KR20210110842A - 인터루킨 6(il-6)을 표적화하는 펩타이드 면역원 및 il-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환의 면역요법을 위한 이의 제형 - Google Patents

인터루킨 6(il-6)을 표적화하는 펩타이드 면역원 및 il-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환의 면역요법을 위한 이의 제형 Download PDF

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펑 린
준 보 천
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유나이티드 바이오메디칼 인크.
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Abstract

본 개시내용은 인터루킨 6(IL-6) 단백질을 표적으로 하는 개별 펩타이드 면역원 작제물, 작제물을 함유하는 조성물, 작제물에 의해 유도되는 항체 및 작제물 및 이의 조성물을 만드는 방법 및 사용하는 방법에 관한 것이다. 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 이종 T 헬퍼 세포(Th) 에피토프에 직접적으로 또는 선택적 이종 스페이서를 통해 연결된 IL-6으로부터의 B 세포 에피토프를 함유한다. IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 IL-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 IL-6 수용체(IL-6R) 결합 부위에 대해 고특이적인 항체의 생성을 자극한다.

Description

인터루킨 6(IL-6)을 표적화하는 펩타이드 면역원 및 IL-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환의 면역요법을 위한 이의 제형
본 출원은 2018년 12월 28일에 출원된, 미국 가출원 제62/786,192호의 혜택을 주장하는 PCT 국제 출원으로, 상기 미국 가출원의 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 개시내용은 인터루킨 6(IL-6)을 표적화하는 펩타이드 면역원 작제물 및 IL-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환의 면역요법을 위한 이의 제형에 관한 것이다.
IL-6은 4개의-나선형 다발 구조 특징을 갖는 184개의 아미노산(표 1)으로 구성된 작은(약 25kD) 분비 당단백질이다. IL-6은 지질다당류 및 다른 세균 산물, 바이러스, 사이토카인(TNF-α, IL-1, 전환성장인자(TGF)-β), 아데노신 3인산, 부갑상선호르몬, 비타민 D3, 호모시스테인 및 안지오텐신 II와 같은 다양한 자극제에 반응하여 백혈구(T- 및 B-백혈구, 단핵구, 대식세포), 섬유아세포, 조골세포, 각질형성세포, 내피세포, 혈관사이세포, 지방세포, 골격근세포, 심근세포, 뇌세포(성상세포, 미세아교세포, 뉴런) 및 일부 종양세포를 포함하는 여러 세포 유형에 의해 생산된다(Sebba, 2008).
순환 IL-6은 건강한 사람의 혈액에서 낮은 농도(1pg/㎖ 이하)로 발견되며, 염증 반응 시 유의하게 증가하고, 패혈증에 의해 ng/㎖ 농도 범위에 도달한다. IL-6은 급성기 면역 반응 및 조혈작용을 자극하여 감염 및 조직 손상에 대한 숙주의 방어에 결정적으로 기여한다. 또한, IL-6은 생리학적 조건 하에서 대사, 재생 및 신경 과정을 조절한다. 일단 방출되면, IL-6은 IL-6 수용체(IL-6R) 및 다운스트림 신호전달 분자를 포함하는 고유의 IL-6R 신호전달 시스템을 활성화하여 다면발현성 생물학적 효과를 발휘한다.
IL-6R은 (1) 두 가지 형태, 즉 (a) 80kD 막관통 IL-6Rα(mIL-6Rα) 및 (b) 50 내지 55kD 가용성 IL-6Rα(sIL-6Rα)로 존재하는, IL-6 결합 사슬 또는 IL-6Rα 및 (2) IL-6Rβ(또는 gp130)로 명명된, 130kD 신호-변환 사슬의 두 개의 사슬로 이루어진다.
막 IL-6Rα(또는 mIL-6Rα)는 제한된 수의 세포 유형, 즉 간세포, 거핵세포 및, 단핵구, 대식세포, 호중구 및 T- 및 B-림프구를 포함하는, 백혈구의 표면 상에 발현된다. 가용성 IL-6Rα(또는 sIL-6Rα)는 인간의 혈장(25 내지 75ng/㎖) 및 조직액에 존재하며 메탈로프로테아제(디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(즉, ADAM))에 의한 mIL-6Rα의 단백질 분해 절단(분할)에 의해, 또는, 일부, 막관통 도메인의 누락에 의한 선택적 스플라이싱을 통해 생성될 수 있다. 막 IL-6Rβ는 모든 인간 세포에서 보편적으로 발현된다(Sebba, 2008).
IL-6은 IL-6Rα(mIL-6Rα 또는 sIL-6Rα)에 결합할 때 IL-6Rα/IL-6Rβ 사슬의 동종이량체화를 유도하여, 육량체(두 개의 IL-6, 두 개의 IL-6Rα 및 2개의 IL-6Rβ 단백질을 포함)의 형성을 초래하고, 결국 다운스트림 신호전달 캐스케이드를 유발한다(Rose-John, et al, 2017).
mIL-6Rα에 결합하는 IL-6을 통한 세포 활성화를 "클래식 신호전달"(classic signaling)이라고 한다. mIL-6Rα를 발현하지 않는 다른 모든 세포는, IL-6이 순환 sIL-6Rα에 결합하고, 이 복합체가 세포 표면 상의 IL-6Rβ와 함께 신호전달 복합체를 형성하는, "트랜스-신호전달"(trans-signaling)로 IL-6 신호를 받는다. 트랜스-신호전달은 광범위한 인간 세포에서 발생할 수 있으므로, IL-6의 다면발현성 활성을 설명하는데 기여한다. 현재 IL-6의 항상성 및 재생적 활성은 클래식 신호전달로 매개되며, 전염증성 효과는 트랜스-신호전달 경로의 활성화로부터 초래되는 것으로 이해된다. 많아지는 증거가 IL-6 트랜스-신호전달이 특히 질병 발달에 관여함을 나타낸다. sIL-6Rβ(또는 sgp130)의 가용 형태 또한 순환계에서 상대적으로 높은 농도로 검출되었으며, 주로 선택적 스플라이싱으로 생산되었다. sIL-6Rβ는 IL-6/sIL-6Rα 복합체에 결합할 수 있기 때문에 IL-6 매개 트랜스-신호전달의 자연적 및 특이적 저해제로 작용하지만 클래식 신호전달에는 영향을 주지 않는다.
IL-6Rα는 IL-6의 고유 결합 수용체이지만, IL-6Rβ(또는 gp130) 신호-변환 사슬은, 백혈병 억제 인자, 온코스타틴 M, 섬모 향신경성 인자, IL-11, 카디오트로핀-1, 뉴로포이에틴-1, IL-27 및 IL-35를 포함하는, IL-6 패밀리의 구성원과 공유된다.
IL-6 결합 후, 수용체의 동종이량체화는 IL-6Rβ(또는 gp130) 사슬과 타이로신 인산화효소 JAK(야누스 인산화효소) 사이의 상호작용을 촉진하여, 상호 트랜스활성화를 초래한다. 차례로, JAK 활성화는 두 가지 주요 단백질, 즉 1) SHP-2(Src Homology domain-containing protein tyrosine Phospatase-2) 및 2) STAT(signal transducer and activator of transcription protein)(STAT1 내지 STAT3)의 인산화를 통해, 세 가지 주요 세포 내 신호전달 경로를 촉발한다. 일단 인산화되면, SHP-2는 Grb2(growth factor receptor bound protein 2)와 상호작용하여 Ras/ERK/MAPK(rat sarcoma protein/extracellular signal-regulated kinase/mitogen-activated protein kinase)의 활성화를 유도하고/유도하거나 PI3K/Akt(phosphoinositol-3 kinase/protein kinase B) 경로를 활성화할 수 있다. 반대로, STAT 단백질의 인산화는, 이후 핵으로 전이되는, 이종이량체(STAT1/STAT3) 또는 동종이량체(STAT1/STAT1 및/또는 STAT3/STAT3)의 형성을 유도한다. 모든 경우에, 이들 세포 내 경로의 활성화는 IL-6의 다면발현성 생물학적 활성을 설명하는 다중 표적 유전자 전사의 유도로 이어진다(Lazzerini, et al, 2016).
IL-6은 급성 염증성 반응의 활성화, 뿐만 아니라 선천성에서 후천성 면역으로의 전환에 결정적으로 관여하는, 광범위한 생물학적 활성을 발휘한다. IL-6은, 대사, 인지 기능 및 배아 발달을 포함하는, 다양한 다른 과정에서 몇몇 추가적인 역할을 갖는다.
급성 염증 반응의 활성화에서 IL-6의 효과가 연구되었다. 다양한 원인의 감염 또는 조직 손상이 발생하면, 전신성 급성기 반응이 빠르게 유도되어 병원체를 중화하고 추가 침입을 막고 조직 손상을 최소화하고 상처 치유를 촉진한다. 열 및 간세포에 의한 급성기 단백질의 생산으로 이루어지는, 이러한 급성기 반응은 주로 IL-6에 의해 조절된다.
이를 위해, IL-6은 체온 조절에 연관된 시각전 시상하부 영역의 뉴런 상에 작용하여 체온을 높이고 간이, C-반응성 단백질(CRP), 피브리노겐, 보체 성분 C3, 혈청 아밀로이드 A, 헵시딘, 합토글로빈, α1-산성 당단백질, α1-항트립신, α1-항키모트립신 및 세룰로플라스민과 같은, 급성기 단백질을 합성하도록 자극하지만, 알부민, 트랜스페린, 피브로넥틴, 트랜스타이레틴 및 레티놀-결합 단백질("음성적" 급성기 단백질)의 생산은 저해된다.
또한, IL-6은 단핵구에서 대식세포로의 분화를 촉진하고, 골수성 전구체 및 거핵세포의 성숙화를 자극하여 호중구증가증 및 혈소판증가증을 유발하고, 혈관 내피 성장 인자의 생산을 통해 혈관신생을 유도하고, 내피세포의 접착 분자(특히, ICAM-1(intracellular adhesion molecule-1) 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule)) 발현을 상향조절하여 림프구 및 호중구 트래피킹을 강화하고, B 림프구에 의한 항체 생산을 높이고, T 헬퍼(TH) 림프구의 증식을 강화하여 TH2 또는 TH17 세포로의 분화를 촉진한다. 모든 경우에, 이러한 변화는, 서로 다르지만 시너지 효과가 있는 메커니즘을 통해, 숙주의 방어에 대한 통합된 반응을 실현하는데 기여한다.
면역염증 반응에서 이의 핵심적인 관여 이외에도, IL-6은 배아발생, 포도당 및 지질 대사, 뼈 재형성, 간 재생, 신경 조직 항상성, 인지 기능, 수면, 기억, 통증 및 감정적 행동과 같은 여러 가지 다중전신성 기능을 조절하여 생리학적 조건 하에서 중요한 역할을 한다.
이러한 추가-면역염증 효과에 대한 지식은 류마티스 관절염(RA) 및 지속적인 IL-6 수준의 상승을 특징으로 하는 다른 만성 염증성 질환에서 관찰되는 일부 전신성 증상의 병인을 설명하는데 도움을 줄 수 있다.
RA 환자에서, 대사 및 뼈 항상성 상 이러한 사이토카인의 영향은 특히 병리생리학 및 임상적 관심사이다.
지방 조직은 생리학적 조건 하에서, 순환 IL-6 수준의 약 35%로, IL-6의 생산에 상당한 기여를 한다. 장시간의 운동 중에, 수축하는 골격근은 IL-6의 주요 공급원이 되어, 혈장 수준을 최대 100배 증가시킨다. IL-6은 지방세포에서 지방분해를 자극하고(그리고 지방생성을 억제함), 초저밀도 지방단백질 수용체 발현의 강화를 통해 말초 조직에 의한 콜레스테롤 및 트라이글라이세리드 흡수를 증가시켜, 체중 손실 및 혈청 지질 수준의 감소를 촉진한다. 또한, IL-6은 간세포 및 근육 세포의 인슐린 민감성을 높여, 포도당의 이용 및 내성을 개선한다. 이러한 효과는 이 사이토카인이 지구력을 향상시키는 운동-유도 인슐린 활성 증가를 바탕으로 하는 생리학적 메커니즘의 일부일 수 있음을 제시한다. 그러나, 부분적으로 예를 들어 장기간의 과도한 운동으로 인한, IL-6의 만성적 상승은 간 및 지방세포에서 인슐린 저항성을 유발할 수 있다.
뼈 조직 상의 영향과 관련하여, IL-6은 조골세포, 파골세포 및 연골세포의 분화 및 활성을 조절하여 뼈의 발달, 성장 및 유지에 필요한 뼈 흡수 및 뼈 형성에 영향을 미친다. 파골 세포 분화 및 뼈 흡수를 차례로 자극하는, 기질/조골 세포 표면 상 RANKL(receptor activator of nuclear factor-kB ligand)의 발현 강화에서 IL-6의 역할은 생리학적 조건 하에서 뼈 항상성을 위한 잠재적인 양성적 효과와 함께 뼈 재형성을 촉진할 수 있다. RA에서, 이의 과장되고 오래 지속되는 활성화는 비정상적인 파골세포형성을 유도하여, 골다공증 및 뼈 파괴를 유발한다.
IL-6, IL-6 수용체, IL-6 신호 전달, IL-6의 다면발현성 생물학적 효과, 면역-염증 반응에서의 효과, 면역염증 이외의 효과 및 류마티스 관절염, 자가면역 과정 발달, 관절 손상, 관절 이외의 증상을 포함하는 다양한 병리적 상태에서 IL-6의 역할에 관한 최신의 리뷰가 본 명세서에 참조(Lazzerini, P., et al., 2016)에 의해 포함되어 있으며 여기에서 상기 배경 부분의 설명에 대한 지원 문헌을 찾을 수 있다.
IL-6은 실질적으로 모든 기관 시스템의 생리에 관여하고 상해 또는 감염에 대한 반응에서 주요 역할을 하는 다면발현성 사이토카인이기 때문에, IL-6의 비정상적인 발현은 다양한 인간의 질병, 특히 염증 및 자가면역 장애, 관상동맥 및 신경계 질환, 임신 문제 및 신생물과 관련된다.
이들 많은 질환에 대한 요법으로서 IL-6이 IL6R(즉, IL-6Rα 및 IL-6Rβ/또는 gp130) 복합체에 결합하는 것을 저해하는 항체의 개발에 대한 관심이 있다. 첫 번째 항체로 토실리주맙(Tocilizumab), 다음으로 사릴루맙(Sarilumab)이 개발되었으며, 둘 다 IL-6R을 표적으로 하고, 류마티스 관절염, 캐슬만병 및 전신성 소아 특발성 관절염의 치료제로 승인되었다. IL-6을 표적으로 하는 단클론 항체인 실툭시맙(Siltuximab)이 현재 특발성 다중심성 캐슬만병(MCD)에 대해 US FDA가 승인한 유일한 치료제이다. 중등도에서 중증의 류마티스 관절염을 앓는 성인의 IL-6 경로를 차단하기 위해 설계된 다른 고친화성 항-IL-6 단클론 항체인 시루쿠맙(Sirukumab)은 약물을 복용한 환자의 사망률 증가로 인해 FDA의 관절염 자문위원회에서 승인을 권장하지 않았다. 이러한 목적을 위해 많은 다른 항-IL-6 또는 항-IL-6R 단클론 항체(문헌[Rose-John, et al., 2017]에서 논의됨)가 적극적으로 연구되었다. 많은 단클론 항-IL-6 또는 항-IL-6 수용체 항체가 특정 질환의 면역요법에 효과적임이 입증될 수 있지만, 이들은 비싸고 혈청 IL-6의 충분한 억제와 이로부터 파생된 임상적 이점을 유지하기 위해 자주 그리고 만성적으로 투여해야 한다.
IL-6-관련 면역 장애와 싸우기 위한 몇몇 백신접종 방법도 기술되었다. 한 가지 접근법은 면역원으로서 7개의 아미노산 치환을 갖는 인간 IL-6 변이체인 Sant1(De Benedetti, et al, 2001; 미국 특허 제6,706,261호)을 사용한다. 하지만, 이 연구는 거의 20년 전에 처음 공개된 이후로 어떠한 임상적 발전도 이루어지지 않았다. 다른 그룹(Desallais, L., et al, 2014)은 184개 잔기 길이 IL-6 단백질의 40% 이상을 커버하는 다섯 가지의 무작위로 선택된 IL-6 펩타이드로, 각각의 펩타이드의 면역원성을 강화하기 위해 복잡한 화학적 커플링 과정을 통해 큰 운반 단백질 KLH에 부착된, 펩타이드의 사용을 보고하였다. 이 방법으로 제조된 백신은 대부분 원치않는 운반 단백질 KLH에 대한 것이고 단지 일부만이 표적으로 하는 IL-6에 대한 것인 항체를 생성하였다. 또한, 이 백신은 제형화에서 임상적 및 산업적 적용을 위한 최적화와는 거리가 먼 CFA(Complete Freund’s Adjuvant) 및 ICFA(Incomplete Freund’s Adjuvant)를 필요로 하였다.
상기 기술된 바와 같이, 현재 IL-6 백신 설계에는 여러 한계와 문제가 있다(예를 들어, 면역원 제작을 위한 복잡한 화학적 커플링 과정, 대부분 운반 단백질에 대한 항체를 유도하는 KLH를 운반 단백질로 사용하는 것, 백신접종에서 면역원성을 강화하기 위해 임상적으로 허가되지 않은 완전 프로인트 아쥬반트를 사용하는 것, 가장 공격적인 면역 프로토콜을 사용했음에도 불구하고 예방접종한 동물에서 표적 IL-6에 대한 면역원성이 약한 것, 불명확한 작용 기작 등). 따라서, IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환을 앓는 환자의 치료에 대한 전세계적인 적용을 위해 IL-6에 대한 고특이적 면역 반응을 유도할 수 있고, 환자에 쉽게 투여할 수 있고, 엄격한 GMP(good manufacturing practice) 하에서 제조할 수 있고, 비용 효율적인 효과적인 면역요법 백신의 개발에 대한 충족되지 않은 요구가 분명히 있다.
본 개시내용의 주 목적은 설계된 펩타이드 면역원 작제물의 B 에피토프가 IL-6의 IL-6R 결합 부위를 밀접하게 모방하고; 자가-단백질 IL-6에 대한 면역 내성을 돌파하기 위해 예방접종한 숙주에서 강한 면역 반응을 생성할 수 있는 이러한 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형을 포함하는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 백신 제형을 안출/개발하고, IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환의 치료를 위해 IL-6R 결합 부위를 표적으로 하는 효과적인 항체를 생성하는 것이다.
본 개시내용은 인터루킨 6(IL-6)을 표적으로 하는 개별 펩타이드 면역원 작제물과 IL-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환의 면역요법을 위한 이의 제형에 관한 것이다.
이들 개별 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 IL-6 수용체 결합 영역 E42 내지 C83(서열번호 16) 또는 N144 내지 I166(서열번호 19) 또는 이의 단편으로부터 유래된 기능적 B 세포 에피토프로서, 병원체 단백질로부터 유래된 이종의 T 헬퍼 세포(Th) 에피토프에 스페이서 잔기(들)를 통해 연결된, B 세포 에피토프를 포함하는 길이 상 30개 이상의 아미노산을 갖는다. 설계된 B 세포- 및 Th 세포 에피토프를 함유하는 이들 IL-6 펩타이드 작제물은 IL-6R 결합 영역에 대한 고특이적 항체의 생성을 자극하는데 함께 작용하여, IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환에 걸리기 쉽거나 질환을 앓는 대상에 치료적 면역 반응을 제공한다.
일부 실시형태에서, 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편으로부터 유래된 B 세포 항원 부위(서열번호 5 내지 20; 72 내지 74, 표 1에 나타냄)로서, 재조합 인간 IL-6(서열번호 1) 또는 마카크(macaque)(서열번호 2), 생쥐(서열번호 3) 및 쥐(서열번호 4)와 같은 다른 종의 IL-6과 교차반응하는 고특이적 항체의 생성을 자극하는데 함께 작용하는 병원성 단백질로부터 유래된 이종 Th 에피토프(서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226, 표 2에 나타냄)에 연결된, B 세포 항원 부위를 갖는 혼성 펩타이드를 포함한다.
참고문헌:
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도 1은 인간(서열번호 227), 마카크(서열번호 228), 생쥐(서열번호 229) 및 쥐(서열번호 230) 종으로부터의 IL-6 서열의 서열 얼라인먼트를 나타낸다. 아미노산 위치 44 내지 50번 및 73 내지 83번으로부터 발생하는 분자 내 루프 구조를 음영의 시스테인 및 괄호로 나타낸다.
도 2는 본 명세서에 설명된 특정 실시형태에 따른 선택된 표적에 대한 약학적 조성물의 상업화(산업화)로 이어지는 개발 과정을 식별하는 플로우 차트이다. 본 개시내용은 IL-6 펩타이드 면역원 설계, IL-6 펩타이드 조성물 설계, IL-6 약학적 제형 설계, 시험관 내 IL-6 기능적 항원성 연구 설계, 생체 내 IL-6 면역원성 및 효능 연구 설계 및 IL-6 치료 임상 프로토콜 설계를 포함한다. 각 단계의 구체적인 평가 및 분석은 궁극적으로 안전하고 효과적인 IL-6 약학적 조성물의 상업화로 이어질 일련의 실험으로 이어졌다.
도 3A 내지 도 3D는 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물로 면역화한 기니피그에서 12주 동안의 항체 반응 동역학을 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 서열번호 107, 112 내지 114 및 116 내지 118의 펩타이드 면역원 작제물에 대한 항체 반응은 도 3A; 서열번호 124 내지 130의 펩타이드 면역원 작제물에 대한 항체 반응은 도 3B; 서열번호 131 내지 137의 펩타이드 면역원 작제물에 대한 항체 반응은 도 3C; 서열번호 138 내지 145의 펩타이드 면역원 작제물에 대한 항체 반응은 도 3D에 나타낸다. ELISA 플레이트를 재조합 인간 IL-6으로 코팅하였다. 4배 연속 희석으로 혈청을 1:100 내지 1:4.19×108으로 희석하였다. Log10(EC50)로 표시된 시험 혈청의 역가는 4-파라미터 로지스틱 곡선-맞춤을 사용한 비선형 회귀로 계산하였다.
도 4a 내지 도 4b는 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 대한 다양한 정제 다클론 항-IL-6 항체의 교차반응성을 나타낸다. 구체적으로, 서열번호 107, 116, 118, 124 내지 128의 결과는 도 4a에 나타내고 서열번호 129 내지 133의 결과는 도 4b에 나타낸다. ELISA 플레이트를 재조합 인간, 원숭이, 생쥐 또는 쥐의 IL-6 단백질로 코팅하였다. 단백질 A 크로마토그래피로 기니피그 혈청으로부터 정제한 다클론 항-IL-6 IgG 항체를 4배 연속 희석으로 10㎍/㎖ 내지 0.00238ng/㎖로 희석하였다. 4-파라미터 로지스틱 곡선-맞춤을 사용한 비선형 회귀로 EC50을 계산하였다.
도 5a는 ELISA-기반 분석에서 IL-6 및 IL-6R의 상호작용에 대한 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 107, 116, 118, 124, 132, 133, 124 및 137, 및 GP IgG)에 의해 생성된 다양한 정제 다클론 항-IL-6 항체의 중화 활성을 나타낸다. ELISA 플레이트를 재조합 인간 IL-6R 단백질로 코팅하였다. 인간 IL-6을 10ng/㎖로, 다양한 다클론 항-IL-6 IgG 항체를 3-배 연속 희석으로 100㎍/㎖에서부터 0.412㎍/㎖로 농도를 낮추면서 사전혼합하고 IL-6R-코팅 웰에 첨가하였다. 포획된 IL-6을 바이오틴-표지 토끼 항-IL-6 항체 및 스트렙타비딘 폴리-HRP로 검출하였다. 4-파라미터 로지스틱 곡선-맞춤을 사용한 비선형 회귀로 IC50을 계산하였다.
도 5b는 ELISA-기반 분석에서 IL-6/IL-6R 및 gp130의 상호작용에 대한 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 128, 129, 134 및 135, 및 GP IgG)에 의해 생성된 다양한 정제 다클론 항-IL-6 항체의 중화 활성을 나타낸다. ELISA 플레이트를 재조합 gp130-Fc 융합 단백질로 코팅하였다. 사전 형성된 IL-6/IL-6R 복합체를 사전 정의된 비율로, 다양한 다클론 항-IL-6 IgG 항체를 3-배 연속 희석으로 100㎍/㎖에서부터 0.412㎍/㎖로 농도를 낮추면서 사전혼합하고 gp130-Fc-코팅 웰에 첨가하였다. 포획된 IL-6/IL-6R 복합체를 바이오틴-표지 토끼 항-IL-6 항체 및 스트렙타비딘 폴리-HRP로 검출하였다. 4-파라미터 로지스틱 곡선-맞춤을 사용한 비선형 회귀로 IC50을 계산하였다.
도 6은 ELISA-기반 분석에서 IL-6-의존성 STAT3 인산화에 대한 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 116, 124, 127, 128, 129, 134, 135 및 137, 및 GP IgG)에 의해 생성된 다양한 정제 다클론 항-IL-6 항체의 중화 활성을 나타낸다. RMPI 8226 세포를 10ng/㎖의 인간 IL-6 및 100㎍/㎖ 농도의 다양한 다클론 항-IL-6 IgG 항체와 함께 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 배양하고 ELISA-기반 분석에서 인산화된 STAT3 수준을 결정하기 위해 용해시켰다.
도 7a 내지 도 7b는 IL-6-의존성 세포 증식에 대한 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 의해 생성된 다양한 정제 다클론 항-IL-6 항체의 중화 활성을 나타낸다. 서열번호 116, 118, 124 내지 129, 131, 132 및 133의 중화 활성은 도 7a에 나타내고 서열번호 134 내지 145의 중화 활성은 도 7b에 나타낸다. TF-1 세포를 10ng/㎖의 인간 IL-6 및 결정된 농도의 다양한 다클론 항-IL-6 IgG 항체와 함께 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였다. 대사적 활성 세포에서 ATP의 양을 측정하여 세포 생존능을 모니터하였다.
도 8a 내지 도 8b는 IL-6-유도 MCP-1 분비에 대한 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 의해 생성된 다양한 정제 다클론 항-IL-6 항체의 중화 활성을 나타낸다. 서열번호 116, 118, 124 내지 134 및 136의 중화 활성은 도 8a에 나타내고 서열번호 138 내지 145의 중화 활성은 도 8b에 나타낸다. U937 세포를 10ng/㎖의 인간 IL-6 및 결정된 농도의 다양한 다클론 항-IL-6 IgG 항체와 함께 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. MCP-1 수준을 결정하기 위해 배양 상등액을 수집하였다.
도 9는 예방 모델을 사용하여 쥐 콜라겐-유도 관절염(CIA)에서 쥐 IL-6 펩타이드 작제물의 효능을 평가하기 위한 실험 설계를 나타낸다. -31, -10 및 4일에 45㎍의 용량으로 서열번호 148 또는 157의 펩타이드 면역원 작제물을 근육 내 투여하여 암컷 루이스 쥐(군당 n=7)를 면역화하였다. 관절염을 유도하기 위해, 0 및 7일에 소의 II형 콜라겐/IFA 에멀션을 피부 내 투여하였다.
도 10은 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 148 및 157)로 면역화한 쥐에서의 28일 동안의 항체 반응 동역학을 나타낸다. ELISA 플레이트를 재조합 쥐 IL-6으로 코팅하였다. 4배 연속 희석으로 혈청을 1:100 내지 1:4.19×108으로 희석하였다. Log10(EC50)로 표시된 시험 혈청의 역가는 4-파라미터 로지스틱 곡선-맞춤을 사용한 비선형 회귀로 계산하였다.
도 11은 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 148 및 157)로 사전 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 관절염 점수가 감소함을 나타낸다.
도 12는 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 148 및 157)로 사전 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 뒷발 종창(swelling)이 감소함을 나타낸다.
도 13은 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 148 및 157)로 사전 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 혈액 호중구증가증이 감쇠됨을 나타낸다.
도 14는 치료 모델을 사용하여 쥐 콜라겐-유도 관절염(CIA)에서 쥐 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 효능을 평가하기 위한 실험 설계를 나타낸다. -7, 7, 14, 21 및 28일에 45㎍의 용량으로 서열번호 148을 근육 내 투여하여 암컷 루이스 쥐(군당 n=6 또는 7)를 면역화하였다. 관절염을 유도하기 위해, 0 및 7일에 소의 II형 콜라겐/IFA 에멀션을 피부 내 투여하였다.
도 15는 ISA 51 또는 ISA 51/CpG로 제형화한 서열번호 148로 면역화한 쥐에서의 43일 동안의 항체 반응 동역학을 나타낸다. ELISA 플레이트를 재조합 쥐 IL-6으로 코팅하였다. 4배 연속 희석으로 혈청을 1:100 내지 1:4.19×108으로 희석하였다. Log10(EC50)로 표시된 시험 혈청의 역가는 4-파라미터 로지스틱 곡선-맞춤을 사용한 비선형 회귀로 계산하였다.
도 16은 ISA 51 또는 ISA 51/CpG로 제형화한 서열번호 148로 사전 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 관절염 점수 및 뒷발 종창이 감소함을 나타낸다.
도 17은 ISA 51 또는 ISA 51/CpG로 제형화한 서열번호 148로 사전 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 간 C-반응성 단백질(CRP)이 감소함을 나타낸다.
도 18은 ISA 51 또는 ISA 51/CpG로 제형화한 서열번호 148로 사전 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 발목 관절 붕괴가 완화됨을 나타낸다.
도 19는 ISA 51 또는 ISA 51/CpG로 제형화한 서열번호 148로 사전 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 조직 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-17 및 MCP-1)의 생산이 감소함을 나타낸다.
도 20은 ISA 51/CpG 또는 ADJU-PHOS/CpG로 제형화한 서열번호 148을 서로 다른 용량으로 투여하여 면역화한 쥐에서의 43일 동안의 항체 반응 동역학을 나타낸다. 본 연구는 도 17과 같은 실험 설계에 따라 수행하였다. ELISA 플레이트를 재조합 쥐 IL-6으로 코팅하였다. 4배 연속 희석으로 혈청을 1:100 내지 1:4.19×108으로 희석하였다. Log10로 표시된 시험 혈청의 역가는 비선형 회귀로 각 혈청 시료의 4-파라미터 로지스틱 곡선에 0.45의 컷오프를 통합하여 계산하였다.
도 21은 ISA 51/CpG 또는 ADJU-PHOS/CpG로 제형화한 서열번호 148을 점차 높은 용량으로 투여하여 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 체중 감소가 완화됨을 나타낸다.
도 22는 ISA 51/CpG 또는 ADJU-PHOS/CpG로 제형화한 서열번호 148을 점차 높은 용량으로 투여하여 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 뒷발 종창이 감소함을 나타낸다.
