CN112969717A - 与工程化Fc-抗原结合结构域构建体有关的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及工程化Fc‑抗原结合结构域构建体的组合物和方法，其中所述Fc‑抗原结合结构域构建体包括至少两个Fc结构域和至少一个抗原结合结构域。

Description

与工程化Fc-抗原结合结构域构建体有关的组合物和方法
背景技术
许多治疗性抗体通过Fc结构域的效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC))募集先天免疫系统的元件而发挥作用。一直需要改进的治疗性蛋白质。
发明内容
本公开的特征在于用于将抗原结合结构域的靶特异性与至少两个Fc结构域组合以产生具有独特生物活性的新治疗剂的组合物和方法。本文所述的组合物和方法允许构建由数条多肽链组成并且具有多个具有不同靶标特异性的抗原结合结构域(即双特异性、三特异性或多特异性蛋白)和来自多个多肽链的多个Fc结构域的构建体。可以调节抗原结合结构域的数量和靶标特异性和间隔以改变构建体对靶抗原的结合特性(例如，结合亲合力)，并且可以调节Fc结构域的数量以控制效应子功能杀死抗原结合细胞的强度。将突变(即，如本文所述的异二聚化和/或同二聚化突变)引入构建体的多肽中，以减少产生的不期望的、可另选地组装的蛋白复合物的数量。在一些情况下，将异二聚化或同二聚化突变引入Fc结构域单体中(优选地在CH3结构域中)，并且将差异突变的Fc结构域单体置于组装成构建体的不同多肽链之间，以便控制多肽链组装成期望的构建体。这些突变选择性地使某些Fc结构域单体的期望配对稳定，并且选择性地使其他Fc结构域单体的不期望配对不稳定。在一些情况下，Fc-抗原结合结构域构建体是由包含多个Fc结构域单体(其中至少两个Fc单体包含不同的异二聚化突变(因此在序列上彼此不同))的第一多肽(例如，较长多肽，具有两个或更多个具有不同异二聚化突变的Fc单体)和各自包含至少一个Fc单体的至少两个附加多肽(其中附加多肽的Fc单体包含彼此不同的异二聚化突变(因此包含不同的序列))(例如，两个较短多肽，各自包含单个具有不同异二聚化突变的Fc结构域单体)形成的“正交”Fc-抗原结合结构域构建体。附加多肽的异二聚化突变与第一多肽的至少Fc单体的异二聚化突变相容。
在一些情况下，本公开设想将两个或更多个抗原结合结构域(例如，治疗性抗体的抗原结合结构域)与至少两个Fc结构域组合以产生新型治疗剂。在一些情况下，抗原结合结构域是相同的。在一些情况下，抗原结合结构域是不同的。为了产生此类构建体，本公开提供了用于组装具有至少两个(例如，多个)Fc结构域的构建体的各种方法，并且为了控制此类构建体的同二聚化和异二聚化，本公开提供了用于由有限数量的多肽链组装不同大小的分子的各种方法，所述多肽也是本公开的主题。这些构建体的特性允许有效产生基本上同质的药物组合物。药物组合物中的此类同质性是期望的，以便确保药物组合物的安全性、功效、均匀性和可靠性。在一些实施方案中，本文所述的具有至少两个Fc结构域的新型治疗性构建体具有比具有单个Fc结构域的治疗性蛋白质更大的生物活性。
在第一方面，本公开的特征在于包括增强的效应子功能的Fc-抗原结合结构域构建体，其中该Fc-抗原结合结构域构建体包括至少两个抗原结合结构域，例如两个、三个、四个或五个抗原结合结构域，并且第一Fc结构域通过接头与第二Fc结构域连接。在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域具有不同的靶标特异性。在一些情况下，Fc-抗原结合结构域构建体相对于具有单个Fc结构域和至少两个抗原结合结构域的构建体在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中具有增强的效应子功能。
在一个方面，本公开涉及一种多肽，其包含：具有第一特异性的抗原结合结构域；第一接头；第一IgG1 Fc结构域单体，其包含第一异二聚化选择性模块；第二接头；第二IgG1Fc结构域单体，其包含第二异二聚化选择性模块；任选的第三接头；以及任选的第三IgG1Fc结构域单体，其中第一异二聚化选择性模块和第二异二聚化选择性模块是不同的。
在一些实施方案中，该多肽包含第三接头和第三IgG Fc结构域单体，其中第三IgG1 Fc结构域单体包含同二聚化选择性模块或与第一异二聚化选择性模块或第二异二聚化选择性模块相同的异二聚化选择性模块。
在一些实施方案中，该多肽按该顺序包含：具有第一特异性的抗原结合结构域；第一接头；第一IgG1 Fc结构域单体，其包含第一异二聚化选择性模块；第二接头；第二IgG1Fc结构域单体，其包含第二异二聚化选择性模块；任选的第三接头；以及第三IgG1 Fc结构域单体。
在一些实施方案中，该多肽按该顺序包含：具有第一特异性的抗原结合结构域；第一接头；第一IgG1 Fc结构域单体，其包含第一异二聚化选择性模块；第三接头；第三IgG1Fc结构域单体；第二接头；以及第二IgG1 Fc结构域单体，其包含第二异二聚化选择性模块。
在一些实施方案中，该多肽按该顺序包含：具有第一特异性的抗原结合结构域；第三接头；第三IgG1 Fc结构域单体；第一接头；第一IgG1 Fc结构域单体，其包含第一异二聚化选择性模块；第二接头；以及第二IgG1Fc结构域单体，其包含第二异二聚化选择性模块。
在一些实施方案中，该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中第一IgG1 Fc结构域单体和第二IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变，并且第三IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
在一些实施方案中，该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中第一IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变，并且第二IgG1结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
在一些实施方案中，该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中第二IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变，并且第一IgG1结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
在一些实施方案中，该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中两个IgG1 Fc结构域单体各自包含两个或四个反向电荷突变，并且一个IgG1 Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变。
在一些实施方案中，该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中两个IgG1 Fc结构域单体各自包含形成工程化突起的突变，并且一个IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
在一些实施方案中，包含形成工程化突起的突变的IgG1 Fc结构域单体还包含一个、两个或三个反向电荷突变。在一些实施方案中，该多肽的包含形成工程化突起的突变的IgG1 Fc结构域单体各自具有相同的形成突起的突变。在一些实施方案中，该多肽的包含两个或四个反向电荷突变但不包含突起形成突变的IgG1 Fc结构域单体各自具有相同的反向电荷突变。
在一些实施方案中，形成工程化突起的突变和反向电荷突变在CH3结构域中。在一些实施方案中，突变在从EU位置G341到EU位置K447的序列内，包括端点。在一些实施方案中，突变是单一氨基酸变化。
在一些实施方案中，第二接头和任选的第三接头包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成：
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG和GGGGGGGGGGGGGGGG。在一些实施方案中，第二接头和任选的第三接头是甘氨酸间隔物。在一些实施方案中，第二接头和任选的第三接头独立地由4至30、4至20、8至30、8至20、12至20或12至30个甘氨酸残基组成。在一些实施方案中，第二接头和任选的第三接头由20个甘氨酸残基组成。
在一些实施方案中，至少一个Fc结构域单体在EU位置I253处包含单一氨基酸突变。在一些实施方案中，EU位置I253处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组：I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y。在一些实施方案中，位置I253处的每个氨基酸突变是I253A。
在一些实施方案中，至少一个Fc结构域单体在EU位置R292处包含单一氨基酸突变。在一些实施方案中，EU位置R292处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组：R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y。在一些实施方案中，位置R292处的每个氨基酸突变是R292P。
在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的铰链独立地包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成：EPKSCDKTHTCPPCPAPELL和DKTHTCPPCPAPELL。在一些实施方案中，第二Fc结构域单体和第三Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL。在一些实施方案中，第一Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL。在一些实施方案中，第一Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL，并且第二Fc结构域单体和第三Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL。
在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH2结构域独立地包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK，其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK，其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK，其具有不超过两个单一氨基酸置换。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK。
在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过10个单一氨基酸置换。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过8个单一氨基酸置换。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过6个单一氨基酸置换。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过5个单一氨基酸置换。
在一些实施方案中，单一氨基酸置换选自由以下项组成的组：S354C、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有多至10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，多至6个单一氨基酸置换是CH3结构域中的反向电荷突变或是形成工程化突起的突变。在一些实施方案中，单一氨基酸置换在从EU位置G341到EU位置K447的序列内，包括端点。
在一些实施方案中，至少一个形成工程化突起的突变选自由以下项组成的组：S354C、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T和T394F。在一些实施方案中，两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
在一些实施方案中，抗原结合结构域是scFv。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含VH结构域和CH1结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域还包含VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域包含表1A或表1B中列出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列。在一些实施方案中，VH结构域包含含有表2中列出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且该VH序列不包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中列出的抗体的VH序列具有至少95％或98％的同一性。在一些实施方案中，VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表1A或表1B中列出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含来自表2中列出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且该VL结构域包含表2中列出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中VH结构域和VL结构域序列不包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中列出的抗体的VH和VL序列具有至少95％或98％的同一性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表2中列出的抗体的一组VH和VL序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含IgG CL抗体恒定结构域和IgG CH1抗体恒定结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含VH结构域和CH1结构域，并且可以与包含VL结构域和CL结构域的多肽结合以形成Fab。
在一些实施方案中，本公开涉及一种多肽复合物，其包含前述实施方案中任一项的多肽的两个拷贝，这两个拷贝通过每个多肽的IgG1 Fc结构域单体的铰链内的半胱氨酸残基之间的二硫键连接。在一些实施方案中，多肽的每个拷贝相同地包含具有选自以下项的两个或四个反向电荷突变的Fc结构域单体：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K，其中多肽的两个拷贝在具有这些反向电荷突变的Fc结构域单体处连接。
在一些实施方案中，本公开涉及一种多肽复合物，其包含与第二多肽连接的前述实施方案中任一项的多肽，该第二多肽包含IgG1 Fc结构域单体，其中多肽和第二多肽通过多肽的第一IgG1 Fc结构域单体、第二IgG1Fc结构域单体或第三IgG1 Fc结构域单体的铰链结构域内的半胱氨酸残基与第二多肽的铰链结构域内的半胱氨酸残基之间的二硫键连接。
在一些实施方案中，第二多肽IgG1 Fc单体包含形成工程化空腔的突变。在一些实施方案中，形成工程化空腔的突变选自由以下项组成的组：Y407T、Y407A、F405A、T394S、T394W/Y407A、T366W/T394S、T366S/L368A/Y407V/Y349C、S364H/F405A。在一些实施方案中，第二多肽单体还包含至少一个反向电荷突变。在一些实施方案中，至少一个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。在一些实施方案中，第二多肽单体包含两个或四个反向电荷突变，其中两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。在一些实施方案中，第二多肽包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有多至10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二多肽还包含具有第一特异性或第二特异性的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域具有第二特异性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含抗体重链可变结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是scFv。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含VH结构域和CH1结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域还包含VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域包含表1A或表1B中列出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列。在一些实施方案中，VH结构域包含含有表2中列出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且该VH序列不包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中列出的抗体的VH序列具有至少95％或98％的同一性。在一些实施方案中，VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表1A或表1B中列出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含来自表2中列出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且该VL结构域包含表2中列出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中VH结构域和VL结构域序列不包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中列出的抗体的VH和VL序列具有至少95％或98％的同一性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表2中列出的抗体的VH和VL序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含IgG CL抗体恒定结构域和IgG CH1抗体恒定结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含VH结构域和CH1结构域，并且可以与包含VL结构域和CL结构域的多肽结合以形成Fab。
在一些实施方案中，多肽复合物还与第三多肽连接，该第三多肽包含IgG1 Fc结构域单体，该IgG1 Fc结构域单体包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中多肽和第三多肽通过多肽的第一IgG1 Fc结构域单体、第二IgG1 Fc结构域单体或第三IgG1 Fc结构域单体的铰链结构域内的半胱氨酸残基与第三多肽的铰链结构域内的半胱氨酸残基之间的二硫键连接，其中第二多肽和第三多肽与多肽的不同IgG1 Fc结构域单体连接。
在一些实施方案中，第三多肽单体包含两个或四个反向电荷突变，其中两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。在一些实施方案中，第三多肽包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有多至10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第三多肽还包含具有第二特异性或第三特异性的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域具有第三特异性。
在一些实施方案中，多肽复合物相对于具有单个Fc结构域和至少两个具有不同特异性的抗原结合结构域的多肽复合物在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中包含增强的效应子功能。
在另一方面，本公开涉及一种多肽，其包含：第一IgG1 Fc结构域单体，其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域；第二接头；第二IgG1 Fc结构域单体，其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域；任选的第三接头；以及任选的第三IgG1 Fc结构域单体，其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中至少一个Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变，并且其中至少一个Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
在一些实施方案中，第一IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变，并且第二IgG1 Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变。在一些实施方案中，第一IgG1 Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变，并且第二IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
在一些实施方案中，该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中第一IgG1 Fc结构域单体和第二IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变，并且第三IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
在一些实施方案中，该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中第一IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变，并且第二IgG1结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
在一些实施方案中，该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中第二IgG1 Fc结构域单体和第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变，并且第一IgG1结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
在一些实施方案中，该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中两个IgG1 Fc结构域单体各自包含两个或四个反向电荷突变，并且一个IgG1 Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变。
在一些实施方案中，该多肽包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中两个IgG1 Fc结构域单体各自包含形成工程化突起的突变，并且一个IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
在一些实施方案中，包含形成工程化突起的突变的IgG1 Fc结构域单体还包含一个、两个或三个反向电荷突变。在一些实施方案中，该多肽的包含形成工程化突起的突变的IgG1 Fc结构域单体各自具有相同的形成突起的突变。在一些实施方案中，该多肽的包含两个或四个反向电荷突变但不包含突起形成突变的IgG1 Fc结构域单体各自具有相同的反向电荷突变。
在一些实施方案中，形成工程化突起的突变和反向电荷突变在CH3结构域中。在一些实施方案中，突变在从EU位置G341到EU位置K447的序列内，包括端点。在一些实施方案中，突变是单一氨基酸变化。
在一些实施方案中，第二接头和任选的第三接头包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成：
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG和GGGGGGGGGGGGGGGG。在一些实施方案中，第二接头和任选的第三接头是甘氨酸间隔物。在一些实施方案中，第二接头和任选的第三接头独立地由4至30、4至20、8至30、8至20、12至20或12至30个甘氨酸残基组成。在一些实施方案中，第二接头和任选的第三接头由20个甘氨酸残基组成。
在一些实施方案中，至少一个Fc结构域单体在EU位置I253处包含单一氨基酸突变。在一些实施方案中，EU位置I253处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组：I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y。在一些实施方案中，位置I253处的每个氨基酸突变是I253A。
在一些实施方案中，至少一个Fc结构域单体在EU位置R292处包含单一氨基酸突变。在一些实施方案中，EU位置R292处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组：R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y。在一些实施方案中，位置R292处的每个氨基酸突变是R292P。
在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的铰链独立地包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成：EPKSCDKTHTCPPCPAPELL和DKTHTCPPCPAPELL。在一些实施方案中，第二Fc结构域单体和第三Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL。在一些实施方案中，第一Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL。在一些实施方案中，第一Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL，并且第二Fc结构域单体和第三Fc结构域单体的铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL。
在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH2结构域独立地包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK，其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK，其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK，其具有不超过两个单一氨基酸置换。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK。
在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过10个单一氨基酸置换。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过8个单一氨基酸置换。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过6个单一氨基酸置换。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体的CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过5个单一氨基酸置换。
在一些实施方案中，单一氨基酸置换选自由以下项组成的组：S354C、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。在一些实施方案中，每个Fc结构域单体独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有多至10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，多至6个单一氨基酸置换是CH3结构域中的反向电荷突变或是形成工程化突起的突变。在一些实施方案中，单一氨基酸置换在从EU位置G341到EU位置K447的序列内，包括端点。在一些实施方案中，至少一个形成工程化突起的突变选自由以下项组成的组：S354C、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T和T394F。在一些实施方案中，两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
在一些实施方案中，本公开涉及一种多肽复合物，其包含前述实施方案中任一项的多肽，其中多肽与第二多肽连接，该第二多肽包含具有第一特异性的抗原结合结构域和IgG1 Fc结构域单体，该IgG1 Fc结构域单体包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中多肽和第二多肽通过多肽的第一IgG1 Fc结构域单体、第二IgG1 Fc结构域单体或第三IgG1Fc结构域单体的铰链结构域内的半胱氨酸残基与第二多肽的铰链结构域内的半胱氨酸残基之间的二硫键连接，并且其中多肽还与第三多肽连接，该第三多肽包含具有第二特异性的抗原结合结构域和IgG1 Fc结构域单体，该IgG1 Fc结构域单体包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中多肽和第三多肽通过多肽的第一IgG1 Fc结构域单体、第二IgG1 Fc结构域单体或第三IgG1 Fc结构域单体的未被第二多肽连接的铰链结构域内的半胱氨酸残基与第三多肽的铰链结构域内的半胱氨酸残基之间的二硫键连接。
在一些实施方案中，第二多肽单体或第三多肽单体包含形成工程化空腔的突变。在一些实施方案中，形成工程化空腔的突变选自由以下项组成的组：Y407T、Y407A、F405A、T394S、T394W/Y407A、T366W/T394S、T366S/L368A/Y407V/Y349C、S364H/F405A。在一些实施方案中，第二多肽单体包含形成工程化空腔的突变，并且还包含至少一个反向电荷突变。在一些实施方案中，第三多肽单体包含形成工程化空腔的突变，并且还包含至少一个反向电荷突变。在一些实施方案中，至少一个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。在一些实施方案中，第二多肽单体或第三多肽单体包含两个或四个反向电荷突变，其中两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。在一些实施方案中，第三多肽单体包含两个或四个反向电荷突变，其中两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。在一些实施方案中，第二多肽单体包含两个或四个反向电荷突变，其中两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
