nature)，433，769-773中说明的)。相对地，植物miRNA与它们的靶标具有较少的(0至5个)错配并且通常触发有限数量的转录本切割以及随后的mRNA降解(例如，如Llave，C.，等人(2002))《科学》(Science)，297，2053-2056；以及Schwab，R.，等人(2005)《发育的细胞》(DevelopmentalCell)，8，517-527中说明的)。
使用长dsRNA转基因下调感兴趣基因的一个替代方案涉及内源miRNA的修饰型式(例如，如Zeng，Y.，等人(2002)《分子细胞》(MolecularCell)，9，1327-1333；Parizotto，E.A.，等人(2004)《基因与发育》(GenesDev.)，18，1-6；Alvarez，J.P.，等人(2006)《植物细胞》(ThePlantCell)，18，1134-1151；Niu，Q.W.，等人(2006)《自然生物技术》(Nat.Biotechnol.)，24，1420-1428；Schwab，R.，等人(2006)《植物细胞》(ThePlantCell)，18，1121-1133；以及Warthmann，N.，等人(2008)PloSONE，3，e1829中说明的)。这种人工miRNA方法克服了siRNA自我沉默的问题，因为miRNA通常与转录沉默不相关联。此外，每种人工miRNA前体仅产生一个单一的微小RNA种类，该种类可以被优化以避免脱靶效应(至少在具有完整基因组信息的生物的情况下)。
可以将衣藻miRNA基因座再分成两个类别。在“短发夹”类别中的那些类似于陆生植物和动物的典型的miRNA基因座，在于这些发夹区是短于150nt并且它们限定了一个单个的miRNA。在衣藻中的“长发夹”基因座的预测转录本可以形成长的(150-729nt)几乎完全的发夹，其具有产生多个微小RNA的潜力(例如，如Molnar，A.，等人(2007)《自然》(Nature)，447，1126-1129；以及Zhao，T.，等人(2007)《基因与发育》(GenesDev.)，21，1190-1203中说明的)。
人工miRNA(amiRNA)可以用作一种高特异性高通量沉默系统，用来验证所希望的表型(例如，一种抗盐、抗除草剂、或抗漂白生物)，这是候选基因表达的结果。
本披露认识到藻类的大规模培养可以用来生产多种生物分子。提供了这些披露的方法、构建体、藻类、以及细胞用来完全实现藻类培养物的优点，用于大规模生产有用的生物分子以及用于其他目的，例如像碳固定或化合物、溶液、或混合物的净化。本披露还认识到藻类通过光合碳固定将CO2转化成糖、淀粉、脂质、脂肪、或其他生物分子的潜力，由此从大气中去除温室气体同时提供了治疗或工业产物、燃料产物、或用于人类或动物消费的营养物。为了使藻类培养物能够大规模生长于开放的池塘或大容器中(在其中它们有效地并且经济地接近CO2和光)，重要的是妨碍否则可能污染和甚至超过该培养物的竞争生物的生长。在此提供了其中基因已经被敲除或敲低以便赋予耐盐性的藻类，从而该藻类能够在盐存在下在妨碍不包含携带该敲除或敲低基因的藻类生长的浓度下生长。该盐浓度还可以妨碍其他生物(例如但不必限于其他藻类种类)的生长。
植物种类(包括藻类)在如何很好地耐受盐方面是不同的。一些植物可以耐受高水平的盐度，而其他植物可能几乎不耐受盐度或不耐受盐度。在盐度存在下的植物的相对生长称为它们的耐盐性。耐盐性是与未修饰的植物或植物细胞相比较，修饰的植物或植物细胞(也称为宿主细胞或生物)对于细胞外和/或细胞内盐浓度(包括但不限于Na+、Li+和K+)的增加显示出的改进的反应的能力。增加的耐盐性可以由多种表型特征来证明，包括当经受盐浓度增加时，与未修饰的植物相比较，植物的更长的生存期、表观正常生长以及功能、和/或降低的坏死水平。耐盐性是通过本领域已知的方法来测量的，例如在Inan等人(2004年7月)《植物生理学》(PlantPhysiol.)135：1718中说明的那些，包括但不限于，NaCl休克暴露或NaCl浓度的逐渐增加。
相对于不含该敲除或敲低基因的野生型藻类细胞，本披露的转基因藻类细胞具有增加的耐盐性。在一些实施方案中，该耐盐性是野生型藻类的至少两倍。该耐盐性可以比野生型藻类高至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、5或大于5倍。
本披露中使用的盐可以是一种钠(Na+)盐、一种锂(Li+)盐、或一种钾(K+)盐。用于本披露转基因藻类的选择培养基中的Na+的浓度可以是至少200mM。用于本披露转基因藻类的选择培养基中Li+的浓度可以是至少2mM。
藻类
本披露提供了其中一种或多种核苷酸已经被敲除以赋予耐盐性的藻类和藻类细胞。还提供了用编码对于一些昆虫和轮虫种类是致死性的Bt毒素的多核苷酸转化的藻类和藻类细胞。转化的藻类在此可以称为“宿主藻类”。
如在此披露的其中基因已经被敲除以便提供耐盐性的藻类可以是巨藻或微藻。微藻包括真核微藻和蓝细菌。
用于本披露中的一个示例性的生物的组是绿藻(绿藻门)种类。这些藻类发现于土壤、淡水、海洋中，以及甚至山顶上的雪中。这个属中的藻类具有细胞壁、叶绿体、以及允许在液体环境中移动的两个前鞭毛。已经说明了500种以上的不同种类的衣藻。
最广泛使用的实验室种类是莱茵衣藻。当剥夺氮时，莱茵衣藻细胞可以分化成同形配子。存在被命名为mt+和mt-的两种不同的交配型。这些交配型有性融合，由此产生一种厚壁合子，该合子形成一个保护它免受多种环境条件影响的硬外壁。当在光和水存在下恢复到氮培养基上时，该二倍体接合孢子经历减数分裂并且释放出四个单倍体细胞，它们继续营养生活周期。细胞在有丝分裂生长中快至每8小时就翻倍。
已被良好建立莱茵衣藻的核遗传学。存在已经被表征的大量的突变体并且莱茵衣藻中心(www.chlamy.org)维持了衣藻种类的广泛的突变体收集、以及注释的基因组序列。已经在莱茵衣藻中产生了大量的叶绿体突变体以及一些线粒体突变体。
当在一些示例性方面用莱茵衣藻在此说明这些方法和转化的细胞时，应当理解的是在此所述的这些方法和转化体还可以应用于其他藻类，包括蓝细菌例如但不限于聚球藻、集胞藻、旋藻、组囊藻、鱼腥藻、念珠藻、螺旋藻，以及夫列藻种类，并且包括绿色微藻，例如但不限于杜氏藻属、栅藻属、小球藻属、团藻属、或红球藻属种类。
通过将DNA引入一个靶细胞群并且选择已经吸收了该DNA的细胞来产生转化的细胞。在一些实施方案中，可以使赋予耐盐性的敲除物或敲低物在高盐浓度存在下生长从而选择成功的敲除物或敲低物。可以使用直接基因转移法例如像电穿孔、使用基因枪的微粒介导的(生物射弹)转化、“玻璃珠法”或通过阳离子脂质或脂质体介导的转化，将敲除或敲低序列引入藻类细胞中。
真核藻类细胞的核转化可以是通过微粒介导的转化，或可以是通过原生质体转化、电穿孔、使用玻璃纤维引入DNA、或玻璃珠搅拌法(作为非限制性实例)(Kindle，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.SciencesUSA)87：1228-1232(1990)；Shimogawara等人《遗传学》(Genetics)148：1821-1828(1998))。藻类核转化的标记包括但不限于：拯救营养缺陷型菌株的标记(例如，衣藻中的NIT1和ARG7；Kindle等人《细胞生物学期刊》(J.CellBiol.)109：2589-2601(1989)，Debuchy等人EMBOJ.8：2803-2809(1989))、以及显性选择标记(例如，CRY1、aada；Nelson等人《分子细胞生物学》(Mol.CellularBiol.)14：4011-4019(1994)，Cerutti等人《遗传学》(Genetics)145：97-110(1997))。在一些实施方案中，敲除或敲低的存在被用作转化体的一种选择标记。在一些实施方案中可以将敲除序列与编码有待由藻类产生的蛋白质(例如，一种治疗蛋白、工业酶)或促进或增强一种商业、治疗或营养产物的生产的蛋白质的一种第二序列共同转化。在一些实施方案中，该第二序列作为用于转化到藻类中的敲除序列被提供在相同的核酸构建体中，其中该敲除序列在激活感兴趣的基因中的成功被用作选择标记。
在转化之后通常需要数个细胞分裂周期以达到同倍体状态。在筛选转化体之前，可以允许藻类在选择剂存在或缺乏下、或在加速选择下(比同型细胞更低浓度的选择剂的使用将被期望逐渐使人接受，这可以随着时间增加)分裂。例如，可以通过进行PCR、或Southern杂交筛选转化体来确定转化体是同型的还是异型的，以及如果是异型的，该重组体基因整合到叶绿体基因组的拷贝中的程度。
对于叶绿体的转化而言，主要的益处可以是一种重组核酸构建体的利用，该构建体含有敲除序列和一种或多种感兴趣基因两者。典型地，通过用两种构建体(一种含有敲除序列并且第二种含有感兴趣的一种或多种基因)共转化叶绿体来实现叶绿体的转化。针对敲除或敲低(耐盐性)的存在、并且在一些实施方案中针对感兴趣的另外的一种或多种基因的存在，对转化体进行筛选。典型地，通过PCR或Southern印迹进行感兴趣的一种或多种基因的二次筛选(参见，例如PCT/US2007/072465)。
可以转化在此的生物/宿主细胞，以通过载体来改变一种或多种产物的产生，在这种情况下，用来减少或消除一种或多种产物的产生。典型地该载体与有待敲除的基因是基本上同源的从而允许发生同源重组，但已经以这样一种方式被修饰，即通常由该基因产生的产物不被产生、以一种非活性形式产生、或以其中该产物的正常活性大大降低的一种形式来产生。
构建基因操纵的藻类菌株的一种方法涉及用失活感兴趣的基因从而例如赋予抗盐性的一种核酸进行转化。在一些实施方案中，转化可以将核酸引入宿主藻类细胞中(例如，真核宿主细胞的叶绿体或细胞核)。在引入外源核酸之后，典型地将转化的细胞铺板于选择性培养基上。这种方法还可以包括用于筛选的数个步骤。最初地，典型地进行初级转化体筛选，以确定哪些克隆具有这些外源核酸的正确插入。可以将显示正确整合的克隆复制铺板并且再筛选从而确保遗传稳定性。这样的方法确保感兴趣的基因已经被敲除或敲低。在许多情况下，通过聚合酶链式反应(PCR)来进行这样的筛选；然而，可以使用本领域已知的任何其他适当的技术。PCR的许多不同方法是本领域已知的(例如，巢式PCR、实时PCR)。
莱茵衣藻的全叶绿体基因组能够按照GenBankAcc.No.BK000554得到，并且综述于J.Maul，等人《植物细胞》(ThePlantCell)14：2659-2679(2002)中，两者通过引用结合在此。还将衣藻基因组在环球网上在URL“biology.duke.edu/chlamy_genome/-chloro.html”下提供给公众(参见“以文本文件形式查看全基因组”链接以及“叶绿体基因组图谱”链接)，通过引用将它们每一项结合在此。为了产生敲除，选择叶绿体基因组DNA的核苷酸序列使得它是感兴趣的基因的一部分，包括调节序列或编码序列。在这个方面，包括莱茵衣藻叶绿体基因组序列的站点还提供了显示叶绿体基因组的编码和非编码区的图谱，因此有助于选择对于构建敲除载体有用的序列。
敲除核酸分子可以包括编码报告基因多肽或其他选择标记的核苷酸序列。术语“报告基因”或“选择标记”是指赋予可检测表型的一种多核苷酸(或编码的多肽)。报告基因通常编码可检测的多肽，例如一种绿色荧光蛋白或一种酶例如荧光素酶，当与适当试剂(对应地，特定波长的光或萤光素)接触时它产生可以用眼睛或使用适当仪器检测的一种信号(Giacomin，《植物科学》(PlantSci.)116：59-72，1996；Scikantha，《细菌学期刊》(J.Bacteriol.)178：121，1996；Gerdes，FEBSLett.389：44-47，1996；还参见Jefferson，EMBOJ.6：3901-3907，1997，f1-葡萄糖醛酸酶)。
选择标记可以提供快速筛选已经结合了该敲除序列并且因此表达该标记的原核细胞或植物细胞或两者的一种手段。选择标记的实例包括但不限于赋予抗代谢药抗性的那些，例如赋予对甲氨蝶呤的抗性的二氢叶酸还原酶(Reiss，《植物生理学》(PlantPhysiol.)(《生命科学进展》(LifeSci.Adv.)13：143-149，1994)；赋予对氨基糖苷类(新霉素、卡那霉素以及巴龙霉素)的抗性的新霉素磷酸转移酶(Herrera-Estrella，EMBOJ.2：987-995，1983)；赋予对潮霉素的抗性的hygro(Marsh，《基因》(Gene)32：481-485，1984)；允许细胞使用吲哚(代替色氨酸)的trpB；允许细胞使用组氨醇(代替组氨酸)的hisD(Hartman，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)85：8047，1988)；允许细胞利用甘露糖(WO94/20627)的甘露糖-6-磷酸异构酶；赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸(DFMO；McConlogue，1987，在《现代分子生物学通讯》中(In：CurrentCommunicationsinMolecularBiology)的抗性的鸟氨酸脱羧酶，冷泉港实验室编(ColdSpringHarborLaboratoryed.))；以及赋予对杀稻瘟菌素S的抗性的来自土曲霉的脱氨酶(Tamura，《生物科学、生物技术、和生物化学》(Biosci.Biotechnol.Biochem.)59：2336-2338，1995)。选择标记包括赋予对真核细胞的二氢叶酸还原酶(DHFR)或新霉素抗性、和四环素抗性，对原核生物例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性，以及在植物中的博来霉素、庆大霉素、草甘膦、潮霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、福来霉素、草铵磷、大观霉素、链霉素、磺酰胺和磺酰脲抗性的多核苷酸(参见，例如，Maliga等，MethodinPlantMolecularBiology，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1995，第39页)。
耐盐性还可以是一种选择标记。可以用升高的盐浓度选择在此披露的宿主藻类(用敲除或敲低一个或多个基因的多核苷酸来转化它们用于提供耐盐性)。可替代地，一种选择标记(如卡那霉素或博来霉素或硝酸盐还原酶)可以与该敲除序列一起共同转化，并且最初可以使用选择性培养基或与敲除的基因无关的化合物来选择转化的细胞。
针对耐盐性的生物工程化藻类的大规模培养可以用于生产多种生物分子，这些生物分子可以是治疗、营养、商业、或燃料产物，或用于CO2固定，或用于化合物、混合物、样品、或溶液的净化。可以使在此提供的耐盐藻类在一个盐浓度下生长，该盐浓度能够阻碍或阻止除了用于生物生产、净化、或CO2固定的藻类种类之外的种类的生长。在某些实施方案中，盐浓度是相应的野生型藻类所耐受的1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5倍或5倍以上。在其他实施方案中，Na2+的平均浓度是200mM或更多。仍然在其他实施方案中，培养基中的Li+浓度是大约2mM或更多。在本披露的某些实施方案中，用编码在使藻类在培养下生长时由它产生的外源或内源蛋白质的一种或多种另外的基因来转化被工程化以便提供耐盐性的宿主藻类，其中该外源或内源蛋白质是一种治疗、营养、商业、或燃料产物，或增加治疗、营养、商业、或燃料产物的产量或促进它们的分离。
如在此提供的耐盐藻类可以用于一些实施方案中，以产生对于藻类宿主而言是内源的或非内源的生物分子。在一些实施方案中，可以培养这些基因工程化的耐盐藻类用于环境修复或CO2固定。可以另外地用一种或多种重组外源或内源多核苷酸来转化这些藻类，这些多核苷酸使该藻类能够在至少一种除草剂的存在下生长。用于赋予除草剂抗性的藻类的基因工程已经在于2008年12月31日提交的美国专利申请61/142,091中进行了说明，通过引用将其全部内容结合在此。
在一些实施方案中，除了耐盐之外，在此提供的原核藻类对一种或多种除草剂具有抗性。原核藻类可以包括提供对第一除草剂的抗性的一个第一重组外源或内源除草剂抗性基因以及赋予对第二除草剂的抗性的一个第二外源或内源除草剂抗性基因。
可以将编码除草剂抗性基因的多核苷酸提供到用于转化藻类宿主的载体中。在一些实施方案中，该载体被设计成整合到宿主基因组中，并且可以包括例如与宿主基因组具有同源性的序列，其侧翼是促进同源重组的除草剂抗性基因。在其他实施方案中，该载体可以具有一个复制起点，使得它可以作为一个自主复制的游离基因而保持在宿主中。在一些实施方案中，该多核苷酸的蛋白质编码序列是密码子偏倚的，以反映宿主藻类的密码子偏倚。
本披露进一步还提供了进一步包括编码赋予除草剂抗性的蛋白质的一种或多种重组多核苷酸序列的一种耐盐真核藻类，其中这些蛋白质各自赋予对不同除草剂的抗性。在一些实施方案中，用除草剂抗性基因转化的抗除草剂藻类对于抑制不同氨基酸生物合成途径的两种或更多种除草剂(例如草甘磷和磺酰脲，或草甘磷和草胺膦)是抗性的。在一些实施方案中，用除草剂抗性基因转化的抗除草剂藻类对于两种或更多种除草剂是抗性的，其中至少一种除草剂抑制氨基酸生物合成途径，并且至少一种除草剂不抑制氨基酸生物合成途径。例如，一种抗除草剂藻类可以包括赋予草甘磷抗性和达草灭抗性的重组基因。
在包括两种或更多种编码赋予除草剂抗性的蛋白质的重组多核苷酸序列的藻类的一些实施方案中，这些重组多核苷酸的至少之一编码赋予除草剂抗性的一种内源蛋白质。在一些实施方案中，这些多核苷酸的至少之一编码赋予除草剂抗性的一种外源蛋白质。
并且在此披露了生产一种或多种生物分子的方法，其中这些方法包括通过敲除一个或多个基因将藻类工程化，由此提供耐盐性，使藻类在升高的盐浓度存在下生长，并且从该藻类或藻类培养基中收获一种或多种生物分子。在一些实施方案中，这些方法包括分离该一种或多种生物分子。
使基因工程化的耐盐藻类在含有一种盐浓度的培养基中生长，该盐浓度允许转化的藻类生长，但是抑制未被工程化的相同种类的藻类的生长，从而赋予耐盐性。在一些实施方案中，在其中该基因工程化藻类生长以产生一种生物分子或产物的培养基中的盐浓度抑制了至少一种其他藻类种类的生长。在一些实施方案中，在其中该基因工程化藻类生长以产生一种生物分子或产物的培养基中的盐浓度抑制了至少一种细菌种类或至少一种真菌种类的生长。可以经验地确定宿主藻类的最佳生物生产和其他未转化种类的生长抑制的浓度。
在一些实施方案中，使包括一种或多种编码蛋白质(各自赋予对不同除草剂的抗性)的重组多核苷酸的基因工程化耐盐藻类生长于含有一种或多种除草剂的培养基中。该一种除草剂或多种除草剂的组合可以抑制至少一个藻类种类、至少一个细菌种类、以及至少一个真菌种类的任何组合的生长。
可以通过包括以下步骤的方法通过藻类培养生产一种产物(例如燃料产物、香料产物、杀虫剂产物、商业产物、治疗产物)：将一种耐盐藻类生长/培养于包括升高的一种或多种盐(如，NaCl或LiCl或两者)浓度的培养基中。在此所述的方法可以进一步包括收集由该生物产生的产物的步骤。该产物可以是转化到藻类中的一种外源核苷酸的产物。在一些实施方案中，该产物(例如燃料产物、香料产物、杀虫剂产物)是通过收获该生物来收集的。然后可以从该生物中提取该产物。
在一个实施方案中，提供了用于在藻类中生产生物质降解酶的方法，其中该方法包括将藻类工程化以敲除一个或多个基因，由此对该藻类赋予耐盐性，并且用编码外源生物质降解酶或促进内源生物质降解酶表达增加的序列转化该藻类；在一种或多种盐升高的浓度存在下在允许产生该生物质降解酶的条件下使藻类生长从而产生该生物质降解酶，其中该盐处于足够抑制未针对耐盐性进行工程化的藻类生长的浓度。在一些实施方案中，这些方法包括分离该生物质降解酶。
在一些实施方案中，该产物(例如燃料产物、香料产物、杀虫剂产物)的表达是可诱导的。该产物可以被诱导表达。表达可以通过光来诱导。仍然在其他实施方案中，该产物的生产是可自动调节的。该产物可以形成一个反馈环，其中当该产物(例如燃料产物、香料产物、杀虫剂产物)达到某一水平时，产物的表达可以被抑制。在其他实施方案中，生物代谢物的水平抑制了该产物的表达。例如，作为增加的能量产生以表达该产物的结果，由该生物产生的内源ATP可以形成一个反馈环来抑制该产物的表达。仍然在另一个实施方案中，该产物的产生可以是可诱导的(例如通过光或抑制外源试剂)。例如，用于影响在宿主生物中的产物的产生的表达载体可以包括一个可诱导的调节控制序列，该序列被一种外源试剂活化或失活。
在此所述的这些方法可以进一步包括向该生物提供无机碳源(如烟道气)的步骤。在一些情况下，该无机碳源提供制造该产物(例如燃料产物)所必需的所有的碳。该生长/培养步骤可以发生在适当的培养基中，例如除了升高浓度的一种或多种盐之外具有矿物质和/或维生素的培养基。
在此所述的方法包括选择用于生产产物，例如燃料、香料、治疗性化合物、和杀虫剂的基因，用这样的一种或多种基因转化基因工程化的耐盐藻类，并且使这样的藻类在一种或多种升高浓度的盐的存在下在适合于允许产生该产物的条件下生长。可以将这些生物在常规的发酵生物反应器中培养，它们包括但不限于批量、分批补料、细胞再循环、以及连续发酵罐。另外，可以使它们在光生物反应器中生长(参见例如美国申请公开号20050260553；美国专利号5,958,761；美国专利号6,083,740)。培养还可以在摇瓶、试管、微量滴定板、以及培养皿中进行。在一定温度、适合于重组细胞的pH和氧含量下，并且在盐允许藻类生长和生物生产的盐浓度下进行培养。
在此提供的基因工程化耐盐藻类以及方法可以将藻类的培养条件扩展到更大的区域，这些区域可以是开放的并且在缺乏抗性下(经受培养物的污染)，例如在陆地上，例如在填埋场中。在一些情况下，使一种或多种生物生长在乙醇生产厂或产生CO2的其他设施或区域(例如，城市、公路等)附近。像这样，在此所述的方法考虑了用于将碳信用(carboncredits)销售给乙醇厂或产生CO2的其他设施或区域的多种商业方法，同时通过使一种或多种在此所述的修饰生物在升高浓度的一种或多种盐的存在下生长来制造燃料。
宿主细胞或宿主生物
与未修饰的生物相比较，可以从已经修饰(例如基因工程化)成为例如抗盐、抗除草剂、或抗次氯酸钠的宿主细胞或宿主生物中获得在此所述的方法和系统中有用的生物质。此外，可以进一步修饰宿主细胞或宿主生物以表达一种外源或内源蛋白质，如涉及类异戊二烯生物合成途径的蛋白质或涉及脂肪酸、甘油脂类、或油类的积聚和/或分泌的蛋白质。
