CN1624120A - 盐生杜氏藻（6－4）光裂合酶及其编码序列 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的耐盐相关蛋白－盐生杜氏藻(6－4)光裂合酶，编码(6－4)光裂合酶的多核苷酸和经重组技术产生这种(6－4)光裂合酶的方法。本发明还公开了编码这种(6－4)光裂合酶的多核苷酸的用途。本发明还公开了此(6－4)光裂合酶用于改善植物耐盐性和抗紫外性的方法。

Description

盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶及其编码序列

技术领域

本发明属于生物学领域，具体地说，本发明涉及新的编码盐生杜氏藻(Dunaliella salina)耐盐相关蛋白-(6-4)光裂合酶的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本发明的多肽是一种新的耐盐相关蛋白。

背景技术

目前，世界人口不断增加，而可耕种土地却不断减少。然而，地球上还有许多因盐碱化而无法有效利用的土地资源。为了有效地利用这些盐碱化的土地资源，人们一直在寻找既适应生长而具有较高经济价值的植物品种。然而，迄今为止没有十分合适的植物品种。

另一种开发耐盐碱植物的方法是对已有的植物品种，尤其是具有较高经济价值的植物品种进行改良。然而，传统的植物改良方法费时、费力、并且缺乏针对性。

为了有效地、针对性地改善植物品种的耐盐性，本领域迫切需要开发与耐盐性有关的基因和蛋白。

此外，随着世界工业的迅猛发展，大量温室气体的释放导致全球变暖，特别是氯氟烃(氟利昂，chlorofluorocarbons，CFCs)等化学物质的大量使用，大气平流层臭氧浓度日益下降，地面太阳辐射(特别是UV-B，280-320nm)的增强。近地表太阳UV-B辐射强度的增加对生活在地球生物圈中的各种生物以及它们的生存环境的质量都将产生深刻的影响。UV-B辐射对人类、动物的直接影响主要体现在眼和皮肤这些易受太阳照射的部位。而对植物则主要是光合作用系统的伤害，因此太阳UV-B辐射对植物的危害大于对人体健康的影响。为了有效和针对性地提高生物体的抗紫外线特性，迫切需要开发抗紫外线相关的基因与蛋白。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的盐生杜氏藻耐盐相关蛋白(6-4)光裂合酶以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤其是在提高植物耐盐性方面的用途。

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)属绿藻门、绿藻纲、团藻目、多毛藻科、杜氏藻属，主要生长于高盐度水体中。细胞形态通常为卵圆形，当外界渗透压发生变化时，其形态可变为球形至纺锤形。它具有两条等长的鞭毛和一个杯状叶绿体，在叶绿体的外缘可积累大量的β-胡萝卜素小滴，是细胞呈橙红色。细胞无细胞壁，具有由糖蛋白形成的包被。盐生杜氏藻与衣藻(Chlamydomonas)具有较近的亲缘关系。本发明人通过多年对盐生杜氏藻的研究，发现了盐生杜氏藻中与耐盐性有关的蛋白-(6-4)光裂合酶，在此基础上完成了本发明。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的(6-4)光裂合酶(或简称为“光裂合酶”)，该酶源自盐生杜氏藻的，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该酶选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(6-4)光裂合酶功能的由(a)衍生的多肽。

更佳地，该酶是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％相同性：(a)编码上述盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中1-1800位的序列；(b)具有SEQ IDNO：1中1-1803位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的方法，该方法包含：(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶。

在本发明的第五方面，提供了与上述的盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-1803个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶活性的化合物，以及抑制盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在(6-4)光裂合酶的方法，它包括：将样品与(6-4)光裂合酶的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在(6-4)光裂合酶。

在本发明的第八方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶活性的激动剂，或者筛选抑制盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第九方面，提供了一种产生转基因植物的方法，该方法可改善植物耐盐性和/或抗紫外性，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有(6-4)光裂合酶DNA编码序列，所述的(6-4)光裂合酶选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(6-4)光裂合酶功能的由(a)衍生的多肽。