在一些实施方案中，第二多肽包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有多至10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，第三多肽包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有多至10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域包含抗体重链可变结构域。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域是scFv。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域包含VH结构域和CH1结构域。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域还包含VL结构域。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域的VH结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域的VH结构域包含表1A或表1B中列出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域的VH结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域的VH结构域包含含有表2中列出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域的VH结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域的VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且该VH序列不包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中列出的抗体的VH序列具有至少有95％或98％的同一性。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域包含表1A或表1B中列出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域包含来自表2中列出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且该VL结构域包含表2中列出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中VH结构域和VL结构域序列不包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中列出的抗体的VH和VL序列具有至少95％或98％的同一性。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域包含表2中列出的抗体的VH和VL序列。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域包含IgG CL抗体恒定结构域和IgG CH1抗体恒定结构域。在一些实施方案中，具有第一特异性的抗原结合结构域和/或具有第二特异性的抗原结合结构域包含VH结构域和CH1结构域，并且可以与包含VL结构域和CL结构域的多肽结合以形成Fab。
在一些实施方案中，多肽复合物相对于具有单个Fc结构域和至少两个具有不同特异性的抗原结合结构域的多肽复合物在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中包含增强的效应子功能。
在另一方面，本公开涉及一种核酸分子，其编码前述实施方案中任一项的多肽。
在另一方面，本公开涉及一种表达载体，其包含该核酸分子。
在另一方面，本公开涉及一种宿主细胞，其包含该核酸分子。
在另一方面，本公开涉及一种宿主细胞，其包含该表达载体。
在另一方面，本公开涉及一种产生前述实施方案中任一项的多肽的方法，其包括在表达该多肽的条件下培养前述实施方案中任一项的宿主细胞。
在一些实施方案中，该宿主细胞还包含编码包含抗体VL结构域的多肽的核酸分子。在一些实施方案中，该宿主细胞还包含编码包含抗体VL结构域的多肽的核酸分子。在一些实施方案中，该宿主细胞还包含编码包含抗体VL结构域和抗体CL结构域的多肽的核酸分子。在一些实施方案中，该宿主细胞还包含编码包含抗体VL结构域和抗体CL结构域的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，该宿主细胞还包含编码具有不超过10个单一氨基酸突变的IgG1 Fc结构域单体的多肽的核酸分子。在一些实施方案中，该宿主细胞还包含编码包含具有不超过10个单一氨基酸突变的IgG1 Fc结构域单体的多肽的核酸分子。在一些实施方案中，IgG1 Fc结构域单体在CH3结构域中包含SEQ ID No:42、43、45和47中任一者具有不超过10、8、6或4个单一氨基酸突变的氨基酸序列。
在另一方面，本公开涉及一种药物组合物，其包含前述实施方案中任一项的多肽。
在一些实施方案中，该药物组合物的少于40％、30％、20％、10％、5％、2％的多肽在Fc结构域单体上具有至少一个岩藻糖修饰。
在本公开的所有方面，一些或全部Fc结构域单体(例如，包含SEQ ID No:42、43、45和47中任一者具有不超过10、8、6或4个单一氨基酸置换(例如，仅在CH3域中)的氨基酸序列的Fc结构域单体)除了具有其他氨基酸置换或修饰之外，还可以具有E345K和E430G氨基酸置换中的一者或两者。E345K和E430G氨基酸置换可以增加Fc结构域多聚化。
定义：
如本文所用，术语“Fc结构域单体”是指包括至少铰链结构域以及第二抗体恒定结构域和第三抗体恒定结构域(CH2和CH3)或它们的功能片段(例如，至少铰链结构域或其功能片段、CH2结构域或其功能片段以及CH3结构域或其功能片段)(例如，能够(i)与另一个Fc结构域单体二聚化形成Fc结构域的片段，并且(ii)与Fc受体结合的片段)的多肽。优选的Fc结构域单体从氨基到羧基末端包含IgG1铰链、IgG1 CH2结构域和IgG1 CH3结构域的至少一部分。因此，Fc结构域单体(例如，人IgG1 Fc结构域单体)可以从E316延伸到G446或K447，从P317延伸到G446或K447，从K318延伸到G446或K447，从K318延伸到G446或K447，从S319延伸到G446或K447，从C320延伸到G446或K447，从D321延伸到G446或K447，从K322延伸到G446或K447，从T323延伸到G446或K447，从K323延伸到G446或K447，从H324延伸到G446或K447，从T325延伸到G446或K447，或者从C326延伸到G446或K447。Fc结构域单体可以是任何免疫球蛋白抗体同种型，包括IgG、IgE、IgM、IgA或IgD(例如，IgG)。另外，Fc结构域单体可以是IgG亚型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)(例如，人IgG1)。人IgG1 Fc结构域单体用于本文所述的实例中。人IgG1的全铰链结构域从EU编号E316延伸到P230或L235，CH2结构域从A231或G236延伸到K340，并且CH3结构域从G341延伸到K447。对于铰链结构域的最后一个氨基酸的位置有不同的看法。它是P230或L235。在本文的许多实例中，CH3结构域不包括K347。因此，CH3结构域可以是G341至G446。在本文的许多实例中，铰链结构域可以包括E216至L235。例如，当铰链在CH1结构域或CD38结合结构域的羧基末端时，就是如此。在一些情况下，例如当铰链位于多肽的氨基末端时，EU编号221处的Asp突变为Gln。Fc结构域单体不包括免疫球蛋白的能够充当抗原识别区域的任何部分，例如可变结构域或互补决定区(CDR)。Fc结构域单体可以包含来自野生型(例如，人)Fc结构域单体序列的多达十个变化(例如，1-10、1-8、1-6、1-4个氨基酸置换、添加或缺失)，这些变化改变Fc结构域与Fc受体之间的相互作用。Fc结构域单体可以包含来自野生型Fc结构域单体序列的多达十个变化(例如，单一氨基酸变化)(例如，1-10、1-8、1-6、1-4个氨基酸置换、添加或缺失)，这些变化改变Fc结构域单体之间的相互作用。在某些实施方案中，与以下人IgG1 CH3结构域序列相比，CH3结构域上有多至10、8、6或5个单一氨基酸置换：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG。合适变化的实例是本领域已知的。
如本文所用，术语“Fc结构域”是指能够结合Fc受体的两个Fc结构域单体的二聚体。在野生型Fc结构域中，两个Fc结构域单体通过两个CH3抗体恒定结构域之间的相互作用以及在两个二聚化Fc结构域单体的铰链结构域之间形成的一个或多个二硫键而二聚化。
在本公开中，术语“Fc-抗原结合结构域构建体”是指形成至少两个如本文所述的Fc结构域并且包括至少一个“抗原结合结构域”的缔合多肽链。本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体可以包括具有相同或不同序列的Fc结构域单体。例如，Fc-抗原结合结构域构建体可以具有三个Fc结构域，其中两个包括IgG1或IgG1衍生的Fc结构域单体，并且第三个包括IgG2或IgG2衍生的Fc结构域单体。在另一个实例中，Fc-抗原结合结构域构建体可以具有三个Fc结构域，其中两个包括“突起-进入-空腔对”，并且第三个不包括“突起-进入-空腔对”，例如，第三Fc结构域包括一个或多个静电转向突变而不是突起-进入-空腔对，或者第三Fc结构域具有野生型序列(即，不包括突变)。Fc结构域形成与Fc受体(例如，FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb或FcγRIV)结合的最小结构。在一些情况下，Fc-抗原结合结构域构建体是通过将包含多个Fc结构域单体(其中至少两个Fc单体包含不同的异二聚化突变(即，Fc单体各自具有不同的突起形成突变或各自具有不同的静电转向突变，或者一个单体具有突起形成突变，而一个单体具有静电转向突变))的第一多肽与各自包含至少一个Fc单体的至少两个附加多肽(其中附加多肽的Fc单体包含彼此不同的异二聚化突变(即，附加多肽的Fc单体具有不同的突起形成突变或具有不同的静电转向突变，或者一个单体具有突起形成突变，而一个单体具有静电转向突变))连接而形成的“正交”Fc-抗原结合结构域构建体。附加多肽的异二聚化突变与第一多肽的至少Fc单体的异二聚化突变相容地缔合。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指能够特异性结合靶分子的肽、多肽或一组缔合多肽。在一些实施方案中，“抗原结合结构域”是抗体的与抗体所结合的抗原特异性结合的最小序列。表面等离子共振(SPR)或本领域已知的各种免疫测定(例如，Western印迹或ELISA)可以用于评估抗体对抗原的特异性。在一些实施方案中，“抗原结合结构域”包括抗体的可变结构域或互补决定区(CDR)，例如表1A或表1B中列出的抗体的一个或多个CDR、表2中列出的抗体的一个或多个CDR或者表2中列出的抗体的VH和/或VL结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以包括VH结构域和CH1结构域，任选地具有VL结构域。在其他实施方案中，抗原结合结构域是抗体或scFv的Fab片段。抗原结合结构域也可以是特异性结合靶标的合成工程化肽，诸如基于纤连蛋白的结合蛋白(例如，纤连蛋白III型结构域(FN3)单体)。在一些实施方案中，本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体具有两个或更多个具有不同靶标特异性的抗原结合结构域，即该Fc-抗原结合结构域构建体是双特异性、三特异性或多特异性的。在一些实施方案中，具有不同靶标特异性的抗原结合结构域与不同的靶标分子(例如，不同的蛋白质或抗原)结合。在一些实施方案中，具有不同靶标特异性的抗原结合结构域与同一蛋白质的不同部分结合，例如与同一蛋白质的不同表位结合。
如本文所用，术语“互补决定区”(CDR)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在对于抗原结合是必需的。每个可变结构域通常具有三个CDR区，被标识为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。每个互补决定区可包括来自由Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即，大约轻链可变结构域中的残基24-34(CDR-L1)、50-56(CDR-L2)和89-97(CDR-L3)以及重链可变结构域中的残基31-35(CDR-H1)、50-65(CDR-H2)和95-102(CDR-H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即，大约轻链可变结构域中的残基26-32(CDR-L1)、50-52(CDR-L2)和91-96(CDR-L3)以及重链可变结构域中的残基26-32(CDR-H1)、53-55(CDR-H2)和96-101(CDR-H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在一些情况下，互补决定区可以包括来自根据Kabat定义的CDR区以及高变环两者的氨基酸。
“骨架区”(下文称为FR)是除CDR残基以外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个FR，被标识为FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是根据Kabat定义的，则轻链FR残基位于大约残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)和98-107(LCFR4)处，并且重链FR残基位于大约重链残基中的残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)处。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，则轻链FR残基位于大约轻链中的残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)和97-107(LCFR4)处，并且重链FR残基位于大约重链残基中的残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)和102-113(HCFR4)处。在一些情况下，当CDR包括来自如由Kabat定义的CDR以及高变环的CDR两者的氨基酸时，将相应地调节FR残基。
“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成，该二聚体在性质上可以是共价的，例如在scFv中。在这种构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。
“Fab”片段包含轻链的可变结构域和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段包括一对Fab片段，它们通常在其羧基末端附近通过铰链半胱氨酸共价连接。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段在单个多肽链中包括抗体的VH和VL结构域。通常，scFv多肽还包括在VH与VL结构域之间的多肽接头，该接头使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。
如本文所用，术语“抗体恒定结构域”是指对应于抗体的恒定区结构域的多肽(例如，CL抗体恒定结构域、CH1抗体恒定结构域、CH2抗体恒定结构域或CH3抗体恒定结构域)。
如本文所用，术语“促进”意指支持且有利于，例如有利于由彼此的结合亲和力比其他不同的Fc结构域单体更高的两个Fc结构域单体形成Fc结构域。如本文所述，组合以形成Fc结构域的两个Fc结构域单体可以在其各自的CH3抗体恒定结构域的界面处具有相容氨基酸修饰(例如，工程化突起和工程化空腔，以及/或者静电转向突变)。相容氨基酸修饰促进或有利于此类Fc结构域单体相对于与缺乏此类氨基酸修饰或具有不相容氨基酸修饰的其他Fc结构域单体彼此的选择性相互作用。这是因为，由于两个相互作用的CH3抗体恒定结构域的界面处的氨基酸修饰，Fc结构域单体对彼此的亲和力比对缺乏氨基酸修饰的其他Fc结构域单体更高。
如本文所用，术语“二聚化选择性模块”是指Fc结构域单体的促进两个Fc结构域单体之间的有利配对的序列。“互补”二聚化选择性模块是促进或有利于两个Fc结构域单体彼此的选择性相互作用的二聚化选择性模块。互补二聚化选择性模块可以具有相同或不同的序列。本文描述了示例性互补二聚化选择性模块，并且可以包括选自表4的工程化突起形成和空腔形成突变或表5的静电转向突变的互补突变。
如本文所用，术语“工程化空腔”是指用侧链体积比原始氨基酸残基更小的不同氨基酸残基置换CH3抗体恒定结构域中的至少一个原始氨基酸残基，从而在CH3抗体恒定结构域中产生三维空腔。术语“原始氨基酸残基”是指由野生型CH3抗体恒定结构域的遗传密码编码的天然存在的氨基酸残基。可以通过例如表4的任何一个或多个空腔形成置换突变来形成工程化空腔。
如本文所用，术语“工程化突起”是指用侧链体积比原始氨基酸残基更大的不同氨基酸残基置换CH3抗体恒定结构域中的至少一个原始氨基酸残基，从而在CH3抗体恒定结构域中产生三维突起。术语“原始氨基酸残基”是指由野生型CH3抗体恒定结构域的遗传密码编码的天然存在的氨基酸残基。可以通过例如表4的任何一个或多个突起形成置换突变来形成工程化突起。
如本文所用，术语“突起-进入-空腔对”描述了包括两个Fc结构域单体的Fc结构域，其中第一Fc结构域单体在其CH3抗体恒定结构域中包括工程化空腔，而第二Fc结构域单体在其CH3抗体恒定结构域中包括工程化突起。在突起-进入-空腔对中，第一Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域中的工程化突起被定位成使得其与第二Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域的工程化空腔相互作用，而不显著扰乱二聚体在CH3抗体恒定结构域间界面处的正常缔合。突起-进入-空腔对可以包括例如表4的任何一个或多个空腔形成置换突变和任何一个或多个突起形成置换突变的互补对。
如本文所用，术语“异二聚体Fc结构域”是指通过两个Fc结构域单体的异二聚化形成的Fc结构域，其中所述两个Fc结构域单体含有促进这两个Fc结构域单体的有利形成的不同反向电荷突变(参见例如，表5中的突变)。在具有三个Fc结构域的(一个羧基末端“茎”Fc结构域和两个氨基末端“分支”Fc结构域)Fc构建体中，每个氨基末端“分支”Fc结构域都可以是异二聚体Fc结构域(也称为“分支异二聚体Fc结构域”)。
如本文所用，关于Fc-抗原结合结构域构建体群体的术语“在结构上相同”是指以相同比率和构型组装相同多肽序列的构建体，但不指任何翻译后修饰，诸如糖基化。
如本文所用，术语“同二聚体Fc结构域”指通过两个Fc结构域单体的同二聚化形成的Fc结构域，其中所述两个Fc结构域单体含有相同的反向电荷突变(参见例如，表5和表6中的突变)。在具有三个Fc结构域(一个羧基末端“茎”Fc结构域和两个氨基末端“分支”Fc结构域)的Fc构建体中，羧基末端“茎”Fc结构域可以是同二聚体Fc结构域(也称为“茎同二聚体Fc结构域”)。
如本文所用，术语“异二聚化选择性模块”是指可以在Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域中产生的工程化突起、工程化空腔和某些反向电荷氨基酸置换，以便促进具有相容异二聚化选择性模块的两个Fc结构域单体的有利异二聚化。含有异二聚化选择性模块的Fc结构域单体可组合以形成异二聚体Fc结构域。异二聚化选择性模块的实例在表4和表5中示出。
如本文所用，术语“同二聚化选择性模块”是指CH3结构域之间的界面处的带电残基环内至少两个位置中的Fc结构域单体中的促进Fc结构域单体的同二聚化以形成同二聚体Fc结构域的反向电荷突变。例如，形成同二聚化选择性模块的反向电荷突变可以在位置356、357、370、392、399和/或409(通过EU编号)中的至少两个氨基酸中，所述至少两个氨基酸在CH3结构域之间的界面处的带电残基环内。同二聚化选择性模块的实例在表4和表5中示出。因此，D356可以变为K或R；E357可以变为K或R；K370可以变为D或E；K392可以变为D或E；D399可以变为K或R；并且K409可以变为D或E。
如本文所用，术语“连接”用于描述通过包括化学缀合、重组手段和化学键(例如，肽键、二硫键和酰胺键)在内的手段来组合或附接两种或更多种元件、组分或蛋白质结构域(例如，多肽)。例如，可以通过化学缀合、化学键、肽接头或任何其他共价键合手段来连接两种单个多肽以形成一个连续的蛋白质结构。在一些实施方案中，通过从编码抗原结合结构域和Fc结构域单体两者的连续核酸序列表达来将抗原结合结构域与Fc结构域单体连接。在其他实施方案中，通过肽接头将抗原结合结构域与Fc结构域单体连接，其中通过化学键(例如，肽键)将肽接头的N末端与抗原结合结构域的C末端连接，并且通过化学键(例如，肽键)将肽接头的C末端与Fc结构域单体的N末端连接。
如本文所用，术语“缔合”用于描述多肽(或一种单一多肽内的序列)之间的相互作用，例如氢键合、疏水相互作用或离子相互作用，使得多肽(或一种单一多肽内的序列)被定位为形成本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体(例如，具有三个Fc结构域的Fc-抗原结合结构域构建体)。例如，在一些实施方案中，四种多肽(例如，各自包括两个Fc结构域单体的两种多肽和各自包括一个Fc结构域单体的两种多肽)缔合以形成具有三个Fc结构域的Fc构建体(例如，如图50和图51所描绘)。四种多肽可以通过其各自的Fc结构域单体缔合。多肽之间的缔合不包括共价相互作用。
如本文所用，术语“接头”是指两个元件(例如，蛋白质结构域)之间的键合。接头可以是共价键或间隔物。术语“键”是指化学键(例如，酰胺键或二硫键)或由化学反应产生(例如，化学缀合)的任何种类的键。术语“间隔物”是指存在于两个多肽或多肽结构域之间以在两个多肽或多肽结构域之间提供空间和/或灵活性的部分(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)或氨基酸序列(例如，3-200个氨基酸、3-150个氨基酸或3-100个氨基酸序列)。氨基酸间隔物是多肽一级序列的部分(例如，经由多肽主链与间隔的多肽或多肽结构域连接)。例如在两个铰链区或形成Fc结构域的两个Fc结构域单体之间形成的二硫键不被认为是接头。因此，D356可以变为K或R；E357可以变为K或R；K370可以变为D或E；K392可以变为D或E；D399可以变为K或R；并且K409可以变为D或E。如本文所用，术语“甘氨酸间隔物”是指串联连接两个Fc结构域单体的仅含有甘氨酸的接头。甘氨酸间隔物可含有至少4、8或12个甘氨酸(例如，4-30、8-30或12-30个甘氨酸；例如，12-30、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个甘氨酸)。在一些实施方案中，甘氨酸间隔物具有序列GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:27)。如本文所用，术语“白蛋白结合肽”是指对血清白蛋白具有亲和力并且具有结合血清白蛋白的功能的12至16个氨基酸的氨基酸序列。白蛋白结合肽可以具有不同起源，例如人、小鼠或大鼠。在本公开的一些实施方案中，将白蛋白结合肽与Fc结构域单体的C末端融合，以增加Fc-抗原结合结构域构建体的血清半衰期。可以直接或通过接头将白蛋白结合肽与Fc结构域单体的N末端或C末端融合。
如本文所用，术语“纯化肽”是指可以用于纯化、分离或鉴定多肽的任何长度的肽。可以将纯化肽与多肽连接以帮助从例如细胞裂解产物混合物中纯化多肽和/或分离多肽。在一些实施方案中，纯化肽结合对纯化肽具有特异性亲和力的另一部分。在一些实施方案中，将与纯化肽特异性结合的此类部分附接到固体支持物，诸如基质、树脂或琼脂糖珠。可与Fc-抗原结合结构域构建体连接的纯化肽的实例在本文中进一步详细描述。
如本文所用，术语“多聚体”是指包括至少两个本文所述的缔合Fc构建体或Fc-抗原结合结构域构建体的分子。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指寡核苷酸或核苷酸以及它们的片段或部分，并且是指基因组或合成起源的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，并且代表有义链或反义链。单个多核苷酸被翻译成单个多肽。
如本文所用，术语“多肽”描述了其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的单个聚合物。多肽旨在涵盖天然存在、重组或合成产生的任何氨基酸序列。
如本文所用，术语“氨基酸位置”是指蛋白质或蛋白质结构域中氨基酸的位置编号。在标出地方(例如，对于CDR和FR区)使用Kabat编号系统(Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,第5版,1991)对氨基酸位置进行编号，否则使用EU编号。
图37A-37D描绘了使用EU编号系统编号的人IgG1 Fc结构域。
如本文所用，术语“氨基酸修饰”是指与参考序列(例如，野生型、未突变或未修饰Fc序列)相比可对以下项有影响并且可促进改善治疗免疫和炎性疾病的功效的Fc结构域多肽序列的改变：Fc构建体的药代动力学(PK)和/或药效动力学(PD)特性、血清半衰期、效应子功能(例如，细胞裂解(例如，抗体依赖性细胞介导的毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性活性(CDC))、吞噬作用(例如，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDCC))、免疫激活和T细胞激活)、对Fc受体(例如，Fc-γ受体(FcγR)(例如，FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16a)和/或FcγRIIIb(CD16b))、Fc-α受体(FcαR)、Fc-ε受体(FcεR)和/或新生儿Fc受体(FcRn))的亲和力、对参与补体级联的蛋白质(例如，C1q)的亲和力、翻译后修饰(例如，糖基化、唾液酸化)、聚合特性(例如，形成二聚体(例如，同二聚体和/或异二聚体)和/或多聚体的能力)以及生物物理特性(例如，改变CH1与CL之间的相互作用、改变稳定性和/或改变对温度和/或pH的敏感性)。氨基酸修饰包括氨基酸置换、缺失和/或插入。在一些实施方案中，氨基酸修饰是单一氨基酸的修饰。在其他实施方案中，氨基酸修饰是多个(例如，多于一个)氨基酸的修饰。氨基酸修饰可包括氨基酸置换、缺失和/或插入的组合。包括在氨基酸修饰的描述中的是编码Fc多肽的核苷酸序列的遗传(即DNA和RNA)改变，诸如点突变(例如，单个核苷酸与另一个核苷酸的交换)、插入和缺失(例如，一个或多个核苷酸的添加和/或移除)。
在某些实施方案中，Fc构建体或Fc-抗原结合结构域构建体内的至少一个(例如，一个、两个或三个)Fc结构域包括氨基酸修饰。在一些情况下，至少一个Fc结构域包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或二十个或更多个)氨基酸修饰。
在某些实施方案中，Fc构建体或Fc-抗原结合结构域构建体内的至少一个(例如，一个、两个或三个)Fc结构域单体包括氨基酸修饰(例如，置换)。在一些情况下，至少一个Fc结构域单体包括一个或多个(例如，不超过两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或二十个)氨基酸修饰(例如，置换)。
如本文所用，术语“同一性百分比(％)”是指在比对序列并引入缺口(如有需要)以实现最大同一性百分比(即，可以在候选序列和参考序列中的一者或两者中引入缺口以用于最佳比对，并且可以忽略非同源序列以用于比较目的)之后，候选序列(例如，本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体中的Fc结构域单体的序列)的氨基酸(或核酸)残基与参考序列(例如，野生型Fc结构域单体的序列)的氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。比对以用于确定同一性百分比的目的可以以在本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在待比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在一些实施方案中，如下计算给定候选序列和、与或相对于给定参考序列的氨基酸(或核酸)序列同一性百分比(其可以另选地表达为给定候选序列和、与或相对于给定参考序列具有或包括一定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比)：
100x(A/B的分数)
其中A是在候选序列和参考序列的比对中评分为相同的氨基酸(或核酸)残基的数目，并且其中B是参考序列中氨基酸(或核酸)残基的总数。在其中候选序列的长度不等于参考序列的长度的一些实施方案中，候选序列与参考序列的氨基酸(或核酸)序列同一性百分比不等于参考序列与候选序列的氨基酸(或核酸)序列同一性百分比。
在一些实施方案中，本文所述的Fc构建体(例如，具有三个Fc结构域的Fc-抗原结合结构域构建体)中的Fc结构域单体可具有与野生型Fc结构域单体的序列(例如，SEQ IDNO:42)具有至少95％同一性(至少97％、99％或99.5％同一性)的序列。在一些实施方案中，本文所述的Fc构建体(例如，具有三个Fc结构域的Fc-抗原结合结构域构建体)中的Fc结构域单体可具有与SEQ ID NO:43-48和50-53中任一者的序列具有至少95％同一性(至少97％、99％或99.5％同一性)的序列。在某些实施方案中，Fc构建体中的Fc结构域单体可具有与SEQ ID NO:48、52和53的序列具有至少95％同一性(至少97％、99％或99.5％同一性)的序列。
在一些实施方案中，两个Fc结构域单体之间的间隔物可具有与本文进一步描述的SEQ ID NO:1-36(例如，SEQ ID NO:17、18、26和27)中任一者的序列具有至少75％同一性(至少75％、77％、79％、81％、83％、85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％、99.5％或100％同一性)的序列。
在一些实施方案中，Fc构建体中的Fc结构域单体可具有与SEQ ID NO:42-48和50-53中任一者的序列相差多至10个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的序列。在一些实施方案中，Fc构建体中的Fc结构域单体相对于SEQ ID NO:42-48和50-53中任一者的序列具有多至10个氨基酸置换，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指包括从其对应的核酸表达蛋白质所需的必要细胞组分(例如，细胞器)的媒介物。核酸通常包括在核酸载体中，可以通过本领域已知的常规技术(转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等)将所述核酸载体引入宿主细胞中。宿主细胞可以是原核细胞(例如，细菌细胞)或真核细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，CHO细胞))。如本文所述，宿主细胞用于表达编码所需结构域的一种或多种多肽，然后可以将所述结构域组合以形成所需Fc-抗原结合结构域构建体。