도 23은 ISA 51/CpG 또는 ADJU-PHOS/CpG로 제형화한 서열번호 148을 점차 높은 용량으로 투여하여 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐의 뒷발을 24일째에 육안으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 24는 ISA 51/CpG 또는 ADJU-PHOS/CpG로 제형화한 서열번호 148을 점차 높은 용량으로 투여하여 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 관절염 점수가 감소함을 나타낸다.
도 25는 ISA 51/CpG 또는 ADJU-PHOS/CpG로 제형화한 서열번호 148을 점차 높은 용량으로 투여하여 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 혈액 호중구증가증이 감쇠됨을 나타낸다.
도 26은 ISA 51/CpG 또는 ADJU-PHOS/CpG로 제형화한 서열번호 148을 점차 높은 용량으로 투여하여 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 혈소판 방출이 감쇠됨을 나타낸다.
도 27은 ISA 51/CpG 또는 ADJU-PHOS/CpG로 제형화한 서열번호 148을 점차 높은 용량으로 투여하여 면역화하고 콜라겐을 투여한 쥐에서 혈액 AST 증가가 감소함을 나타낸다.
도 28은 결정된 아쥬반트로 제형화한 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 102, 114, 115, 117 및 118)로 면역화한 기니피그에서 12주 동안의 항체 반응 동역학을 나타낸다. ELISA 플레이트를 재조합 인간 IL-6으로 코팅하였다. 4배 연속 희석으로 혈청을 1:100 내지 1:4.19×108으로 희석하였다. Log10(EC50)로 표시된 시험 혈청의 역가는 4-파라미터 로지스틱 곡선-맞춤을 사용한 비선형 회귀로 계산하였다.
본 개시내용은 인터루킨 6(IL-6)을 표적으로 하는 개별 펩타이드 면역원 작제물과 IL-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환의 면역요법을 위한 이의 제형에 관한 것이다.
개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 IL-6 수용체(IL-6R) 결합 영역 E42 내지 C83(서열번호 16) 또는 N144 내지 I166(서열번호 19) 또는 이의 단편(서열번호 5 내지 19)으로부터 유래된 기능적 B 세포 에피토프로서, 병원체 단백질로부터 유래된 이종의 T 헬퍼 세포(Th) 에피토프(서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226)에 선택적 이종 스페이서를 통해 연결된, B 세포 에피토프를 포함하는 30개 이상의 아미노산을 갖는다. 설계된 B 세포- 및 Th 세포 에피토프를 함유하는 이들 IL-6 펩타이드 작제물은 IL-6R 결합 영역에 대한 고특이적 항체의 생성을 자극하는데 함께 작용하여, IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환을 앓거나 질환에 걸리기 쉬운 환자에 예방적 및/또는 치료적 면역 반응을 제공한다. 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편으로부터 유래된 B 세포 항원 부위(서열번호 5 내지 20; 72 내지 75)로서, 재조합 인간 IL-6(서열번호 1) 또는 마카크(서열번호 2), 생쥐(서열번호 3) 및 쥐(서열번호 4)와 같은 다른 종의 IL-6과 교차반응하는 고특이적 항체의 생성을 자극하는데 함께 작용하는 병원성 단백질로부터 유래된 이종 Th 에피토프(예를 들어, 표 2의 서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226)에 연결된, B 세포 항원 부위를 갖는 혼성 펩타이드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL-6 펩타이드 면역원 작제물(예를 들어, 표 3의 서열번호 107 내지 186)은 B 세포 항원 부위로, 재조합 인간 IL-6(서열번호 1)과 교차반응하고, 다른 종의 IL-6(서열번호 2, 3, 4)에 대해 교차반응성을 갖는 항체를 유도할 수 있는 다양한 병원성 단백질로부터 유래된 이종 Th 에피토프(서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226)에 연결된, B 세포 항원 부위, 예를 들어 C73 내지 C83(서열번호 5)를 갖는 혼성 펩타이드를 포함한다. B 세포 항원 부위를 강화하기 위해 적용된 이종 Th 에피토프 중에서, 천연 병원체 EBV BPLF1(서열번호 105), EBV CP(서열번호 102), 클로스트리디움 테타니(Clostridium Tetani)1,2,4(서열번호 78, 99 내지 101), 콜레라 독소(서열번호 85), 스키스토소마 만소니(Schistosoma mansoni)(서열번호 84)로부터 유래된 Th 에피토프 및 홍역 바이러스(Measles Virus) 융합 단백질(MVF 1 내지 5) 및 B형 간염 표면 항원(HBsAg 1 내지 3)으로부터 유래된 단일 서열 또는 조합 서열 형태의 이들의 최적화 인공 Th 에피토프(예를 들어 서열번호 79, 86 내지 92)가 면역원성 스크리닝 테스트를 통해 특히 이러한 B 세포 항원성 강화에 사용되는 것으로 밝혀졌다.
본 개시내용은 또한 서로 다른 병원체로부터 유래된 이종 Th 에피토프와 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 혼합물을 포함하는 펩타이드 조성물에 관한 것이다. IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 혼합물을 포함하는 조성물은 환자에 광범위한 유전적 배경의 적용 범위를 허용하여 IL-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 면역화 시 더 높은 퍼센트의 반응자 비율을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 하나 초과의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 펩타이드 조성물을 사용하는 경우 면역 반응의 시너지성 강화를 관찰할 수 있다.
이러한 펩타이드 면역원 작제물로부터 유래된 항체 반응은 대부분(90% 초과), 만약 있다면, 면역원성 강화를 위해 적용된 이종 Th 에피토프에 대한 많은 관련없이, IL-6R 결합 영역 펩타이드(서열번호 5 내지 19)에 대한 교차반응성에 초점을 맞추었다. 이는 KLH, 톡소이드 또는 펩타이드 항원성 강화를 위해 사용되는 다른 생물학적 담체와 같은 기존의 운반 단백질을 사용하는 표준 방법과는 뚜렷한 대조를 이룬다.
본 개시내용은 또한 IL-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 제형을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 정전기적 결합을 통해 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 혼합물을 함유하는 펩타이드 조성물과 CpG 올리고머를 혼합하여 형성되는, 안정화된 면역자극성 복합체를 포함하는 약학적 조성물은 IL-6 펩타이드 면역원성을 전장 인간 IL-6(서열번호 1) 또는 마카크(서열번호 2), 생쥐(서열번호 3) 및 쥐(서열번호 4)와 같은 다른 종의 IL-6과의 원하는 교차반응성 방향으로 보다 강화시킨다.
다른 실시형태에서, 현탁물을 형성하기 위한 알륨 겔(Alum gel)(ALHYDROGEL) 또는 인산알루미늄(ADJU-PHOS)을 포함하는 무기염 또는 유중수 에멀션을 형성하기 위한 아쥬반트로서의 MONTANIDE ISA 51 또는 720과 접촉하는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 혼합물의 펩타이드 조성물을 포함하는 약학적 조성물이 IL-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 환자 투여에 사용되었다.
또한, 본 개시내용은 IL-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환을 갖는 동물 및 환자의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형의 저비용 제조 및 품질 관리 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 대한 항체에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 IL-6 분자의 IL-6R 결합 부위와 교차반응하는 고특이적 항체의 생성을 자극할 수 있다. 개시된 항체는, 만약 있다면, 면역원성 강화를 위해 적용된 이종 Th 에피토프에 대한 많은 관련없이 높은 특이성으로 IL-6R 결합 부위에 결합하며, 이는 이러한 펩타이드 면역원성 강화를 위해 사용된 기존의 단백질 또는 다른 생물학적 담체를 사용하여 생산된 항체와 뚜렷한 대조를 이룬다. 따라서, 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은, 다른 펩타이드 또는 단백질 면역원에 비교하여 높은 반응자 비율로, 자가 IL-6 단백질에 대한 면역 내성을 파괴할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항체는 인간 IL-6 분자(서열번호 1)의 IL-6R 결합 부위에 대한 것이고 이 부위에 특이적으로 결합한다. IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도되는 고특이적 항체는 IL-6과 IL-6R의 결합 및 IL-6-유도 STAT3 인산화, IL-6 의존성 세포 증식, IL-6 유도 MCP 생산 및 다른 IL-6 관련 병리학적 상태와 같은 다운스트림 사건을 저해하여, IL-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환을 앓는 환자의 효과적인 치료를 유도할 수 있다.
추가 양상에서, 본 개시내용은 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물을 제공받는 환자에서 유도된 IL-6에 대한 인간 항체(다클론 및 단클론)를 제공한다. 인간 환자의 혈액으로부터 단리된 B 세포로부터 인간 단클론 항체를 만드는 효과적인 방법이 Traggiai, et al.(2004)에 의해 기술되며, 그 개시내용 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
고유의 특성 및 속성을 기초로, IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도되는 개시된 항체는 IL-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환을 앓는 환자의 치료를 위한 면역요법적 접근법을 제공할 수 있다.
본 개시내용은 또한 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물, 조성물 및 항체를 만드는 방법에 관한 것이다. 개시된 방법은 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 작제물을 함유하는 조성물의 저비용 제조 및 품질 관리를 제공하며, 이는 IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환을 앓는 환자의 치료를 위한 방법에 사용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및/또는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 대한 항체를 사용하여 대상의 IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 포함한다. 개시된 방법은 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법에 사용되는 조성물은, IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환에 걸리기 쉽거나 질환을 앓는 대상에 대한 투여를 위해, 정전기적 결합을 통해, CpG 올리고머와 같은, 음전하 올리고뉴클레오타이드와 안정한 면역자극성 복합체를 형성하는 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하며, 아쥬반트가 추가로 보충될 수 있다.
개시된 방법은 또한 IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 펩타이드 면역원 작제물을 투여하기 위한 투여 요법, 투여 형태 및 경로를 포함한다.
일반 사항
본 명세서에 사용된 절의 머릿말은 단지 구성적 목적을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원에 인용된 모든 참조 또는 참조의 일부는 임의의 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 명시적으로 원용된다.
달리 설명하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 단수 용어는 복수의 대상을 포함한다. 유사하게, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, "또는"은 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 어구 "A 또는 B를 포함하는"은 A 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 폴리펩타이드를 위해 주어진 모든 아미노산 크기 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 근사치이며, 설명을 위해 제공된 것임을 추가로 이해해야 한다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 개시된 방법의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래에 기술된다. 본 명세서에 언급된 모든 공개 문헌, 특허 출원, 특허 및 다른 참조 문헌은 그 전체가 참조에 의해 원용된다. 상충되는 경우, 용어의 설명을 포함하는 본 명세서가 우선한다. 또한, 본 명세서에 개시된 재료, 방법 및 예시는 단지 예시적인 것일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.
IL-6 펩타이드 면역원 작제물
본 개시내용은 IL-6 수용체(IL-6R) 결합 영역 E42 내지 C83(서열번호 16) 또는 N144 내지 I166(서열번호 19), 또는 이의 단편(예를 들어 서열번호 5 내지 19)으로부터의 아미노산 서열을 갖는 B 세포 에피토프를 함유하는 펩타이드 면역원 작제물을 제공한다. B 세포 에피토프는 병원체 단백질로부터 유래된 이종 T 헬퍼 세포(Th) 에피토프에 직접적으로 또는 선택적 이종 스페이서를 통해 공유결합으로 연결된다. 설계된 B 세포- 및 Th 세포 에피토프를 함유하는 이들 작제물은 IL-6의 IL-6R 결합 영역에 대한 고특이적 항체의 생성을 촉진하는데 함께 작용하여, IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환에 걸리기 쉽거나 질환을 앓는 환자에 치료적 면역 반응을 제공한다.
본 명세서에 사용된 어구 "IL-6 펩타이드 면역원 작제물" 또는 "펩타이드 면역원 작제물"은 (a) 펩타이드 E42 내지 C83(서열번호 16) 또는 N144 내지 I166(서열번호 19)로 표시되는, 전장 인간 IL-6(서열번호 1)의, IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편(예를 들어 서열번호 5 내지 19)으로부터의 약 10개 초과의 연속된 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프; (b) 이종 Th 에피토프; 및 (c) 선택적 이종 스페이서를 함유하는 길이 상으로 30개 이상의 아미노산을 갖는 펩타이드를 의미한다.
특정 실시형태에서, IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 다음 식으로 표시될 수 있다:
(Th)m-(A)n-(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)-X
또는
(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)-(A)n-(Th)m-X
또는
(Th)m-(A)n-(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)-(A)n-(Th)m-X
여기서
Th는 이종 T 헬퍼 에피토프이고;
A는 이종 스페이서이고;
(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)은 IL-6(서열번호 1)의 IL-6R 결합 영역의 약 7 내지 약 42개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프 펩타이드이고;
X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이고;
m은 1 내지 약 4이고;
n은 0 내지 약 10이다.
본 개시내용의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 다음을 포함하는 여러 이유를 기반으로 설계 및 선택되었다:
i. IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드는 자가 T 세포 활성화를 피하기 위해 자체적으로 비-면역원성이며;
ii. IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드는 단백질 담체 또는 유력한 T 헬퍼 에피토프(들)의 사용으로 면역원성이 될 수 있으며;
iii. IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드가 면역원성이 되어 숙주에 투여되었을 때, 펩타이드 면역원 작제물은:
a. 단백질 담체 또는 T 헬퍼 에피토프(들)가 아닌 IL-6 펩타이드 서열(B 세포 에피토프)에 대해 우선적으로 높은 역가의 항체를 유도하고;
b. 면역화된 숙주에서 면역 내성을 파괴하고 IL-6(서열번호 1)과의 교차반응성을 갖는 고특이적 항체를 생성하고;
c. IL-6과 IL-6R의 결합 및 IL-6-유도 STAT3 인산화, IL-6 의존성 세포 증식, IL-6 유도 MCP 생산과 같은 다운스트림 사건을 저해할 수 있는 고특이적 항체를 생성하고;
d. 다른 IL-6 관련 병리학적 상태의 생체 내 감소를 유도할 수 있는 고특이적 항체를 생성한다.
개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형은 IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환에 걸리기 쉬운 또는 질환을 앓는 대상을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학적 조성물로서 효과적으로 기능할 수 있다.
개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 다양한 구성요소가 아래에 보다 구체적으로 기술된다.
a. IL-6R 결합 영역으로부터의 B 세포 에피토프 펩타이드
본 개시내용은 인간 재조합 IL-6 단백질에 대한 특이성 및 마카크, 생쥐 및 쥐 종의 IL-6 단백질에 대한 교차반응성을 갖는 고역가 항체의 생성을 위한 신규 펩타이드 조성물에 관한 것이다. 펩타이드 조성물의 부위-특이성은 IL-6의 다른 영역의 부적절한 부위 또는 운반 단백질의 부적절한 부위에 대한 항체 생성을 최소화하여, 높은 안전성을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어 "IL-6"은 인간의 전장 IL-6 단백질(UniProtKB P05231; GenBank 등록 번호 NP_000591.1) 및, 마카크(UniProtKB A0A1D5QM02-1; GenBank 등록 번호 NP_001274245.1), 생쥐(UniProtKB P08505; GenBank 등록 번호 NP_112445.1) 및 쥐(UniProtKB P20607; GenBank 등록 번호 NP_036721.1)를 포함하는, 교차반응성을 갖는 다른 종의 전장 IL-6 단백질을 의미한다. 인간(서열번호 227), 마카크(서열번호 228), 생쥐(서열번호 229) 및 쥐(서열번호 230)에 대한 전장 IL-6 서열의 아미노산 서열 얼라인먼트를 도 1에 나타낸다.
보다 구체적으로, 본 명세서에서 사용된 용어 "IL-6"은 N-말단 신호 펩타이드(종에 따라 약 24 내지 28개의 아미노산을 함유함)가 잘린 전장 성숙형 IL-6 단백질의 아미노산 서열을 의미한다. 인간(서열번호 1), 마카크(서열번호 2), 생쥐(서열번호 3) 및 쥐(서열번호 4)의 전장 성숙형 IL-6 단백질의 아미노산 서열을 표 1에 나타낸다. 본 출원의 전반에 걸쳐, IL-6 단백질 내 아미노산 위치의 번호 설정은 표 1에 나타낸 바와 같은 서열번호 1 내지 4로 표시되는, N-말단 신호 서열이 잘린, IL-6의 전장 성숙형 서열을 기반으로 한다.
IL-6R은 (1) 두 가지 형태, 즉 (a) 80kD 막관통 IL-6Rα(mIL-6Rα)(UniProtKB: P08887; GenBank 등록 번호 NP_000556.1) 및 (b) 50 내지 55kD 가용성 IL-6Rα(sIL-6Rα)(UniProtKB: P08887 또는 P08887-2)로 존재하는, IL-6 결합 사슬 또는 IL-6Rα 및 (2) IL-6Rβ 또는 gp130(UniProtKB: P40189; GenBank 등록 번호 NP_002175.2)로 명명된, 130kD 신호-변환 사슬의 두 개의 사슬로 이루어진다.
막 IL-6Rα(또는 mIL-6Rα)는 제한된 수의 세포 유형, 즉 간세포, 거핵세포 및, 단핵구, 대식세포, 호중구 및 T- 및 B-림프구를 포함하는, 백혈구의 표면 상에 발현된다. 가용성 IL-6Rα(또는 sIL-6Rα)는 인간의 혈장(25 내지 75ng/㎖) 및 조직액에 존재하며 메탈로프로테아제(디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(즉, ADAM))에 의한 mIL-6Rα의 단백질 분해 절단(쉐딩)(shedding)에 의해, 또는, 일부, 막관통 도메인의 누락에 의한 선택적 스플라이싱을 통해 생성될 수 있다.
막 IL-6Rβ 또는 gp130은 모든 인간 세포에서 보편적으로 발현된다(Sebba, 2008).
클래식 신호전달에서, IL-6은 막결합 IL-6 수용체(mIL-6Rα)에 결합하고 IL-6-mIL-6Rα 복합체는 IL-6Rβ-서브유닛(gp130)과 결합하여, gp130 이합체화 및 세포 내 신호전달을 유도한다. 선택적으로, IL-6은, 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 도메인-함유 단백질 17(ADAM17)에 의해 mIL-6Rα의 절단으로 생성되는, 가용성 IL-6Rα(sIL-6Rα)에 결합할 수 있다. IL-6-sIL-6Rα 복합체는 이후, IL-6R을 발현하지 않는 세포에서 조차, 막결합 IL-6Rβ-서브유닛(gp130)에 결합하고, 트랜스-신호전달을 유도한다. 따라서, mIL-6Rα(또는 sIL-6Rα)에 결합 시, IL-6은 육량체(두 개의 IL-6, 두 개의 IL-6Rα 및 2개의 IL-6Rβ(gp130)를 포함) 단백질의 형성을 유도하며, 이는 차례로 다운스트림 신호전달 캐스케이드를 유발한다(Rose-John, et al, 2017).
mIL-6Rα에 결합하는 IL-6를 통한 세포 활성화를 "클래식 신호전달"이라고 한다. mIL-6Rα를 발현하지 않는 다른 모든 세포는 "트랜스-신호전달"로 IL-6 신호를 받는다: IL-6은 순환 sIL-6Rα에 결합하고, 이 복합체는 세포 표면 상의 IL-6Rβ 또는 gp130과 함께 신호전달 복합체를 형성한다. 트랜스-신호전달은 광범위한 인간 세포에서 발생할 수 있으므로, IL-6의 다면발현성 활성에 기여한다. 현재 IL-6의 항상성 및 재생적 활성은 클래식 신호전달로 매개되며, 전염증성 효과는 주로 트랜스-신호전달 경로의 활성화로부터 초래되는 것으로 이해된다. 많아지는 증거가 IL-6 트랜스-신호전달이 특히 질병 발달에 관여함을 나타낸다. IL-6Rβ 또는 gp130의 가용성 형태(sIL-6Rβ 또는 sgp130) 또한 순환계에서 상대적으로 높은 농도로 검출되었으며, 주로 선택적 스플라이싱으로 생산되었다. sgp130은 IL-6/sIL-6Rα 복합체에 결합할 수 있기 때문에, IL-6 매개 트랜스-신호전달의 자연적 및 특이적 저해제로 작용하지만 클래식 신호전달은 sgp130에 의해 영향을 받지 않는다.
IL-6Rα는 IL-6에 대한 고유 결합 수용체이지만, IL-6Rβ(또는 gp130) 신호-변환 사슬은, 백혈병 저해 인자, 온코스타틴 M, 섬모 향신경성 인자, IL-11, 카디오트로핀-1, 뉴로포이에틴-1, IL-27 및 IL-35를 포함하는, IL-6 패밀리의 구성원과 공유된다.
IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 IL-6 B 세포 에피토프 부분은 IL-6 분자의 IL-6R 결합 영역을 표적으로 한다. B 세포 에피토프 펩타이드는 전장 성숙형 IL-6 단백질(서열번호 1 내지 4)의 E42 내지 C83(서열번호 16) 또는 N144 내지 I166(서열번호 19)으로부터 유래된 약 7 내지 약 42개의 아미노산 잔기를 함유한다. IL-6 B 세포 에피토프는 IL-6 단백질의 단편을 사용한 광범위 혈청학적 스크리닝 후 선택되었으며, 그 중 일부는, 도 1에 음영처리된 시스테인 잔기로 나타낸 바와 같이, 단백질 내 자연적으로 존재하는 분자 내 루프를 함유한다.
특정 실시형태에서, 설계 이유를 기반으로 스크리닝 및 선택된, B 세포 에피토프 펩타이드는 전장 성숙형 IL-6 단백질 서열(서열번호 1)의 번호 설정에 따른 내생 시스테인(예를 들어, C73 내지 C83(서열번호 5) 또는 C44 내지 C50(서열번호 15))에 의해 형성되는 IL-6의 내부 분자 내 루프 또는 N144 내지 I166(서열번호 19)로부터의 아미노산 서열을 포함하는 IL-6 분자의 C-말단으로부터 아미노산 잔기를 함유한다. 일부 실시형태에서, B 세포 에피토프는 표 1에 나타낸 바와 같은, 서열번호 5 내지 19의 아미노산 서열을 갖는다.
본 개시내용의 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드는 또한 IL-6 펩타이드(서열번호 5 내지 19)의 면역학적 기능성 유사체 또는 동족체를 포함한다. IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 기능성 면역학적 유사체 또는 동족체는 본래의 펩타이드와 실질적으로 같은 면역원성을 갖는 변이체를 포함한다. 면역학적 기능성 유사체는 아미노산 위치에 보존적 치환; 전체 전하의 변화; 다른 모이어티에의 공유 부착; 또는 아미노산 부가, 삽입 또는 결실; 및/또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다(예를 들어, 서열번호 72 내지 76의 IL-6 펩타이드).
b. 이종 T 헬퍼 세포 에피토프(Th 에피토프)
본 개시내용은 이종 T 헬퍼 세포(Th) 에피토프에 직접적으로 또는 선택적 이종 스페이서를 통해 공유결합으로 연결된 IL-6으로부터의 B 세포 에피토프를 함유하는 펩타이드 면역원 작제물을 제공한다.
IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 이종 Th 에피토프는 IL-6 단편의 면역원성을 강화하며, 이는 설계 이유를 기반으로 스크리닝 및 선택된 최적화 표적 B 세포 에피토프 펩타이드(즉, IL-6 단편)에 대한 특이적 고역가 항체의 생산을 촉진한다.
본 명세서에 사용된 용어 "이종"은 IL-6의 야생형 서열의 일부가 아니거나 이 서열에 상동적이지 않은 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, 이종 Th 에피토프는 IL-6에서 자연적으로 발견되지 않는 아미노산 서열로부터 유래된 Th 에피토프이다(즉, Th 에피토프는 IL-6에 대해 자가 유래가 아니다). Th 에피토프는 IL-6의 이종이므로, 이종 Th 에피토프가 IL-6 단편에 공유결합으로 연결되는 경우 IL-6의 천연 아미노산 서열은 N-말단 또는 C-말단 방향으로 확장되지 않는다.
본 개시내용의 이종 Th 에피토프는 IL-6에서 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 갖지 않는 임의의 Th 에피토프일 수 있다. Th 에피토프는 또한 여러 종의 MHC 클래스 II 분자에 대한 무차별 결합 모티프를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, Th 에피토프는 면역 반응의 개시 및 조절을 이끄는 T 헬퍼 세포의 최대 활성화를 허용하는 무차별 MHC 클래스 II 결합 모티프를 포함한다. Th 에피토프는 바람직하게는 그 자체로 면역침묵성이어서, 즉, 만약 있다면, IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 의해 생성되는 항체의 소수 만이 Th 에피토프에 대한 것이 되어서, 표적화된 IL-6의 B 세포 에피토프 펩타이드에 대한 면역 반응이 고도로 집중되도록 한다.
본 개시내용의 Th 에피토프는, 표 2에 예시된 바와 같이(서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226), 외래 병원체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 또한, Th 에피토프는 최적화 인공 Th 에피토프 및 조합된 최적화 인공 Th 에피토프를 포함한다(예를 들어, 서열번호 79, 86, 91, 92 및 79, 86 내지 92). 조합된 서열로서 제시된 이종 Th 에피토프 펩타이드(예를 들어, 서열번호 87 내지 90)는 특정 펩타이드에 대한 동족체의 가변 잔기를 기반으로 하여 펩타이드 프레임워크의 특정 위치에 표시된 아미노산 잔기의 혼합물을 함유한다. 조합 펩타이드의 조립체는 합성 과정에서 특정 위치에, 하나의 특정 아미노산 대신, 지정된 보호된 아미노산의 혼합물을 첨가하여 하나의 과정에서 합성될 수 있다. 이러한 조합 이종 Th 에피토프 펩타이드 조립체는 다양한 유전적 배경을 갖는 동물들에 대한 광범위한 Th 에피토프 범위를 허용할 수 있다. 이종 Th 에피토프 펩타이드의 대표적인 조합 서열은 표 2에 제시된 서열번호 87 내지 90을 포함한다. 본 개시내용의 Th 에피토프 펩타이드는 유전적으로 다양한 집단의 동물 및 환자에 광범위한 반응성 및 면역원성을 제공한다.
c. 이종 스페이서
개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드를 이종 T 헬퍼 세포(Th) 에피토프에 공유결합으로 연결하는 이종 스페이서를 선택적으로 함유한다.
위에서 논의된 바와 같이, 용어 "이종"은 IL-6의 자연형 서열의 일부가 아니거나 이 서열에 상동적이지 않은 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, 스페이서가 IL-6 서열의 이종이므로 이종 스페이서가 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드에 공유결합으로 연결되는 경우 IL-6의 천연 아미노산 서열은 N-말단 또는 C-말단 방향으로 확장되지 않는다.
스페이서는 두 개의 아미노산 및/또는 펩타이드를 연결할 수 있는 임의의 분자 또는 화학적 구조이다. 스페이서는 적용에 따라 길이 또는 극성이 변경될 수 있다. 스페이서 부착은 아마이드- 또는 카복시- 연결을 통해 이루어질 수 있지만 다른 기능성도 가능하다. 스페이서는 화학적 화합물, 자연적으로 발생하는 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다.
스페이서는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 구조적 특징을 제공할 수 있다. 구조적으로, 스페이서는 IL-6 단편의 B 세포 에피토프로부터 Th 에피토프의 물리적인 분리를 제공한다. 스페이서에 의한 물리적 분리는 Th 에피토프와 B 세포 에피토프의 연결로 생성되는 임의의 인공적 2차 구조를 방해할 수 있다. 추가적으로, 스페이서에 의한 에피토프의 물리적 분리는 Th 세포 및/또는 B 세포 반응 사이의 간섭을 제거할 수 있다. 또한, 스페이서는 펩타이드 면역원 작제물의 2차 구조를 생성하거나 변형하기 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 Th 에피토프와 B 세포 에피토프의 분리를 강화하기 위해 유연한 힌지로 작용하도록 설계될 수 있다. 유연한 힌지 스페이서는 또한 제시된 펩타이드 면역원과 적합한 Th 세포 및 B 세포 사이의 보다 효과적인 상호작용을 허용하여 Th 에피토프와 B 세포 에피토프에 대한 면역 반응을 강화할 수 있다. 유연한 힌지를 암호화하는 예시 서열은 면역글로불린 중쇄 힌지 영역에서 발견되며, 이 서열은 종종 프롤린이 많은 서열이다. 스페이서로 사용될 수 있는 특히 유용한 유연한 힌지는 서열 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(서열번호 76)으로 제공되며, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 아스파르트산이다.
스페이서는 또한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 기능적 특징을 제공할 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 전체 전하가 변경되도록 설계될 수 있으며, 이는 펩타이드 면역원 작제물의 용해성에 영향을 미칠 수 있다. 추가적으로, IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 전체 전하의 변경은 다른 화합물 및 시약과 연합하는 펩타이드 면역원 작제물의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 아래에서 보다 구체적으로 논의되는 바와 같이, IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 정전기적 결합을 통해 CpG 올리고머와 같은 고전하 올리고뉴클레오타이드와 함께 안정한 면역자극성 복합체로 형성될 수 있다. IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 전체 전하는 이러한 안정한 면역자극성 복합체의 형성을 위해 중요하다.
스페이서로 사용될 수 있는 화학적 화합물은 (2-아미노에톡시) 아세트산(AEA), 5-아미노발레르산(AVA), 6-아미노카프로산(Ahx), 8-아미노-3,6-다이옥사옥타노산(AEEA, mini-PEG1), 12-아미노-4,7,10-트라이옥사도데카노산(mini-PEG2), 15-아미노-4,7,10,13-테트라옥사펜타-데카노산(mini-PEG3), 트라이옥사트라이데칸-숙시남산(Ttds), 12-아미노-도데카노산, Fmoc-5-아미노-3-옥사펩타노산(O1Pen) 및 기타 같은 종류의 것을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다.
자연적으로 발생하는 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글라이신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린을 포함한다.
비-자연 발생 아미노산은 ε-N 라이신, β-알라닌, 오르니틴, 노르루신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 타이록신, γ-아미노 부티르산, 호모세린, 시트룰린, 아미노벤조산, 6-아미노카프로산(Aca; 6-아미노헥사노산), 하이드록시프롤린, 메르캅토프로피온산(MPA), 3-나이트로-타이로신, 파이로글루탐산 및 기타 같은 종류의 것을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다.
IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 스페이서는 Th 에피토프 및 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 공유결합으로 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 Th 에피토프의 C-말단과 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 N-말단에 공유결합으로 연결된다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 C-말단과 Th 에피토프의 N-말단에 공유결합으로 연결된다. 특정 실시형태에서, 예를 들어 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 하나 초과의 Th 에피토프가 존재하는 경우, 하나 초과의 스페이서가 사용될 수 있다. 하나 초과의 스페이서가 사용되는 경우, 각 스페이서는 서로 같거나 다를 수 있다. 추가적으로, IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 하나 초과의 Th 에피토프가 존재하는 경우, Th 에피토프는 스페이서로 분리될 수 있으며, 이는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드로부터 Th 에피토프를 분리하는데 사용된 스페이서와 같거나 다를 수 있다. Th 에피토프 또는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드와 관련하여 스페이서의 배열에는 제한이 없다.
