JP6438672B2 - 藻類培養方法及び浸透圧調整物質の製造方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、これまでのベタイン生産は、ショ糖製造の副産物からの二次利用規模での生産に留まっており、ベタインを主たる生産物として積極的に生産する方法は存在せず、かかる需要増に対する対応が必要な状況にあった。
かかる課題に対し、ベタインを高含有する原料を新たに調査した結果、好塩環境に生育する微細藻類が、ベタインを従来原料よりも150倍近く高含有で蓄積するという知見を得て、微細藻類を用いた原料生産方法等に関する研究開発を鋭意実施した。
結果、単純な工程で、効率よくベタイン等の浸透圧調整物質を製造可能な藻類培養方法及びかかる物質の製造方法を提供する本発明に至った。
前記複数の集積培養物から、本培養の実施期間中に想定される培地の温度変動とpH変動に応じて至適集積培養物を選択して、前記本培養の実施期間中における一連の培養運転を想定する培養計画を作成する工程と、
前記培養計画に基づいて、更に、光独立栄養条件下、10重量%以上の塩分濃度条件にて前記本培養を実施し、前記ベタイン或いはグルコシルグリセロールを含有する微細藻類を含む本培養物を作製する本培養工程と、を行うことを特徴とする藻類培養方法。
前記集積培養物変更工程は、年間における気温変化に応じて実施されることを特徴とする(5)記載の藻類培養方法。
前記複数の集積培養物から、本培養の実施期間中に想定される培地の温度変動とpH変動に応じて至適集積培養物を選択して、前記本培養の実施期間中における一連の培養運転を想定する培養計画を作成する工程と、
前記培養計画に基づいて、更に、光独立栄養条件下、10重量%以上の塩分濃度条件にて前記本培養を実施し、前記ベタイン或いはグルコシルグリセロールを含有する微細藻類を含む本培養物を作製する本培養工程と、
該本培養工程と同時及び/又は後に、前記本培養物から、前記ベタイン或いはグルコシルグリセロールを分離して取得する工程と、を行うことを特徴とするベタイン或いはグルコシルグリセロール製造方法。
本明細書において、ベタイン(Betaine)は、トリメチルグリシン(N,N,N-trimethylglycine:C5H11NO2)を意味し、グリシンベタイン、無水ベタイン、TMG等とも呼ばれている。
かかる工程では、まずは、「環境試料或いは環境試料由来の微細藻類の培養物」を用意する。
また、かかる単純移動平均は過去のデータを用いるので、実勢に多少遅れた対応となるが、温度上昇トレンドにある冬季から夏季に向かう期間での微細藻類は、増殖や代謝も上昇傾向にあり、多少の遅れは問題とならない。
一方、温度下降トレンドとなる夏季から冬季に関しては、微細藻類の増殖や代謝も低下傾向となり培養も不安定になりやすい。また実施場所が沿岸部か内陸部かによってもかかる温度低下トレンドは異なる。この様に下降トレンドにある場合は、平均気温トレンドよりも更に低い温度を示す、最低気温データを用いたトレンド等を参考にすると良い。
最も有効と思われる対応の一つとして、集積培養物選択の工夫がある。具体的には、変更の前後にて集積培養組成たる微細藻類叢にて共通種の重複がある様に、各温度別集積培養物を組み合わせる工夫をすることである。実施例を示す図4での温度別集積培養物の選択では、各培養物にて構成される微細藻類種の重複を考慮した組み合わせを図っている。
この操作により、形式上10℃幅の変化に応じた集積培養物調整が、実質20℃幅に対応できる様な温度変動リスクへの対応を図ることができる。
ここまでに、一定の培養期間で変動する培養液温度、かかる培養液温度変動に応じた至適集積物の選択、至適集積培養物を構成する優占種が好むpH範囲の推定を実施したが、かかる本培養計画にて至適集積培養物が順次変化する一連の流れにおいて、かかる至適集積培養物を構成する優占種が好むpHを参照した場合に、至適集積培養物の切り替えによって、極端なpH変化を伴うpHギャップを生じる計画である場合は、培養液のpH調整ができるだけ少なくなる様な至適集積培養物の運用計画への変更が好ましい。