如本文所用，术语“药物组合物”是指含有活性成分以及一种或多种赋形剂和稀释剂以使活性成分能够适合于施用方法的医学或药物制剂。本公开的药物组合物包括与Fc-抗原结合结构域构建体相容的药学上可接受的组分。药物组合物通常为用于静脉内或皮下施用的水性形式。
如本文所用，多肽或Fc构建体的“基本上同质的群体”是指组合物(例如，细胞培养基或药物组合物)中至少50％的多肽或Fc构建体具有相同数量的Fc结构域，如通过非还原SDS凝胶电泳或尺寸排阻色谱测定的。多肽或Fc构建体的基本上同质的群体可在纯化之前或者在蛋白A或蛋白G纯化之后或者在只进行任何Fab或Fc特异性亲和色谱之后获得。在各种实施方案中，组合物中至少55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的多肽或Fc构建体具有相同数量的Fc结构域。在其他实施方案中，组合物中至多85％、90％、92％或95％的多肽或Fc构建体具有相同数量的Fc结构域。
如本文所用，术语“药学可接受的载体”是指药物组合物中的赋形剂或稀释剂。药学可接受的载体必须与制剂的其他成分相容并且对接受者无害。在本公开中，药学上可接受的载体必须为Fc-抗原结合结构域构建体提供足够的药物稳定性。载体的性质因施用模式而异。例如，对于经口施用，固体载体是优选的；对于静脉内施用，一般使用水性溶液载体(例如，WFI和/或缓冲溶液)。
如本文所用，“治疗有效量”是指有效诱导受试者或患者中的所需生物效应或者有效治疗患有本文所述病症或障碍的患者的量，例如药物剂量。本文还应理解，“治疗有效量”可被解释为以一个剂量或以任何剂量或途径服用、单独或与其他治疗剂组合服用的给予所需治疗效果的量。
如本文所用，术语“片段”和术语“部分”可以互换使用。
附图说明
图1是示出具有两个Fc结构域(通过将相同的多肽链连接在一起形成)的串联构建体和通过串联Fc序列的错配缔合产生的一些所得物质的示意图。Fab部分的可变结构域(VH+VL)被描绘为平行四边形，Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形，Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆，并且铰链二硫化物被描绘为平行线对。
图2是示出具有通过肽接头连接的三个Fc结构域(通过将相同的多肽链连接在一起形成)的串联构建体和通过串联Fc序列的非寄存器缔合产生的一些所得物质的示意图。Fab部分的可变结构域(VH+VL)被描绘为平行四边形，Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形，Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆，并且铰链二硫化物被描绘为平行线对。
图3A和图3B是具有通过接头连接并使用正交异二聚化结构域组装的两个Fc结构域(图3A)或三个Fc结构域(图3B)的Fc构建体的示意图。每个独特的多肽链用不同的阴影表示。Fab部分的可变结构域(VH+VL)被描绘为平行四边形，Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形，Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆，接头被示出为虚线，并且铰链二硫化物被描绘为平行线对。CH3椭圆被示出为具有突起用于描绘旋钮-进入-孔洞对的旋钮，并且具有空腔用于描绘孔洞。加号和/或减号用于描绘CH3结构域中的静电转向突变。
图4A-J是附接到具有三个Fc结构域的同一Fc构建体结构的不同类型的Fab相关抗原结合结构域的示意图。每个独特的多肽链用不同的阴影或散列表示。Fab部分的可变结构域(VH+VL)被描绘为平行四边形(针对特异性A)和具有弯边的平行四边形(针对特异性B)。Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形，Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形，接头被示出为虚线，并且铰链二硫键被示出为平行线对。CH3椭圆被示出为具有突起用于描绘旋钮-进入-孔洞对的旋钮，并且具有空腔用于描绘孔洞。加号和/或减号用于描绘CH3结构域中的静电转向突变。在小图G中，字母H和L分别用于表示重链和轻链恒定结构域序列。
图5描绘了每个构建体使用单一类型的Fc异二聚化元件的双特异性Fc-抗原结合结构域构建体的示意图。每个独特的多肽链用不同的阴影或散列表示。具有第一靶标特异性的Fab部分的可变结构域(VH+VL)被描绘为平行四边形并用数字1注释，并且具有第二靶标特异性的Fab可变结构域被描绘为具有弯边的平行四边形并用数字2注释。Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形。Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形。接头被示出为虚线。铰链二硫键被示出为连接多肽链的平行线对。用A、B、C或D表示Fab恒定结构域(CL和CH)的A-B或C-D配对突变。用J、K、H或I表示Fc CH3结构域的J-K或H-I异二聚化突变，或用O表示O-O同二聚化突变。
图6描绘了具有使用两个正交Fc异二聚化元件的串联Fc结构域的双特异性Fc-抗原结合结构域构建体的示意图。每个独特的多肽链用不同的阴影或散列表示。具有第一靶标特异性的Fab部分的可变结构域(VH+VL)被描绘为平行四边形并用数字1注释，并且具有第二靶标特异性的Fab可变结构域被描绘为具有弯边的平行四边形并用数字2注释。Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形。Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形。接头被示出为虚线。铰链二硫键被示出为连接多肽链的平行线对。用A、B、C或D表示Fab恒定结构域(CL和CH)的A-B或C-D配对突变。用J、K、H或I表示Fc CH3结构域的J-K或H-I异二聚化配对突变。
图7描绘了具有使用两个正交Fc异二聚化元件的分支Fc结构域的双特异性Fc-抗原结合结构域构建体的示意图。每个独特的多肽链用不同的阴影或散列表示。具有第一靶标特异性的Fab部分的可变结构域(VH+VL)被描绘为平行四边形并用数字1注释，并且具有第二靶标特异性的Fab可变结构域被描绘为具有弯边的平行四边形并用数字2注释。Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形。Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形。接头被示出为虚线。铰链二硫键被示出为连接多肽链的平行线对。用A、B、C或D表示Fab恒定结构域(CL和CH)的A-B或C-D配对突变。用J、K、H或I表示Fc CH3结构域的J-K或H-I异二聚化配对突变，或用O表示O-O同二聚化突变。
图8描绘了三特异性Fc-抗原结合结构域构建体的示意图，其中抗原结合结构域使用三个不同的轻链或一个共同的轻链。每个独特的多肽链用不同的阴影或散列表示。在使用三个不同的轻链的情况下，Fab部分的具有第一靶标特异性的可变结构域(VH+VL)被描绘为平行四边形并用数字1注释；具有第二靶标特异性的Fab可变结构域被描绘为具有一种类型的弯边的平行四边形并用数字2注释，并且具有第三靶标特异性的Fab可变结构域被描绘为具有另一种类型的弯边的平行四边形并用数字3注释。在使用共同轻链的情况下，Fab的具有不同特异性的VH结构域分别用1、2或3注释，并且共同VL结构域用星号标记。Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形。Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形。接头被示出为虚线。铰链二硫键被示出为连接多肽链的平行线对。用A、B、C、D、E或F表示Fab恒定结构域(CL和CH)的A-B、C-D或E-F配对突变。用J、K、H或I表示Fc CH3结构域的J-K或H-I异二聚化突变。
图9描绘了具有三个对称分布的Fc结构域和抗原结合结构域的三特异性分支Fc-抗原结合结构域构建体的示意图，这些结构域通过使用正交异二聚化结构域通过使用正交异二聚化结构域不对称排列多肽链进行组装。这些构建体使用两条独特的轻链(用1或星号注释)。Fab的具有不同特异性的VH结构域分别用1、2或3注释，并且被描绘为具有直边的平行四边形或具有弯边的平行四边形。Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形。Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形。接头被示出为虚线。铰链二硫键被示出为连接多肽链的平行线对。用A、B、C或D表示Fab恒定结构域(CL和CH)的A-B或C-D配对突变。用J、K、H或I表示Fc CH3结构域的J-K或H-I异二聚化突变。
图10描绘了具有五个对称分布的Fc结构域和抗原结合结构域的三特异性分支Fc-抗原结合结构域构建体的示意图，这些结构域通过使用正交异二聚化结构域通过使用正交异二聚化结构域不对称排列多肽链进行组装。这些构建体使用两条独特的轻链(用1或星号注释)。Fab的具有不同特异性的VH结构域分别用1、2或3注释，并且被描绘为具有直边的平行四边形或具有弯边的平行四边形。Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形。Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形。接头被示出为虚线。铰链二硫键被示出为连接多肽链的平行线对。用A、B、C或D表示Fab恒定结构域(CL和CH)的A-B或C-D配对突变。用J、K、H或I表示Fc CH3结构域的J-K或H-I异二聚化突变。
图11A描绘了基于使用两个独特的轻链和五个Fc结构域的对称分支Fc骨架的三特异性Fc-抗原结合结构域构建体的示意图。每个独特的多肽链用不同的阴影或散列表示。Fab的具有不同特异性的VH结构域分别用1、2或3注释，并且被描绘为具有直边的平行四边形或具有弯边的平行四边形。Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形。Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形。接头被示出为虚线。铰链二硫键被示出为连接多肽链的平行线对。用A、B、C或D表示Fab恒定结构域(CL和CH)的A-B或C-D配对突变。用J、K、H或I表示FcCH3结构域的J-K或H-I异二聚化突变，并且用O表示O-O同二聚化突变。
图11B描绘了基于使用两个独特的轻链和五个Fc结构域的对称分支Fc骨架的三特异性Fc-抗原结合结构域构建体的示意图。每个独特的多肽链用不同的阴影或散列表示。Fab的具有不同特异性的VH结构域分别用1、2或3注释，并且被描绘为具有直边的平行四边形或具有弯边的平行四边形。Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形。Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形。接头被示出为虚线。铰链二硫键被示出为连接多肽链的平行线对。用A、B、C或D表示Fab恒定结构域(CL和CH)的A-B或C-D配对突变。用J、K、H或I表示FcCH3结构域的J-K或H-I异二聚化突变，并且用O表示O-O同二聚化突变。
图12描绘了基于使用两个独特的轻链和四至五个Fc结构域的不对称分支Fc骨架的三特异性Fc-抗原结合结构域构建体的示意图。每个独特的多肽链用不同的阴影或散列表示。Fab的具有不同特异性的VH结构域分别用1、2或3注释，并且被描绘为具有直边的平行四边形或具有弯边的平行四边形。Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形。Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形。接头被示出为虚线。铰链二硫键被示出为连接多肽链的平行线对。用A、B、C、D、E或F表示Fab恒定结构域(CL和CH)的A-B、C-D或E-F配对突变。用J、K、H或I表示Fc CH3结构域的J-K或H-I异二聚化突变。
图13描绘了基于使用两个独特的轻链和四至五个Fc结构域的不对称分支Fc骨架的三特异性Fc-抗原结合结构域构建体的示意图。每个独特的多肽链用不同的阴影或散列表示。Fab的具有不同特异性的VH结构域分别用1、2或3注释，并且被描绘为具有直边的平行四边形或具有弯边的平行四边形。Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形。Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形。接头被示出为虚线。铰链二硫键被示出为连接多肽链的平行线对。用A、B、C、D、E或F表示Fab恒定结构域(CL和CH)的A-B、C-D或E-F配对突变。用J、K、H或I表示Fc CH3结构域的J-K或H-I异二聚化突变。
图14A描绘了具有三个串联Fc结构域和使用共同轻链的具有不同靶标特异性的两个Fab的双特异性Fc-抗原结合结构域构建体的示意图。该双特异性Fc构建体用于证明双特异性Fc构建体的表达。Fab部分的具有第一靶标特异性的可变结构域(VH+VL)被描绘为平行四边形，具有第二特异性的可变结构域(VH)被描绘为具有弯边的平行四边形。Fab部分(CH1+CL)的恒定结构域被描绘为矩形，Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形，接头被示出为虚线，并且铰链二硫键被示出为平行线对。CH3椭圆被示出为具有突起用于描绘旋钮-进入-孔洞对的旋钮，并且具有空腔用于描绘孔洞。加号和减号指示静电转向突变的电荷改变。
图14B示出了用编码组装成图14A的Fc构建体的多肽的基因转染的细胞的SDS-PAGE分析结果。泳道1和2中存在250kDa条带表明形成了预期的双特异性构建体。在泳道3和4(其中仅用轻链和含有三个串联Fc序列的多肽链的基因转染细胞)中不存在250kDa条带表明含有三个串联Fc序列的多肽链不形成同二聚体。
图15A描绘了具有附接到单个Fc结构域的两个不同Fab序列的双特异性抗体的示意图。Fab部分的具有第一靶标特异性的可变结构域(VH+VL)被描绘为平行四边形，具有第二靶标特异性的可变结构域(VH)被描绘成具有弯边的平行四边形，Fab部分的恒定结构域(CH1+CL)被描绘为矩形，Fc部分的结构域(CH2和CH3)被描绘为椭圆形，接头被示出为虚线，并且铰链二硫键被示出为平行线对。CH3椭圆被示出为具有突起用于描绘旋钮-进入-孔洞对的旋钮，并且具有空腔用于描绘孔洞。加号和减号指示静电转向突变的电荷改变。用A、B、C或D表示Fab恒定结构域(CL和CH)的A-B或C-D配对突变。
图15B示出了用编码组装成图15A的双特异性抗体的多肽的基因转染的细胞的SDS-PAGE分析结果。存在于抗体的Fab结构域的重链和轻链中的用于促进各个Fab结构域的组装的不同组突变在表3中示出，并且这些抗体的SDS-PAGE结果在泳道1-7中示出。泳道8包含具有3个Fc结构域但不具有抗原结合结构域的Fc构建体。存在150kDa条带表明形成了预期的构建体。图15C示出了图15B的泳道1的纯化构建体的LC-MS分析结果。
图15D示出了图15B的泳道2的纯化构建体的LC-MS分析结果。
图15E示出了图15B的泳道3的纯化构建体的LC-MS分析结果。
图15F示出了图15B的泳道4的纯化构建体的LC-MS分析结果。
图16是包含两个Fc结构域和具有两种不同特异性的三个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体22)的图示。该构建体由三个含有Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(2202)包含含有突起的Fc结构域单体(2208)，该Fc结构域单体通过间隔物与另一个包含突起的Fc结构域单体(2206)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(2222)串联连接。第二多肽和第三多肽(2226和2224)各自包含含有空腔的Fc结构域单体(2210和2216)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(2214和2220)串联连接。包含VL的结构域(2204、2212和2218)与每个VH结构域连接。
图17是包含三个Fc结构域和具有两种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体23)的图示。该构建体由四个含有Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(2302)包含三个包含突起的Fc结构域单体(2310、2308和2306)，这些Fc结构域单体通过间隔物与在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(2330)串联连接。第二多肽、第三多肽和第四多肽(2336、2334和2332)包含含有空腔的Fc结构域单体(2312、2318和2324)，这些Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(2316、2322和2328)串联连接。包含VL的结构域(2304、2314、2320和2326)与每个VH结构域连接。
图18是包含三个Fc结构域和具有两种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体24)的图示。该构建体由四个含有Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(2402和2436)包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(2410和2412)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与包含突起的Fc结构域单体(2426和2424)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(2430和2420)串联连接。第三多肽和第四多肽(2404和2434)包含含有空腔的Fc结构域单体(2408和2414)，这两个Fc结构域单体与包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(2432和2418)串联连接。包含VL的结构域(2406、2416、2422和2428)与每个VH结构域连接。
图19是包含三个Fc结构域和具有两种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体25)的图示。该构建体由四个含有Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(2502和2536)包含含有突起的Fc结构域单体(2516和2518)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(2508和2526)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(2532和2530)串联连接。第二多肽和第三多肽(2504和2534)包含含有空腔的Fc结构域单体(2514和2520)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(2510和2524)串联连接。包含VL的结构域(2506、2512、2522和2528)与每个VH结构域连接。
图20是包含五个Fc结构域和具有两种不同特异性的六个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体26)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(2602和2656)包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(2618和2620)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与包含突起的Fc结构域单体(2642和2640)、第二包含突起的Fc结构域单体(2644和2638)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(2648和2634)串联连接。第三多肽、第四多肽、第五多肽和第六多肽(2606、2604、2654和2652)包含含有空腔的Fc结构域单体(2616、2610、2622和2628)，这些Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(2612、2650、2626和2632)串联连接。包含VL的结构域(2608、2614、2624、2630、2636和2646)与每个VH结构域连接。
图21是包含五个Fc结构域和具有两种不同特异性的六个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体27)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(2702和2756)包含含有突起的Fc结构域单体(2720和2722)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(2712和2730)、包含突起的Fc结构域单体(2744和2742)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(2748和2738)串联连接。第三多肽、第四多肽、第五多肽和第六多肽(2706、2704、2754和2752)包含含有空腔的Fc结构域单体(2718、2724、2710和2732)，这些Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(2714、2728、2750和2736)串联连接。包含VL的结构域(2708、2716、2726、2743、2740和2746)与每个VH结构域连接。
图22是包含五个Fc结构域和具有两种不同特异性的六个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体28)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(2802和2856)包含含有突起的Fc结构域单体(2824和2830)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与第二包含突起的Fc结构域单体(2826和2828)、在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(2810和2844)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(2850和2848)串联连接。第三多肽、第四多肽、第五多肽和第六多肽(2806、2804、2854和2852)包含含有空腔的Fc结构域单体(2822、2816、2832和2838)，这些Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(2818、2812、2836和2842)串联连接。包含VL的结构域(2808、2814、2820、2834、2840和2846)与每个VH结构域连接。
图23是包含两个Fc结构域和具有两种不同特异性的两个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体29)的图示。该构建体由三个含有Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(2902)包含两个各自具有一组不同的异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(2908和2906)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(2918)串联连接。第二多肽(2920)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(2910)，该Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(2914)串联连接。第三多肽(2916)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体。包含VL的结构域(2904和2912)与每个VH结构域连接。
图24是包含两个Fc结构域和具有两种不同特异性的三个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体30)的图示。该构建体由三个含有Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(3002)包含两个各自具有一组不同的异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(3008和3006)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3022)串联连接。第二多肽(3024)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3010)，该Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(3014)串联连接。第三多肽(3026)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3016)，该Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3020)串联连接。包含VL的结构域(3004、3012和3018)与每个VH结构域连接。
图25是包含两个Fc结构域和具有三种不同特异性的三个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体31)的图示。该构建体由三个含有Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(3102)包含两个各自具有一组不同的异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(3108和3106)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3122)串联连接。第二多肽(3126)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3110)，该Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(3114)串联连接。第三多肽(3124)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3116)，该Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第三特异性的抗原结合结构域(3120)串联连接。包含VL的结构域(3104、3112和3118)与每个VH结构域连接。
图26是包含三个Fc结构域和具有两种不同特异性的三个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体32)的图示。该构建体由四个含有Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(3202)包含三个包含突起的Fc结构域单体(3210、3208和3206)(第三Fc结构域单体具有与前两个Fc结构域单体不同的一组异二聚化突变)，这些Fc结构域单体通过间隔物与在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3226)串联连接。第二多肽和第三多肽(3230和3228)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3212和3218)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(3216和3222)串联连接。第四多肽(3224)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体。包含VL的结构域(3204、3214和3220)与每个VH结构域连接。
图27是包含三个Fc结构域和具有两种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体33)的图示。该构建体由四个含有Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(3302)包含三个包含突起的Fc结构域单体(3310、3308和3306)(第三Fc结构域单体具有与前两个Fc结构域单体不同的一组异二聚化突变)，这些Fc结构域单体通过间隔物与在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3330)串联连接。第二多肽和第三多肽(3336和3334)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3312和3318)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(3316和3322)串联连接。第四多肽(3322)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3324)，该Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3328)串联连接。包含VL的结构域(3304、3314、3320和3326)与每个VH结构域连接。
图28是包含三个Fc结构域和具有三种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体34)的图示。该构建体由四个含有Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(3402)包含三个包含突起的Fc结构域单体(3410、3408和3406)(第三Fc结构域单体具有与前两个Fc结构域单体不同的一组异二聚化突变)，这些Fc结构域单体通过间隔物与在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3430)串联连接。第二多肽和第三多肽(3436和3434)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3412和3418)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(3416和3422)串联连接。第四多肽(3432)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3424)，该Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第三特异性的抗原结合结构域(3428)串联连接。包含VL的结构域(3404、3414、3420和3426)与每个VH结构域连接。