특정 실시형태에서, 이종 스페이서는 자연적으로 발생하는 아미노산 또는 비-자연 발생 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 하나 초과의 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산을 함유한다. 특정 실시형태에서, 스페이서는 Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 77) 또는 Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(서열번호 231)이다.
d. IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 특정 실시형태
특정 실시형태에서, IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 다음 식으로 표시될 수 있다:
길이 상으로 약 30개 초과의 아미노산을 갖는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물로서, 다음의 식으로 표시되는, IL-6 펩타이드 면역원 작제물:
(Th)m-(A)n-(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)-X
또는
(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)-(A)n-(Th)m-X
또는
(Th)m-(A)n-(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)-(A)n-(Th)m-X
여기서
Th는 이종 T 헬퍼 에피토프이고;
A는 이종 스페이서이고;
(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)은 IL-6(서열번호 1)의 IL-6R 결합 영역으로부터의 약 7 내지 약 42개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프 펩타이드이고;
X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이고;
m은 1 내지 약 4이고;
n은 0 내지 약 10이다.
일부 실시형태에서, (IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)은 서열번호 5 내지 19 중 임의의 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 B 세포 에피토프 펩타이드이다. 특정 실시형태에서, B 세포 에피토프는 IL-6(서열번호 1 내지 4)의 E42 내지 C83(서열번호 16) 또는 N144 내지 I166(서열번호 19) 또는 이의 단편으로부터의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시형태에서, (IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)은, 도 1에 제시된 바와 같은, C73 내지 C83(서열번호 5) 및/또는 C44 내지 C50(서열번호 15)로부터의 적어도 하나의 자연적으로 존재하는 분자 내 루프를 함유하는 B 세포 에피토프이다.
특정 실시형태에서, IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 이종 Th 에피토프는, 표 2에 제시된 바와 같은, 서열번호 78 내지 106, 216 내지 226 또는 이들의 조합 중 임의의 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 하나 초과의 Th 에피토프를 함유한다.
특정 실시형태에서, 선택적 이종 스페이서는 Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(서열번호 76), ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 77), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(서열번호 231) 및 이들의 임의의 조합 중 임의의 것으로부터 선택되며, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산이지만, 바람직하게는 아스파르트산이다. 특정 실시형태에서, 이종 스페이서는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 77) 또는 Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(서열번호 231)이다.
특정 실시형태에서, IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드는 서열번호 1의 전장 성숙형 IL-6 단백질로부터의 약 7 내지 약 42개의 아미노산 잔기를 갖는다. 특정 실시형태에서, IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드는 E42 내지 C83(서열번호 16) 내에 함유된 IL-6의 분자 내 루프로부터의 아미노산 서열을 함유한다. 특정 실시형태에서, IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드는, 표 1에 제시된 바와 같은, 아미노산 C73 내지 C83(서열번호 5) 또는 IL-6 C44 내지 C50(서열번호 15)(예를 들어, 서열번호 5 내지 8, 10, 12, 15 내지 17)로부터의 IL-6의 내부 루프를 함유한다.
특정 실시형태에서, IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 표 3에 제시된 바와 같은 서열번호 107 내지 215 중 임의의 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시형태에서, IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 서열번호 107 내지 160 중 임의의 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
Th 에피토프를 포함하는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 IL-6 단편과 함께 나란히 단일 고체상 펩타이드 합성에서 동시에 생산될 수 있다. Th 에피토프는 또한 Th 에피토프의 면역학적 유사체를 포함한다. 면역학적 Th 유사체는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드에 대한 면역 반응을 강화 또는 자극하기에 충분한 면역-강화 유사체, 교차반응성 유사체 및 이들 Th 에피토프 중 임의의 에피토프의 단편을 포함한다.
IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 Th 에피토프는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 공유결합으로 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, Th 에피토프는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 N-말단에 공유결합으로 연결된다. 다른 실시형태에서, Th 에피토프는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 C-말단에 공유결합으로 연결된다. 특정 실시형태에서, 하나 초과의 Th 에피토프가 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드에 공유결합으로 연결된다. IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드에 하나 초과의 Th 에피토프가 연결되는 경우, 각 Th 에피토프는 같은 아미노산 서열 또는 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 추가로, IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드에 하나 초과의 Th 에피토프가 연결되는 경우, Th 에피토프는 임의의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, Th 에피토프는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 N-말단에 연속적으로 또는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 C-말단에 연속적으로 연결될 수 있거나, Th 에피토프는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 N-말단에 공유결합으로 연결되고 분리된 Th 에피토프는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 C-말단에 공유결합으로 연결될 수 있다. IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드와 관련하여 Th 에피토프의 배열에는 제한이 없다.
일부 실시형태에서, Th 에피토프는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드에 직접적으로 공유결합으로 연결된다. 다른 실시형태에서, Th 에피토프는 IL-6 단편에 이종 스페이서를 통해 공유결합으로 연결된다.
e. 변이체, 동족체 및 기능적 유사체
바람직한 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드에 대한 항체를 유도하고/유도하거나 이 항체와 교차반응하는 상기 면역원성 펩타이드 작제물의 변이체 및 유사체 또한 사용될 수 있다. 대립유전자, 종 및 유도된 변이체를 포함하는 유사체는 전형적으로 종종 보존적 치환으로 인해 하나, 둘 또는 몇몇 위치에서 자연적으로 발생하는 펩타이드와 다르다. 유사체는 전형적으로 천연 펩타이드와 적어도 80 또는 90% 서열 동일성을 나타낸다. 일부 유사체는 또한 비천연 아미노산 또는 하나, 둘 또는 몇몇 위치에서 N- 또는 C-말단 아미노산의 변형을 포함한다.
기능적 유사체인 변이체는 아미노산 위치의 보존적 치환; 전체 전하 변화; 다른 모이어티에의 공유 부착; 또는 아미노산의 부가, 삽입 또는 결실; 및/또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다.
보존적 치환은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되는 경우이다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글라이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; 양전하(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함하고; 음전하(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
특정 실시형태에서, 기능적 유사체는 본래의 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 동일성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 기능적 유사체는 본래의 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 기능적 유사체는 본래의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 기능적 유사체는 본래의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는다.
변이체는 또한 인산화된 잔기에 대한 변형을 포함한다. 예를 들어, 변이체는 펩타이드 내에 인산화된 다른 잔기를 포함할 수 있다. 변이체 면역원성 IL-6 펩타이드는 또한 유사-인산화 펩타이드를 포함할 수 있다. 유사-인산화 펩타이드는 IL-6 펩타이드의 인산화 세린, 트레오닌 및 타이로신 잔기 중 하나 이상을 글루탐산 및 아스파르트산과 같은 산성 아미노산 잔기로 치환하는 것으로 생성된다.
Th 에피토프 펩타이드의 기능적 면역학적 유사체 또한 효과적이며 본 개시내용의 일부로 포함된다. 기능적 면역학적 Th 유사체는 Th 에피토프의 Th-자극 기능을 본질적으로 변형하지 않는 Th 에피토프의 1 내지 약 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환, 부가, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 보존적 치환, 부가 및 삽입은, IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드에 대해 위에 기술된 바와 같이, 천연 또는 비천연 아미노산으로 달성될 수 있다. 표 2는 Th 에피토프 펩타이드에 대한 기능적 유사체의 또 다른 변형을 확인한다. 특히, MvF1 및 MvF2 Th의 서열번호 79 및 86은 각각 N- 및 C-말단의 2개의 아미노산의 결실(서열번호 79 및 86) 또는 포함(서열번호 89 및 91)으로 아미노산 프레임이 다르다는 점에서 MvF4 및 MvF5의 서열번호 89 및 91의 기능적 유사체이다. 이들 두 유사체 서열 사이의 차이는 이들 서열 내에 함유된 Th 에피토프의 기능에 영향을 미치지 않을 것이다. 따라서, 기능적 면역학적 Th 유사체는 홍역 바이러스 융합 단백질 MvF1 내지 4 Th(서열번호 79, 86, 87 및 89) 및 간염 표면 단배질 HBsAg1 내지 3 Th(서열번호 88, 90 및 92)로부터 유래된 Th 에피토프의 몇몇 다른 버전을 포함한다.
조성물
본 개시내용은 또한 개시된 IL-6 면역원 펩타이드 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다.
a. 펩타이드 조성물
개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물은 액체 또는 고체/동결건조 형태일 수 있다. 액체 조성물은 물, 완충제, 용매, 염 및/또는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 구조적 또는 기능적 특성을 변경하지 않는 임의의 다른 허용가능한 시약을 포함할 수 있다. 펩타이드 조성물은 하나 이상의 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유할 수 있다.
b. 약학적 조성물
본 개시내용은 또한 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 전달 시스템의 담체 및/또는 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 따라서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 아쥬반트 및/또는 희석제, 첨가제, 안정화제, 보존제, 가용화제, 완충제 및 기타 같은 종류의 것과 같은 다른 부형제와 함께 약학적 유효량의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유할 수 있다.
약학적 조성물은 그 자신이 임의의 특이적 항원성 효과를 갖지 않고 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 대한 면역 반응을 가속화, 연장 또는 강화하는 작용을 하는 하나 이상의 아쥬반트를 함유할 수 있다. 약학적 조성물에 사용되는 아쥬반트는 오일, 오일 에멀션, 알루미늄염, 칼슘염, 면역 자극 복합체, 박테리아성 및 바이러스성 유도체, 바이로솜(virosome), 탄수화물, 사이토카인, 중합체 마이크로입자를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 아쥬반트는 알륨(인산 칼륨 알루미늄), 인산 알루미늄(예를 들어 ADJU-PHOS®), 수산화 알루미늄(예를 들어 ALHYDROGEL®), 인산 칼슘, 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA), 프로인트 완전 아쥬반트, MF59, 아쥬반트 65, 리포반트(Lipovant), ISCOM, 리포신(liposyn), 사포닌, 스쿠알렌, L121, EmulsIL-6n®, MPL(monophosphoryl lipid A), Quil A, QS21, MONTANIDE® ISA 35, ISA 50V, ISA 50V2, ISA 51, ISA 206, ISA 720, 리포솜, 인지질, 펩티도글리칸, 리포다당류(LPS), ASOl, AS02, AS03, AS04, AF03, lipid A(lipophilic phospholipid), 감마 인슐린, 알감물린(algammulin), 글루칸, 덱스트란, 글루코만난, 갈락토만난, 레반, 자일란, 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDA) 및 다른 아쥬반트 및 유화제로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 MONTANIDE™ ISA 51(유중수 에멀션 생산을 위한 식물성 오일 및 만니드 올레이트로 구성된 오일 아쥬반트 조성물), TWEEN® 80(폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트로도 알려짐), CpG 올리고뉴클레오타이드 및/또는 이들의 임의의 조합을 함유한다. 다른 실시형태에서, 약학적 조성물은 아쥬반트로 EmulsIL-6n 또는 EmulsIL-6n D를 함유하는 수중유중수(즉 w/o/w) 에멀션이다.
약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 첨가제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 항산화제, 결합제, 완충제, 증량제, 담체, 킬레이트제, 착색제, 희석제, 붕해제, 에멀션화제, 충진제, 겔화제, pH 완충제, 보존제, 가용화제, 안정화제 및 기타 같은 종류의 것을 함유할 수 있다.
약학적 조성물은 즉시 방출 또는 지속 방출 제형으로 제형화될 수 있다. 추가적으로, 약학적 조성물은 면역원 포획 및 마이크로입자와의 공동 투여를 통한 전신성 또는 국소적 점막 면역의 유도를 위해 제형화될 수 있다. 이러한 전달 시스템은 이 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정된다.
약학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능하게 제조될 수 있다. IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 액체 비히클은 또한 주사 전에 제조될 수 있다. 약학적 조성물은 임의의 적합한 적용 방식, 예를 들어, i.d., i.v., i.p., i.m, 비강내, 경구, 피하 등 및 임의의 적합한 전달 장치로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 정맥 내, 피하, 피내 또는 점막내 투여를 위해 제형화된다. 경구 및 비강 내 적용을 포함하는, 다른 방식의 투여에 적합한 약학적 조성물 또한 제조될 수 있다.
약학적 조성물은 또한 적합한 용량 단위 형태로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 체중 ㎏당 약 0.1㎍ 내지 약 1㎎의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유한다. 약학적 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 다른 약물을 투여했는지의 여부 및 치료가 예방인지 치료인지를 포함하는 많은 다른 요소에 따라 달라진다. 일반적으로, 환자는 인간이지만 형질전환 포유류 또한 치료될 수 있다. 다중 용량으로 전달되는 경우, 약학적 조성물은 용량 단위 형태 당 적절한 양으로 편리하게 나뉘어질 수 있다. 투여 용량은 치료 분야에 잘 알려진 바와 같이 대상의 나이, 체중 및 일반적인 건강 상태에 따를 것이다.
일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 하나 초과의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유한다. 하나 초과의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 혼합물을 함유하는 약학적 조성물은 작제물의 면역효과의 상승적인 강화를 허용한다. 하나 초과의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약학적 조성물은 광범위한 MHC 클래스 II 범위로 인해 더 큰 유전적 집단에서 더 효과적일 수 있어 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 대한 개선된 면역 반응을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 서열번호 107 내지 215(표 3)로부터 선택된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 동족체, 유사체 및/또는 이들의 조합을 함유한다.
특정 실시형태에서, 조합 형태에서 MVF 및 HBsAg로부터 유래된 이종 Th 에피토프(서열번호 87 내지 90)를 갖는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 170 내지 172)은 다양한 유전적 배경을 갖는 숙주 집단의 최대 범위를 허용하기 위해 동몰(equimolar) 비율로 혼합되었다. IL-6 73 내지 83 면역원 작제물(서열번호 170, 172)에서 상승적 강화가 본 개시내용의 펩타이드 조성물에서 관찰되었다.
또한, IL-6 펩타이드 면역원 작제물(예를 들어 서열번호 91을 함유하는 UBITh®1)에 의해 유도되는 항체 반응은 대부분(90% 초과), 만약 있다면, 면역원성 강화를 위해 적용된 이종 Th 에피토프에 대한 많은 관련없이, 원하는 IL-6의 B 세포 에피토프 펩타이드(서열번호 5)에 대한 교차반응성에 집중되었다(실시예 6, 표 8). 이는 KLH 또는 IL-6 펩타이드 면역원성 강화를 위해 사용되는 다른 생물학적 단백질 담체와 같은 기존 단백질과 뚜렷한 대조를 이룬다.
다른 실시형태에서, 예를 들어 현탁 제형을 형성하기 위한 아쥬반드로서 알륨 겔(ALHYDROGEL) 또는 인산 알루미늄(ADJUPHOS)을 포함하는 무기염과 접촉된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 혼합물의 펩타이드 조성물을 포함하는 약학적 조성물이 숙주에 대한 투여를 위해 사용되었다.
IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약학적 조성물은 투여 시 숙주에서 면역 반응을 유도하고 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
c. 면역자극성 복합체
본 개시내용은 또한 CpG 올리고뉴클레오타이드와의 면역자극성 복합체 형태의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 면역자극성 복합체는 특히 아쥬반트 및 펩타이드 면역원 안정화제로 작용하도록 조정된다. 면역자극성 복합체는 미립자 형태로, 면역 시스템의 세포에 IL-6 펩타이드 면역원을 효과적으로 제공하여 면역 반응을 생성할 수 있다. 면역자극성 복합체는 비경구 투여를 위해 현탁물로 제형화될 수 있다. 면역자극성 복합체는 또한 비경구 투여 후 숙주의 면역 시스템의 세포에 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 효과적인 전달을 위해 무기염 또는 원위치 겔화 중합체와 조합된 현탁물로서, 유중수(w/o) 형태로 제형화될 수 있다.
안정화된 면역자극성 복합체는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물과 음이온성 분자, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 조합의 정전기적 결합을 통한 복합화로 형성될 수 있다. 안정화된 면역자극성 복합체는 면역원 전달 시스템으로서 약학적 조성물에 포함될 수 있다.
특정 실시형태에서, IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 5.0 내지 8.0의 pH 범위에서 양전하로 하전된 양이온성 부분을 함유하도록 설계된다. IL-6 펩타이드 면역원 작제물 또는 작제물 혼합물의 양이온성 부분의 순전하는 각 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 대해 +1 전하, 각 아스파르트산(D) 또는 글루탐산(E)에 대해 -1 전하, 서열 내의 다른 아미노산에 대해 0 전하를 부여하여 계산된다. 전하는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 양이온성 부분 내에서 합산되고 순 평균 전하로 표시된다. 적합한 펩타이드 면역원은 순 평균 양전하가 +1인 양이온성 부분을 갖는다. 바람직하게, 펩타이드 면역원은 +2를 초과하는 범위의 순 양 전하를 갖는다. 일부 실시형태에서, IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 양이온성 부분은 이종 스페이서이다. 특정 실시형태에서, IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 양이온성 부분은 스페이서 서열이 (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 77)인 경우 +4의 전하를 갖는다.
본 명세서에 기술된 "음이온성 분자"는 5.0 내지 8.0의 pH 범위에서 음전하로 하전되는 임의의 분자를 의미한다. 특정 실시형태에서, 음이온성 분자는 올리고머 또는 중합체이다. 올리고머 또는 중합체 상의 순 음 전하는 올리고머의 각 포스포다이에스터 또는 포스포로티오에이트기에 대해 -1 전하를 부여하여 계산된다. 적합한 음이온성 올리고뉴클레오타이드는, 1 내지 10 범위의 CpG 모티프의 반복수를 갖는, 8 내지 64개의 뉴클레오타이드 염기를 갖는 단일가닥 DNA 분자이다. 바람직하게, CpG 면역자극성 단일가닥 DNA 분자는, 3 내지 8 범위의 CpG 모티프의 반복수를 갖는, 18 내지 48개의 뉴클레오타이드 염기를 포함한다.
보다 바람직하게 음이온성 올리고뉴클레오타이드는 5' X1CGX2 3'의 식으로 표시되며 여기서 C 및 G는 메틸화되지 않으며; X1은 A(아데닌), G(구아닌) 및 T(티민)으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 C(시토신) 또는 T(티민)이다. 또는, 음이온성 올리고뉴클레오타이드는 5' (X3)2CG(X4)2 3'의 식으로 표시되며 여기서 C 및 G는 메틸화되지 않으며; X3는 A, T 또는 G로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 C 또는 T이다. 특정 실시형태에서, CpG 올리고뉴클레오타이드는 CpG1: 5' TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT TTg TCg TT 3'(완전히 포스포로티오에이트화 됨)(서열번호 232), CpG2: 5' 인산염 TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT 3'(완전히 포스포로티오에이트화 됨)(서열번호 233) 또는 CpG3 5' TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT 3'(완전히 포스포로티오에이트화 됨)(서열번호 234)의 서열을 갖는다.
생성된 면역자극성 복합체는 전형적으로 1 내지 50 마이크론 범위의 크기를 갖는 입자 형태이며 상호작용하는 종의 상대적 전하 화학양론 및 분자량을 포함하는 많은 인자의 함수적 성질의 것이다. 입자화된 면역자극성 복합체는 생체 내에서 특정 면역 반응의 아쥬반트화 및 상향조절을 제공하는 이점을 갖는다. 추가적으로, 안정화된 면역자극성 복합체는 유중수 에멀션, 무기염 현탁물 및 중합체 겔을 포함하는 다양한 과정으로 약학적 조성물을 제조하는데 적합하다.
본 개시내용은 또한, IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한, 제형을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 정전기적 결합을 통해 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(예를 들어, 서열번호 107 내지 215)의 혼합물을 함유하는 펩타이드 조성물과 CpG 올리고머의 혼합을 통해 형성된, 안정화된 면역자극성 복합체를 포함하는 약학적 조성물은 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 면역원성을 더 강화하고 IL-6R 결합 영역에 대한 서열번호 1 내지 4의 IL-6 단백질과 교차반응하는 항체를 유도한다(실시예 6).
또 다른 실시형태에서, 약학적 조성물은, 선택적으로, 숙주에 투여하기 위한 현탁 제형을 형성하기 위해, 높은 안전성을 갖는 아쥬반트로서 알륨 겔(ALHYDROGEL) 또는 인산 알루미늄(ADJUPHOS)을 포함하는 무기염과 혼합한, CpG 올리고머와의 안정화된 면역자극성 복합체 형태의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 혼합물(예를 들어, 서열번호 107 내지 215의 임의의 조합)을 함유한다.
항체
본 개시내용은 또한 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 항체를 제공한다.
본 개시내용은, 제조에 비용 효과적이고, 면역화된 숙주에서 높은 반응율로 자가-단백질 IL-6에 대한 면역 내성을 부술 수 있는 IL-6 분자의 IL-6R 결합 영역을 표적화하는 고역가 항체를 유도할 수 있도록 그 설계가 최적화된, IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형을 제공한다. IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 의해 생성된 항체는 IL-6R 결합 영역에 대해 높은 친화성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체를 유도하기 위한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 선택적 스페이서를 통해 홍역 바이러스 융합(MVF) 단백질 및 기타(서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226)와 같은 병원성 단백질에서 유래된 이종 Th 에피토프에 연결된 IL-6(표 1, 도 1 및 서열번호 1 및 227 참조) 내부의 IL-6 펩타이드 C73 내지 C83(서열번호 5) 또는 C44 내지 C50(서열번호 15)에서 유래된 분자 내 루프 구조를 선택적으로 포함하는 IL-6Rα 및 IL-6Rβ 결합 영역을 커버하는 약 7 내지 약 42개의 아미노산을 함유하는 B 세포 에피토프를 갖는 IL-6 펩타이드의 혼성체를 포함한다. IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 B 세포 에피토프 및 Th 에피토프는 함께 작용하여 IL-6 단백질(서열번호 1)의 IL-6R 결합 영역과 교차반응하는 고특이적 항체의 생성을 자극한다.
운반 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모사이아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin: KLH) 또는 디프테리아 톡소이드(Diphtheria toxoid: DT) 및 파상풍 톡소이드(Tetanus Toxoid: TT) 단백질과 같은 다른 운반 단백질에 화학적으로 커플링하는 것과 같이, 펩타이드를 면역강화하는 전통적인 방법은 전형적으로 다량의 운반 단백질에 대한 항체의 생성을 초래한다. 따라서, 이러한 펩타이드-운반 단백질 조성물의 주요 결함은 면역원에 의해 생성되는 항체의 대부분(90% 초과)이 에피토프성 억제를 유도할 수 있는 운반 단백질 KLH, DT 또는 TT에 대한 비-기능성 항체라는 것이다.
펩타이드를 면역강화하는 전통적인 방법과 달리, 개시된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(예를 들어, 서열번호 142)에 의해 생성된 항체는, 만약 있다면, 이종 Th 에피토프(예를 들어 표 8의 서열번호 91) 또는 선택적 이종 스페이서에 대한 항체를 소량 함유하는 IL-6 B 세포 에티토프 펩타이드(서열번호 5 내지 19)에 고특이적으로 결합한다. 특히, 면역화된 동물에서 유도된 다클론 항체는 중앙 IL-6R 결합 영역(서열번호 107)에 고특이적으로 결합하여, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 시스(cis)-신호전달을 통해 IL-6 및 IL-6R 상호작용의 저해를 초래한다.
방법
본 개시내용은 또한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물, 조성물 및 약학적 조성물을 만들고 사용하는 방법에 관한 것이다.
a. IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 제조하는 방법
본 개시내용의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 통상의 기술자에게 잘 알려진 화학적 합성 방법으로 만들 수 있다(예를 들어, 문헌 [Fields et al, Synthetic Peptides: AUser’s Guide, ed]의 챕터 3, 문헌 [Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p. 77] 참조). IL-6 펩타이드 면역원 작제물은, 예를 들어, Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A 또는 431 상에서 측쇄 보호 아미노산을 사용하여 t-Boc 또는 F-moc으로 보호된 α-NH2를 사용한 고상 합성 자동화 메리필드 기술을 사용하여 합성할 수 있다. Th 에피토프를 위한 조합 라이브러리 펩타이드를 포함하는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 제작은 주어진 가변 위치에 커플링하기 위한 대체 아미노산의 혼합물을 제공함으로써 달성할 수 있다.
원하는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 완전한 조립 후, 레진으로부터 펩타이드를 자르는 표준 공정에 따라 레진을 처리할 수 있고 아미노산 측쇄의 기능기를 비블록(deblock)화할 수 있다. 자유로운 펩타이드를 HPLC로 정제하고, 예를 들어 아미노산 분석 또는 시퀀싱으로, 생화학적으로 특성을 확인할 수 있다. 펩타이드의 정제 및 특성 확인 방법은 이 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
이러한 화학적 공정으로 생산된 펩타이드의 품질은 조절 및 명확히 밝혀질 수 있고, 그 결과, IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 재현성, 면역원성 및 수율이 보장될 수 있다. 고상 펩타이드 합성을 통한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 제조의 구체적인 설명을 실시예 1에 나타낸다.
의도된 면역학적 활성의 유지를 허용하는 구조적 가변성의 범위는 저분자에 의한 특이적 약물 활성 또는 생물학적-유래 약물과 공동생산되는 고분자에서 발견되는 원하는 활성 및 원치않는 독성의 보유를 허용하는 구조적 가변성의 범위 보다 훨씬 더 수용적인 것으로 나타났다.
따라서, 의도적으로 설계된 또는 의도된 펩타이드와 유사한 크로마토그래피적 및 면역학적 특성을 갖는 삭제 서열 부산물의 혼합물로서 합성 공정의 오류로 불가피하게 생산된, 펩타이드 유사체는 종종 원하는 펩타이드의 정제된 제제만큼 효과적이다. 설계된 유사체 및 의도치 않은 유사체 혼합물은 이들 펩타이드를 적용한 최종 제품의 재현성 및 효능을 보장하기 위해 제조 공정 및 생산 평가 공정을 모니터하기 위한 식별 QC 공정이 개발되는 한 효과적이다.
IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 핵산 분자, 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는 재조합 DNA 기술을 사용하여 만들 수도 있다. 이와 같이, IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 면역학적 기능적 유사체를 암호화하는 핵산 분자 또한 본 개시내용의 일부로서 본 개시내용에 포함된다. 유사하게, 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터를 포함하는, 벡터뿐만 아니라 벡터를 함유하는 숙주 세포 또한 본 개시내용의 일부로서 본 개시내용에 포함된다.
다양한 예시적인 실시형태는 또한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 면역학적 기능적 유사체를 생산하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 방법은 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및/또는 이의 면역학적 기능적 유사체를 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 펩타이드 및/또는 유사체가 발현되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 더 긴 합성 펩타이드 면역원은 잘 알려진 재조합 DNA 기술로 합성할 수 있다. 이러한 기술은 잘 알려진 표준 설명서에 구체적인 프로토콜과 함께 제공된다. 본 개시내용의 펩타이드를 암호화하는 유전자를 구축하기 위해, 아미노산 서열을 역번역하여, 바람직하게는 유전자가 발현될 유기체에 최적화된 코돈을 갖는, 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 얻는다. 그 다음, 전형적으로 펩타이드 및, 필요시, 조절 요소를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 합성을 통해 합성 유전자를 만든다. 합성 유전자를 적합한 클로닝 벡터에 삽입하고 숙주 세포에 형질 주입한다. 이후 펩타이드를 선택된 발현 시스템 및 숙주에 적합한 조건 하에서 발현시킨다. 펩타이드를 정제하고 표준 방법으로 특성을 확인한다.
b. 면역자극성 복합체를 제조하는 방법
다양한 예시적인 실시형태는 또한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 CpG 올리고뉴클레오타이드(ODN) 분자를 포함하는 면역자극성 복합체를 생산하는 방법을 포함한다. 안정화된 면역자극성 복합체(ISC)는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 양이온성 부분 및 다가 음이온성 CpG ODN 분자에서 유래된다. 자가-조립 시스템은 전하의 정전기적 중화에 의해 구동된다. 음이온성 올리고머에 대한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 양이온성 부위의 몰 전하 비율의 화학양론은 결합의 정도를 결정한다. IL-6 펩타이드 면역원 작제물과 CpG ODN의 비-공유 정전기적 결합은 완전히 재현가능한 공정이다. 펩타이드/CpG ODN 면역자극성 복합체는 응집하여, 면역 시스템의 "전문적인" 항원 제시 세포(APC)로의 제시를 용이하게 하고 이에 따라 복합체의 면역원성을 강화한다. 제조 과정에서의 품질 관리를 위한 이러한 복합체의 특성 확인은 쉽게 이루어진다. 펩타이드/CpG ISC는 생체 내에서 잘 견딘다. CpG ODN 및 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 포함하는 이러한 신규 미립자 시스템은 CpG ODN의 사용과 관련된 일반화된 B 세포 유사분열촉진성의 장점을 얻으면서 균형잡힌 Th-1/Th-2 유형 반응을 촉진하기 위해 설계되었다.
개시된 약학적 조성물의 CpG ODN은 대립 전하의 정전기적 중화로 매개되는 공정에서 100% 면역원에 결합되어, 마이크론-크기 미립자의 형성을 초래한다. 미립자 형태는 CpG 아쥬반트의 통상적인 사용으로부터 유의적으로 감소된 CpG 용량을 허용하고, 불리한 선천성 면역 반응에 대한 가능성을 줄이고, 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 대체 면역원 처리 경로를 가능하게 한다. 결과적으로, 이러한 제형은 개념상 신규한 것이고 대체 메커니즘에 의한 면역 반응의 자극을 촉진하여 잠재적인 이점을 제공한다.
c. 약학적 조성물을 제조하는 방법
다양한 예시적인 실시형태는 또한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약학적 조성물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 미네랄 염과 함께 오일 에멀션 및 현탁물 중 물을 사용한다.
큰 집단에 사용하기 위한 약학적 조성물을 위해, 안정성이 고려해야 할 또 다른 중요한 요소가 된다. 많은 임상 시험에서 유중수 에멀션이 사용되었음에도 불구하고, 알륨은 이의 안정성으로 인해 제형에 사용하기 위한 주요 아쥬반트로 남아 있다. 따라서, 알륨 또는 이의 미네랄 염 인산 알루미늄(ADJUPHOS)은 임상 적용을 위한 제제의 아쥬반트로 자주 사용된다.
다른 아쥬반트 및 면역자극제는 3 디-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 3-DMP, 폴리글루탐산 또는 폴리라이신과 같은, 다량체 또는 단량체 아미노산을 포함한다. 이러한 아쥬반트는 무라밀 펩타이드(예를 들어, N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-아이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민(nor-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2' 다이팔미토일-sn-글리세롤-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸무라밀-L-Al-D-아이소글루-L-Ala-다이팔미톡시 프로필아미드(DTP-DPP) THERAMIDE™) 또는 다른 세균성 세포벽 성분과 같은 다른 특이적 면역자극제와 함께 또는 다른 특이적 면역자극제 없이 사용될 수 있다. 수중유 에멀션은, 미세유동화기를 사용하여 서브미크론 입자로 제형화한 5% Squalene, 0.5% TWEEN 80 및 0.5% Span 85를 함유하는(선택적으로 MTP-PE를 다양한 양으로 함유), MF59(Van Nest 등의 WO 90/14837 참조, 이의 전체가 참조에 의해 포함됨); 서브미크론 에멀션으로 미세유동화되거나 더 큰 입자 크기의 에멀션을 생성하기 위해 볼텍스한, 10% Squalene, 0.4% TWEEN 80, 5% 플루로닉-블록 중합체 L 121 및 thr-MDP를 함유하는, SAF; 및 2% 스쿠알렌, 0.2% TWEEN 80 및 모노포스포릴 지질 A(MPL), 트레할로오스 다이마이콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세균성 세포벽 성분, 바람직하게는 MPL+CWS(Detox™)을 함유하는 RIBI™ 아쥬반트 시스템(RAS)(Ribi ImmunoChem, 몬태나 주 해밀턴 소재)을 포함한다. 다른 아쥬반트는 완전 프로인트 아쥬반트(CFA), 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA) 및, 인터루킨(IL-1, IL-2 및 IL-12), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 종양 괴사 인자(TNF-α)와 같은, 사이토카인을 포함한다.