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使(6-4)光裂合酶DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入(6-4)光裂合酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1是GST-(6-4)光裂合酶融合蛋白的表达电泳图。其中泳道M是蛋白质分子量标准，泳道1是JM109同条件IPTG诱导4小时；泳道2为pGEX-4T-1的转化菌同条件诱导4小时；泳道3为pGEX-4T-1/6-4转化菌无诱导；泳道4为pGEX-4T-1/6-4转化菌诱导2小时；泳道5为pGEX-4T-1/6-4转化菌诱导4小时。

具体实施方式

在本发明中，术语“(6-4)光裂合酶[(6-4)Photolyase-Like Protein]”、“(6-4)光裂合酶多肽”或“耐盐相关蛋白(6-4)光裂合酶”可互换使用，都指具有盐生杜氏藻耐盐相关蛋白(6-4)光裂合酶氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的耐盐相关蛋白(6-4)光裂合酶。

在本发明中，“光裂合酶”指“(6-4)光裂合酶”，除非特别指出。

(6-4)光裂合酶催化的反应如下：

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的(6-4)光裂合酶或多肽”是指(6-4)光裂合酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化(6-4)光裂合酶。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶”指具有盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的可溶性片段。通常，该片段具有盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶或多肽的类似物。这些类似物与天然盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶保守性变异多肽”指与SEQ IDNO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                   表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser

Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码(6-4)光裂合酶的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或(6-4)光裂合酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的(6-4)光裂合酶。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得耐盐性提高的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗(6-4)光裂合酶功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。较佳地，指那些能与盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的分子，也包括那些并不影响盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶的抗体可用于检测样品中的盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶。例如通过定量检测盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶，并利用(6-4)光裂合酶与盐浓度的相关性，可以确定盐生杜氏藻生产环境中盐浓度。

多克隆抗体的生产可用盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明还涉及定量和定位检测盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶水平，可用于解释盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶在耐盐性方面重要性。

一种检测检测样品中是否存在(6-4)光裂合酶的方法是利用(6-4)光裂合酶的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与(6-4)光裂合酶特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在(6-4)光裂合酶。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用(6-4)光裂合酶特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测(6-4)光裂合酶的转录产物。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从盐生杜氏藻cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1803个碱基，其开放读框位于1-1800位，编码全长为600个氨基酸的盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶(SEQ ID NO：2)。(6-4)光裂合酶为改善植物的耐盐性和耐紫外性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的克隆

1.盐生杜氏藻的采集(Collection)

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)购自武汉水生生物研究所藻种库。

2.Poly A⁺RNA的分离(Poly A⁺RNA isolation)

用Trizol试剂(Gibco，NY，USA)提取盐生杜氏藻的总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)提供的试剂盒操作说明书抽取盐生杜氏藻的mRNA。

3.盐生杜氏藻cDNA文库的构建(Cloning of Full-length cDNA)

使用Smart cDNA Library Construction Kit(ClonTech)提供的试剂盒说明书，以λTriplEX2为载体，构建盐生杜氏藻的cDNA噬菌体文库。

4.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

通过对大量不同物种(包括如拟南芥、果蝇、非洲爪蟾等)的(6-4)光裂合酶进行比较，确定了部分氨基酸保守序列。据此设计引物，采用RACE方法(Gibco试剂盒，NY，USA)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)使用引物，以Poly A⁺RNA为模板，进行RT-PCR扩增

以寡核苷酸：5′ATGGCAAGGGAGGCAGGAGTGGA 3′(SEQ ID NO：3)为正向引物；寡核苷酸：5′GAGGGACATCGGTGGCTGTGAAT 3′(SEQ ID NO：4)为反向引物，以Poly A+RNA为模板，进行RT-PCR扩增，扩增条件为94℃5分钟，随后94℃30秒、55℃30秒、72℃ 1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得的片段长度约为0.5kb，回收片段连接到购买的T-easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序，测得一个506bp序列。