宿主细胞可以含有编码本披露的多肽进的一种多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞是多细胞生物的一部分。在其他实施方案中，宿主细胞作为单细胞生物培养。
宿主生物可以包括任何适当的宿主，例如一种微生物。用于在此所述方法的微生物包括例如光合细菌(例如，蓝细菌)、非光合细菌(例如，大肠杆菌)、酵母(例如，酿酒酵母)、以及藻类(例如，微藻，如莱茵衣藻)。
可以用感兴趣的多核苷酸(例如，编码涉及类异戊二烯生物合成路径的蛋白质的多核苷酸)转化的宿主生物的实例包括维管和非维管生物。该生物可以是原核的或真核的。该生物可以是单细胞的或多细胞的。宿主生物是包括宿主细胞的一种生物。在其他实施方案中，该宿主生物是光合性的。光合生物是天然地光合成的生物(例如藻类)或被基因工程化或以别的方式被修饰成光合性的生物。在一些情况下，可以用使光合生物机构(photosyntheticapparatus)的全部或部分不可操作的本披露的构建体或载体来转化光合生物。
作为举例，可以将非维管光合微藻种类(例如莱茵衣藻、海洋微绿球藻、盐生微绿球藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻、小球藻、以及海洋单细胞绿藻)基因工程化，以生产感兴趣的多肽，例如一种壳梭孢菌素二烯(fusicoccadiene)合成酶或一种FPP合成酶。通过将这些微藻工程化以在藻类叶绿体或细胞核中表达壳梭孢菌素二烯合成酶或PP合成酶，可以实现在这些微藻中产生壳梭孢菌素二烯合成酶或FPP合成酶。
在其他实施方案中，该宿主生物是一种维管植物。这类植物的非限制性实例包括多种单子叶植物和双子叶植物，包括高油种子植物例如高油种子芸苔属(例如，黑芥、欧洲油菜、白芥、芜青、白菜型油菜、埃塞俄比亚芥、以及芥菜型油菜)、黄豆(Glycinemax)、蓖麻子(Ricinuscommunis)、棉花、红花(Carthamustinctorius)、向日葵(Helianthusannuus)、亚麻(Linumusitatissimum)、玉米(Zeamays)、椰子(Cocosnucifera)、棕榈(Elaeisguineensis)，油坚果树如橄榄(Oleaeuropaea)、芝麻、和花生(Arachishypogaea)，以及拟南芥属、烟草、小麦、大麦、燕麦、苋菜、马铃薯、水稻、番茄、以及豆类(例如豌豆、菜豆、小扁豆、苜蓿等)。
该宿主细胞可以是原核的。本披露的一些原核生物的实例包括但不限于：蓝细菌(例如，聚球藻、集胞藻、旋藻、组囊藻、鱼腥藻、念珠藻、螺旋藻、夫列藻、粘球藻、颤藻以及假鱼腥藻)。适当的原核细胞包括但不限于任何以下多种实验室菌株：大肠杆菌、乳酸菌、沙门菌、以及志贺菌。(例如，如Carrier等人(1992)《免疫学期刊》(J.Immunol.)148：1176-1181；美国专利号6,447,784；以及Sizemore等人(1995)《科学》(Science)270：299-302中说明的)。可以用于本披露中的沙门氏菌菌株的实例包括但不限于伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌。适合的志贺菌株包括但不限于弗氏志贺菌、索氏志贺菌、以及痢疾志贺菌。典型地，该实验室菌株是非致病性菌株。其他适合的细菌的非限制性实例包括但不限于：恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、mevalonii假单胞菌(Pseudomonasmevalonii)、类球红细菌、荚膜红细菌、深红红螺菌、以及红球菌属。
在一些实施方案中，该宿主生物是真核的(例如，绿藻、红藻、褐藻)。在一些实施方案中，该藻类是一种绿藻类，例如一种绿藻(Chlorophycean)。该藻类可以是单细胞的或多细胞的。适合的真核宿主细胞包括但不限于酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、以及藻类细胞。适合的真核宿主细胞包括但不限于：巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、koclamae毕赤酵母(Pichiakoclamae)、膜醭毕赤酵母、opuntiae(opuntiae毕赤酵母)、耐热毕赤酵母、柳毕赤酵母、guercuum毕赤酵母(Pichiaguercuum)、皮杰普毕赤酵母、树干毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、斯巴达克毕赤酵母、酿酒酵母、酵母菌属、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属、乳酸克鲁维酵母、白色念珠菌、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、lucknowense金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、镰孢霉属、禾谷镰孢菌、镶片镰孢菌(Fusariumvenenatum)、粗糙脉孢菌、以及莱茵衣藻。
在一些实施方案中，将真核微藻，例如像衣藻、团藻、杜氏藻、栅藻、小球藻属、或红球藻种类用于披露的方法中。在其他实施方案中，宿主细胞是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、海洋微绿球藻、盐生微绿球藻、二形栅藻、小球藻、绿色杜氏藻、或海洋单细胞绿藻。
在一些情况下，该生物是红藻、绿藻、不等长鞭毛藻(heterokontophyte)、黄绿藻(tribophyte)、灰藻(glaucophyte)、chlorarachniophyte、眼虫藻(euglenoid)、定鞭藻(haptophyte)、隐藻(cryptomonad)、双鞭藻(dinoflagellum)、或浮游微藻(phytoplankton)。
在一些情况下，宿主生物是维管和光合性的。维管植物的实例包括但不限于被子植物、裸子植物、红藻门植物、或其他维管植物。
在一些情况下，宿主生物是非维管性和光合性的。如在此所使用，术语“非维管光合生物”是指任何宏观或微观生物，其包括但不限于藻类、蓝细菌和光合细菌，其不具有如在维管植物中发现的维管系统。非维管光合生物的实例包括苔藓，例如地钱门植物(marchantiophyte)或角苔门植物(anthocerotophyte)。在一些情况下，该生物是一种蓝细菌。在一些情况下，该生物是藻类(例如巨藻或微藻)。该藻类可以是单细胞或多细胞藻类。例如，可以用一种载体或它的一个线性部分转化微藻莱茵衣藻，从而编码一种或多种感兴趣的蛋白质(例如一种涉及类异戊二烯生物合成途径的蛋白质)。
藻类转化的方法在美国临时专利申请号60/142,091中进行了说明。本披露的方法可以使用藻类例如微藻莱茵衣藻来进行。根据本披露的方法使用微藻来表达肽或蛋白复合物提供的优点是，可以使大量微藻生长(包括商业上的(Cyanotech公司；Kailua-KonaHI))，因此允许生产并且如果希望的话分离大量的所希望的产物。
本披露的载体也许能够稳定地或瞬时地转化多种光合生物，包括但不限于：光合细菌(包括蓝细菌)、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、甲藻门、不等鞭毛门、黄绿藻植物门(tribophyta)、灰色藻门(glaucophyta)、chlorarachniophytes、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门(包括硅藻)、隐藻门、隐藻、甲藻门、双鞭藻门、定鞭金藻门(pyrmnesiophyta)、硅藻门、黄藻门、黄绿藻门(eustigmatophyta)、针胞藻门(raphidophyta)、褐藻门、以及浮游植物。本披露的其他载体能够稳定地或瞬时地转化例如莱茵衣藻、海洋微绿球藻、盐生微绿球藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻、或海洋单细胞绿藻。
适当宿主的实例包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO、COS或Bowes黑色素瘤；腺病毒类；以及植物细胞类。适当宿主的选择被认为是在本领域的技术人员的了解范围内。
将如在此说明的选择和分离的多核苷酸引入到适合的宿主细胞内。适合的宿主细胞是能够促进重组和/或还原性再分布(reductivereassortment)的任何细胞。选择的多核苷酸可以是例如在包括适当控制序列的载体中。宿主细胞可以是例如一种高等真核细胞，如一种哺乳动物细胞，或低等真核细胞如酵母细胞，或该宿主细胞可以是一种原核细胞如一种细菌细胞。可以通过例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔来进行将构建体(载体)引入宿主细胞中。
重组多肽(包括蛋白复合物)可以表达于植物中，允许生产这类植物作物并且因此能够方便地生产大量的所希望的产物。因此，可以使用任何植物来实践本披露的方法，包括例如微藻和巨藻(例如海藻和海草)以及在土壤中生长的植物。
在一个实施方案中，该宿主细胞是一种植物。术语“植物”在此广泛地用来指含有质体(如叶绿体)的一种真核生物，并且包括处于发育任何阶段的任何这类生物、或指植物的一部分，包括植物插条、植物细胞、植物细胞培养物、植物器官、植物种子、以及小植株。植物细胞是植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单细胞或培养的细胞的形式，或可以是高等组织单位的一部分，例如植物组织、植物器官、或植物。因此，植物细胞可以是一种原生质体、配子产生细胞、或再生成全植物的一个细胞或细胞集合。像这样，包括多个植物细胞并且能够再生成全植物的种子被认为是用于本披露目的的植物细胞。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织、或组织成结构或功能单位的任何其他植物细胞群。特别有用的植物部分包括可收获部分以及用于繁殖子代植物的部分。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，例如花、花粉、幼苗、块茎、叶、茎、果实、种子、以及根。用于繁殖的植物的一个部分包括例如种子、果实、插条、幼苗、块茎、以及根茎。
本披露的方法可以产生含有基因组DNA(例如，核和/或质体基因组DNA)的植物，该植物被基因修饰以含有稳定整合的多核苷酸(例如，Hager和Bock，《应用微生物生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)54：302-310，2000中所说明的)。因此，本披露进一步提供了含有一个或多个叶绿体的一种转基因植物例如莱茵衣藻，这个或这些叶绿体含有编码一个或多个外源或内源多肽(包括可以允许分泌燃料产物和/或燃料产物前体(例如，类异戊二烯、脂肪酸、脂质、甘油三酯)的多肽)的多核苷酸。本披露的光合生物包括被修饰成产生例如一种燃料产物或一种燃料产物前体的至少一种宿主细胞。
用于所披露的实施方案中的一些宿主生物是，例如极端微生物，如超嗜热菌、嗜冷性细菌、低溫菌、嗜盐微生物、嗜压微生物以及嗜酸菌。可以用于实践本披露的一些宿主生物是嗜盐的(例如，盐生杜氏藻、绿色杜氏藻、或海洋单细胞绿藻)。例如，盐生杜氏藻可以生长在海水和盐湖(例如盐度从千分之30至千分之300)以及高盐度培养基(例如人工海水培养基、海水营养琼脂、半咸水培养基、以及海水培养基)中。在本披露的一些实施方案中，表达本披露蛋白的宿主细胞可以生长于液体环境中，该液体环境是例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3摩尔或更高浓度的氯化钠。本领域普通技术人员应当理解的是其他盐(钠盐、钙盐、钾盐、或其他盐)也可以存在于这些液体环境中。
当嗜盐生物用于本披露中时，可以用在此所述的任何载体将其转化。例如，可以用能够插入叶绿体或核基因组中的并且含有编码一种蛋白质(例如，一种FPP合成酶或一种壳梭孢菌素二烯合成酶)的核酸的载体转化盐生杜氏藻。然后可以使转化的嗜盐生物生长于高盐环境中(例如盐湖、盐池、以及高盐培养基)以产生感兴趣的产物(例如，脂质)。产物的分离可以涉及在从该生物中提取产物之前从高盐环境中移出转化的生物。在产物分泌到周围环境中的情况下，在对产物进行任何进一步处理之前，使该液体环境脱盐可能是必需的。
本披露进一步提供了包括遗传修饰的宿主细胞的组合物。组合物包括一种遗传修饰的宿主细胞，并且在一些实施方案中可以包括一个或多个另外的组分，这些组分是部分基于预期使用遗传修饰的宿主细胞而选择的。适合的组分包括但不限于盐类、缓冲剂、稳定剂、蛋白酶抑制剂、细胞膜-和/或细胞壁保护性化合物，例如甘油和二甲基亚砜、以及适合于该细胞的营养培养基。
为了生产蛋白质，例如一种类异戊二烯或类异戊二烯前体化合物，宿主细胞可以是例如产生或已经被基因修饰用来产生在异戊二烯基转移酶途径和/或甲羟戊酸酯途径和/或类异戊二烯生物合成途径中的一种或多种酶的一种细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是产生异戊二烯基转移酶、类异戊二烯合成酶或甲羟戊酸酯途径酶的底物的一种细胞。
在一些实施方案中，基因修饰宿主细胞是包括内源甲羟戊酸酯途径和/或类异戊二烯生物合成途径和/或异戊二烯基转移酶途径的一种宿主细胞。在其他实施方案中，基因修饰宿主细胞是这样一种宿主细胞，该宿主细胞在通常不经由甲羟戊酸途径产生甲羟戊酸酯，或经由异戊二烯基转移酶途径产生FPP、GPP或GGPP，但是已经用包括编码一个或多个甲羟戊酸途径、类异戊二烯合成酶途径或异戊二烯基转移酶途径的酶的核苷酸序列的一个或多个多核苷酸基因修饰(例如，如美国专利公开号2004/005678、美国专利公开号2003/0148479、以及Martin等人(2003)《自然生物技术》(Nat.Biotech.)21(7)：796-802中所述)。
细胞或生物的培养
可以使生物在多种条件下生长，这些条件允许光合作用，然而，这不是必要条件(例如，可以在缺乏光的情况下使宿主生物生长)。在一些情况下，能够以这样一种方式对宿主生物进行基因修饰，即它的光合能力被减小或破坏。在其中宿主生物不能光合作用的生长条件下(例如，由于缺乏光和/或遗传修饰)，典型地，将必需营养素提供给生物以支持在缺乏光合作用下的生长。例如，生物生长于其中(或其上)的培养基可以添加有任何需要的营养素，包括有机碳源、氮源、磷源、维生素、金属、脂质、核酸、微量营养素、和/或生物特异性需要物。有机碳源包括宿主生物能够代谢的任何碳源，包括但不限于乙酸盐、简单的碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、以及乳糖)、复杂的碳水化合物(例如，淀粉和糖原)、蛋白质、和脂质。本领域的技术人员应当认识到的是，不是所有生物都能够充分代谢特定的营养素，并且从一种生物至另一种生物可能需要改变营养素混合物，以提供适当的营养素混合物。
生物的最佳生长通常发生在大约20℃至大约25℃的温度下，虽然一些生物仍然可以生长在高达约35℃的温度下。活性生长典型地在液体培养物中完成。如果生物在液体培养基中生长并且被摇动或混合，在静止期在任何地方的细胞密度可以是从大约1至5×108细胞/ml。例如，对于衣藻而言在静止期的细胞密度可以是大约1至5×107细胞/ml；对于微绿球藻而言在静止期的细胞密度可以是大约1至5×108细胞/ml；对于栅藻而言在静止期的细胞密度可以是大约1至5×107细胞/ml；并且对于小球藻而言在静止期的细胞密度可以是大约1至5×108细胞/ml。静止期的示例性细胞密度如下：衣藻可以是大约1×107细胞/ml；微绿球藻可以是大约1×108细胞/ml；栅藻可以是大约1×107细胞/ml；并且小球藻可以是大约1×108细胞/ml。示例性的生长速率可以例如每天产生细胞的两倍至四倍增加(取决于生长条件)。此外，生物的倍增时间可以例如是5小时至30小时。生物还可以在固体培养基上生长，例如在平板中或斜面上含有大约1.5％琼脂的培养基。
能源是荧光灯，该荧光灯可以置于例如距离该生物大约1英寸至大约两英尺的距离。荧光类型的实例包括例如冷白光和日光。用空气或CO2鼓泡提高生物的生长速率。用CO2鼓泡可以例如用1％至5％的CO2。如果以规则的间隔(例如，12∶12或14∶10小时的明∶暗)将光开启和关闭，一些生物的细胞将变得同步。
通过将生物划线到平板上，用例如ParafilmTM来密封培养皿，并且将它们置于在大约10℃至大约18℃下的暗光下，可以实现生物的长期储存。可替代地，能够以划线或针刺的方式使生物在琼脂管中生长，加盖，并且在大约10℃至大约18℃下储存。这两种方法允许生物储存数月。
为了更长时间的储存，可以使生物在液体培养物中生长至对数期的中至晚期，进而添加穿透性冷冻保护剂例如DMSO或MeOH，并且储存在低于-130℃下。可以使用的DMSO浓度的一个示例性范围是5％至8％。可以使用的MeOH浓度的一个示例性范围是3％至9％。
为了更长时间储存，可以使生物生长在限定的基本培养基上(例如，高盐培养基(HSM)、改良人工海水培养基(MASM)、或F/2培养基)，以光线作为唯一能源。在其他情况下，可以使生物生长在培养基中(例如，三羟甲基氨基甲烷乙酸磷酸盐(TAP)培养基)，并且补充有有机碳源。生物(如藻类)可以自然生长于淡水或海水中。用于淡水藻类的培养基可以是例如合成培养基、富集培养基、土壤水培养基、以及固化培养基，如琼脂。不同的培养基已经被开发并且用于分离和培养淡水藻类并且在Watanabe，M.W.(2005).FreshwaterCultureMedia.InR.A.andersen(Ed.)，AlgalCulturingTechniques(pp.13-20).ElsevierAcademicPress中进行了说明。用于海藻的培养基可以是例如人工海水培养基或天然海水培养基。制备培养基的指南在Harrison，P.J.andBerges，J.A.(2005).MarineCultureMedia.InR.A.andersen(Ed.)，AlgalCulturingTechniques(pp.21-33).ElsevierAcademicPress中进行了说明。
生物可以生长在户外开放水域中，如池塘、洋、海、河、水床、沼泽、浅水池、湖、渡槽、以及水库。当生长在水中时，生物可以被包含在盐样物体(halo-likeobject)中，包括lego样颗粒(lego-likeparticle)。盐样物体环绕该生物并且允许它保持来自水下的营养素同时将它保持在开放的日光中。
在一些情况下，可以使生物生长在容器中，其中每个容器包括一种或两种生物、或多种生物。这些容器可以被配置成漂浮在水上。例如，可以用空气和水的组合来填充一个容器使该容器和在其中的该一种或多种生物有浮力。因此可以使适合生长在淡水中的生物生长在盐水中(例如，海洋)并且反之亦然。如果存在对容器的任何损害时，这个机制允许生物自动死亡。
用于藻类的培养技术是本领域的技术人员熟知的并且例如在FreshwaterCultureMedia.InR.A.andersen(Ed.)，AlgalCulturingTechniques.ElsevierAcademicPress中进行了说明。
由于光合生物(例如藻类)需要日光、CO2和水用于生长，可以将它们培养在例如开放的池塘和湖中。然而，与封闭系统相比较，这些开放系统更易受到污染的影响。使用开放系统的一个挑战是，感兴趣的生物可能不如潜在的侵入物生长得快。当另一种生物侵入感兴趣的生物正生长于其中的液体环境时，这成为一个问题，并且该侵入的生物具有更快的生长速率并且占据了该系统。
此外，在开放系统中，对水温、CO2浓度、以及采光条件存在较少的控制。生物的生长期主要依赖于位置，并且除了热带地区之外，限定于年度中较温暖的月份。此外，在开放系统中，可以生长的不同生物的数量限于在选择的位置中能够存活的那些。然而，与封闭系统相比较，开放系统可以更廉价地建立和/或维持。
培养生物的另一种方法是使用半封闭系统，例如用一种结构(例如一种“温室型”结构)覆盖池塘或水池。同时这可以导致较小的系统，它解决了与开放系统相关的许多问题。半封闭系统的优点是它可以允许更大数量的不同生物生长，通过针对侵入生物生长所需营养素，允许感兴趣的生物竞争超过侵入生物，它可以允许生物比侵入生物占优势，并且它可以延长该生物的生长期。例如，如果将该系统加热，该生物可以整年生长。
池塘系统的一个变更是一种人工池塘，例如一种跑道池。在这些池塘中，生物、水、和营养素围绕一个“跑道”循环。明轮为跑道中的液体提供恒定运动，允许以选定的频率使生物循环返回到液体表面。明轮还提供了一种搅拌源并且将该系统氧合。这些跑道池可以封闭在例如一个建筑物或温室中，或可以位于室外。
跑道池通常被保持浅的状态因为需要将生物暴露于日光，并且日光仅能够穿透池塘水到达有限深度。跑道池的深度可以是例如大约4英寸至大约12英寸。此外，可以包含在跑道池中的液体的体积可以是例如大约200升至大约600,000升。
跑道池能够以连续方式来操作，例如将CO2和营养素恒定地喂入池塘中，同时在另一端将含生物的水移开。
如果将跑道池置于室外，存在数种不同途径来解决不需要的生物的侵入。例如，所希望的生物位于其中的液体的pH或盐度可以是这样的，其使得侵入生物减慢其生长或死亡。
而且，可以将化学品添加到液体中，如漂白粉，或可以将杀虫剂(如草甘磷)添加到该液体中。此外，可以对感兴趣的生物进行基因修饰，使得它更好地适合于在该液体环境中存活。可以使用上述策略的任何一项或多项来解决不需要的生物的侵入。
可替代地，可以使生物(如藻类)生长于封闭结构如光生物反应器中，其中该环境是处于比开放系统或半封闭系统更严格的控制下。光生物反应器是一种结合了某一类型的光源的生物反应器，以将光子能量输入提供到反应器中。术语光生物反应器可以指相对于环境而被封闭的并且与该环境无气体和污染物直接交换的一个系统。光生物反应器可以被描述为一个封闭的、光照的培养容器，其被设计用于光养液体细胞悬液培养物的受控的生物质产生。光生物反应器的实例包括例如玻璃容器、塑料管、槽、塑料套管、以及袋。可以用来提供维持光合作用所需能量的光源的实例包括例如荧光灯泡、LED、以及天然日光。因为这些系统是封闭的，生物生长所需要的所有事物(例如，二氧化碳、营养素、水、以及光)必须被引入该生物反应器中。