아쥬반트의 선택은 아쥬반트를 함유하는 면역원성 제형의 안정성, 투여 경로, 투여 일정, 면역화되는 종에 대한 아쥬반트의 효능에 따르며, 인간에서, 약학적으로 허용가능한 아쥬반트는 관련 규제 기관에 의해 인간 투여에 대해 승인되었거나 승인가능한 것이다. 예를 들어, 알륨, MPL 또는 불완전 프로인트 아쥬반트(Chang, et al, 1998, 이의 전체가 참조에 의해 포함됨) 단독 또는 선택적으로 이들의 모든 조합이 인간 투여에 적합하다.
조성물은, 동물 또는 인간 투여를 위한 약학적 조성물을 제형화하는데 일반적으로 사용되는 비히클로 정의되는, 약학적으로 허용가능한, 비-독성 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 희석제는 그 조합의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예시는 증류수, 생리학적 인산-완충 염수, 링거 용액, 덱스트로오스 용액 및 행크 용액이다. 또한, 약학적 조성물 또는 제형은 다른 담체, 아쥬반트 또는 비독성, 비치료적, 비면역원성 안정화제 및 기타 같은 종류의 것을 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 또한, 단백질, 키토산과 같은 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체(예를 들어, 라텍스 기능화 세파로오스, 아가로오스, 셀룰로오스 및 기타 같은 종류의 것), 다량체 아미노산, 아미노산 공중합체 및 지질 응집체(예를 들어, 오일 드롭렛 또는 리포솜)와 같은, 천천히 대사되는 고분자를 포함할 수 있다. 추가적으로, 이들 담체는 면역자극제(즉, 아쥬반트)로서 기능할 수 있다.
본 개시내용의 약학적 조성물은 적합한 전달 비히클을 더 포함할 수 있다. 적합한 전달 비히클은 바이러스, 세균, 생물분해 미세구, 극미립자, 나노입자, 리포솜, 콜라겐 미니펠릿 및 코클리에이트(cochleate)를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다.
d. 약학적 조성물을 사용하는 방법
본 개시내용은 또한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약학적 조성물을 사용하는 방법을 포함한다.
특정 실시형태에서, IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약학적 조성물은 IL-6의 조절장애의 영향을 받는 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 약학적 유효량의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 숙주에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 인간 IL-6 단백질(서열번호 1) 또는 다른 종으로부터의 IL-6 단백질(서열번호 2 내지 4)과 교차반응하는 고특이적 항체를 유도하기 위해 약학적 유효량의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 포함하는 약학적 조성물을 온혈 동물(예를 들어, 인간, 시노몰구스 마카크(Cynomolgus macaque), 생쥐)에 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약학적 조성물은 시험관 내 분석 및 생체 내 질환 모델에 나타난 바와 같이 IL-6 조절의 기능장애의 영향을 받는 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
e. 시험관 내 기능적 분석 및 생체 내 개념 입증 연구
IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 의해 면역화된 숙주에서 유도된 항체는 시험관 내 기능적 분석에 사용될 수 있다. 이러한 기능적 분석은 다음을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다:
(1) 재조합 단백질로서 IL-6 단백질(서열번호 1)에 대한 시험관 내 결합;
(2) IL-6Rα 시스-결합에 대한 IL-6의 시험관 내 저해;
(3) IL-6Rβ 트랜스-결합에 대한 IL-6/IL-6Rα의 시험관 내 저해(실시예 3);
(4) IL-6 유도 TF-1 증식의 시험관 내 저해(실시예 3 및 7);
(5) IL-6 유도 STAT3 인산화의 시험관 내 저해(실시예 3 및 7);
(6) 인간 U937 세포에 의한 IL-6 유도 MCP-1 생산의 시험관 내 저해(실시예 3 및 7);
(7) 쥐에서 콜라겐-유도 관절염(CIA)의 생체 내 저해;
(8) 쥐에서 골수로부터 순환으로의 호중구 방출의 생체 내 저해/감쇠;
(9) 다음으로 측정된 관절염 점수에 의해 쥐에서 나타난 바와 같은 관절염 증상의 생체 내 저해
(i) 염증 유도 간 분비 단백질;
(ii) 발목 관절 파괴;
(iii) 조직 TNF-α, IL-17 및 MCP의 생산;
(iv) 역 체중 손실;
(v) 뒷발 종창;
(vi) 감쇠된 호중구;
(vii) 감쇠된 혈소판 방출.
특정 실시형태
(1) 약 30개 이상의 아미노산을 갖는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물로서, 다음의 식으로 표시되는, IL-6 펩타이드 면역원 작제물:
(Th)m-(A)n-(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)-X
또는
(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)-(A)n-(Th)m-X
또는
(Th)m-(A)n-(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)-(A)n-(Th)m-X
여기서
Th는 이종 T 헬퍼 에피토프이고;
A는 이종 스페이서이고;
(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)은 IL-6(서열번호 1)의 IL-6R 결합 영역으로부터의 약 7 내지 약 42개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프 펩타이드이고;
X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이고;
m은 1 내지 약 4이고;
n은 0 내지 약 10이다.
(2) (1)에 있어서, 상기 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편은 서열번호 5 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
(3) (1) 또는 (2) 중 어느 하나에 있어서, 상기 Th 에피토프는 서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
(4) (1)에 있어서, 상기 펩타이드 면역원 작제물은 서열번호 107 내지 215로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
(5) IL-6 펩타이드 면역원 작제물로서,
a. 서열번호 1 내지 4의 IL-6 서열로부터의 약 7 내지 약 42개의 아미노산 잔기를 포함하는 B 세포 에피토프;
b. 서열번호 78 내지 106, 216 내지 226 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 T 헬퍼 에피토프; 및
c. 아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 77), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(서열번호 231) 및 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(서열번호 76) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 선택적 이종 스페이서를 포함하고,
상기 B 세포 에피토프는 직접적으로 또는 선택적 이종 스페이서를 통해 상기 T 헬퍼 에피토프에 공유결합으로 연결된, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
(6) (5)에 있어서, 상기 B 세포 에피토프는 서열번호 5 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
(7) (5)에 있어서, 상기 T 헬퍼 에피토프는 서열번호 78 내지 106으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
(8) (5)에 있어서, 상기 선택적 이종 스페이서는 (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 77), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(서열번호 231) 또는 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(서열번호 76)이고, 상기 Xaa는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 아스파르트산인, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
(9) (5)에 있어서, 상기 T 헬퍼 에피토프는 상기 B 세포 에피토프의 아미노 말단에 공유결합으로 연결된, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
(10) (5)에 있어서, 상기 T 헬퍼 에피토프는 상기 선택적 이종 스페이서를 통해 상기 B 세포 에피토프의 아미노 말단에 공유결합으로 연결된, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
(11) (1)에 따른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 포함하는 조성물.
(12) 약학적 조성물로서,
a. (1)에 따른 펩타이드 면역원 작제물; 및
b. 약학적으로 허용가능한 전달 비히클 및/또는 아쥬반트를 포함하는, 약학적 조성물.
(13) (12)에 있어서,
a. 상기 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편은 서열번호 5 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고;
b. 상기 Th 에피토프는 서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고;
c. 상기 이종 스페이서는 아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 77), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(서열번호 231) 및 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(서열번호 76) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고;
상기 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 안정화된 면역자극성 복합체를 형성하기 위해 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)와 혼합된, 약학적 조성물.
(14) (12)에 있어서,
a. 상기 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 서열번호 107 내지 215로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고;
상기 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 안정화된 면역자극성 복합체를 형성하기 위해 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)와 혼합된, 약학적 조성물.
(15) (12)에 따른 약학적 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물에서 IL-6에 대한 항체를 생성하는 방법.
(16) (1)따른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에서 IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
(17) (16)에 있어서, 상기 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 결합된 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
(1) 내지 (10) 중 어느 하나에 따른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 상기 B 세포 에피토프 펩타이드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
(18) (16)에 따른 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 조성물.
(19) (12)의 약학적 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물에서 IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환의 예방 및/또는 치료 방법.
실시예 1
IL-6 관련 펩타이드의 합성 및 이의 제형 제조
a. IL-6 관련 펩타이드의 합성
IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 개발 노력에 포함된 IL-6 관련 펩타이드를 합성하는 방법을 설명한다. 펩타이드를 혈청학적 분석, 실험실 파일럿 및 현장 연구에 유용한 소규모의 양으로, 뿐만 아니라 약학적 조성물의 산업적/상업적 생산에 유용한 대규모(킬로그램)의 양으로 합성하였다. 에피토프의 맵핑을 위해 그리고 효과적인 IL-6 표적화 요법적 조성물에 사용하기 위한 가장 최적의 펩타이드 면역원 작제물의 스크리닝 및 선택을 위해 대략 7 내지 70개의 아미노산 길이의 서열을 갖는 IL-6 관련 항원성 펩타이드의 큰 레퍼토리를 설계하였다.
다양한 혈청학적 분석에서 에피토프 맵핑을 위해 사용된 인간, 생쥐, 쥐 및 마카크 종의 대표적인 전장 IL-6(서열번호 1 내지 4), IL-6 펩타이드 단편 및 10량체 펩타이드가 표 1에 나열되어 있다(서열번호 5 내지 75).
표 2(서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226)에 나타낸 홍역 바이러스 융합 단백질(MVF), B형 간염 표면 항원 단백질(HBsAg), 펩타이드 인플루엔자, 클로스트리듐 테타니(Clostridum tetani) 및 엡스타인-바 바이러스(EBV)를 포함하는 병원성 단백질에서 유래된 신중하게 설계된 헬퍼 T 세포(Th) 에티토프에 합성적으로 연결하여 선택된 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드를 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 내에 형성하였다. 각각의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 면역원성을 강화하기 위해 Th 에피토프 펩타이드를 단일 서열(서열번호 78 내지 86 및 91 내지 106) 또는 조합 라이브러리(서열 87 내지 90)로 사용하였다.
수백개의 펩타이드 작제물로부터 선택된 대표적인 IL-6 펩타이드 면역원 작제물이 표 3에 나타나 있다(서열번호 107 내지 215).
항-IL-6 항체의 검출 및/또는 측정을 위한 면역원성 연구 또는 관련 혈청학적 시험을 위해 사용된 모든 펩타이드를 Applied BioSystems Model 430A, 431 및/또는 433의 펩타이드 합성기로 F-moc 화학을 사용하여 소규모로 합성하였다. 각 펩타이드를 N-말단의 F-moc 보호 및 삼기능성 아미노산의 측쇄 보호기와 함께 고상 지지체 상에서 독립적 합성으로 생산하였다. 완성된 펩타이드를 고상 지지체로부터 자르고 측쇄 보호기를 90% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 제거하였다. 정확한 아미노산 함량을 확보하기 위해 합성 펩타이드 제조물을 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-Of-Flight) 질량 분석으로 평가하였다. 또한 합성 프로파일 및 제조물의 농도를 확인하기 위해 각 합성 펩타이드를 역상 HPLC(RP-HPLC)로 평가하였다. 합성 과정의 엄격한 조절에도 불구하고(커플링 효능의 단계적 모니터링 포함), 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 조기 종결을 포함하는 연장 주기 중의 의도치 않은 사건으로 인해 펩타이드 유사체도 생성되었다. 따라서 합성된 제조물은 표적화 펩타이드와 함께 여러 펩타이드 유사체를 포함하였다.
이러한 의도치 않은 펩타이드 유사체의 포함에도 불구하고, 제조된 합성 펩타이드 제조물은 면역진단(항체 포획 항원으로서) 및 약학적 조성물(펩타이드 면역원으로서)을 포함하는 면역학적 적용에의 사용에 적합하였다. 전형적으로, 의도적으로 설계되었거나 합성 과정을 통해 부산물의 혼합물로 생성된, 이러한 펩타이드 유사체는, 이들 펩타이드를 적용한 최종 제품의 재현성 및 효능을 보장하기 위한 제조 공정 및 제품 평가 공정을 모니터하기 위한 식별 QC 절차가 개발되는 한, 대부분 원하는 펩타이드의 정제된 제조물만큼 효과적이다. 맞춤형 자동화 펩타이드 합성기 UBI2003 또는 기타 같은 종류의 합성기에서 15mmole 내지 150mmole 규모로 수백 그램 내지 킬로그램 양의 대규모 펩타이드 합성을 수행하였다.
임상 시험을 위한 최종 약학적 조성물에 사용된 활성 성분의 경우, IL-6 관련 펩타이드 면역원 작제물을 얕은 용출 구배 하에서 예비 RP-HPLC로 정제하고 순도 및 동일성을 위해 MALDI-TOF 질량 분석, 아미노산 분석 및 RP-HPLC로 특성을 확인하였다.
b. IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물의 제조
무기염과 함께 오일 에멀션에 그리고 현탁액에 물을 사용한 제형을 제조하였다. 큰 집단이 사용하도록 설계된 약학적 조성물의 경우, 안전성이 고려해야 할 또 다른 중요한 요소가 된다. 많은 임상 시험에서 약학적 조성물로서 유중수 에멀션이 인간에 사용되었다는 사실에도 불구하고, 알륨은 그 안전성으로 인해 약학적 조성물에 사용하기 위한 주요 아쥬반트로 남아 있다. 따라서 알륨 또는 이의 무기염 ADJUPHOS(인산 알루미늄)은 임상 적용을 위한 준비에서 아쥬반트로 자주 사용된다.
간단히 설명하면, 아래에 기술된 각각의 연구군에 명시된 제형은 일반적으로 모든 유형의 IL-6 설계 펩타이드 면역원 작제물을 함유하였다. 면역원의 B 에피토프 펩타이드를 대표하는 해당 IL-6 펩타이드에 상대적인 면역원성에 대해 기니피그에서 200종 이상의 설계 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 신중하게 평가하였다. 서열번호 1 내지 75를 포함하는 목록으로부터 선택된 펩타이드로 코팅된 플레이트를 사용한 ELISA 분석으로 다양한 상동성 펩타이드 사이에서 에피토프 맵핑 및 혈청학적 교차반응성을 분석하였다.
다양한 양의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 인간에 사용하기 위해 승인된 오일로서 Seppic MONTANIDE™ ISA 51과 함께 유중수 에멀션 내에 준비하거나, 명시된 무기염 ADJUPHOS(인산 알루미늄) 또는 ALHYDROGEL(알륨)과 혼합하였다. 전형적으로 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 약 20 내지 800㎍/㎖로 물에 용해하여 조성물을 제조하였고 유중수 에멀션(1:1 부피)에 MONTANIDE™ ISA 51과 함께 또는 무기염 ADJUPHOS 또는 ALHYDROGEL(알륨)(1:1 부피)과 함께 제형화하였다. 조성물을 약 30분 동안 상온으로 유지하고 면역화 전 약 10 내지 15초 동안 볼텍스로 혼합하였다. 근육 내 경로로, 0시(최초) 및 면역화 개시 3주 후에 투여(부스트)하고, 선택적으로 두 번째 부스트를 위해 5 또는 6wpi(week post initial immunization)에 투여하여, 동물을 2 내지 3회 용량의 특이적 조성물로 면역화하였다. 이후 제형에 존재하는 다양한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 면역원성을 평가하고 해당 혈청의 IL-6 단백질과의 교차반응성에 대해 평가하기 위해 면역화된 동물의 혈청을 선택된 B 에피토프 펩타이드(들)로 시험하였다. 해당 혈청의 기능적 특성에 대한 시험관 내 분석으로 기니피그에서의 초기 스크리닝에서 발견된 잠재적인 면역원성을 갖는 이들 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 추가 시험하였다. 이후 선택된 후보 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 면역화 프로토콜에 의해 지시된 바와 같은 명시된 기간 동안의 투여 요법을 위해 유중수 에멀션, 무기염 및 알륨-기반 제형에 준비하였다.
IL-6 조절장애의 영향을 받는 환자에서의 임상 시험으로 이어지는 연구용 신약 적용 의뢰를 위한 준비 과정에서 GLP 유도 사전 임상 연구의 면역원성, 지속성, 독성 및 효능 연구를 위한 최종 제형에 통합하기 전에 가장 유망한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물만을 추가로 광범위하게 평가하였다.
다음 실시예는 본 개시내용을 예시하기 위해 제공되는 것으로 본 개시내용의 범위를 제한하기 위해 사용되는 것이 아니다.
실시예 2
혈청학적 분석법 및 시약
IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형의 기능적 면역원성을 평가하기 위한 혈청학적 분석법 및 시약을 아래에 구체적으로 설명한다.
a. 항체 특이성 분석을 위한 IL-6 또는 IL-6 펩타이드 단편 기반 ELISA
다음의 실시예에 기술된 면역 혈청 시료를 평가하기 위한 ELISA 분석법을 개발하였고 아래에 설명하였다. 96-웰 플레이트의 웰을 각각, pH 9.5(달리 명시되지 않는 한)이며, 10mM NaHCO3 완충액에, 2㎍/㎖(달리 명시되지 않는 한)로 함유된, IL-6 또는 IL-6 단편 펩타이드(서열번호 1 내지 20, 72 내지 75) 100㎕로 37℃에서 1시간 동안 코팅하였다.
비-특이적 단백질 결합 부위를 차단하기 위해 IL-6 또는 IL-6 단편 펩타이드-코팅 웰을 1시간 동안 37℃에서 3중량% 젤라틴의 PBS 250㎕와 함께 항온처리하고, 0.05부피% TWEEN® 20 함유 PBS로 3회 세척하고 건조하였다. 분석할 혈청을 20부피% 일반 염소 혈청, 1중량% 젤라틴 및 0.05부피% TWEEN® 20 함유 PBS로 1:20(달리 명시되지 않는 한) 희석하였다. 희석된 시료(예를 들어, 혈청, 혈장)의 100마이크로리터(100㎕)를 각 웰에 첨가하였고 37℃에서 60분 동안 반응이 이루어지도록 하였다. 이후 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 웰을 0.05부피% TWEEN® 20 함유 PBS로 6회 세척하였다. 겨자무 페록시다아제(HRP)-접합 종(예를 들어, 기니피그 또는 쥐) 특이적 염소 다클론 항-IgG 항체 또는 단백질 A/G를 양성 웰에 형성된 항체/펩타이드 항원 복합체와 결합하는 표지된 추적자(tracer)로 사용하였다. 0.05부피% TWEEN® 20 및 1부피% 일반 염소 혈청 함유 PBS에 사전-적정된 최적 희석으로, HRP-표지된 검출 시약 100마이크로리터를 각 웰에 첨가하고 추가 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 0.05부피% TWEEN® 20 함유 PBS로 6회 세척하고 추가 15분 동안 시트르산나트륨 완충액에 0.04중량% 3',3',5',5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 및 0.12부피% 과산화수소를 함유하는 기질 혼합물 100㎕와 반응시켰다. 이 기질 혼합물을 착색된 생산물 형성에 의한 페록시다아제 표지를 검출하기 위해 사용하였다. 100㎕의 1.0M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시키고 450㎚(A450)에서 흡광도를 결정하였다. 다양한 펩타이드 제형을 투여한 면역화된 동물의 항체 역가를 결정하기 위해, 1:100 내지 1:10,000으로 10배 연속 희석한 혈청 또는 1:100 내지 1:4.19x108으로 4배 연속 희석한 혈청을 시험하였고, Log10으로 표시되는, 시험한 혈청의 역가를 컷오프 A450을 0.5로 설정한 A450의 선형 회귀 분석으로 계산하였다.
b. Th 펩타이드 기반 ELISA 시험에 의한 Th 펩타이드에 대한 항체 반응성 평가
96-웰 ELISA 플레이트의 웰을 유사한 ELISA 방법에서 각각 37℃에서 1시간 동안 2㎍/㎖(달리 명시되지 않는 한)의 Th 펩타이드 함유 pH 9.5(달리 명시되지 않는 한)의 10mM NaHCO3 완충액 100㎕로 코팅하고 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 다양한 IL-6 펩타이드 제형을 투여한 면역화된 동물의 항체 역가를 결정하기 위해, 1:100 내지 1:10,000으로 10배 연속 희석한 혈청을 시험하였고, Log10으로 표시되는, 시험한 혈청의 역가를 컷오프 A450을 0.5로 설정한 A450의 선형 회귀 분석으로 계산하였다.
c. B 세포 에피토프 클러스터 10-량체 펩타이드-기반 ELISA 시험을 통한 에피토프 맵핑으로 결정된 표적 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 정밀 특이성 분석
IL-6 펩타이드 면역원 작제물로 면역화된 숙주로부터의 항-IL-6 항체의 정밀 특이성을 B 세포 에피토프 클러스터 10량체 펩타이드-기반 ELISA 시험을 사용한 에피토프 맵핑으로 결정하였다. 간단히 설명하면, 96-웰 플레이트의 웰을 웰당 0.1㎖당 0.5㎍의 각각의 IL-6 10-량체 펩타이드(서열번호 21 내지 71)로 코팅하고 위에 기술된 항체 ELISA 방법의 단계에 따라 2반복으로 100㎕ 혈청 시료(PBS에서 1:100 희석)를 10-량체 플레이트 웰에서 항온처리하였다. 면역화된 숙주로부터의 항-IL-6 항체의 정밀 특이성 분석과 관련된 표적 B 세포 에피토프를 해당 IL-6 펩타이드 또는 특이성 확인을 위한 비-관련성 대조군 펩타이드로 시험하였다.
d. 면역원성 평가
동물 또는 인간 대상으로부터의 사전면역 및 면역 혈청 시료를 실험 프로토콜에 따라 수집하고 30분 동안 56℃로 가열하여 혈청 보체 인자를 비활성화하였다. 제형 투여 후, 혈액 시료를 프로토콜에 따라 수득하고 이들의 특이적 표적 부위(들)에 대한 면역원성을 해당 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드-기반 ELISA 시험으로 평가하였다. 연속 희석한 혈청을 시험하였고 양성 역가를 상호 희석의 Log10으로 표시하였다. 특정 제형의 면역원성을 표적 항원 내 원하는 에피토프 특이성 및 IL-6 단백질과의 높은 교차-반응성에 대해 고역가 항체 반응을 유도하는 이의 능력에 대해 평가하였고, 원하는 B 세포 반응의 강화를 제공하기 위해 "헬퍼 T 세포 에피토프"에 대한 무시할 수 있는 낮은 항체 반응성 유지를 적용하였다.
e. 쥐 혈청에서 C-반응성 단백질(CRP) 수준의 평가를 위한 면역분석
포획 항체로 다클론 토끼 항-쥐 CRP 항체(Sino Biological)을 사용하고 검출 항체로 바이오틴-표지 토끼 항 쥐 CRP 항체(Assaypro LLC)를 사용한 샌드위치 ELISA로 쥐 C-반응성 단백질(CRP)의 수준을 측정하였다. 간단하게 설명하면, 다클론 토끼 항-쥐 CRP 항체를 코팅 완충액(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.6) 중 50ng/웰로 96-웰 플레이트에 고정하고 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 코팅된 웰을 1시간 동안 상온에서 웰당 200㎕의 분석 희석제(1% BSA, 0.05% TWEEN-20 및 0.01% ProClin 300 함유 PBS)로 블로킹하였다. 플레이트를 웰당 200㎕의 세척 완충액(0.05% TWEEN-20 및 0.01% ProClin 300 함유 PBS)으로 3회 세척하였다. 분석 희석제에서 표준 곡선(2.5배 연속 희석으로 450 내지 1.84ng/㎖ 범위)을 생성하기 위해 재조합 쥐 CRP(Sino Biological)를 사용하였다. 100㎕의 희석 혈청(1:30,000) 및 표준물을 코팅된 웰에 첨가하였다. 항온처리는 2시간 동안 상온에서 수행하였다. 모든 웰을 흡인하고 웰당 200㎕의 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 포획된 CRP를 100㎕의 검출 항체 용액(100ng/㎖ 바이오틴-표지 토끼 항-쥐 CRP 항체 함유 분석 희석제)과 함께 1시간 동안 상온에서 항온처리하였다. 이후, 1시간 동안 스트렙타비딘 poly-HRP(1:10,000 희석, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여(100㎕/웰) 결합된 바이오틴-표지 항체를 검출하였다. 모든 웰을 흡인하고 웰당 200㎕의 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 최종적으로, 웰을 웰당 100㎕의 NeA-Blue TMB 기질(Clinical Science Products)로 전개시키고 웰당 100㎕의 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. VersaMax ELISA 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)로 색채적 흡광도를 측정하고 4 파라미터 로지스틱 커브-핏을 생성하기 위해 SoftMax Pro 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 표준 곡선을 만들고 모든 시험 시료의 CRP 농도 계산을 위해 사용하였다. Prism 소프트웨어(GraphPad Software)를 사용한 데이터 비교를 위해 스튜던트 T 검정을 사용하였다.
실시예 3
동물에서 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형에 의해 유도된 항체의 기능적 특성 평가
면역화된 동물의 면역 혈청 또는 정제된 항-IL-6 항체를 (1) IL-6 및 이의 수용체인 IL-6R(IL-6α 및 IL-6Rβ/gp130) 사이의 상호작용을 차단하는 능력, (2) RPMI 8226 세포에서 IL-6-유도 STAT3 인산화를 억제하는 능력, (3) IL-6-의존성 TF-1 세포 증식을 억제하는 능력 및 (4) U937 세포주에서 MCP-1(monocyte chemotractant protein-1) 생산을 저해하는 능력에 대하여 추가 시험하였다.
a. 세포
(1) RPMI 8226 세포를 American Type Culture Collection(버지니아 주 머내서스 소재)으로부터 입수하고 5% CO2 함유 가습 37℃ 배양기에서 10% 소태아혈청(FBS), 4.5g/ℓ L-글루타민, 피루브산나트륨 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI1640 배지에서 유지시켰다.
(2) TF-1 세포주는 5% CO2 함유 가습 37℃ 배양기에서 2mM 글루타민, 1% 피루브산나트륨(NaP), 2ng/㎖ 인간 GM-CSF(Human Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) 및 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI 1640 배지에서 유지시켰다.
