CN115490771A - 重组抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种双特异性抗体及其应用，该抗体为双链抗体，包括：第一条肽链，包含CD3单链抗体和第一Fc区，所述CD3单链抗体包括重链可变区、轻链可变区；以及第二条肽链，包含TIGIT胞外区和第二Fc区；其中，所述CD3单链抗体的C端与所述第一Fc区的N端相连，所述TIGIT胞外区的C端与所述第二Fc区的N端相连。本发明所制备的双特异性抗体能同时靶向CD3和CD155，从而介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤，具有较强的肿瘤抑制能力。

Description

重组抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，涉及重组抗体及其应用，更具体地，涉及重组抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞、组合物、所述重组抗体或抗原结合片段或核酸分子或表达载体或重组细胞或组合物在制备药物中的用途、药物、所述重组抗体在制备试剂盒中的用途和试剂盒。
背景技术
近年来，双特异抗体成为了免疫治疗中的研究热点。双特异抗体是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能够在靶细胞(肿瘤细胞)和效应细胞(免疫细胞)之间架起桥梁，产生导向性杀伤肿瘤的效应功能。然而，由于(1)双特异抗体药物存在免疫原性的风险：其抗体本身并不是人自身所有，为小鼠等动物经抗原免疫产生，人源化改造仅能够部分降低其免疫原性，人的免疫系统仍会产生针对该抗体的抗体，即抗抗体，进而造成药物的减效甚至失效。(2)靶向肿瘤相关抗原的抗体如为轻、重链二聚体结构，则存在生产、纯化难度；如靶向肿瘤相关抗原的抗体为ScFv片段，则它对肿瘤相关抗原的亲和力会大幅降低，影响抗癌效果。
因此，仍需进一步开发低免疫原性、强亲和力的双特异性抗体。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
肿瘤组织中CD155相对于正常组织的差异化高表达，且CD155结合免疫检查点受体TIGIT，进而抑制免疫细胞的抗癌功能，CD3抗体单链可变片段(ScFv)能够结合T细胞，基于此，发明人设计了靶向CD155的双特异抗体CD3×TIGIT extra，经过大量筛选后，获得了优势双特异抗体，该抗体能够同时与肿瘤组织中高表达的CD155以及T细胞进行结合，有效介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤，具有较强的抗癌能力。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组抗体。根据本发明的实施例，包括：第一条肽链，包含CD3单链抗体和第一Fc区，所述CD3单链抗体包括重链可变区、轻链可变区；以及第二条肽链，包含TIGIT胞外区和第二Fc区；其中，所述CD3单链抗体的C端与所述第一Fc区的N端相连，所述TIGIT胞外区的C端与所述第二Fc区的N端相连。根据本发明实施例的重组抗体可以同时与CD3和CD155进行结合，有效介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤抑制能力。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码第一方面所述的重组抗体。根据本发明实施例的核酸编码的重组抗体可以同时与CD3和CD155进行结合，有效介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤抑制能力。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，携带第二方面所述的核酸。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述重组抗体，所述重组抗体可以同时与CD3和CD155进行结合，有效介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤抑制能力。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备第一方面所述的重组抗体的方法。根据本发明的实施例，包括：将第三方面所述的表达载体引入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组抗体。根据本发明实施例的方法可以有效获得所述重组抗体，所述重组抗体可以同时与CD3和CD155进行结合，有效介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤抑制能力。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带第二方面所述的核酸、或第三方面所述的表达载体。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的一些具体实施例，所述重组细胞在合适条件下可高效表达上述重组抗体，所述重组抗体可以同时与CD3和CD155进行结合，有效介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤抑制能力。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，包括：第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3和CD155蛋白分子结合，促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的组合物，如食品组合物、药物组合物等，同样具有显著的治疗或预防肿瘤的作用。
在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3和CD155蛋白分子结合，促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的一系列物质的药物同样具有显著的治疗或预防癌症的作用。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物包括：第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗癌症。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3和CD155蛋白分子结合，促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，因此，包含所述重组抗体的一系列物质的药物同样具有显著的治疗或预防癌症的作用。
在本发明的第九方面，本发明提出了第一方面所述的重组抗体在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于检测CD3和/或CD155。所述重组抗体可与CD3和/或CD155蛋白进行结合，因此，包含所述重组抗体的试剂盒可用于有效检测CD3和/或CD155。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的CD3和/或CD155蛋白。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含第一方面所述的重组抗体。根据本发明实施例提供的所述重组抗体可与CD3和/或CD155蛋白进行结合，因此，包含所述重组抗体的试剂盒可用于有效检测CD3和/或CD155。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的CD3和/或CD155蛋白，此外，也可以用于对个体状态进行判断，如获得所述个体的PD-L1水平后，判断其PD-L1水平是否过高于或低于正常水平。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的重组双特异抗体的结构示意图，其中，并未给出连接肽的连接位置，重组双特异性抗体的第一Fc区(左侧)和第二Fc区(右侧)通过knob-into-hole结构进行连接；
图2是根据本发明实施例的重组双特异抗体与Jurkat细胞结合能力的检测结果图；
图3是根据本发明实施例的重组双特异抗体与CHO-K1-CD155结合能力的检测结果图；
图4是根据本发明实施例的重组双特异抗体与肺癌NCI-H1299细胞结合能力的检测结果图；
图5是根据本发明实施例的重组双特异性抗体对PBMC杀伤肺癌NCI-H1299细胞的检测结果图；
图6是根据本发明实施例的重组双特异性抗体对PBMC杀伤肺癌NCI-H358细胞的检测结果图；以及
图7是根据本发明实施例的重组双特异性抗体对PBMC杀伤肝癌HepG2细胞的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。
本文中，“双链抗体”是指由可特异性识别不同蛋白分子的肽链分别与Fc区的两条链进行连接而获得的，其中，所述Fc区的两条链通过knob into hole结构进行连接。
本文中“knob into hole结构”为在抗体重链Fc的CH3区形成钮(Knob)扣(hole)突变，便于重链咬合，形成异二聚体，例如，本申请中，通过突变人IgG1-Fc CH3结构域中氨基酸(一条链中为T366S、L368A、Y407V突变，即“hole”；另一链中为T366W突变，即“knob”)实现。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组抗体，所述重组抗体为双链抗体，包括：第一条肽链，包含CD3单链抗体和第一Fc区，所述CD3单链抗体包括重链可变区、轻链可变区；以及第二条肽链，包含TIGIT胞外区和第二Fc区；其中，所述CD3单链抗体的C端与所述第一Fc区的N端相连，所述TIGIT胞外区的C端与所述第二Fc区的N端相连。根据本发明实施例的重组抗体可以同时与CD3和CD155进行结合，有效介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤抑制能力。
根据本发明的一些具体实施例，上述重组抗体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，进一步包括连接肽1，所述连接肽1的N端与所述重链可变区的C端相连，所述连接肽1的C端与所述轻链可变区的N端相连。
根据本发明的一些具体实施例，所述连接肽1包括SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：14)。
根据本发明的一些具体实施例，进一步包括连接肽2，所述连接肽2的N端与所述轻链可变区的C端相连，所述连接肽2的C端与所述第一Fc区的N端相连。