图29是包含三个Fc结构域和具有三种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体35)的图示。该构建体由四个含有Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(3502)包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(3510)，该Fc结构域单体通过间隔物与具有第一组异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(3526)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3530)串联连接。第二多肽(3536)包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(3512)，该Fc结构域单体通过间隔物与具有第二组异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(3524)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3520)串联连接。第三多肽(3504)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3508)，该Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(3532)串联连接。第四多肽(3534)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3514)，该Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第三特异性的抗原结合结构域(3518)串联连接。包含VL的结构域(3506、3516、3522和3528)与每个VH结构域连接。
图30是包含五个Fc结构域和具有两种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体36)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(3602和3644)包含具有第一组异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(3614和3616)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(3610和3620)、另一个具有第二组异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(3634和3632)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3638和3628)串联连接。第三多肽和第四多肽(3612和3618)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体。第五多肽和第六多肽(3604和3642)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3608和3622)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(3640和3626)串联连接。包含VL的结构域(3606、3624、3630和3636)与每个VH结构域连接。
图31是包含五个Fc结构域和具有三种不同特异性的六个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体37)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(3702和3756)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3720和3722)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(3712和3730)、另一个具有第二组异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(3744和3742)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3748和3738)串联连接。第三多肽和第四多肽(3706和3754)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3718和3724)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(3714和3728)串联连接。第五多肽和第六多肽(3704和3752)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3710和3732)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第三特异性的抗原结合结构域(3750和3736)串联连接。包含VL的结构域(3708、3716、3726、3234、3740和3746)与每个VH结构域连接。
图32是包含三个Fc结构域和具有三种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体38)的图示。该构建体由四个含有Fc结构域单体的多肽形成。第一多肽(3802)包含具有第一组异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(3816)，该Fc结构域单体通过间隔物与在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(3808)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3832)串联连接。第二多肽(3836)包含具有第二组异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(3818)，该Fc结构域单体通过间隔物与在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(3826)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3830)串联连接。第三多肽(3804)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3814)，该Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(3810)串联连接。第四多肽(3834)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3820)，该Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第三特异性的抗原结合结构域(3824)串联连接。包含VL的结构域(3806、3812、3822和3828)与每个VH结构域连接。
图33是包含五个Fc结构域和具有两种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体39)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(3902和3944)包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(3912和3914)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与具有第一组异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(3932和3930)、具有第二组异二聚化突变的第二包含突起的Fc结构域单体(3934和3928)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(3938和3924)串联连接。第三多肽和第四多肽(3910和3916)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体。第五多肽和第六多肽(3904和3942)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(3908和3918)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(3940和3922)串联连接。包含VL的结构域(3906、3920、3926和3936)与每个VH结构域连接。
图34是包含五个Fc结构域和具有三种不同特异性的六个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体40)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(4002和4056)包含在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(4018和4020)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与具有第一组异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(4042和4040)、具有第二组异二聚化突变的第二包含突起的Fc结构域单体(4044和4038)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(4048和4034)串联连接。第三多肽和第四多肽(4006和4054)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(4016和4022)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(4012和4026)串联连接。第五多肽和第六多肽(4004和4052)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(4010和4028)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第三特异性的抗原结合结构域(4050和4032)串联连接。包含VL的结构域(4008、4014、4024、4030、4036和4046)与每个VH结构域连接。
图35是包含五个Fc结构域和具有两种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体41)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(4102和4144)包含具有第一组异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(4118和4124)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与具有第二组异二聚化突变的第二包含突起的Fc结构域单体(4120和4122)、在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(4108和4134)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(4140和4138)串联连接。第三多肽和第四多肽(4104和4142)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(4116和4126)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(4112和4130)串联连接。第五多肽和第六多肽(4110和4132)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体。包含VL的结构域(4106、4114、4128和4136)与每个VH结构域连接。
图36是包含五个Fc结构域和具有三种不同特异性的六个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体42)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。两个多肽(4202和4256)包含具有第一组异二聚化突变的包含突起的Fc结构域单体(4224和4230)，这两个Fc结构域单体通过间隔物与具有第二组异二聚化突变的第二包含突起的Fc结构域单体(4226和4228)、在CH3-CH3界面处包含与WT序列不同的带电氨基酸的Fc结构域单体(4210和4244)和在N末端包含VH结构域的具有第一特异性的抗原结合结构域(4250和4248)串联连接。第三多肽和第四多肽(4206和4254)包含具有第一组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(4222和4232)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第二特异性的抗原结合结构域(4218和4236)串联连接。第五多肽和第六多肽(4204和4252)包含具有第二组异二聚化突变的包含空腔的Fc结构域单体(4216和4238)，这两个Fc结构域单体与在N末端包含VH结构域的具有第三特异性的抗原结合结构域(4212和4242)串联连接。包含VL的结构域(4208、4214、4220、4234、4240和4246)与每个VH结构域连接。
图37A描绘了具有EU编号的人IgG1的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)。铰链区用双下划线标出，CH2结构域未用下划线标出，而CH3区用下划线标出。
图37B描绘了具有EU编号的人IgG1的氨基酸序列(SEQ ID NO:45)。缺少E216-C220(包括端点)的铰链区用双下划线标出，CH2结构域未用下划线标出，而CH3区用下划线标出并且缺少K447。
图37C描绘了具有EU编号的人IgG1的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)。铰链区用双下划线标出，CH2结构域未用下划线标出，而CH3区用下划线标出并且缺少447K。
图37D描绘了具有EU编号的人IgG1的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)。缺少E216-C220(包括端点)的铰链区用双下划线标出，CH2结构域未用下划线标出，而CH3区用下划线标出。
图38A是包含两个Fc结构域和具有两种不同特异性的两个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体29)的图示。该构建体由三个含有Fc结构域单体的多肽形成。
图38B是Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体29)的示例性氨基酸序列。
图39A是包含两个Fc结构域和具有两种不同特异性的三个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体30)的图示。该构建体由三个含有Fc结构域单体的多肽形成。
图39B是Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体30)的示例性氨基酸序列。
图40A是包含两个Fc结构域和具有三种不同特异性的三个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体31)的图示。
图40B是Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体30)的示例性氨基酸序列。
图41A是包含三个Fc结构域和具有两种不同特异性的三个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体32)的图示。该构建体由四个含有Fc结构域单体的多肽形成。
图41B是Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体31)的示例性氨基酸序列。
图42A是包含三个Fc结构域和具有两种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体33)的图示。该构建体由四个含有Fc结构域单体的多肽形成。
图42B是Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体33)的示例性氨基酸序列。
图43A是包含三个Fc结构域和具有三种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体34)的图示。该构建体由四个含有Fc结构域单体的多肽形成。
图43B是Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体34)的示例性氨基酸序列。
图44A是包含三个Fc结构域和具有三种不同特异性的四个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体35)的图示。
图44B是Fc-抗原结合结构域构建体(替代构建体35)的示例性氨基酸序列。
图45A是包含五个Fc结构域和具有三种不同特异性的六个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体37)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。
图45B是Fc-抗原结合结构域构建体(构建体37)的示例性氨基酸序列。
图46A是包含五个Fc结构域和具有三种不同特异性的六个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体(构建体40)的图示。该构建体由六个包含Fc结构域单体的多肽形成。
图46B是Fc-抗原结合结构域构建体(构建体37)的示例性氨基酸序列。
具体实施方式
许多治疗性抗体通过Fc结构域的效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC))募集先天免疫系统的元件而发挥作用。在一些情况下，本公开设想将含单个Fc-结构域的治疗剂(例如，已知治疗性抗体)的至少两个抗原结合结构域与至少两个Fc结构域组合以产生具有独特生物活性的新型治疗剂。在一些情况下，本文公开的新型治疗剂具有比含单个Fc结构域的治疗剂(例如，已知治疗性抗体)更大的生物活性。至少两个Fc结构域的存在可以增强效应子功能并激活多种效应子功能，诸如ADCC结合ADCP和/或CDC，从而提高治疗性分子的功效。
本文所述的方法和组合物允许通过将多种正交异二聚化技术(例如，选自表4和表5的两组不同的突变)和/或同二聚化技术(例如，选自表6和表7的突变)引入结合在一起以形成同一蛋白质的多肽中来构建具有多个Fc结构域的抗原结合蛋白。本文所述的设计原理(将多个异二聚化突变和/或同二聚化突变引入组装成同一蛋白质的多肽中)允许创建多种多样的蛋白质构型，包括例如具有串联Fc结构域的抗体样蛋白质、对称分支蛋白质、非对称分支蛋白质和多特异性抗原靶向蛋白质。本文所述的设计原理允许受控产生复杂的蛋白质构型，同时不利于形成不期望的更高级结构或不受控复合物。
本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体可以包含至少两个抗原结合结构域以及通过接头连接在一起的至少两个Fc结构域，其中至少两个Fc结构域彼此不同，例如，构建体的至少一个Fc结构域与抗原结合结构域(例如，VH结构域、CH1结构域)连接，并且构建体的至少一个Fc结构域不与抗原结合结构域连接，或者构建体的两个Fc结构域与不同的抗原结合结构域连接。通过以下过程制造Fc-抗原结合结构域构建体：表达含有两个或更多个被接头分开的Fc单体的一条长肽链，并且表达各自含有被设计成优先结合长肽链上的一个或多个特定Fc单体的单个Fc单体的两条或更多条不同的短肽链。可以以这种方式串联连接任意数量的Fc结构域，从而允许创建具有2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个Fc结构域的构建体。
Fc-抗原结合结构域构建体使用在PCT/US2018/012689、WO 2015/168643、WO2017/151971、WO 2017/205436和WO 2017/205434(这些文献通过引用整体并入本文)中描述的用于组装具有两个或更多个Fc结构域的分子的Fc工程化方法。这些工程化方法利用一组或两组异二聚化选择性模块来准确组装正交Fc-抗原结合结构域构建体(构建体22-42；图4-图13；图16-图36:(i)具有不同反向电荷突变(表5)的异二聚化选择性模块以及(ii)具有工程化空腔和突起(表4)的异二聚化选择性模块)。可以将任何异二聚化选择性模块结合到一对Fc单体中，该对Fc单体被设计成通过将特定的氨基酸置换引入每个Fc单体多肽中来组装到构建体的特定Fc结构域中。异二聚化选择性模块被设计成支持具有特定异二聚化选择性模块的互补氨基酸置换的Fc单体之间的缔合，同时不利于与具有不同异二聚化选择性模块的突变的Fc单体缔合。这些异二聚体化突变确保将不同的Fc单体多肽组装成构建体的不同Fc结构域的所需串联构型，而最小化形成较小或较大复合物。这些构建体的特性允许有效产生基本上同质的药物组合物，这对于确保药物组合物的安全性、功效、均匀性和可靠性是期望的。
在一些实施方案中，本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体的组装可以使用本文所述的两组异二聚化突变之间的不同静电转向突变来实现。静电转向突变的一个实例是Fc单体的第一旋钮中的E357K和Fc单体的第一孔洞中的K370D(其中这些Fc单体缔合形成第一Fc结构域)以及Fc单体的第二旋钮中的D399K和Fc单体的第二孔洞中的K409D(其中这些Fc单体缔合形成第二Fc结构域)。
在一些实施方案中，Fc-抗原结合结构域构建体具有至少两个对不同靶分子具有不同结合特征(诸如不同结合亲和力(对于相同或不同靶标))或特异性的抗原结合结构域(例如，两个、三个、四个、五个或六个抗原结合结构域)。可由上述Fc支架产生双特异性、三特异性或多特异性构建体，其中Fc-抗原结合结构域构建体的两个或更多个多肽包括不同的抗原结合结构域。在一些实施方案中，构建体的抗原结合结构域具有不同的靶标特异性，即抗原结合结构域与不同的靶分子结合。在一些实施方案中，长链多肽包括一个具有第一特异性的抗原结合结构域，而短链多肽包括具有第二特异性的不同抗原结合结构域。不同的抗原结合结构域可使用不同的轻链或共同的轻链，或者可由scFv结构域或Fab相关结构域组成(参见图4)。该概念的说明性实例是Fc-抗原结合结构域构建体22-42(图16-图36)和图4-图13中的构建体。
可通过使用两组不同的异二聚化突变(即具有或不具有同二聚化突变的正交异二聚化突变)来产生双特异性和三特异性构建体(例如，Fc-抗原结合结构域构建体22-42；图16-图36；图4-图13)。此类异二聚化序列需要以它们不利于与其他异二聚化序列缔合的方式进行设计。此类涉设计可以使用如本文所述的两组异二聚化突变之间的不同静电转向突变和/或两组异二聚化突变之间的不同的突起-进入-空腔突变来实现。正交静电转向突变的一个实例是第一旋钮Fc中的E357K、第一孔洞Fc中的K370D、第二旋钮Fc中的D399K和第二孔洞Fc中的K409D。
I.Fc结构域单体
Fc结构域单体包括铰链结构域、CH2抗体恒定结构域和CH3抗体恒定结构域(例如，人IgG1铰链、CH2抗体恒定结构域和具有任选氨基酸置换的CH3抗体恒定结构域)的至少一部分。Fc结构域单体可以是免疫球蛋白抗体同种型IgG、IgE、IgM、IgA或IgD。Fc结构域单体也可以是任何免疫球蛋白抗体同种型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)。Fc结构域单体也可以是杂合体，例如具有来自IgG1的铰链和CH2以及来自IgA的CH3或者具有来自IgG1的铰链和CH2以及来自IgG3的CH3。Fc结构域单体的二聚体是可以结合Fc受体(例如，FcγRIIIa，一种位于白细胞的表面上的受体)的Fc结构域(本文进一步定义)。在本公开中，Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域可在CH3-CH3抗体恒定结构域的界面处含有氨基酸置换，以促进它们彼此的缔合。在其他实施方案中，Fc结构域单体包括附接到N末端或C末端的附加部分，例如白蛋白结合肽或纯化肽。在本公开中，Fc结构域单体不含有任何类型的抗体可变区，例如VH、VL、互补决定区(CDR)或高变区(HVR)。
在一些实施方案中，本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体(例如，具有三个Fc结构域的Fc-抗原结合结构域构建体)中的Fc结构域单体可具有与SEQ ID NO:42的序列具有至少95％同一性(至少97％、99％或99.5％同一性)的序列。在一些实施方案中，本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体(例如，具有三个Fc结构域的Fc-抗原结合结构域构建体)中的Fc结构域单体可具有与SEQ ID NO:43、44、46、47、48和50-53中任一者的序列具有至少95％同一性(至少97％、99％或99.5％同一性)的序列。在某些实施方案中，Fc-抗原结合结构域构建体中的Fc结构域单体可具有与SEQ ID NO:48、52和53中任一者的序列具有至少95％同一性(至少97％、99％或99.5％同一性)的序列。
SEQ ID NO:42
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:44
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:46
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:48
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:50
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:51
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:52
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:53
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
II.Fc结构域
如本文所定义，Fc结构域包括两个Fc结构域单体，它们通过CH3抗体恒定结构域之间的相互作用而二聚化。Fc结构域形成与Fc受体(例如，Fc-γ受体(即Fcγ受体(FcγR))、Fc-α受体(即Fcα受体(FcαR))、Fc-ε受体(即、Fcε受体(FcεR))和/或新生儿Fc受体(FcRn))结合的最小结构。在一些实施方案中，本公开的Fc结构域与Fcγ受体(例如，FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRIIIb(CD16b))和/或FcγRIV和/或新生儿Fc受体(FcRn)结合。
III.抗原结合结构域
抗原结合结构域可以是与特定靶分子或靶分子组结合的任何蛋白质或多肽。抗原结合结构域包括特异性结合靶分子的一种或多种肽或多肽。抗原结合结构域可包括抗体的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是抗体或抗体构建体的片段，例如抗体的与靶抗原结合的最小部分。抗原结合结构域也可以是特异性结合靶标的合成工程化肽，例如基于纤连蛋白的结合蛋白(例如，FN3单体)。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是配体或受体。片段抗原结合(Fab)片段是抗体上与靶抗原结合的区域。它由重链和轻链中每一者的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。Fab片段包括VH、VL、CH1和CL结构域。可变结构域VH和VL各自在单体的氨基末端处包含一组3个互补决定区(CDR)。Fab片段可以是免疫球蛋白抗体同种型IgG、IgE、IgM、IgA或IgD。Fab片段单体也可以是任何免疫球蛋白抗体同种型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)。在一些实施方案中，在对免疫球蛋白进行蛋白酶(例如，胃蛋白酶)处理之后，Fab片段可共价附接到第二相同的Fab片段，从而形成F(ab’)2片段。在一些实施方案中，Fab可表达为单个多肽，该单个多肽包括例如与结构域之间的接头融合的可变结构域和恒定结构域。
在一些实施方案中，可仅使用Fab片段的一部分作为抗原结合结构域。在一些实施方案中，可仅使用Fab的轻链组分(VL+CL)，或者可仅使用Fab的重链组分(VH+CH)。在一些实施方案中，可使用单链可变片段(scFv)，该单链可变片段是Fab可变区的VH和VL链的融合蛋白。在其他实施方案中，可使用线性抗体，该线性抗体包括一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该对串联Fd区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。
在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是本领域已知的任何Fab相关构建体。例如，抗原结合结构域可以是通过经由肽接头将轻链可变结构域与重链可变结构域融合而形成的单链可变片段(scFv)结构域。参见Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-83,1988，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是基于骆驼科(Camelidae)重链抗体的可变重链(VHH)或纳米抗体结构域。参见Kastelic等人,J.Immunol.Methods,350:54-62,2009，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是基于角鲨科(Squalidae)重链抗体的可变新抗原受体(VNAR)片段。参见Greenberg等人,Eur.J.Immunol.,26:1123–9,1996，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是可以通过产生两个肽序列而形成的双抗体(Db)。例如，可以将对抗原A具有特异性的可变轻结构域经由短肽接头与对抗原B具有特异性的可变重结构域融合，并表达为单条多肽链。当结合多肽链包含经由短肽接头与对抗原B具有特异性的可变轻结构域融合的对抗原A具有特异性的可变重结构域时，形成具有抗原A和B的结合结构域的双链抗体。参见Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-8,1993，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是可以通过在双抗体的两条链之间添加肽接头而形成的单链双抗体(scDb)。参见Brüsselbach等人,TumorTargeting,4:115-23,1999，该文献通过引用整体并入本文。