(3) U937 세포주는 5% CO2 함유 가습 37℃ 배양기에서 2mM 글루타민, 1% NaP 및 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI 1640 배지에서 유지시켰다.
b. IL-6Rα 사슬에 대한 IL-6의 결합(시스-결합)
ELISA를 사용하여 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물로 사전 면역화된 기니피그의 모집한 면역 혈청으로부터 정제된 IgG 다클론 항체가 IL-6Rα에 대한 IL-6의 결합을 억제하는 상대적인 능력에 대해 조사하였다. 96-웰 플레이트의 웰을 각각 4㎍/㎖ 재조합 His-태깅 인간 IL-6Rα(GenScript) 함유 코팅 완충액(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.6) 50㎕로 코팅하고 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 코팅된 웰을 1시간 동안 상온에서 웰당 200㎕의 분석 희석제(1% BSA, 0.05% TWEEN-20 및 0.01% ProClin 300 함유 PBS)로 블로킹하였다. 플레이트를 웰당 200㎕의 세척 완충액(0.05% TWEEN-20 및 0.01% ProClin 300 함유 PBS)으로 3회 세척하였다. 10ng/㎖의 인간 IL-6(GenScript) 및 서로 다른 농도의 정제된 기니피그 IgG 다클론 항체의 혼합물 100㎕를 상온에서 1시간 동안 사전 항온처리하고 이후 코팅된 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 상온에서 항온처리를 수행하였다. 모든 웰을 흡인하고 웰당 200㎕의 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 포획된 IL-6를 1시간 동안 상온에서 웰당 100㎕의 바이오틴-표지 토끼 항-IL-6 항체(1:1,000 희석, R&D Systems)로 검출하였다. 이후, 1시간 동안 스트렙타비딘 poly-HRP(1:40,000 희석, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여(100㎕/웰) 결합된 바이오틴-표지 항체를 검출하였다. 모든 웰을 흡인하고 웰당 200㎕의 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 최종적으로, 웰을 웰당 100㎕의 OptEIA TMB 기질(BD Biosciences)로 전개시키고 웰당 100㎕의 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. VersaMax ELISA 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)로 색채적 흡광도를 측정하고 Prism 6 소프트웨어(GraphPad Software)에서 절반 최대 저해 농도(IC50)의 계산을 위해 4 파라미터 로지스틱 커브-핏을 사용하여 반응성 곡선을 생성하였다.
c. IL-6Rβ 사슬/gp130에 대한 IL-6/IL-6Rα 사슬 복합체의 결합(트랜스-결합)
96-웰 플레이트의 웰을 각각 300ng/㎖ 재조합 인간 gp130-Fc 키메라 단백질(R&D systems) 함유 코팅 완충액(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.6) 50㎕로 코팅하고 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 코팅된 웰을 1시간 동안 상온에서 웰당 200㎕의 분석 희석제(1% BSA, 0.05% TWEEN-20 및 0.01% ProClin 300 함유 PBS)로 블로킹하였다. 플레이트를 웰당 200㎕의 세척 완충액(0.05% TWEEN-20 및 0.01% ProClin 300 함유 PBS)으로 3회 세척하였다. 분석 전에, 1시간 동안 상온에서 His-태깅 인간 IL-6Rα(4㎍/㎖, GenScript)와 IL-6(100ng/㎖, GenScript)을 항온처리하여 1:20의 IL-6 대 sIL-6Rα 몰비로 sIL-6Rα/IL-6 복합체를 형성시켰다. 사전-형성된 복합체 용액 10㎕를 1시간 동안 상온에서 100㎕의 총 부피 중 서로 다른 농도의 정제된 기니피그 IgG 다클론 항체와 항온처리하고 이후 혼합물을 gp130-Fc-코팅 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 상온에서 항온처리를 수행하였다. 모든 웰을 흡인하고 웰당 200㎕의 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 포획된 IL-6을 1시간 동안 상온에서 웰당 100㎕의 바이오틴-표지 토끼 항-IL-6 항체(1:1,000 희석, R&D Systems)로 검출하였다. 이후, 1시간 동안 스트렙타비딘 poly-HRP(1:40,000 희석, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여(100㎕/웰) 결합된 바이오틴-표지 항체를 검출하였다. 모든 웰을 흡인하고 웰당 200㎕의 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 최종적으로, 웰을 웰당 100㎕의 OptEIA TMB 기질(BD Biosciences)로 전개시키고 웰당 100㎕의 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. VersaMax ELISA 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)로 색채적 흡광도를 측정하고 Prism 6 소프트웨어(GraphPad Software)에서 절반 최대 저해 농도(IC50)의 계산을 위해 4 파라미터 로지스틱 커브-핏을 사용하여 반응성 곡선을 생성하였다.
d. IL-6-의존성 TF-1 세포 증식 분석
인간 적백혈병 TF-1 세포는 인간 IL-6에 반응하여 증식할 수 있다. 72시간 동안 37℃, 5% CO2에서 웰당 2.5% FBS로 보충한 최종 부피 100㎕의 RPMI 1640 배지에 서로 다른 농도의 정제된 기니피그 IgG 다클론 항체의 존재 내에서 최종 농도 10ng/㎖의 인간 재조합 IL-6와 함께 5×103 세포를 동시 배양하여 분석을 수행하였다. 또한 항-IL-6 수용체 항체인 토실리주맙(Tocilizumab)을 연구 대조군으로 포함시켰다. 웰당 40㎕의 CellTiterGlo 시약(Promega)을 첨가하고 10분 동안 상온에서 반응 항온처리하여 세포 성장 및 생존력을 결정하였다. SpectraMax i3x 다중-모드 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)로 생성된 발광을 측정하고 Prism 6 소프트웨어(GraphPad Software)에서 절반 최대 저해 농도(IC50)의 계산을 위해 4 파라미터 로지스틱 커브-핏을 사용하여 반응성 곡선을 생성하였다.
e. IL-6-유도 STAT3 인산화 분석
구성적으로 활성 STAT3 인산화가 없는 인간 골수종 세포주 RPMI 8226은 STAT3의 활성을 위해 IL-6 노출을 필요로 한다. 정제된 IgG가 RPMI 8226 세포에서 IL-6-유도 STAT3 인산화를 저해할 수 있는지를 조사하기 위해, 30분 동안 37℃, 5% CO2에서 최종 부피 500㎕의 RMPI 8226 배양 배지에 100㎍/㎖ 농도의 기니피그 다클론 항체의 존재 내에서 최종 농도 10ng/㎖의 IL-6와 함께 8×105 세포를 동시 배양하였다. 또한 항-IL-6 수용체 항체인 토실리주맙을 연구 대조군으로 포함시켰다. PathScan p-Stat3 ELISA 키트(Cell Signaling)로 인산화된 STAT3 수준을 측정하였다. 간단하게 설명하면, 1% 포스파타아제 저해제 칵테일 3(Sigma- Aldrich)을 공급한 30㎕의 세포 용해 완충액(Cell Signaling)에 세포를 부유시키고 10분 동안 4℃에서 12,000 x g 원심분리로 세포 잔해를 제거하여 세포 용해물을 제조하였다. 공급업체의 설명 책자에 따라 10㎍의 깨끗한 세포 용해물을 사용하여 인산화된 STAT3의 함량을 측정하였다. VersaMax ELISA 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)로 색채적 흡광도를 측정하였다.
f. IL-6-유도 MCP-1 생산
U937은 여러 작용제에 의해 성숙한 대식세포로의 분화가 유도될 수 있는 전단핵구성 세포주이다. IL-6는 단핵구성 세포에서 MCP-1 생산을 촉진할 수 있다. IL-6 펩타이드 작제물 면역원에 의해 유도되는 항-IL-6 항체는 U937 세포주에서 IL-6-의존성 MCP-1 분비를 조절할 수 있다. 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 웰당 최종 부피 100㎕의 U937 배양 배지에서 8×103 세포, 최종 농도 10ng/㎖의 인간 재조합 IL-6 및 서로 다른 농도의 정제된 기니피그 IgG 다클론 항체를 배양하여 분석을 수행하였다. 또한 항-IL-6 수용체 항체인 토실리주맙을 연구 대조군으로 포함시켰다. 배양 배지를 10분 동안 300×g로 원심분리하여 깨끗한 상등액을 준비하고 -30℃에 보관하였다. 공급업체의 설명에 따라 100㎕의 희석된 상등액(1:100 희석)을 인간 MCP-1 정량 ELISA 키트(Thermo Fisher)에 적용하였다. VersaMax ELISA 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)로 색채적 흡광도를 측정하고 4 파라미터 로지스틱 커브-핏을 생성하기 위해 SoftMax Pro 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 표준 곡선을 만들고 모든 시험 시료의 MCP-1 농도 계산을 위해 사용하였다. Prism 6 소프트웨어(GraphPad Software)에서 절반 최대 저해 농도(IC50)의 계산을 위해 4 파라미터 로지스틱 커브-핏을 사용하여 반응성 곡선을 생성하였다.
실시예 4
안전성, 면역원성, 독성 및 효능 연구에 사용된 동물
기니피그:
성숙하고 실험 경험이 없는 성체 수컷 및 암컷 Duncan-Hartley 기니피그(300 내지 350g/BW)에서 면역원성 연구를 수행하였다. 군당 적어도 3마리의 기니피그를 실험에 사용하였다. UBI 후원 하에 계약된 동물 시설에서 승인된 IACUC 신청서에 따라 Duncan-Hartley 기니피그(8 내지 12주령; Covance Research Laboratories, 미국 펜실베니아 주 덴버 소재)를 포함하는 프로토콜을 수행하였다.
쥐:
콜라겐-유도 관절염(CIA)의 유도를 위해 Lewis 쥐를 사용하였다. 8 내지 12주령의 암컷 Lewis 쥐를 Biolasco로부터 입수하고 체중을 약 180g으로 맞추었다. 동물을 UBI 아시아 실험 동물 시설에 수용하고 일정한 온도(22℃), 습도(72%), 12시간 광/12시간 암 주기 하에서 1주 동안 적응시켰다. 쥐가 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 모든 프로토콜은 실험 동물 관리 원칙에 따랐다. 콜라겐 공격 주사를 피내 경로로 0 및 7일에 꼬리 기저부에 투여하였다. 프로토콜에서 지시한대로 혈액을 수집하였다. 35일까지 CIA 설치류 모델에서 관절염 중증도를 평가하기 위한 채점 시스템을 사용하여 주 3회 임상 관찰을 수행하였다. ELISA 분석으로 항-IL-6(쥐)에 대한 항체 역가를 시험하였다. CRP와 같은, 관련 염증 바이오마커 및 혈액 WBC 수에 대한 혈액학 분석을 수행하였다.
실시예 5
기니피그에서 IL-6 펩타이드 작제물의 면역원성 평가를 위한 제형
각 실험에 사용된 약학적 조성물 및 제형을 아래와 같이 보다 구체적으로 설명한다. 간단하게 설명하면, 각 연구군에 지정된 제형은 일반적으로 다른 유형의 스페이서(예를 들어, 펩타이드 작제물의 용해성을 강화하기 위한 εLys(εK) 또는 라이신-라이신-라이신(KKK))에 의해 연결된 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 부분과 홍역 바이러스 융합 단백질 및 B형 간염 표면 항원 유래 2세트의 인공 T 헬퍼 에피토프를 포함하는 혼합 헬퍼 T 세포 에피토프를 갖는 모든 유형의 설계 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하였다. IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드는 설계 펩타이드 작제물의 N- 또는 C-말단에 연결된다. 수백종의 설계 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 해당 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드에 상대적인 면역원성에 대해 기니피그에서 처음 평가하였다. 지정된 대로, IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 인간 백신 용도에 대해 승인된 오일로 Seppic MONTANIDE ISA 51을 사용하여 유중수 에멀션에서 다양한 양으로 준비하거나, 무기염(ADJUPHOS) 또는 ALHYDROGEL(알륨)을 사용하여 현탁액으로 준비하였다. 제형은 보통 물에 IL-6 펩타이드 작제물을 약 20 내지 800㎍/㎖로 용해시키고 MONTANIDE ISA 51을 사용하여 유중수 에멀션(1:1 부피)으로 제형화하거나 무기염(ADJUPHOS) 또는 ALHYDROGEL(알륨)으로 제형화(1:1 부피)하여 제조하였다. 제형은 약 30분 동안 상온에서 유지시켰고 면역화하기 전에 약 10 내지 15초 동안 볼텍스로 혼합하였다.
일부 동물은, 근육 내 경로로, 0시(처음) 및 첫 면역화 3주 후(부스트)에 투여, 선택적으로 두 번째 부스트를 위해 5 또는 6wpi에 투여하여, 2 내지 3회 용량의 특이적 제형으로 면역화하였다. 이후 이러한 면역화된 동물의 재조합 IL-6과의 교차-반응성에 대한 각각의 제형에 사용된 해당 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 면역원성에 대해 평가하였다. 기니피그에서의 첫 스크리닝에서 유력한 면역원성을 갖는 것으로 나타난 이러한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 면역화 프로토콜에 의해 지시된 바와 같이 지정된 기간 동안의 투약 요법에 대해 마카크에서 유중수 에멀션, 무기염 및 알륨-기반 제형에서 추가 시험하였다.
면역 내성 생쥐 또는 쥐를 돌파하는 능력에 대해 평가하기 위해 가장 유망한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물만을 대상으로 해당 생쥐 또는 쥐 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 사용하여 광범위하게 평가하였다. 내인성 IL-6에 대한 항-IL-6 항체 역가를 유도한 쥐에서, 특히 혈액 염증 인자를 억제하고 CIA 유도 Lewis 쥐 모델의 류마티스 관절염 임상 증상을 경감시키는 능력에 대해, 또는 시노몰구스 마카크에서 혈액 호중구증가증을 억제하는 능력에 대해 가장 좋은 면역원성을 갖는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 외래성 IL-6의 피하 주사로 촉발시켰다. 최적화된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 연구용 신약 적용 및 자가면역 류마티스 관절염을 앓는 환자에서의 임상 시험 의뢰를 위한 준비 과정에서 GLP 유도 면역원성, 지속성, 독성 및 효능 증명 연구를 위한 최종 제형에 통합시켰다.
실시예 6
IL-6 펩타이드 면역원 작제물이 통합된 다중-성분 제형의 자가면역 류마티스 관절염의 치료에 대한 설계 근거, 스크리닝, 식별, 기능적 특성 평가 및 최적화
사이토카인인 IL-6을 설계를 위한 표적 분자로 그리고 본 개시내용의 성분으로 선택하였다. 도 1은 인간(서열번호 227), 마카크(서열번호 228), 생쥐(서열번호 229) 및 쥐(서열번호 230) 종들의 IL-6 서열의 얼라인먼트를 나타낸다. 발명 및 개발 단계의 일반적인 요약이 IL-6 제형의 상업화(산업화)로 이어지는 개발 과정을 식별하는 흐름도와 함께 도 2에 기술되어 있다. 유쾌하고 불쾌한 놀라움과 함께, 각 단계의 구체적인 평가 및 분석이 궁극적으로 안전하고 효과적인 IL-6 제형의 상업화를 초래할 과거의 무수히 많은 실험으로 이어졌다.
a. 설계 역사
각 펩타이드 면역원 작제물 또는 면역요법 제품은 이의 특정 질환 메커니즘 및 개입에 필요한 표적 단백질(들)을 기반으로 하는 설계 초점 및 접근 방식이 필요하다. 설계를 모델화한 표적 IL-6 분자는 사이토카인이다. 연구에서 상업화까지의 과정은 전형적으로 달성하는데 10년 이상이 필요하다. 개입을 위한 기능적 부위(들)에 상관관계가 있는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드의 식별이 면역원 작제물 설계의 핵심이다. 유도된 항체의 기능적 특성을 평가하기 위해 다양한 제형 내 다양한 T 헬퍼 지원(운반 단백질 또는 적합한 T 헬퍼 펩타이드)을 포함하는 기니피그에서의 연속적인 파일럿 면역원성 연구를 수행한다. 광범위한 혈청학적 검증 시, IL-6 펩타이드 면역원 설계의 면역원성 및 방향을 추가 검증하기 위해 후보 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드 면역원 작제물을 표적 종 또는 비-인간 영장류에서 추가 시험한다. 이후 조합으로 사용되는 경우 펩타이드 작제물 사이의 각 상호작용과 관련된 기능적 특성에서의 미묘한 차이를 평가하기 위해 선택된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 다양한 혼합물로 제조한다. 추가 평가에 따라, 제형의 각 물리적 파라미터와 함께, 최종 펩타이드 작제물, 펩타이드 조성물 및 이의 제형이 확립되어 최종 제품 개발 과정으로 이어진다.
b. 자가면역 류마티스 관절염을 포함하여 IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환을 앓는 환자를 치료할 잠재력을 갖는 약학적 조성물을 위한 IL-6 유래 펩타이드 면역원 작제물의 설계 및 검증
약학적 조성물에 통합하기 위한 가장 유력한 펩타이드 작제물을 생성하기 위해, 인간 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드(서열번호 5 내지 19) 및 다양한 병원체로부터 유래된 무작위 T 헬퍼 에피토프 또는 인공적 T 헬퍼 에피토프(서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226)의 목록을 추가로 설계하고 기니피그에서의 첫 면역원성 연구를 위한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 107 내지 215)로 만들었다.
i) 설계를 위한 2개의 분자 내 루프를 포함하는 영역으로부터의 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드 서열 선택
추가 B 세포 에피토프 펩타이드 설계를 위해 2개의 분자 내 루프 사이에 위치하고 이를 포함하는 영역을, 시험된 많은 다른 영역 사이에서, 선택한다. 이 영역은 IL-6R의 α 및 β 또는 gp130 사슬 근처에 존재하는 것으로 발견되었다. IL-6가 IL-6R에 결합할 때, IL-6R은 세포내부적으로 활성화 신호를 전달하여 이후 주요 세포적 사건을 유발할 것이다. 2개의 루프는 표 1의 서열번호 1 또는 도 1의 서열번호 227 내에 나타난 C73 내지 C83(서열번호 5) 및 C44 내지 C50(서열번호 15)이고, 2개의 루프 사이에는 3 내지 4개의 알파-나선형 번들이 위치한다.
처음으로, IL-6 C73 내지 C83(서열번호 5)에 대한 생쥐 및 쥐에 대응하는 루프 구조(예를 들어, 서열번호 20 및 74)를 UBITh®3 T 헬퍼 펩타이드(서열번호 89) 및 링커(서열번호 77)와 연결된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 설계하기 위한 B 에피토프로 선택하였다. 400㎍/1㎖로 기니피그를 최초 면역화하고 100㎍/0.25㎖로 부스트(3, 6 및 9wpi)하기 위해 2종의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 ISA 51 및 CpG로 제형화하였다. 기니피그에서 면역원성을 시험하기 위해, 1:100 내지 1:10000으로 10배 연속 희석한 기니피그 면역 혈청과 함께 ELISA 분석을 사용하였다. ELISA 플레이트를 웰당 0.5㎍ 펩타이드의 인간 IL-6 펩타이드(서열번호 5), 생쥐 또는 쥐 펩타이드(서열번호 20 및 74)로 코팅하였다. Log10으로 표시되는, 시험한 혈청의 역가를 컷오프 A450을 0.5로 설정한 A450㎚의 선형 회귀 분석으로 계산하였다. ELISA 결과는 인간 IL-6 73 내지 83(서열번호 107) 및 생쥐 IL-6 72 내지 82(서열번호 146)로부터의 2종의 펩타이드 면역원 작제물이 이들 자신의 B 에피토프 펩타이드 인간 IL-6 C73 내지 C83(서열번호 5) 및 생쥐 B 에피토프 펩타이드(서열번호 20)에 대한 높은 면역원성 역가를 유도할 뿐만 아니라, 2종의 항혈청이 표 4에 나타난 바와 같이 인간 및 생쥐 IL-6로부터의 이들의 상동성 B 에피토프 펩타이드에 대한 중간의 교차-반응성을 갖는다는 것을 보여주었다. 연구는 설계된 2종의 펩타이드 면역원이 인간 IL-6 C73 내지 C83 펩타이드 및 이의 생쥐 대응 펩타이드에 대한 교차-반응성을 갖는 특이적 항체를 유도할 수 있음을 나타내었다. 추가로, IL-6 73 내지 83을 넘어 루프의 N-말단 부분까지 확장된 서열을 갖는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 124, 125, 126 및 132(환형) 및 133(비환형) 또한 높은 면역원성 및 중간의 교차-반응성을 나타내는 표 5A에 나타난 바와 같이 인간 IL-6 단백질과의 교차-반응성뿐만 아니라 면역원성에 대해 시험하였다.
이후, IL-6 C44 내지 C50의 다른 루프 구조를 설계하였다. IL-6 펩타이드 면역원을 제작하기 위해 C44 내지 C50 루프를 커버하는 다양한 크기의 B 세포 에피토프 펩타이드를 선택하였다. 새로운 인간 IL-6 면역원 작제물을 만들기 위해 UBITh®1 T 헬퍼 에피토프 펩타이드(서열번호 91) 및 짧은 링커 εK 또는 보다 긴 링커 KKK-εK(서열번호 77)를 사용하였다. 링커 서열과 함께 UBITh®1 T 헬퍼 에피토프 펩타이드를 표적 B 세포 에피토프 펩타이드에 대한 작제물의 N 또는 C 말단 또는 양쪽에 배치하였다. 3가지 다른 크기의 B 에피토프 IL-6 44 내지 50(서열번호 15), IL-6 42 내지 57(서열번호 12), IL-6 42 내지 72(서열번호 10)로부터의 7가지 인간 IL-6 면역원 작제물(서열번호 128, 129, 131 및 134 내지 137)을 설계하고 면역원성 연구를 위해 사용하였다. 군당 3마리의 기니피그로, 최초 면역화로서 400㎍/㎖의 용량 및 3, 6, 9wpi의 부스트 용량으로서 100㎍/㎖로 기니피그를 면역화하기 위해 각 펩타이드 면역원을 ISA51 및 CpG로 제형화하였다. 설계된 IL-6 펩타이드 면역원의 면역원성을 평가하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 표적 펩타이드로서 제공되는 플레이트 웰을 코팅하기 위해 IL-6 B 에피토프 펩타이드 및 인간 IL-6 단백질(서열번호 1)을 사용하였다. 기니피그 면역 혈청을 10배 연속 희석으로 1:100 내지 1:100000으로 희석하였다. Log10으로 표시되는, 시험한 혈청의 역가를 컷오프 A450을 0.5로 설정한 A450㎚의 선형 회귀 분석으로 계산하였다. 모든 8가지 펩타이드 면역원은 플레이트 웰에 코팅된 B 에피토프 펩타이드에 대해 강한 면역원성 역가를 유도하였다. ELISA 결과는 이들 7가지 펩타이드 면역원 작제물이 상응하는 IL-6 B 에피토프 펩타이드에 대해 높은 면역원성 역가를 유도할 뿐만 아니라, 이들 항혈청이 표 5B에 나타낸 인간 IL-6 단백질(서열번호 1)에 대한 중간의 교차-반응성을 갖는다는 것을 보여주었다.
또한, 서열번호 13 및 서열번호 9의 2가지 루프(즉, IL-6 61 내지 75 및 IL-6 52 내지 72) 사이로부터 얻은 서열을 갖는 2가지의 다른 B 세포 에피토프 페타이드를 설계하였다. 새로운 인간 IL-6 면역원 작제물(서열번호 127, 138 내지 145)을 만들기 위해 UBITh®1 T 헬퍼 에피토프 펩타이드(서열번호 91) 및 짧은 링커 εK 또는 보다 긴 링커 KKK-εK(서열번호 77)을 사용하였다. 링커 서열과 함께 UBITh®1 T 헬퍼 에피토프 펩타이드를 표적 B 세포 에피토프 펩타이드에 대한 작제물의 N 또는 C 말단에 배치하였다. 3가지 다른 크기의 B 에피토프 IL-6 52 내지 72(서열번호 9), IL-6 61 내지 75(서열번호 13), IL-6 61 내지 72(서열번호 14)로부터의 9가지 인간 IL-6 면역원 작제물(서열번호 127, 138 내지 145)을 설계하고 면역원성 연구를 위해 사용하였다. 군당 3마리의 기니피그로, 최초 면역화로서 400㎍/㎖의 용량 및 3, 6, 9wpi의 부스트 용량으로서 100㎍/㎖로 기니피그를 면역화하기 위해 각 펩타이드 면역원을 ISA51 및 CpG로 제형화하였다. 설계된 IL-6 펩타이드 면역원의 면역원성을 평가하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 표적 펩타이드로서 제공되는 플레이트 웰을 코팅하기 위해 IL-6 B 에피토프 펩타이드 및 인간 IL-6 단백질(서열번호 1)을 사용하였다. 기니피그 면역 혈청을 10배 연속 희석으로 1:100 내지 1:100000으로 희석하였다. Log10으로 표시되는, 시험한 혈청의 역가를 컷오프 A450을 0.5로 설정한 A450㎚의 선형 회귀 분석으로 계산하였다. 모든 9가지 펩타이드 면역원은 플레이트 웰에 코팅된 B 에피토프 펩타이드에 대해 강한 면역원성 역가를 유도하였다. ELISA 결과는 이들 8가지 펩타이드 면역원 작제물이 상응하는 IL-6 B 에피토프 펩타이드에 대해 높은 면역원성 역가를 유도할 뿐만 아니라, 이들 항혈청이 표 5C에 나타낸 인간 IL-6 단백질(서열번호 1)에 대한 중간의 교차-반응성을 갖는다는 것을 보여주었다.
상기 기술된 바와 같이 내인성 내부 루프를 포함하는 펩타이드 작제물에 더해, 인간 IL-6 상의 단클론 항체 올로키주맙(Olokizumab) 관련 에피토프에 대한 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드 또한 설계하였다. 올로키주맙은 IL-6/sIL-6R이 gp130에 결합하는 것을 저해하는 것으로 알려진다. IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 만들기 위해 올로키주맙 관련 구조적 에피토프 부분을 커버하는 2가지 다른 서열 크기의 펩타이드를 설계하였다. 새로운 인간 IL-6 면역원 작제물을 만들기 위해 UBITh®1 T 헬퍼 에피토프 펩타이드(서열번호 91) 및 보다 긴 링커 εK-KKK(서열번호 77)를 선택하였다. UBITh®1 T 헬퍼 에피토프 및 링커 서열을 B 에피토프 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단, 또는 양쪽에 배치하였다. 2가지 다른 크기의 B 에피토프(서열번호 18 및 19)로부터의 5가지 인간 IL-6 면역원 작제물(서열번호 112 내지 117)을 설계하고 면역원성 연구를 위해 사용하였다. N 및 C 말단 양쪽에 UBITh®1을 갖는 하나 이상의 IL-6 73 내지 83 작제물(서열번호 118)(6번 군)을 면역원성 및 면역 특이성 비교를 위한 대조군으로 제공하였다. 군당 3마리의 기니피그로, 최초 면역화로서 400㎍/㎖의 용량 및 3, 6, 9wpi의 부스트 용량으로서 100㎍/㎖로 기니피그를 면역화하기 위해 각 펩타이드 면역원을 ISA51 및 CpG로 제형화하였다. 이들 설계된 펩타이드 면역원의 면역원성을 평가하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 표적 펩타이드로서 제공되는 플레이트 웰을 코팅하기 위해 IL-6 C73 내지 C83(서열번호 5), IL-6 150 내지 162(서열번호 18) 및 IL-6 144 내지 166(서열번호 19)의 3가지 B 에피토프 펩타이드를 사용하였다. 기니피그 면역 혈청을 10배 연속 희석으로 1:100 내지 1:100000으로 희석하였다. Log10으로 표시되는, 시험한 혈청의 역가를 컷오프 A450을 0.5로 설정한 A450㎚의 선형 회귀 분석으로 계산하였다. 모든 6가지 펩타이드 면역원은 플레이트 웰에 코팅된 그들 자신의 B 에피토프 펩타이드에 대해 강한 면역원성 역가를 유도하였다. ELISA 데이터는, 표 5D에 나타난 바와 같이 5가지 면역원 작제물(서열번호 112 내지 117)이 아미노산 서열 144 내지 166으로부터의 같은 헬릭스-턴-헬릭스 구조를 공유하기 때문에, 이들 사이에 교차-반응성이 있음을 보여준다. 이들 작제물로부터의 면역 혈청의 인간 IL-6 단백질에 대한 교차-반응성은 표 5E에 나타나 있으며, 이는 다른 IL-6 유도 기능적 분석에서 시험될 IL-6 결합 개입에 대한 이 부위의 잠재력을 나타낸다.
ii) 선택된 IL-6 B 에피토프 펩타이드의 면역원성을 강화하기 위한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 설계에서 병원체 및 이의 함유물에서 유래된 이종 T 헬퍼 에피토프의 순위
B 세포 에피토프 면역원성을 강화하기 위해 생쥐, 쥐, 기니피그, 개코원숭이(baboon) 및 마카크 등 여러 종에서 상대적인 잠재력을 시험한 총 29종의 이종 Th 에피토프(서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226)를 표 2에 나열한다.
표 6에 나타난 바와 같이 각 이종 T 헬퍼 에피토프의 상대적인 효과를 순위화하기 위한 기니피그에서의 면역원성 연구를 위해 εK 스페이서를 통해 개별 무작위 T 헬퍼 에피토프와 연결된 IL-6 C73 내지 C83 B 세포 에피토프 펩타이드(서열번호 5)를 함유하는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 대표적인 연구를 수행하였다. 첫 면역화 6주 후(6wpi)에 얻은 결과를 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 순위화에 사용하였다. 모든 선택된 Th 에피토프가 IL-6 B-에피토프 펩타이드의 면역원성을 강화하는 능력을 갖지만, 가장 유력한 작제물은 서열번호 119의 작제물인 것으로 나타났다.
영장류를 포함하는 다른 종에서 각각의 그리고 모든 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 면역원성의 신중한 측정은 궁극적인 Th 펩타이드의 선택 및 최종 제형 개발에서의 성공을 보장할 것이다.
iii) 재조합 IL-6과의 항체 반응성에 대한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 면역원성 평가
도 3은 25종의 서로 다른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 107, 112 내지 114, 116 내지 118 및 124 내지 145)로 면역화한 기니피그에서 12주 동안의 항혈청 동역학을 나타낸다. 0, 3, 6, 8/9 및 12wpi에서 얻은 기니피그 항혈청을 4배 연속 희석으로 1:100 내지 1:4.19x108으로 희석하였다. ELISA 플레이트를 웰당 50ng의 인간 IL-6(GenScript)으로 코팅하였다. Log에서 최대 절반 효능 농도(EC50)를 얻기 위해 4 파라미터 로지스틱 커브-핏을 사용하여 시험 혈청의, Log(EC50)으로 표시되는, 역가를 계산하였다. 25종의 면역원 작제물 모두 천연 인간 IL-6에 대해 특정 정도의 교차-반응성을 유도할 수 있었고, 이는 이들에 의해 발생하는 항-IL-6 항체가 IL-6 활성을 중화시킬 가능성이 있음을 제시한다.
설계된 인간 IL-6 펩타이드 면역원이 서로 다른 동물 종으로부터 교차-반응성을 갖는 항체를 유도할지를 조사하기 위해, 데이터는 추가 동물 연구에서 유용한 정보를 제공할 수 있다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 IgG를 정제하기 위해 29종의 서로 다른 면역원 작제물(서열번호 107, 112 내지 114, 116 내지 118 및 124 내지 145)로 유도된 8- 또는 9-wpi 혈청을 선택하였다. 도 4는 서열번호 107, 116, 118 및 124 내지 133으로 유도된 정제된 다클론 기니피그 IgG가 인간, 원숭이 및 쥐의 재조합 IL-6 단백질(모두 GenScript에서 구입)과 교차-반응할 것임을 나타낸다. 이들 중, 서열번호 107, 118 및 124 내지 126의 펩타이드는 서로 다른 펩타이드 구성과 함께 IL-6 73 내지 83 루프를 함유하고, 서열번호 128, 129 및 131의 펩타이드는 IL-6 44 내지 50 루프를 함유하고, 서열번호 132는 두 루프를 모두 함유한다.
iv) IL-6 B 에피토프 펩타이드 설계에서 배제하기 위한 내인성/자가 Th 에피토프의 식별
알츠하이머병 백신을 위한 AN1792의 이전과 같이, 펩타이드 면역원 작제물 내 헬퍼 T 세포 에피토프(들) 구조 특징의 존재가 자가 T 세포의 활성화로 인해 부스터 면역화 시 원치않는 염증을 잠재적으로 유발할 수 있기 때문에 표적 단백질에 존재할 가능성이 있는 내인성/자가 Th 에피토프의 식별은 면역요법적 개입을 위한 조성물의 설계에 이점을 제공할 것이다. 표 7에 나타난 바와 같이, 유력한 유중수 에멀션 제형에도 불구하고, 유리 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드 IL-6 62 내지 83(서열번호 6), IL-6 58 내지 83(서열번호 7); IL-6 52 내지 83(서열번호 8), IL-6 52 내지 72(서열번호 9); 및 IL-6 42 내지 72(서열번호 10)는 면역원성 시험에서 깨끗한 배경을 제공하였으며, 이는 IL-6 제형에 사용하기 위한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 만드는데 사용되는 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드에 대한 후보로서 자격이 있음을 나타낸다.
v) IL-6 펩타이드 면역원 작제물로 유도되는 집중된 항체 반응은 IL-6 B 세포 에피토프만을 표적으로 한다.
각 운반 단백질에 대한 이러한 B 세포 에피토프 펩타이드의 화학적 결합에 의해 표적화된 B 세포 에피토프 펩타이드에 대한 면역 반응을 가능하게 하기 위해 사용된 모든 운반 단백질(예를 들어, 키홀 림펫 헤모사이아닌(KLH) 또는 디프테리아 톡소이드(DT) 및 파상풍 톡소이드(TT) 단백질과 같은 다른 운반 단백질)은 면역화된 숙주에서 90% 초과의 강화 운반 단백질에 대한 항체를 유도하고 10% 미만의 표적화 B 세포 에피토프에 대한 항체를 유도할 것임이 잘 알려져 있다. 따라서 본 개시내용의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 특이성을 평가하는 것은 흥미롭다. 스페이서 서열을 통해 이종 T 세포 에피토프 UBITh®1(서열번호 91)에 연결된 다양한 길이의 B 세포 에피토프를 갖는 8종의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(표 3의 서열번호 138 내지 145) 중 A 시리즈를 면역원성 평가를 위해 제조하였다. UBITh®1(B 에피토프 면역강화를 위해 사용된 T 헬퍼 펩타이드)을 플레이트에 코팅하고 기니피그 면역 혈청을 면역강화를 위해 사용된 UBITh® 1 펩타이드와의 교차-반응성을 위한 시험을 위해 사용하였다. IL-6 B 에피토프(들)에 대해 생성된 항체의 높은 역가에 의해 나타난 바와 같이 이들 작제물의 해당 표적화 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드에 대한 높은 면역원성에 반해 표 8에 나타난 바와 같이 면역 혈청의, 전부가 아닌 경우, 대부분이 UBITh®1 펩타이드에 대해 비-반응성인 것으로 나타났다.