将该序列及其编码蛋白质序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+Swissprot+Superdate+PIR数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与拟南芥的(6-4)光裂合酶基因有较高的同源性，证实了引物的正确。

(2).RACE

根据以上序列分析设计

5’RACE引物：5’GGTGCCTCTTTGAAGCCCATCTCCT 3’(SEQ ID NO：5)；

3’RACE引物：5’ATTCACAGCCACCGATGTCCCTC 3’(SEQ ID NO：6)；

使用SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)，按照操作手册进行，得到盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的5’和3’端序列。

(3).PCR扩增得到(6-4)光裂合酶基因编码区(过程同(1))。

在拼接得到全长(包括完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物：以寡核苷酸：CGCGGATCCATGCTGAGGTGCGCA(SEQ ID NO：7)为正向引物；寡核苷酸：CCGCTCGAGTTACTGGCACCTTTTCTT(SEQ ID NO：8)为反向引物，以用常规方法抽提的盐生杜氏藻总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序。结果验证了盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶蛋白的全长编码序列的正确性。

盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因全长序列如SEQ ID NO：1所示，其中读框位置是1-1800位。

atgctgaggt gcgcacaacc taagtatgca cctttgaagc gccaggcctt caaccagaaa    60

ttgaataggc ttgtggcagc agcccgcacc cctagcaaat catcttcaac atcaaggatg    120

gcctcaacat caagtggaca gcaaggccgc tctatcttgt ggtttagaaa gggcctgcgg    180

ctccacgaca accctgctct cagagatgcc tgcacagggt ctgctgctgt gttccctatc    240

ttcatcattg atccgtactt ccttcaaaaa tccaataaca aggttggtgt aaaccgctat    300

cagttccttt tggagagctt gagcgacctg aattcgagcc tgactagtct tggctcccaa    360

ctcctggttt tgagaggtac cccagaggag gtgataccaa gagttctgcg cgactggagc    420

atcaagaagc tctgctatga gattgacacg gagccatacg ctaaggcccg agatgctcgt    480

gtagatgaca tggcaaggga ggcaggagtg gaggtcaaaa agcactggag ccacacacta    540

tatgatacag acatgctagt gcgagaaaac aaagggaagg caccactgac catgcaggcg    600

tttgagaagt tggtagaccg tgttggccac cccctcaccg ctctgcctgc ccccacggct    660

cgccttcctc cggttgatgt cagcctgcca ggcatcaagg acgcagaagt gggagtcccc    720

acgtggcagg agatgggctt caaagaggca cccacagcta tcttcaaggg cggagagacg    780

gaggccctga agaggctgga acattacatg aaagacacaa agtgggyggc ctcgtttgag    840

aagccttcca ccgacccctc agccttcaca gagccctcca ccactgcgct gtccccatac    900

ctcaagtttg gatgcctgtc tgcacgcttc tttcaccaaa ggctgctgga tgtgtaccgc    960

cttcacccca agcattcaca gccaccgatg tccctccgag ggcagctgct gtggcgagag    1020

ttcttctata cattgggctc acacacccca aactttgacc gcatagcagg caaccccatc    1080

tgccgacaga ttacttggga cacaaaccca gccctgctca aggcttggcg agatggggcc    1140

actggttatc catggattga tgctgcgatg acccaactga gggaatgggg ctggatgcac    1200

cacctggcac gccactctgt ggcttgcttc ctcaccaggg gggacctgta cctgagctgg    1260

gagtctggca aggaggtgtt cgaggagttg ctcctggatg cagactattt cattaatgca    1320

gcaaactgga tgtggctgag tgccagcgcg ttctttgcac aatactttag agtgtacagc    1380

cctgttgtgt ttggcaagaa gtatgacaag gagggcgcct acatccggaa gttcttgcca    1440