可将抗原结合结构域在本文所述的含Fc的多肽内以各种数量放置并且放置在各种位置处。在一些实施方案中，可将一个或多个抗原结合结构域放置在含Fc的多肽的Fc结构域的N末端、C末端和/或这些Fc结构域之间。在一些实施方案中，可将多肽或肽接头放置在抗原结合结构域(例如，Fab结构域)与含Fc的多肽的Fc结构域之间。在一些实施方案中，可将串联连接的多个抗原结合结构域(例如，2、3、4或5个或更多个抗原结合结构域)沿着多肽链放置在任何位置处(Wu等人,Nat.Biotechnology,25:1290-1297,2007)。
在一些实施方案中，可以将两个或更多个抗原结合结构域相对于彼此以各种距离放置在含Fc结构域的多肽上或由多个含Fc结构域的多肽制成的蛋白质复合物上。在一些实施方案中，将两个或更多个抗原结合结构域彼此靠近放置，例如放置在同一Fc结构域上，如在单克隆抗体中。在一些实施方案中，将两个或更多个抗原结合结构域相对于彼此更远离地放置，例如抗原结合结构域被蛋白质结构上的1、2、3、4或5个或更多个Fc结构域彼此分开。
在一些实施方案中，Fc-抗原结合结构域构建体可以具有两个或更多个具有不同靶标特异性的抗原结合结构域，例如两个、三个、四个或五个或更多个具有不同靶标特异性的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合结构域包括表1A或表1B中列出的靶标或抗原，以及表1A或表1B中针对所列出的靶标或抗原列出的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个CDR序列，如下表1A或表1B进一步详细提供。在一些实施方案中，Fc-抗原结合结构域构建体具有两个或更多个抗原结合结构域，每个抗原结合结构域具有表1A或表1B中针对所列出的靶标或抗原列出的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个CDR序列，其中两个或更多个抗原结合结构域具有不同的CDR序列，例如其中一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR序列在Fc构建体的抗原结合结构域之间不同。
Figure BDA0002972274020000431
Figure BDA0002972274020000441
Figure BDA0002972274020000451
Figure BDA0002972274020000461
Figure BDA0002972274020000471
表1B：可变结构域序列
Figure BDA0002972274020000481
Figure BDA0002972274020000491
Fc-抗原结合结构域构建体22的抗原结合结构域(图16中的2204/2222)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体22的抗原结合结构域(图16中的2218/2220和2212/2214中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体23的抗原结合结构域(图17中的2330/2304)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体23的抗原结合结构域(图17中的2328/2326、2322/2320和2316/2314中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体24的抗原结合结构域(图18中的2430/2428和2420/2422中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体24的抗原结合结构域(图18中的2432/2406和2418/2416中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体25的抗原结合结构域(图19中的2532/2506和2530/2528中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体25的抗原结合结构域(图19中的2510/2512和2524/2522中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体26的抗原结合结构域(图20中的2648/2646和2634/2636中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体26的抗原结合结构域(图20中的2612/2614、2650/2608、2632/2630和2626/2624中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体27的抗原结合结构域(图21中的2748/2746和2738/2740中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体27的抗原结合结构域(图21中的2714/2716、2750/2708、2736/2734和2728/2726中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体28的抗原结合结构域(图22中的2850/2808和2848/2846中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体28的抗原结合结构域(图22中的2818/2820、2812/2814、2842/2840和2836/2834中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体29的抗原结合结构域(图23中的2918/2904)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体29的抗原结合结构域(图23中的2914/2912)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体30的抗原结合结构域(图24中的3022/3004和3020/3018中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体30的抗原结合结构域(图24中的3014/3012)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体31的抗原结合结构域(图25中的3122/3104)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体31的抗原结合结构域(图25中的3120/3118)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体31的抗原结合结构域(图25中的3114/3112)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体32的抗原结合结构域(图26中的3226/3204)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体32的抗原结合结构域(图26中的3222/3220和3216/3214中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体33的抗原结合结构域(图27中的3330/3304和3328/3326中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体33的抗原结合结构域(图27中的3322/3320和3316/3314中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体34的抗原结合结构域(图28中的3430/3404)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体34的抗原结合结构域(图28中的3428/3426)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体34的抗原结合结构域(图28中的3422/3420和3416/3414中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体35的抗原结合结构域(图29中的3530/3528和3520/3522中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体35的抗原结合结构域(图29中的3532/3506)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体35的抗原结合结构域(图29中的3518/3516)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体36的抗原结合结构域(图30中的3638/3636和3628/3620中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体36的抗原结合结构域(图30中的3640/3606和3626/3624中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体37的抗原结合结构域(图31中的3748/3746和3738/3740中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体37的抗原结合结构域(图31中的3750/3708和3736/3734中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体37的抗原结合结构域(图31中的3714/3716和3728/3726中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体38的抗原结合结构域(图32中的3832/3806和3830/3822中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体38的抗原结合结构域(图32中的3810/3812)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体38的抗原结合结构域(图32中的3824/3822)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体39的抗原结合结构域(图33中的3938/3936和3924/3926中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体39的抗原结合结构域(图33中的3940/3906和3922/3920中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体40的抗原结合结构域(图34中的4048/4046和4034/4036中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体40的抗原结合结构域(图34中的4050/4008和4032/4030中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体40的抗原结合结构域(图34中的4012/4014和4026/4024中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体41的抗原结合结构域(图35中的4140/4106和4138/4136中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体41的抗原结合结构域(图35中的4112/4114和4130/4128中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体42的抗原结合结构域(图36中的4250/4208和4248/4246中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体42的抗原结合结构域(图36中的4218/4220和4236/4234中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体42的抗原结合结构域(图36中的4212/4214和4242/4240中的每一者)可以包括表1A或表1B中列出的抗体中的任何一种的三个重链和三个轻链CDR序列。
在一些实施方案中，抗原结合结构域(例如，Fab或scFv)包括表2或表1B中列出的抗体的VH和VL链。在一些实施方案中，Fab包括表2或表1B中列出的抗体的VH和VL链中包含的CDR。在一些实施方案中，Fab包括表2中列出的抗体的VH和VL链中包含的CDR，并且VH和VL序列的其余部分与表2中的抗体的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。在一些实施方案中，Fab包括表1B中列出的抗体的VH和VL链中包含的CDR，并且VH和VL序列的其余部分与表1B中的抗体的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
表2
Figure BDA0002972274020000531
Figure BDA0002972274020000541
Fc-抗原结合结构域构建体22的抗原结合结构域(图16中的2204/2222)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体22的抗原结合结构域(图16中的2218/2220和2212/2214中的每一者)可以包括表2中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体23的抗原结合结构域(图17中的2330/2304)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体23的抗原结合结构域(图17中的2328/2326、2322/2320和2316/2314中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体24的抗原结合结构域(图18中的2430/2428和2420/2422中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体24的抗原结合结构域(图18中的2432/2406和2418/2416中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体25的抗原结合结构域(图19中的2532/2506和2530/2528中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体25的抗原结合结构域(图19中的2510/2512和2524/2522中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体26的抗原结合结构域(图20中的2648/2646和2634/2636中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体26的抗原结合结构域(图20中的2612/2614、2650/2608、2632/2630和2626/2624中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体27的抗原结合结构域(图21中的2748/2746和2738/2740中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体27的抗原结合结构域(图21中的2714/2716、2750/2708、2736/2734和2728/2726中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体28的抗原结合结构域(图22中的2850/2808和2848/2846中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体28的抗原结合结构域(图22中的2818/2820、2812/2814、2842/2840和2836/2834中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体29的抗原结合结构域(图23中的2918/2904)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体29的抗原结合结构域(图23中的2914/2912)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体30的抗原结合结构域(图24中的3022/3004和3020/3018中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体30的抗原结合结构域(图24中的3014/3012)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体31的抗原结合结构域(图25中的3122/3104)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体31的抗原结合结构域(图25中的3120/3118)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体31的抗原结合结构域(图25中的3114/3112)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体32的抗原结合结构域(图26中的3226/3204)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体32的抗原结合结构域(图26中的3222/3220和3216/3214中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体33的抗原结合结构域(图27中的3330/3304和3328/3326中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体33的抗原结合结构域(图27中的3322/3320和3316/3314中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体34的抗原结合结构域(图28中的3430/3404)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体34的抗原结合结构域(图28中的3428/3426)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体34的抗原结合结构域(图28中的3422/3420和3416/3414中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体35的抗原结合结构域(图29中的3530/3528和3520/3522中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体35的抗原结合结构域(图29中的3532/3506)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体35的抗原结合结构域(图29中的3518/3516)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体36的抗原结合结构域(图30中的3638/3636和3628/3620中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体36的抗原结合结构域(图30中的3640/3606和3626/3624中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体37的抗原结合结构域(图31中的3748/3746和3738/3740中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体37的抗原结合结构域(图31中的3750/3708和3736/3734中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体37的抗原结合结构域(图31中的3714/3716和3728/3726中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体38的抗原结合结构域(图32中的3832/3806和3830/3822中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体38的抗原结合结构域(图32中的3810/3812)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体38的抗原结合结构域(图32中的3824/3822)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体39的抗原结合结构域(图33中的3938/3936和3924/3926中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体39的抗原结合结构域(图33中的3940/3906和3922/3920中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体40的抗原结合结构域(图34中的4048/4046和4034/4036中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体40的抗原结合结构域(图34中的4050/4008和4032/4030中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体40的抗原结合结构域(图34中的4012/4014和4026/4024中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体41的抗原结合结构域(图35中的4140/4106和4138/4136中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体41的抗原结合结构域(图35中的4112/4114和4130/4128中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体42的抗原结合结构域(图36中的4250/4208和4248/4246中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体42的抗原结合结构域(图36中的4218/4220和4236/4234中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体42的抗原结合结构域(图36中的4212/4214和4242/4240中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列。
Fc-抗原结合结构域构建体22的抗原结合结构域(图16中的2204/2222)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体22的抗原结合结构域(图16中的2218/2220和2212/2214中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体23的抗原结合结构域(图17中的2330/2304)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体23的抗原结合结构域(图17中的2328/2326、2322/2320和2316/2314中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体24的抗原结合结构域(图18中的2430/2428和2420/2422中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体24的抗原结合结构域(图18中的2432/2406和2418/2416中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体25的抗原结合结构域(图19中的2532/2506和2530/2528中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体25的抗原结合结构域(图19中的2510/2512和2524/2522中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体26的抗原结合结构域(图20中的2648/2646和2634/2636中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体26的抗原结合结构域(图20中的2612/2614、2650/2608、2632/2630和2626/2624中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体27的抗原结合结构域(图21中的2748/2746和2738/2740中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体27的抗原结合结构域(图21中的2714/2716、2750/2708、2736/2734和2728/2726中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体28的抗原结合结构域(图22中的2850/2808和2848/2846中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体28的抗原结合结构域(图22中的2818/2820、2812/2814、2842/2840和2836/2834中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体29的抗原结合结构域(图23中的2918/2904)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体29的抗原结合结构域(图23中的2914/2912)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体30的抗原结合结构域(图24中的3022/3004和3020/3018中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体30的抗原结合结构域(图24中的3014/3012)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体31的抗原结合结构域(图25中的3122/3104)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体31的抗原结合结构域(图25中的3120/3118)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体31的抗原结合结构域(图25中的3114/3112)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体32的抗原结合结构域(图26中的3226/3204)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体32的抗原结合结构域(图26中的3222/3220和3216/3214中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体33的抗原结合结构域(图273中的3330/3304和3328/3326中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体33的抗原结合结构域(图27中的3322/3320和3316/3314中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体34的抗原结合结构域(图28中的3430/3404)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体34的抗原结合结构域(图28中的3428/3426)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体34的抗原结合结构域(图28中的3422/3420和3416/3414中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体35的抗原结合结构域(图29中的3530/3528和3520/3522中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体35的抗原结合结构域(图29中的3532/3506)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体35的抗原结合结构域(图29中的3518/3516)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体36的抗原结合结构域(图30中的3638/3636和3628/3620中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体36的抗原结合结构域(图30中的3640/3606和3626/3624中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体37的抗原结合结构域(图31中的3748/3746和3738/3740中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体37的抗原结合结构域(图31中的3750/3708和3736/3734中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体37的抗原结合结构域(图31中的3714/3716和3728/3726中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体38的抗原结合结构域(图32中的3832/3806和3830/3822中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体38的抗原结合结构域(图32中的3810/3812)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体38的抗原结合结构域(图32中的3824/3822)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体39的抗原结合结构域(图33中的3938/3936和3924/3926中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体39的抗原结合结构域(图33中的3940/3906和3922/3920中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体40的抗原结合结构域(图34中的4048/4046和4034/4036中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体40的抗原结合结构域(图34中的4050/4008和4032/4030中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体40的抗原结合结构域(图34中的4012/4014和4026/4024中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体41的抗原结合结构域(图35中的4140/4106和4138/4136中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体41的抗原结合结构域(图35中的4112/4114和4130/4128中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体42的抗原结合结构域(图36中的4250/4208和4248/4246中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体42的抗原结合结构域(图36中的4218/4220和4236/4234中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体42的抗原结合结构域(图36中的4212/4214和4242/4240中的每一者)可以包括表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列中包含的CDR序列。