요약하자면, 신중하게 선택된 T 헬퍼 에피토프에 연결된 표적 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드를 통합하는 단순한 면역원 설계는 해당 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드에 대해서만 표적으로 하는 집중적이고 깨끗한 면역 반응의 생성을 허용한다. 약학적 조성물 설계의 경우, 더 특이적인 면역 반응이 생성될수록, 조성물에 대한 더 높은 안전성 프로파일을 제공한다. 따라서 본 개시내용의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 그 표적에 대해 매우 특이적이며 매우 유력하다.
vi) IL-6 및 IL-6R 상호작용을 저해하는 항체에 대한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 면역원성 평가
IL-6은 이종삼량체성 IL-6R/gp130 복합체를 통해 신호를 보내며, 이의 결합은 다운스트림 신호전달의 활성화를 촉발한다. IL-6 또는 IL-6R 단독으로는 다운스트림 신호전달을 활성화할 수 없다. 후보 IL-6 펩타이드 면역원 작제물이 기니피그에서 항체를 유도할 수 있는지 그리고 IL-6 및 IL-6 수용체(IL-6R) 사이의 상호작용을 차단(Rose-John, et al, 2017)하기 위해 유도된 항체가 IL-6를 중화할 수 있는지를 조사하기 위해 추가 연구를 수행하였다.
(a) 실시예 3에 기술된 바와 같이 고상 항원 코팅으로서 해당 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드를 사용한 ELISA로 상대적인 면역원성을 평가하고; (b) 인간, 원숭이 및 설치류 종으로부터의 IL-6 단백질과 교차-반응하는 상대적인 능력을 평가하고; (a) 및 (b) 모두에 해당하는 경우, 정제된 항체가 IL-6 단백질을 중화할 수 있는지 그리고 이에 따라 IL-6와 IL-6Rα 사이의 상호작용(즉, 시스-신호전달) 또는 IL-6/IL-6Rα와 IL-6Rβ/또는 gp130 사이의 상호작용(즉, 트랜스-신호전달)을 저해하는지를 평가하기 위해 25종의 각 후보 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 107, 116, 118, 124 내지 145)로 면역화된 기니피그의 면역 혈청으로부터 정제된 기니피그 IgG를 ELISA 분석에 사용하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 신중하게 설계된 각 후보 IL-6 펩타이드 면역원 작제물로 면역화한 기니피그의 정제된 항체 모두 면역화 일정과 일치하는 시간 경과에 따라 유의한 항체 역가를 나타냈다. 또한, 도 4a 및 4B에 나타난 바와 같이 이들 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 사용한 면역화로부터 유래된 면역 혈청으로부터의 정제된 항체 모두 인간 IL-6 단백질과 높은 반응성을 나타냈고 원숭이(마카크) 및 설치류 IL-6 단백질과 중간의 교차-반응성을 나타냈다.
또한, 도 5a에 나타난 바와 같이, 각 후보 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(예를 들어 서열번호 107, 116, 118, 124, 132 내지 134 및 137을 갖는 것들)로 면역화한 기니피그의 면역 혈청으로부터 정제된 대표적인 항체는 용량 의존적 방식으로 경쟁적으로 시스-신호전달 방식을 통해 IL-6와 IL-6Rα 상호작용을 저해하였다.
도 5b에 나타난 바와 같이, 각 후보 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(예를 들어 서열번호 128, 129, 134 및 135를 갖는 것들)로 면역화한 기니피그의 면역 혈청으로부터 정제된 대표적인 항체는 용량 의존적 방식으로 경쟁적으로 트랜스-신호전달 방식을 통해 IL-6-IL-6Ra 복합체와 IL-6Rb/gp130의 상호작용을 저해하였다.
반면, 이전 기술의 B 세포 에피토프 펩타이드 서열(서열번호 11)을 포함하는 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 130)에서 유래된 면역 혈청으로부터 정제된 항체는 시스-경로도 트랜스-경로도 억제하지 못했다.
vii) 다양한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물로 유도된 면역 혈청(9wpi)에 의한 미세 특이성 분석을 위한 에피토프 맵핑
IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 IL-6 조성물의 설계는 IL-6R 결합 부위에 가까운 2개의 분자 내 루프 C44 내지 C50(서열번호 15) 및 C73 내지 C83(서열번호 5)를 포함하는 영역에 초점을 두었다. 이러한 구조-기반 설계는 면역원성 표적으로서 적어도 하나의 천연 분자 내 루프를 보유하는 것을 목표로 한다.
62 내지 83(서열번호 124), 58 내지 83(서열번호 125), 52 내지 83(서열번호 126), 52 내지 72(서열번호 127), 42 내지 72(B 세포 에피토프의 N-말단에 위치된 Th를 갖는 서열번호 128), 42 내지 72(B 세포 에피토프의 C-말단에 위치된 Th를 갖는 서열번호 129), 50 내지 67(서열번호 130) 및 73 내지 83(서열번호 107)의 8종의 대표 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드.
기본형 펩타이드 면역원을 형성하기 위해 B 세포 에피토프 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 UBITh®1(서열번호 91)과 연결된 B 세포 에피토프 펩타이드를 설계하기 위해 IL-6 62 내지 83(서열번호 6), 58 내지 83(서열번호 7), 52 내지 83(서열번호 8), 52 내지 72(서열번호 9), 42 내지 72(서열번호 10), 50 내지 67(서열번호 11) 및 73 내지 83(서열번호 5)를 사용하였다. 표 3에 나타난 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 124 내지 130, 107)을 만들기 위해 εK 링커 또는 εK-KKK(서열번호 77) 스페이서를 B 세포 및 Th 에피토프 사이에 사용하였다. 아미노산(aa) 42 내지 83, 42 내지 72 및 73 내지 83 내의 모든 B 세포 에피토프 펩타이드는 고리화에 의해 루프 구조가 만들어지는 C44 내지 C50 또는 C73 내지 C83으로 설계하였다.
IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 124 내지 130, 107)로 면역화한 기니피그에서 얻은 과면역 혈청의 항체 반응성을 평가하기 위해 플레이트 코팅에 C73 내지 C83(서열번호 5) 및 E42 내지 G72(서열번호 10)의 개별 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드를 사용한 ELISA 시험을 수행하였다. 이의 결과는 C73 내지 C83 루프 구조를 포함하는 서열번호 124, 125, 126 및 107의 작제물이 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드 C73 내지 C83(서열번호 5)에 대한 고역가 항체를 유도하고 C44 내지 C50 루프 구조를 포함하는 서열번호 127 내지 130의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물로 유도된 기니피그 항혈청이 B 세포 에피토프 펩타이드 E42 내지 C72(서열번호 10)와 항체 반응성을 가지며 C73 내지 C83 루프(서열번호 5)에 대한 교차반응성은 거의 또는 전혀 없다는 것을 보여주었고, 이는 면역원성의 고특이성, 즉 설계된 면역원 작제물이 IL-6 해당 B 세포 에피토프 도메인과 반응하는 특이적인 항체를 발생시킬 수 있음을 나타낸다(표 9).
표적 영역 내 특정 잔기에 대한 항체 결합 부위를 밝히기 위한 미세 에피토프 맵핑 연구(표 9)에서, IL-6의 32번 아미노산 내지 91번 아미노산 서열 영역을 커버하는 51종의 겹치는 10량체 펩타이드(서열번호 21 내지 71)를 합성하였다. 이러한 10량체 펩타이드를 고상 면역흡수제로서 96-웰 마이크로타이터 플레이트 웰 상에 개별적으로 코팅하였다. 모은 기니피그 항혈청을 표본 희석 완충액에 1:100으로 희석하고 이를 10량체 펩타이드가 2.0㎍/㎖로 코팅된 플레이트 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트 웰을 세척 완충액으로 세척한 후, 겨자무 페록시다아제-접합 r단백질 A/G를 첨가하고 30분 동안 항온처리하였다. PBS로 다시 세척한 후, ELISA 플레이트 리더로 450㎚에서 흡광도를 측정하기 위해 기질을 웰에 첨가하였고, 이때 시료를 2반복으로 분석하였다. 해당 IL-6 B 세포 에피토프 펩타이드 코팅 웰에 대한 IL-6 펩타이드 면역원 유도 면역 혈청의 결합은 최대 항체 결합 신호를 나타낸다.
미세 에피토프 맵핑 결과는 C73 내지 C83 루프 구조를 포함하는 서열번호 124, 125, 126 및 107의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물로부터 모집한 기니피그 혈청이 아미노산 35 내지 44(서열번호 24)를 갖는 펩타이드에 대한 높은 교차-반응성과 루프의 N-말단을 넘어 약간의 확장된 부분에 일부 중간 정도의 활성을 가지며 주로 아미노산 69 내지 78(서열번호 58)에서부터 아미노산 76 내지 85(서열번호 65)까지의 10량체 펩타이드의 클러스터에 대한 고역가 항체를 유도하였음을 보여준다.
놀랍게도, C44 내지 C50 루프 구조를 포함하는 서열번호 127 내지 129의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물로부터의 모집된 기니피그 혈청은 B 에피토프 펩타이드 41 내지 50(서열번호 30), 45 내지 54(서열번호 34), 57 내지 66(서열번호 46), 58 내지 67(서열번호 47)의 N-말단 부분까지 확장된 더 광범위한 산란된 항체 반응성을 갖는 IL-6 펩타이드 작제물 129와 함께 주로 C44 내지 C50 루프 외부의 아미노산 61 내지 70(서열번호 50) 내지 아미노산 67 내지 76(서열번호 56)의 10량체 펩타이드의 클러스터에 대한 고역가 항체를 유도하였다. IL-6 펩타이드 면역원 작제물 128 및 129에 의해 생성된 면역 혈청이 각 ELISA에 의한 경쟁적 IL-6/IL-6Rα 시스- 및 (IL-6/IL-6Rα 복합체)/IL-6Rβ 트랜스-경쟁적 결합 억제 연구에서 우선적 트랜스-억제를 보였음을 주목하는 것이 중요하다.
요약하면, UBITh®1 에피토프 펩타이드에 연결된 IL-6 내의 루프 구조 C44 내지 C50 및 C73 내지 C83로 표시되는 설계된 합성 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 중요한 의학적 의미를 가질 수 있는 IL-6/IL-6Rα 매개 시스- 또는 (IL-6/IL-6Rα 복합체)/IL-6Rβ(또는 Gp130) 매개-트랜스-경쟁적 결합 억제를 허용하는(도 5a 및 5B 참조) IL-6R 결합 영역에 대한 가까운 근접성을 갖는 10량체 펩타이드의 별개의 클러스터를 표적으로 하는 다클론 항체를 생성하는 강한 면역 반응을 유도하였다.
실시예 7
생체 외 방식에서 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형에 의해 유도되는 항체의 기능적 특성 평가
신중하게 선택된 각 후보 IL-6 면역원 작제물로 면역화한 기니피그의 면역 혈청으로부터 정제된 항체의 높은 면역원성 및 교차-반응성을 입증한 후, 이러한 면역 혈청으로부터 정제된 대표적인 IgG가 (a) IL-6-유도 STAT3 인산화를 억제할 수 있는지; (b) TF-1 세포주에서 세포 증식을 저해할 수 있는지; 및 (c) U937 세포에서 IL-6-유도 MCP-1 생산을 억제할 수 있는지에 대해, 모두 생체 외 방식에서 평가하기 위해 다음 연구를 설계하였다.
항-IL-6 항체에 의한 IL-6-유도 STAT3 인산화의 억제
IL-6 신호전달 경로는 초기 세포막에 IL-6/IL-6Ra/IL-6Rb(또는 Gp130) 복합체가 형성되고 세포질 내의 다운스트림 단백질 STAT3의 인산화로 이어지는 것과 관련된다. 8226 세포주가 인산화된 STAT3을 본질적으로 발현하지 않기 때문에 신중하게 선택된 후보 IL-6 펩타이드 면역원 작제물로 면역화한 기니피그의 면역 혈청에서 유래된 정제 항-IL-6 항체의 IL-6 유도 STAT3 인산화를 억제하는 능력을 평가하기 위해 RPMI 8226 세포주를 사용하였다.
먼저, 배양된 세포를 IL-6(10ng/㎖) 및 서로 다른 농도의 정제된 IgG로 동시에 처리하였다. 도 6에서와 같이, 항-IL-6R 단클론 항체, 대표적인 면역원(서열번호 128, 129, 134, 135 및 137)으로 유도된 항-IL-6 IgG는 100㎍/㎖의 IgG 농도에서 STAT3 인산화를 감소시킬 수 있었다. 선행기술의 B 에피토프 서열(서열번호 11)을 포함하는 펩타이드 작제물(서열번호 130)로 유도된 면역 혈청으로부터의 IgG는 STAT3 인산화를 저해하지 못했다.
TF-1 세포에서 IL-6-의존성 세포 증식의 억제
인간 적백혈병 TF-1 세포는 인간 IL-6에 반응하여 증식할 수 있다. 신중하게 선택된 후보 IL-6 펩타이드 작제물(서열번호 116, 118, 124 내지 129, 131 내지 145)로 면역화한 기니피그의 면역 혈청으로부터 정제된 IgG가 TF-1 세포주에서 IL-6 의존성 세포 증식을 억제할 수 있는지 조사하기 위해, 모든 TF-1 세포 배양에 IL-6(10ng/㎖) 및 정제된 기니피그 IgG를 동시에 처리하였다. IL-6을 처리하지 않은 TF-1 세포와 항체없이 IL-6만을 처리한 TF-1 세포를 대조군으로 설정하였다. 도 7a 및 7B에 나타난 바와 같이, TF-1 세포는 모든 다른 군보다 IL-6 만이 존재하는 경우에 더 증식하였고 이 경우 IL-6을 처리하지 않은 세포의 2배로 증식하였다. 대표적인 후보 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 116, 118, 124 내지 245, 127 내지 129, 131 내지 145)에 의해 유도된 항-IL-6 IgG 항체의 존재 내에서 TF-1 세포의 성장이 특정 정도로 억제될 수 있었다(도 7a 및 7B). 선행기술의 B 에피토프 서열(서열번호 11)을 포함하는 펩타이드 작제물(서열번호 130)에 의해 유도된 면역 혈청으로부터의 IgG는 IL-6 유도 세포 증식을 저해하지 못했다.
IL-6 유도 MCP-1 생산 억제
MCP-1은 급성 및 만성 염증 과정에서 중심적 역할을 한다. MCP-1은 질병의 병인에서 단핵구와 호염기구를 끌어들이는 주화성 인자이다. IL-6은 전단핵구 세포주 U937에서 MCP-1의 발현을 유도할 수 있다. IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 의해 기니피그에서 유도된 항-IL-6 항체가 U937 세포주에서 IL-6-의존성 MCP-1 분비를 억제할 수 있는지를 조사하기 위해, 모든 세포 배양군에 IL-6 사이토카인을 10ng/㎖의 농도로 처리하여 MCP-1 생산을 유도하였다. 후보 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 116, 118, 124 내지 134, 136, 138 내지 145)에 의해 유도된 기니피그의 면역 혈청으로부터 정제된 IgG의 대표적인 준비물을 서로 다른 농도로 시험군에 첨가하고 양성 대조군으로 토실리주맙도 포함시켰다. 항체 첨가없이 IL-6 만 존재하는 경우의 U937 세포 배양을 음성 대조군으로 설정하였다. 선행기술의 B 에피토프 서열(서열번호 11)을 포함하는 펩타이드 작제물(서열번호 130)로 유도된 면역 혈청으로부터의 IgG를 제외하고(도 8a 참조) 다양한 정도로 도 8a 및 8B에 나타난 바와 같이 대표적인 후보 펩타이드 작제물로 유도된 정제 IgG 항체를 처리한 군에서 용량 의존적 방식으로 MCP-1 생산의 항체 농도-의존적 억제가 관찰되었다.
상기 생체 외 기능적 연구는 이들 대표적인 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 IL-6 유도 염증 과정 및 병인 억제가 증명되었음을 나타내고, 이는 자가면역 류마티스 질환을 포함하여 IL-6 조절장애에 영향을 받는 질환의 치료에 대한 이들의 잠재력을 나타낸다.
실시예 8
LEWIS 쥐의 콜라겐 유도 관절염(CIA) 모델 상 예방적인 방식에서 쥐 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 후보의 평가
류마티스 관절염을 위한 쥐 콜라겐-유도 관절염(CIA) 모델에서 IL-6 펩타이드 면역원 작제물의 효과를 아래에 기술된 바와 같은 예방 연구에서 평가하였다.
인간 IL-6은 쥐 IL-6과 약 40% 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 쥐 IL-6 단백질 서열을 기반으로, 각각 IL-6 B 에피토프 펩타이드의 N 또는 C 말단에 연결된 링커로서 εK-KKK 링커(서열번호 77)와 T 헬퍼 에피토프(서열번호 89)로 강화된 B 세포 에피토프 펩타이드로 UBITh®3을 갖는 IL-6 73 내지 83 및 IL-6 144 내지 166의 인간 IL-6 B 세포 에피토프의 동족체로서 쥐 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 148 및 157)을 설계하였다.
본 연구를 위해 도 9에 간략히 나타낸 프로토콜과 함께 Lewis 쥐를 사용하였다. 아쥬반트만을 주사하는 위약군과 함께 3개의 군에 총 21마리의 쥐를 할당하였다. 실험군의 쥐에 ISA 51 및 CpG로 제형화한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 처음 및 부스트 면역화를 위해 45㎍/0.5㎖ 용량으로 주사하였다. 총 3회 용량을 -31, -10 및 4일에 투여하였다. 세 번째 투여 4일 전(0일) 및 세 번째 투여 3일 후(7일) 부스트로 모든 쥐의 꼬리 밑부분에 소 II형 콜라겐/IFA 에멀션을 피내 경로로 주사(쥐당 100㎕ 내 100㎍)하였다. -31, -10, 0, 7, 14, 21, 26, 28 및 35일에 쥐로부터 채혈하였다. 쥐 재조합 IL-6 단백질에 대한 면역원성 역가를 측정하기 위해 ELISA 분석을 사용하였다.
ELISA 결과는 -31일의 면역화 이전 각 군에서 검출가능한 항체 역가가 관찰되지 않았음을 보여준다. 3회의 면역화 후, 위약-처리 쥐 중 아무것도 항-쥐 재조합 IL-6에 대한 검출가능한 항체 역가를 보이지 않았다. IL-6 73 내지 83 B 세포 에피토프를 표적으로 하는 펩타이드 면역원(서열번호 148)은 CIA 기간 동안 약 3.0의 Log(EC50)으로 다른 군(서열번호 157)에 비해 더 유력한 항-IL-6 항체 역가를 유도할 수 있었다(도 10).
쥐 CIA 모델 상 예방적 방식에서 평가된 IL-6 면역요법의 효과
쥐 IL-6 펩타이드 작제물(서열번호 148 또는 157 포함)로 면역화하고 CIA 관절염을 유도한 쥐의 관절염에 대한 임상적 징후 및 증상을 신중하게 조사하였다. 콜라겐(소 II형 콜라겐, Chondrex Inc.)을 주사한 쥐에서 CIA 유도 관절염이 빠르게 진행되었다. 콜라겐을 주사 약 2주 후 뒷발에서 각각 0 내지 4 등급으로 등급화된(0 내지 16의 총 등급 범위), 홍반 및 관절 종창을 포함하는, 급성 관절염의 임상적 염증 징후가 발견되었다. 각 군에서 CIA 주사 약 3주 후에 최대 관절염 중증도 및 가장 심각한 발 종창이 발견되었다(도 11 및 12). 관절염 중증도로 서로 다른 IL-6 면역원 작제물에서의 치료 효능을 평가하였다. 다른 시험한 면역원 작제물(서열번호 157)에 비해 서열번호 148로 면역화한 군에서 더 낮은 완화된 관절염 중증도 및 덜한 발 종창을 나타냈고 이러한 생체 내 면역요법 연구 동안 위약군과 비교하여 통계적으로 유의적인 차이를 나타냈다(도 11 및 12 및 표 10 및 11).
쥐 CIA 도전 연구 동안 IL-6 면역원이 골수에서 순환계로의 호중구 방출을 약화시킬 수 있는지를 관찰하였고, 이의 결과는 골수로부터 방출된 호중구의 수가 0일에서부터 점차 증가하였고 14일에 정점에 도달하였음을 보여주었다. 쥐 IL-6 면역원(서열번호 148)은 골수로부터 순환계로의 호중구 방출을 효과적으로 약화시켰다(도 13 및 표 12). 이는 설계된 IL-6 면역원 작제물 모두 염증 과정의 감소에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
본 연구 결과는 IL-6 쥐 B 세포 에피토프 펩타이드 IL-6 72 내지 82가 IL-6 분자에 대해 유도된 다클론 항체가 혈액 순환 사이토카인 IL-6을 중화하여 이의 신호 전달을 차단/억제하고 이에 따라 임상적 염증성 병리학적 과정을 감소시키는 예방적 방식에서의 IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환의 치료를 위한 B 세포 에피토프 펩타이드로서 IL-6 73 내지 83을 포함하는 인간 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 대한 좋은 후보임을 나타낸다.
CIA 쥐에 쥐 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 또는 아쥬반트만을 근육내 경로로 3회 주사하였다. 동물은 45㎍/0.5㎖ 용량의 후보 쥐 IL-6 제형에 대해 전반적으로 좋은 내성을 가졌다. 서열번호 148을 포함하는 후보 쥐 IL-6 펩타이드 면역원은 서열번호 157을 포함하는 것에 비해 항체 반응 및 관절염 중증도 약화에서 더 높은 효능을 나타냈다.
실시예 9
LEWIS 쥐의 CIA 모델에서 입증된 바와 같은 류마티스 관절염의 치료에 대한 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형의 효과
Lewis 쥐 콜라겐 유도 관절염(CIA) 모델에서 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 대한 개념 증명(POC) 연구
IL-6 면역원 작제물(서열번호 148)의 효능을 확인하기 위해, Lewis 쥐 CIA 모델에서 POC 연구를 수행하였으며, 도 14에 나타난 바와 같이 2개의 서로 다른 아쥬반트 제형을 본 효능 연구에서 평가하였다. 7마리의 동물을 각 2개의 처리군에 할당하고 6마리의 동물을 위약군에 할당하였다. 2개 처리군의 동물에 ISA 51 만으로 또는 ISA51/CpG로 제형화한 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 148)을 -7, 7, 14, 21 및 28일에 최초 및 부스트로 45㎍/0.5㎖/용량으로 주사하였다. 위약군은 처리군과 같은 주사 시점으로 펩타이드 면역원 작제물 없이 아쥬반트 비히클만을 주사하였다. 관절염을 유도하기 위해 모든 군에 소 II형 콜라겐/IFA 에멀션을 0 및 7일에 피내 경로로 꼬리 밑부분에 주사(쥐당 100㎕ 내 100㎍)하였다. 본 연구는 35일에 종료하였다.
면역화한 쥐 혈청으로부터의 쥐 IL-6 재조합 단백질에 대한 면역원성 역가를 ELISA로 평가하였다. 이의 결과 서로 다른 아쥬반트로 제형화한 같은 IL-6 펩타이드 면역원 작제물로 처리한 처리군 둘 다 면역화 이후 항체 역가가 꾸준히 증가하여 쥐 IL-6에 대해 높은 항체 역가를 생성한 것으로 나타났다. 두 처리군 모두 21일에 역가가 3 Log(EC50)의 수준으로 정점에 달했고 35일에 연구를 종료할 때까지 안정한 상태를 유지하였다(도 15). 이러한 결과는 이러한 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 148)이 상당히 면역원성이고 항체 생산이 효과적으로 강화된 두 아쥬반트 제형과 함께 면역 내성을 파괴하여 쥐 IL-6에 대한 특이적인 다클론 항체를 유도할 수 있음을 확인시켜주었다.
CIA로 관절염을 유도한 Lewis 쥐에서 CIA 관절염 유도와 함께 IL-6 면역원 작제물로 면역화하기 전 및 후 처리군 및 위약군 사이의 임상적인 평가를 수행하였다. 연구 과정 동안 관절염 중증도의 임상적 징후를 기반으로 관절염 중증도가 각 발에 따라 0 내지 4의 등급으로 등급화(총 0 내지 16 범위의 점수)되었다. 이의 결과 콜라겐이 주사된 이후 쥐에서 CIA 유도 관절염이 빠르게 발전된 것으로 나타났다. 아쥬반트 위약군은 14일에 9점의 최대 관절염 점수에 도달하였다. 반면, 두 처리군은 14일의 같은 시점에서 모두 점수가 6 보다 낮아 관절염 중증도가 많이 순화된 것으로 나타났고 이는 통계적으로 유의하였다(p<0.01). 이후 연구 종결까지 총 9번의 평가와 함께 14 내지 35일에 2 내지 3일 마다 모니터된 모든 군에서 감소된 관절염 점수가 관찰되었다. 각 평가 결과 두 처리군은 14 내지 35일에 위약군보다 훨씬 낮은 관절염 중증도 점수를 나타내었으며 이는 통계적 유의성이 있었다(대부분 p<0.01 또는 P<0.001). 35일에 연구가 끝날 무렵, 도 16에 나타난 바와 같이 위약군의 점수는 약 6이었고, 두 처리군의 점수는 약 3이었다. 뒷발에서 CIA의 임상적 징후도 평가하였는데, 이의 결과 관절 염증의 결과로 인해 14일에 모든 관절염성 쥐에서 뒷발 부피가 증가한 것으로 나타났다. 하지만 각각 14, 21, 28 및 35일에 두 처리군이 위약군보다 훨씬 낮은 뒷발 부피를 나타내는 유사한 결과가 관찰되었으며, 이는 통계적 유의성이 있었다(대부분 p<0.01 내지 P<0.001). 35일에 연구가 끝날 무렵, 도 16에 나타난 바와 같이 이들 두 처리군의 뒷발 부피는 정상 부피에 가까운 반면, 위약군은 여전히 높은 부피를 유지하였다. 이러한 모든 발견은 두 아쥬반트가 본 연구에서 유사한 임상적 효능을 나타내며, ISA51 + CpG 조합이 ISA51에 비해 약간 더 좋다는 것을 나타낸다.
혈청 IL-6 수준은 관절 관련 정도 및 중증도와 양의 상관관계가 있었고; C-반응성 단백질(CRP)과 같은 일부 다른 다운스트림 혈청 염증 바이오마커 또한 염증 중등도를 평가하기 위한 지표이다. ELISA를 사용하여 혈청 CRP의 수준을 결정하였다. 위약군(아쥬반트 비히클-처리 CIA)의 쥐는 두 처리군과 비교하여 유의적으로 높은 혈청 CRP 수준(p<0.05)을 나타냈다(도 17). 면역원(서열번호 148) 처리 CIA 쥐에서 혈청 CRP의 평균값은 정상값에 가까웠고, 21일에서 위약군에 비해 유의적으로 낮았다.
조직병리학적 시험 연구를 수행하여 발목 관절의 조직학적 파괴 변화 상에서 IL-6 펩타이드 면역원의 효과를 평가하였다. 35일에 CIA 쥐(처리군당 7마리, 위약군 6마리)를 희생시키고, 발목 관절 조직을 얻어 고정, 탈회(decalcification) 및 파라핀 포매하였다. 조직 절편을 준비하고 H&E로 염색하였다. 조직병리학적 시험 결과는 도 18에 나타나 있으며 여기서 정상 대조군은 건강한 관절 공간 및 정상 조직을 나타낸다. 반면, 위약군은, 두드러지는 활액 및 관절주위의 염증, 활액 과형성 및 뼈 침식의 특징을 나타내는, 전형적인 관절염 특징을 나타내었다. 서열번호 148로 면역화한 CIA 쥐의 관절 병리학적 특징은 완화된 세포 침윤, 더 경미한 활액 과형성 및 뼈 침식과 함께 훨씬 완화된 염증을 나타내었고, 이는 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 148)에 의해 발목 관절 파괴가 완화되었음을 나타낸다. 도 18 또한 3개의 서로 다른 군의 병리학적 점수 비교를 나타내며, 여기서 변형된 Mankin 채점 시스템을 사용하여 관절 구조에서 0 내지 6으로, 세포 형태에서 0 내지 3으로, 사프라닌 O 염색에서 0 내지 4로, 활액성 염증 및 과형성에서 0 내지 4로 등급화하는 관절 연골 평가를 수행하였다(Clin Immunol. 124:244-257). 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 148) 처리군은 6점으로 11점의 위약군에 비교하여 유의적으로 감소한 병리학적 점수를 나타냈다.
염증성 사이토카인은 RA 병인에서 중요한 역할을 하는 것으로 제안된다. 면역조직화학적 염색 방법을 적용하여 염증이 발생한 발목 조직을 평가하였다. 간단히 설명하면, 포르말린-고정 파라핀 포매 조직 절편을 자일렌에서 탈파라핀화하고, 감소한 농도의 에탄올에 담그고, 물에서 재수화하였다. 마이크로파-강화 항원 복구(antigen retrieval)를 위해 모든 절편을 처리하였다. 항원 복구 시트르산염 용액(Scytek)에 담긴 슬라이드가 올려진 절편을 마이크로파 오븐에서 최대 출력으로 끓을 때까지 가열하고 30분 동안 상온으로 식혔다. 10분 동안 3% 과산화수소/PBS로 내인성 페록시다아제 활성을 차단하였다. 절편을 1시간 동안 상온에서 Ultravision Protein Block(ThermoFisher)과 함께 사전항온처리하였다. 이후 절편을 4℃에서 밤새도록 1차 토끼 항-쥐 IL-17(Abbiotec, PBST에 1:100 희석), 항-쥐 TNF-α(Abeam, PBST에 1:100 희석) 또는 항-쥐 MCP-1(Abeam, PBST에 1:200 희석)과 함께 항온처리하고, TBST(Scytek)로 세척하고, DAB 키트(GBI Labs)를 사용하여 Polink-2 Plus HRP Rabbit으로 전개하였다. 절편을 헤마톡실린(Leica Biosystems)으로 대비염색하고, 탈수화하고, Surgipath Micromount 마운팅 배지(Leica Biosystems)에 마운트하였다. 도 19는 위약군에서 조직 TNF-α, IL-17 및 MCP-1이 실질적으로 증가하였음을 보여준다. 그러나, 이들 사이토카인의 생산은 IL-6 면역원-처리 CIA 쥐에서 크게 억제되었다.
본 연구는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 면역화가 염증성 관절염의 발생률을 극적으로 줄이고 뼈 및 연골을 파괴로부터 보호한다는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 류마티스 관절염 및 다른 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 생체 내 IL-6 펩타이드 면역원 면역화의 임상적 적용을 강력하게 뒷받침한다.
CIA 모델에서 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도되는 면역 반응 상 투여 및 아쥬반트의 효과 평가
CIA 쥐에서의 POC 연구는 설계된 펩타이드 면역원 작제물이 류마티스 관절염 및 다른 자가면역 질환에서 잠재적인 면역요법적 적용과 관련이 있는 IL-6 유도 병인에 대한 높은 면역원성 및 치료적 효능을 갖는다는 것을 입증하였다. 다음 연구는 CIA Lewis 쥐에서 펩타이드 면역원 작제물의 최적화 및 아쥬반트의 선택, 그리고 용량 결정에 초점을 둔다.