光生物反应器(尽管建立和维持它们的成本不同)具有多个胜过开放系统的优点，例如它们可以防止污染或将污染降至最低，允许单种培养(仅由一种生物种类组成的一种培养物)的无菌性生物培养，对培养条件(例如，pH、光、二氧化碳、以及温度)提供更好的控制，防止水分蒸发，降低了由于放气造成的二氧化碳损耗，并且允许更高的细胞浓度。
另一方面，光生物反应器的某些要求，如冷却、混合、氧积累以及生物污垢的控制，使得这些系统比开发系统或半封闭系统的建立和操作费用更高。
可以建立光生物反应器以便连续收获(当用大多数的较大体积的培养系统时)或一次一批地收获(例如，当用聚乙烯袋培养时)。用例如营养素、一种生物(例如藻类)、以及水来建立序批式光生物反应器，并且允许该生物生长直至将该批次被收获。可以例如连续地、每日地、或以固定时间间隔对连续光生物反应器进行收获。
高密度光生物反应器在例如Lee等人《生物技术与生物工程》(Biotech.Bioengineering)44：1161-1167，1994中进行了说明。其他类型的生物反应器，如用于污水和废水处理的那些，在Sawayama等人《应用微生物学和生物技术》Appl.Micro.Biotech.，41：729-731，1994中进行了说明。光生物反应器的另外实例在美国申请公开号2005/0260553、美国专利号5,958,761、以及美国专利号6,083,740中进行了说明。而且，可以对生物(如藻类)进行大量培养用于从水、土壤、或其他来源或样品中除去重金属(例如，如Wilkinson，《生物技术通讯》(Biotech.Letters)，11：861-864，1989中所述)、氢(例如，如美国专利申请公开号2003/0162273中所述)、以及药物化合物。还可以在常规的发酵生物反应器中培养生物，这些生物反应器包括但不限于分批、分批补料、细胞再循环、以及连续发酵罐。培养生物的另外方法以及在此所述方法的变体是本领域的技术人员已知的。
还可以使生物在乙醇生产工厂或产生CO2的其他设施或区域(例如城市和公路)附近生长。像这样，在此所述的方法考虑了用于将碳信用销售给乙醇工厂或产生CO2的其他设施或区域的商业方法，同时通过使在此所述的一种或多种生物在乙醇生产工厂、设施、或区域附近生长来制造燃料或燃料产物。
生长于在此所述的任何这些系统中的感兴趣的生物可以例如被连续地收获，或一次一批地收获。
可以例如通过从含有生物的液体表面下鼓泡通入CO2将CO2递送到在此所述的任何一个系统中。而且，可以使用喷雾来将CO2注入液体中。喷雾器是例如也称为鼓泡器、碳酸化器、充气器、多孔石以及扩散器的多孔盘或管组件。
可以用于在此所述的系统中的营养素包括例如氮(处于NO3 -或NH4 +的形式)、磷、以及微量金属(Fe、Mg、K、Ca、Co、Cu、Mn、Mo、Zn、V、以及B)。营养素能够以例如固体形式或以液体形式提供。如果营养素处于固体形式，在递送到含有生物的液体中之前，或递送到光生物反应器之前可以将它们与例如淡水或盐水混合。
可以使生物以培养物的形式生长，例如大规模培养，其中大规模培养是指是培养物生长于大于约6升，或大于约10升，或大于约20升体积中。大规模生长还可以是使培养物生长于50升或更多、100升或更多、或200升或更多的体积中。大规模培养可以是使培养物生长于例如池塘、器皿、容器、或其他区域中，其中含有该培养物的池塘、器皿、容器、或区域是面积例如至少5平方米、至少10平方米、至少200平方米、至少500平方米、至少1,500平方米、至少2,500平方米，或更大。
衣藻、微绿球藻、栅藻、以及小球藻是可以如在此所述进行培养并且可以在广泛排列的条件下生长的示例性藻类。
可以如在此所述进行培养的一种生物是一种常用的实验室种类莱茵衣藻。这个种类的细胞是单倍体，并且可以在无机盐的简单培养基上生长，使用光合作用来提供能量。如果提供乙酸盐作为碳源，这种生物还可以生长在完全黑暗中。在标准荧光灯下在室温下莱茵衣藻可以容易地生长。此外，可以通过将它们置于明-暗周期中使这些细胞同步。培养莱茵衣藻细胞的其他方法是本领域的技术人员已知的。
多核苷酸和多肽
与未工程化生物相比较，除了基因工程化成例如耐盐、抗除草剂、或抗次氯酸钠之外，可以将宿主细胞或宿主生物进一步修饰成表达一种外源或内源蛋白质，例如一种涉及类异戊二烯生物合成途径的蛋白质或一种涉及脂肪酸、甘油脂类、或油类的积累和/或分泌的蛋白质。
还提供了编码在此所述的一种蛋白质，例如一种FPP合成酶的分离的多核苷酸。如在此是使用的“分离的多核苷酸”表示这样一种多核苷酸，它不含有在该多核苷酸从中得到的该生物的天然发生的基因组中的多核苷酸的侧翼的核苷酸序列之一或两者。该术语包括例如一个多核苷酸或其片段，该多核苷酸或其片段结合到一个载体或表达盒中；结合到自主复制的质粒或病毒中；结合到原核生物或真核生物的基因组DNA中；或作为独立于其他多核苷酸的分离的分子而存在。它还包括一个重组多核苷酸，该重组多核苷酸是杂交多核苷酸，例如编码多肽序列的杂交多核苷酸的一部分。
可以通过本领域已知的任何方法来制造本披露的蛋白质。可以使用固相肽合成或者通过作为液相肽合成同样已知的经典的溶液肽合成来合成该蛋白质。使用Val-Pro-Pro、乙丙脯氨酸以及苯丁酸赖脯酸作为起始模板，可以使用固相或液相肽合成来合成若干系列的肽类似物，如X-Pro-Pro、X-Ala-Pro、以及X-Lys-Pro，其中X代表任何氨基酸残基。还已经说明了用于进行结合到可溶性低聚物载体上的肽和寡核苷酸文库的液相合成的方法。Bayer，Ernst和Mutter，Manfred，《自然》(Nature)237：512-513(1972)；Bayer，Ernst等人《美国化学协会期刊》(J.Am.Chem.Soc.)96：7333-7336(1974)；Bonora，GianMaria等人《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)18：3155-3159(1990)。液相合成法具有胜过固相合成法的优点，因为液相合成法不需要在一个第一反应物上存在适合于将该反应物附连到该固相上的结构。而且，液相合成法不需要避免可能切割固相和该第一反应物(或中间产物)之间的键的化学条件。此外，与多相的固相/液相系统中得到的那些(如在固相合成中存在的那些)相比较，均相溶液中的反应可以给出更好的产量和更完全的反应。
在寡聚物支持的液相合成中，生长的产物被附连到一个大的可溶性聚合物基团上。然后可以基于在较大聚合物附连的产物与未反应的反应物之间在尺寸上的较大差异从未反应的反应物中分离出每一合成步骤中的产物。这允许在非均相溶液中进行反应，并且消除了与传统液相合成相关联的繁琐的纯化步骤。寡聚物支持的液相合成还可以适合于肽的自动液相合成。Bayer，Ernst，等人《肽：化学、结构、生物学》(Peptides：Chemistry，Structure，Biology)，426-432。
对于固相肽合成而言，该步骤能够将适当的氨基酸依次组装到具有所希望的序列的肽中，同时使增长的肽末端连接到一个不溶性载体上。通常，肽的羧基末端连接到当用切割试剂处理时可以将它释放的一种聚合物上。在常规方法中，一个氨基酸被结合到一个树脂颗粒上，并且通过依次添加保护氨基酸以逐步的方式产生肽，从而生产氨基酸的一个链。通常使用Merrifield所述的技术的修改形式。参见例如Merrifield，《美国化学协会期刊》(J.Am.Chem.Soc.)96：2989-93(1964)。在自动固相方法中，通过将羧基端氨基酸加载到有机接头上(例如PAM，4-氧甲基苯基乙酰氨基甲基)来合成肽，该有机接头共价连接到一个与二乙烯基苯交联的不溶性聚苯乙烯树脂上。可以通过用叔丁氧羰基封闭来保护末端胺。羟基和羧基基团通常通过用O-苄基基团封闭来保护。在自动化肽合成仪中实现合成，例如从AppliedBiosystems(福斯特市，加利福尼亚州)可得到的合成仪。合成之后，可以将产物从树脂中移出。根据已建立的方法通过使用氢氟酸或三氟甲基磺酸将封闭基团去除。常规合成可以生产0.5mmole肽树脂。在切割和纯化之后，典型地产生大致60％至70％的产率。通过例如从有机溶剂(如甲基丁基醚)中结晶肽，然后溶于蒸馏水中，并且使用透析(如果受主题肽的分子量大于约500道尔顿)或反向高压液相色谱法(例如使用C18柱，用0.1％三氟乙酸和乙腈作为溶剂)(如果该肽的分子量小于500道尔顿)来完成产物肽的纯化。可以将纯化的肽冻干并且以干燥状态储存直至使用。可以使用分析型高压液相色谱(HPLC)和电喷射质谱(ES-MS)的常规方法来完成生成的肽的分析。
在其他情况下，通过重组方法生产蛋白质，例如涉及类异戊二烯生物合成途径或涉及脂肪酸合成的蛋白质。为了生产在此所述的任何一种蛋白质，可以使用转化有含编码这样的蛋白质的多核苷酸的表达载体的宿主细胞。该宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，如酵母或藻类细胞，或该宿主可以是一种原核细胞，如一种细菌细胞。可以通过多种方法来完成将表达载体引入宿主细胞中，这些方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺、原生质体融合、脂质体、直接显微注射到细胞核中、划痕荷载(scrapeloading)、生物射弹转化以及电穿孔。从重组生物中大规模生产蛋白质是在商业规模上实践的良好建立的方法并且也是在本领域的技术人员的能力范围之内的。
应当认识到的是，本披露不限于含有在此披露的一种或多种蛋白质的转基因细胞、生物、以及质体，但是还可以包括转化有编码涉及脂肪酸合成的酶的另外的核苷酸序列的这类细胞、生物、以及质体。因此，一些实施方案涉及引入编码除了在此披露的蛋白质之外的涉及脂肪酸合成的蛋白质的一种或多种序列。例如，可以直接地或者间接地连接脂肪酸生产途径中的数种酶，使得通过该途径中的一种酶产生的产物一旦产生，就紧密接近该途径中的下一个酶。这些另外的序列可以包含在一个单一载体中，该单一载体可操作地连接到一个单一启动子上或连接到多个启动子上，例如每个序列一个启动子。可替代地，可以将另外的编码序列包含在多个另外的载体中。当使用多个载体时，可以同时地或依次地将它们引入宿主细胞或生物中。
另外的实施方案提供了一种质体，并且具体地是一种叶绿体，它转化有编码本披露的蛋白质的一种多核苷酸。可以使用在此所述的任何一种方法或本领域已知的其他方法将该蛋白质引入质体的基因组中。可以将质体包含在它自然发生在其中的生物中。可替代地，该质体可以是一种分离的质体，即已经从它通常发生于其中的细胞中取出的一种质体。用于分离质体的方法是本领域已知的并且可以例如在Maliga等人，《植物分子生物学方法》(MethodsinPlantMolecularBiology)，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，1995；Gupta和Singh，《生物科学期刊》(J.Biosci.)，21：819(1996)；以及Camara等人，《植物生理学》(PlantPhysiol.)，73：94(1983)中找到。可以将转化有本披露蛋白质的分离的质体引入宿主细胞中。宿主细胞可以是天然包含该质体的一种细胞或其中该质体并未自然发现于其中的一种细胞。
含有编码本披露的蛋白质中的任何一种或多种的核苷酸序列的人工质体基因组(例如叶绿体基因组)也在本披露的范围之内。用于组装人工质体基因组的方法可以在于2008年10月6日提交的共同未决的美国专利申请序列号12/287,230(作为美国专利号2009/0123977于2009年5月14日公开)，以及于2009年4月8日提交的美国专利申请序列号12/384,893(作为美国专利号2009/0269816于2009年10月29日公开)中找到，通过引用将它们各自以其全部内容结合在此。
将多核苷酸引入宿主生物或细胞中
为了产生基因修饰宿主细胞，使用多种已建立的技术将多核苷酸、或克隆到载体中的多核苷酸稳定地或瞬时地引入宿主细胞中，这些技术包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、以及脂质体介导的转染。为了转化，本披露的多核苷酸通常可以进一步包括一个选择标记，例如几种熟知的选择标记中的任何一种，如新霉素抗性、氨苄青霉素抗性、四环素抗性、氯霉素抗性、以及卡那霉素抗性。
可以使用本领域已知的任何方法将在此所述的多核苷酸或重组核酸分子引入细胞中(例如，藻类细胞)。多核苷酸可以通过本领域熟知的多种方法引入细胞中并且部分地基于特定的宿主细胞而将其选择。例如，使用直接基因转移法，如电穿孔或使用粒子枪的微粒介导的(生物射弹)转化、或“玻璃珠法”或通过花粉介导的转化、脂质体介导的转化、使用创伤的或酶降解的未成熟胚或创伤的或酶降解的胚性愈伤组织进行的转化，可以将多核苷酸引入至细胞(例如，如Potrykus，Ann.Rev.Plant.Physiol.PlantMol.Biol.42：205-225，1991中所述)中。
如上面讨论的，可以使用微弹介导的转化将一种多核苷酸引入细胞中(例如，如Klein等人，《自然》(Nature)327：70-73，1987中所述)。该方法利用微粒，如金或钨，通过氯化钙、精脒或聚乙二醇沉淀用所希望的多核苷酸将其包被。用设备如生物射弹PD-1000粒子枪(BioRad；Herculescalif.)，将微粒粒子以高速加速进入细胞中。使用生物射弹法进行转化的方法是本领域熟知的(例如，如Christou，《植物科学趋势》(TrendsinPlantScience)1：423-431，1996中所述)。例如已经使用了微粒介导的转化来产生多种转基因植种类，包括棉花、烟草、玉米、杂交白杨以及木瓜。也使用微粒介导的递送方法对多种重要的谷类作物如小麦、燕麦、大麦、高粱以及水稻进行了转化(例如，如Duan等人，《自然生物技术》(NatureBiotech.)14：494-498，1996；以及Shimamoto，《生物技术新观点》(Curr.Opin.Biotech.)5：158-162，1994中所述)。上以用所述的方法转化大多数双子叶植物是可能的。单子叶植物的转化也可以使用例如如以上所述的生物射弹法、原生质体转化、部分透化细胞的电穿孔、使用玻璃纤维的DNA引入、以及玻璃珠搅拌法进行转化。
用于在光合微生物中的转化和表达的基本技术类似于通常用于大肠杆菌、酿酒酵母以及其他种类中的那些。专门用于光合微生物(例如藻类菌株的叶绿体)的转化方法是本领域已知的。这些方法在标准分子生物学操作的多个文本中进行了说明(参见Packer&Glaser，1988，“蓝细菌”，《酶学方法》(Meth.Enzymol.)，Vol.167；Weissbach&Weissbach，1988，“植物分子生物学方法，”科学院出版社(AcademicPress)，纽约(NewYork)，Sambrook，Fritsch&Maniatis，1989，《分子克隆实验手册》(″MolecularCloning：Alaboratorymanual，″)第二版(2ndedition)冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约(N.Y.)；以及ClarkMS，1997，《植物分子生物学》(PlantMolecularBiology)，Springer，纽约(N.Y.))。这些方法包括例如生物射弹设备(参见例如，Sanford，《生物技术趋势》(TrendsInBiotech.)(1988)6：299-302，美国专利号4,945,050；电穿孔(Fromm等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA))(1985)82：5824-5828)；激光束、电穿孔、显微注射或能够将DNA引人宿主细胞中任何其他方法的使用。
质体转化是用于将多核苷酸引入植物细胞叶绿体中的常规的并且熟知的方法(参见美国专利号5,451,513、5,545,817、以及5,545,818；WO95/16783；McBride等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA91：7301-7305，1994)。在一些实施方案中，叶绿体转化涉及引入在所希望的核苷酸序列的侧翼的叶绿体DNA的区域，从而允许将外源DNA同源重组到目标叶绿体基因组中。在一些情况下，可以使用1至1.5kb的叶绿体基因组DNA的侧翼核苷酸序列。使用这种方法，可以利用叶绿体16SrRNA和rps12基因中的点突变(它们可以赋予对大观霉素和链霉素的抗性)作为转化的选择标记(Svab等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)87：8526-8530，1990)，并且能够以目标叶的大致100分之一轰击的频率导致稳定的同质转化体。
促进在植物质体基因组中引入的DNA编码序列表达的时间和组织模式的控制的叶绿体转化/表达技术中的进一步精化已经在PCT国际公开WO95/16783以及美国专利5,576,198中进行了说明。这种方法涉及将构建体引入植物细胞中用于核转化，它们提供病毒单亚基RNA聚合酶的表达并且通过融合到质体转运肽上将这种聚合酶靶向到质体中。用包括对从可操作地连接到感兴趣的DNA编码区上的细胞核表达构建体中表达的RNA聚合酶具有特异性的病毒单亚基RNA聚合酶特异性启动子的DNA构建体转化质体允许在植物中以组织和/或发育特异性方式控制质体表达构建体，这些植物包括细胞核聚合酶构建体和这些质体表达构建体两者。可以将细胞核RNA聚合酶编码序列的表达置于组成型启动子或组织或发育阶段特异性启动子的控制下，由此将这种控制延伸到响应于质体靶向的、细胞核编码的病毒RNA聚合酶的质体表达构建体。
当使用核转化时，通过使用植物细胞核转化构建体可以对蛋白质进行修饰用于质体靶向，其中感兴趣的DNA编码序列融合到任何一个可供使用的转运肽序列上，该转运肽序列能够促进将编码的酶运送到植物载体中并且通过使用适当的启动子来驱动表达。可以通过将DNA编码质体例如叶绿体、白色体、造粉体、等转运肽序列融合到编码这些酶的DNA的5′端上来实现蛋白质的靶向。可以例如从植物细胞核编码的质体蛋白质获得编码转运肽区域的序列，如二磷酸核酮糖羧化酶小亚基(SSU)、EPSP合成酶、植物脂肪酸生物合成相关基因，包括脂肪酰基-ACP硫酯酶、酰基载体蛋白(ACP)、硬脂酰-ACP脱饱和酶、β-酮脂酰-ACP合成酶以及酰基-ACP硫酯酶、或LHCPII基因等。还可以从编码类胡萝卜素生物合成酶(如GGPP合成酶、八氢番茄红素合成酶、以及八氢番茄红素脱饱和酶)的核酸序列获得质体转运肽序列。其他转运肽序列披露于VonHeijne等人(1991)《植物分子生物学报告》(PlantMol.Biol.Rep.)9：104；Clark等人(1989)《生物化学期刊》(J.Biol.Chem.)264：17544；della-Cioppa等人(1987)《植物生理学》(PlantPhysiol.)84：965；Romer等人(1993)《生物化学与生物物理学研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)196：1414；以及Shah等人(1986)《科学》(Science)233：478中。另一种转运肽序列是来自衣藻的完整ACCase的序列(genbankEDO96563，氨基酸1-33)。在运送到质体中有效的转运肽的编码序列可以包括特定转运肽的编码序列的全部或部分，并且还可以含有与特定转运肽相关联的成熟蛋白质编码序列的多个部分。存在可以用来将目标蛋白递送到质体中的转运肽的许多实例，并且用于本披露中的特定转运肽编码序列不是关键性的，只要获得至质体中的递送即可。然后在质体内的蛋白酶解加工产生成熟的酶。例如，用涉及聚羟基烷酸酯生物合成的酶(Nawrath等人(1994)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91：12760)、以及新霉素磷酸转移酶II(NPT-II)和CP4EPSPS(Padgette等人(1995)《作物科学》(CropSci.)35：1451)已经证明这种技术是成功的。
令人感兴趣的是从已知的有待输入到种子白色体中的酶中得到的转运肽序列。包含有用的转运肽酶的实例包括与以下各项有关的那些：脂质生物合成(例如，质体靶向的双子叶乙酰-辅酶A羧化酶、生物素羧化酶、生物素羧基载体蛋白、α-羧基-转移酶、以及质体靶向的单子叶多功能乙酰辅酶A羧化酶(Mw，220,000)的亚基、脂肪酸合成酶复合体的质体亚基(例如，酰基载体蛋白(ACP)、丙二酰-ACP合成酶、KASI、KASII、以及KASIII)、硬脂酰-ACP脱饱和酶、硫酯酶(对于短、中、以及长链酰基ACP特异的)、质体靶向的酰基转移酶(例如，甘油-3-磷酸盐和酰基转移酶)、涉及天冬氨酸家族氨基酸的生物合成的酶类、八氢番茄红素合成酶、赤霉酸生物合成(例如，对映贝壳杉烯合成酶1和2)、以及类胡萝卜素生物合成(例如，番茄红素合成酶)。
真核藻类细胞的核转化可以是通过微粒介导的转化，或可以是通过原生质体转化、电穿孔、使用玻璃纤维引入DNA、或玻璃珠搅拌法(作为非限制性实例)(Kindle，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.SciencesUSA)87：1228-1232(1990)；Shimogawara等人，《遗传学》(Genetics)148：1821-1828(1998))。藻类核转化的标记包括但不限于拯救营养缺陷菌株的标记(例如，衣藻中的NIT1和ARG7；Kindle等人，《细胞生物学期刊》(J.CellBiol.)109：2589-2601(1989)，Debuchy等人EMBOJ.8：2803-2809(1989))、以及显性选择标记(例如，CRY1，aada；Nelson等人，《分子细胞生物学》(Mol.CellularBiol.)14：4011-4019(1994)，Cerutti等人，《遗传学》(Genetics)145：97-110(1997))。在一些实施方案中，敲除的存在被用作用作针对转化体的选择标记。在一些实施方案中敲除序列可以与编码有待由该藻类生产的蛋白质(例如，一种治疗蛋白、工业酶)或促进或增强商业、治疗、或营养产物的生产的蛋白质的一个第二序列共转化。在一些实施方案中该第二序列提供在与敲除序列相同的核酸构建体上，用于转化到藻类中，其中该敲除序列在活化感兴趣基因中的成功被用作选择标记。