本発明であるところの微細藻類の商業生産は、エンドプロダクトに着目し、生産する微細藻類を問わないというスタンスで実施する特徴から、広い温度域に対応し、また培養条件を応じて変動させることを前提として、また条件変動を利用した捕食被害を軽減するなどの対応によって、エンドプロダクトの生産性の安定化を図る特徴を有する。かかる第二の実施工程である培養計画工程2は、微細藻類培養の安定化はもとより、エンドプロダクトの生産性の安定化を図る上で、特に重要な工程とも位置づけられる。
なお、本発明によるところの培養では、現地の温度トレンドに応じて、適切な集積培養物を選択し、かかる集積培養物の至適条件に応じた培養を実施して長期に亘る培養を実現するマルチカルチャー方式を採用している点が、従来のモノカルチャーをベースとする培養方法とは異なる。
これらの工程は、年間を通じて生産される微細藻類種によっても方法が異なるので、都度、費用対効果を考慮した方法を設定する。なお、汎用性がある方法として、培養懸濁液からの藻体分離では、遠心分離、加圧浮上、凝集沈殿等を挙げることができる。この際、藻体と分離された培養液は、再度、培養槽に戻すことを基本とする。
総じて、かかる手法を組み合わせて実施して、微細藻類からのベタイン等の分離を図る。
オマーンでの実証試験に用いる集積培養物を作成するために、オマーン国内にて環境資料採取を、以下の地点で実施した。
[1]マングローブ干潟12か所由来の底泥15試料
[2]Umm as Samim地域の塩平原13か所由来の表土試料
[3]Barr Al−Hikman地域の塩田や高塩分濃度(20%程度)の潮溜まり11か所からの水・藻マット試料14試料
[4]原油精製プラント排水の高温酸性排水溜まり2か所由来の汚泥・藻マット4試料
かかる各集積培養への環境試料の接種は、各試料の0.1gを各集積培養で用いる培養液50mlに懸濁して十分に攪拌した後、10分間の静置の後の上清25mlを75mlの各培養液に接種し100mlの試料懸濁液を調整した。調整後、300ml容の滅菌三角フラスコに試料懸濁液を移し、所定温度の恒温インキュベータの上部から、メタルハライドランプを用いて(光量子束密度:約2mmol・m−2・s−1)を用いた疑似太陽光照射条件によって、約3週間の集積培養を実施した。
pH3においては、塩分濃度10重量%区の温度40、50℃条件では、紅藻が優占種、温度20、30℃、或いは最終塩分濃度20重量%では、ペディノ藻が優占種であり、最終塩分濃度30重量%の場合、全温度域において微細藻類の生育な観察されなかった。
pH5においては、温度20、30、40℃の全塩分濃度区にて、ペディノ藻が優占種であった。また、温度40、50℃で最終塩分濃度10、20重量%の場合は、糸状性藍藻が優占種であった。
pH9においては、全温度域の塩分濃度10、20重量%の条件にて、球状藍藻が優占化する傾向が見られた。また、温度30、40、50℃で、塩分濃度20、30重量%の場合に桿状藍藻が優占化する傾向が見られた。
このように、多数の集積培養を実施することによって、各培養条件に応じて微細藻類組成の異なる多様な集積培養物を取得することができた。増殖が確認できなかった条件区も存在したが、少なくとも、微細藻類の増殖が確認できた全ての集積培養物に関しては、集積された微細藻類の乾燥重量当たり1.4重量%以上、2.4重量%以下の範囲で、ベタイン等の含有がHPLC分析にて確認された(図3)。
これらベタイン等の含有が確認された集積培養物に対して、以後、2週間毎に、各集積培養条件に応じた継代培養を実施し、集積培養系統を保存した。