gtgctgaagg acatgcccgc aaagtacatc tatgagccat ggactgcgcc gaaagaagtc    1500

cagcagcgcg ccaactgtat cataggccgg gactaccctg ctcccattgt ggaccatgca    1560

gttgcaagca aagaatgcat agccagaatg ggagctgcgt acaaagccac aaacaccggg    1620

ggcagtgcag gcaaagcctc ccctgcaaaa gcggcctctt ctggtgacgc cggcacttct    1680

gcatcagcag gagcgccatc ttcgtccaag aagaccacag gcaagcgggc agcatctgca    1740

gaccaaggtg gcaagcgtca aaagactctg gaggagtcga tgacgaagaa aaggtgccag    1800

taa                                                                  1803

(SEQ ID NO：1)

盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因编码一个由600个氨基酸构成(6-4)光裂合酶，其序列如SEQ ID NO：2所示。

MLRCAQPKYA PLKSQAFNQK LNRLVAAART PSKSSSTSRM ASTSSGQQGR SILWFRKGLR    60

LHDNPALRDA CTGSAAVFPI FIIDPYFLQK SNNKVGVNRY QFLLESLSDL NSSLTSLGSQ    120

LLVLRGTPEE VIPRVLRDWS IKKLCYEIDT EPYAKARDAR VDDMAREAGV EVKKHWSHTL    180

YDTDMLVREN KGKAPLTMQA FEKLVDRVGH PLTALPAPTA RLPPVDVSLP GIKDAEVGVP    240

TWQEMGFKEA PTAIFKGGET EALKRLEHYM KDTKWVASFE KPSTDPSAFT EPSTTALSPY    300

LKFGCLSARF FHQRLLDVYR LHPKHSQPPM SLRGQLLWRE FFYTLGSHTP NFDRIAGNPI    360

CRQITWDTNP ALLKAWRDGA TGYPWIDAAM TQLREWGWMH RLARHSVACF LTRGDLYLSW    420

ESGKEVFEEL LLDADYFINA ANWMWLSASA FFAQYFRVYS PVVFGKKYDK EGAYIRKFLP    480

VLKDMPAKYI YEPWTAPKEV QQRANCIIGR DYPAPIVDHA VASKECIARM GAAYKATNTG    540

GSAGKASPAK AASSGDAGTS ASAGAPSSSK KTTGKRAASA DQGGKRQKTL EESMTKKRCQ    600

实施例2

盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶蛋白的结构和功能

将盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因全长序列及其编码蛋白用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank cdstranslations+PDB+SwissProt+PIR数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现在核酸数据库中没有明显的相似序列。只是在1243bp到1332bp这90个核苷酸序列总能击中光裂合酶/蓝光受体家族的成员。在氨基酸水平上，它与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的(6-4)光裂合酶mRNA全编码序列(GenBankAccession No.X66412)有52％的相同性，它与非洲爪蟾(Xenopus laevis)的(6-4)光裂合酶蛋白(GenBank Accession No.BAA97126)有53％的相同性。

将盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶蛋白的氨基酸在blocks数据库(http：//www.blocks.fhcrc.org)中检索结构域，发现在氨基酸序列中存在(6-4)光裂合酶蛋白的所有模块，对应模块号为IPB002081A、IPB002081B、IPBO02081C、IPBO02081D、IPBO02081E、IPBO02081F，分布如下：

IPB006050A  54-64

IPB006050B  145-158

IPB006050C  282-309

IPB006050D  386-434

IPB006050E  457-481

在该氨基酸序列中存在(6-4)光裂合酶蛋白功能模块，因此可预见其具有(6-4)光裂合酶蛋白的相应功能。

实施例3

盐生杜氏藻cDNA文库大规模测序和表达谱芯片的构建(High ThroughputSequencing of cDNA Library and Construction of Expression Microarray)

对所得的盐生杜氏藻cDNA文库中的克隆进行序列测定，用所测得的靶序列构建表达谱芯片。将测序所得的克隆子溶解于3×SSC溶液中，使用Cartesian公司的Cartesian 7500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片，按公司提供的使用说明书操作。点样后玻片经水合、干燥、UV交连，再分别用SDS、水处理10分钟，晾干备用。