在一些实施方案中，用编码感兴趣蛋白质的核酸转化藻类，该感兴趣蛋白质例如是异戊二烯基转移酶、类异戊二烯合成酶、或一种能够将前体转化成燃料产物或燃料产物前体(例如，一种类异戊二烯或脂肪酸)的酶。
在一个实施方案中，转化可以将一种核酸引入到宿主藻类的质体中(例如，叶绿体)。在另一些实施方案中，转化可以将一种核酸引入到宿主藻类的核基因组中。仍然在另一个实施方案中，转化可以将核酸引入核基因组以及质体两者中。
在引入外源核酸之之后，可以将转化的细胞铺板于选择性培养基上。这种方法还可以包括用于筛选的若干步骤。可以对初级转化体进行筛选，以确定哪些克隆具有外源核酸的正确插入。可以将显示正确整合的克隆繁殖并且再筛选，以确保遗传稳定性。这类方法确保这些转化体包含感兴趣的基因。在许多情况下，通过聚合酶链式反应(PCR)进行这样的筛选；然而，可以使用本领域已知的任何其他适当的技术。许多不同的PCR方法是本领域已知的(例如，巢式PCR，实时PCR)。对于任何给定的筛选，本领域的技术人员将认识到的是，可以改变PCR组分来实现最佳的筛选结果。例如，当在破碎的藻类细胞上进行PCR时可能需要向上调节镁浓度，向这些细胞(它们螯合镁)中加入镁以螯合有毒金属。在用适当整合的外源核酸筛选克隆之后，可以针对一种或多种编码蛋白和/或产物的存在对克隆进行筛选。可以通过Western印迹分析和/或酶活性测定进行蛋白质表达筛选。可以通过本领域已知的任何方法进行转运蛋白和/或产物筛选，该方法例如是ATP周转测定(turnoverassay)、底物转运测定、HPLC或气相色谱法。
可以通过将编码蛋白质或酶的一种多核苷酸序列(基因)插入到微藻的叶绿体或核基因组中来实现蛋白质或酶的表达。可以使修饰的微藻菌株同质化，以确保多核苷酸可以稳定地维持在所有后代的叶绿体基因组中。例如，当插入的基因存在于叶绿体基因组的所有拷贝中时，对于一种基因而言微藻是同质的。对本领域普通技术人员显而易见的是叶绿体可含有其基因组的多拷贝，因此，术语“同质的”或“同质性”是指感兴趣的特定基因座的所有拷贝是基本上相同的状态。质体表达(其中基因通过同源重组插入至存在于每个植物细胞中的环形质体基因组的所有数千个拷贝)利用相比于核表达的基因的巨大拷贝数优势，以允许表达水平能够容易超过总的可溶性植物蛋白的10％或更高。确定本披露生物的原生质状态的方法涉及针对在给定的感兴趣基因座处的外源核酸的存在和野生型核酸的缺乏来筛选转化体。
载体
贯穿本披露，构建体、载体和质粒可互换地使用。可以将编码在此所述的蛋白质的核酸包括在载体中，包括克隆载体和表达载体。克隆载体是用于将DNA片段转移到宿主细胞中的自主复制的DNA分子。三种常用类型的克隆载体是细菌质粒、噬菌体、以及其他病毒。表达载体是一种克隆载体，其被设计使得在特定位点处插入的克隆序列可以被转录和翻译成蛋白质。克隆和表达载体两者可以含有允许载体在一种或多种适合的宿主细胞中复制的核苷酸序列。在克隆载体中，该序列通常是使该载体能够独立于宿主细胞染色体而复制的一种序列，并且还包括复制起点或自主复制序列。
在一些实施方案中，使用本领域的技术人员已知的克隆技术将本披露的多核苷酸克隆或插入到一个表达载体中。可以通过许多种方法将这些核苷酸序列插入到载体中。在最常用的方法中，使用本领域的技术人员通常是已知的并且详见例如Sambrook等人，《分子克隆实验手册》(MolecularCloning，ALaboratoryManual)，第二版(2ndEd.)，冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress)，(1989)以及Ausubel等人，《精编分子生物学实验指南》(ShortProtocolsinMolecularBiology)，第二版(2ndEd.)，JohnWiley&Sons(1992)的步骤将这些序列插入一个或多个适当的限制性内切核酸酶位点中。
适合的表达载体包括但不限于：杆状病毒载体、噬菌体载体、质粒、噬菌粒、粘粒、福斯质粒(fosmid)、细菌人工染色体、病毒载体(例如，基于痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、以及单纯疱疹病毒的病毒载体)、基于PI的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体、以及对于感兴趣的特定宿主细胞具有特异性的任何其他载体(例如大肠杆菌和酵母)。因此，例如可以将编码FPP合成酶的一个多核苷酸插入许多种能够表达该酶的表达载体的任何之一中。这类载体可以包括例如染色体DNA序列、非染色体DNA序列以及合成DNA序列。
适合的表达载体包括染色体DNA序列、非染色体DNA序列、以及合成DNA序列，例如SV40衍生物类、细菌质粒类、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒类、从质粒和噬菌体DNA的组合衍生的载体、以及病毒DNA如牛痘苗病毒、腺病毒、鸡痘病毒、以及伪狂犬病毒。此外，可以使用在宿主中能够复制并且能存活的任何其他载体。例如，可以使用载体如Ble2A、Arg7/2A、以及SEnuc357用于表达蛋白质。
很多适合的表达载体是本领域的技术人员已知的。作为举例提供以下这些载体；对于细菌宿主细胞为：pQE载体(Qiagen)、pBluescript质粒、pNH载体、λ-ZAP载体(Stratagene)、pTrc99a、pKK223-3、pDR540、以及pRIT2T(Pharmacia)；对于真核宿主细胞为：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pET21a-d(+)载体(Novagen)、以及pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可以使用任何其他质粒或其他载体，只要它可与宿主细胞相容即可。
表达载体，或其线性部分，可以编码一个或多个外源或内源核苷酸序列。可以转化到宿主中的外源核苷酸序列的实例包括来自细菌、真菌、植物、光合细菌或其他藻类的基因。可以转化到宿主中的其他类型的核苷酸序列的实例包括但不限于：转运蛋白基因、产生类异戊二烯的基因、编码用两种磷酸盐产生类异戊二烯的蛋白质(例如，GPP合成酶和/或FPP合成酶)的基因、编码产生脂肪酸、脂质、或甘油三酯的蛋白质(例如ACC酶)的基因、内源启动子、以及来自psbA、atpA、或rbcL基因的5’UTR。在一些情况下，外源序列的侧翼为两个同源序列。
同源序列是例如与参考氨基酸序列或核苷酸序列(例如在宿主细胞中自然发现的氨基酸序列或核苷酸序列)具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％序列同一性的那些。该第一和第二同源序列能够将外源或内源序列重组到宿主生物的基因组中。该第一和第二同源序列可以具有至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、或至少1500个核苷酸长度。
该多核苷酸序列可以包括多种核苷酸序列，这些核苷酸序列对于正在被转化的生物中的表达是密码子偏倚的。熟练的技术人员应当熟知在使用核苷酸密码子来限定给定的氨基酸中通过特定宿主细胞展示的“密码子偏倚”。不受理论束缚，通过使用宿主细胞的偏爱密码子，翻译的速率可以更快。因此，当合成在宿主细胞中的表达提高的基因时，可能令人希望的是设计这种基因使得它的密码子使用频率接近宿主细胞的偏爱密码子使用的频率。在一些生物中，密码子偏倚在核基因组和细胞器基因组之间是不同的，因此，可以实现针对靶基因组的密码子优化或偏倚(例如，核密码子偏倚或叶绿体密码子偏倚)。在一些实施方案中，密码子偏倚发生在诱变之前，以产生一种多肽。在其他实施方案中，密码子偏倚发生在诱变之后，以产生一种多核苷酸。仍然在其他实施方案中，密码子偏倚发生在诱变之前以及在诱变之后。在此对密码子偏倚进行详细说明。
在一些实施方案中，载体包括可操作地连接到一个或多个控制元件如启动子和/或转录终止子上的多核苷酸。当将核酸序列置于与另一种核酸序列的功能性关系中时，该核酸序列是可操作地连接的。例如，如果多肽作为参与该多肽的分泌的一种前蛋白而被表达，则前序列或分泌性前导序列的DNA被可操作地连接到多肽的DNA上；如果启动子影响该序列的转录，则将该启动子可操作地连接到编码序列上；或如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则将它可操作地连接到编码序列上。总之，可操作地连接的序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下是连续的并且在阅读相中。通过在限制性酶切位点处连接实现连接。如果适合的限制酶切位点不能得到，则如本领域的技术人员已知的，可以使用合成的寡核苷酸接头或连接物。Sambrook等人，《分子克隆实验手册》(MolecularCloning，ALaboratoryManual)，第二版(2ndEd.)，冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress)，(1989)以及Ausubel等人，《精编分子生物学实验指南》(ShortProtocolsinMolecularBiology)，第二版(2ndEd.)，JohnWiley&Sons(1992)。
在一些实施方案中的载体提供了拷贝数的多核苷酸的扩增。载体可以是例如提供在宿主细胞中(例如原核宿主细胞或真核宿主细胞)表达ACC酶、异戊二烯基转移酶、类异戊二烯合成酶、或甲羟戊酸酯合成酶的表达载体。
可以将一种或多种多核苷酸包含在一个或多个载体中。例如，当希望一个第二(或更多)核酸分子时，可以将该第二核酸分子包含在一个载体中，该载体可以是(但不限于)与包含该第一核酸分子的载体相同的载体。该载体可以是用于将多核苷酸引入基因组中的任何载体并且可以包括基因组DNA(例如核或质体)的核苷酸序列，该序列足以经历与基因组DNA的同源重组，例如包括基因组DNA的大约400至大约1500个或更多个基本上连续的核苷酸的一个核苷酸序列。
调节或控制元件，如本文所用术语，宽泛地指调节多核苷酸转录或翻译或可操作地连接到其上的多肽的定位的核苷酸序列。例子包括但不限于：RBS、启动子、增强子、转录终止子、起始(start)密码子、用于内含子切除和正确读码框维持的剪接信号、sToP密码子、琥珀密码子或赭石密码子、以及IREs。调控元件可以包括一个启动子和转录和翻译终止信号。为了引入特异性限制酶切位点的目的，这些元件可以配备有连接物，以促进这些控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接。此外，可以将包括细胞区室化信号的序列(即将多肽靶向到胞质溶胶、细胞核、叶绿体膜或细胞膜上的序列)附连到编码感兴趣蛋白质的多核苷酸上。这些信号是本领域熟知的并已广泛报道(参见，例如，美国专利号5,776,689)。
启动子是位于距离结构基因起始密码子上游通常100至1000个碱基对(bp)的非翻译序列，它们调节在它们控制下的核酸序列的转录和翻译。
用于本披露的启动子可来自任何来源(例如，病毒、细菌、真菌、原生生物、以及动物)。在此考虑的启动子可以是对光合生物、非维管光合生物和维管光合生物(例如，藻类、开花植物)特异的。在一些情况下，上述核酸被插入到包括光合生物例如藻类的启动子的载体中。启动子可以是一种组成型启动子或一种诱导型启动子。启动子典型地包括接近转录起始位点的必需核酸序列(例如，TATA元件)。用于表达载体中的常用启动子包括但不限于：LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、以及噬菌体λPL启动子。可以使用已知用来控制原核或真核细胞中的基因表达的其他启动子并且它们是本领域的技术人员已知的。表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点、以及一个转录终止子。载体还可以包含用于扩增基因表达的序列。
“组成型”启动子是一种在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是一种在可控环境或发育条件下有活性的启动子。诱导型启动子/调节元件的实例包括例如，硝酸盐诱导型启动子(例如，如Bock等人，《植物分子生物学》，(PlantMoI.Biol.)17：9(1991)中说明的)、或光诱导型启动子，(例如，如Feinbaum等人，《分子遗传学和基因组学》(MolGen.Genet.)226：449(1991)；以及Lam和Chua，《科学》(Science)248：471(1990)中说明的)、或热感应启动子(例如，如Muller等人，《基因》(Gene)111：165-73(1992)中说明的)。
在许多实施方案中，本披露的多核苷酸包括编码本披露的蛋白质或酶的核苷酸序列，其中编码该多肽的核苷酸序列被可操作地连接到一个诱导型启动子上。诱导型启动子是本领域熟知的。适合的诱导型启动子包括但不限于：噬菌体λ的pL；Placo；Ptrp；Ptac(Ptrp-lac杂合启动子)；异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导型启动子，例如lacZ启动子；四环素诱导型启动子；阿拉伯糖诱导型启动子，例如PBAD(例如，如Guzman等人(1995)《细菌学期刊》(J.Bacteriol.)177：4121-4130中说明的)；木糖诱导型启动子，例如Pxyl(例如如Kim等人(1996)《基因》(Gene)181：71-76中说明的)；GAL1启动子；色氨酸启动子；lac启动子；醇诱导型启动子例如，甲醇诱导型启动子，乙醇诱导型启动子；棉子糖诱导型启动子；以及热诱导型启动子，例如热诱导型λPL启动子以及由热敏感型阻抑物控制的启动子(例如，C1857-抑制的基于λ的表达载体；例如，如Hoffmann等人(1999)FEMSMicrobiolLett.177(2)：327-34中说明的)。
在许多实施方案中，本披露的多核苷酸包括编码本披露的蛋白质或酶的核苷酸序列，其中编码该多肽的核苷酸序列被可操作地连接到一个组成型启动子上。适合的用于原核细胞的组成型启动子是本领域已知的并且包括但不限于σ70启动子，以及共有σ70启动子。
适合的用于原核宿主细胞的启动子包括但不限于：噬菌体T7RNA聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂合启动子，例如lac/tac杂合启动子，tac/trc杂合启动子，trp/lac启动子，T7/lac启动子；trc启动子；tac启动子；araBAD启动子；体内调节的启动子，如ssaG启动子或相关启动子(例如，如美国专利公开号20040131637中说明的)，pagC启动子(例如，如Pulkkinen和Miller，《细菌学期刊》(J.Bacteriol.)，1991：173(1)：86-93；以及Alpuche-Aranda等人，PNAS，1992；89(21)：10079-83中说明的)，nirB启动子(例如，如Harborne等人(1992)《分子微生物学》(Mol.Micro.)6：2805-2813；Dunstan等人(1999)《传染与免疫》(Infect.Immun.)67：5133-5141；McKelvie等人(2004)《疫苗》(Vaccine)22：3243-3255；以及Chatfield等人(1992)《生物技术》(Biotechnol.)10：888-892中说明的)；σ70启动子，例如共有σ70启动子(例如GenBank登记号AX798980、AX798961、以及AX798183)；静止期启动子，例如dps启动子、spv启动子；从致病岛SPI-2得到的启动子(例如，如WO96/17951中说明的)；actA启动子(例如，如Shetron-Rama等人(2002)《传染与免疫》(Infect.Immun.)70：1087-1096中说明的)；rpsM启动子(例如，如Valdivia和Falkow(1996).《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)22：367-378中说明的)；tet启动子(例如，如Hillen，W.和Wissmann，A.(1989)InSaenger，W.andHeinemann，U.(eds)，TopicsinMolecularandStructuralBiology，Protein-NucleicAcidInteraction.Macmillan，伦敦，英国，第10卷，第143-162页中说明的)；以及SP6启动子(例如，如Melton等人(1984)《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)12：7035-7056中说明的)。
在酵母中，可以使用许多含有组成型或诱导型启动子的载体。关于这类载体的综述参见《现代分子生物学指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，第2卷，1988，Ed.Ausubel，等人，GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience，Ch.13；Grant等人，1987，《酵母的表达和分泌载体》(ExpressionandSecretionVectorsforYeast)，《酶学方法》(inMethodsinEnzymology)，Eds.Wu&Grossman，31987，Acad.出版社，纽约，第153卷，第516-544页；Glover，1986，《DNA克隆》(DNACloning)，第II卷，IRL出版社，Wash.，D.C.，Ch.3；Bitter，1987，《酵母中异源基因表达》(HeterologousGeneExpressioninYeast)，《酶学方法》(MethodsinEnzymology)，Eds.Berger&Kimmel，Acad出版社，纽约，第152卷，第673-684页；以及酵母的分子生物学(TheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomyces)，1982，Eds.Strathern等人，冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress)，Vols.I和II。可以使用组成型酵母启动子如ADH或LEU2或诱导型启动子如GAL(例如，如《酵母中克隆》(CloninginYeast)，第3章(Ch.3)，R.Rothstein在《DNA克隆》中(DNACloning)第11卷，《一种实用方法》(APracticalApproach)，Ed.DMGlover，1986，IRL出版社，Wash.，D.C.中所述)。可替代地，可以使用促进外源DNA序列整合到酵母染色体中的载体。
适合的真核启动子的非限制性实例包括CMV即刻早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTRs、以及小鼠金属硫蛋白-I。适当的载体和启动子的选择也在本领域普通技术人员的水平范围内。表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点、以及一个转录终止子。表达载体还可以包括用于扩增表达的适当序列。
用于本披露实践的载体也可含有对载体赋予令人希望的特征的一个或多个另外的核苷酸序列，包括例如多种序列，如促进载体操作的克隆位点、指导载体复制或包含在其中的核苷酸序列的转录的调控元件、以及编码选择标记的序列。像这样，载体可含有例如，一个或多个克隆位点(如多克隆位点)，可以而不必被定位以使外源或内源多核苷酸可以插入到载体中并可操作地连接到所希望的元件上。
T载体也可含有原核生物复制起点(ori)，例如，大肠杆菌复制起点或粘粒复制起点，从而使载体在原核生物宿主细胞以及植物叶绿体中传代。不同的细菌和病毒复制起点是本领域的技术人员熟知的并且包括但不限于pBR322质粒起点、2u质粒起点、以及SV40、多瘤、腺病毒、VSV、以及BPV病毒起点。
调节或控制元件，如本文所用术语，宽泛地是指调节多核苷酸转录或翻译或可操作地连接到其上的多肽的定位的核苷酸序列。例子包括但不限于RBS、启动子、增强子、转录终止子、起始(start)密码子、用于内含子切除和正确读码框维持的剪接信号、终止密码子、琥珀密码子或赭石密码子、IRES。另外地，一个元件可以是细胞区室化信号(即将多肽靶向胞质溶胶、细胞核、叶绿体膜或细胞膜上的序列)。在本披露的一些方面，可以将细胞区室化信号(例如细胞膜靶向序列)连接到一个基因和/或转录本上，使得该基因的翻译发生在叶绿体中。在其他方面中，可以将细胞区室化信号连接到一个基因上使得在该基因翻译之后，蛋白质被运送到细胞膜上。细胞区室化信号是本领域熟知的并已广泛报道(参见，例如，美国专利号5,776,689)。
载体或其线性部分可以包括编码报告基因多肽或其他选择标记的一个核苷酸序列。术语“报告基因”或“选择标记”是指赋予可检测表型的一个多核苷酸(或编码的多肽)。报告基因通常编码一种可检测多肽，例如绿色荧光蛋白或一种酶例如荧光素酶，当与适当试剂接触时(对应地是特定波长的光或荧光素)该酶产生一种信号，该信号可以通过肉眼或使用适当仪器检测(例如，如Giacomin，《植物科学》(PlantSci.)116：59-72，1996；Scikantha，《细菌学期刊》(J.Bacteriol.)178：121，1996；Gerdes，FEBSLett.389：44-47，1996；以及Jefferson，EMBOJ.6：3901-3907，1997，f1-葡萄糖醛酸酶中说明的)。选择标记通常是一种分子，当其在细胞中存在或表达时，向含有该标记的细胞提供选择优势(或劣势)，例如，在试剂存在的情况下生长的能力，否则该试剂将杀死细胞。