図2に示す集積培養結果に基づいて、培養水温が20℃から50℃に向かう、冬季から夏季への季節の培養水温の変動があると仮定し、培養計画工程でのステップ1と2の実施を試みた。なお、培養のpH調整は、硝酸カリウムと硫安を交互用いてpH変動幅をある一定幅に抑制することを前提に、各温度域にて用いる集積培養物を選択した。なお、塩分濃度は20重量%に固定とした。
各条件で得られた集積培養での優占種に着目して、各温度域にて用いる集積培養物を選択した。結果を図4に示す。
続く、温度30℃における培養は、pH3とpH5の範囲にて、集積培養物P3/S20/T30とP5/S20/T30の2種を混合して用いる計画とした。この集積培養物の混合体は、20℃と同様に、概ねペディノ藻が優占する。
更に、温度40℃における培養は、pH5とpH7の範囲にて、集積培養物P5/S20/T40とP7/S20/T40の2種を混合して用いる計画とした。この集積培養物の混合体は、ペディノ藻と桿状藍藻を含み、糸状藍藻が優占する。ここで、これまでの20℃から30℃の培養にて優占種であったペディノ藻から糸状藍藻への優占交代を図る計画とした。
上記の様に温度によって優占種が入れ替わる設定では、この優占種が変わることを前提として、その一つ前の集積培養物の選択において、以後の温度設定にて優占化が予想される微細藻類が含まれる集積培養物を選択する様にして、スムースな移行を図る様に考慮した。
現地マスカット(オマーン国)における過去の気象観測データでの最高気温データを用いて、かかる集積培養物の変更のタイミングを予想すると、20℃から30℃の集積培養物に変更するタイミングは3月下旬から4月上旬と予想され、30℃から40℃のものに変更するタイミングは5月下旬から6月上旬と予想された。また50℃の集積培養物は、実水温に応じて、その適用を考慮するが、計画では予備とした。
総じて、上記を培養水温が20℃から50℃に向かう、冬季から夏季に向かう場合における集積培養物の選択方法と計画した。
2:培養計画工程
3:本培養工程(含:浸透圧調整物質分離取得工程)
4:ベタイン
5:グルコシルグリセロール
6:塩化ナトリウム
Claims (7)
- 20℃〜50℃の温度条件と、pH3〜pH9のpH条件と、培養の最終塩分濃度が10重量%以上30重量%以下となるように調整される塩分濃度条件と、のうち少なくとも一つを複数の異なる条件とすることで得られる複数の異なる培養条件を用いて、環境試料或いは該環境試料由来の微細藻類の培養物を、光独立栄養条件下で、それぞれ培養することにより、ベタイン或いはグルコシルグリセロールを含有する微細藻類を含み、且つ微細藻類叢の優占種が相互に異なる複数の集積培養物を調製し、前記複数の集積培養物は、pH3、20℃及び塩分濃度10〜20%、又は、pH3、30℃及び塩分濃度20%で培養して得た、ペディノ藻を優占種とする集積培養物、pH3、40〜50℃及び塩分濃度10%で培養して得た、紅藻を優占種とする集積培養物、pH5、20〜30℃及び塩分濃度10〜30%で培養して得た、ペディノ藻を優占種とする集積培養物、pH5、50℃及び塩分濃度10〜20%で培養して得た、糸状藍藻を優占種とする集積培養物、pH5、50℃及び塩分濃度30%で培養して得た、桿状藍藻を優占種とする集積培養物、pH7、20℃及び塩分濃度10〜30%、又は、pH7、30℃及び塩分濃度30%で培養して得た、ペディノ藻を優占種とする集積培養物、pH7、50℃及び塩分濃度20〜30%で培養して得た、桿状藍藻を優占種とする集積培養物、pH9、20℃及び塩分濃度10〜20%で培養して得た、球状藍藻を優占種とする集積培養物、pH9、30℃及び塩分濃度30%、又は、pH9、40〜50℃及び塩分濃度20〜30%で培養して得た、桿状藍藻を優占種とする集積培養物から選択される集積培養物調製工程と、
前記複数の集積培養物から、本培養の実施期間中に想定される培地の温度変動とpH変動に応じて至適集積培養物を選択して、前記本培養の実施期間中における一連の培養運転を想定する培養計画を作成する工程と、