각각 같은 펩타이드 면역원(서열번호 148) 및 CpG와 제형화한 서로 다른 아쥬반트로서의 MONTANIDE ISA 51 및 ADJU-PHOS를 쥐 CIA 면역화 연구에서 평가하였다. 2가지의 서로 다른 아쥬반트를 위해 총 10개 군으로, 각각 5개의 군에 할당된 5마리의 쥐에 2가지의 아쥬반트 제형 중 하나를 투여하였다. -7, 7, 14, 21 및 28일에 최초 및 부스트로 i.m. 경로를 통해 처리군의 모든 동물에 0.5㎖ 내 5, 15, 45, 150㎍의 서로 다른 용량으로 주사하고 35일까지 임상적인 관찰을 수행하였다. 펩타이드 면역원을 처리하지 않는 2개의 서로 다른 아쥬반트 위약군은 제형에 아쥬반트 비히클만을 포함하는 주사를 투여하였다. 다음 연구에서 항-IL-6 역가, 체중, 뒷발 종창 검사, 관절염 중증도 점수, 혈액 호중구, 혈소판수 및 간 기능을 모두 평가하였다.
항-IL-6 역가는 플레이트 웰에 코팅된 쥐 IL-6 재조합 단백질에 대한 ELISA로 측정하였다. 이의 결과 ELISA를 통해 2개의 서로 다른 아쥬반트 비히클을 주사한 2개의 위약군 모두 검출가능한 항-IL-6 항체 역가가 발견되지 않은 반면, 아쥬반트 제형과 함께 IL-6 면역원 작제물(서열번호 148)로 면역화한 모든 처리군은 쥐 IL-6에 대한 항체를 생성한 것으로 나타났다. 일반적으로 말하면, 특히 ISA 51 제형으로 처리한 군에서, 용량 의존적 방식의 결과가 나타났다(도 20). ISA 51 제형은 면역화된 쥐에서 ADJUPHOS 제형에 비해 더 높은, 각각의 모든 용량에서 3을 넘는 Log10 값의 면역원성을 갖는, 면역 반응을 유도하였다.
35일의 연구 과정 동안 7일 마다 체중을 모니터하였다. 도 21에, 면역화한 쥐의 체중 변화 양상이, 정상 쥐와 비교하여, 나타나 있고, 여기서 검사한 CIA 쥐의 체중 손실이 14일에 시작되어, 21일에 가장 낮은 점에 도달하였고, 이후 각 군의 체중이 점차 증가하였다. 연구의 마지막에(35일) 모든 CIA 쥐는, 정상 대조군에 비교하여, 여전히 약 10%의 체중 손실을 나타냈다. 이 체중 변화 데이터 또한 용량-의존적 방식을 나타냈고, 더 높은 용량 투여군에서 더 낮은 체중 손실이 관찰되었다. 150㎍ 용량 투여군은 사용된 아쥬반트에 상관없이 다른 용량 투여군에 비해 더 많은 체중을 얻었다. 비교적으로, ADJUPHOS와 함께 150㎍으로 투여한 군이 28 및 35일에서 임의의 다른 군에 비해 더 많은, 200g 수준을 넘는, 체중을 얻었다(표 13).
발 부피 변화를 정량하여 쥐에서의 CIA 유도 염증 및 파괴의 임상적 중등도 또한 평가하였다. 육안 관찰 결과 ISA 51 또는 ADJUPHOS로 제형화된 IL-6 면역원 작제물(서열번호 148)이 쥐 모델에서 CIA 발달을 막을 수 있는 것으로 나타났다. 콜라겐 주사 후 연구 기간 동안 쥐에서 발의 종창 및 발적의 급성 임상적 징후를 기록하였다. 도 22 및 표 14에 나타난 바와 같이, 7 내지 21일에 모든 면역화된 쥐에서 발 종창이 증가하고 이후 염증이 감소함에 따라 점차 회복되는 것으로 나타났다. 24일에 위약군은 육안 관찰에서 정상군에 비교하여 유의적인 종창 및 발적 변화를 나타냈다(도 23). 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 148)은 용량-의존적 방식으로 발의 발적 및 종창을 감소시켰다. 정량적 분석에 따른 최대 염증 감소는 24일에 150㎍ 투여군에서 나타났다. ADJU-PHOS가 MONTANIDE ISA 51에 비해 약간 더 좋았다.
홍반 및 종창 징후의 염증성 변화에 따라, 관절염의 임상적 중증도를 각 발에 대해 0 내지 4의 등급으로 등급화하였다(점수 기준). 동물을 2 또는 3일 마다 검사하고 평균±S.D.로 측정하여 관절염 중증도를 평가하였다(도 24 및 표 15). 콜라겐 처리로 유도된 초기 관절염 발달 징후는 14일에 가시화되었다. 처리군 및 위약군 모두에서 CIA 군의 관절염 점수는 빠르게 증가하였고, 약 20일에 5 내지 9의 최대 점수에 도달하였고, 이후 염증성 징후는 21 내지 35일에 점차 약해졌다. 그러나, 연구 기간 동안 면역원 작제물(서열번호 148)을 처리한 모든 처리군은 임상적 징후 점수로 위약군보다 관절염의 더 큰 감소를 나타냈다. 또한 아쥬반트 ISA51 또는 ADJUPHOS로 처리한 모든 처리군에서 더 높은 용량 투여군이 더 낮은 관절염 점수를 받은 것과 같이 펩타이드 면역원 용량 의존적 방식이 관찰되었다. 2개의 서로 다른 아쥬반트 비히클로 처리한 2개의 위약군은 모든 처리군에 비해 더 높은 임상적 징후 점수를 가져 임상적 관절염 징후에서 더 큰 중증도를 나타냈다. 가장 좋은 용량 수준은 45 및 150㎍으로 나타났고, 이 경우 ISA 51 및 ADJUPHOS 제형 모두 5 및 15㎍ 용량에 비해 관절염 징후 및 증상이 유의적으로 감소하였다. 33 및 35일에, 150㎍ 용량 수준의 ADJUPHOS 제형 처리군은 각각 31% 및 45% 감소를 보인 ISA 51 처리군에 비해 61% 및 63%로 관절염 점수의 보다 유의적인 감소를 나타냈다.
호중구 수는 첫 콜라겐 주사 후 0 내지 7일에 빠르게 증가하였고, 이후 두 번째 주사 후 14일까지 점차 증가하였다. 상승된 호중구 수는 면역화에 의해 용량-의존적 방식으로 빠르게 감소하였다(도 25 및 표 16). 모든 면역원 처리군은 각 시점에서 위약군보다 더 큰 호중구 수 감소를 나타냈다. IL-6 면역원 처리군에서, 2개의 더 높은 용량이 호중구를 유의적으로 감소시켰는데, ADJUPHOS 제형에서 45 및 150㎍ 용량은 호중구 수를 각각 ㎕ 당 1.55±0.23×103 및 ㎕ 당 1.36±0.25×103으로 유의적으로 감소시켜(p<0.001), 같은 용량 수준에서 ISA 51로 제형화한 것 보다 더 우수하였다.
콜라겐 유도 관절염은 혈소판 수의 유의적인 증가와도 관련이 있다. 시험한 CIA 쥐에서, 평균 혈소판 수는 모든 군에서 첫 번째 콜라겐 주사 후 꾸준한 증가를 보이고, 이후 점차 감소하였다(도 26 및 표 17). 용량-의존성 또한 관찰되어, 더 높은 용량에 대해 더 낮은 혈소판 수를 보여주었다. 특히, 45 및 150㎍ 용량에서 ADJUPHOS로 제형화된 IL-6 조성물은 정상값에 가깝게 혈소판 수준을 유의적으로 감소시킨 반면 위약군은 각 시점에서 혈액 혈소판 수가 더 높았다.
Hitachi 7080 화학 분석기(Hitachi) 상의 일상적인 인간 AST 검사로 혈청 아스파르트산 아미노트랜스페라아제(AST) 수준을 측정하여 간 손상을 정량하였다(도 27 및 표 18). IL-6 펩타이드 면역원 작제물 제형 및 콜라겐으로 쥐를 처리하면 정상쥐군에 비교하여 0 및 7일 사이에 혈청 AST 수준이 중간정도로 증가하였다. AST 농도는 21일까지 일정하였고, 이후 연구가 끝날 때까지 천천히 감소하였다. 용량 의존성이 AST 수준에서도 관찰되었다. 150㎍ 용량으로 처리한 쥐는 두 제형 모두에서 유의적으로 낮은 AST 수준을 나타냈다. 45㎍ 용량에서는, ADJUPHOS 제형에서만 유의적으로 낮은 AST 수준이 나타났고, ISA 51에서는 그렇지 않았다.
요약하면, 아쥬반트로 제형화된 IL-6 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 148)은 IL-6 항체를 유도하여 과도한 IL-6을 중화하고 이에 따라 관절염 중증도를 약화시키고 혈액 호중구 및 혈소판 수와 같은 염증성 인자를 억제할 뿐만 아니라 간 기능을 보호할 수 있다. 조성물에 대한 반응의 유사한 용량-의존적 양식이 각 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 처리군에서 관찰되었다. 결과는 용량 당 150㎍을 투여받는 동물이 가장 높은 면역 반응을 보이고 45㎍을 투여받은 동물은 그 다음임을 나타냈다. 또한, ISA 51 및 ADJUPHOS의 두 아쥬반트 전달 시스템 모두 IL-6 펩타이드 면역원 작제물과 조합하여 사용할 때 관절염 증상을 약화하는 능력을 보였다. 그러나, 모든 관절염-관련 병리학적 파라미터에서 아쥬반트 ADJU-PHOS가 MONTANIDE IS A 51보다 약간 더 우수하였다. 따라서 0.5㎖ ADJUPHOS 당 150㎍의 가장 높은 용량이 쥐의 면역화를 위한 최적 용량으로 간주되고 다른 종에서 면역원성을 탐색하기 위한 지침으로 사용될 것이다.
실시예 10
IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형을 사용한 면역화에 의한 만성 염증성 질환의 치료
IL-6은 면역 반응, 혈구형성 및 급성기 반응과 같은 광범위한 범위의 생물학적 사건에 관여한다. 그러나, IL-6의 과생산은, 몇몇 만성 염증성 질환 및 암을 포함하는, 다양한 질환의 병인과 관련이 있다. IL-6 신호전달에 대한 저해제의 사용은 IL-6 조절장애의 영향을 받는 질환의 분자적 메커니즘을 더 잘 이해하기 위한 중요한 정보를 제공하여 이들 질환에 대한 새로운 요법적 개입의 개발을 촉진할 것이다. 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약학적 조성물로서 본 개시내용의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형의 임상적 적용은 실시예 11 내지 15에 기술되어 있다. 질환에서 IL-6 신호전달에 대한 IL-6 저해제의 잠재적인 임상적 적용에 관한 리뷰 논문이 참조에 의해 제공되었다(Mihara, et al, 2012).
만성 염증성 질환의 빈혈(ACD)
빈혈은 종종, RA, 염증성 장 질환 및 암과 같은, 만성 염증성 질환을 앓는 환자에서 관찰되며, ACD(anemia of chronic disease)로 불린다. ACD는 충분한 철분 저장소의 존재 하에서의 저철혈증이 특징이다. 염증성 사이토카인이 ACD에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각된다.
원숭이의 콜라겐-유도 관절염에서 관찰되는 빈혈은 혈청 철분 및 트랜스페린 포화도의 감소 및 혈청 페리틴의 상승이 특징이다. 빈혈의 중증도는 혈청 IL-6 수준과 관련이 있다. 헵시딘(Hepcidin)은 인간 및 다른 포유동물에서 철분 항상성의 주요 조절제이다. 이는 소장에서의 철분 흡수 및 대식세포로부터 재활용된 철분의 방출을 저해하여, 골수에서 성숙화하는 적혈구에 철분을 전달하는 것을 효과적으로 감소시킨다. 헵시딘을 과생산하도록 유전적으로 조작된 생쥐는 출생 직후 심각한 철분 결핍으로 죽는다.
IL-6은 간 세포에서 헵시딘 생산을 유도한다. 콜라겐-유도 관절염을 앓는 원숭이에 IL-6 수용체에 대한 단클론 항체인 TCZ를 투여하면 빈혈이 빠르게 개선되고 혈청 헵시딘의 빠른, 하지만 일시적인, 감소가 유도되었다. 헵시딘 mRNA 발현은 TCZ 투여에 의해 저해된 건강한 동물보다 관절염 원숭이의 혈청에 의해 더 강하게 유도되었다. 이러한 증거는 TCZ가 IL-6-유도 헵시딘 생산의 저해를 통해 원숭이 관절염에서 빈혈을 개선함을 나타낸다.
고가의 항체 치료 대신, IL-6와 IL-6R 결합에 개입하는 IL-6R 결합 부위 항체의 유도를 위해 환자에 본 개시내용의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형을 투여하여 질병 치료를 유도한다.
실시예 11
IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형을 사용한 면역화에 의한 암의 치료
인간 발암의 만성 염증
만성 염증은 인간의 발암에서 중요한 역할을 수행한다. 질환 중증도 및 결과와 관련된 암 환자에서 상승된 혈청 IL-6 수준이 기술된 많은 보고가 있다. IL-6은 많은 암의 성장 및 분화 조절과 관련이 있다. IL-6의 상승은 신장 세포 암종, 난소암, 림프종, 흑색종 및 전립선암에서 불량한 예후와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. ERK1/2을 활성화하여, IL-6은 종양 세포 증식을 자극한다. IL-6은 세포 생존의 중요한 조절자로, 스트레스 및 세포독성 약물에 의해 유도되는 세포사를 피하는 메커니즘을 종양 세포에 제공한다. 추가로, IL-6의 생리학적 역할은 종양 증식뿐만 아니라 전이 및 악액질 증상을 촉진하는 것으로 나타났다.
다발성 골수종(MM)
MM은 형질 세포의 악성종양이며 성인에서 가장 일반적인 악성 림프종이다. 이것은 종양 세포가 골수에 퍼져 골 질환을 유도하는 것이 특징이다. 골수 미세환경에서 MM 세포와 간질 세포 사이의 상호작용은 사이토카인, 성장 인자 및 점착 분자의 생산을 자극한다. 이들은 함께 골수에서 MM 세포의 증식 및 국소화에서 중요한 역할을 수행한다. MM 세포는 골용해를 야기하여 골 통증 및 고칼슘혈증을 유도한다. IL-6은 MM 세포에 대한 주요 성장 인자이다. 모든 MM 환자 중 약 절반에서, 배양된 MM 세포의 증식이 자가분비 루프에 의해 매개되는 것으로 관찰되었고, 골수 환경에 의해 생산된 IL-6가 MM 세포의 성장 및 생존에 관련된 주요 사이토카인이라는 것이 현재 잘 알려져 있다. 또한, IL-6는, 덱사메타손, Fas 및 혈청 결핍과 같은 다른 자극에 의해 유도되는 MM 세포의 자멸사를 막기 때문에, MM 세포의 생존에서 필수적인 인자임이 잘 알려져 있다. IL-6-sIL-6R 복합체는, 세포 표면에 IL-6R을 발현하지 않는 천연 MM 세포에서 Bcl-xL 및 Mcl-1을 모두 상향조절하는데 IL-6 단독 보다 강력하다. 따라서, 트랜스-신호전달을 방해할 수 있는, 즉 IL-6/IL-6Rα 복합체와 IL-6Rβ/즉 gp130의 수준에서 방해하는, 부위에 대한 항체를 유도할 수 있는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물을 얻는 것이 중요하다. 따라서, 본 개시내용의 IL-6 조성물은 MM의 치료에 적용할 수 있다.
전립선암
전립선암에서 IL-6 및 IL-6R의 발현 및 성장 인자로서의 IL-6의 역할은 잘 알려져 있다. IL-6은 진행성 전립선암 세포주 LNCaP에서 세포자멸사에 대한 저항과 Bcl-2 패밀리의 항-세포자멸사성 구성원의 수준 증가를 담당한다. 전립선암 세포의 성장이 안드로겐의 존재에 의존하기 때문에, 진행성 전립선암을 앓는 거의 모든 환자는 초기에 안드로겐 차단 및 항-안드로겐 요법에 반응한다. IL-6이 전립선암 세포에서 안드로겐 생합성 및 AR(안드로겐 수용체)의 발현을 자극하기 때문에, IL-6이 전립선암에서 항-안드로겐 치료의 치료적 효과를 줄일 가능성이 있다. 반면, AR-음성 전립선암에서, IL-6은 세포자멸사의 저해제로 알려져 있다. 본 개시내용의 IL-6 조성물은 면역화된 환자에서 항-IL-6 항체의 생성을 허용하여 IL-6에 의한 부정적인 영향을 중화할 것이다.
암-관련 식욕부진 및 악액질
암-관련 식욕부진 및 악액질은 악성 질환과 관련된 심각한 합병증이다. 악액질의 특징은 빈혈, 간 기능 이상, 피로 및 구토이다. 췌장암 환자에서의 혈청 IL-6 상승 및 악액질과의 상호관련성이 관찰되었다. 상기 기술된 바와 같이, IL-6은 철분 대사와 관련이 있다. 또한, IL-6은 과도한 포도당 대사 및 근육 손실과 관련된 조절 역할도 한다. IL-6은, 항-IL-6 항체로 처리하여 암 악액질의 유도가 차단된, 동계 생쥐 모델에서 암 악액질에 필수적인 것으로 알려져 있다. 또한, 동계 생쥐에서, IL-6 cDNA-형질주입 Lewis 폐암종 세포의 주사는 변하지 않은 순수 종양 성장률을 나타냈지만, 체중 손실 및 생존기간의 단축을 야기하였다. 항-인간 IL-6 항체(ALD518)는 진행성 비소세포 폐암을 앓는 환자에서 피로를 완화하고 지방제외체중의 손실을 줄이는 것(위약을 취한 경우의 -1.50㎏에 비교하여 ALD518을 취한 환자의 경우 -0.19㎏)으로 보고되었다. 이 환자에서, ALD518는 헤모글로빈, 헤마토크리트, 평균 적혈구 헤모글로빈 및 알부민을 증가시켰고, 11g/㎗ 이하의 기준선 헤모글로빈 수준을 갖는 환자 중 58%의 헤모글로빈 수준을 12g/㎗ 이상으로 올렸다. 따라서, 항-IL-6 항체는, 단클론 항체로서 또는 환자를 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물로 면역화하여 유도되는 항체로서, 암-관련 빈혈에 대한 비-적혈구생성적-자극제가 될 수 있다.
장기 궤양성 대장염 환자는 결장암 발생 위험이 훨신 높으며, 이는 결장에서 면역 시스템의 종양 촉진자로서의 역할을 시사한다. 연구는, 장 손상에 반응하여 고유판(lamina propria) 내 선천성 면역 세포에서 생산되는, IL-6이 종양-개시 세포의 증식을 강화하고 급성 결장 염증 및 CAC(대장염-관련 암) 유도 동안 정상 및 사전-악성 장 상피 세포를 세포자멸사로부터 보호한다는 것을 보여준다. 또한, 궤양성 대장염 모델의 아족시메탄-유도 결장 종양에서, 종양의 출현은, IL-6을 포함하는, 종양-촉진 인자의 근원인, F4/80+CD11bhighGr1low(M2) 대식세포 부분 집합의 공동-출현을 하였다. 이러한 결과는 IL-6 봉쇄가 대장염-관련 암의 요법을 위한 접근방식이 될 수 있음을 시사한다.
다발성 골수종(MM), 안드로겐 의존성 또는 안드로겐 독립성 전립선암, 비소세포 폐암, 암-관련 식욕부진 및 악액질, 암-관련 빈혈 및 대장염-관련 암을 포함하는 암의 치료 및 개선을 위해 IL-6와 IL-6 수용체의 상호작용을 방해하고 IL-6 혈청 수준을 줄이는 값비싼 항체 치료를 적용하는 것 대신, IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형으로 면역화하는 것이 이러한 파괴적인 질환의 치료를 위해 적합할 것이다.
실시예 12
IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형을 사용한 면역화에 의한 류마티스 관절염의 치료
류마티스 관절염(RA)
류마티스 관절염(RA)은 특히 손과 발의 관절에 영향을 미치는 원인을 알 수 없는 만성 진행성 자가면역 염증성 질환이다. 영향을 받는 관절의 활액 조직은, 대식세포 및 림프구와 같은, 염증성 세포에 의해 침윤되어, 혈관신생과 함께 과형성을 일으키고 결국 관절 종창, 경직 및 통증을 유발한다. 이 과정은 궁극적으로 영구적인 장애를 겪고 있는 일부 환자의 관절에서 연골 파괴와 골 재흡수로 이어진다. IL-6의 생물학적 활성 및 RA 환자의 혈청 및 활액에서 IL-6의 상승은 IL-6이 RA의 발달에 관련된 핵심 사이토카인 중 하나임을 나타낸다. 일본 및 전세계에서 수행된 항-IL-6R 단클론 항체 TCZ(토실리주맙)를 사용한 7회의 III상 임상 시험은, 중간 내지 중증 RA를 앓는 성인 환자의 치료에서 단일요법 또는 DMARD(질환-변형 항 류마티스성 약물)와의 조합-요법으로서, 이의 효능을 보여주었다. 또한, SAMURAI(류마티스 관절염에 사용되는 능동적 조절 단일요법의 연구, IL-6 저해제) 및 LITHE(토실리주맙 안정성 및 구조적 관절 손상 예방 시험) 시험은 TCZ 치료로 관절의 방사성 손상이 유의적으로 저해됨을 증명하였다. 결과적으로, 현재 TCZ는 많은 나라에서 RA 치료를 위해 승인되었다.
전신성 소아 특발성 관절염(sJIA)
전신성 소아 특발성 관절염(sJIA)는 전신성 염증을 하는 관절의 파괴 및 기능적 장애를 유발하는 만성 소아기 관절염의 하위유형이다. 이러한 지속성 염증은 스파이크 열, 빈혈 및 성장 장애도 야기한다. 대식세포 활성화 증후근으로 알려진 sJIA의 급성 합병증은 심각한 사망률과 관련이 있다. IL-6은 환자의 혈액 및 활액에서 뚜렷하게 상승하는 것으로 보고되었고, IL-6 수준은 질환의 활성과 상관관계가 있는 것으로 나타났다. TCZ는, 기존 치료 요법에 반응하지 않은, sJIA를 앓는 56명의 환자를 대상으로 한 무작위 이중-맹검 위약-대조 금단 III상 시험에서 우수한 효능을 나타냈다. 이는 sJIA에 대한 첫 번째 생물학적 약물로서 일본에서 2008년에 승인되었다.
IL-6 혈청 수준을 줄이고 sJIA 질환을 개선하기 위해 IL-6와 IL-6 수용체의 상호작용 수준을 방해하는 위에 나타낸 바와 같은 값비싼 항체 치료를 적용하는 것 대신, 본 개시내용의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형으로 면역화하는 것이 sJIA 질환의 치료를 위해 적합할 것이다.
실시예 13
IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형을 사용한 면역화에 의한 캐슬만병의 치료
캐슬만병은 내피 과형성을 동반하는 여포성 과형성 및 모세관 증식이 특징인 양성 증식성 림프절을 갖는 림프구증식성 질환이다. IL-6은 증식성 림프절에서 높은 수준으로 생산되고 다양한 임상적 증상을 담당하는 핵심 요소이다. 2번의 개방 임상 시험은 항 IL-6R 항체 TCZ를 2주 마다 8㎎/㎏ 체중으로 투여한 경우 임상적 증상, 실험실 결과 및 조직학적으로 결정된 개선에서 뚜렷한 효과가 있음을 보여주었다. 또한, TCZ 치료는 캐슬만병 환자에서 혈청 헵시딘-25의 빠른 감소를 초래하였다. TCZ 치료 시작 후, 철분-관련 파라미터의 점진적인 정상화 및 증상의 개선을 동반한, 장기간 감소가 관찰되었으며, 이는 IL-6이 캐슬만병에서 헵시딘의 유도에 필수적인 역할을 수행한다는 것을 나타낸다. TCZ는 일본에서 2005년에 캐슬만병에 대한 희귀 약물로 승인되었다.
IL-6 혈청 수준 감소 및 캐슬만병의 개선을 위해 IL-6 및 IL-6 수용체의 상호작용의 수준을 방해하는 값비싼 항체 치료를 적용하는 대신, IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형으로 면역화하는 것이 캐슬만병의 치료를 위해 적합할 것이다.
실시예 14
IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형을 사용한 면역화에 의한 우울증의 치료
면역 시스템과 뇌 사이의 연관성은 새로운 메커니즘적인 이해 및 우울증 치료를 위한 통찰력을 제공할 수 있다. 면역 시스템과 뇌 사이의 사이토카인-매개 교신은 우울증의 병인과 관련이 있다. 주요 우울증은 C형 간염 바이러스에 걸린 환자에서, 사이토카인의 유력한 유도제인, 인터페론 치료 후에 흔히 발생한다(4명 중 1명). 건강한 지원자에서 실험적 면역-활성은 우울증 증상 및 인지 성능 감소로 이어진다. 횡단적 연구의 메타-분석에서 우울증 환자의 순환 염증성 사이토카인 수준의 상승이 확인되었다. 장기적인 연구에서 먼저 혈청 사이토카인 수준이 상승하고, 이에 따라 잠재적으로 우울증 증상이 유발되는 것이 입증되었다. 또한, 염증 시스템의 활성화는 항-우울증 저항성의 기저를 이루는 것으로 생각되어, 이는 치료 반응에서 염증이 관여함을 강조한다. 이러한 발견을 기반으로, 염증성 사이토카인 특히 IL-6을 표적으로 하여 우울증 및 통증을 앓는 환자, 특히 만성 염증성 상태를 갖는 환자에 치료적 이점을 제공하기 위해 본 개시내용의 IL-6 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형을 사용하는 것이 가장 의미가 있을 것이다.
Figure pct00003
Figure pct00004
* IL-6 단편의 N-말단 및/또는 C-말단에서 아미노산을 대체하는 시스테인을 밑줄로 표시함.
Figure pct00005
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Figure pct00007
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* 내부-시스테인 이황화 결합의 형성으로 고리화되는 폴리펩타이드로, 굵은 기울임체로 식별함. IL-6 단편의 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산을 대체하는 시스테인을 밑줄로 표시함.