选择标记可以提供一种手段以获得例如表达该标记的原核细胞、真核细胞、和/或植物细胞并且因此可以用作本披露载体的一个部件。该选择基因或标记可以编码使转化有该载体的宿主细胞存活或生长所必需的蛋白质。一类选择标记是天然的或修饰的基因，这些基因使宿主细胞恢复生物或生理功能(例如恢复光合能力或恢复代谢途径)。选择标记的其他实例包括但不限于赋予抗代谢药抗性的那些，例如，赋予对甲氨喋呤的抗性的二氢叶酸还原酶(例如，如Reiss，《植物生理学》(PlantPhysiol.)(《生命科学进展》(LifeSci.Adv.))13：143-149，1994中说明的)、赋予对氨基糖甙类(新霉素、卡那霉素以及巴龙霉素)的抗性的新霉素磷酸转移酶(例如，如Herrera-Estrella，EMBOJ.2：987-995，1983中说明的)、赋予对潮霉素抗性的hygro(例如，如Marsh，《基因》(Gene)32：481-485，1984中说明的)、允许细胞利用吲哚(代替色氨酸)的trpB；它允许细胞利用组氨醇(代替组氨酸)的hisD(例如，如Hartman，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)85：8047，1988中说明的)、允许细胞利用甘露糖的甘露糖-6-磷酸异构酶(例如，如PCT公开申请号WO94/20627中说明的)、赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸的抗性的鸟氨酸脱羧酶(DFMO；例如，如McConlogue，1987，在《分子生物学最新通讯》中(CurrentCommunicationsinMolecularBiology)，冷泉港实验室编辑(ColdSpringHarborLaboratoryed.)中说明的)、以及赋予对杀稻瘟菌素S的抗性的来自土曲霉的脱氨酶(例如，如Tamura，《生物科学、生物技术以及生物化学》(Biosci.Biotechnol.Biochem.)59：2336-2338，1995中说明的)。另外的选择标记包括赋予除草剂抗性的那些，例如赋予对草胺膦抗性的草胺膦乙酰转移酶基因(例如，如White等人，《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)18：1062，1990；以及Spencer等人，《理论和应用遗传学》(Theor.Appl.Genet.)79：625-631，1990中说明的)、赋予草甘磷抗性的突变EPSPV合成酶(例如，如Hinchee等人，《生物技术》(BioTechnology)91：915-922，1998中说明的)、赋予对咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变乙酰乳酸合成酶(例如，如Lee等人，EMBOJ.7：1241-1248，1988中说明的)、赋予对阿特拉津抗性的突变psbA(例如，如Smeda等人，《植物生理学》(PlantPhysiol.)103：911-917，1993中说明的)、或突变原卟啉原氧化酶(例如，如美国专利号5,767,373中说明的)、或赋予对除草剂例如草丁膦抗性的其他标记。选择标记包括多核苷酸，其赋予对真核细胞的二氢叶酸还原酶(DHFR)或新霉素的抗性；对原核生物如大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性；以及在植物中的对博来霉素、庆大霉素、草甘膦、潮霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、福来霉素、草铵磷、大观霉素、链霉素、磺酰胺和磺酰脲的抗性(例如，如，Maliga等，MethodinPlantMolecularBiology，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1995，第39页中说明的)。选择标记可以具有其自己的启动子或它的表达可以通过一个启动子来驱动，该启动子驱动感兴趣多肽的表达。
报告基因大大增强了在许多生物有机体中的监控基因表达的能力。报告基因已成功用于高等植物的叶绿体，并已报道高水平的重组蛋白表达。此外，报告基因已经用于莱茵衣藻的叶绿体中。在高等植物的叶绿体中，β-葡萄糖醛酸酶(uidA，例如，如Staub和Maliga，EMBOJ.12：601-606，1993中说明的)、新霉素磷酸转移酶(nptII，例如，如Carrer等人，《分子基因遗传学》(Mol.Gen.Genet.)241：49-56，1993中说明的)、腺苷基-3-腺苷转移酶(aadA，例如，如Svab和Maliga，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)90：913-917，1993中说明的)、以及维多利亚多管发光水母GFP(例如，如Sidorov等人，《植物期刊》(PlantJ.)19：209-216，1999中说明的)已经用作报告基因(例如，如Heifetz，《生物化学》(Biochemie)82：655-666，2000中说明的)。这些基因的每一个均具有使它们成为叶绿体基因表达的有用的报告基因的属性，如分析简便、灵敏、或原位检测表达的能力。基于这些研究，其他外源蛋白已经表达于高等植物的叶绿体中，赋予对昆虫食草动物的抗性的如苏云金芽孢杆菌Cry毒素(例如，如Kota等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)96：1840-1845，1999中说明的)、或人促生长素(例如，如Staub等人，《自然生物技术》(Nat.Biotechnol.)18：333-338，2000中说明的)，一种潜在的生物药物。数种报告基因已经表达于真核绿藻莱茵衣藻的叶绿体中，包括aadA(例如，如Goldschmidt-Clermont，《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)19：4083-40891991；以及Zerges和Rochaix，《分子细胞生物学》(Mol.CellBiol.)14：5268-5277，1994中说明的)、uidA(例如如Sakamoto等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)90：477-501，1993；以及Ishikura等人，《生物科学与生物工程期刊》(J.Biosci.Bioeng.)87：307-3141999中说明的)、海肾萤光素酶(例如，如Minko等人，《分子基因遗传学》(Mol.Gen.Genet.)262：421-425，1999中说明的)以及来自鲍曼不动杆菌的氨基糖苷磷酸转移酶aphA6(例如，如Bateman和Purton，《分子基因遗传学》(Mol.Gen.Genet)263：404-410，2000中说明的)。在一个实施方案中，通过添加一个N端strep标签表位对在此说明的蛋白质进行修饰以添加到蛋白表达的检测中。
在一些情况下，本披露的载体可以含有多种元件，如大肠杆菌或啤酒酵母复制起点。与适当选择标记结合的这些特征允许该载体在目标宿主细胞与细菌和/或酵母细胞之间“穿梭”。本披露的穿梭载体在一个第二宿主中通过的能力可以允许更方便地操纵该载体的特征。例如，可以将含有该载体和插入的感兴趣的一种或多种多核苷酸的反应混合物转化到原核宿主细胞中(如大肠杆菌)使用常规方法进行扩增和收集，并且进行检查以鉴定含有插入片段或感兴趣构建体的载体。如果希望的话，可以对该载体进行进一步操作，例如通过对插入的多核苷酸进行定点诱变，然后再一次扩增和选择具有感兴趣的突变多核苷酸的载体。然后可以将穿梭载体引入植物细胞叶绿体中，其中感兴趣的多肽可以被表达并且如果希望的话根据本披露的方法进行分离。
宿主生物例如莱茵衣藻的叶绿体或核基因组的知识在构建用于披露的实施方案的载体中是有用的。用于选择叶绿体基因组的区域用作载体的叶绿体载体和方法是熟知的(参见例如Bock，《分子生物学期刊》(J.Mol.Biol.)312：425-438，2001；Staub和Maliga，《植物细胞》(PlantCell)4：39-45，1992；以及Kavanagh等人，《遗传学》(Genetics)152：1111-1122，1999，通过引用将它们各自结合在此)。莱茵衣藻的全叶绿体基因组可在环球网上在URL“biology.duke.edu/chlamy_genome/-chloro.html”下提供给公众(参见“以文本文件形式查看全基因组”链接以及“叶绿体基因组图谱”链接)；J.Maul，J.W.Lilly，和D.B.Stern，未公布的结果；2002年1月28日修订版；将以GenBankAcc.No.AF396929形式公开的；以及Maul，J.E.，等人(2002)《植物细胞》(ThePlantCell)，Vol.14(2659-2679))。通常，选择使用的叶绿体基因组DNA的核苷酸序列不是基因的一部分，包括一个调节序列或编码序列。例如，该选择的序列不是这样一个基因，如果断裂，由于同源重组事件，该基因将对叶绿体产生有害作用。例如，对叶绿体基因组的复制或对包含该叶绿体的植物细胞的有害作用。在这个方面，含有莱茵衣藻叶绿体基因组序列的站点还提供了显示叶绿体基因组编码和非编码区的图谱，因此有助于选择用于构建载体的序列(还在Maul，J.E.，等人(2002)《植物细胞》(ThePlantCell)，Vol.14(2659-2679)中进行了说明)。例如，叶绿体载体，p322，是从位于大约位置143.1kb处的Eco(EcoRI)位点延伸到位于大约位置148.5kb处的Xho(XhoI)位点的一种克隆(参见环球网，在URL“biology.duke.edu/chlamy_genome/chloro.html”下，并且点击“mapsofthechloroplastgenome”链接，以及“140-150kb”链接；还可以直接在环球网上在URL“biology.duke.edu/chlam-y/chloro/chlorol40.html”下进入)。
此外，莱茵衣藻的全核基因组在Merchant，S.S.，等人，《科学》(Science)(2007)，318(5848)：245-250中进行说明，并且有助于本领域普通技术人员选择一个或多个序列用来构建载体。
为了在宿主中表达多肽，可以使用一个表达盒或载体。表达载体可以提供转录和翻译起始区、以及一个转录和翻译终止区，该起始区可以是诱导型的或组成型的，其中该编码区可操作地连接在转录起始区的转录控制下。这些控制区对于该基因可以是天然的，或可以从外源来源得到。表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制酶切位点，以提供编码外源或内源蛋白质的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中可操作的选择标记。
可以通过多种方法将这些核苷酸序列插入载体中。在最常用的方法中，使用本领域的技术人员通常已知并且详见例如Sambrook等人，《分子克隆实验手册》(MolecularCloning，ALaboratoryManual)，第二版(2ndEd.)，冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress)，(1989)以及Ausubel等人，《精编分子生物学实验指南》(ShortProtocolsinMolecularBiology)，第二版(2ndEd.)，JohnWiley&Sons(1992)的步骤将这些序列插入一个或多个适当的限制性内切核酸酶位点中。
在此的说明提供的是，这些宿主细胞可以用载体来转化。本领域的技术人员应当认识到的是，这类转化包括用环形或线性载体或载体的线性部分进行转化。因此，包括载体的宿主细胞可以含有细胞中的整个载体(处于环形或线性形式)或者可以含有在此披露的载体的线性部分。在一些情况下，可以使用0.5至1.5kb的叶绿体基因组DNA的侧翼核苷酸序列。在一些情况下，可以使用0.5至1.5kb的核基因组DNA的侧翼核苷酸序列，或可以使用2.0至5.0kb。
化合物
在此披露的修饰的或转化的宿主生物在生产所希望的生物分子、化合物、组合物、或产物中是有用的；这些术语可互换地使用。本披露提供了在宿主细胞中生产例如类异戊二烯或类异戊二烯前体化合物的方法。一种这样的方法涉及在促进合成产物(例如类异戊二烯化合物或类异戊二烯前体化合物)的条件下在适合的培养基中培养修饰的宿主细胞，其中通过表达本披露的酶来产生该类异戊二烯化合物，其中该酶使用存在于宿主细胞中的底物。在一些实施方案中，一种方法进一步包括从细胞中和/或从培养基中分离类异戊二烯化合物。
在一些实施方案中，通过收获液体培养基来收集产物(例如燃料分子)。由于一些燃料分子(例如单萜)不溶于水，它们将漂浮到液体培养基的表面上并且可以例如通过浮渣而容易地提取。在其他情况下，可以从液体培养基中提取燃料分子。仍然在其他情况下，这些燃料分子是挥发性的。在这样的情况下，不可渗透的阻挡层可以覆盖或另外地围绕生长环境并且可以从阻挡层内空气中提取。对于一些燃料分子，可以从环境(例如液体环境和/或空气)以及从完整的宿主细胞两者中提取产物。典型地，可以在适当的点处收获生物并且然后可以从该生物中提取产物。可以通过本领域已知的任何手段收集细胞，包括但不限于浓缩细胞、机械地或化学地破碎细胞、以及从细胞培养物中和/或细胞溶解产物中纯化一种或多种产物。可以使细胞和/或生物生长并且然后通过本领域的技术人员已知的任何手段来收集一种或多种产物。提取产物的一种方法是通过收集该宿主细胞或一群宿主细胞并且然后将该一个或多个细胞干燥。然后通过破碎细胞以暴露出产物从干燥的一个或多个宿主细胞中收获该一种或多种产物。在一些情况下，可以生产产物而不杀死这些生物。生产和/或表达产物可能不会使该生物不能独立生存。
在一些实施方案中，将基因修饰宿主细胞在适当的培养基(例如Luria-Bertoni肉汤，任选地添加有一种或多种另外的试剂，如诱导物(例如，当类异戊二烯合成酶处于诱导型启动子控制下时))中培养；并且该培养基覆盖有一种有机溶剂，例如十二烷，形成了一个有机层。由基因修饰宿主生产的化合物分配到然后可以从中将其纯化的有机层中。在一些实施方案中，当例如异戊二烯基转移酶、类异戊二烯合成酶或甲羟戊酸酯合成编码核苷酸序列可操作地连接到诱导型启动子上时，将一种诱导物添加到培养基中；并且在适当的时间之后，从覆盖在培养基上的有机层中分离出该化合物。
在一些实施方案中，可以从可能存在于有机层中的其他产物中分离出该化合物或产物，例如类异戊二烯化合物。使用例如标准色谱技术易于实现从可能存在于有机层中的其他产物中分离出该化合物。
培养宿主细胞、分离产物、以及分离所希望的一种产物或多种产物的方法是本领域的技术人员已知的并且在此进一步讨论。
在一些实施方案中，在基因修饰宿主细胞中以比通过相同生物合成途径产生类异戊二烯或类异戊二烯前体化合物的未修饰宿主细胞中产生的类异戊二烯或类异戊二烯前体化合物水平高至少大约2倍、至少大约5倍、至少大约10倍、至少大约25倍、至少大约50倍、至少大约100倍、至少大约500倍、至少大约1000倍、至少大约2000倍、至少大约3000倍、至少大约4000倍、至少大约5000倍、或至少大约10,000倍、或更高的水平产生该化合物，例如类异戊二烯或类异戊二烯化合物。
在一些实施方案中，该化合物，例如类异戊二烯化合物是纯的，例如至少大约40％纯、至少大约50％纯、至少大约60％纯、至少大约70％纯、至少大约80％纯、至少大约90％纯、至少大约95％纯、至少大约98％、或大于98％纯。在类异戊二烯化合物的情况下，“纯”是指一种不含有例如其他类异戊二烯化合物、化合物的部分、污染物，以及不需要的副产物的类异戊二烯化合物。
在此考虑的产物的实例包括烃产物以及烃衍生物产物。烃产物是仅由氢分子和碳分子组成的一种产物。烃衍生物产物是具有一种或多种杂原子的烃产物，其中该杂原子是非氢或碳的任何原子。杂原子的实例包括但不限于氮、氧、硫、以及磷。一些产物可以是富含烃的，其中，例如，按重量计至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的产物是由碳和氢构成的。
一个示例性的烃产物群是类异戊二烯类。类异戊二烯类(包括萜类)是从异戊二烯亚基衍生的，但是例如通过添加杂原子(例如氧)、通过碳骨架重排、以及通过烷基化而被修饰。类异戊二烯类通常具有许多碳原子，这些碳原子可平等地被5整除，但是这不是一个必要条件，因为“不规则的”萜类是本领域的技术人员已知的。类胡萝卜素类，如胡萝卜素类或叶黄素类是作为有用产物的类异戊二烯的实例。类固醇是萜类化合物的一个实例。类异戊二烯的实例包括但不限于半萜类(C5)、单萜类(C10)、倍半萜类(C15)、二萜类(C20)、三萜类(C30)、四萜类(C40)、多萜类(Cn，其中“n”等于或大于45)，以及它们的衍生物。类异戊二烯的其他实例包括但不限于苧烯、1，8-桉油素、α-蒎烯、莰烯、(+)-桧萜、月桂烯、松香二烯、紫杉烯、焦磷酸法尼酯、壳梭孢菌素二烯、紫穗槐二烯、(E)-α-没药烯、姜烯、或diapo八氢番茄红素(diapophytoene)、以及它们的衍生物类。
包括烃类的产物，例如燃料产物，可以是前体或常规地从原油、或石油衍生的产物，例如但不限于：液化石油气、石脑油(轻石油)、汽油、煤油、柴油、润滑油、重气、焦炭、沥青、焦油、以及蜡类。
有用的产物包括但不限于如上所述的萜烯和萜类化合物。一个示例性萜烯群是二萜类(C20)。二萜类是可以被修饰的(例如，氧化、去除甲基基团、或环化)烃类；二萜类的碳骨架可以被重排从而形成例如萜类化合物，如壳梭孢菌素二烯。壳梭孢菌素二烯还可以例如直接地从异戊二烯前体形成，而不受二萜或GGDP可得性的束缚。通过在此所述的方法对生物(如藻类)进行基因修饰可能导致产生壳梭孢菌素二烯，例如其他类型的萜类，例如像苧烯。基因修饰还可能导致生产修饰的萜类，例如甲基角鲨烯或羟基化和/或共轭萜类，如紫杉醇。
其他有用的产物可以是例如包括从表达二萜合成酶的生物中获得的烃的产物。这类示例性的产物包括内贝壳杉烯、蓖麻烯、和壳梭孢菌素二烯，并且还可以包括燃料添加剂。
在一些实施方案中，在此考虑的产物(如燃料产物)包括从一种无机碳源得到的一个或多个碳。在一些实施方案中，如在此说明的产物的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％的碳是从无机碳源得到的。无机碳源的实例包括但不限于二氧化碳、碳酸盐、重碳酸盐、以及碳酸。该产物可以是例如具有在光合作用过程中被固定的来自无机碳源的碳的一种有机分子。
本披露生产的产物可以通过转化的一种或多种宿主细胞和/或一种或多种生物天然地、或非天然地(例如，作为转化的结果)产生。例如，由藻类非天然产生的产物可能包括非天然萜烯/萜类化合物，如壳梭孢菌素二烯或苧烯。天然地产生于藻类中的产物可以是一种萜，如一种类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素)。宿主细胞可以例如通过用编码蛋白质的序列转化该细胞而被基因修饰，其中蛋白质的表达导致天然或非天然产生的一种产物或多种产物的分泌。该产物可以是自然界中未发现的一种分子。
产物的实例包括石油化学产品、石油化学产品的前体、燃料产物、石油产物、石油产物的前体、以及可以用于石油化学工业中的所有其他物质。该产物可以用于产生在石油化学工业中有用的多种物质或材料。这些产物可以用于燃烧室(如锅炉、窑、干燥器或熔炉)中。燃烧室的其他实例是内燃机，如车辆发动机或发电机，包括汽油发动机、柴油发动机、喷气式发动机、以及其他类型的发动机。在一个实施方案中，在此所述的方法包括燃烧一种“精制的”或“升级的”组合物。例如，燃烧一种精制的组合物可以包括将该精制的组合物插入内燃机(如汽车发动机或喷气式发动机)中。在此所述的产物还可以用来生产例如塑料、树脂、纤维、弹性体、药物制剂、营养制品、润滑剂、以及凝胶类。
有用的产物还可以包括类异戊二烯前体。类异戊二烯前体是通过两个途径之一产生的：甲羟戊酸酯途径或甲基赤藓糖磷酸(MEP)途径。两个途径产生二甲基丙烯焦磷酸脂(DMAPP)以及焦磷酸异戊酯(IPP)，它们是针对类异戊二烯的共同C5前体。DMAPP和IPP被缩合从而形成从中形成高级类异戊二烯的牻牛儿基二磷酸酯(GPP)，或其他前体，如法尼基二磷酸酯(FPP)或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯(GGPP)。
有用的产物还可以包括小烷烃类(例如，1至大致4个碳)，如甲烷、乙烷、丙烷、或丁烷，它们可以用于加热(例如烹饪)或制造塑料。这些产物还可以包括具有大致5至大致9个碳原子的碳主链的分子，如石脑油或轻石油，或它们的前体。其他产物可以包括具有大约5至大约12个碳原子的碳主链(carbonbackground)的分子，或用作汽油或发动机燃料的环烷烃。大致10至大致18个碳的分子和芳香族化合物(如煤油，或它的前体)还可以用作产物。其他产物包括润滑油、重瓦斯油、或燃料油、或它们的前体，并且可以包含大致12至大致70个碳原子的烷烃类、环烷烃类、或芳香族化合物。这些产物还包括可以从原油(例如焦炭、沥青、焦油、以及蜡，通常含有具有大约70个或更多个碳的多个环，以及它们的前体)中得到或从中发现的其他残余物。
在一些实施方案中在CO2存在下可以使修饰的生物生长从而产生一种所希望的多肽。在一些实施方案中，分离或收集了由修饰的生物产生的产物。然后可以例如通过精制和/或裂解来进一步修饰收集的产物(如萜烯和萜类化合物)，以产生燃料分子或组分。
可以通过许多方法将不同的产物进一步精制成针对最终用户的最终产物。例如，可以通过分馏来进行精制。例如，可以通过分馏将产物的混合物(如具有不同链长度的不同烃类的混合物)分离成不同的组分。
精制还可以包括一个或多个以下步骤：裂解、一体化(unify)、或改变该产物。通过裂解可以将大的产物(例如，大烃类(例如≥C10))分解成较小的片段。可以通过加热或高压，如通过蒸汽、减粘裂化、或结焦进行裂解。还可以通过减粘裂化，例如通过在熔炉中加热产物通过热裂解产物中的大烃分子来精制产物。精制还可以包括结焦，其中生产了重的、几乎纯的碳残余物。还可以通过催化装置来进行裂解，以通过使用催化剂(例如但不限于沸石、水合硅酸铝、铝土矿、或硅铝催化剂)来增强裂化反应的速率。催化还可以是通过流化催化裂化，由此使用一种热催化剂(如沸石)来催化裂化反应。还可以通过加氢裂解来进行催化，其中通常使用比流化催化裂化更低的温度。在升高的氢气分压的存在下可以发生加氢裂解。可以通过催化裂化对产物进行精制，以产生柴油、汽油、和/或煤油。
还可以通过将它们结合到一个统一步骤中例如通过使用催化剂(如铂或铂-铼混合物)对这些产物进行精制。一体化过程可以产生氢气(一种副产物)，这可以用在裂解中。