Fc-抗原结合结构域构建体22的抗原结合结构域(图16中的2204/2222)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体22的抗原结合结构域(图16中的2218/2220和2212/2214中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体23的抗原结合结构域(图17中的2330/2304)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体23的抗原结合结构域(图17中的2328/2326、2322/2320和2316/2314中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体24的抗原结合结构域(图18中的2430/2428和2420/2422中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体24的抗原结合结构域(图18中的2432/2406和2418/2416中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体25的抗原结合结构域(图19中的2532/2506和2530/2528中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体25的抗原结合结构域(图19中的2510/2512和2524/2522中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体26的抗原结合结构域(图20中的2648/2646和2634/2636中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体26的抗原结合结构域(图20中的2612/2614、2650/2608、2632/2630和2626/2624中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体27的抗原结合结构域(图21中的2748/2746和2738/2740中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体27的抗原结合结构域(图21中的2714/2716、2750/2708、2736/2734和2728/2726中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体28的抗原结合结构域(图22中的2850/2808和2848/2846中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体28的抗原结合结构域(图22中的2818/2820、2812/2814、2842/2840和2836/2834中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体29的抗原结合结构域(图23中的2918/2904)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体29的抗原结合结构域(图23中的2914/2912)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体30的抗原结合结构域(图24中的3022/3004和3020/3018中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体30的抗原结合结构域(图24中的3014/3012)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体31的抗原结合结构域(图25中的3122/3104)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体31的抗原结合结构域(图25中的3120/3118)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体31的抗原结合结构域(图25中的3114/3112)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体32的抗原结合结构域(图26中的3226/3204)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体32的抗原结合结构域(图26中的3222/3220和3216/3214中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体33的抗原结合结构域(图27中的3330/3304和3328/3326中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体33的抗原结合结构域(图27中的3322/3320和3316/3314中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体34的抗原结合结构域(图28中的3430/3404)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体34的抗原结合结构域(图28中的3428/3426)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体34的抗原结合结构域(图28中的3422/3420和3416/3414中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体35的抗原结合结构域(图29中的3530/3528和3520/3522中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体35的抗原结合结构域(图29中的3532/3506)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体35的抗原结合结构域(图29中的3518/3516)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体36的抗原结合结构域(图30中的3638/3636和3628/3620中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体36的抗原结合结构域(图30中的3640/3606和3626/3624中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体37的抗原结合结构域(图31中的3748/3746和3738/3740中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体37的抗原结合结构域(图31中的3750/3708和3736/3734中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体37的抗原结合结构域(图31中的3714/3716和3728/3726中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体38的抗原结合结构域(图32中的3832/3806和3830/3822中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体38的抗原结合结构域(图32中的3810/3812)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体38的抗原结合结构域(图32中的3824/3822)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体39的抗原结合结构域(图33中的3938/3936和3924/3926中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体39的抗原结合结构域(图33中的3940/3906和3922/3920中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体40的抗原结合结构域(图34中的4048/4046和4034/4036中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体40的抗原结合结构域(图34中的4050/4008和4032/4030中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体40的抗原结合结构域(图34中的4012/4014和4026/4024中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体41的抗原结合结构域(图35中的4140/4106和4138/4136中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体41的抗原结合结构域(图35中的4112/4114和4130/4128中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体42的抗原结合结构域(图36中的4250/4208和4248/4246中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体42的抗原结合结构域(图36中的4218/4220和4236/4234中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
Fc-抗原结合结构域构建体42的抗原结合结构域(图36中的4212/4214和4242/4240中的每一者)可以包括VH和VL序列中包含的CDR序列，并且VH和VL序列的其余部分与表2或表1B中列出的抗体中的任何一种的VH和VL序列具有至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或至99.5％同一性。
抗原结合结构域异二聚化突变
在一些情况下，可以将一种或多种异二聚化技术结合到本文所述的Fc构建体的抗原结合结构域中以促进抗原结合结构域在构建体上的组装。当两个或更多个不同的抗原结合结构域附接到Fc构建体时，例如当具有不同靶标特异性的抗原结合结构域附接到双特异性或三特异性Fc构建体时，在抗原结合结构域中使用异二聚化技术特别有用。例如，可以将第一异二聚化技术结合到具有第一靶标特异性的第一Fab结构域中，并且可以将第二异二聚化技术结合到具有第二靶标特异性的第二Fab结构域中。第一异二聚化技术促进第一Fab的重链和轻链的缔合，同时阻止第一Fab的重链或轻链与第二Fab的重链或轻链的缔合。同样，第二异二聚化技术促进第二Fab的重链和轻链的缔合，同时阻止第二Fab的重链或轻链与第一Fab的重链或轻链的缔合。
在一些实施方案中，将表3中存在的一种或多种异二聚化技术引入Fc-抗原结合结构域构建体上的一个或多个抗原结合结构域中。在一些实施方案中，抗原结合结构域具有如以下文献中所述的至少一种异二聚化技术：Liu等人,J.Biol.Chem.290:7535-7562,2015；Schaefer等人,Cancer Cell,20:472-86,2011；Lewis等人,Nat Biotechnol,32:191-8,2014；Wu等人,MAbs,7:364-76,2015；Golay等人,J Immunol,196:3199-211,2016；以及Mazor等人,MAbs,7:377-89,2015，这些文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，可以将异二聚化技术结合到抗原结合结构域的VH结构域、CH1结构域、VL结构域和/或CL结构域。在一些实施方案中，异二聚化技术可以是抗原结合结构域的VH结构域、CH1结构域、VL结构域和/或CL结构域中的一个或多个突变。
表3.Fab臂异二聚化方法
Figure BDA0002972274020000691
表3.Fab臂异二聚化方法
Figure BDA0002972274020000701
1所有残基均按提供的参考文献中所述进行编号
IV.二聚化选择性模块
在本公开中，二聚化选择性模块包括Fc结构域单体内的组分或选择性氨基酸，所述组分或选择性氨基酸促进两个Fc结构域单体的优选配对以形成Fc结构域。具体地，二聚化选择性模块是Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域的部分，该部分包括位于两个Fc结构域单体的相互作用的CH3抗体恒定结构域之间的界面处的氨基酸置换。在二聚化选择性模块中，由于针对氨基酸置换选择的氨基酸的相容性，那些置换使得两个CH3抗体恒定结构域的二聚化变得有利。有利的Fc结构域的最终形成选择性超过其他Fc结构域，所述其他Fc结构域由缺少二聚化选择性模块的Fc结构域单体形成或在二聚化选择性模块中具有不相容的氨基酸置换。这种类型的氨基酸置换可以使用本领域众所周知的常规分子克隆技术(诸如
Figure BDA0002972274020000702
诱变)产生。
在一些实施方案中，二聚化选择性模块在CH3抗体恒定结构域中包括工程化空腔(本文进一步描述)。在其他实施方案中，二聚化选择性模块在CH3抗体恒定结构域中包括工程化突起(本文进一步描述)。为了选择性地形成Fc结构域，具有相容二聚化选择性模块的两个Fc结构域单体(例如，含有工程化空腔的一个CH3抗体恒定结构域和含有工程化突起的另一个CH3抗体恒定结构域)组合以形成Fc结构域单体的突起-进入-空腔对。工程化突起和工程化空腔是异二聚化选择性模块的实例，它们可以在Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域中产生，以便促进具有相容异二聚化选择性模块的两个Fc结构域单体的有利异二聚化。
在其他实施方案中，具有包含带正电荷的氨基酸置换的二聚化选择性模块的Fc结构域单体和具有包含带负电荷的氨基酸置换的二聚化选择性模块的Fc结构域单体可通过带电氨基酸的有利静电转向(本文进一步描述)选择性地组合以形成Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域单体可包括以下带正电荷和带负电荷的氨基酸置换中的一者或多者：K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439D和K439E。在一个实例中，包含带正电荷的氨基酸置换(例如，D356K或E357K)的Fc结构域单体和包含带负电荷的氨基酸置换(例如，K370D或K370E)的Fc结构域单体可通过带电氨基酸的有利静电转向选择性地组合以形成Fc结构域。在另一个实例中，包含E357K的Fc结构域单体和包含K370D的Fc结构域单体可通过带电氨基酸的有利静电转向选择性地组合以形成Fc结构域。在另一个实例中，包含E356K和D399K的Fc结构域单体和包含K392D和K409D的Fc结构域单体可通过带电氨基酸的有利静电转向选择性地组合以形成Fc结构域。在一些实施方案中，可将反向电荷氨基酸置换用作异二聚化选择性模块，其中包含不同但相容的反向电荷氨基酸置换的两个Fc结构域单体组合以形成异二聚体Fc结构域。特定二聚化选择性模块在下文进一步描述的表4和表5中进一步列出，但不限于此。
在其他实施方案中，两个Fc结构域单体包括在CH3结构域之间的界面处的带电残基环内至少两个位置中包含相同的反向电荷突变的同二聚化选择性模块。同二聚体选择性模块是促进Fc结构域单体的同二聚化以形成同二聚体Fc结构域的反向电荷氨基酸置换。通过逆转两个Fc结构域单体中的两个或更多个互补残基对的两个成员的电荷，突变的Fc结构域单体保持与相同突变序列的Fc结构域单体互补，但与不含那些突变的Fc结构域单体具有更低的互补性。在一个实施方案中，Fc结构域包括Fc结构域单体，其包括双重突变体K409D/D399K、K392D/D399K、E357K/K370E、D356K/K439D、K409E/D399K、K392E/D399K、E357K/K370D或D356K/K439E。在另一个实施方案中，Fc结构域包括Fc结构域单体，其包括组合任何一对双重突变体的四重突变体，例如K409D/D399K/E357K/K370E。同二聚化选择性模块的实例进一步在表5和表6中示出。同二聚化Fc结构域可以用于在Fc-抗原结合结构域构建体上产生对称的分支点。在一个实施方案中，本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体具有一个同二聚化Fc结构域。在一个实施方案中，Fc-抗原结合结构域构建体具有两个或更多个同二聚化Fc结构域，例如两个、三个、四个或五个或更多个同二聚化结构域。在一个实施方案中，Fc-抗原结合结构域构建体具有三个同二聚化Fc结构域。在一些实施方案中，Fc-抗原结合结构域构建体具有一个同二聚化选择性模块。在一些实施方案中，Fc-抗原结合结构域构建体具有两个或更多个同二聚化选择性模块，例如两个、三个、四个或五个或更多个同二聚化选择性模块。
在其他实施方案中，含有(i)至少一个反向电荷突变和(ii)至少一个工程化空腔或至少一个工程化突起的Fc结构域单体可与另一个含有(i)至少一个反向电荷突变和(ii)至少一个工程化突起或至少一个工程化空腔的Fc结构域单体选择性地组合以形成Fc结构域。例如，含有反向电荷突变K370D和工程化空腔Y349C、T366S、L368A和Y407V的Fc结构域单体以及另一个含有反向电荷突变E357K和工程改化突起S354C和T366W的Fc结构域单体可选择性地组合以形成Fc结构域。
此类Fc结构域的形成通过CH3抗体恒定结构域中的相容氨基酸置换来促进。含有不相容氨基酸置换的两个二聚化选择性模块(例如，两者均含有工程化空腔，两者均含有工程化突起，或两者均在CH3-CH3界面处含有相同的带电氨基酸)不会促进异二聚体Fc结构域的形成。
可以使用多对异二聚化Fc结构域来产生具有多个不对称分支点、多个非分支点或不对称分支点和非分支点两者的Fc-抗原结合结构域构建体。将多种不同的异二聚化技术(参见例如，表4和表5)结合到不同的Fc结构域中以组装这些含Fc结构域的构建体。异二聚化技术对不期望的Fc单体配对具有最小的缔合(正交性)。可以在不同的Fc结构域中使用两种不同的Fc异二聚化方法(诸如旋钮-进入-孔洞(表4)和静电转向(表5))，以控制多肽链组装成所需构建体。另选地，可以将两个不同的旋钮-进入-孔洞变体(例如，选自表4的两组不同的突变)或两个不同的静电转向变体(例如，选自表5的两组不同的突变)用于不同的Fc结构域中，以控制多肽链组装成所需的构建体。可以通过将异二聚化Fc结构域的Fc结构域单体放置在不同的多肽链(多肽链具有多个Fc结构域)上来产生不对称分支。可以通过将异二聚化Fc结构域的一个Fc结构域单体放置在具有多个Fc结构域的多肽链上并且将异二聚化Fc结构域的另一个Fc结构域单体放置在具有单个Fc结构域的多肽链上来产生非分支点。
在一些实施方案中，本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体是线性的。在一些实施方案中，本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体不具有分支点。例如，Fc-抗原结合结构域构建体可以由一个较大肽与两个或更多个Fc结构域单体(其中至少两个Fc结构域单体是不同的(即，具有不同的异二聚化突变))以及两个或更多个较小肽(各自具有不同的单个Fc结构域单体(即，两个或更多个较小肽具有Fc结构域单体，这些Fc结构域单体具有不同的异二聚化突变))组装而成。本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体可以具有彼此不相容的两个或更多个二聚化选择性模块，例如选自表4和/或表5的至少两个不相容的二聚化选择性模块，这些二聚化选择性模块促进或有利于Fc-抗原结合结构域构建体的适当形成，从而每个较小肽的Fc结构域单体与较大肽上的其相容Fc结构域单体缔合。在一些实施方案中，长肽上的第一Fc结构域单体或Fc结构域单体的第一子集包含形成第一二聚化选择性模块的一部分的氨基酸置换，该部分与第一二聚化选择性模块的通过第一短肽的Fc结构域单体中的氨基酸置换形成的一部分相容。长肽上的第二Fc结构域单体或Fc结构域单体的第二子集包含形成第二二聚化选择性模块的一部分的氨基酸置换，该部分与第二二聚化选择性模块的通过第二短肽的Fc结构域单体中的氨基酸置换形成的一部分相容。第一二聚化选择性模块有利于长肽上的第一Fc结构域单体(或Fc结构域单体的第一子集)与第一短肽的Fc结构域单体结合，同时不利于第一Fc结构域单体与第二短肽的Fc结构域单体之间的结合。类似地，第二二聚化选择性模块有利于长肽上的第二Fc结构域单体(或Fc结构域单体的第二子集)与第二短肽的Fc结构域单体结合，而不利于第二Fc结构域单体与第一短肽的Fc结构域单体之间的结合。
在某些实施方案中，Fc-抗原结合结构域构建体可以包括具有第一二聚化选择性模块的第一Fc结构域和具有第二二聚化选择性模块的第二Fc结构域。在一些实施方案中，第一Fc结构域由具有选自表4的至少一个突起形成突变和/或选自表5的至少一个反向电荷突变的一个Fc单体(例如，该Fc单体可以具有S354C和T366W突起形成突变以及E357K反向电荷突变)以及具有选自表4的至少一个空腔形成突变和/或选自表5的至少一个反向电荷突变的一个Fc单体(例如，该Fc单体可以具有Y349C、T366S、L368A和Y407V空腔形成突变以及K370D反向电荷突变)组装而成。在一些实施方案中，第二Fc结构域由具有选自表4的至少一个突起形成突变和/或选自表5的至少一个反向电荷突变的一个Fc单体(例如，该Fc单体可以具有D356K和D399K反向电荷突变)以及具有选自表4的至少一个空腔形成突变和/或选自表5的至少一个反向电荷突变的一个Fc单体(例如，该Fc单体可以具有K392D和K409D反向电荷突变)组装而成。
此外，用于促进具有明确的Fc结构域单体的Fc结构域的形成的其他方法包括但不限于：LUZ-Y方法(美国专利申请公开号WO2011034605)，该方法包括使亮氨酸拉链的单体α-螺旋与每个Fc结构域单体进行C末端融合，以允许异二聚体形成；以及链交换工程化结构域(SEED)主体方法(Davis等人,Protein Eng Des Sel.23:195-202,2010)，该方法生成具有异二聚体Fc结构域单体的Fc结构域，这些异二聚体Fc结构域单体各自包括IgA和IgG CH3序列的交替区段。
V.工程化空腔和工程化突起
Carter和同事(Ridgway等人,Protein Eng.9:617-612,1996；Atwell等人,J MolBiol.270:26-35,1997；Merchant等人,Nat Biotechnol.16:677-681,1998)描述了工程化空腔和工程化突起(或“旋钮-进入-孔洞”策略)的用途。旋钮和孔洞相互作用有利于异二聚体形成，而旋钮-旋钮和孔洞-孔洞相互作用由于空间冲突和有利相互作用的缺失会阻碍同二聚体形成。“旋钮-进入-孔洞”技术也在美国专利号5,731,168中公开。
在本公开中，工程化空腔和工程化突起用于制备本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体。工程化空腔是当用具有较小侧链体积的不同氨基酸替换蛋白质中的原始氨基酸时产生的空隙。工程化突起是当用具有较大侧链体积的不同氨基酸替换蛋白质中的原始氨基酸时产生的突起。具体地，被替换的氨基酸位于Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域中，并且涉及两个Fc结构域单体的二聚化。在一些实施方案中，产生一个CH3抗体恒定结构域中的工程化空腔，以容纳另一个CH3抗体恒定结构域中的工程化突起，使得两个CH3抗体恒定结构域均充当促进或有利于两个Fc结构域单体的二聚化的二聚化选择性模块(例如，异二聚化选择性模块)(上文描述)。在其他实施方案中，产生一个CH3抗体恒定结构域中的工程化空腔，以更好地容纳另一个CH3抗体恒定结构域中的原始氨基酸。在另外其他实施方案中，产生一个CH3抗体恒定结构域中的工程化突起，以与另一个CH3抗体恒定结构域中的原始氨基酸形成另外的相互作用。
可以通过用含有较小侧链的氨基酸(诸如丙氨酸、缬氨酸或苏氨酸)替换含有较大侧链(诸如酪氨酸或色氨酸)的氨基酸来构建工程化空腔。具体地，一些二聚化选择性模块(例如，异二聚化选择性模块)(上文进一步描述)含有工程化空腔，诸如CH3抗体恒定结构域中的Y407V突变。类似地，可以通过用含有较大侧链的氨基酸替换含有较小侧链的氨基酸来构建工程化突起。具体地，一些二聚化选择性模块(例如，异二聚化选择性模块)(上文进一步描述)含有工程化突起，诸如CH3抗体恒定结构域中的T366W突变。在本公开中，还将工程化空腔和工程化突起与CH3结构域间二硫键工程化组合，以增强异二聚体形成。在一个实例中，含有工程化空腔Y349C、T366S、L368A和Y407V的Fc结构域单体可与含有工程化突起S354C和T366W的另一个Fc结构域单体选择性地组合以形成Fc结构域。在另一个实例中，含有添加有Y349C的工程化空腔的Fc结构域单体和含有添加有S354C的工程化突起的Fc结构域单体可选择性地组合以形成Fc结构域。与二硫键工程化或结构计算(混合HA-TF)组合的其他工程化空腔和工程化突起包括在表4中，但不限于此。
表4：Fc异二聚化方法(旋钮-进入-孔洞)]
Figure BDA0002972274020000741
Figure BDA0002972274020000751
注意：所有残基均按EU编号方案(Edelman等人,Proc Natl Acad Sci USA,63:78-85,1969)进行编号
用不同的氨基酸残基替换CH3抗体恒定结构域中的原始氨基酸残基可以通过改变编码原始氨基酸残基的核酸来实现。可以被替换的原始氨基酸残基的数量上限是CH3抗体恒定结构域的界面中的残基总数，只要仍维持界面处充分的相互作用。
将工程化空腔和工程化突起与静电转向组合
可以将静电转向与旋钮-进入-孔洞调节技术组合，以有利于例如两个不同多肽中的Fc结构域单体之间的异二聚化作用。下文更详细描述的静电转向利用肽、蛋白质结构域和蛋白质中带相反电荷的氨基酸之间的有利静电相互作用来控制更高级蛋白质分子的形成。可以使用静电转向来促进同二聚化或异二聚化，可以将后者有效地与旋钮-进入-孔洞技术组合。在异二聚化的情况下，将不同但相容的突变引入要异二聚化的每个Fc结构域单体中。因此，可以修饰Fc结构域单体以包括以下带正电荷和带负电荷的氨基酸置换中的一者：D356K、D356R、E357K、E357R、K370D、K370E、K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439D和K439E。例如，一个Fc结构域单体(例如，具有空腔(Y349C、T366S、L368A和Y407V)的Fc结构域单体)还可以包括K370D突变，并且另一个Fc结构域单体(例如，具有突起(S354C和T366W)的Fc结构域单体)可以包括E357K。
更一般地，可以将以下任何空腔突变(或突变组合)与表5中的突变组合：Y407T、Y407A、F405A、Y407T、T394S、T394W:Y407A、T366W:T394S、T366S:L368A:Y407V:Y349C和S3364H:F405，并且可以将以下任何突起突变(或突变组合)与表5中的突变组合：T366Y、T366W、T394W、F405W、T366Y:F405A、T366W:Y407A、T366W:S354C和Y349T:T394F，该突变与表5中与空腔突变(突变组合)组合使用的突变配对。
VI.静电转向
静电转向是利用肽、蛋白质结构域和蛋白质中带相反电荷的氨基酸之间的有利静电相互作用来控制更高级蛋白质分子的形成。在美国专利申请公开号2014-0024111中公开了使用静电转向效应来改变抗体结构域的相互作用以减少同二聚体形成的方法，有利于在双特异性抗体的生成中的异二聚体形成。
在本公开中，使用静电转向来控制Fc结构域单体的二聚化和Fc-抗原结合结构域构建体的形成。具体地，为了使用静电转向来控制Fc结构域单体的二聚化，用带正电荷或带负电的氨基酸残基替换构成CH3-CH3界面的一个或多个氨基酸残基，使得相互作用取决于引入的具体带电氨基酸而变得具有静电有利或不利。在一些实施方案中，用带负电荷的氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)替换界面中带正电荷的氨基酸(诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)。在其他实施方案中，用带正电荷的氨基酸替换界面中带负电荷的氨基酸。可将带电氨基酸引入相互作用的CH3抗体恒定结构域中的一者或两者。通过将带电氨基酸引入相互作用的CH3抗体恒定结构域，产生二聚化选择性模块(上文进一步描述)，这些二聚化选择性模块可以选择性地形成Fc结构域单体的二聚体，如由来源于带电氨基酸之间的相互作用的静电转向效应控制。
在一些实施方案中，为了产生包括反向电荷的二聚化选择性模块(该二聚化选择性模块可以选择性地形成Fc结构域单体的二聚体，如由静电转向效应控制)，可通过异二聚化或同二聚化选择性地形成两个Fc结构域单体。
Fc结构域单体的异二聚化
可以通过在两个Fc结构域单体中引入不同但相容的突变(诸如表5中包括的电荷残基对，但不限于此)来促进Fc结构域单体的异二聚化。在一些实施方案中，Fc结构域单体可包括以下带正电荷和带负电荷的氨基酸置换中的一者或多者：D356K、D356R、E357K、E357R、K370D、K370E、K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439D和K439E，例如D356K、D356R、E357K、E357R、K370D、K370E、K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439D和K439E中的1、2、3、4或5个或更多个。在一个实例中，包含带正电荷的氨基酸置换(例如，D356K或E357K)的Fc结构域单体和包含带负电荷的氨基酸置换(例如，K370D或K370E)的Fc结构域单体可通过带电氨基酸的有利静电转向选择性地组合以形成Fc结构域。在另一个实例中，包含E357K的Fc结构域单体和包含K370D的Fc结构域单体可通过带电氨基酸的有利静电转向选择性地组合以形成Fc结构域。在另一个实例中，包含E356K和D399K的Fc结构域单体和包含K392D和K409D的Fc结构域单体可通过带电氨基酸的有利静电转向选择性地组合以形成Fc结构域。