根据本发明的一些具体实施例，所述连接肽2包括SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
GGGGS(SEQ ID NO：15)。
根据本发明的一些具体实施例，进一步包括连接肽3，所述连接肽3的N端与所述TIGIT胞外区的C端相连，所述连接肽3的C端与所述第二Fc区的N端相连；
根据本发明的一些具体实施例，所述连接肽3包括SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
GGGGS(SEQ ID NO：18)。
根据本发明的一些具体实施例，所述第一Fc区和第二Fc区通过knob into hole结构进行连接。
根据本发明的一些具体实施例，所述第一Fc区与野生型IgG1 Fc区相比具有缺少CH1区、T366W突变中的至少之一，所述第二Fc区与野生型IgG1 Fc区相比具有缺少CH1区、T366S、L368A、Y407V突变中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源IgG或其突变体。
根据本发明的一些具体实施例，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源IgG1或其突变体。
根据本发明的一些具体实施例，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自人源IgG1或其突变体。
根据本发明的一些具体实施例，所述第一抗体Fc区具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述第二抗体Fc区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
PKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：16)。
PKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：19)。
根据本发明的一些具体实施例，所述重组抗体的具有SEQ ID NO：3、4所示的氨基酸序列。
EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：3)。
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFcIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPGGGGSPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：4)。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸，所述核酸编码第一方面所述的重组抗体。根据本发明实施例的核酸编码的重组抗体可以同时与CD3和CD155进行结合，有效介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤抑制能力。
根据本发明的一些具体实施例，所述核酸具有SEQ ID NO：1、2所示的核苷酸序列。
GAGGTTCAACTGCTCGAATCTGGAGGTGGTTTGGTGCAACCTGGTGGATCACTGAAGCTGAGCTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTAATACTTACGCTATGAATTGGGTAAGACAGGCCCCAGGAAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGGATTAGGTCTAAGTACAATAATTACGCAACTTATTATGCCGATTCCGTGAAAGATCGCTTCACCATTAGCCGGGATGACTCTAAAAACACCGCATATCTGCAGATGAACAATCTGAAAACCGAGGACACTGCTGTGTACTACTGCGTTCGCCACGGCAACTTCGGAAACTCTTATGTGAGTTGGTTCGCTTACTGGGGTCAGGGCACCTTGGTGACCGTCAGTAGTGGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGTGGATCTGGCGGAGGAGGATCAGAGCTGGTGGTGACACAGGAGCCTTCTTTGACAGTCTCTCCAGGAGGGACAGTAACACTGACATGCCGGAGCAGCACTGGAGCTGTCACCACAAGTAACTACGCTAACTGGGTACAACAAAAGCCTGGGCAGGCACCTAGGGGGTTGATTGGGGGAACTAACAAGCGCGCCCCAGGAACCCCTGCAAGATTCTCTGGCAGCTTGCTTGGCGGGAAAGCTGCACTGACCCTTTCTGGAGTGCAGCCCGAGGACGAGGCAGAATATTACTGTGCTCTGTGGTACTCAAACCTCTGGGTGTTCGGGGGAGGAACCAAGCTTACTGTGCTCGGCGGGGGAGGCAGTCCTAAATCATGCGACAAAACTCATACATGTCCACCTTGTCCTGCTCCTGAAGCTGCCGGGGGACCTTCAGTGTTCCTGTTTCCACCTAAGCCCAAAGATACCTTGATGATTTCTCGAACCCCAGAGGTGACTTGCGTGGTAGTCGATGTCTCCCACGAAGATCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACAAAGCCCCGAGAGGAACAGTATAATAGTACCTATCGCGTGGTTAGCGTCCTTACTGTGTTGCATCAGGACTGGCTGAATGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTATCAAATAAGGCCCTCCCAGCTCCCATCGAGAAAACTATTTCCAAGGCCAAGGGTCAGCCAAGGGAGCCACAGGTCTACACCTTGCCCCCTAGTCGGGAAGAAATGACCAAAAACCAGGTGAGTCTGTGGTGCCTGGTTAAGGGTTTCTACCCCTCTGATATTGCAGTGGAGTGGGAGTCAAACGGCCAGCCAGAGAACAACTATAAGACAACCCCTCCAGTGCTGGACTCAGACGGGTCTTTCTTTCTCTATAGCAAACTGACTGTCGACAAGAGCAGGTGGCAGCAAGGGAACGTCTTCAGCTGCTCAGTGATGCATGAGGCACTGCATAACCACTATACTCAAAAAAGCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAA(SEQ ID NO：1)。
ATGATGACAGGCACCATTGAAACCACCGGGAACATTTCAGCCGAAAAGGGTGGCAGCATCATCCTGCAGTGTCATCTGTCTAGTACTACAGCCCAGGTGACCCAGGTGAATTGGGAGCAGCAGGACCAGCTGCTGGCAATCTGTAACGCCGACCTCGGTTGGCATATTAGCCCCAGTTTCAAGGATAGGGTCGCACCCGGCCCCGGATTGGGCCTGACACTCCAGAGCCTGACCGTGAACGATACAGGTGAATACTTTTGTATTTACCACACATACCCTGACGGAACATATACTGGTAGGATATTCCTCGAGGTGCTGGAATCTTCAGTGGCCGAGCACGGGGCTCGGTTTCAGATTCCTGGAGGTGGAGGGAGTCCCAAGAGTTGTGATAAGACACATACATGCCCTCCCTGCCCAGCACCCGAAGCAGCTGGAGGCCCAAGTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAACCTAAGGACACCCTGATGATCTCACGCACTCCTGAGGTTACCTGCGTGGTAGTGGATGTGTCCCACGAAGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTCGATGGAGTCGAAGTCCATAACGCCAAGACCAAGCCACGTGAGGAGCAGTACAATTCAACATACCGAGTGGTGAGTGTGCTGACCGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAAGAGTACAAGTGTAAGGTGTCTAATAAAGCATTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACAATTTCAAAGGCTAAAGGTCAGCCACGAGAACCCCAAGTTTATACCCTGCCTCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTCAGTCTTTCTTGTGCCGTGAAGGGTTTTTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCAAACGGGCAGCCCGAGAATAATTATAAGACAACACCACCAGTGCTGGACTCCGATGGAAGCTTTTTCCTGGTGTCCAAGCTCACTGTCGACAAGTCTAGGTGGCAACAGGGAAATGTGTTCTCATGTTCCGTAATGCACGAGGCCCTCCATAACCACTATACTCAAAAGAGCCTGAGCCTGAGTCCCGGCAAG(SEQ ID NO：2)。
需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体，携带第二方面所述的核酸。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述重组抗体，所述重组抗体可以同时与CD3和CD155进行结合，有效介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤抑制能力。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备第一方面所述的重组抗体的方法，包括：将第三方面所述的表达载体引入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组抗体。本发明实施例所提出的方法可有效获得所述重组抗体，所述重组抗体可以同时与CD3和CD155进行结合，有效介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤抑制能力。
根据本发明的一些具体实施例，所述细胞为真核细胞。
根据本发明的一些具体实施例，所述真核细胞为哺乳动物细胞。