实施例4

盐生杜氏藻表达谱芯片的筛选(Screening of the Expression Microarry)

使用0.5mol/l、1.5mol/l、4.5mol/l浓度的NaCl溶液分别处理盐生杜氏藻2小时后，提取不同盐浓度处理后的盐生杜氏藻mRNA，分别用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP标记，与表达谱芯片杂交，用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片，用Axon公司的Genepix 3.01软件分析荧光信号强度。

表达谱芯片杂交结果显示，有若干基因的表达量与盐生杜氏藻的生长盐浓度呈高度相关。其中，(6-4)光裂合酶基因为其中一条。其具体数据分为三组：第一组为cy5(4M)、cy3(1.5M)标记的；第二组为cy5(4M)、cy3(0.5M)标记的；第三组为cy5(1.5M)、cy3(0.5M)标记的。三组标记荧光信号强度的自然对数1n(cy5/cy3)的平均值为0.4，这说明随着盐浓度的变化，该基因的表达差异在1.5倍左右。

综上所述，(6-4)光裂合酶为一未见报道的新型耐盐相关蛋白。

实施例5

盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因表达载体的构建

根据盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物(对应于SEQ ID NO：1中最前20bp和最后20bp)，经PCR扩增后，将盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因cDNA克隆至中间载体pBluescript(购自Stratagene公司)，进一步克隆到双元表达载体pBI 121(购自Clontech公司)，在保证阅读框的前提下鉴定好的表达载体，在将其转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中，获得阳性克隆，用于转化模式植物烟草。

实施例6

利用叶盘法转化烟草

按如下步骤转化烟草：

(1)用无菌牙签挑取YEB选择平板上的实施例5中制备的农杆菌阳性克隆，接种于2M LYEB液体(Sm⁺，Kan⁺)，28℃，200rpm振荡培养24-36小时；

(2)室温下4,000g离心10分钟；

(3)弃上清，菌体用1/2 MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD₆₀₀在0.5左右；

(4)取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1cm²见方的小叶片；

(5)将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5分钟，在无菌滤纸上吸干菌液；

(6)把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；

(7)将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+羧卞青霉素250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；

(8)约20天后可见分化芽长出，带芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；

待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

初步结果表明，转入盐生杜氏藻藻烯醇酶基因的烟草的耐盐性略高于对照烟草。

实施例7

盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因表达载体的构建

根据盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的全长编码序列，设计扩增出完整编码读框的引物，

正向引物为

CGCGGATCCATGCTGAGGTGCGCA(SEQ ID NO：7)

反向引物为：

CCGCTCGAGTTACTGGCACCTTTTCTT(SEQ ID NO：8)

并在正反引物上分别引入BamH I以及Xho I限制性酶切位点。盐生杜氏藻藻烯醇酶基因的全长基因经PCR扩增后和酶切后，将盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶cDNA克隆至中间载体(pBluescript)，进一步克隆到原核表达载体pEGX-4T-1(购自ANERSHAM PHARMACIA公司)，在保证阅读框正确的前提下鉴定表达载体，在将其转入大肠杆菌(JM109)感受态细胞中，形成表达载体pEGX-4T-1/6-4，挑选克隆子，提取质粒进行BamHI、Xhol双酶切验证。

实施例8

盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的功能鉴定

(1)融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测：

对实施例7中获得的转化带pEGX-4T-1/6-4的大肠杆菌，按1％体积接种到新的含氨苄的LB培养基中，37摄氏度剧烈震荡培养3～5h，至其OD600为0.6时，加IPTG至终浓度为1mmol/l，再培养1～4h，每隔1h分别取样1ml离心，40μl无菌水重悬，加入等体积样品缓冲液，沸水煮5min，冷却后取20微升进行8％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，并同时设置大肠杆菌JM109空白对照和pGEX-4T-1转化菌对照。