UBITh®1: 서열번호 91
UBITh®2: 서열번호 92
UBITh®3: 서열번호 89
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*, p<0.05 **, p<0.01 ***, p<0.001 ****, p<0.0001
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*, p<0.05 **, p<0.01 ***, p<0.001
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*, p<0.05 **, p<0.01
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*, p<0.05 **, p<0.01
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*, p<0.05 **, p<0.01 ***, p<0.001
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SEQUENCE LISTING <110> UBI IP Holdings UBI US Holdings, LLC <120> PEPTIDE IMMUNOGENS TARGETING INTERLEUKIN 6 (IL-6) AND FORMULATIONS THEREOF FOR IMMUNOTHERAPY OF DISEASES IMPACTED BY IL-6 DYSREGULATION <130> WO 2020/140106 <140> PCT/US2019/068854 <141> 2019-12-28 <150> US 62/786,192 <151> 2018-12-28 <160> 236 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(184) <223> Human IL-6 1-184 <400> 1 Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg 1 5 10 15 Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile 20 25 30 Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn 35 40 45 Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu 50 55 60 Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu 65 70 75 80 Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val 85 90 95 Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala 100 105 110 Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys 115 120 125 Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn 130 135 140 Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp 145 150 155 160 Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 180 <210> 2 <211> 184 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(184) <223> Macaque IL-6 1-184 <400> 2 Pro Val Leu Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Ser 1 5 10 15 Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys His Ile Arg Tyr Ile 20 25 30 Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Arg Ser Asn 35 40 45 Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu 50 55 60 Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu 65 70 75 80 Asp Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val 85 90 95 Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala 100 105 110 Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys 115 120 125 Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Asn 130 135 140 Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp 145 150 155 160 Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 180 <210> 3 <211> 184 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(184) <223> Mouse IL-6 1-184 <400> 3 Ser Gln Val Arg Arg Gly Asp Phe Thr Glu Asp Thr Thr Pro Asn Arg 1 5 10 15 Pro Val Tyr Thr Thr Ser Gln Val Gly Gly Leu Ile Thr His Val Leu 20 25 30 Trp Glu Ile Val Glu Met Arg Lys Glu Leu Cys Asn Gly Asn Ser Asp 35 40 45 Cys Met Asn Asn Asp Asp Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Lys Leu Pro 50 55 60 Glu Ile Gln Arg Asn Asp Gly Cys Tyr Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu 65 70 75 80 Ile Cys Leu Leu Lys Ile Ser Ser Gly Leu Leu Glu Tyr His Ser Tyr 85 90 95 Leu Glu Tyr Met Lys Asn Asn Leu Lys Asp Asn Lys Lys Asp Lys Ala 100 105 110 Arg Val Leu Gln Arg Asp Thr Glu Thr Leu Ile His Ile Phe Asn Gln 115 120 125 Glu Val Lys Asp Leu His Lys Ile Val Leu Pro Thr Pro Ile Ser Asn 130 135 140 Ala Leu Leu Thr Asp Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu Arg Thr 145 150 155 160 Lys Thr Ile Gln Phe Ile Leu Lys Ser Leu Glu Glu Phe Leu Lys Val 165 170 175 Thr Leu Arg Ser Thr Arg Gln Thr 180 <210> 4 <211> 184 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(184) <223> Rat IL-6 1-184 <400> 4 Ser Gln Val Arg Arg Gly Asp Phe Thr Glu Asp Thr Thr His Asn Arg 1 5 10 15 Pro Val Tyr Thr Thr Ser Gln Val Gly Gly Leu Ile Thr Tyr Val Leu 20 25 30 Arg Glu Ile Leu Glu Met Arg Lys Glu Leu Cys Asn Gly Asn Ser Asp 35 40 45 Cys Met Asn Ser Asp Asp Ala Leu Ser Glu Asn Asn Leu Lys Leu Pro 50 55 60 Glu Ile Gln Arg Asn Asp Gly Cys Phe Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu 65 70 75 80 Ile Cys Leu Leu Lys Ile Cys Ser Gly Leu Leu Glu Phe Arg Phe Tyr 85 90 95 Leu Glu Phe Val Lys Asn Asn Leu Gln Asp Asn Lys Lys Asp Lys Ala 100 105 110 Arg Val Ile Gln Ser Asn Thr Glu Thr Leu Val His Ile Phe Lys Gln 115 120 125 Glu Ile Lys Asp Ser Tyr Lys Ile Val Leu Pro Thr Pro Thr Ser Asn 130 135 140 Ala Leu Leu Met Glu Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu Arg Thr 145 150 155 160 Lys Thr Ile Gln Leu Ile Leu Lys Ala Leu Glu Glu Phe Leu Lys Val 165 170 175 Thr Met Arg Ser Thr Arg Gln Thr 180 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> IL-6 73-83 <400> 5 Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 1 5 10 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> IL-6 62-83 <400> 6 Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly 1 5 10 15 Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 <210> 7 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> IL-6 58-83 <400> 7 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys 1 5 10 15 Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 <210> 8 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(32) <223> IL-6 52-83 <400> 8 Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met 1 5 10 15 Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> IL-6 52-72 <400> 9 Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met 1 5 10 15 Ala Glu Lys Asp Gly 20 <210> 10 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72 <400> 10 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly 20 25 30 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> IL-6 50-67, C67 substitute M67 <400> 11 Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro 1 5 10 15 Lys Cys <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> IL-6 42-57 <400> 12 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> IL-6 61-75, S73 substitute C73 <400> 13 Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Ser Phe Gln 1 5 10 15 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> IL-6 61-72 <400> 14 Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> IL-6 44-50 <400> 15 Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys 1 5 <210> 16 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(42) <223> IL-6 44-83 <400> 16 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys 20 25 30 Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 35 40 <210> 17 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(40) <223> IL-6 44-83 <400> 17 Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu 1 5 10 15 Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln 20 25 30 Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 35 40 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> IL-6 150-162, C150 substitute K150, C162 substitute T162 <400> 18 Cys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Cys 1 5 10 <210> 19 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> IL-6 144-166, C144 substitute N144, C166 substitute I166 <400> 19 Cys Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln 1 5 10 15 Asp Met Thr Thr His Leu Cys 20 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> mouse IL-6 72-82 <400> 20 Cys Tyr Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Ile Cys 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 32-41 <400> 21 Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 33-42 <400> 22 Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 34-43 <400> 23 Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 35-44 <400> 24 Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 36-45 <400> 25 Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 37-46 <400> 26 Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 38-47 <400> 27 Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 39-48 <400> 28 Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 40-49 <400> 29 Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 41-50 <400> 30 Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys 1 5 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 42-51 <400> 31 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu 1 5 10 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 43-52 <400> 32 Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 44-53 <400> 33 Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 45-54 <400> 34 Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 46-55 <400> 35 Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 47-56 <400> 36 Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 48-57 <400> 37 Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 49-58 <400> 38 Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 50-59 <400> 39 Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 51-60 <400> 40 Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL6- 52-61 <400> 41 Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 53-62 <400> 42 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 54-63 <400> 43 Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 55-64 <400> 44 Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 56-65 <400> 45 Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 57-66 <400> 46 Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 58-67 <400> 47 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met 1 5 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 59-68 <400> 48 Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 60-69 <400> 49 Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu 1 5 10 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 61-70 <400> 50 Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys 1 5 10 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 62-71 <400> 51 Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp 1 5 10 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 63-72 <400> 52 Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly 1 5 10 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 64-73 <400> 53 Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys 1 5 10 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 65-74 <400> 54 Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe 1 5 10 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 66-75 <400> 55 Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln 1 5 10 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 67-76 <400> 56 Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 68-77 <400> 57 Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 69-78 <400> 58 Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 70-79 <400> 59 Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 71-80 <400> 60 Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 72-81 <400> 61 Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 73-82 <400> 62 Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr 1 5 10 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 74-83 <400> 63 Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 75-84 <400> 64 Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 76-85 <400> 65 Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 77-86 <400> 66 Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys 1 5 10 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 78-87 <400> 67 Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile 1 5 10 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 79-88 <400> 68 Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile 1 5 10 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 80-89 <400> 69 Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr 1 5 10 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 81-90 <400> 70 Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly 1 5 10 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IL-6 82-91 <400> 71 Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu 1 5 10 <210> 72 <211> 14 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Rat IL-6 150-162, C150 substitute K150, C162 substitute T162 <400> 72 Cys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu Arg Thr Lys Thr Cys 1 5 10 <210> 73 <211> 23 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> rat IL-6 144-166 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> rat IL-6 144-166, C144 substitute N144, C166 substitute I162 <400> 73 Asn Ala Leu Leu Met Glu Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu Arg 1 5 10 15 Thr Lys Thr Ile Gln Leu Ile 20 <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> rat IL-6 72-82 <400> 74 Cys Phe Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Ile Cys 1 5 10 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> macaque IL-6 73-83 <400> 75 Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Asp Thr Cys 1 5 10 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> Spacer1 <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> Any amino acid, preferably aspartic acid <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> Any amino acid, preferably aspartic acid <400> 76 Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro 1 5 <210> 77 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> epsilon K-KKK as spacer <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> epsilon-K <400> 77 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 1 Th <400> 78 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Leu <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF1 Th <400> 79 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 1 5 10 15 <210> 80 <211> 24 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> Bordetella pertussis Th <400> 80 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu 20 <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 2 Th <400> 81 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 Thr <210> 82 <211> 23 <212> PRT <213> diphtheria bacilli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Diphtheria Th <400> 82 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys 20 <210> 83 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Plasmodium falciparum Th <400> 83 Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser 20 <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> Schistosoma mansoni <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Schistosoma mansoni Th <400> 84 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 1 5 10 15 His <210> 85 <211> 25 <212> PRT <213> Cholera Toxin <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Cholera Toxin Th <400> 85 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser 20 25 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF 2 Th <400> 86 Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile 1 5 10 15 <210> 87 <211> 22 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF 3 Th <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> G or T <400> 87 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile Glu Xaa Ile Leu Phe 20 <210> 88 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 1 Th <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> F or K or R <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> D or R <400> 88 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Pro Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 89 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <400> 89 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 90 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 2 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> T or L <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> P or I <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I <400> 90 Lys Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Ile Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Asp <210> 91 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 5 Th (UBITh1) <400> 91 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 92 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 3 Th (UBITh2) <400> 92 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Influenza MP1_1 Th <400> 93 Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg 1 5 10 <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Influenza MP1_2 Th <400> 94 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val 1 5 10 15 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> Influenza NSP1 Th <400> 95 Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser 1 5 <210> 96 <211> 19 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> EBV BHRF1 Th <400> 96 Ala Gly Leu Thr Leu Ser Leu Leu Val Ile Cys Ser Tyr Leu Phe Ile 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Clostridium tetani TT1 Th <400> 97 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 98 <211> 20 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> EBV EBNA-1 Th <400> 98 Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu 1 5 10 15 Gln Thr His Ile 20 <210> 99 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Clostridium tetani TT2 Th <400> 99 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 100 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT3 Th <400> 100 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe 1 5 10 15 <210> 101 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT4 Th <400> 101 Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys 1 5 10 15 <210> 102 <211> 18 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> EBV CP Th <400> 102 Val Pro Gly Leu Tyr Ser Pro Cys Arg Ala Phe Phe Asn Lys Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu <210> 103 <211> 14 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> HCMV IE1 Th <400> 103 Asp Lys Arg Glu Met Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His 1 5 10 <210> 104 <211> 15 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> EBV GP340 Th <400> 104 Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 105 <211> 13 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> EBV BPLF1 Th <400> 105 Lys Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Gln 1 5 10 <210> 106 <211> 11 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> EBV EBNA-2 Th <400> 106 Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu 1 5 10 <210> 107 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(34) <223> IL-6 73-83 cyclized <400> 107 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu 20 25 30 Thr Cys <210> 108 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> IL-6 73-83 cyclized <220> <221> PEPTIDE <222> (12)..(15) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(34) <223> MvF4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (23)..(23) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (27)..(27) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (28)..(28) <223> K or R <400> 108 Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Lys Lys Lys Lys Ile 1 5 10 15 Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr Ile 20 25 30 Leu Phe <210> 109 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(54) <223> IL-6 154-184 <400> 109 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr 20 25 30 Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu 35 40 45 Arg Ala Leu Arg Gln Met 50 <210> 110 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> (IL-6 154-184) x 6 as branched peptide <220> <221> SITE <222> (32)..(33) <223> (epsilon K-K) x 4 as a linker <220> <221> SITE <222> (34)..(35) <223> (epsilon K-K) x 2 as a linker <220> <221> PEPTIDE <222> (36)..(39) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (40)..(58) <223> MvF4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (43)..(43) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (46)..(46) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (47)..(47) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (51)..(51) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (52)..(52) <223> K or R <400> 110 Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser 1 5 10 15 Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met Lys 20 25 30 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val 35 40 45 Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 55 <210> 111 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(33) <223> (KK- IL-6 154-184) x 6 as branched peptide <220> <221> SITE <222> (34)..(35) <223> (epsilon K-K) x 4 as a linker <220> <221> SITE <222> (36)..(37) <223> (epsilon K-K) x 2 as a linker <220> <221> PEPTIDE <222> (38)..(41) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (42)..(60) <223> MvF4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (45)..(45) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (48)..(48) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (49)..(49) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (53)..(53) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (54)..(54) <223> K or R <400> 111 Lys Lys Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu 1 5 10 15 Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln 20 25 30 Met Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa 35 40 45 Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 55 60 <210> 112 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(36) <223> IL-6 150-162 cyclized <400> 112 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu 20 25 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Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu 20 25 30 Gln Asp Met Cys Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly 35 40 45 Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 55 <210> 115 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(46) <223> IL-6 144-166 cyclized <400> 115 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln 20 25 30 Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Cys 35 40 45 <210> 116 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> IL-6 144-166 cyclized <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(27) <223> epsilon K-KKK as spacer <220> <221> SITE <222> (27)..(27) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (28)..(46) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 116 Cys Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln 1 5 10 15 Asp Met Thr Thr His Leu Cys Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu 20 25 30 Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 35 40 45 <210> 117 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(46) <223> IL-6 144-166 cyclized <220> <221> PEPTIDE <222> (47)..(50) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (50)..(50) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (51)..(69) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 117 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln 20 25 30 Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Cys Lys Lys 35 40 45 Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile 50 55 60 Glu Thr Ile Leu Phe 65 <210> 118 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(34) <223> IL-6 73-83 cyclized <220> <221> PEPTIDE <222> (35)..(38) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (38)..(38) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (39)..(57) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 118 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu 20 25 30 Thr Cys Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile 35 40 45 Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 55 <210> 119 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(34) <223> IL-6 73-83 cyclized <400> 119 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu 20 25 30 Thr Cys <210> 120 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg3 Th (UBITh2) <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(22) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(33) <223> IL-6 73-83 cyclized <400> 120 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr 20 25 30 Cys <210> 121 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> IL-6 144-166 cyclized <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(27) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (27)..(27) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (28)..(45) <223> HBsAg3 Th (UBITh2) <400> 121 Cys Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln 1 5 10 15 Asp Met Thr Thr His Leu Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Ile 20 25 30 Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr Ile Asp 35 40 45 <210> 122 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(31) <223> IL-6 73-83 cyclized <400> 122 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 123 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg3 Th (UBITh2) <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(30) <223> IL-6 73-83 cyclized <400> 123 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 124 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(42) <223> IL-6 62-83 cyclized <400> 124 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys 20 25 30 Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 35 40 <210> 125 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(46) <223> IL-6 58-83 cyclized <400> 125 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu 20 25 30 Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 35 40 45 <210> 126 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(52) <223> IL-6 52-83 cyclized <400> 126 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn 20 25 30 Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn 35 40 45 Glu Glu Thr Cys 50 <210> 127 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(41) <223> IL-6 52-72 <400> 127 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn 20 25 30 Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly 35 40 <210> 128 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(51) <223> IL-6 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epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(36) <223> rat counterpart IL-6 150-162 cyclized <220> <221> PEPTIDE <222> (37)..(40) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (40)..(40) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (41)..(59) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 153 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu 20 25 30 Arg Thr Lys Cys Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly 35 40 45 Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 55 <210> 154 <211> 46 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> rat counterpart IL-6 144-166 cyclized <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(27) <223> epsilon K-KKK as spacer <220> <221> SITE <222> (27)..(27) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (28)..(46) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 154 Cys Ala Leu Leu Met Glu Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu 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SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(36) <223> rat counterpart IL-6 150-162 cyclized <220> <221> PEPTIDE <222> (37)..(40) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (40)..(40) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (41)..(59) <223> MvF 4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (44)..(44) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (47)..(47) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (48)..(48) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (52)..(52) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (53)..(53) <223> K or R <400> 156 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu 20 25 30 Arg Thr Lys Cys Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa 35 40 45 Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 55 <210> 157 <211> 46 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> rat counterpart IL-6 144-166 cyclized <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(27) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (27)..(27) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (28)..(46) <223> MvF4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (31)..(31) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (34)..(34) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (34)..(35) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (39)..(39) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (40)..(40) <223> K or R <400> 157 Cys Ala Leu Leu Met Glu Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu Arg 1 5 10 15 Thr Lys Thr Ile Gln Leu Cys Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu 20 25 30 Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr Ile Leu Phe 35 40 45 <210> 158 <211> 34 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(34) <223> macaque counterpart IL-6 73-83 cyclized <400> 158 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Asp 20 25 30 Thr Cys <210> 159 <211> 34 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(34) <223> macaque counterpart IL-6 73-83 cyclized <400> 159 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Asp 20 25 30 Thr Cys <210> 160 <211> 33 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg3 Th (UBITh2) <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(22) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(33) <223> macaque counterpart IL-6 73-83 cyclized <400> 160 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Asp Thr 20 25 30 Cys <210> 161 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(21) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (21)..(21) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(32) <223> IL-6 73-83 <400> 161 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Leu Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 162 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(19) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(30) <223> IL-6 73-83 <400> 162 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 163 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> Bordetella pertussis Th <220> <221> PEPTIDE <222> (25)..(28) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (28)..(28) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (29)..(39) <223> IL-6 73-83 <400> 163 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser 20 25 30 Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 35 <210> 164 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(21) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (21)..(21) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(32) <223> IL-6 73-83 <400> 164 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 Thr Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 165 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Diphtheria Th <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(27) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (27)..(27) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (28)..(38) <223> IL-6 73-83 <400> 165 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly 20 25 30 Phe Asn Glu Glu Thr Cys 35 <210> 166 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Plasmodium falciparum Th <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(25) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (25)..(25) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (26)..(36) <223> IL-6 73-83 <400> 166 Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn 20 25 30 Glu Glu Thr Cys 35 <210> 167 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Schistosoma mansoni Th <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(21) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (21)..(21) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(32) <223> IL-6 73-83 <400> 167 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 1 5 10 15 His Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 168 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Cholera Toxin Th <220> <221> PEPTIDE <222> (26)..(29) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (29)..(29) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (30)..(40) <223> IL-6 73-83 <400> 168 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln 20 25 30 Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 35 40 <210> 169 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(19) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(30) <223> IL-6 73-83 <400> 169 Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 170 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF3 Th <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> G or T <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(26) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (26)..(26) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (27)..(37) <223> IL-6 73-83 <400> 170 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile Glu Xaa Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe 20 25 30 Asn Glu Glu Thr Cys 35 <210> 171 <211> 33 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 1 Th <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> F or K or R <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> D or R <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(22) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(33) <223> IL-6 73-83 <400> 171 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Pro Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr 20 25 30 Cys <210> 172 <211> 33 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 2 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> T or L <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> P or I <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(22) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(33) <223> IL-6 73-83 <400> 172 Lys Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Ile Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Asp Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr 20 25 30 Cys <210> 173 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Influenza MP1_1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (12)..(15) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(26) <223> IL-6 73-83 <400> 173 Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Lys Lys Lys Lys Cys 1 5 10 15 Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 <210> 174 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Influenza MP1_2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(19) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (30)..(30) <223> IL-6 73-83 <400> 174 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 175 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> Influenza NSP1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (10)..(13) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (14)..(24) <223> IL-6 73-83 <400> 175 Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln 1 5 10 15 Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 <210> 176 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> EBV BHRF1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (23)..(23) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(34) <223> IL-6 73-83 <400> 176 Ala Gly Leu Thr Leu Ser Leu Leu Val Ile Cys Ser Tyr Leu Phe Ile 1 5 10 15 Ser Arg Gly Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu 20 25 30 Thr Cys <210> 177 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Clostridium tetani TT1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(19) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(30) <223> IL-6 73-83 <400> 177 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 178 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> EBV EBNA-1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(24) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (24)..(24) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (25)..(35) <223> IL-6 73-83 <400> 178 Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu 1 5 10 15 Gln Thr His Ile Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu 20 25 30 Glu Thr Cys 35 <210> 179 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Clostridium tetani TT2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(25) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (25)..(25) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (26)..(36) <223> IL-6 73-83 <400> 179 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn 20 25 30 Glu Glu Thr Cys 35 <210> 180 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT3 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (17)..(20) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(31) <223> IL-6 73-83 <400> 180 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe 1 5 10 15 Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 181 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT4 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (17)..(20) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(31) <223> IL-6 73-83 <400> 181 Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 182 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> EBV CP Th <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(22) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(33) <223> IL-6 73-83 <400> 182 Val Pro Gly Leu Tyr Ser Pro Cys Arg Ala Phe Phe Asn Lys Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr 20 25 30 Cys <210> 183 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> HCMV IE1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(18) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(29) <223> IL-6 73-83 <400> 183 Asp Lys Arg Glu Met Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 <210> 184 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> EBV GP340 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(19) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(30) <223> IL-6 73-83 <400> 184 Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr Asp Tyr Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 185 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> EBV BPLF1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (14)..(17) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(28) <223> IL-6 73-83 <400> 185 Lys Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Gln Lys Lys Lys 1 5 10 15 Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 <210> 186 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> EBV EBNA-2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (12)..(15) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(26) <223> IL-6 73-83 <400> 186 Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu Lys Lys Lys Lys Cys 1 5 10 15 Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 <210> 187 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(49) <223> Clostridium tetani 1 Th <400> 187 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 35 40 45 Leu <210> 188 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(47) <223> MvF1 Th <400> 188 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 35 40 45 <210> 189 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(56) <223> Bordetella pertussis Th <400> 189 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 35 40 45 Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu 50 55 <210> 190 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(49) <223> Clostridium tetani 2 Th <400> 190 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 35 40 45 Thr <210> 191 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(55) <223> Diphtheria Th <400> 191 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 35 40 45 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys 50 55 <210> 192 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(53) <223> Plasmodium falciparum Th <400> 192 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 35 40 45 Asn Val Val Asn Ser 50 <210> 193 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(49) <223> Schistosoma mansoni Th <400> 193 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 35 40 45 His <210> 194 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Cholera Toxin Th <400> 194 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser 20 25 <210> 195 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(47) <223> MvF 2 Th <400> 195 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile 35 40 45 <210> 196 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(54) <223> KKKMvF 3 Th <220> <221> SITE <222> (39)..(39) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (42)..(42) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (43)..(43) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (47)..(47) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (48)..(48) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (51)..(51) <223> G or T <400> 196 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa 35 40 45 Ile Glu Xaa Ile Leu Phe 50 <210> 197 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(50) <223> HBsAg 1 Th <220> <221> SITE <222> (33)..(33) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (34)..(34) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (35)..(35) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (36)..(36) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (37)..(37) <223> F or K or R <220> <221> SITE <222> (38)..(38) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (39)..(39) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (41)..(41) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (42)..(42) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (43)..(43) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (45)..(45) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (47)..(47) <223> Q or L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (49)..(49) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (50)..(50) <223> D or R <400> 197 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Pro Xaa Ser 35 40 45 Xaa Xaa 50 <210> 198 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(50) <223> HBsAg 2 Th <220> <221> SITE <222> (36)..(36) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (37)..(37) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (38)..(38) <223> T or L <220> <221> SITE <222> (39)..(39) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (43)..(43) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (46)..(46) <223> P or I <220> <221> SITE <222> (47)..(47) <223> Q or T <220> <221> SITE <222> (48)..(48) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (49)..(49) <223> L or I <400> 198 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Lys Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Ile Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Asp 50 <210> 199 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 3 Th (UBITh2) <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(50) <223> HBsAg 3 Th (UBITh2) <400> 199 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 35 40 45 Ile Asp 50 <210> 200 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Influenza MP1_1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Influenza MP1_1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(43) <223> Influenza MP1_1 Th <400> 200 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg 35 40 <210> 201 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(47) <223> Influenza MP1_2 Th <400> 201 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val 35 40 45 <210> 202 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(41) <223> Influenza NSP1 Th <400> 202 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser 35 40 <210> 203 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(51) <223> EBV BHRF1 Th <400> 203 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Ala Gly Leu Thr Leu Ser Leu Leu Val Ile Cys Ser Tyr Leu Phe Ile 35 40 45 Ser Arg Gly 50 <210> 204 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(47) <223> Clostridium tetani TT1 Th <400> 204 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 35 40 45 <210> 205 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(52) <223> EBV EBNA-1 Th <400> 205 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu 35 40 45 Gln Thr His Ile 50 <210> 206 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(53) <223> Clostridium tetani TT2 Th <400> 206 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 35 40 45 Ala Ser His Leu Glu 50 <210> 207 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(48) <223> Clostridium tetani TT3 Th <400> 207 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe 35 40 45 <210> 208 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(48) <223> Clostridium tetani TT4 Th <400> 208 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys 35 40 45 <210> 209 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(50) <223> EBV CP Th <400> 209 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Val Pro Gly Leu Tyr Ser Pro Cys Arg Ala Phe Phe Asn Lys Glu Glu 35 40 45 Leu Leu 50 <210> 210 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(46) <223> HCMV IE1 Th <400> 210 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Asp Lys Arg Glu Met Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His 35 40 45 <210> 211 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(47) <223> EBV GP340 Th <400> 211 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr Asp Tyr 35 40 45 <210> 212 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(45) <223> EBV BPLF1 Th <400> 212 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Lys Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Gln 35 40 45 <210> 213 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(43) <223> EBV EBNA-2 Th <400> 213 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu 35 40 <210> 214 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(47) <223> HBsAg4 Th (UBITh4) <400> 214 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp 35 40 45 <210> 215 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 42-72, cyclized <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> epsilon-K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(48) <223> Yersinia Invasin (Inv) Th <400> 215 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Lys 20 25 30 Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe 35 40 45 <210> 216 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KKKMvF3 Th (individual) <400> 216 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys 1 5 10 15 Ile Glu Gly Ile Leu Phe 20 <210> 217 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KKKMvF3 Th (individual) <400> 217 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg 1 5 10 15 Ile Glu Thr Ile Leu Phe 20 <210> 218 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBsAg1 Th (individual) <400> 218 Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr Leu Pro Gln Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 219 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBsAg1 Th (individual) <400> 219 Arg Arg Arg Ile Lys Ile Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Pro Leu Ser 1 5 10 15 Ile Arg <210> 220 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBsAg1 Th (individual) <400> 220 Lys Lys Lys Val Arg Val Val Thr Lys Val Val Thr Val Pro Ile Ser 1 5 10 15 Val Asp <210> 221 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBsAg1 Th (individual) <400> 221 Lys Lys Lys Phe Phe Phe Phe Thr Lys Phe Phe Thr Phe Pro Val Ser 1 5 10 15 Phe Asp <210> 222 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBsAg1 Th (individual) <400> 222 Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr Leu Pro Phe Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 223 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MvF4 Th (individual) <400> 223 Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 224 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MvF4 Th (individual) <400> 224 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 225 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBsAg2 Th (individual) <400> 225 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Pro Gln Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 226 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBsAg2 Th (individual) <400> 226 Lys Lys Lys Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp <210> 227 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(212) <223> IL-6 Protein <400> 227 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr 35 40 45 Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile 50 55 60 Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 65 70 75 80 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 85 90 95 Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 100 105 110 Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 115 120 125 Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln 130 135 140 Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 180 185 190 Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala 195 200 205 Leu Arg Gln Met 210 <210> 228 <211> 212 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(212) <223> IL-6 Protein <400> 228 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Leu Pro 20 25 30 Gly Glu Asp Ser Lys Asn Val Ala Ala Pro His Ser Gln Pro Leu Thr 35 40 45 Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys His Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile 50 55 60 Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Arg Ser Asn Met Cys Glu Ser 65 70 75 80 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 85 90 95 Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Asp Thr Cys Leu 100 105 110 Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 115 120 125 Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln 130 135 140 Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 180 185 190 Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Asn Leu Arg Ala 195 200 205 Leu Arg Gln Met 210 <210> 229 <211> 211 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(211) <223> IL-6 Protein <400> 229 Met Lys Phe Leu Ser Ala Arg Asp Phe His Pro Val Ala Phe Leu Gly 1 5 10 15 Leu Met Leu Val Thr Thr Thr Ala Phe Pro Thr Ser Gln Val Arg Arg 20 25 30 Gly Asp Phe Thr Glu Asp Thr Thr Pro Asn Arg Pro Val Tyr Thr Thr 35 40 45 Ser Gln Val Gly Gly Leu Ile Thr His Val Leu Trp Glu Ile Val Glu 50 55 60 Met Arg Lys Glu Leu Cys Asn Gly Asn Ser Asp Cys Met Asn Asn Asp 65 70 75 80 Asp Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Lys Leu Pro Glu Ile Gln Arg Asn 85 90 95 Asp Gly Cys Tyr Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Ile Cys Leu Leu Lys 100 105 110 Ile Ser Ser Gly Leu Leu Glu Tyr His Ser Tyr Leu Glu Tyr Met Lys 115 120 125 Asn Asn Leu Lys Asp Asn Lys Lys Asp Lys Ala Arg Val Leu Gln Arg 130 135 140 Asp Thr Glu Thr Leu Ile His Ile Phe Asn Gln Glu Val Lys Asp Leu 145 150 155 160 His Lys Ile Val Leu Pro Thr Pro Ile Ser Asn Ala Leu Leu Thr Asp 165 170 175 Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu Arg Thr Lys Thr Ile Gln Phe 180 185 190 Ile Leu Lys Ser Leu Glu Glu Phe Leu Lys Val Thr Leu Arg Ser Thr 195 200 205 Arg Gln Thr 210 <210> 230 <211> 211 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(211) <223> IL-6 Protein <400> 230 Met Lys Phe Leu Ser Ala Arg Asp Phe Gln Pro Val Ala Phe Leu Gly 1 5 10 15 Leu Met Leu Leu Thr Ala Thr Ala Phe Pro Thr Ser Gln Val Arg Arg 20 25 30 Gly Asp Phe Thr Glu Asp Thr Thr His Asn Arg Pro Val Tyr Thr Thr 35 40 45 Ser Gln Val Gly Gly Leu Ile Thr Tyr Val Leu Arg Glu Ile Leu Glu 50 55 60 Met Arg Lys Glu Leu Cys Asn Gly Asn Ser Asp Cys Met Asn Ser Asp 65 70 75 80 Asp Ala Leu Ser Glu Asn Asn Leu Lys Leu Pro Glu Ile Gln Arg Asn 85 90 95 Asp Gly Cys Phe Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Ile Cys Leu Leu Lys 100 105 110 Ile Cys Ser Gly Leu Leu Glu Phe Arg Phe Tyr Leu Glu Phe Val Lys 115 120 125 Asn Asn Leu Gln Asp Asn Lys Lys Asp Lys Ala Arg Val Ile Gln Ser 130 135 140 Asn Thr Glu Thr Leu Val His Ile Phe Lys Gln Glu Ile Lys Asp Ser 145 150 155 160 Tyr Lys Ile Val Leu Pro Thr Pro Thr Ser Asn Ala Leu Leu Met Glu 165 170 175 Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu Arg Thr Lys Thr Ile Gln Leu 180 185 190 Ile Leu Lys Ala Leu Glu Glu Phe Leu Lys Val Thr Met Arg Ser Thr 195 200 205 Arg Gln Thr 210 <210> 231 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> KKK-epsilon-K as spacer <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> epsilon-K <400> 231 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 232 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG1 oligonucleotide ODN <400> 232 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgttttgtcg tt 32 <210> 233 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG2 oligonucleotide ODN <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> phosphorothioate group <400> 233 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 234 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG3 Oligonucleotide ODN <400> 234 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 235 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(60) <223> IL-6 (32-91) <400> 235 Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser 1 5 10 15 Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn 20 25 30 Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn 35 40 45 Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu 50 55 60 <210> 236 <211> 31 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-6 (154-184) <400> 236 Gln Lys Glu Trp Leu Arg Thr Lys Thr Ile Gln Phe Ile Leu Lys Ser 1 5 10 15 Leu Glu Glu Phe Leu Lys Val Thr Leu Arg Ser Thr Arg Gln Thr 20 25 30

Claims (19)

  1. 약 30개 이상의 아미노산을 갖는 IL-6 펩타이드 면역원 작제물로서, 다음의 식으로 표시되는, IL-6 펩타이드 면역원 작제물:
    (Th)m-(A)n-(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)-X
    또는
    (IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)-(A)n-(Th)m-X
    또는
    (Th)m-(A)n-(IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)-(A)n-(Th)m-X
    식 중,
    Th는 이종 T 헬퍼 에피토프이고;
    A는 이종 스페이서이고;
    (IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편)은 IL-6(서열번호 1)의 IL-6R 결합 영역으로부터의 약 7 내지 약 42개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프 펩타이드이고;
    X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이고;
    m은 1 내지 약 4이고;
    n은 0 내지 약 10이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편은 서열번호 5 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 Th 에피토프는 서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 면역원 작제물은 서열번호 107 내지 215로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
  5. IL-6 펩타이드 면역원 작제물로서,
    a. 서열번호 1 내지 4의 IL-6 서열로부터의 약 7 내지 약 42개의 아미노산 잔기를 포함하는 B 세포 에피토프;
    b. 서열번호 78 내지 106, 216 내지 226 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 T 헬퍼 에피토프; 및
    c. 아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 77), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(서열번호 231) 및 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(서열번호 76) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 선택적 이종 스페이서
    를 포함하되, 상기 B 세포 에피토프는 직접적으로 또는 선택적 이종 스페이서를 통해 상기 T 헬퍼 에피토프에 공유결합으로 연결된, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 B 세포 에피토프는 서열번호 5 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 T 헬퍼 에피토프는 서열번호 78 내지 106 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 선택적 이종 스페이서는 (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 77), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(서열번호 231) 또는 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(서열번호 76) 및 이들의 임의의 조합인, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 T 헬퍼 에피토프는 상기 B 세포 에피토프의 아미노 말단에 공유결합으로 연결된, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
  10. 제5항에 있어서, 상기 T 헬퍼 에피토프는 상기 선택적 이종 스페이서를 통해 상기 B 세포 에피토프의 아미노 말단에 공유결합으로 연결된, IL-6 펩타이드 면역원 작제물.
  11. 제1항에 따른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물을 포함하는 조성물.
  12. 약학적 조성물로서,
    a. 제1항에 따른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물; 및
    b. 약학적으로 허용가능한 전달 비히클 및/또는 아쥬반트
    를 포함하는, 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    a. 상기 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편은 서열번호 5 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고;
    b. 상기 Th 에피토프는 서열번호 78 내지 106 및 216 내지 226으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고;
    c. 상기 이종 스페이서는 아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 77), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(서열번호 231) 및 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(서열번호 76) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고;
    상기 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 안정화된 면역자극성 복합체를 형성하기 위해 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)와 혼합된, 약학적 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    a. 상기 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 서열번호 107 내지 215로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고;
    상기 IL-6 펩타이드 면역원 작제물은 안정화된 면역자극성 복합체를 형성하기 위해 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)와 혼합된, 약학적 조성물.
  15. 동물에서 IL-6에 대한 항체를 생성하는 방법으로서, 제12항에 따른 약학적 조성물을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제1항에 따른 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에서 IL-6의 IL-6R 결합 영역 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 상기 IL-6 펩타이드 면역원 작제물에 결합된, 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  18. 제16항에 따른 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 조성물.
  19. 동물에서 IL-6 조절장애에 의해 영향을 받는 질환의 예방 및/또는 치료 방법으로서, 제12항에 따른 약학적 조성물을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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