根据本发明的一些具体实施例，所述真核细胞不包括生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞，所述重组细胞携带第二方面所述的核酸、或第三方面所述的表达载体。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的一些具体实施例，所述重组细胞在合适条件下可高效表达上述重组抗体，所述重组抗体可以同时与CD3和CD155进行结合，有效介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤抑制能力。
需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞，且不包括生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述重组抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合重组抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述重组抗体表达的条件。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物，包括：第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与免疫细胞表面的CD3和肿瘤细胞表面的CD155蛋白分子结合，促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的组合物，如食品组合物、药物组合物等，同样具有显著的治疗或预防肿瘤的作用。
需要注意的是，所述组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者，或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时，各个成分可以同时或依次施用于受试者。
在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3和CD155蛋白分子结合，进而可特异性识别T细胞和肿瘤细胞，并促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的一系列物质的药物同样具有显著的治疗或预防肿瘤的作用。
根据本发明的一些具体实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物，所述药物包括：第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗癌症。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3和CD155蛋白分子结合，进而可特异性识别T细胞和肿瘤细胞，并促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，因此，包含所述重组抗体的一系列物质的药物同样具有显著的治疗或预防癌症的作用。
根据本发明的一些具体实施例，上述药物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。
根据本发明的一些具体实施例，包括药学上可接受的载体和有效量的所述抗体活性成分。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
在本发明的第九方面，本发明提出了第一方面所述的重组抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD3和/或CD155。所述重组抗体可与CD3和/或CD155蛋白进行结合，因此，包含所述重组抗体的试剂盒可用于有效检测CD3和/或CD155。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的CD3和/或CD155蛋白。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的重组抗体。根据本发明实施例提供的所述重组抗体可与CD3和/或CD155蛋白进行结合，因此，包含所述重组抗体的试剂盒可用于有效诊断或检测CD3和/或CD155。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的CD3和/或CD155蛋白，也可以用于对个体状态进行判断，如获得所述个体的PD-L1水平后，判断其PD-L1水平是否过高于或低于正常水平。
根据本发明的一些具体实施例，所述试剂盒用于检测CD3和/或CD155。
下面将对实施例作具体介绍。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1双特异性抗体分子的制备
本实施例进行双特异性抗体的生产，具体实验操作如下：利用ExpiCHOExpression Medium培养基(购自Thermo Fisher，A2910001)培养ExpiCHO细胞(购自ThermoFisher)，调整细胞浓度为6×106/mL，以获得ExpiCHO细胞溶液。将含有a链和b链编码基因(分别如SEQ ID NO：1、2所示)的pTT5载体(由苏州金唯智合成)加入2mL OptiSFM培养基(Thermo Fisher，12309019)中，获得溶液A，其中，a链编码基因包括编码CD3单链抗体(SEQID NO：5)、连接肽1(SEQ ID NO：6)、连接肽2(SEQ ID NO：7)和第一Fc区(SEQ ID NO：8)的核苷酸序列，b链编码基因包括编码TIGIT胞外区(SEQ ID NO：9)、连接肽3(SEQ ID NO：10)和第二Fc区(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列。将160μL ExpiFectamineCHO转染试剂(ThermoFisher，A29130)加入2mL OptiSFM培养基中，获得溶液B。然后将溶液A和溶液B混合，获得转染混合物，并在5分钟内将转染混合物全部加入50mL ExpiCHO细胞溶液中。在37℃、5％CO2条件下培养1天后，加入8mL Feed、300μL Enhancer(Thermo Fisher，A29130)，并转入32℃、5％CO2条件下培养9天后收获培养上清，其中第5天添加8mL Feed。利用Protein A纯化柱(购自GE)从培养上清中亲和纯化双特异抗体，具体的结果如图1所示，SEQ ID NO:3和SEQID NO:4分别示出了该双特异抗体中的片段a(第一条肽链)和片段b(第二条肽链)的氨基酸序列，其中，所述a片段包括CD3单链抗体(SEQ ID NO：13)、连接肽1(SEQ ID NO：14)、连接肽2(SEQ ID NO：15)和第一Fc区(SEQ ID NO：16)的氨基酸序列，所述b片段包括TIGIT胞外区(SEQ ID NO：17)、连接肽3(SEQ ID NO：18)和第二Fc区(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列。
a链编码基因包括如下所示的核苷酸序列：
GAGGTTCAACTGCTCGAATCTGGAGGTGGTTTGGTGCAACCTGGTGGATCACTGAAGCTGAGCTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTAATACTTACGCTATGAATTGGGTAAGACAGGCCCCAGGAAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGGATTAGGTCTAAGTACAATAATTACGCAACTTATTATGCCGATTCCGTGAAAGATCGCTTCACCATTAGCCGGGATGACTCTAAAAACACCGCATATCTGCAGATGAACAATCTGAAAACCGAGGACACTGCTGTGTACTACTGCGTTCGCCACGGCAACTTCGGAAACTCTTATGTGAGTTGGTTCGCTTACTGGGGTCAGGGCACCTTGGTGACCGTCAGTAGTGGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGTGGATCTGGCGGAGGAGGATCAGAGCTGGTGGTGACACAGGAGCCTTCTTTGACAGTCTCTCCAGGAGGGACAGTAACACTGACATGCCGGAGCAGCACTGGAGCTGTCACCACAAGTAACTACGCTAACTGGGTACAACAAAAGCCTGGGCAGGCACCTAGGGGGTTGATTGGGGGAACTAACAAGCGCGCCCCAGGAACCCCTGCAAGATTCTCTGGCAGCTTGCTTGGCGGGAAAGCTGCACTGACCCTTTCTGGAGTGCAGCCCGAGGACGAGGCAGAATATTACTGTGCTCTGTGGTACTCAAACCTCTGGGTGTTCGGGGGAGGAACCAAGCTTACTGTGCTCGGCGGGGGAGGCAGTCCTAAATCATGCGACAAAACTCATACATGTCCACCTTGTCCTGCTCCTGAAGCTGCCGGGGGACCTTCAGTGTTCCTGTTTCCACCTAAGCCCAAAGATACCTTGATGATTTCTCGAACCCCAGAGGTGACTTGCGTGGTAGTCGATGTCTCCCACGAAGATCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACAAAGCCCCGAGAGGAACAGTATAATAGTACCTATCGCGTGGTTAGCGTCCTTACTGTGTTGCATCAGGACTGGCTGAATGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTATCAAATAAGGCCCTCCCAGCTCCCATCGAGAAAACTATTTCCAAGGCCAAGGGTCAGCCAAGGGAGCCACAGGTCTACACCTTGCCCCCTAGTCGGGAAGAAATGACCAAAAACCAGGTGAGTCTGTGGTGCCTGGTTAAGGGTTTCTACCCCTCTGATATTGCAGTGGAGTGGGAGTCAAACGGCCAGCCAGAGAACAACTATAAGACAACCCCTCCAGTGCTGGACTCAGACGGGTCTTTCTTTCTCTATAGCAAACTGACTGTCGACAAGAGCAGGTGGCAGCAAGGGAACGTCTTCAGCTGCTCAGTGATGCATGAGGCACTGCATAACCACTATACTCAAAAAAGCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAA(SEQ ID NO:1)。
b链编码基因包括如下所示的核苷酸序列：