融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测：用IPTG诱导无转化的大肠杆菌JM109、转化了载体pGEX-4T-1和转化了载体pGEX-4T-1/6-4的大肠杆菌，它们与无诱导的含质粒pGEX-4T-1/6-4的大肠杆菌的总蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图。其中含质粒pGEX-4T-1/6-4的大肠杆菌经过IPTG诱导后，其细胞裂解物在对应于约90KDa处有一明显的GST-(6-4)光裂合酶条带，分子量与预测值相符(图1)。

(2)盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的功能鉴定：

各挑取对照菌(含质粒pGEX-4T-1)和阳性菌(含质粒pGEX-4T-1/6-4的大肠杆菌)的单菌落，分别在2ml含抗生素(Amp)的LB液体培养基中37摄氏度培养过夜。吸取10ul培养物加到2ml新鲜的LB(含Amp)中37摄氏度继续培养3～4小时后，再加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养2～3小时。在2个无菌的1.5ml的离心管中加入1ml无菌的LB培养基，分别吸取10ul培养物稀释到管中，振荡混匀。吸取100ul的稀释液涂布在含Amp的LB固体培养基上，每个样品涂布3个培养皿，分别取1个作为对照。将剩余的4个培养皿，放置在紫外光下照射(打开培养皿的盖子)，时间为30秒。照射完毕后，立即盖上盖子，每个样品取出1个用牛皮纸包严，不要透光，暗处37摄氏度培养过夜。剩余的2个和对照一起放到光下，37摄氏度培养过夜。计算菌落数，根据对照计算存活菌落数及存活率。

结果使得含有(6-4)光裂合酶基因表达载体的菌种具有比不含此质粒的菌种在紫外线下具有更高的存活率(约提高50％)，这表明分离出的(6-4)光裂合酶具有修复DNA的活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                           序列表

<110>四川川大光耀生物工程有限公司

<120>盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶及其编码序列

<130>037214

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1803

<212>DNA

<213>盐生杜氏藻(Dunaliella salina)