“异二聚体Fc结构域”是指通过两个Fc结构域单体的异二聚化形成的Fc结构域，其中两个Fc结构域单体含有促进这两个Fc结构域单体的有利形成的不同反向电荷突变(异二聚化选择性模块)(参见例如，表5中的突变)。在一个实例中，在具有三个Fc结构域的Fc-抗原结合结构域构建体中，三个Fc结构域中的两个可通过两个Fc结构域单体的异二聚化形成，如通过静电转向效应促进。
表5：Fc异二聚化方法(静电转向)
Figure BDA0002972274020000771
Figure BDA0002972274020000781
注意：所有残基均按EU编号方案(Edelman等人,Proc Natl Acad Sci USA,63:78-85,1969)进行编号
Fc结构域单体的同二聚化
可以通过以对称方式在两个Fc结构域单体中引入相同的静电转向突变(同二聚化选择性模块)来促进Fc结构域单体的同二聚化。在一些实施方案中，两个Fc结构域单体包括在CH3结构域之间的界面处的带电残基环内至少两个位置中包含相同的反向电荷突变的同二聚化选择性模块。通过逆转两个Fc结构域单体中的两个或更多个互补残基对的两个成员的电荷，突变的Fc结构域单体保持与相同突变序列的Fc结构域单体互补，但与不含那些突变的Fc结构域单体具有更低的互补性。可被引入Fc结构域单体中以促进其同二聚化的静电转向突变在表5和表6中示出，但不限于此。在一个实施方案中，Fc结构域包括两个Fc结构域单体，每个Fc结构域单体包括双重反向电荷突变体(表5)，例如K409D/D399K。在另一个实施方案中，Fc结构域包括两个Fc结构域单体，每个Fc结构域单体包括四重反向突变体(表6)，例如K409D/D399K/K370D/E357K。
例如，在具有三个Fc结构域的Fc-抗原结合结构域构建体中，三个Fc结构域中的一个可通过两个Fc结构域单体的同二聚化形成，如通过静电转向效应促进。“同二聚体Fc结构域”是指通过两个Fc结构域单体的同二聚化形成的Fc结构域，其中两个Fc结构域单体含有相同的反向电荷突变(参见例如，表5和表6中的突变)。在具有三个Fc结构域(一个羧基末端“茎”Fc结构域和两个氨基末端“分支”Fc结构域)的Fc-抗原结合结构域构建体中，羧基末端“茎”Fc结构域可以是同二聚体Fc结构域(也称为“茎同二聚体Fc结构域”)。茎同二聚体Fc结构域可由两个Fc结构域单体形成，每个Fc结构域单体含有双重突变体K409D/D399K。
表6：Fc同二聚化方法
Figure BDA0002972274020000791
Figure BDA0002972274020000801
注意：所有残基均按EU编号方案(Edelman等人,Proc Natl Acad Sci USA,63:78-85,1969)进行编号
表7：Fc同二聚化方法
Figure BDA0002972274020000802
Figure BDA0002972274020000811
注意：所有残基均按EU编号方案(Edelman等人,Proc Natl Acad Sci USA,63:78-85,1969)进行编号
其他异二聚化方法
已经描述了许多其他异二聚化技术。可以将这些技术(表8)中的任何一种或多种与本文所述的任何旋钮-进入-孔洞和/或静电转向异二聚化和/或同二聚化技术组合，以产生Fc-抗原结合结构域构建体。
表8：其他Fc异二聚化方法
Figure BDA0002972274020000812
Figure BDA0002972274020000821
注意：所有残基均按EU编号方案(Edelman等人,Proc Natl Acad Sci USA,63:78-85,1969)进行编号
VII.接头
在本公开中，接头用于描述多肽或蛋白质结构域和/或结合的非蛋白质部分之间的键合或连接。在一些实施方案中，接头是至少两个Fc结构域单体之间的键合或连接，接头将第一Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域的C末端与第二Fc结构域单体的铰链结构域的N末端连接，使得两个Fc结构域单体彼此串联连接。在其他实施方案中，接头是Fc结构域单体与附接到其上的任何其他蛋白质结构域之间的键合。例如，接头可以将Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域的C末端附接到白蛋白结合肽的N末端。
接头可以是简单的共价键(例如，肽键)、合成聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)或由化学反应(例如，化学缀合)产生的任何种类的键。在接头是肽键的情况下，在一个蛋白质结构域的C末端处的羧酸基团可以在缩合反应中与另一个蛋白质结构域的N末端的氨基反应，以形成肽键。具体地，肽键可以通过本领域众所周知的常规有机化学反应由合成手段形成，或通过天然产生由宿主细胞形成，其中编码以串联系列的两种蛋白质的DNA序列的多核苷酸序列，例如两个Fc结构域的单体，可以通过宿主细胞中的必需分子机器，例如DNA聚合酶和核糖体，直接转录且翻译成编码两种蛋白质的连续多肽。
在接头是合成聚合物例如PEG聚合物的情况下，聚合物可以在每个末端处用反应性化学官能团官能化，以与在两个蛋白质的连接末端处的末端氨基酸反应。
在接头(除了上述肽键之外)由化学反应制成的情况下，可以分别将化学官能团(例如，胺、羧酸、酯、叠氮化物或本领域常用的其他官能团)合成地附接到一种蛋白质的C末端和另一种蛋白质的N末端。然后两个官能团可以通过合成化学手段反应，以形成化学键，因此将两种蛋白质连接在一起。此类化学缀合程序对于本领域技术人员是常规的。
间隔物
在本公开中，两个Fc结构域单体之间的接头可以是包括3-200个氨基酸的氨基酸间隔物(例如，3-200、3-180、3-160、3-140、3-120、3-100、3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-45、3-40、3-35、3-30、3-25、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-200、5-200、6-200、7-200、8-200、9-200、10-200、15-200、20-200、25-200、30-200、35-200、40-200、45-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200、120-200、140-200、160-200或180-200个氨基酸)。在一些实施方案中，两个Fc结构域单体之间的接头是含有至少12个氨基酸(诸如12-200个氨基酸(例如，12-200、12-180、12-160、12-140、12-120、12-100、12-90、12-80、12-70、12-60、12-50、12-40、12-30、12-20、12-19、12-18、12-17、12-16、12-15、12-14或12-13个氨基酸)(例如，14-200、16-200、18-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200、120-200、140-200、160-200、180-200或190-200个氨基酸))的氨基酸间隔物。在一些实施方案中，两个Fc结构域单体之间的接头是含有12-30个氨基酸(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸)的氨基酸间隔物。合适的肽间隔物是本领域已知的，并且包括例如含有柔性氨基酸残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)的肽接头。在某些实施方案中，间隔物可以含有GS、GGS、GGGGS(SEQ IDNO:1)、GGSG(SEQ ID NO:2)或SGGG(SEQ ID NO:3)的基序，例如多个或重复基序。在某些实施方案中，间隔物可以含有2至12个氨基酸，包括GS的基序，例如GS、GSGS(SEQ ID NO:4)、GSGSGS(SEQ ID NO:5)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:6)、GSGSGSGSGS(SEQ ID NO:7)或GSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:8)。在某些其他实施方案中，间隔物可以含有3至12个氨基酸，包括GGS的基序，例如GGS、GGSGGS(SEQ ID NO:9)、GGSGGSGGS(SEQ ID NO:10)和GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:11)。在另外其他实施方案中，间隔物可以含有4至20个氨基酸，包括GGSG(SEQID NO:2)的基序，例如GGSGGGSG(SEQ ID NO:12)、GGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:13)、GGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:14)或GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:15)。在其他实施方案中，间隔物可以含有GGGGS(SEQ ID NO:1)的基序，例如GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:17)。在某些实施方案中，间隔物是SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:18)。
在一些实施方案中，两个Fc结构域单体之间的间隔物仅含有甘氨酸残基，例如至少4个甘氨酸残基(例如，4-200、4-180、4-160、4-140、4-40、4-100、4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20、4-19、4-18、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6或4-5个甘氨酸残基)(例如，4-200、6-200、8-200、10-200、12-200、14-200、16-200、18-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200、120-200、140-200、160-200、180-200或190-200个甘氨酸残基)。在某些实施方案中，间隔物具有4-30个甘氨酸残基(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个甘氨酸残基)。在一些实施方案中，仅含有甘氨酸残基的间隔物可不被糖基化(例如，O-连接糖基化，也称为O-糖基化)，或与例如含有一个或多个丝氨酸残基的间隔物(例如，SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:18))相比，可具有降低水平的糖基化(例如，降低水平的O-糖基化)(例如，降低水平的用聚糖(诸如木糖、甘露糖、唾液酸、岩藻糖(Fuc)和/或半乳糖(Gal)(例如，木糖))进行的O-糖基化)。
在一些实施方案中，仅含有甘氨酸残基的间隔物可不被O-糖基化(例如，O-木糖基化)，或与例如含有一个或多个丝氨酸残基的间隔物(例如，SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(SEQ IDNO:18))相比，可具有降低水平的O-糖基化水平(例如，降低水平的O-木糖基化)。
在一些实施方案中，仅含有甘氨酸残基的间隔物可不经历蛋白水解，或与例如含有一个或多个丝氨酸残基的间隔物(例如，SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:18))相比，可具有降低速率的蛋白水解。
在某些实施方案中，间隔物可以含有GGGG(SEQ ID NO:19)的基序，例如GGGGGGGG(SEQ ID NO:20)、GGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:21)、GGGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:22)或GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:23)。在某些实施方案中，间隔物可以含有GGGGG(SEQID NO:24)的基序，例如GGGGGGGGGG(SEQ ID NO:25)或GGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:26)。在某些实施方案中，间隔物是GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:27)。
在其他实施方案中，间隔物还可以含有除甘氨酸和丝氨酸外的氨基酸，例如GENLYFQSGG(SEQ ID NO:28)、SACYCELS(SEQ ID NO:29)、RSIAT(SEQ ID NO:30)、RPACKIPNDLKQKVMNH(SEQ ID NO:31)、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG(SEQ IDNO:32)、AAANSSIDLISVPVDSR(SEQ ID NO:33)或GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS(SEQ ID NO:34)。
在本公开的某些实施方案中，使用12或20个氨基酸肽间隔物串联连接两个Fc结构域单体，所述12和20个氨基酸的肽间隔物由序列GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:35)和SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:18)组成。在其他实施方案中，可使用由序列GGSGGGSGGGSGGGSGGS(SEQ ID NO:36)组成的18个氨基酸肽间隔物。
在一些实施方案中，两个Fc结构域单体之间的间隔物可具有与上文所述的SEQ IDNO:1-36中任一者的序列具有至少75％同一性(例如，至少77％、79％、81％、83％、85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或99.5％同一性)的序列。在某些实施方案中，两个Fc结构域单体之间的间隔物可具有与SEQ ID NO:17、18、26和27中任一者的序列具有至少80％同一性(例如，至少82％、85％、87％、90％、92％、95％、97％、99％或99.5％同一性)的序列。在某些实施方案中，两个Fc结构域单体之间的间隔物可具有与SEQ ID NO:18或27的序列具有至少80％同一性(例如，至少82％、85％、87％、90％、92％、95％、97％、99％或99.5％同一性)的序列。
在某些实施方案中，Fc结构域单体的铰链的氨基末端与同一多肽中的Fc单体的羧基末端之间的接头(即，该接头将第一Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域的C-末端与第二Fc结构域单体的铰链结构域的N-末端连接，使得两个Fc结构域单体彼此串联连接)是具有3个或更多个氨基酸(例如，3-200个氨基酸(例如，3-200、3-180、3-160、3-140、3-120、3-100、3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-45、3-40、3-35、3-30、3-25、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-200、5-200、6-200、7-200、8-200、9-200、10-200、15-200、20-200、25-200、30-200、35-200、40-200、45-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200、120-200、140-200、160-200或180-200个氨基酸))的间隔物而不是共价键或含有至少12个氨基酸(诸如12-200个氨基酸，例如12-200、12-180、12-160、12-140、12-120、12-100、12-90、12-80、12-70、12-60、12-50、12-40、12-30、12-20、12-19、12-18、12-17、12-16、12-15、12-14或12-13个氨基酸)(例如14-200、16-200、18-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200、120-200、140-200、160-200、180-200或190-200个氨基酸)的氨基酸间隔物。
间隔物也可以存在于Fc结构域单体的铰链结构域的N-末端与CD38结合结构域(例如，CD38重链结合结构域的CH1结构域或CD38轻链结合结构域的CL结构域)的羧基末端之间，使得这些结构域通过3个或更多个氨基酸(例如，3-200个氨基酸(例如，3-200、3-180、3-160、3-140、3-120、3-100、3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-45、3-40、3-35、3-30、3-25、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-200、5-200、6-200、7-200、8-200、9-200、10-200、15-200、20-200、25-200、30-200、35-200、40-200、45-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200、120-200、140-200、160-200或180-200个氨基酸))的间隔物或含有至少12个氨基酸(诸如12-200个氨基酸，例如12-200、12-180、12-160、12-140、12-120、12-100、12-90、12-80、12-70、12-60、12-50、12-40、12-30、12-20、12-19、12-18、12-17、12-16、12-15、12-14或12-13个氨基酸)(例如14-200、16-200、18-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200、120-200、140-200、160-200、180-200或190-200个氨基酸)的氨基酸间隔物连接。
VII.血清蛋白结合肽
与血清蛋白肽结合可以改善蛋白质药物的药代动力学，并且具体地，可将本文描述的Fc-抗原结合结构域构建体与血清蛋白结合肽融合。
作为一个实例，可以用于本文所述的方法和组合物中的白蛋白结合肽是本领域一般已知的。在一个实施方案中，白蛋白结合肽包括序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:37)。在一些实施方案中，白蛋白结合肽具有与SEQ ID NO:37的序列至少80％同一性(例如，80％、90％或100％同一性)的序列。
在本公开中，可将白蛋白结合肽附接到Fc-抗原结合结构域构建体中的某些多肽的N末端或C末端。在一个实施方案中，可将白蛋白结合肽附接到含有抗原结合结构域的Fc构建体中的一个或多个多肽的C末端。在另一个实施方案中，可以将白蛋白结合肽融合到含有抗原结合结构域的Fc构建体中的编码串联连接的两个Fc结构域单体的多肽的C末端。在又一个实施方案中，可以将白蛋白结合肽附接到与编码串联连接的两个Fc结构域单体的多肽中的第二Fc结构域单体连接的Fc结构域单体(例如，图1中的Fc结构域单体114和116；图2中的Fc结构域单体214和216)的C末端。可以将白蛋白结合肽遗传融合到Fc-抗原结合结构域构建体或通过化学手段(例如，化学缀合)附接到Fc-抗原结合结构域构建体。如果需要，可以在Fc-抗原结合结构域构建体与白蛋白结合肽之间插入间隔物。不受理论束缚，预期在本公开的Fc-抗原结合结构域构建体中包括白蛋白结合肽可通过其与血清白蛋白结合延长治疗性蛋白质的保留。
VIII.Fc-抗原结合结构域构建体
一般来讲，本公开的特征在于具有2-10个Fc结构域以及附接的一个或多个抗原结合结构域的Fc-抗原结合结构域构建体。这些Fc结构域对于Fc受体(例如，FcγRIIIa)可具有比单个野生型Fc结构域更高的结合亲和力和/或亲合力。本公开公开了工程化两个相互作用的CH3抗体恒定结构域的界面处的氨基酸的方法，使得Fc结构域的两个Fc结构域单体彼此选择性地形成二聚体，从而防止形成不需要的多聚体或聚集体。Fc-抗原结合结构域构建体包括偶数数量的Fc结构域单体，其中每对Fc结构域单体形成Fc结构域。Fc-抗原结合结构域构建体至少包括由四个Fc结构域单体和一个抗原结合结构域的二聚体形成的两个功能性Fc结构域。可例如用接头、间隔物、肽键、化学键或化学部分将抗原结合结构域与Fc结构域连接。在一些实施方案中，本公开涉及工程化第一对两个相互作用的CH3抗体恒定结构域的界面处选自表4和表5的一组氨基酸置换以及工程化第二对两个相互作用的CH3抗体恒定结构域的界面处选自表4和表5的第二组氨基酸置换(不同于第一组氨基酸置换)的方法，使得Fc结构域的第一对两个Fc结构域单体彼此选择性地形成二聚体，并且Fc结构域的第二对两个Fc结构域单体彼此选择性地形成二聚体，从而防止形成不需要的多聚体或聚集体。
可以使用本文所述的异二聚化Fc结构域、任选地与同二聚化Fc结构域一起将Fc-抗原结合结构域构建体组装成许多不同类型的结构。Fc-抗原结合结构域构建体可以由不对称串联Fc结构域组装而成。Fc-抗原结合结构域构建体可以由单分支的Fc结构域组装而成，其中分支点在N末端Fc结构域。Fc-抗原结合结构域构建体可以由单分支的Fc结构域组装而成，其中分支点在C末端Fc结构域。Fc-抗原结合结构域构建体可以由单分支的Fc结构域组装而成，其中分支点在N末端或C末端Fc结构域。
可以使用具有不同抗原结合结构域序列的长链和短链将Fc-抗原结合结构域构建体组装形成双特异性、三特异性或多特异性构建体(例如，图4-图13；图16-图36)。可以使用具有不同组异二聚化突变和/或同二聚化突变以及不同抗原结合结构域的链将Fc-抗原结合结构域构建体组装形成双特异性、三特异性或多特异性构建体。异二聚化和/或同二聚化突变可以指导许多不同类型的构建体结构的特异性形成，从而允许将具有不同特异性的抗原结合结构域放置在特定的所选构建体位置上，同时阻止具有不需要或不期望的结构的构建体的形成。双特异性Fc-抗原结合结构域构建体包括两个不同的抗原结合结构域。三特异性Fc-抗原结合结构域构建体包括三个不同的抗原结合结构域。多特异性Fc-抗原结合结构域构建体可以包括多于三个的不同抗原结合结构域。
可以以许多方式将抗原结合结构域与Fc-抗原结合结构域构建体连接。可以将抗原结合结构域表达为Fc链的融合蛋白。可以将抗原的重链组分表达为Fc链的融合蛋白，并且可以将轻链组分表达为单独的多肽。在一些实施方案中，将scFv用作抗原结合结构域。可以将scFv表达为长Fc链的融合蛋白。在一些实施方案中，单独表达重链和轻链组分并将其外源添加到Fc-抗原结合结构域构建体中。在一些实施方案中，单独表达抗原结合结构域，稍后利用化学键将其与Fc-抗原结合结构域构建体连接。
在一些实施方案中，Fc-抗原结合结构域构建体中的一个或多个Fc多肽缺乏C末端赖氨酸残基。在一些实施方案中，Fc-抗原结合结构域构建体中的所有Fc多肽缺乏C末端赖氨酸残基。在一些实施方案中，在Fc-抗原结合结构域构建体中的一个或多个Fc多肽中不存在C末端赖氨酸可改善Fc-抗原结合结构域构建体(例如，具有三个Fc结构域的Fc-抗原结合结构域构建体)(例如，具有至少85％、90％、95％、98％或99％同质性的具有三个Fc结构域的Fc-抗原结合结构域构建体群体)的同质性。
在一些实施方案中，可将本文所述的Fc抗原结合结构域构建体中的第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽、第五多肽或第六多肽(例如，图16中的多肽2202、2222和2224，图17中的2302、2332、2334和2336，图18中的2402、2404、2434和2436，图19中的2502、2504、2534和2536，图20中的2602、2604、2606、2652、2654和2656，图21中的2702、2704、2706、2752、2754和2756，图22中的2802、2804、2806、2852、2854和2856，图23中的2902、2916和2920，图24中的3002、3024和3026，图25中的3102、312和3126，图26中的3202、3224、3228和3230，图27中的3302、3332、3334和3336，图28中的3402、3432、3434和3436，图29中的3502、3504、3534和3536，图30中的3602、3604、3612、3618、3642和3644，图31中的3702、3704、3706、3752、3754和3756，图32中的3802、3804、3834和3836，图33中的3902、3904、3910、3916、3942和3944，图34中的4002、4004、4006、4052、4054和4056，图35中的4102、4104、4110、4132、4142和4144，图36中的4202、4204、4206、4252、4254和4256)中的一者或多者的N末端Asp突变为Gln。
对于本文实施例中描述的示例性Fc-抗原结合结构域构建体，Fc-抗原结合结构域构建体1-28可分别在旋钮和孔洞亚基中包含E357K和K370D电荷对。Fc-抗原结合结构域构建体29-42可以使用可含有E357K和K370D对的正交静电转向突变，并且还可以包括其他转向突变。对于具有正交旋钮和孔洞的Fc-抗原结合构建体29-42，除了一个正交对外，都需要静电转向突变，并且这些静电转向突变可包括在所有正交对中。
在一些实施方案中，如果需要两个正交旋钮和孔洞，则旋钮1的静电转向修饰可以是E357K，而孔洞1的静电转向修饰可以是K370D，并且旋钮2的静电转向修饰可以是K370D，而孔洞2的静电转向修饰可以是E357K。如果需要第三正交旋钮和孔洞(例如，对于三特异性抗体)，则可为旋钮3添加静电转向修饰E357K和D399K，而为孔洞3添加静电转向修饰K370D和K409D，或者可为旋钮3添加静电转向修饰K370D和K409D，而孔洞3添加静电转向修饰E357K和D399K。
本文所述的示例性Fc-抗原结合结构域构建体(例如，Fc-抗原结合结构域构建体1-42)中的任何一种相对于具有单个Fc结构域和抗原结合结构域的构建体可以在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中具有增强的效应子功能，或可以包括具有单个Fc结构域和抗原结合结构域的构建体不显示的生物活性。
IX.宿主细胞和蛋白质的产生
在本公开中，宿主细胞指包括从其对应的核酸表达本文所述多肽和构建体所需的必要细胞组分(例如，细胞器)的媒介物。核酸可包括在核酸载体中，可以通过本领域已知的常规技术(转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等)将所述核酸载体引入宿主细胞中。宿主细胞可以是哺乳动物、细菌、真菌或昆虫起源。哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO(或CHO衍生的细胞株，例如CHO-K1、CHO-DXB11 CHO-DG44)、鼠宿主细胞(例如NS0、Sp2/0)、VERY、HEK(例如HEK293)、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。还可以选择宿主细胞，其调节蛋白质构建体的表达，或以所需的特定方式修饰且加工蛋白质产物。不同的宿主细胞具有蛋白质产物的翻译后加工和修饰的特征和特异性机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保表达的蛋白质的正确修饰和加工。
为了从其相应的DNA质粒构建体表达和分泌蛋白质产物，可以用通过本领域已知的适当表达控制元件控制的DNA转染或转化宿主细胞，所述表达控制元件包括启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点和可选择标记物。用于表达治疗性蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如，Paulina Balbas,Argelia Lorence(编辑)Recombinant GeneExpression:Reviews and Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press；2004版本第2版(2004年7月20日)；Vladimir Voynov和Justin A.Caravella(编辑)Therapeutic Proteins:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)Humana Press；2012版本第2版(2012年6月28日)。
在一些实施方案中，通过用编码组装成Fc构建体的多肽的DNA质粒构建体转染的宿主细胞产生(细胞培养上清液中)的至少50％的Fc-抗原结合结构域构建体在结构上相同(例如，以摩尔为基础)，例如50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％的Fc构建体在结构上相同。
X.无岩藻糖基化
每个Fc单体在Asn 297处包括N-糖基化位点。聚糖可以以多种不同形式存在于给定的Fc单体上。在含有抗体或本文所述的抗原结合Fc构建体的组合物中，聚糖可以是非常异质的，并且存在的聚糖的性质尤其取决于用于产生抗体或抗原结合Fc构建体的细胞的类型、细胞的生长条件(包括生长培养基)和产生后纯化。在各种情况下，将含有本文所述的构建体的组合物无岩藻糖基化至少某种程度。例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或95％存在于组合物中的聚糖(例如，Fc聚糖)缺乏岩藻糖残基。因此，5％-60％、5％-50％、5％-40％、10％-50％、10％-50％、10％-40％、20％-50％或20％-40％的聚糖缺乏岩藻糖残基。可以通过在1,3,4-三-O-乙酰基-2-脱氧基-2-氟-L-岩藻糖抑制剂存在下培养产生抗体的细胞来产生无岩藻糖基化至少某种程度的组合物。可以使用多种其他方法来产生本文所述的构建体和多肽的相对无岩藻糖基化形式，包括：在FUT8表达降低或不表达的细胞中表达，以及在过表达β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(GnT-III)的细胞中表达。
XI.纯化
可以通过蛋白质纯化领域中已知的任何方法来纯化Fc-抗原结合结构域构建体，例如通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和(例如，蛋白A亲和)色谱法和尺寸排阻柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。例如，可以通过适当选择并组合亲和柱(诸如蛋白A柱)与色谱柱、过滤、超滤、盐析和透析程序来分离和纯化Fc-抗原结合结构域构建体(参见例如，Process Scale Purification of Antibodies,UweGottschalk(编辑)John Wiley&Sons,Inc.,2009；以及Subramanian(编辑)Antibodies-Volume I-Production and Purification,Kluwer Academic/Plenum Publishers,NewYork(2004))。