ATGATGACAGGCACCATTGAAACCACCGGGAACATTTCAGCCGAAAAGGGTGGCAGCATCATCCTGCAGTGTCATCTGTCTAGTACTACAGCCCAGGTGACCCAGGTGAATTGGGAGCAGCAGGACCAGCTGCTGGCAATCTGTAACGCCGACCTCGGTTGGCATATTAGCCCCAGTTTCAAGGATAGGGTCGCACCCGGCCCCGGATTGGGCCTGACACTCCAGAGCCTGACCGTGAACGATACAGGTGAATACTTTTGTATTTACCACACATACCCTGACGGAACATATACTGGTAGGATATTCCTCGAGGTGCTGGAATCTTCAGTGGCCGAGCACGGGGCTCGGTTTCAGATTCCTGGAGGTGGAGGGAGTCCCAAGAGTTGTGATAAGACACATACATGCCCTCCCTGCCCAGCACCCGAAGCAGCTGGAGGCCCAAGTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAACCTAAGGACACCCTGATGATCTCACGCACTCCTGAGGTTACCTGCGTGGTAGTGGATGTGTCCCACGAAGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTCGATGGAGTCGAAGTCCATAACGCCAAGACCAAGCCACGTGAGGAGCAGTACAATTCAACATACCGAGTGGTGAGTGTGCTGACCGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAAGAGTACAAGTGTAAGGTGTCTAATAAAGCATTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACAATTTCAAAGGCTAAAGGTCAGCCACGAGAACCCCAAGTTTATACCCTGCCTCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTCAGTCTTTCTTGTGCCGTGAAGGGTTTTTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCAAACGGGCAGCCCGAGAATAATTATAAGACAACACCACCAGTGCTGGACTCCGATGGAAGCTTTTTCCTGGTGTCCAAGCTCACTGTCGACAAGTCTAGGTGGCAACAGGGAAATGTGTTCTCATGTTCCGTAATGCACGAGGCCCTCCATAACCACTATACTCAAAAGAGCCTGAGCCTGAGTCCCGGCAAG(SEQ ID NO:2)。
a片段包括如下所示氨基酸序列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:3)。
b片段包括如下所示氨基酸序列：
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPGGGGSPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:4)。
编码a链的基因包括如下所示的核苷酸序列：
GGAGGTTCAACTGCTCGAATCTGGAGGTGGTTTGGTGCAACCTGGTGGATCACTGAAGCTGAGCTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTAATACTTACGCTATGAATTGGGTAAGACAGGCCCCAGGAAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGGATTAGGTCTAAGTACAATAATTACGCAACTTATTATGCCGATTCCGTGAAAGATCGCTTCACCATTAGCCGGGATGACTCTAAAAACACCGCATATCTGCAGATGAACAATCTGAAAACCGAGGACACTGCTGTGTACTACTGCGTTCGCCACGGCAACTTCGGAAACTCTTATGTGAGTTGGTTCGCTTACTGGGGTCAGGGCACCTTGGTGACCGTCAGTAGTGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGTGGATCTGGCGGAGGAGGATCAGAGCTGGTGGTGACACAGGAGCCTTCTTTGACAGTCTCTCCAGGAGGGACAGTAACACTGACATGCCGGAGCAGCACTGGAGCTGTCACCACAAGTAACTACGCTAACTGGGTACAACAAAAGCCTGGGCAGGCACCTAGGGGGTTGATTGGGGGAACTAACAAGCGCGCCCCAGGAACCCCTGCAAGATTCTCTGGCAGCTTGCTTGGCGGGAAAGCTGCACTGACCCTTTCTGGAGTGCAGCCCGAGGACGAGGCAGAATATTACTGTGCTCTGTGGTACTCAAACCTCTGGGTGTTCGGGGGAGGAACCAAGCTTACTGTGCTC(SEQID NO:5)。
编码连接肽1的基因包括如下所示的核苷酸序列：
GAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGTGGATCTGGCGGAGGAGGATCA(SEQ ID NO:6)。
编码连接肽2的基因包括如下所示的核苷酸序列：
GGCGGGGGAGGCAGT(SEQ ID NO:7)。
编码第一Fc区的基因包括如下所示的核苷酸序列：
CCTAAATCATGCGACAAAACTCATACATGTCCACCTTGTCCTGCTCCTGAAGCTGCCGGGGGACCTTCAGTGTTCCTGTTTCCACCTAAGCCCAAAGATACCTTGATGATTTCTCGAACCCCAGAGGTGACTTGCGTGGTAGTCGATGTCTCCCACGAAGATCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACAAAGCCCCGAGAGGAACAGTATAATAGTACCTATCGCGTGGTTAGCGTCCTTACTGTGTTGCATCAGGACTGGCTGAATGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTATCAAATAAGGCCCTCCCAGCTCCCATCGAGAAAACTATTTCCAAGGCCAAGGGTCAGCCAAGGGAGCCACAGGTCTACACCTTGCCCCCTAGTCGGGAAGAAATGACCAAAAACCAGGTGAGTCTGTGGTGCCTGGTTAAGGGTTTCTACCCCTCTGATATTGCAGTGGAGTGGGAGTCAAACGGCCAGCCAGAGAACAACTATAAGACAACCCCTCCAGTGCTGGACTCAGACGGGTCTTTCTTTCTCTATAGCAAACTGACTGTCGACAAGAGCAGGTGGCAGCAAGGGAACGTCTTCAGCTGCTCAGTGATGCATGAGGCACTGCATAACCACTATACTCAAAAAAGCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAA(SEQ ID NO:8)。
编码TIGIT胞外区的基因包括如下所示的核苷酸序列：
ATGATGACAGGCACCATTGAAACCACCGGGAACATTTCAGCCGAAAAGGGTGGCAGCATCATCCTGCAGTGTCATCTGTCTAGTACTACAGCCCAGGTGACCCAGGTGAATTGGGAGCAGCAGGACCAGCTGCTGGCAATCTGTAACGCCGACCTCGGTTGGCATATTAGCCCCAGTTTCAAGGATAGGGTCGCACCCGGCCCCGGATTGGGCCTGACACTCCAGAGCCTGACCGTGAACGATACAGGTGAATACTTTTGTATTTACCACACATACCCTGACGGAACATATACTGGTAGGATATTCCTCGAGGTGCTGGAATCTTCAGTGGCCGAGCACGGGGCTCGGTTTCAGATTCCT(SEQ ID NO:9)。
编码连接肽3的基因包括如下所示的核苷酸序列：
GGAGGTGGAGGGAGT(SEQ ID NO:10)。
编码第二Fc区的基因包括如下所示的核苷酸序列：
CCCAAGAGTTGTGATAAGACACATACATGCCCTCCCTGCCCAGCACCCGAAGCAGCTGGAGGCCCAAGTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAACCTAAGGACACCCTGATGATCTCACGCACTCCTGAGGTTACCTGCGTGGTAGTGGATGTGTCCCACGAAGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTCGATGGAGTCGAAGTCCATAACGCCAAGACCAAGCCACGTGAGGAGCAGTACAATTCAACATACCGAGTGGTGAGTGTGCTGACCGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAAGAGTACAAGTGTAAGGTGTCTAATAAAGCATTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACAATTTCAAAGGCTAAAGGTCAGCCACGAGAACCCCAAGTTTATACCCTGCCTCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTCAGTCTTTCTTGTGCCGTGAAGGGTTTTTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCAAACGGGCAGCCCGAGAATAATTATAAGACAACACCACCAGTGCTGGACTCCGATGGAAGCTTTTTCCTGGTGTCCAAGCTCACTGTCGACAAGTCTAGGTGGCAACAGGGAAATGTGTTCTCATGTTCCGTAATGCACGAGGCCCTCCATAACCACTATACTCAAAAGAGCCTGAGCCTGAGTCCCGGCAAG(SEQ ID NO:11)。
CD3单链抗体包括如下所示的氨基酸序列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:13)。
连接肽1包括如下所示的氨基酸序列：
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:14)。