<400>1

atgctgaggt gcgcacaacc taagtatgca cctttgaagc gccaggcctt caaccagaaa    60

ttgaataggc ttgtggcagc agcccgcacc cctagcaaat catcttcaac atcaaggatg    120

gcctcaacat caagtggaca gcaaggccgc tctatcttgt ggtttagaaa gggcctgcgg    180

ctccacgaca accctgctct cagagatgcc tgcacagggt ctgctgctgt gttccctatc    240

ttcatcattg atccgtactt ccttcaaaaa tccaataaca aggttggtgt aaaccgctat    300

cagttccttt tggagagctt gagcgacctg aattcgagcc tgactagtct tggctcccaa    360

ctcctggttt tgagaggtac cccagaggag gtgataccaa gagttctgcg cgactggagc    420

atcaagaagc tctgctatga gattgacacg gagccatacg ctaaggcccg agatgctcgt    480

gtagatgaca tggcaaggga ggcaggagtg gaggtcaaaa agcactggag ccacacacta    540

tatgatacag acatgctagt gcgagaaaac aaagggaagg caccactgac catgcaggcg    600

tttgagaagt tggtagaccg tgttggccac cccctcaccg ctctgcctgc ccccacggct    660

cgccttcctc cggttgatgt cagcctgcca ggcatcaagg acgcagaagt gggagtcccc    720

acgtggcagg agatgggctt caaagaggca cccacagcta tcttcaaggg cggagagacg    780

gaggccctga agaggctgga acattacatg aaagacacaa agtgggyggc ctcgtttgag    840

aagccttcca ccgacccctc agccttcaca gagccctcca ccactgcgct gtccccatac    900

ctcaagtttg gatgcctgtc tgcacgcttc tttcaccaaa ggctgctgga tgtgtaccgc    960

cttcacccca agcattcaca gccaccgatg tccctccgag ggcagctgct gtggcgagag   1020

ttcttctata cattgggctc acacacccca aactttgacc gcatagcagg caaccccatc   1080

tgccgacaga ttacttggga cacaaaccca gccctgctca aggcttggcg agatggggcc   1140

actggttatc catggattga tgctgcgatg acccaactga gggaatgggg ctggatgcac   1200

cacctggcac gccactctgt ggcttgcttc ctcaccaggg gggacctgta cctgagctgg   1260

gagtctggca aggaggtgtt cgaggagttg ctcctggatg cagactattt cattaatgca   1320

gcaaactgga tgtggctgag tgccagcgcg ttctttgcac aatactttag agtgtacagc   1380

cctgttgtgt ttggcaagaa gtatgacaag gagggcgcct acatccggaa gttcttgcca   1440

gtgctgaagg acatgcccgc aaagtacatc tatgagccat ggactgcgcc gaaagaagtc   1500

cagcagcgcg ccaactgtat cataggccgg gactaccctg ctcccattgt ggaccatgca   1560

gttgcaagca aagaatgcat agccagaatg ggagctgcgt acaaagccac aaacaccggg   1620

ggcagtgcag gcaaagcctc ccctgcaaaa gcggcctctt ctggtgacgc cggcacttct   1680

gcatcagcag gagcgccatc ttcgtccaag aagaccacag gcaagcgggc agcatctgca   1740

gaccaaggtg gcaagcgtca aaagactctg gaggagtcga tgacgaagaa aaggtgccag   1800

taa                                                                 1803

<210>2

<211>600

<212>PRT

<213>盐生杜氏藻(Dunaliella salina)