还可以通过将烃改变、重排、或重构成较小的分子来精制这些产物。存在着许多本领域的普通技术人员已知的在催化重整过程中发生的化学反应。可以在催化剂和高氢分压的存在下进行催化重整。一种常规的方法是烷基化。例如，丙烯和丁烯与催化剂(如氢氟酸或硫酸)混合，并且得到的产物是高辛烷烃类，这可以用来降低汽油混合物中的爆震。
这些产物还可以共混或结合成混合物，从而得到一种终产物。例如，可以将这些产物混合从而形成不同等级的汽油、具有或不具有添加剂的汽油、不同重量和等级的润滑油、不同等级的煤油、喷气燃料、柴油、加热油、以及用于制造塑料和其他聚合物的化学品。在此说明的产物的组合物可以与通过其他手段生产的燃料产物结合或混合。
从本披露的宿主细胞产生的一些产物(尤其是在精制之后)与现有的石油化学产品将是相同的，即包含相同的化学结构。例如，原油包含类异戊二烯姥鲛烷，它被认为是植醇(它是叶绿素的一种组分)的一种分解产物。这些产物中的一些与现有的石油化学产品可以是不同的。然而，虽然一种分子可能不存在于常规的石油化学产品或精制物中，它在这些行业中仍然是有用的。例如，可以生产一种烃，该烃在汽油的沸点范围内，并且它可以用作汽油或一种添加剂(即使该烃并不通常出现在汽油中)。
在此的产物可以通过它的碳同位素分布(CID)来说明。在分子水平下，CID是分子内的单个碳原子是天然发生的碳同位素(例如12C、13C、或14C)之一的统计可能性。在产物的批量水平上，CID可以是在含有至少一个碳原子的化合物中的天然发生的碳同位素(例如12C、13C、或14C)的相对丰度。值得注意的是化石燃料的CID可以基于它的来源而不同。例如，其中CID(fos)(在化石燃料(如石油、天然气、以及煤)中的碳的CID)可与CID(atm)(在当前大气二氧化碳中的碳的CID)区别开。另外地，CID(photo-atm)是指在近期以来通过光合作用产生的基于碳的化合物的CID，其中无机碳源是大气中的二氧化碳。而且，CID(photo-fos)是指近期以来通过光合作用产生的基于碳的化合物的CID，其中基本上所有的无机碳源是通过化石燃料(例如煤、天然气、和/或石油)的燃烧产生的二氧化碳。确切的分布也是以下各项的一个特征：1)产生该分子的光合生物的类型，以及2)无机碳源。这些同位素分布可以用来定义源于光合作用的燃料产物的构成。碳同位素不均匀地分布在不同化合物之中和之内，并且该同位素分布可以显示关于涉及碳转化的物理、化学、以及代谢过程的信息。在光合生物中13C相对于12C的总丰度通常小于在大气二氧化碳中的13C相对于12C的总丰度，表明在二氧化碳结合到光合生物质中出现了碳同位素区别。
在精制之前或之后的一种产物与现有石油化学产品可以是相同的。这些燃料产物中的一些与现有石油化学产品可以是不同的。在一个实施方案中，燃料产物类似于现有石油化学产品(除了碳同位素分布之外)。例如，应当理解的是，没有化石燃料石油化学产品具有小于-32％的δ13C分布，而如在此所述的燃料产物可以具有小于-32％、小于-35％、小于-40％、小于-45％、小于-50％、小于-55％、或小于-60％的δ13C分布。在另一个实施方案中，燃料产物或组合物与现有化石燃料石油化学产品是相似而不同的，并且具有小于-32％、小于-35％、小于-40％、小于-45％、小于-50％、小于-55％、或小于-60％的δ13C分布。
燃料产物可以是包括例如氢和碳分子的一种组合物，其中该氢和碳分子具有该组合物至少大约80％原子量，并且其中该组合物的δ13C分布是小于约-32％。对于在此所述的一些燃料产物而言，氢和碳分子占该组合物的原子量的至少90％。例如，生物柴油或甲基脂肪酸酯(它具有按重量计小于90％氢和碳分子)可以不是该组合物的一部分。仍然在其他组合物中，这些氢和碳分子占该组合物的原子量的至少95％或至少99％。仍然在其他组合物中，这些氢和碳分子占该组合物的原子量的100％。在一些实施方案中，该组合物是一种液体。在其他实施方案中，该组合物是一种燃料添加剂或一种燃料产物。
在此还说明了包括一种组合物的燃料产物，该组合物包括：氢和碳分子，其中这些氢和碳分子占该组合物的原子量的至少80％，并且其中该组合物的δ13C分布小于-32％；以及一种燃料组分。在一些实施方案中，该组合物的δ13C分布小于约-35％、小于约-40％、小于约-45％、小于约-50％、小于约-55％、或小于约-60％。在一些实施方案中，该组合物的燃料组分是一种混合燃料，例如一种化石燃料、汽油、柴油、乙醇、喷气燃料、或它们的任何组合。仍然在其他实施方案中，该混合燃料具有大于-32％的δ13C分布。对于在此说明的一些燃料产物，该燃料组分是一种燃料添加剂，该燃料添加剂可以是MTBE、一种抗氧化剂、一种抗静电剂、一种腐蚀抑制剂、或它们的任何组合。如在此所述的燃料产物可以是通过将如所述的燃料产物和一种燃料组分混合而产生的一种产物。在一些实施方案中，该燃料产物具有大于-32％的δ13C分布。在其他实施方案中，该燃料产物具有小于-32％的δ13C分布。例如，在精炼(例如裂解)之前可以将从生物中提取的油组合物与一种燃料组分混合，从而产生如在此所述的一种燃料产物。一种燃料产物，可以是一种化石燃料，或用于产生燃料产物的一种混合的共混物。例如，用于燃料混合的混合物可以是一种烃混合物，该烃混合物适合与另一种烃混合物共混从而产生一种燃料产物。例如，轻烷类的混合物可能不具有适合于一种燃料类型的某一辛烷值，然而，可以将它与高辛烷混合物共混从而产生一种燃料产物。在另一个实例中，具有小于-32％的δ13C分布的组合物与用于燃料混合的一种烃混合物共混从而产生一种燃料产物。在一些实施方案中，该组合物或燃料组分单独不适合作为燃料产物，然而当结合时，它们用作燃料产物。去其他实施方案中，该组合物或燃料组分或两者单独适合用作燃料产物。仍然在另一种实施方案中，该燃料组分是现有的石油产品，如汽油或喷气燃料。在其他实施方案中，该燃料组分是从可再生来源得到的，如生物乙醇、生物柴油、以及生物汽油。
源于从宿主细胞获得的生物质的多种油组合物可以用来生产高辛烷值烃产品。因此，一个实施方案说明了一种形成燃料产物的方法，包括：获得升级的油组合物，将该油组合物裂解，并且将生成的具有4至12个碳并且辛烷值为80或更高的一种或多种轻烃与具有辛烷值为80或更低的一种烃混合。具有辛烷值80或更低的烃是例如从精炼原油得到的化石燃料。
从宿主生物获得的生物质原料可以被修饰或标记，这样使得轻烃产物可以被识别或被追踪至它们的初始进料。例如，在其生物合成过程中可以将碳同位素引入生物质烃中。可以使标记的烃原料经受在此所述的精炼过程从而产生标记有碳同位素的一种轻烃产物。这些同位素允许单独地或与其他未标记产物结合来识别标记的产物，这样使得这些标记的产物可以被追踪至它们的初始生物质原料。
表A：涉及类异戊二烯途径的酶的实例
合成酶 来源 NCBI蛋白质ID
苧烯 留兰香 2ONH A
桉油素 地榆 AAC26016
蒎烯 大冷杉 AAK83564
莰烯 大冷杉 AAB70707
桧萜 地榆 AAC26018
月桂烯 大冷杉 AAB71084
松香二烯 大冷杉 Q38710
紫杉二烯 短叶红豆杉 AAK83566
FPP 原鸡 P08836
紫穗槐二烯 青蒿 AAF61439
没药烯 大冷杉 O81086
Diapo八氢番茄红素 金黄色葡萄球菌
Diapo八氢番茄红素脱饱和酶 金黄色葡萄球菌
GPPS-LSU 留兰香 AAF08793
GPPS-SSU 留兰香 AAF08792
GPPS 拟南芥 CAC16849
GPPS 莱茵衣藻 EDP05515
FPP 大肠杆菌 NP_414955
FPP 拟南芥 NP_199588
FPP 拟南芥 NP_193452
FPP 莱茵衣藻 EDP03194
IPP异构酶 大肠杆菌 NP_417365
IPP异构酶 雨水血球藻 ABB80114
苧烯 狭叶薰衣草 ABB73044
单萜 番茄 AAX69064
萜品油烯 罗勒 AAV63792
月桂烯 罗勒 AAV63791
姜烯 罗勒 AAV63788
月桂烯 冬青栎 CAC41012
月桂烯 欧洲云杉 AAS47696
月桂烯、罗勒烯 拟南芥 NP_179998
月桂烯、罗勒烯 拟南芥 NP_567511
倍半萜 玉米；B73 AAS88571
倍半萜 拟南芥 NP_199276
倍半萜 拟南芥 NP_193064
倍半萜 拟南芥 NP_193066
姜黄烯 藿香 AAS86319
法呢烯 苹果 AAX19772
法呢烯 黄瓜 AAU05951
法呢烯 柚子 AAK54279
法呢烯 欧洲云杉 AAS47697
没药烯 欧洲云杉 AAS47689
倍半萜 拟南芥 NP_197784
倍半萜 拟南芥 NP_175313
GPP嵌合体
GPPS-LSU+SSU融合物
牻牛儿基牻牛儿基还原酶 拟南芥 NP_177587
牻牛儿基牻牛儿基还原酶 莱茵衣藻 EDP09986
脱植基叶绿素水解酶 莱茵衣藻 EDP01364
脱植基叶绿素水解酶 拟南芥 NP_564094
脱植基叶绿素水解酶 拟南芥 NP_199199
磷酸酶 啤酒酵母 AAB64930
FPP A118W 原鸡
密码子优化
如上讨论的，编码多核苷酸的一个或多个密码子可以被“偏倚”或“优化”，以反映宿主生物的密码子使用。例如，编码多核苷酸的一个或多个密码子可以被“偏倚”或“优化”，以反映叶绿体密码子使用(表B)或核密码子使用(表C)。大多数氨基酸是由两个或更多个不同的(简并的)密码子编码的，并且众所公认的是不同的生物利用优先于其他密码子的某些密码子。贯穿本说明书，“偏倚”或密码子“优化”可以互换地使用。密码子偏倚在不同的植物中(包括例如相比于烟草的藻类中)可以被不同地偏斜。通常，选择的密码子偏倚反映正在用本披露的核酸转化的植物(或其中的细胞器)的密码子使用。
针对特定密码子使用的偏倚的多核苷酸可以从头合成，或可以使用常规重组DNA技术进行基因修饰(例如通过定点诱变法)从而改变一个或多个密码子，使得它们针对叶绿体密码子使用而被偏倚。
用于叶绿体中的这类优选的密码子使用在此称为“叶绿体密码子使用”。表B(下文)显示了针对莱茵衣藻的叶绿体密码子使用(参见于2004年1月22日公开的美国专利申请公开号2004/0014174)
表B
*-每1,000个密码子的密码子使用频率。**-在36个叶绿体编码序列中观察的次数(10,193个密码子)。
可以(但不必需)基于有待在其中表达合成多核苷酸的具体生物来选择叶绿体密码子偏倚。操作可以是例如经过一种方法(如定点诱变)，通过一种方法(如使用针对有待改变的一个或多个核苷酸错配的引物的PCR)改变密码子，从而使得该扩增产物被偏倚以反映叶绿体密码子使用，或可从头合成多核苷酸序列，使得该改变(偏倚)作为合成操作的结果而被引入。
除了利用叶绿体密码子偏倚作为一种手段来提供多肽的有效翻译之外，应当理解的是，用于获得在叶绿体中的多肽的有效翻译的一种替代手段是将叶绿体基因组(例如莱茵衣藻叶绿体基因组)重新工程化，以表达否则在叶绿体基因组中不表达的tRNA。这类表达一种或多种外源tRNA分子的工程化藻类提供了这样的优点，即它可以避免对有待引入叶绿体基因组中并且从中表达的每个感兴趣的多核苷酸进行修饰的要求；相反，可以针对根据本披露的任何方法的有效多肽翻译来提供和使用藻类，如包括基因修饰的叶绿体基因组的莱茵衣藻。在高度表达的基因中的tRNA丰度与密码子使用之间的相关是熟知的(例如，如Franklin等人，《植物期刊》(PlantJ.)30：733-744，2002；Dong等人，《分子生物学期刊》(J.Mol.Biol.)260：649-663，1996；Duret，《遗传学趋势》(TrendsGenet.)16：287-289，2000；Goldman等人，《分子生物学期刊》(J.Mol.Biol.)245：467-473，1995；以及Komar等人，《生物学与化学》(Biol.Chem.)379：1295-1300，1998中说明的)。例如，在大肠杆菌中，用来表达未充分利用的tRNA的菌株的重新工程化导致利用这些密码子的基因的增强表达(参见Novy等人，inNovations12：1-3，2001)。利用内源tRNA基因，可以使用定点诱变来制造一种合成tRNA基因，可以将它引入到叶绿体中用来互补叶绿体基因组(例如莱茵衣藻叶绿体基因组)中的稀少的或从未用过的tRNA基因。
通常，针对本披露目的(包括例如在制备如在此披露的合成多核苷酸中)选择的叶绿体基因组偏倚反映植物叶绿体的叶绿体密码子使用，并且包括相对于密码子的第三位置偏向于A/T的密码子偏倚，例如，其中该第三位置具有大于约66％的AT偏倚、或大于约70％的AT偏倚。在一个实施方案中，该叶绿体密码子使用被偏倚，以反映藻类叶绿体密码子使用，例如莱茵衣藻，在第三密码子位置中它具有大约74.6％的AT偏倚。藻类叶绿体中优选的密码子使用已经在US2004/0014174进行了说明。
表C举例说明了优先用于藻类核基因中的密码子。可以(但不必需)基于有待在其中表达合成多核苷酸的具体生物来选择核密码子偏倚。操作可以是例如经过一种方法(如定点诱变)，通过一种方法(如使用针对有待改变的一个或多个核苷酸错配的引物的PCR)改变密码子，从而使得该扩增产物被偏倚以反映核密码子使用，或可从头合成多核苷酸序列，使得该改变(偏倚)作为合成操作的结果而被引入。
除了利用核密码子偏倚作为一种手段来提供多肽的有效翻译之外，应当理解的是，用于获得在核中的多肽的有效翻译的一种替代手段是将核基因组(例如莱茵衣藻核基因组)重新工程化，以表达否则在核基因组中不表达的tRNA。这类表达一种或多种外源tRNA分子的工程化藻类提供了这样的优点，即它可以避免对有待引入核基因组中并且从中表达的每个感兴趣的多核苷酸进行修饰的要求；相反，可以针对根据本披露的任何方法的有效多肽翻译来提供和使用藻类，如包括基因修饰的核基因组的莱茵衣藻。在高度表达的基因中的tRNA丰度与密码子使用之间的相关是熟知的(例如，如Franklin等人，《植物期刊》(PlantJ.)30：733-744，2002；Dong等人，《分子生物学期刊》(J.Mol.Biol.)260：649-663，1996；Duret，《遗传学趋势》(TrendsGenet.)16：287-289，2000；Goldman等人，《分子生物学期刊》(J.Mol.Biol.)245：467-473，1995；以及Komar等人，《生物学与化学》(Biol.Chem.)379：1295-1300，1998中说明的)。例如，在大肠杆菌中，用来表达未充分利用的tRNA的菌株的重新工程化导致利用这些密码子的基因的增强表达(参见Novy等人，inNovations12：1-3，2001)。利用内源tRNA基因，可以使用定点诱变来制造一种合成tRNA基因，可以将它引入到核中用来互补核基因组(例如莱茵衣藻核基因组)中的稀少的或从未用过的tRNA基因。
通常，针对本披露目的(包括例如在制备如在此披露的合成多核苷酸中)选择的核密码子偏倚可以反映藻类细胞核的核密码子使用并且包括导致包含大于60％G/C含量的编码序列的密码子偏倚。
表C
每个字段：[三字母][频率：一千](数量)
编码GC66.30％第一字母GC64.80％第二字母GC47.90％第三字母GC86.21％
表D列出了用于将蛋白质回译成用于合成的DNA序列的在每个位置处选择的密码子。选择的密码子是被在叶绿体基因组中编码的tRNA(当存在时)识别的序列；终止密码子(TAA)是最频繁出现在叶绿体编码基因中的密码子。如果产生所不希望的限制酶切位点，根据消除限制酶切位点的常规衣藻叶绿体使用表选出下一个最佳选择。
表D
氨基酸 使用的密码子
F TTC
L TTA
I ATC
V GTA
S TCA
P CCA
T ACA
A GCA
Y TAC
H CAC
Q CAA
N AAC
K AAA
D GAC
E GAA
C TGC
R CGT
G GGC
W TGG
M ATG
终止 TAA
序列同一性百分比
适合于确定在核酸序列或多肽序列之间的序列同一性百分比或序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，它例如在Altschul等人，《分子生物学期刊》(J.Mol.Biol.)215：403-410(1990)中进行了说明。用于进行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心是公众可得的。BLAST算法参数W、T、和X确定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值为100、M＝5、N＝-4、以及两个链的比较作为默认值。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62打分矩阵作为默认值(例如，如Henikoff&Henikoff(1989)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89：10915中说明的)。除了计算序列同一性百分比以外，BLAST算法还可以进行在两个序列之间的相似性的统计分析(例如，如Karlin&Altschul，《美国国家科学院院刊》(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA)，90：5873-5787(1993)中说明的)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总和概率(P(N))，它提供了由此将偶然发生在两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配的概率的一个指示。例如，在测试核酸与参考核酸的比较中，如果最小总和概率小于约0.1、小于约0.01、或小于约0.001，则该核酸被认为是与参考序列相似的。
脂肪酸和甘油脂类
本披露说明了通过用编码一种或多种不同酶的核酸转化宿主细胞(例如藻类细胞，如莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红藻、以及蓝细菌细胞)能够制造多肽的宿主细胞，这些多肽促成了脂肪酸、甘油脂类、或油类的积累和/或分泌。这样的酶的实例包括乙酰辅酶A羧化酶、酮还原酶、硫酯酶、丙二酰转移酶、脱水酶、脂酰辅酶A连接酶、酮脂酰合成酶、烯酰还原酶、以及去饱和酶。这些酶可以是例如分解代谢酶类或生物降解酶类。
在一些情况下，宿主细胞可以自然产生感兴趣的脂肪酸、甘油脂类、甘油三酯、或油。因此，用编码一种酶(例如ACC酶)的多核苷酸转化宿主细胞将允许细胞中的酶活性增加和/或感兴趣分子(例如脂质)的积累和/或分泌的增加。
通过转化的宿主细胞，所希望的产物(例如脂肪酸、甘油脂类、或油类)的积累和/或分泌的变化可以包括，例如，超过通常存在于细胞中的总油含量的变化，或通常存在于细胞中的油类型的变化。
可以用编码一种或多种酶的多个基因转化一些宿主细胞。例如，单个转化的细胞可以含有编码多种酶的外源核酸，这些酶构成整个甘油脂类合成途径。一个途径实例可能包括编码乙酰辅酶A羧化酶、丙二酰转移酶、酮脂酰合成酶、以及硫酯酶的基因。用整个路径和/或从这些细胞中提取的酶转化的细胞可以合成例如脂肪酸合成途径的完整脂肪酸或中间体。这些构建体可以包括例如同一基因的多个拷贝、编码来自不同生物的相同酶的多基因、和/或在一个或多个编码序列中具有一个或多个突变的多基因。
由这些修饰的细胞产生的一种或多种酶可以导致可以从细胞和/或周围环境(例如，生物反应器或生长培养基)中收集的脂肪酸、甘油脂类、甘油三酯、或油类的产生。在一些实施方案中，在通过细胞膜转运蛋白从细胞中分泌产物之后进行脂肪酸、甘油脂类、甘油三酯、或油类的收集。
可以用于说明的实施方案中的编码甘油脂代谢的酶类的候选衣藻基因的实例在TheChlamydomonasSourcebookSecondEdition，organellarandMetabolicProcesses，Vol.2，pp.41-68，DavidB.Stern(Ed.)，(2009)，ElsevierAcademicPress中进行了说明。
例如，对涉及质体、线粒体、和胞浆途径的酶类连同脂肪酸去饱和酶的质体和胞质亚型、以及甘油三酯合成酶进行了说明(并且提供了它们的登录号)。所说明的基因中的一些的示例性图表提供如下：
酰基-ACP硫酯酶 FAT1 EDP08596
长链脂酰辅酶A合成酶 LCS1 EDO96800
CDP-DAG：肌醇磷酸转移酶 PIS1 EDP06395
脂酰辅酶A：二酰甘油酰基转移酶 DGA1 EDO96893
磷脂：二酰甘油酰基转移酶 LRO1(LCA1) EDP07444
下面对宿主细胞或生物可以产生的脂肪酸和/或甘油脂类的类型的实例进行说明。
脂类是天然发生分子的一个广泛的集合，这些分子包括脂肪类、蜡类、甾醇类、脂溶性维生素类(例如维生素A、D、E以及K)、甘油单酯类、甘油二酯类、磷脂类、以及其他物质。脂类的主要生物功能包括能量储存、作为细胞膜的结构性组分，以及作为重要的信号分子。
脂质可以广义地定义为疏水性或两亲性小分子；一些脂质的两亲性质允许它们在水性环境中形成多种结构，如囊泡、脂质体、或膜。生物脂质全部或部分地源于两种不同类型的生物化学亚基或“构造块”：酮脂酰和异戊二烯基团。脂质可以被分成8个类别：脂肪酰类、甘油脂类、甘油磷脂类、鞘脂类、糖酯类(saccharolipid)以及聚酮化合物类(从酮脂酰亚基缩合得到)；以及甾醇脂类和异戊烯醇酯类(从异戊二烯亚基缩合得到)。对于本披露，糖脂类将不进行讨论。
脂肪是称为甘油三酯的脂类的一个亚组。脂质还包括多种分子，如脂肪酸和它们的衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、以及甘油单酯和磷脂类)、以及其他含有甾醇的代谢物，例胆固醇。人类和其他哺乳动物使用不同的生物合成途径来分解和合成这些脂质。
脂肪酰类
脂肪酰(用于描述脂肪酸、它们的结合物以及衍生物的总称)是在称为脂肪酸合成的过程中通过具有丙二酰CoA或甲基丙二酰辅酶A基团的乙酰辅酶A引物的链延长而合成的不同的分子团。脂肪酸是任何一种脂肪族单羧酸，这些脂肪族单羧酸可以通过水解从天然发生的脂肪和油类中释放出来。它们由一个烃链构成，该烃链以一个羧酸基团封端；这种安排为该分子提供了一个极性的亲水末端、以及一个不溶于水的非极性的疏水末端。脂肪酸结构是生物脂质最基本的类别之一，并且通常用作结构更复杂的脂质的构造块。碳链(典型地在4至24个碳长度之间)可以是饱和的或不饱和的，并且可以附连到含有氧、卤素、氮以及硫的多种官能团上；还出现分支脂肪酸和羟基脂肪酸，并且在蜡中发现了超过30个碳的非常长链酸。当存在双键时，存在着顺式或反式几何异构的可能性，这显著地影响分子的分子构型。顺式双键引起脂肪酸链弯曲，链中的双键越多，影响越显著。这进而在细胞膜的结构和功能中起重要作用。大多数天然发生的脂肪酸具有顺式构型，虽然反式形式确实存在于一些天然的和部分氢化的脂肪和油类中。