连接肽2包括如下所示的氨基酸序列：
GGGGS(SEQ ID NO:15)。
第一Fc区包括如下所示的氨基酸序列：
PKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:16)。
TIGIT胞外区包括如下所示的氨基酸序列：
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFcIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP(SEQ ID NO:17)。
连接肽3包括如下所示的氨基酸序列：
GGGGS(SEQ ID NO:18)。
第二Fc区包括如下所示的氨基酸序列：
PKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:19)。
实施例2双特异抗体与Jurkat T细胞的结合能力鉴定
本实施例使用流式细胞术检测双特异抗体的结合特性，并基于双特异抗体加入后信号的强弱用于判断双特异抗体和Jurkat的结合特性。具体的实验操作如下：
用PBS将Jurkat T细胞稀释为1×106/mL，以90μL/管的体积加于1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管小鼠血清，于4℃封闭30min。封闭结束后，向所述稀释后的Jurkat T细胞分别加入一系列浓度梯度(10-3、10-2、10-1、100、101、102μg/mL)的双特异抗体或IgG(对照IgG1，Biolegend，QA16A12)10μL/管，于4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，于4℃、100g条件下离心5min，弃尽上清，再用PBS洗一遍沉淀，离心后弃尽上清，用100μL/管PBS重悬细胞，向重悬后的细胞中加入1μL/管Alexa-647标记的小鼠抗人Fc抗体二抗(Biolegend，HP6017)，4℃、避光条件下孵育30min。孵育结束后，用PBS洗两遍，离心后弃尽上清；用200μL/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，具体的实验结果如图2所示，说明本发明双特异抗体能够结合Jurkat T细胞。
实施例3双特异抗体与CHO-K1-CD155细胞的结合能力鉴定
本实施例使用流式细胞术检测双特异抗体的结合特性，并基于双特异抗体加入后信号的强弱用于判断双特异抗体和CHO-K1-CD155细胞的结合特性。具体的实验操作如下：
HEK293T细胞按照5×105细胞/孔铺六孔板，用不含双抗的DMEM培养基培养过夜。转染前弃去培养基，加入1mL新鲜的不含双抗的DMEM培养基。将pLVX-CD155-IRES-puro(pLVX-EF1a-IRES-puro载体的酶切位点EcoRI与BamHI之间插入有CD155蛋白(SEQ ID NO:20)的编码序列、pMD2G、psPAX2载体(共3μg)按照2:1:1的比例加入200μL无血清DMEM培养基中，加入12μg聚醚酰亚胺(PEI，Polysciences有限公司)，获得的CD155蛋白具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。混匀后静置16min，然后将全部液体加入铺有HEK293T细胞的六孔板中。培养6h后，弃去培养基，加入新鲜的完全DMEM培养基培养。转染48h后，收细胞培养上清，过0.45μm滤器(Millipore)，即为病毒上清。将病毒上清全部加入含有1×104个CHO-K1细胞的6孔板中，加入终浓度4μg/mL的聚凝胺(Sigma)，培养12h。随后弃尽上清，加入新鲜的完全DMEM培养基。所得细胞即为CHO-K1-CD155细胞。
编码CD155的基因包括如下所示的核苷酸序列：
ATGGCTAGAGCAATGGCAGCTGCTTGGCCACTTTTGTTGGTAGCACTCCTGGTGCTTTCATGGCCCCCACCTGGAACTGGCGATGTGGTCGTGCAGGCTCCTACCCAGGTGCCTGGTTTCTTGGGGGATTCTGTCACACTGCCATGTTACCTTCAGGTTCCTAACATGGAAGTCACTCACGTGTCCCAACTGACATGGGCTAGGCACGGTGAGTCTGGCTCCATGGCCGTGTTCCACCAGACACAGGGTCCTAGTTATTCAGAGTCCAAACGCTTGGAGTTTGTCGCCGCAAGACTGGGGGCTGAGTTGAGGAATGCAAGCCTGCGGATGTTCGGACTTCGGGTCGAAGATGAAGGGAACTACACCTGCTTGTTTGTTACCTTTCCTCAGGGTAGCAGATCCGTTGACATATGGTTGAGAGTACTGGCCAAGCCACAGAATACTGCAGAGGTCCAGAAGGTCCAGTTGACAGGCGAACCTGTGCCAATGGCAAGATGCGTTTCCACCGGTGGTAGACCACCAGCTCAGATTACTTGGCATAGTGACCTGGGCGGGATGCCTAACACATCTCAAGTGCCTGGCTTTTTGTCAGGCACCGTCACTGTGACCTCCCTTTGGATCCTGGTTCCAAGTTCTCAGGTTGACGGCAAAAACGTAACATGCAAGGTGGAGCATGAGAGCTTTGAGAAGCCACAGCTCCTTACCGTGAATCTCACCGTGTATTACCCTCCTGAGGTGTCTATCAGCGGATATGACAACAACTGGTATCTCGGGCAGAATGAGGCAACCCTGACCTGTGATGCTCGCAGTAATCCTGAGCCCACCGGGTATAATTGGAGCACTACCATGGGCCCACTTCCCCCTTTCGCTGTGGCTCAGGGCGCACAACTGCTTATTCGGCCTGTAGATAAGCCCATTAACACCACTTTGATCTGTAACGTGACTAATGCTTTGGGAGCTCGCCAGGCCGAATTGACCGTACAGGTGAAAGAAGGTCCTCCTTCCGAGCATTCCGGCATTTCCCGAAACGCCATCATTTTTCTGGTGCTGGGTATCCTGGTGTTTCTGATCTTGTTGGGGATCGGTATCTACTTTTACTGGTCCAAATGCAGCCGCGAAGTCCTGTGGCACTGCCATCTGTGCCCAAGTTCTACTGAGCACGCCTCTGCCTCCGCAAATGGTCACGTGTCCTACAGTGCTGTGTCTAGAGAGAACTCATCTAGTCAGGATCCTCAGACTGAGGGTACTCGG(SEQ ID NO:20)。
CD155蛋白包括如下所示的氨基酸序列：
MARAMAAAWPLLLVALLVLSWPPPGTGDVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGISRNAIIFLVLGILVFLILLGIGIYFYWSKCSREVLWHCHLCPSSTEHASASANGHVSYSAVSRENSSSQDPQTEGTR(SEQ ID NO:12)。
用PBS将CHO-K1-CD155细胞稀释为1×106/mL，以90μL/管的体积加于1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管小鼠血清，于4℃封闭30min。封闭结束后，向上述CHO-K1-CD155细胞分别加入一系列浓度梯度(10-3、10-2、10-1、100、101、102μg/mL)的双特异抗体或IgG(对照IgG1，Biolegend，QA16A12)10μL/管，于4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，于4℃、100g条件下离心5min，弃尽上清，再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清，用100μL/管PBS重悬细胞，向其中加入1μL/管Alexa-647标记的小鼠抗人Fc抗体二抗(Biolegend，HP6017)，4℃、避光条件下孵育30min。用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μL/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，具体的实验结果如图3所示，进一步显示本发明的双特异抗体能够结合CHO-K1-CD155细胞。
实施例4双特异抗体与NCI-H1299肺癌细胞的结合能力鉴定
本实施例使用流式细胞术检测双特异抗体的结合特性，并基于双特异抗体加入后信号的强弱用于判断双特异抗体和NCI-H1299细胞的结合特性。具体实验操作如下：
用PBS将NCI-H1299细胞稀释为1×106/mL，以90μL/管的体积加于1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管小鼠血清，于4℃封闭30min。封闭结束后，分别加入一系列浓度梯度(10-3、10-2、10-1、100、101、102μg/mL)的双特异抗体或IgG(对照IgG1，Biolegend，QA16A12)10μL/管，于4℃孵育30min。孵育结束后，向EP管中加入1mL PBS，于4℃、100g条件下离心5min，弃尽上清，再用PBS洗一遍沉淀。离心后弃尽上清，用100μL/管PBS重悬细胞，向其中加入1μL/管Alexa-647标记的小鼠抗人Fc抗体二抗(Biolegend，HP6017)，4℃、避光孵育30min。用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μL/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，具体的实验结果如图4所示，进一步显示本发明的双特异抗体能够结合NCI-H1299细胞。
实施例5双特异抗体促进PBMC杀伤肿瘤细胞
本实施例检测实施例1获得的双特异性抗体对PBMC杀伤肿瘤细胞组(肺癌NCI-H1299细胞、NCI-H358细胞、肝癌HepG2细胞)的影响，通过构建所述肿瘤细胞+PBMC+双特异性抗体的反应体系进行检测，具体实验操作如下：
(1)向16孔RTCA板中加入完全DMEM培养基，上机校准；
(2)用完全DMEM培养基分别将上述肿瘤细胞稀释为2×105/mL，加入步骤(1)获得的RTCA板中，添加体积为50μL/孔，然后于37℃、5％CO2条件下使用xCELLigence RTCA TP设备检测细胞系数24h；
(3)用完全DMEM将实施例1制备获得的特异抗体稀释为一系列浓度梯度(0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL)后，将其加入步骤(2)获得的RTCA板中，添加体积为20μL/孔；