<400>2

Met Leu Arg Cys Ala Gln Pro Lys Tyr Ala Pro Leu Lys Ser Gln Ala

1               5                  10                  15

Phe Asn Gln Lys Leu Asn Arg Leu Val Ala Ala Ala Arg Thr Pro Ser

            20                 25                  30

Lys Ser Ser Ser Thr Ser Arg Met Ala Ser Thr Ser Ser Gly Gln Gln

        35                 40                  45

Gly Arg Ser Ile Leu Trp Phe Arg Lys Gly Leu Arg Leu His Asp Asn

    50                 55                  60

Pro Ala Leu Arg Asp Ala Cys Thr Gly Ser Ala Ala Val Phe Pro Ile

65                 70                  75                  80

Phe Ile Ile Asp Pro Tyr Phe Leu Gln Lys Ser Asn Asn Lys Val Gly

                85                 90                  95

Val Asn Arg Tyr Gln Phe Leu Leu Glu Ser Leu Ser Asp Leu Asn Ser

            100                105                 110

Ser Leu Thr Ser Leu Gly Ser Gln Leu Leu Val Leu Arg Gly Thr Pro

        115                120                 125

Glu Glu Val Ile Pro Arg Val Leu Arg Asp Trp Ser Ile Lys Lys Leu

    130                135                 140

Cys Tyr Glu Ile Asp Thr Glu Pro Tyr Ala Lys Ala Arg Asp Ala Arg

145                150                 155                 160

Val Asp Asp Met Ala Arg Glu Ala Gly Val Glu Val Lys Lys His Trp

                165                170                 175

Ser His Thr Leu Tyr Asp Thr Asp Met Leu Val Arg Glu Asn Lys Gly

            180                185                 190

Lys Ala Pro Leu Thr Met Gln Ala Phe Glu Lys Leu Val Asp Arg Val

        195                200                 205

Gly His Pro Leu Thr Ala Leu Pro Ala Pro Thr Ala Arg Leu Pro Pro

    210                215                 220

Val Asp Val Ser Leu Pro Gly Ile Lys Asp Ala Glu Val Gly Val Pro

225                230                 235                 240

Thr Trp Gln Glu Met Gly Phe Lys Glu Ala Pro Thr Ala Ile Phe Lys

                245                 250                 255

Gly Gly Glu Thr Glu Ala Leu Lys Arg Leu Glu His Tyr Met Lys Asp

            260                 265                 270

Thr Lys Trp Val Ala Ser Phe Glu Lys Pro Ser Thr Asp Pro Ser Ala

        275                 280                 285

Phe Thr Glu Pro Ser Thr Thr Ala Leu Ser Pro Tyr Leu Lys Phe Gly

    290                 295                 300

Cys Leu Ser Ala Arg Phe Phe His Gln Arg Leu Leu Asp Val Tyr Arg

305                 310                 315                 320

Leu His Pro Lys His Ser Gln Pro Pro Met Ser Leu Arg Gly Gln Leu

                325                 330                 335

Leu Trp Arg Glu Phe Phe Tyr Thr Leu Gly Ser His Thr Pro Asn Phe

            340                 345                 350

Asp Arg Ile Ala Gly Asn Pro Ile Cys Arg Gln Ile Thr Trp Asp Thr

        355                 360                 365

Asn Pro Ala Leu Leu Lys Ala Trp Arg Asp Gly Ala Thr Gly Tyr Pro

    370                 375                 380

Trp Ile Asp Ala Ala Met Thr Gln Leu Arg Glu Trp Gly Trp Met His

385                 390                 395                 400

Arg Leu Ala Arg His Ser Val Ala Cys Phe Leu Thr Arg Gly Asp Leu

                405                 410                 415

Tyr Leu Ser Trp Glu Ser Gly Lys Glu Val Phe Glu Glu Leu Leu Leu

            420                 425                 430

Asp Ala Asp Tyr Phe Ile Asn Ala Ala Asn Trp Met Trp Leu Ser Ala

        435                440                 445

Ser Ala Phe Phe Ala Gln Tyr Phe Arg Val Tyr Ser Pro Val Val Phe

    450                455                 460

Gly Lys Lys Tyr Asp Lys Glu Gly Ala Tyr Ile Arg Lys Phe Leu Pro

465                470                 475                 480

Val Leu Lys Asp Met Pro Ala Lys Tyr Ile Tyr Glu Pro Trp Thr Ala

                485                490                 495

Pro Lys Glu Val Gln Gln Arg Ala Asn Cys Ile Ile Gly Arg Asp Tyr

            500                505                 510

Pro Ala Pro Ile Val Asp His Ala Val Ala Ser Lys Glu Cys Ile Ala

        515                520                 525

Arg Met Gly Ala Ala Tyr Lys Ala Thr Asn Thr Gly Gly Ser Ala Gly

    530                535                 540

Lys Ala Ser Pro Ala Lys Ala Ala Ser Ser Gly Asp Ala Gly Thr Ser

545                550                 555                 560

Ala Ser Ala Gly Ala Pro Ser Ser Ser Lys Lys Thr Thr Gly Lys Arg

                565                570                 575

Ala Ala Ser Ala Asp Gln Gly Gly Lys Arg Gln Lys Thr Leu Glu Glu

            580                585                 590

Ser Met Thr Lys Lys Arg Cys Gln

        595                600

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

atggcaaggg aggcaggagt gga                                            23

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

gagggacatc ggtggctgtg aat                                            23

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

ggtgcctctt tgaagcccat ctcct                                          25

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

attcacagcc accgatgtcc ctc                                            23

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

cgcggatcca tgctgaggtg cgca                                           24

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

ccgctcgagt tactggcacc ttttctt                                        27

Claims (10)

1.一种分离的盐生杜氏藻光裂合酶，其特征在于，该酶选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有光裂合酶功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的酶，其特征在于，该光裂合酶是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述的盐生杜氏藻光裂合酶的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中1-1800位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-1803位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出盐生杜氏藻光裂合酶。

9.一种改善植物耐盐性的方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有光裂合酶DNA编码序列，所述的光裂合酶选自下组：(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有光裂合酶功能的由(a)衍生的多肽。

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使光裂合酶DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入光裂合酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该光裂合酶是具有SEQ IDNO：2氨基酸序列的多肽。

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