生物学重要的脂肪酸的实例是主要从花生四烯酸以及二十碳五烯酸衍生的类花生酸类物质，它包括前列腺素类、白三烯类、以及血栓烷类。脂肪酸类别中的其他主要脂质种类是脂肪酯以及脂肪酰胺。脂肪酯包括重要的生物化学中间体，如蜡酯类、脂肪酸硫酯辅酶A衍生物、脂肪酸硫酯ACP衍生物以及脂肪酸肉毒碱类。脂肪酰胺包括N-酰基乙醇胺类。
甘油脂类
甘油脂类主要由甘油单、二、以及三取代的甘油组成，最熟知的甘油脂肪酸酯类(三酰基甘油)，也称为甘油三酯类。在这些化合物中，甘油的三个羟基基团通常各自被不同的脂肪酸被酯化。由于它们作为食物储存(foodstore)起作用，在动物组织中这些脂质含有储存脂肪的大部分。三酰基甘油的酯键的水解并且从脂肪组织中释放甘油和脂肪酸被称为脂肪动员。
甘油脂类的另外的亚类以甘油葡萄糖苷代表，其特征在于存在一个或多个通过糖苷键附连到甘油上的糖残基。在这个类别中的结构的一个实例是在植物膜中发现的二半乳糖二酰基丙三醇。
示例性的衣藻甘油脂类包括：DGDG，二半乳糖二酰基丙三醇；DGTS，二酰基甘油基-N，N，N-三甲基同型丝氨酸；MGDG，单半乳糖基二酰基甘油；PtdEtn，磷脂酰乙醇胺；PtdGro，磷脂酰甘油；PtdIns，磷脂酰肌醇；SQDG，硫代异鼠李糖甘油二脂；以及TAG，三酰甘油。
甘油磷脂类
甘油磷脂类是含有至少一个附连到甘油残基上的O-酰基、O-烷基、或O-烯基基团的甘油磷酸的任何衍生物。通常的甘油磷脂类称为磷脂酸的衍生物(磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、以及磷脂酰乙醇胺)。
甘油磷脂类也称为磷脂类，是自然界中普通存在的并且是细胞脂双层的主要成分，并且涉及代谢和细胞信号传导。可以基于在真核生物和真细菌中的甘油主链的sn-3位置处、或在古细菌情况下的sn-1位置处的极性头基的性质将甘油磷脂类细分成不同种类。
在生物膜中发现的甘油磷脂类的实例是磷脂酰胆碱(也称为PC、GPCho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)以及磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)。除了用作细胞膜以及细胞内和细胞间蛋白质的结合位点的主要成分以外，在真核细胞中的一些甘油磷脂类，如磷脂酰肌醇类和磷脂酸类是膜衍生的第二信使的前体或者是它们本身。典型地，用长链脂肪酸酰化这些羟基基团之一或两者，但是在古细菌也存在烷基连接的以及1Z-烯基连接的(缩醛磷脂)甘油磷脂类、以及二烷基醚变异体。
鞘脂类
鞘脂类是含有长链氨基二醇、鞘氨醇、或紧密相关的碱(例如鞘氨基醇)的任何种类的脂质。脂肪酸以酰胺键结合到氨基基团上并且末端羟基可以连接到许多残基(如磷酸酯或碳水化合物)上。动物体内主要的碱是鞘氨醇而在植物中它是植物鞘氨醇。
主要种类为：(1)磷鞘脂类(也称为神经鞘氨醇磷脂)，其中主要代表物是鞘磷脂；以及(2)糖鞘脂类，它们含有至少一个单糖以及一个鞘氨基醇，并且包括脑苷脂类以及神经节苷脂类。鞘脂类在细胞膜中起重要结构性作用并且可以涉及蛋白激酶C的调节。
如上提及的，鞘脂类是一个复杂的化合物家族，这些化合物共享共同的结构特征，一个鞘氨基醇碱主链，并且从氨基酸丝氨酸和长链脂肪酰基CoA从头合成，然后将它们转化成神经酰胺类、鞘磷脂类、糖鞘脂类以及其他化合物。哺乳动物的主要鞘氨基醇碱通常称为鞘氨醇。神经酰胺类(N-酰基-鞘氨基醇碱)是具有酰胺连接的脂肪酸的鞘氨基醇碱衍生物的主要亚类。这些脂肪酸典型地是饱和的或单不饱和的，具有从16至26个碳原子的链长。
哺乳动物的主要鞘磷脂是鞘磷脂类(神经酰胺磷酸胆碱)，而昆虫主要含有磷酸乙醇胺神经酰胺，并且真菌具有植物神经酰胺磷酸肌醇(phytoceramidephosphoinositol)以及含有甘露糖的头基。糖鞘脂类是由通过糖苷键连接到鞘氨基醇碱上的一个或多个糖残基组成的多个分子家族。这些的实例是简单的和复杂的糖鞘脂类，如脑苷脂类以及神经节苷脂类。
甾醇脂质
甾醇脂质，如胆固醇以及它的衍生物、连同甘油磷脂类和鞘磷脂类一起是膜脂质的重要组分。这些甾醇(都是从相同的稠合四环核心结构衍生的)作为激素和信号分子具有不同的生物学作用。18碳(C18)甾醇包括雌激素家族而C19甾醇包括雄激素类，如睾酮和雄酮。C21亚类包括孕激素类以及糖皮质激素类和盐皮质激素类。开环甾类化合物(包括不同形式的维生素D)的特征在于核心结构的B环的裂开。甾醇类的其他实例是胆酸类以及它们的结合物，它们在哺乳动物体内是胆固醇的氧化衍生物并且在肝脏中合成。植物等效物是植物甾醇类，如β-谷甾醇、豆甾醇、以及菜子甾醇；后者化合物也用作藻类生长的生物标记。真菌细胞膜中的主要甾醇是麦角固醇。
异戊烯醇脂质(PrenolLipids)
异戊烯醇脂质是从5-碳前体异戊烯基二磷酸盐和二甲基烯丙基二磷酸盐(它们主要是通过甲羟戊酸(MVA)途径产生)合成的。通过依次添加C5单元形成简单的类异戊二烯(例如直链醇和二磷酸盐类)，并且根据这些萜单元的数量进行分类。包含40个以上的碳的结构也称为多萜类。类胡萝卜素类是重要的简单类异戊二烯，它们作为抗氧化剂以及作为维生素A的前体起作用。通过醌类和氢醌类对另一种生物学重要的分子种类进行举例说明，它们含有附连到非类异戊二烯类起源的醌型核心上的类异戊二烯尾部。原核生物合成聚异戊烯醇(称为细菌萜醇)，其中附连到氧上的末端类异戊二烯单元保持不饱和，而在动物聚异戊烯醇(长醇)中，末端类异戊二烯被还原。
聚酮化合物
聚酮化合物或有时己酸配质是通过线性-β-酮类合成的不同的天然产物群的任何一种，它们自身是通过反复从头至尾添加乙酰基(或取代的乙酰基)单元形成的，这些乙酰基单元是通过一种类似于脂肪酸生物合成的机制(但是无中间体还原步骤)从乙酸盐(或取代的乙酸盐)间接得到的。在许多情况下，乙酰辅酶A作为起始物单元起作用并且丙二酰CoA作为延伸单元起作用。除了乙酰辅酶A之外的各种分子可以用作起始物，通常用甲氧基丙二酰CoA(methoylmalonyl-CoA)作为延长单元。这些如此形成的聚-β-酮类可以经历许多种另外的反应类型，它们包括烷基化、环化、糖基化、氧化、以及还原。所形成的产物种类-以及它们对应的起始物质-特别包括：毒芹碱(毒芹的)以及苔色酸盐(地衣的)-乙酰辅酶A；黄酮类化合物以及芪类-肉桂酰CoA；四环素类-丙二酰CoA的酰胺；漆酚(毒葛的)-棕榈油酰CoA；以及红霉内酯-丙酰CoA和甲基丙二酰CoA作为延长剂。
聚酮化合物包括大量的来自动物、植物、细菌、真菌以及海洋来源的次级代谢产物以及天然产物，并且具有非常多的结构多样性。许多聚酮化合物是环形分子，其主链通常通过糖基化、甲基化、羟基化、氧化、和/或其他过程而被进一步修饰。许多常用的抗微生物、抗寄生虫、以及抗癌剂是聚酮化合物或聚酮化合物衍生物，如红霉素、四环素、阿维菌素、以及抗肿瘤埃博霉素。
以下实例旨在提供本披露应用的说明。以下实例并不旨在完全限定或另外限制本披露的范围。本领域的技术人员应当理解的是，本领域已知的许多其他方法可以替代地取代在此具体说明或提及的那些。
实例
实例1：产生文库并且分离候选菌株
在这个实例中，产生一个插入诱变文库以分离抗高浓度氯化钠的候选物。在这个实例中的所有DNA操作都是基本上由Sambrook等人《分子克隆实验指南》(MolecularCloning：ALaboratoryManual)(冷却港实验室出版社1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress1989)以及Cohen等人《酶学方法》，(Meth.Enzymol.)297，192-208，1998所说明来进行的。
通过使用pBluescriptIISK(-)(安捷伦科技，加利福尼亚州)作为载体骨架产生转化DNA、在图8中显示的SENuc146质粒。标记Aph7”的区段是来自吸水链霉菌的潮霉素抗性基因。将来自莱茵衣藻rbcS2基因的第一内含子克隆到Aph7”中以便增加表达水平并且结果增加了转化体的数量(Berthold等人《原生动物》(Protist)153：401-412(2002))。Aph7”前面是莱茵衣藻β2-微管蛋白启动子并且其后是莱茵衣藻rbcS2终止子。随后，标记“杂合启动子”的区段指示以莱茵衣藻Hsp70A启动子、莱茵衣藻rbcS2启动子、以及来自莱茵衣藻rbcS2基因的第一内含子开始的一个融合启动子区域(Sizova等人《基因》(Gene)，277：221-229(2001))。通过用侧翼为莱茵衣藻psaD基因的启动子和终止子的编码来自龟裂链霉菌的氨基糖甙-O-磷酸转移酶VIII(AphVIII)的基因取代Aph7”盒来产生SENuc140质粒(图9)。AphVIII的表达赋予了对抗生素巴龙霉素的抗性并且已经显示产生大量的转化体(Sizova等人《基因》(Gene)，181：13-18(1996))。
通过用限制性内切酶NotI和NdeI消化SENuc146或SENuc140，随后用DNA凝胶纯化从骨架载体中分离选择标记盒来制备转化DNA。对于这些实验而言，所有转化都是在莱茵衣藻cc1690(mt+)上进行的。使细胞生长并且通过电穿孔转化。在TAP培养基中使细胞生长至对数中期(大致2-6×106细胞/ml)。在2000xg与5000xg之间将细胞旋持续5分钟。去除上清液，并且将细胞再悬浮于TAP培养基+40mM蔗糖中。在冰上将250ng(在1-5μLH2O中)转化DNA与250μL的3×108细胞/mL混合，然后转移到0.4cm电穿孔杯中。为了产生足够数量的转化体，建立了至少50个转化反应。电穿孔是这样进行的，电容设定于25uF，电压为800V从而递送2000V/cm，导致了大致10-14ms的时间常数。电穿孔之后，将杯返回到室温持续5-20分钟。对于每次转化而言，将细胞转移到10mlTAP培养基+40mM蔗糖中，并且允许在连续摇动下在室温下恢复12-16小时。然后通过在2000xg与5000xg之间离心来收获细胞，弃去上清液，并且将沉淀再悬浮于0.5mlTAP培养基+40mM蔗糖中。然后将再悬浮的细胞铺板于固体TAP培养基+20μg/mL潮霉素或固体TAP培养基+20μg/mL巴龙霉素上。使用总计12.5μg纯化的转化DNA，50个转化将典型地产生大致200,000个单独的转化体。
然后将转化体刮入1L液体TAP培养基中，并且允许在连续搅拌下在室温下恢复48小时。在TAP培养基中将文库恢复一至两天之后，进行细胞密度计数。为了确保文库的完全覆盖，需要文库大小的10x。例如，如果文库大小为2×105个转化体，则要对2×106细胞进行选择。
如上指示，一式三份地将文库大小的10X在3000xg下旋转沉淀持续5分钟。用50mLG0培养基将沉淀洗涤3次。洗涤之后，将沉淀再悬浮于10mL液体G0培养基中并且铺板于含有固体G0培养基+75mMNaCl，G0+100mMNaCl，以及G0+125mMNaCl的生物测定盘(BioassayTrays)上(Nunc目录编号240835)。G0培养基的构成为0.07mMFeCl3、11.71mMNa2EDTA、0.0002mMCoCl2、0.0003mMZnSO4、0.0001mMCuSO4、0.0035mMMnCl2、0.0001mMNa2MoO4、1.42mMNaNO3、0.21mMNaH2PO4、0.003mM盐酸硫胺素、0.0000019mM维生素B12、0.0000106mM生物素、0.406mMMgSO47H20、0.0476mMCaCl22H2O、0.162mMH3BO3、0.00710mMNaVO3、5.95mMNaHCO3。此外，使用相同范围的NaCl浓度进行平行液体测定(数据未显示)。然后将这些平板在室温下在高光照下置于供给有5％CO2的一个箱中。约10至14天之后出现耐增加的NaCl的集落。针对单个集落将集落抹到固体G0培养基上以确保克隆性。然后将单个集落挑入液体G0培养基中用于二次筛选。
将候选物置于固体G0培养基+75mMNaCl、G0+100mMNaCl、以及G0+125mMNaCl上。还将候选物1∶100(v∶v)接种到液体G0培养基+75mMNaCl、G0+100mMNaCl、以及G0+125mMNaCl中。这个过程不但用来证实表型而且以抗性水平定性地排出候选物的顺序。证实的候选物之后接着用于鉴定和确认(表1)。
实例2：候选菌株的分离分析
分离分析是用来确认外源DNA的随机插入被遗传连锁到所观察的表型上的另一种方法，该外源DNA含有赋予抗生素抗性的选择标记。可以将莱茵衣藻的交配型+和交配型杂交。在室温下在高光照下使S7候选菌株(交配型+)与莱茵衣藻cc1691(交配型-)杂交(通过使两者分开地生长于固体TAP培养基上持续5-7天)。在光照下将细胞再悬浮于无氮液体TAP培养基中持续2小时。将200μl的S7和cc1691两者混合并且保留至少2小时以便交配。将细胞铺板于固体HSM培养基上并且在光照下生长过夜，并且随后储存在黑暗中持续3天。应用氯仿蒸汽处理持续30秒以消除配子。将该平板置于光照下持续大致一周以便允许合子萌发。通过连续稀释获得克隆集落。
将抗潮霉素的5个集落和对潮霉素敏感的5个集落接种到液体G0培养基和液体G0培养基+75mMNaCl中。图41中显示的结果证明该表型与抗生素抗性一起分离。这证实了该表型是与基因中断物理连锁的。
实例3：候选菌株的鉴定以及miRNA敲低分析
在这个实例中，确定了抗75mM-125mMNaCl的所有候选菌株的基因中断的同一性。随后，人工miRNA被设计成敲低所鉴定的基因从而再现该表型(作为一种验证手段)。在这个实例中的所有DNA操作都是基本上如Sambrook等人《分子克隆实验指南》(MolecularCloning：ALaboratoryManual)(冷却港实验室出版社1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress1989)以及Cohen等人《酶学方法》，(Meth.Enzymol.)297，192-208，1998所说明来进行的。
鉴定
使被证实具有所希望的表型的候选菌株生长在固体TAP培养基+20μg/mL潮霉素或固体TAP培养基+20μg/mL巴龙霉素上，这取决于所使用的转化DNA。对大致5mL的饱和培养物进行处理从而分离出基因组DNA。使用PromegaWizard基因组DNA纯化试剂盒(PromegaCat.#A1125)从单独的突变体中(集落)分离出基因组DNA。遵循在试剂盒技术手册中概述的用于“从植物组织中分离基因组DNA”的步骤。来自鉴定的结果总结在表1中。基因组步移包括许多方法，每一种都导致有限的成功，它们已经用来鉴定位于已知身份的一个区域的侧翼的DNA序列。使用三种主要方法使鉴定的成功率达到最大。对这些方法进行了说明。
接头连接法或盒PCR接头
如生产厂家(NEB)所推荐的，用平末端限制性内切酶(PmlI和PvuII)来消化500ng-1μg候选菌株的基因组DNA。用PromegaWizardDNA提纯系统(PromegaCat.#A7280)来纯化该消化的基因组DNA。为了产生该接头，将两个接头引物(参见表3的SEQIDNO：88和SEQIDNO：89)再悬浮于STE缓冲液(10mMTris-HClpH8.0，50mMNaCl，1mMEDTA)中。将接头对各25μL混合到一个反应中并且通过每秒降低0.5℃从96℃退火至4℃。如生产厂家(NEB)所推荐的，使用T4DNA连接酶将来自各候选物的4μl消化并且纯化的基因组DNA连接到2μl的25μM接头上。在以下条件下用接头连接的基因组DNA进行初级PCR：在20μl反应体积中1μl连接的DNA、1xExTaq缓冲液(Takara生物公司)、0.5M甜菜碱、3％DMSO(二甲亚砜)、0.1mMdNTPs、1μM接头引物1(SEQIDNO：92，参见表3)、1μM盒特异性引物(SEQIDNO：96、97、101、102、106、107、110、以及111，对于适当的盒特异性引物参见表3)以及1单位ExTaq(Takara生物公司)。对于盒特异性引物存在数种选项：潮霉素或巴龙霉素特异性、5’和/或3’，以及各说明书中的两个或三个引物。初级PCR参数如下：1个循环[95℃持续2分钟]、35个循环[94℃持续20秒，在55℃下退火20秒，在72℃下延伸4分钟]、以及1个循环[在72℃下延伸2分钟]。
然后用以下各项进行第二巢式PCR：在20μl反应体积中0.5μl初级PCR反应物、1μM接头引物2(SEQIDNO：93，参见表3)、1μM巢式盒特异性引物(SEQIDNO：98、99、100、103、104、105、108、109、112、113、114，对于适当的巢式盒特异性引物参见表3)、1xExTaq缓冲液(Takara生物公司)、0.5M甜菜碱、3％DMSO(二甲基亚砜)、0.1mMdNTP、以及1单位ExTaq(Takara生物公司)。对于巢式盒特异性引物存在数种选项：潮霉素或巴龙霉素特异性、5’和/或3’，以及在各说明书中的两个或三个引物。二级PCR参数如下：1个循环[94℃持续2分钟]、42个循环[95℃持续20秒，在57℃下退火20秒，在72℃下延伸4分钟]、以及1个循环[在72℃下延伸2分钟]。在1％琼脂糖/EtBr电泳凝胶上对PCR反应物进行观察。切下条带并且用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(Zymoresearch目录号#D4022)进行纯化。使用适当的AP2引物或适当的巢式盒特异性引物对纯化的DNA进行测序。使用BLAST分析来鉴定该插入片段在莱茵衣藻核基因组中的位置(http://genome.jgi-psf.org/Chlre4/Chlre4.home.html)。使用BLAST分析来确定该断裂基因的身份。
反向串联重复(ITR)或抑制PCR
如生产厂家(NEB)所推荐的，用平末端限制性内切酶(PmlI和PvuII)来消化500ng-1μg候选菌株的基因组DNA。用PromegaWizardDNA提纯系统(PromegaCat.#A7280)来纯化该消化的基因组DNA。为了产生该接头，将两个接头引物(参见表3的SEQIDNO：90和SEQIDNO：91)再悬浮于STE缓冲液中(10mMTris-HClpH8.0，50mMNaCl，1mMEDTA)。将接头对各25μL混合到一个反应中并且通过每秒降低0.5℃从96℃退火至4℃。如生产厂家(NEB)所推荐的，使用T4DNA连接酶将4μl的消化并且纯化的基因组DNA连接到2μl的25μM接头上。
在以下条件下用接头连接的基因组DNA进行初级PCR：在20μl反应体积中1μl连接的DNA、1xExTaq缓冲液(Takara生物公司)、0.5M甜菜碱、3％DMSO(二甲基亚砜)、0.1mMdNTP、1μM接头引物1(SEQIDNO：93，参见表3)、1μM盒子特异性引物(SEQIDNO：96、97、101、102、106、107、110、以及111，对于适当的盒特异性引物参见表3)以及1单位ExTaq(Takara生物公司)。对于盒特异性引物存在数种选项：潮霉素或巴龙霉素特异性、5’和/或3’，以及在各说明书中的两个或三个引物。初级PCR参数如下：1个循环[95℃持续2分钟]、35个循环[94℃持续20秒，在55℃下退火20秒，在72℃下延伸4分钟]、以及1个循环[在72℃下延伸2分钟]。
然后用以下各项进行第二巢式PCR：在20μl反应体积中0.5μl初级PCR反应物、1μM接头引物4(SEQIDNO：94，参见表3)、1μM盒特异性引物(SEQIDNO：98、99、100、103、104、105、108、109、112、113、114，对于适当的巢式盒特异性引物参见表3)、1xExTaq缓冲剂(Takara生物公司)、0.5M甜菜碱、3％DMSO(二甲基亚砜)、0.1mMdNTP、以及1单位ExTaq(Takara生物公司)。对于巢式盒特异性引物存在数种选项：潮霉素或巴龙霉素特异性、5’和/或3’，以及在各说明书中的两个或三个引物。二级PCR参数如下：1个循环[95℃持续2分钟]、42个循环[95℃持续20秒，在57℃下退火20秒，在72℃下延伸4分钟]、以及1个循环[在72℃下延伸2分钟]。在1％琼脂糖/EtBr电泳凝胶上对PCR反应物进行观察。切下条带并且用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(Zymoresearch目录号#D4022)进行纯化。使用适当的AP4引物或适当的巢式盒特异性引物对纯化的DNA进行测序。使用BLAST分析来鉴定该插入片段在莱茵衣藻核基因组中的位置(http://genome.jgi-psf.org/Chlre4/Chlre4.home.html)。使用BLAST分析来确定该断裂基因的身份。
限制酶切位点PCR
限制酶切位点PCR利用基因组中的内源限制酶切位点，该内源限制酶切位点有助于用作PCR扩增的引发位点(Sarkar，G.，等人(1993)《基因组研究》(GenomeRes.)2：318-322)。在以下条件下用候选菌株基因组DNA进行初级PCR：在20μl反应体积中1μl100ng/μlDNA、1xExTaq缓冲液(Takara生物公司)、0.5M甜菜碱、3％DMSO(二甲基亚砜)、0.1mMdNTP、1μMRSO引物(可以使用表3中SEQIDNO：241或SEQIDNO：242)、1μM盒特异性引物(SEQIDNO：96、97、101、102、106、107、110、以及111，关于适当的盒特异性引物参见表3)、以及1UExTaq(Takara生物公司)。对于盒特异性引物存在数种选项：潮霉素或巴龙霉素特异性、5’和/或3’，以及在各说明书中的两个或三个引物。初级PCR参数如下：1个循环[94℃持续2分钟]、30个循环[94℃持续1分钟，在55℃下退火1分钟，在72℃下延伸3分钟]、以及1个循环[在72℃下延伸10分钟]。