(4)用完全DMEM培养基将PBMC稀释为1.25×106个细胞/mL，加入步骤(3)获得的RTCA板中，添加体积为80μL/孔；
(5)于37℃、5％CO2条件下使用xCELLigence RTCA TP设备检测细胞系数72h。
具体的实验结果如图5、图6、图7所示，进一步显示本发明的双特异抗体能够促进PBMC杀伤表达CD155的肺癌NCI-H1299细胞、NCI-H358细胞及肝癌HepG2细胞。
由以上实验结果可以看出，本发明得到的双特异抗体能够与T细胞、肿瘤细胞进行结合，并促进T细胞杀伤肿瘤细胞。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 合肥天港免疫药物有限公司
<120> 重组抗体及其应用
<130> HI5210690
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1
<400> 1
gaggttcaac tgctcgaatc tggaggtggt ttggtgcaac ctggtggatc actgaagctg 60
agctgcgcag ctagcggctt cacctttaat acttacgcta tgaattgggt aagacaggcc 120
ccaggaaagg gactggaatg ggtggccagg attaggtcta agtacaataa ttacgcaact 180
tattatgccg attccgtgaa agatcgcttc accattagcc gggatgactc taaaaacacc 240
gcatatctgc agatgaacaa tctgaaaacc gaggacactg ctgtgtacta ctgcgttcgc 300
cacggcaact tcggaaactc ttatgtgagt tggttcgctt actggggtca gggcaccttg 360
gtgaccgtca gtagtggagg tggaggctca ggaggaggtg gatctggcgg aggaggatca 420
gagctggtgg tgacacagga gccttctttg acagtctctc caggagggac agtaacactg 480
acatgccgga gcagcactgg agctgtcacc acaagtaact acgctaactg ggtacaacaa 540
aagcctgggc aggcacctag ggggttgatt gggggaacta acaagcgcgc cccaggaacc 600
cctgcaagat tctctggcag cttgcttggc gggaaagctg cactgaccct ttctggagtg 660
cagcccgagg acgaggcaga atattactgt gctctgtggt actcaaacct ctgggtgttc 720
gggggaggaa ccaagcttac tgtgctcggc gggggaggca gtcctaaatc atgcgacaaa 780
actcatacat gtccaccttg tcctgctcct gaagctgccg ggggaccttc agtgttcctg 840
tttccaccta agcccaaaga taccttgatg atttctcgaa ccccagaggt gacttgcgtg 900
gtagtcgatg tctcccacga agatcccgag gtgaaattca actggtacgt ggacggcgtg 960
gaggtgcaca atgctaagac aaagccccga gaggaacagt ataatagtac ctatcgcgtg 1020
gttagcgtcc ttactgtgtt gcatcaggac tggctgaatg gaaaggaata caagtgcaag 1080
gtatcaaata aggccctccc agctcccatc gagaaaacta tttccaaggc caagggtcag 1140
ccaagggagc cacaggtcta caccttgccc cctagtcggg aagaaatgac caaaaaccag 1200
gtgagtctgt ggtgcctggt taagggtttc tacccctctg atattgcagt ggagtgggag 1260
tcaaacggcc agccagagaa caactataag acaacccctc cagtgctgga ctcagacggg 1320
tctttctttc tctatagcaa actgactgtc gacaagagca ggtggcagca agggaacgtc 1380
ttcagctgct cagtgatgca tgaggcactg cataaccact atactcaaaa aagcctgtct 1440
ctgagccctg gcaaa 1455
<210> 2
<211> 1068
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2
<400> 2
atgatgacag gcaccattga aaccaccggg aacatttcag ccgaaaaggg tggcagcatc 60
atcctgcagt gtcatctgtc tagtactaca gcccaggtga cccaggtgaa ttgggagcag 120
caggaccagc tgctggcaat ctgtaacgcc gacctcggtt ggcatattag ccccagtttc 180
aaggataggg tcgcacccgg ccccggattg ggcctgacac tccagagcct gaccgtgaac 240
gatacaggtg aatacttttg tatttaccac acataccctg acggaacata tactggtagg 300
atattcctcg aggtgctgga atcttcagtg gccgagcacg gggctcggtt tcagattcct 360
ggaggtggag ggagtcccaa gagttgtgat aagacacata catgccctcc ctgcccagca 420
cccgaagcag ctggaggccc aagtgtgttc ctgttccctc ctaaacctaa ggacaccctg 480
atgatctcac gcactcctga ggttacctgc gtggtagtgg atgtgtccca cgaagacccc 540
gaggtgaaat tcaactggta cgtcgatgga gtcgaagtcc ataacgccaa gaccaagcca 600
cgtgaggagc agtacaattc aacataccga gtggtgagtg tgctgaccgt cctccaccag 660
gactggctga acgggaaaga gtacaagtgt aaggtgtcta ataaagcatt gcccgccccc 720
atcgagaaga caatttcaaa ggctaaaggt cagccacgag aaccccaagt ttataccctg 780
cctcccagcc gggaggagat gaccaagaat caggtcagtc tttcttgtgc cgtgaagggt 840
ttttacccct ccgacatcgc cgtggagtgg gagtcaaacg ggcagcccga gaataattat 900
aagacaacac caccagtgct ggactccgat ggaagctttt tcctggtgtc caagctcact 960
gtcgacaagt ctaggtggca acagggaaat gtgttctcat gttccgtaat gcacgaggcc 1020
ctccataacc actatactca aaagagcctg agcctgagtc ccggcaag 1068
<210> 3
<211> 485
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys
245 250 255
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
275 280 285
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
290 295 300
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
305 310 315 320
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
325 330 335
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
340 345 350
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
355 360 365
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
370 375 380
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
385 390 395 400
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
405 410 415
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
420 425 430
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
435 440 445
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
450 455 460
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
465 470 475 480
Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 4
<211> 356
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4
<400> 4
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys Ser
115 120 125
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
130 135 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
145 150 155 160
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
165 170 175