前記培養計画に基づいて、更に、光独立栄養条件下、10重量%以上の塩分濃度条件にて前記本培養を実施し、前記ベタイン或いはグルコシルグリセロールを含有する微細藻類を含む本培養物を作製する本培養工程と、を行うことを特徴とする藻類培養方法。 - 前記本培養工程と同時及び/又は後に、前記本培養物から、前記ベタイン或いはグルコシルグリセロールを分離して取得することを特徴とする請求項1記載の藻類培養方法。
- 前記本培養工程では、10重量%以上30重量%以下の塩分濃度条件で、かつ30℃以上50℃未満の温度条件で、前記本培養を行うことを特徴とする請求項1又は2記載の藻類培養方法。
- 前記集積培養物調製工程では、前記微細藻類が生息する自然環境から採取された環境試料を用いて培養することを特徴とする請求項1乃至3いずれか記載の藻類培養方法。
- 前記本培養工程において、捕食生物による捕食により、前記微細藻類細胞数の減少を回避するために前記複数の集積培養物から、現状の培養温度とpH4以下で生育可能な前記集積培養物を選択し、選択した前記集積培養物を用いて、pH4以下にて前記本培養を行う集積培養物変更工程を行うことを特徴とする請求項1乃至4いずれか記載の藻類培養方法。
- 前記本培養工程は、通年に亘って実施され、
前記集積培養物変更工程は、年間における気温変化に応じて実施されることを特徴とする請求項5記載の藻類培養方法。 - 20℃〜50℃の温度条件と、pH3〜pH9のpH条件と、培養の最終塩分濃度が10重量%以上30重量%以下となるように調整される塩分濃度条件と、のうち少なくとも一つを複数の異なる条件とすることで得られる複数の異なる培養条件を用いて、微細藻類を含む環境試料或いは該環境試料由来の微細藻類の培養物を、光独立栄養条件下で、それぞれ培養することにより、ベタイン或いはグルコシルグリセロールを含有する微細藻類を含み、且つ微細藻類叢の優占種が相互に異なる複数の集積培養物を調製し、前記複数の集積培養物は、pH3、20℃及び塩分濃度10〜20%、又は、pH3、30℃及び塩分濃度20%で培養して得た、ペディノ藻を優占種とする集積培養物、pH3、40〜50℃及び塩分濃度10%で培養して得た、紅藻を優占種とする集積培養物、pH5、20〜30℃及び塩分濃度10〜30%で培養して得た、ペディノ藻を優占種とする集積培養物、pH5、50℃及び塩分濃度10〜20%で培養して得た、糸状藍藻を優占種とする集積培養物、pH5、50℃及び塩分濃度30%で培養して得た、桿状藍藻を優占種とする集積培養物、pH7、20℃及び塩分濃度10〜30%、又は、pH7、30℃及び塩分濃度30%で培養して得た、ペディノ藻を優占種とする集積培養物、pH7、50℃及び塩分濃度20〜30%で培養して得た、桿状藍藻を優占種とする集積培養物、pH9、20℃及び塩分濃度10〜20%で培養して得た、球状藍藻を優占種とする集積培養物、pH9、30℃及び塩分濃度30%、又は、pH9、40〜50℃及び塩分濃度20〜30%で培養して得た、桿状藍藻を優占種とする集積培養物から選択される集積培養物調製工程と、
前記複数の集積培養物から、本培養の実施期間中に想定される培地の温度変動とpH変動に応じて至適集積培養物を選択して、前記本培養の実施期間中における一連の培養運転を想定する培養計画を作成する工程と、
前記培養計画に基づいて、更に、光独立栄養条件下、10重量%以上の塩分濃度条件にて前記本培養を実施し、前記ベタイン或いはグルコシルグリセロールを含有する微細藻類を含む本培養物を作製する本培養工程と、
該本培養工程と同時及び/又は後に、前記本培養物から、前記ベタイン或いはグルコシルグリセロールを分離して取得する工程と、を行うことを特徴とするベタイン或いはグルコシルグリセロール製造方法。
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