用以下各项进行二级巢式PCR：在20μl反应体积中0.5μl初级PCR反应物、1xExTaq缓冲液(Takara生物公司)、0.5M甜菜碱、3％DMSO(二甲基亚砜)、0.1mMdNTP、1μM与用于初级PCR中相同的RSO引物、1μM巢式盒特异性引物(SEQIDNO：98、99、100、103、104、105、108、109、112、113、114，对于适当的巢式盒特异性引物参见表3)以及1UExTaq(TakaraBio公司)。对于盒特异性引物存在数种选项：潮霉素或巴龙霉素特异性、5’和/或3’，以及在各说明书中的两个或三个引物。二级巢式PCR参数如下：1个循环[94℃持续2分钟]、30个循环[94℃持续1分钟，在55℃下退火1分钟，在72℃下延伸3分钟]、以及1个循环[在72℃下延伸10分钟]。在1％琼脂糖/EtBr电泳凝胶上对PCR反应进行观察。切下条带并且用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(Zymoresearch目录号#D4022)进行纯化。使用适当的AP2引物或适当的巢式盒特异性引物对纯化的DNA进行测序。使用BLAST分析来鉴定该插入片段在莱茵衣藻核基因组中的位置(http://genome.jgi-psf.org/Chlre4/Chlre4.home.html)。使用BLAST分析来确定该断裂基因的身份。
人工miRNA介导的沉默
基因中断的序列表征(参见表1)允许通过RNA干扰进行确认。可以通过表达反向重复转基因或人工miRNA来抑制转录本的表达(Rohr，J.，等人《植物学期刊》(PlantJ)，40，611-621(2004)；Molnar等人，《自然》(Nature)，447：1126-1130(2007)；Molnar等人，《植物学期刊》(PlantJ)，58：165-174(2009))。人工miRNA系统的实例示于图5和图6中。用靶向木聚糖酶转录本的人工miRNA盒来转化一个菌株，该菌株转化有从一个单个转录本产生两种蛋白质(一种博来霉素抗性蛋白和一种木聚糖酶(BD12))的表达盒。通过12个单独的菌株显示效能的变化。一些菌株未被敲低(木聚糖酶活性高、博来霉素抗性高、木聚糖酶转录本水平高)，但是一些菌株被敲低(木聚糖酶活性低、对博来霉素敏感、以及木聚糖酶转录本高)。这些数据证实使用人工miRNA构成一种确认方法。通过沉默鉴定的基因靶标来复制抗盐性证实该基因靶标是该表型的遗传定子。
人工miRNA表达载体构建如下。通过使用pBluescriptIISK(-)(安捷伦科技，加利福尼亚州)作为载体骨架产生修饰的表达载体，SENuc391(图1)。标记“Aph7””的区段是来自吸水链霉菌的潮霉素抗性基因。将来自莱茵衣藻rbcS2基因的第一内含子克隆到Aph7”中，以便增加表达水平并且结果增加了转化体的数量(Berthold等人《原生动物》(Protist)153：401-412(2002))。Aph7”位于莱茵衣藻β2-微管蛋白启动子之前并且其后是莱茵衣藻rbcS2终止子。将潮霉素抗性盒克隆到pBluescriptIISK(-)的NotI和XbaI位点中。随后，标记“杂合启动子”的区段指示以莱茵衣藻Hsp70A启动子、莱茵衣藻rbcS2启动子、以及来自莱茵衣藻rbcS2基因的第一内含子开始的一个融合启动子区域(Sizova等人《基因》(Gene)，277：221-229(2001))。使用重叠引物对“杂合启动子“进行PCR扩增，同时将限制酶切位点引入5’(XbaI)和3’(NdeI，BamHI，KpnI)末端两者中。将这种PCR产生的片段克隆到含有潮霉素抗性盒pBluescriptIISK(-)的XbaI和KpnI位点中。标记“AphVIII”的区段是侧翼为莱茵衣藻psaD基因启动子和终止子的巴龙霉素抗性基因。将盒平端连接到用Klenow处理的消化的KpnI位点上。
前体支架的产生类似于前面所述(Molnar等人，《植物期刊》(PlantJ)，58：165-174(2009))。通过两个引物臂引物1(SEQIDNO：243)和臂引物2(SEQIDNO：244)从莱茵衣藻基因组DNA将前体支架的5’臂扩增。通过两个引物臂引物3(SEQIDNO：245)和臂引物4(SEQIDNO：246)将前体支架的3’臂扩增。将两个生成的PCR片段凝胶纯化并且在一个PCR反应中使用引物臂引物1(SEQIDNO：243)和臂引物4(SEQIDNO：246)融合到一起，生成一个259bp的融合产物。将PCR片段凝胶纯化、用AseI和BamHI消化，并且连接到SEnuc391的NdeI和BamHI位点中。
将候选基因的转录本ID(参见表1)提交给WebMicroRNADesigner(Ossowski等人，《植物学期刊》(PlantJ)，53：674-690；WMD3，http://wmd3.weigelworld.org/)。对于每个基因而言，使用WMD3Oligo功能将“pChlamiRNA2和3”选作载体将预测的miRNA转变成全茎环序列，包括内源cre-MIR1157间隔区、以及相应的miRNA*。通过添加侧翼BglII位点以及将与BD11(SEQIDNO.228)的反义链的5’端互补的序列添加到3’端上来修饰生成的序列。合成这些修饰的序列并且表2显示了与NaCl候选菌株编号和基因序列相关联的人工miRNA序列。为了将miRNA茎环序列克隆到SENuc391中，按照生产厂家的说明书(Finnzymes)，在BD11、每种超聚物(ultramer)、以及引物(SEQIDNO.229)存在下在两个循环的PhusionPCR反应中首先通过PCR扩增来添加一个互补链。将生成的双链DNA片段克隆到SENuc391的BglII位点中。针对适当的取向对生成的质粒测序。
表2
序列表编号 菌株编号 amiRNA序列编号
SEQ ID NO：115 S7 SEQ ID NO：207
SEQ ID NO：116 S16 SEQ ID NO：208
SEQ ID NO：122 S65 SEQ ID NO：209
SEQ ID NO：201 S1659 SEQ ID NO：223
SEQ ID NO：129 S77 SEQ ID NO：210
SEQ ID NO：202 S1666 SEQ ID NO：224
SEQ ID NO：206 S1704 SEQ ID NO：227
SEQ ID NO：133 S105 SEQ ID NO：211
SEQ ID NO：198 S1612 SEQ ID NO：221
SEQ ID NO：200 S1644 SEQ ID NO：222
SEQ ID NO：204 S1693 SEQ ID NO：226
SEQ ID NO：203 S1687 SEQ ID NO：225
SEQ ID NO：135 S129 SEQ ID NO：213
SEQ ID NO：134 S123 SEQ ID NO：212
SEQ ID NO：166 S289 SEQ ID NO：215
SEQ ID NO：162 S276 SEQ ID NO：214
SEQ ID NO：169 S292 SEQ ID NO：217
SEQ ID NO：168 S291 SEQ ID NO：216
SEQ ID NO：170 S294 SEQ ID NO：218
SEQ ID NO：175 S338 SEQ ID NO：220
SEQ ID NO：127 S74 SEQ ID NO：235
SEQ ID NO：230 S1613 SEQ ID NO：236
SEQ ID NO：231 S1621 SEQ ID NO：237
SEQ ID NO：232 S1623 SEQ ID NO：238
SEQ ID NO：233 S1638 SEQ ID NO：239
SEQ ID NO：234 S1655 SEQ ID NO：240
转化DNA的制备涉及用酶PsiI限制性消化从而将DNA线性化。在莱茵衣藻cc1690(mt+)上进行所有的转化。使细胞生长并且通过电穿孔进行转化。在TAP培养基中使细胞生长至对数中期(大致2-6×106细胞/ml)。将细胞轻轻地旋转沉降(在2000与5000xg之间)持续5分钟。去除上清液，并且将细胞再悬浮于TAP培养基+40mM蔗糖中。在冰上将1μg(在1-5μLH2O中)转化DNA与250μL3×108细胞/mL混合，然后转移到0.4cm电穿孔杯中。电穿孔是这样进行的，电容设定于25uF，电压为800V从而递送2000V/cm，导致了大致10-14ms的时间常数。电穿孔之后，将杯返回到室温持续5-20分钟。将细胞转移到10mlTAP培养基+40mM蔗糖中，并且允许在连续摇动下在室温下恢复12-16小时。然后通过在2000xg与5000xg之间离心5分钟来收获细胞，弃去上清液，并且将沉淀再悬浮于0.5mlTAP培养基+40mM蔗糖中。然后将再悬浮的细胞铺板于固体TAP培养基+10μg/mL潮霉素和+10μg/mL巴龙霉素上。
选择
将用人工的miRNA构建体转化的42个集落挑入96孔微孔板中并且使其在室温下在高光照下在供给有5％CO2的箱中在200μlG0培养基中生长。还包括了高度抗NaCl的阳性对照、原始基因中断菌株作为对照、以及野生型莱茵衣藻cc1690(mt+)阴性对照。一旦培养物生长至饱和，将2μl培养物移液到固体G0培养基+75mMNaCl、G0培养基+100mMNaCl、G0培养基+125mMNaCl上(图15-38)。在图15-32中，野生型阴性对照处于第8行第6列位置，初始基因中断菌株处于第8行第5列位置，并且抗NaCl阳性对照处于第8行第3和4列位置。在图33-37中，野生型阴性对照处于第8行第1列位置，初始基因中断菌株处于第8行第3列位置，并且抗NaCl阳性对照处于第8行第5列位置。在图38中，野生型阴性对照处于第8行第6列位置，初始基因中断菌株处于第8行第4列位置，并且抗NaCl阳性对照处于第8行第2列位置。在室温下在高光照下在供给有5％CO2的箱中使平板生长。
进入核基因组中的随机整合通过位置效应影响蛋白质的表达。当表达人工miRNA时，也观察到这种效应。还通过抗NaCl的盐基因靶向人工miRNA转化体的分布(图15-38)与随机DNA片段(例如，靶向非盐目标的人工miRNA)的转化体的抗性进行比较来指示基因靶标的确认。高度抗性菌株的百分比是基因靶标和miRNA设计有效性两者的乘积。这些结果证实，当被插入和/或沉默中断时通过以下各项代表的基因赋予了NaCl抗性：S7(Augustusv.5蛋白质ID：523016)、S16(蛋白质ID：195781)、S65(Augustusv.5蛋白质ID：517886)、S1659(蛋白质ID：178706)、S77(Augustusv.5蛋白质ID：522165)、S1666(Augustusv.5蛋白质ID：514721)、S1704(蛋白质ID：77062)、S105(Augustusv.5蛋白质ID：524679)、S1612(蛋白质ID：103075)、S1644(蛋白质ID：331285)、S1693(蛋白质ID：188114)、S1687(蛋白质ID：291633)、S129(Augustusv.5蛋白质ID：510051)、S123(Augustusv.5蛋白质ID：519822)、S289(Augustusv.5蛋白质ID：518128)、S276(Augustusv.5蛋白质ID：512487)S292(Augustusv.5蛋白质ID：524030)、S291(Augustusv.5蛋白质ID：516191)、S294(Augustusv.5蛋白质ID：522637)、S338(Augustusv.5蛋白质ID：512361)、S74(Augustusv.5蛋白质ID：520845)、S1613(蛋白质ID：174261)、S1621(蛋白质ID：206559)、S1623(蛋白质ID：116195)、S1638(蛋白质ID：418706)、S1655(Augustusv.5蛋白质ID：525078)。
在梯度盐琼脂平板上对一些敲低转化体的表型(针对菌株S7和S16)进行测试。制造200ml的G0琼脂和200mlG0琼脂+200mMNaCl。将9”×9”生物测定托盘的一个边缘设定在0.9cm较高处以产生一个角度。首先倾倒G0琼脂并且以一个角度保留以便凝固。将平板返回到水平位置并且随后倒入200mlG0琼脂+200mMNaCl。使候选菌株S7、S16、连同它们相关联的人工miRNA转化菌株在G0培养基中生长。使用无菌环将大致1mL的2.5×107细胞/ml培养物横过9”×9”生物测定盘的一英寸部分进行涂布。将铺板的候选菌株在倾倒梯度的相同方向上进行涂布。还将野生型莱茵衣藻添加到平板中。在图12、13、和14中，基因中断菌株和敲低转化都显示耐盐性显著增加。
实例4：QPCR。
在这个实例中，通过定量PCR和抗盐性对4个盐基因靶标以及它们的相关的人工miRNA敲低菌株的转录本水平进行检查，这4个盐基因靶标即：S7(蛋白质ID：143076，Augustusv.5ID：523016，SEQIDNO：115)、S16(蛋白质ID：192517，SEQIDNO：116)、S77(Augustusv.5ID：522165，SEQIDNO：129)以及S338(Augustusv.5ID：512361，SEQIDNO：175)。在这个实例中的所有DNA操作都是基本上如Sambrook等人《分子克隆实验指南》(MolecularCloning：ALaboratoryManual)(冷却港实验室出版社1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress1989)以及Cohen等人《酶学方法》，(Meth.Enzymol.)297，192-208，1998所说明来进行的。
通过定量PCR在单独的敲低转化体上进行进一步确认来使表型与转录本水平相关。随着抗盐性的增加，观察到转录本水平的降低，由此进一步证明该表型遗传连锁到基因中断上。针对S7和S16，取在图12、13、和14中的梯度平板上的miRNA-2条带的前缘并且对单个克隆进行冲击。取5个集落。针对S77和S338，取6个随机敲低转化体。在高光照下在供给有5％CO2的箱中使敲低菌株在5mlG0培养基中生长。根据生产厂商将藻类生物质再悬浮于植物RNA试剂(Invitrogen)中并且提取RNA。根据生产厂商通过使用RNeasy旋柱净化(Qiagen)去除残余的DNA从而确保纯化的RNA。使用iScriptcDNA合成试剂盒(Bio-RadLaboratories)将500ng的RNA反转录，并且在PCR扩增之前将生成的cDNA稀释十倍。
使用Biorad的MyiQ2双色实时PCR检测系统进行实时PCR。对qPCR分析中使用的引物进行设计和测试以便确保同一性。在25μl体积中用6μl4μM引物混合物、6μl稀释的cDNA、和12.5μliQSYBR绿色超级混合物(它含有dNTP、iTaq聚合酶、6mMMgCl2、SYBR绿色I、20nM荧光素)进行反应。实验方案如下：1个循环[95℃持续30秒]、45个循环[95℃持续10秒紧接着57℃持续30秒]、以及77个循环[在57℃下延伸10秒]。使用iQ5软件对定量数据进行分析。使用管家基因的转录本水平将转录本水平归一化并且与野生型进行比较。针对S7、S16、S77、S338的qPCR结果对应地示于图10、11、39、以及图40中。对于S7和S16由于仅取耐盐藻类，所有6个样品的转录本水平显著降低了。对于S77和S338的情况，敲低菌株都是耐盐的。针对这两种情况存在细微差别。在图39中，菌株S77-4、S77-5、和S77-6具有与降低的耐盐性相关的稍高的转录本水平，而降低的转录本水平(S77-1、S77-2、和S77-3)与增加的耐盐性相关。在图40中，菌株S338-4具有与降低的耐盐性相关的稍高的转录本水平，而降低的转录本水平(S338-1、S338-2、S338-3、S338-5、以及S338-6)与增加的耐盐性相关。降低的转录本水平和耐盐性连同未改变的转录本水平和盐敏感性进一步确认了这些基因靶标通过敲除或敲低赋予了抗盐性。
表3
RNA印迹分析
可以使用RNA印迹技术检测转基因细胞系中的靶基因的转录本表达水平。可以如所说明(例如，如Molna等人，《自然》(Nature)，447，：1126-1129(2007)中所说明)进行RNA提取和小RNA检测。详细实验方案可以在例如http://www.plantsci.cam.ac.uk/Baulcombe/pdfs/smallrna.pdf找到。将总RNA分离出来，在15％变性聚丙烯酰胺凝胶中分离，并且印迹到HybondN+(GELifesciences，http://www.gelifesciences.com)上。将与amiRNA序列的反向互补物互补的DNA寡核苷酸在γ32P-ATP存在下用多核苷酸激酶(PNK)标记并且与固定的RNA杂交。根据制造厂商的说明书标记的十个RNA标记(Ambion，USA，http://www.ambion.com)被用作尺寸标记。
实例5：通过敲除和/或敲低产生耐盐菌株的其他方法
一旦基因中断的序列表征是已知时，存在着许多有用的用来产生耐盐菌株的方法。如在实例3中提及的，人工miRNA的表达导致转录本水平降低。RNA沉默的其他方法涉及使用串联反向重复系统(Rohr等人，《植物学期刊》(PlantJ)，40：611-621(2004))，其中靶向基因转录本的100-500bp区域被表示为反向重复。沉默的优点在于可以存在其中靶转录本被敲低的变化程度。通常地，转录本的表达是对于细胞活力的必要的。因此，可以存在允许成活力以及还有所希望的表型(例如，耐盐性)两者的中间表达水平。通过沉默发现对于产生该表型所必需的特定表达水平是有可能的。
同源重组可以通过许多方法来进行并且已经展示于绿藻中(Zorin等人，《基因》(Gene)，423：91-96(2009)；Mages等人，《原生动物》(Protist)158：435-446(2007))。可以通过同源重组获得敲除，其中通过基因缺失或插入中断该基因的外源DNA来消除基因产物(例如，mRNA转录本)。
基因缺失
一种这样的方法是PCR扩增该基因的两个非连续区域(从数百个DNA碱基对至数千个DNA碱基对)。这两个非连续区域称为克隆到质粒中的同源区1和同源区2。然后可以使用质粒来转化宿主生物以产生敲除。
基因插入
另一种方法是PCR扩增该基因的两个连续或两个非连续区域(从数百个DNA碱基对至数千个DNA碱基对)。一个第三序列连接在该第一和第二区域之间，并且将生成的构建体克隆到质粒中。然后可以使用质粒来转化宿主生物以产生敲除。该第三序列可以是，例如，一个抗生素选择标记盒、一个营养缺陷型标记盒、一个蛋白质表达盒、或多个盒。
虽然在此已经对某些实施方案进行了显示和说明，本领域的技术人员应当清楚的是这些实施方案仅作为举例而被提供。现在本领域的技术人员会想到众多的变更、变化、和取代，而不偏离本披露。应当理解的是在此说明的本披露的实施方案的各种替代方案可以用于实践本披露。可以预期的是以下的权利要求限定了本披露的范围并且由此涵盖这些权利要求的范围之内的方法和结构以及它们的等效物。

Claims (30)

1.一种微藻，包括核苷酸序列SEQIDNO.115的敲低或敲除；其中与没有所述敲低或敲除的微藻相比较，所述微藻在含有大约75mM与275mM之间的氯化钠的水性环境中具有增加的生长速率，以及与没有所述敲低或敲除的微藻中的所述核苷酸序列的转录相比较，所述核苷酸序列的转录被降低，或者其中所述敲低或敲除导致所述核苷酸序列编码的蛋白质翻译的降低。
2.如权利要求1所述的微藻，其中与没有所述敲低或敲除的微藻相比较，由SEQIDNO.115编码的蛋白质的活性被所述敲低或敲除降低。
3.如权利要求2所述的微藻，其中所述活性被降低至少10％。
4.如权利要求3所述的微藻，其中所述活性被降低至少20％。
5.如权利要求4所述的微藻，其中所述活性被降低至少50％。
6.如权利要求1所述的微藻，其中所述微藻的生长速率比没有所述敲低或敲除的所述微藻至少高10％。
7.如权利要求6所述的微藻，其中所述微藻的生长速率比没有所述敲低或敲除的所述微藻至少高20％。
8.如权利要求7所述的微藻，其中所述微藻的生长速率比没有所述敲低或敲除的所述微藻至少高80％。
9.如权利要求1所述的微藻，其中所述转录被降低至少10％。
10.如权利要求9所述的微藻，其中所述转录被降低至少20％。
11.如权利要求10所述的微藻，其中所述转录被降低至少50％。
12.如权利要求1所述的微藻，其中所述翻译被降低至少10％。
13.如权利要求12所述的微藻，其中所述翻译被降低至少20％。
14.如权利要求13所述的微藻，其中所述翻译被降低至少50％。
15.如权利要求1所述的微藻，其中所述微藻是衣藻属、团藻目、杜氏藻属、栅藻属、小球藻属、红球藻属、或微绿球藻属中的至少之一。
16.如权利要求1所述的微藻，其中所述微藻是团藻属。
17.如权利要求15或16所述的微藻，其中所述微藻是莱茵衣藻、海洋微绿球藻、盐生微绿球藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻、眼点拟微绿球藻或D.tertiolecta的至少之一。
18.如权利要求1所述的微藻，其中在所述水性环境中的氯化钠的所述浓度是在275mM与150mM之间。
19.一种基因修饰的微藻，通过敲低或敲除核苷酸序列SEQIDNO.115而获得；其中与未用该敲低或敲除修饰的微藻相比较，该微藻在含有大约在75mM与275mM之间的氯化钠的水性环境中具有增加的生长速率。
20.如权利要求19所述的微藻，其中与未用所述敲低或敲除修饰的微藻中的所述蛋白质的活性相比较，由SEQIDNO.115编码的蛋白质的活性被所述敲低或敲除降低。
21.如权利要求19所述的微藻，其中所述微藻的生长速率比未用所述敲低或敲除修饰的所述微藻高至少10％。
22.如权利要求21所述的微藻，其中所述微藻的生长速率比未用所述敲低或敲除修饰的所述微藻高至少20％。
23.如权利要求22所述的微藻，其中所述微藻的生长速率比未用所述敲低或敲除修饰的所述微藻高至少80％。
24.如权利要求20所述的微藻，其中所述蛋白质的活性减少至少10％。
25.如权利要求24所述的微藻，其中所述蛋白质的活性减少至少20％。
26.如权利要求25所述的微藻，其中所述蛋白质的活性减少至少50％。
27.如权利要求19所述的微藻，其中所述微藻是衣藻属、团藻目、杜氏藻属、栅藻属、小球藻属、红球藻属、或微绿球藻属中的至少之一。
28.如权利要求19所述的微藻，其中所述微藻是团藻属。
29.如权利要求27或28所述的微藻，其中所述微藻是莱菌衣藻、海洋微绿球藻、盐生微绿球藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻、眼点拟微绿球藻或D.tertiolecta的至少之一。
30.如权利要求19所述的微藻，其中在所述水性环境中的氯化钠的所述浓度是在275mM与150mM之间。
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