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
180 185 190
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
195 200 205
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
210 215 220
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
245 250 255
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
260 265 270
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
275 280 285
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
290 295 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
305 310 315 320
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
325 330 335
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
340 345 350
Ser Pro Gly Lys
355
<210> 5
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<212> DNA
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<220>
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<400> 5
ggaggttcaa ctgctcgaat ctggaggtgg tttggtgcaa cctggtggat cactgaagct 60
gagctgcgca gctagcggct tcacctttaa tacttacgct atgaattggg taagacaggc 120
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cgcatatctg cagatgaaca atctgaaaac cgaggacact gctgtgtact actgcgttcg 300
ccacggcaac ttcggaaact cttatgtgag ttggttcgct tactggggtc agggcacctt 360
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gagctggtgg tgacacagga gccttctttg acagtctctc caggagggac agtaacactg 480
acatgccgga gcagcactgg agctgtcacc acaagtaact acgctaactg ggtacaacaa 540
aagcctgggc aggcacctag ggggttgatt gggggaacta acaagcgcgc cccaggaacc 600
cctgcaagat tctctggcag cttgcttggc gggaaagctg cactgaccct ttctggagtg 660
cagcccgagg acgaggcaga atattactgt gctctgtggt actcaaacct ctgggtgttc 720
gggggaggaa ccaagcttac tgtgctc 747
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6
<400> 6
gaggtggagg ctcaggagga ggtggatctg gcggaggagg atca 44
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7
<400> 7
ggcgggggag gcagt 15
<210> 8
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 8
<400> 8
cctaaatcat gcgacaaaac tcatacatgt ccaccttgtc ctgctcctga agctgccggg 60
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<220>
<223> 9
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aaggataggg tcgcacccgg ccccggattg ggcctgacac tccagagcct gaccgtgaac 240
gatacaggtg aatacttttg tatttaccac acataccctg acggaacata tactggtagg 300
atattcctcg aggtgctgga atcttcagtg gccgagcacg gggctcggtt tcagattcct 360
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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cccaagagtt gtgataagac acatacatgc cctccctgcc cagcacccga agcagctgga 60
ggcccaagtg tgttcctgtt ccctcctaaa cctaaggaca ccctgatgat ctcacgcact 120
cctgaggtta cctgcgtggt agtggatgtg tcccacgaag accccgaggt gaaattcaac 180
tggtacgtcg atggagtcga agtccataac gccaagacca agccacgtga ggagcagtac 240
aattcaacat accgagtggt gagtgtgctg accgtcctcc accaggactg gctgaacggg 300
aaagagtaca agtgtaaggt gtctaataaa gcattgcccg cccccatcga gaagacaatt 360
tcaaaggcta aaggtcagcc acgagaaccc caagtttata ccctgcctcc cagccgggag 420
gagatgacca agaatcaggt cagtctttct tgtgccgtga agggttttta cccctccgac 480
atcgccgtgg agtgggagtc aaacgggcag cccgagaata attataagac aacaccacca 540
gtgctggact ccgatggaag ctttttcctg gtgtccaagc tcactgtcga caagtctagg 600
tggcaacagg gaaatgtgtt ctcatgttcc gtaatgcacg aggccctcca taaccactat 660
actcaaaaga gcctgagcct gagtcccggc aag 693
<210> 12
<211> 417
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12
<400> 12
Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln
20 25 30
Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro
35 40 45
Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu
50 55 60
Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln
65 70 75 80
Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly
100 105 110
Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe
115 120 125
Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys
130 135 140
Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro
145 150 155 160
Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln
165 170 175
Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val
180 185 190
Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu
195 200 205
Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu
210 215 220
His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr
245 250 255
Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro
260 265 270
Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro
275 280 285
Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys
290 295 300
Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala
305 310 315 320
Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu
325 330 335
His Ser Gly Ile Ser Arg Asn Ala Ile Ile Phe Leu Val Leu Gly Ile
340 345 350
Leu Val Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Ile Tyr Phe Tyr Trp Ser
355 360 365
Lys Cys Ser Arg Glu Val Leu Trp His Cys His Leu Cys Pro Ser Ser
370 375 380
Thr Glu His Ala Ser Ala Ser Ala Asn Gly His Val Ser Tyr Ser Ala
385 390 395 400
Val Ser Arg Glu Asn Ser Ser Ser Gln Asp Pro Gln Thr Glu Gly Thr
405 410 415
Arg
<210> 13
<211> 249
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 13
<400> 13
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 14
<400> 14
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 15
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 16
<211> 231
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16
<400> 16
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17
<400> 17
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro
115 120
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 19
<211> 231
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19
<400> 19
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 20
<211> 1251
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20
<400> 20
atggctagag caatggcagc tgcttggcca cttttgttgg tagcactcct ggtgctttca 60
tggcccccac ctggaactgg cgatgtggtc gtgcaggctc ctacccaggt gcctggtttc 120
ttgggggatt ctgtcacact gccatgttac cttcaggttc ctaacatgga agtcactcac 180
gtgtcccaac tgacatgggc taggcacggt gagtctggct ccatggccgt gttccaccag 240
acacagggtc ctagttattc agagtccaaa cgcttggagt ttgtcgccgc aagactgggg 300
gctgagttga ggaatgcaag cctgcggatg ttcggacttc gggtcgaaga tgaagggaac 360
tacacctgct tgtttgttac ctttcctcag ggtagcagat ccgttgacat atggttgaga 420
gtactggcca agccacagaa tactgcagag gtccagaagg tccagttgac aggcgaacct 480
gtgccaatgg caagatgcgt ttccaccggt ggtagaccac cagctcagat tacttggcat 540
agtgacctgg gcgggatgcc taacacatct caagtgcctg gctttttgtc aggcaccgtc 600
actgtgacct ccctttggat cctggttcca agttctcagg ttgacggcaa aaacgtaaca 660
tgcaaggtgg agcatgagag ctttgagaag ccacagctcc ttaccgtgaa tctcaccgtg 720
tattaccctc ctgaggtgtc tatcagcgga tatgacaaca actggtatct cgggcagaat 780
gaggcaaccc tgacctgtga tgctcgcagt aatcctgagc ccaccgggta taattggagc 840
actaccatgg gcccacttcc ccctttcgct gtggctcagg gcgcacaact gcttattcgg 900
cctgtagata agcccattaa caccactttg atctgtaacg tgactaatgc tttgggagct 960
cgccaggccg aattgaccgt acaggtgaaa gaaggtcctc cttccgagca ttccggcatt 1020
tcccgaaacg ccatcatttt tctggtgctg ggtatcctgg tgtttctgat cttgttgggg 1080
atcggtatct acttttactg gtccaaatgc agccgcgaag tcctgtggca ctgccatctg 1140
tgcccaagtt ctactgagca cgcctctgcc tccgcaaatg gtcacgtgtc ctacagtgct 1200
gtgtctagag agaactcatc tagtcaggat cctcagactg agggtactcg g 1251

Claims (22)

1.一种重组抗体，其特征在于，所述重组抗体为双链抗体，包括：
第一条肽链，包含：CD3单链抗体和第一Fc区，所述CD3单链抗体包括重链可变区、轻链可变区；以及
第二条肽链，包含：TIGIT胞外区和第二Fc区；
其中，所述CD3单链抗体的C端与所述第一Fc区的N端相连，所述TIGIT胞外区的C端与所述第二Fc区的N端相连。
2.根据权利要求1所述的重组抗体，其特征在于，进一步包括连接肽1，所述连接肽1的N端与所述重链可变区的C端相连，所述连接肽1的C端与所述轻链可变区的N端相连；
任选地，所述连接肽1包括SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组抗体，其特征在于，进一步包括连接肽2，所述连接肽2的N端与所述轻链可变区的C端相连，所述连接肽2的C端与所述第一Fc区的N端相连；
任选地，所述连接肽2包括SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组抗体，其特征在于，进一步包括连接肽3，所述连接肽3的N端与所述TIGIT胞外区的C端相连，所述连接肽3的C端与所述第二Fc区的N端相连；
任选地，所述连接肽3包括SEQ ID NO：18示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的重组抗体，其特征在于，所述第一Fc区和第二Fc区通过knobinto hole结构进行连接。
6.根据权利要求5所述的重组抗体，其特征在于，所述第一Fc区与野生型IgG1 Fc区相比具有缺少CH1区、T366W突变中的至少之一，所述第二Fc区与野生型IgG1 Fc区相比具有缺少CH1区、T366S、L368A、Y407V突变中的至少之一。
7.根据权利要求5或6所述的重组抗体，其特征在于，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一，
任选地，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源IgG或其突变体；
任选地，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自人源IgG1或其突变体。
8.根据权利要求5-7任一项所述的重组抗体，其特征在于，所述第一抗体Fc区具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述第二抗体Fc区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8任一项所述的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体的具有SEQ IDNO：3、4所示的氨基酸序列。
10.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1～9任一项所述的重组抗体。
11.根据权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQ ID NO：1、2所示的核苷酸序列。
12.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求10或11所述的核酸。
13.一种制备权利要求1～9任一项所述的重组抗体的方法，其特征在于，包括：
将权利要求12所述的表达载体引入到细胞中；
将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组抗体；
任选地，所述细胞为真核细胞。
14.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求10或11所述的核酸或权利要求12所述的表达载体。
15.一种组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～9任一项所述的重组抗体、权利要求10或11所述的核酸、权利要求12所述的表达载体或权利要求14所述的重组细胞。
16.权利要求1～9任一项所述的重组抗体、权利要求10或11所述的核酸、权利要求12所述的表达载体、权利要求14所述的重组细胞或权利要求15所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述癌症包括下列中的至少之一：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。
18.一种药物，其特征在于，包括：权利要求1～9任一项所述的重组抗体、权利要求10或11所述的核酸、权利要求12所述的表达载体、权利要求14所述的重组细胞或权利要求15所述的组合物，所述药物用于治疗癌症。
19.根据权利要求18所述的药物，其特征在于，所述癌症包括下列中的至少之一：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。
20.权利要求1～9任一项所述的重组抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD3和/或CD155。
21.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～9任一项所述的重组抗体。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测CD3和/或CD155。
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