在一些情况下，可以将Fc-抗原结合结构域构建体缀合到一种或多种纯化肽，以促进从例如全细胞裂解产物混合物中纯化和分离Fc-抗原结合结构域构建体。在一些实施方案中，纯化肽结合对纯化肽具有特异性亲和力的另一部分。在一些实施方案中，将与纯化肽特异性结合的此类部分附接到固体支持物，诸如基质、树脂或琼脂糖珠。可与Fc-抗原结合结构域构建体连接的纯化肽的实例包括但不限于六组氨酸肽、FLAG肽、myc肽和血凝素(HA)肽。六组氨酸肽(HHHHHH(SEQ ID NO:38))以微摩尔亲和力结合镍功能化的琼脂糖亲和柱。在一些实施方案中，FLAG肽包括序列DYKDDDDK(SEQ ID NO:39)。在一些实施方案中，FLAG肽包括串联的整数倍的序列DYKDDDDK，例如3xDYKDDDDK。在一些实施方案中，myc肽包括序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:40)。在一些实施方案中，myc肽包括串联的整数倍的序列EQKLISEEDL，例如3xEQKLISEEDL。在一些实施方案中，HA肽包括序列YPYDVPDYA(SEQ ID NO:41)。在一些实施方案中，HA肽包括串联的整数倍的序列YPYDVPDYA，例如3xYPYDVPDYA。特异性识别并结合FLAG、myc或HA纯化肽的抗体是本领域众所周知的，并且通常可商购获得。用这些抗体功能化的固体支持物(例如，基质、树脂或琼脂糖珠)可用于纯化包括FLAG、myc或HA肽的Fc-抗原结合结构域构建体。
对于Fc-抗原结合结构域构建体，可将蛋白A柱色谱法用作纯化过程。蛋白A配体通过Fc区与Fc-抗原结合结构域构建体相互作用，使得蛋白A色谱法成为能够去除大部分宿主细胞蛋白的高选择性捕获过程。在本公开中，可使用如实施例5中所述的蛋白A柱色谱法来纯化Fc-抗原结合结构域构建体。
在一些实施方案中，使用本文所述的异二聚化和/或同二聚化结构域允许制备具有60％或更高纯度的Fc-抗原结合结构域构建体，即其中细胞中产生的60％或更多的蛋白质构建体材料是所需的Fc构建体结构，例如制剂中60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的蛋白质构建体材料是所需的Fc构建体结构。在一些实施方案中，Fc-抗原结合结构域构建体的制剂中少于30％的蛋白质构建体材料是不期望的Fc构建体结构(例如，构建体的更高级物质，如实施例1所述)，例如制剂中30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的蛋白质构建体材料是不期望的Fc构建体结构。在一些实施方案中，在使用一种或多种已知的纯化方法(例如，蛋白A亲和纯化)进一步纯化之后，Fc-抗原结合结构域构建体的最终纯度可以为80％或更高，即其中80％或更多的纯化蛋白质构建体材料是所需的Fc构建体结构，例如制剂中80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的蛋白质构建体材料是所需的Fc构建体结构。在一些实施方案中，使用一种或多种已知的纯化方法(例如，蛋白A亲和纯化)进一步纯化的Fc-抗原结合结构域构建体的制剂中少于15％的蛋白质构建体材料是不期望的Fc构建体结构(例如，构建体的更高级物质，如实施例1所述)，例如制剂中15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的蛋白质构建体材料是不期望的Fc构建体结构。
XII.药物组合物/制剂
本公开的特征在于包括一种或多种本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包括在结构上相同或基本相同的基本上同质的Fc-抗原结合结构域构建体群体。在各种实例中，药物组合物包括Fc-抗原结合结构域构建体1-42中的任何一种的基本上同质的群体。
可以将本公开的治疗性蛋白质构建体(例如，本文所述的Fc-抗原结合结构域构建体(例如，具有三个Fc结构域的Fc-抗原结合结构域构建体))结合到药物组合物中。包括治疗性蛋白质的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的方法进行配制。药物组合物可以以可注射制剂的形式肠胃外施用，所述可注射制剂包括在水或另一种药学可接受的液体中的无菌溶液或悬浮液。例如，药物组合物可以通过以下过程进行配制：将Fc-抗原结合结构域构建体与药学可接受的媒介物或介质(诸如无菌注射用水(WFI)、生理盐水、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂)适当组合，随后以普遍接受的药学实践所需的单位剂量形式混合。在药物制剂中包括的活性成分的量使得提供在指定范围内的合适剂量。
用于注射的无菌组合物可以根据常规药学实践使用注射用蒸馏水作为媒介物进行配制。例如，生理盐水或含有葡萄糖和其他补充剂(诸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠)的等渗溶液可用作注射用水溶液，任选与本领域普遍已知的合适的增溶剂(例如，醇诸如乙醇和多元醇诸如丙二醇或聚乙二醇)和非离子表面活性剂(诸如聚山梨醇酯80TM、HCO-50)等组合。用于治疗性蛋白质产物的配制方法是本领域已知的，参见例如Banga(编辑)Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing and DeliverySystems(第2版)Taylor&Francis Group,CRC Press(2006)。
XIII.治疗方法和剂量
本文所述的构建体可以用于治疗由衍生抗原结合结构域的抗体治疗的障碍。例如，当构建体具有识别CD38的抗原结合结构域时，构建体可以用于治疗多种癌症(例如，恶性血液病和实体瘤)和自身免疫性疾病。药物组合物以与剂量制剂相容的方式施用，并且以治疗有效的量施用，以引起症状的改善或补救。药物组合物以各种剂型施用，例如静脉内剂型、皮下剂型、经口剂型如可摄取溶液、药物释放胶囊等等。用于各个受试者的适当剂量取决于治疗目标、施用途径和患者的状况。一般地，重组蛋白以1-200mg/kg(例如1-100mg/kg，例如20-100mg/kg)给药。相应地，医疗保健提供者有必要根据需要定制且和滴定剂量且修改施用途径，以获得最佳疗效。
XIV.补体依赖性细胞毒性(CDC)
本公开中描述的Fc-抗原结合结构域构建体能够激活各种Fc受体介导的效应子功能。免疫系统的一个组分是补体依赖性细胞毒性(CDC)系统，它是先天免疫系统的一部分，可增强抗体和吞噬细胞清除外源病原体的能力。三种生化途径激活补体系统：经典补体途径、替代补体途径和凝集素途径，这些途径都需要一组复杂的激活和信号级联。
在经典补体途径中，IgG或IgM触发补体激活。C1q蛋白与抗原结合后与这些抗体结合，从而形成C1复合物。该复合物产生C1s酯酶，该酯酶将C4和C2蛋白裂解并激活为C4a和C4b以及C2a和C2b。然后，C2a和C4b片段形成称为C3转化酶的蛋白复合物，该蛋白复合物将C3裂解为C3a和C3b，从而使信号放大并形成膜攻击复合物。
本公开的Fc-抗原结合结构域构建体能够通过免疫系统增强CDC活性。
可通过使用比色测定来评估CDC，在该比色测定中，将Raji细胞(ATCC)用连续稀释的抗体、Fc-抗原结合结构域构建体或IVIg包被。可以将人血清补体(Quidel)以25％v/v添加到所有孔中，并且在37℃下温育2小时。在添加WST-1细胞增殖试剂(Roche AppliedScience)后，可以将细胞在37℃下温育12小时。然后可以将板放置在振荡器上2分钟，并且可以测量450nm处的吸光度。
XV.抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
本公开的Fc-抗原结合结构域构建体还能够通过免疫系统增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。ADCC是适应性免疫系统的一部分，在该系统中，抗体与外源病原体的表面抗原结合并靶向它们以致死亡。ADCC涉及通过抗体激活自然杀伤(NK)细胞。NK细胞表达Fc受体，这些受体与抗体(诸如IgG和IgM)的Fc部分结合。当抗体与病原体感染的靶细胞表面结合后，它们随后会结合NK细胞并激活它们。NK细胞释放细胞因子(诸如IFN-γ)和蛋白质(诸如穿孔素和颗粒酶)。穿孔素是在钙存在下低聚的成孔溶细胞素。颗粒酶是在靶细胞中诱导程序性细胞死亡的丝氨酸蛋白酶。除NK细胞外，巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也可以介导ADCC。
可使用发光测定来评估ADCC。将人原代NK效应细胞(Hemacare)解冻，并使其在淋巴细胞生长培养基-3(Lonza)中以5x105个/mL在37℃下静息过夜。第二天，收获人淋巴母细胞系Raji靶细胞(ATCC CCL-86)，将其重悬于测定培养基(无酚红RPMI，10％FBSΔ，GlutaMAXTM)中，并在37℃下在各种浓度的每种目的探针存在下铺板30分钟。然后收获静息NK细胞，将其重悬于测定培养基中，并添加到含有抗CD20包被的Raji细胞的板中。将板在37℃下温育6小时，其中效应子与靶细胞的最终比例为5:1(5x104个NK细胞:1x104个Raji)。
使用CytoTox-GloTM细胞毒性测定试剂盒(Promega)来确定ADCC活性。CytoTox-GloTM测定使用发光肽底物来测量死细胞蛋白酶活性，该蛋白酶活性由已经丧失膜完整性的细胞(例如，裂解的Raji细胞)释放。温育6小时后，将制备的试剂(底物)添加到板的每个孔中，并在室温下置于定轨板振荡器上15分钟。使用PHERAstar F5读板仪(BMG Labtech)测量发光。从测试条件中减去对照条件(仅NK细胞+Raji)的读数以消除背景后，分析数据。
XVI.抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)
本公开的Fc-抗原结合结构域构建体还能够通过免疫系统增强抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性。ADCP(也称为抗体调理作用)是吞噬细胞标记病原体摄入和清除的过程。吞噬细胞是通过摄入有害的外源病原体以及死亡或垂死的细胞来保护人体的细胞。该过程被病原体相关分子模式(PAMPS)激活，从而引起NF-κB激活。然后，调理素(诸如C3b)和抗体可以附着到目标病原体上。当靶标被调理素包被时，Fc结构域经由其Fc受体吸引吞噬细胞。然后吞噬细胞吞噬细胞，并且摄入物质的吞噬体与溶酶体融合。然后，随后的吞噬溶酶体蛋白水解消化细胞物质。
可使用生物发光测定来评估ADCP。抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)是治疗性抗体的重要作用机制。ADCP可以由单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞经由FcγRIIa(CD32a)、FcγRI(CD64)和FcγRIIIa(CD16a)介导。三种受体都可以参与抗体识别、免疫受体聚簇和导致ADCP的信号事件；但是，阻断研究表明，FcγRIIa是参与该过程的主要Fcγ受体。
FcγRIIa-H ADCP报告基因生物测定是一种基于生物发光细胞的测定，可以用于测量抗体和具有Fc结构域(特异性结合和激活FcγRIIa)的其他生物制剂的效力和稳定性。该测定由表达高亲和力人FcγRIIa-H变体的遗传工程化Jurkat T细胞系组成，该变体在氨基酸131处含有组氨酸(H)并且含有由NFAT响应元件(NFAT-RE)驱动的荧光素酶报告基因。
当与靶细胞和相关抗体共培养时，FcγRIIa-H效应细胞结合抗体的Fc结构域，从而引起FcγRIIa信号传导和NFAT-RE介导的萤光素酶活性。检测生物发光信号并用荧光素酶测定和标准发光计进行定量。
实施例
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供完整的公开内容以及对如何执行、制备和评估本文所要求保护的方法和化合物的描述，并且这些实施例旨在仅是本公开的示例，并非旨在限制发明人视为其公开的内容的范围。
实施例1.正交异二聚化结构域控制包含线性Fc-抗原结构域的多肽的组装的用途
已经描述了将Fc结构域附加到抗体的C末端的多种方法，包括在产生串联Fc构建体时，在Fc结构域之间具有和不具有肽接头的情况下(参见例如，Nagashima等人，Nagashima等人,Mol Immunol,45:2752-63,2008，以及Wang等人,MAbs,9:393-403,2017)。然而，在科学文献中描述的用于制备具有多个Fc结构域的抗体构建体的方法的有效性受到限制，因为这些方法导致产生许多包含Fc结构域的蛋白质的不期望物质。这些物质具有不同的分子量，这是由于在产物产生过程中多肽链的不受控制的错配缔合导致的，从而形成分子量的阶梯(参见例如，Nagashima等人,Mol Immunol,45:2752-63,2008，以及Wang等人,MAbs,9:393-403,2017)。图1和图2示意性地描绘了具有各种分子量的多个Fc结构域的蛋白质物质的一些实例，这些蛋白质物质可以通过包含两个串联Fc单体(图1)或三个串联Fc单体(图3)的多肽的错配缔合产生。使用这些现有方法一致地实现具有多个Fc结构域(具有明确的分子量)的所需Fc-抗原结合结构域构建体需要去除具有较大分子量的更高级物质(HOS)，这大大降低了所需构建体的产率。
使用正交异二聚化结构域允许产生具有串联Fc延伸的结构，而不产生大量的更高级物质(HOS)。图3A和图3B描绘了具有两个Fc结构域(图3A)或3个Fc结构域(图3B)的正交线性Fc-抗原结构域结合构建体的实例，这些构建体通过将具有多个Fc结构域单体的一个长多肽与两个不同的短多肽(各自具有单个Fc单体)连接而产生。在这些实例中，每个构建体的一个Fc结构域包括旋钮-进入-孔洞突变并结合该Fc结构域的CH3-CH3界面中的反向电荷突变，以及1个其他Fc结构域(图3A)或2个其他Fc结构域(图3B)的CH3-CH3界面中的两个反向电荷突变。具有Fc单体(具有两个反向电荷突变)的短多肽链对具有突起形成突变和单个反向电荷突变的长链Fc单体具有较低亲和力，并且更有可能与具有2个相容反向电荷突变的长链Fc单体结合。具有Fc单体的短多肽链(具有空腔形成突变并结合反向电荷突变)更有可能与具有突起形成突变并结合相容反向电荷突变的长链Fc单体结合。
也可以使用正交异二聚化突变来组装双特异性或多特异性Fc-抗原结合结构域构建体，从而将具有不同特异性的特定抗原结合结构域放置在构建体上的特定Fc结构域处，同时减少不需要的蛋白质物质(诸如更高级物质)的产生。实施例3、4和7-27示出了可以通过将正交异二聚化突变(任选地与同二聚化突变一起)引入Fc结构域中来产生的双特异性和多特异性Fc-抗原结合结构域构建体的一些实例。
实施例2.多种抗原结合结构域与Fc-抗原结合结构域构建体的附接
可以使用异二聚化突变以多种组合和构型将许多类型的基于抗体的抗原结合结构域附接到Fc-抗原结合结构域构建体的Fc结构域。例如，可以将不同的Fab或与Fab相关抗原结合结构域附接到特定的Fc结构域以产生对多种抗原具有特异性的Fc构建体。图4示出了具有3个Fc结构域的相同基本结构但具有不同的抗原结合结构域组分的Fc-抗原结合结构域构建体的一些实例。出于实例的目的，图4中的每个双特异性Fc构建体具有两个不同的长链多肽，每个长链多肽包含两个Fc结构域单体，这两个Fc结构域单体在“茎”Fc结构域处连接，该“茎”Fc结构域是当一条长链的包含两个反向电荷突变的Fc单体与另一条长链的包含两个相容的反向电荷突变的Fc单体缔合时形成的。尽管该图中茎Fc结构域的每个单体具有两个反向电荷突变，但Fc单体可以被设计成包括其他(多于两个)相容的反向电荷突变。每个长链多肽还包含以下Fc结构域单体：其包含突起形成突变以及与较短多肽的具有空腔形成突变和相容的反向电荷突变的Fc结构域单体相容的反向电荷突变。长链多肽和/或短链多肽可以包括一个或多个抗原结合结构域。
图4A示出了可以与具有不同靶标特异性的多个Fab结构域(在该实例中为两个Fab结构域)一起使用共同的轻链。参见Merchant等人,Nat.Biotechnol.,16:677-681,1998，该文献通过引用整体并入本文。构建体的Fab重链部分的亲和力成熟可能是必需的。
图4B示出了在使用或不使用抗原结合结构域与Fc结构域之间的肽接头的情况下可以将具有第一靶标特异性的单链抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scFv)、可变重链(VHH)或可变新抗原受体(VNAR))结合在一个位置(例如，一个Fc结构域的N末端或C末端)处，并且可将具有第二靶标特异性的Fab结合在另一个位置(例如，在同一Fc结构域的另一个末端，或者另一个Fc结构域的N末端或C末端)处。参见Coloma和Morrison,Nat.Biotechnol.,15:159-63,1997，该文献通过引用整体并入本文。
图4C示出了在使用或不使用结构域之间的肽接头的情况下可将具有第一靶标特异性的单链抗原结合结构域(例如，scFv、VHH或VNAR)与具有第二靶标特异性的重链或轻链的N末端融合。参见Dimasi等人,J.Mol.Biol.,393:672-92,2009，该文献通过引用整体并入本文。
图4D示出了可将具有第一靶标特异性的重链或轻链与具有第二靶标特异性的单链抗原结合结构域(例如，scFv、VHH或VNAR)的N末端融合。参见Lu等人,J.Immunol.Methods,267:213-26,2002，该文献通过引用整体并入本文。
图4E示出了在使用或不使用Fc结构域的肽接头的情况下可以将具有不同靶标特异性的两个不同单链抗原结合结构域(例如，scFv、VHH或VNAR)结合在构建体的不同位置(例如，各个Fc结构域的N末端或C末端)处。参见Connelly等人,Int.Immunol.,10:1863-72,1998，该文献通过引用整体并入本文。
图4F示出了在使用或不使用多个单链抗原结合结构域之间的肽接头的情况下可将这些抗原结合结构域串联融合。参见Hayden等人,Ther.Immunol.,1:3-15,1994，该文献通过引用整体并入本文。单链抗原结合结构域可以具有不同的靶标特异性。
图4G示出了可在一个抗原结合结构域的重链组分和轻链组分之间交换可变结构域以防止轻链错配。参见WO 2009/080251，该文献通过引用整体并入本文。
图4H示出了在使用或不使用肽接头的情况下可以将双抗体或单链双抗体与一个或多个Fc结构域融合。
图4I示出了可将一个scFv与一条多肽链上的CH1结构域融合，并且可以将具有不同靶标特异性的scFv与另一条多肽链上的CL结构域融合。参见Zuo等人,Protein Eng.,13:361-7,2000，该文献通过引用整体并入本文。
图4J示出了可以将选自例如表3的突变引入一个或多个Fab结构域的轻链和重链序列中以促进每个Fab的轻链结构域和重链结构域的特异性配对。
虽然这些实施例均将抗原结合结构域示出为附接到与Fc构建体缔合的多肽的N末端，但是抗原结合结构域也可以或另选地附接到多肽的C末端或附接到Fc构建体的接头(例如，附接到Fc结构域之间的接头)。
实施例3.可以使用正交异二聚化结构域产生的双特异性Fc构建体结构的类型
可以将具有选自表4和表5的不同旋钮-进入-孔洞和/或静电反向电荷突变的正交异二聚化结构域整合到不同的多肽链中，以控制组装双特异性Fc-抗原结合结构域构建体过程中具有不同靶标特异性的多个抗原结合结构域以及Fc结构域的定位。可以使用以下设计原理来产生各种Fc-抗原结合结构域构建体结构：将一个、两个或更多个正交异二聚化结构域结合到组装成Fc构建体的多肽链中。
图5描绘了可以通过将一组同二聚化突变(O，O)结合到构建体的一个Fc结构域中以连接具有2个或3个Fc单体和具有第一靶标特异性的抗原结合结构域(1、1)的两个长链多肽来组装的分支双特异性Fc-抗原结合结构域构建体的一些实例。使用一组异二聚化突变(H、I或I、H)来将长链多肽的其余Fc单体与具有Fc结构域单体和具有第二靶标特异性的抗原结合结构域(2、2)的单个短链多肽连接。图5A和图5D描绘了可以通过在构建体的Fc结构域中仅使用一组正交异二聚化突变(H、I或I、H)来组装的简单线性双特异性Fc-抗原结合结构域构建体的实例。组装成这些Fc构建体的多肽的所有N末端均具有抗原结合结构域。
图6示出了可以使用两种或更多种正交异二聚化技术组装的一些线性串联Fc-抗原结合结构域构建体的实例。可以使用两组或更多组不同的异二聚化突变来控制具有不同靶标特异性的抗原结合结构域对构建体的一些Fc结构域的选择性放置，同时保持其他Fc结构域不含抗原结合结构域。在这些实例中，具有2个或3个Fc结构域单体的一个长链多肽具有附接到N末端的具有第一特异性的抗原结合结构域(1、1)。使用第一组异二聚化突变(H、I或I、H)来将长链多肽与具有一个Fc结构域单体的第一小多肽链连接，并且使用第二组异二聚化突变(J、K或K、J)来将具有一个Fc结构域单体的第二小多肽与长链连接。不同小链多肽中的一者或两者可以包含具有第二靶标特异性的抗原结合结构域(2、2)或具有第一靶标特异性的抗原结合结构域(1、1)。
图7示出了分支双特异性Fc-抗原结合结构域构建体的实例，其中仅一些Fc结构域与抗原结合结构域连接，因为仅组装成Fc构建体的一些多肽在其N末端具有抗原结合结构域。使用一个同二聚化Fc结构域(O、O)来连接两个不同的长链多肽，并且使用两组不同的异二聚化突变来将长链与两个不同的小多肽连接。使用一组异二聚化突变(H、I或I、H)来将长链多肽Fc单体与具有Fc单体的第一短链多肽连接。使用第二组异二聚化突变(J、K或K、J)来将长链多肽上的另一个Fc单体与具有Fc单体的第二短多肽连接。任何长链或短链多肽可以包含具有第一靶标特异性的第一抗原结合结构域(1、1)或具有第二靶标特异性的第二抗原结合结构域(2、2)。
虽然图5-7中的构建体被绘制为包括具有用于控制Fab组装的突变的Fab结构域(A、B或B、A；C、D或D、C)，但是可以使用其他抗原结合结构域代替，例如单链抗原结合结构域(例如，scFv或VHH)或具有使用共同轻链的不同重链的抗原结合结构域。
实施例4.可以使用正交异二聚化结构域产生的三特异性Fc构建体结构的类型
可以将具有选自表4和表5的不同旋钮-进入-孔洞和/或静电反向电荷突变的正交异二聚化结构域整合到不同的多肽链中，以控制组装三特异性Fc-抗原结合结构域构建体过程中具有不同靶标特异性的多个抗原结合结构域以及Fc结构域的定位。可以使用以下设计原理来产生各种Fc-抗原结合结构域构建体结构：将一个、两个或更多个正交异二聚化结构域结合到组装成Fc构建体的多肽链中。
图8描绘了可以通过在构建体的Fc结构域中使用两组正交异二聚化突变(H、I或I、H和J、K或K、J)来组装的简单线性三特异性Fc-抗原结合结构域构建体的实例。组装成这些Fc构建体的所有多肽的N末端是附接的抗原结合结构域。在这些示例性构建体中，具有2个Fc结构域的长链多肽附接到具有第一靶标特异性的抗原结合结构域(1、1或*、1)。每个具有单个Fc结构域单体的不同短链多肽附接到具有第二靶标特异性的抗原结合结构域(2、2或*、2)或具有第三靶标特异性的抗原结合结构域(3、3或*、3)。每个不同的抗原结合结构域可以具有指导组装的突变(A、B或B、A、C、D或D、C和E、F或F、E)或可以具有不同的重链(1、2或3)和共同的轻链(*)。
图9和图10示出了也可以使用正交异二聚化技术来产生使用多肽链的不对称排列的三特异性分支Fc-抗原结合结构域构建体。在图9中，使用第一组异二聚化突变(H、I或J、K)将两个各自具有2个Fc结构域单体和不同抗原结合结构域(2、2或*、2或*、3)的长链多肽连接起来。使用第二组异二聚化突变(H、I或I、H或J、K或K、J)将每条长链与具有Fc结构域单体和具有第三靶标特异性的抗原结合结构域(1、1或*、1)的短链多肽连接起来。图10示出了使用第一组异二聚化突变(H、I或J、K)将两个各自具有3个Fc结构域单体和不同抗原结合结构域(2、2或*、2或*、3)的长链多肽连接起来。使用第二组异二聚化突变(H、I或I、H或J、K或K、J)将每条长链与具有Fc结构域单体和具有第三靶标特异性的抗原结合结构域(1、1或*、1)的短链多肽连接起来。图9和图10的构建体中的抗原结合结构域可以具有指导轻链组装的突变(A、B或B、A或C、D或D、C)，或者可以使用具有不同重链的共同轻链(1、*或*、1、2、*或*、2或3、*或*、3)。
图11A和图11B示出了与图10的构建体相似的三特异性Fc-抗原结合结构域构建体的实例，不同之处在于它们使用一组同二聚化突变(O，O)来连接各自具有三个Fc结构域单体和具有第一特异性的抗原结合结构域(1、1、*、1或1、*)的两个长链多肽。使用两组不同的异二聚体化突变来将长链与两个不同的小多肽连接，每个小多肽具有Fc结构域单体和不同的抗原结合结构域。使用一组异二聚化突变(H、I或I、H)来将长链多肽Fc单体与包含具有第二靶标特异性的抗原结合结构域(2、2、*、2或2、*)的第一短链多肽连接。使用第二组异二聚化突变(J、K或K、J)来将长链多肽上的另一个Fc单体与包含具有第三靶标特异性的抗原结合结构域(3、3、*、3或3、*)的第二短多肽连接。图11的构建体中的抗原结合结构域可以具有指导轻链组装的突变(A、B或B、A或C、D或D、C)，或者可以使用具有不同重链的共同轻链(1、*或*、1、2、*或*、2或3、*或*、3)。
图12和图13示出了具有抗原结合结构域和Fc结构域的不对称分布的三特异性分支Fc-抗原结合结构域构建体的一些实例。使用两组正交异二聚化突变(H、I或I、H或J、K或K、J)来连接长度不同(2个或3个Fc结构域单体)或长度相同(2个Fc结构域单体)的不同长链多肽的Fc单体。将两个不同的长链多肽附接到具有不同靶标特异性(例如，第二靶标特异性(2、2)或第三靶标特异性(3、3))的抗原结合结构域。使用第二组异二聚化突变(H、I或I、H或J、K或K、J)来将具有Fc结构域单体和具有第一靶标特异性的抗原结合结构域(1、1)的短链多肽与长链多肽上的Fc结构域单体连接。
尽管图8-13中的一些Fc构建体被绘制为包括具有用于控制Fab组装的突变的Fab结构域(例如，A、B或B、A；C、D或D、C或E、F或F、E)，但是可以使用其他抗原结合结构域代替，例如单链抗原结合结构域(例如，scFv或VHH)或具有使用共同轻链的不同重链的抗原结合结构域。
实施例5.靶向CD20和PD-L1的双特异性Fc构建体
产生具有三个串联Fc结构域和两个具有不同靶标特异性的抗原结合结构域(抗CD20(奥滨尤妥珠单抗)和抗PD-L1(阿维鲁单抗)抗原结合结构域)的Fc-抗原结合结构域构建体。不同的Fab具有不同的VH和CH1域，但共享共同的轻链(VL)。Fc构建体具有附接到构建体的第一(顶部)Fc结构域的第一抗原结合结构域和附接到构建体的第三(底部)Fc结构域的第二抗原结合结构域(图14A)。构建体的一个版本将抗CD20 VH和CH1放置在长Fc链上并且将抗PD-L1 VH和CH1放置在短Fc链上，而构建体的另一个版本将抗PD-L1 VH和CH1放置在长Fc链上并且将抗CD20 VH和CH1放置在短链上。使用表9中的多肽序列产生构建体。将携带编码制备Fc构建体所必需的多肽的基因的构建体转染到HEK细胞中，表达多肽，并通过SDS-PAGE分析细胞的废培养基。
表9.双特异性Fc构建体的序列
Figure BDA0002972274020001001
Figure BDA0002972274020001011
Figure BDA0002972274020001021
Figure BDA0002972274020001031
如图14B所示，每种构建体的主要蛋白质条带为250kDa，如所需产物(泳道1和2)所预期的。用于产生能够潜在产生250kDa产物的Fc构建体的四个多肽的唯一其他组合将是Fab轻链的两个拷贝与包含与Fab VH和CH1串联的三个Fc结构域的长链多肽的两个拷贝的组合。这种不需要的产物的形成将需要异二聚化突变的失败，以防止在所有三个串联Fc结构域中的同二聚化。为了排除由于产生不需要的同二化产物而形成250kDa蛋白质条带的可能性，在不存在编码两个短链多肽的其他两个基因的情况下，将共同Fab轻链和具有三个串联Fc结构域的长链多肽的基因转染到HEK细胞中。图示出了通过SDS-PAGE在废培养基中未检测到250kDa产物(泳道3和4)。总而言之，来自图的泳道1-4的结果表明通过表达编码组装所需Fc-抗原结合结构域构建体的两个版本所必需的四个多肽的基因正确地产生了该构建体。
细胞培养
将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。氨基酸序列由多个质粒编码。
蛋白质纯化
使用Poros MabCapture A柱，通过基于蛋白A的亲和柱色谱法从细胞培养上清液中纯化表达的蛋白质。上样后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.0)洗涤捕获的Fc构建体，并进一步用中间洗涤缓冲液50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)洗涤，以除去其他与工艺有关的杂质。用100mM甘氨酸(pH 3)洗脱结合的Fc构建体物质，并通过添加1M TRIS(pH 7.4)快速中和洗脱液，然后离心并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
使用Poros XS树脂，通过离子交换色谱法进一步分离蛋白质。用50mM MES(pH 6，缓冲液A)预平衡柱，并且在平衡缓冲液中稀释(1:3)样品以便上样。使用12-15CV线性梯度(50mM MES(100％A)至400mM氯化钠(pH 6，100％B))作为洗脱缓冲液洗脱样品。通过分析尺寸排阻色谱法(SEC)分析洗脱期间收集的所有级分，并合并目标级分以产生纯化的Fc构建体物质。
在离子交换后，在切向流过滤系统上，使用30kDa截止聚醚砜(PES)膜滤筒将合并物质缓冲交换到1X-PBS缓冲液中。将样品浓缩至大约10-15mg/mL，并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
实施例6.靶向CD38和BCMA的双特异性构建体
为了证明使用异二聚体化突变来指导具有不同靶标特异性的两个不同Fab结构域在同一分子中的组装的可行性，制备了具有一个抗CD38 Fab和一个抗BCMA Fab的双特异性抗体(图15A)。使用两条具有Fc结构域单体的不同多肽链和两条不同的轻链多肽组装Fc构建体。一条多肽链包含具有突起形成突变和反向电荷突变的Fc结构域单体，以及在Fab的恒定结构域(CH1+CL)中具有第一组异二聚化突变(B)的Fab重链部分。该Fab部分的轻链具有一组相容的异二聚化突变(B)或具有野生型序列。第二多肽链包含具有空腔形成突变和反向电荷突变(与第一多肽的反向电荷突变相容)的Fc结构域单体，以及在Fab的恒定结构域(CH1+CL)中具有第二组异二聚化突变(C)的Fab重链部分。该Fab部分的轻链具有一组相容的异二聚化突变(D)或具有野生型序列。表10描绘了在抗CD38 Fab轻链和重链以及在抗BCMA轻链和重链中用于控制Fab的各自组装的不同Fab异二聚化突变。
表10.抗CD38(达雷妥尤单抗)和抗BCMA(贝兰他单抗)序列的突变
Figure BDA0002972274020001041
Figure BDA0002972274020001051
图15B示出了当将编码Fc构建体的四个基因转染到HEK细胞中时，获得150kDa的产物(参见泳道1-6)。这是所需Fc构建体的预期大小。泳道8是对照，其中表达具有三个Fc结构域但不具有抗原结合结构域的构建体。附接到包含旋钮-进入-孔洞和反向电荷突变的Fc结构域的突变Fab结构域的表达表明Fab异二聚化突变和Fc异二聚化突变可以成功地一起用于组装Fc-抗原结合结构域构建体。
液相色谱-质谱(LC-MS)分析
还进行了液相色谱-质谱以确定是否形成所需种类的Fc-抗原结合结构域构建体(图15A和表10)。使用Poros MabCapture A柱，通过基于蛋白A的亲和柱色谱法从细胞培养上清液中纯化表达的蛋白质。上样后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.0)洗涤捕获的Fc-抗原结合结构域构建体，并进一步用中间洗涤缓冲液50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)洗涤，以除去其他与工艺有关的杂质。用100mM甘氨酸(pH 3)洗脱结合的Fc构建体物质，并通过添加1MTRIS(pH 7.4)快速中和洗脱液，然后离心并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
使用10kDa旋转过滤器(EMD Millipore)将100μg每种Fc构建体缓冲交换到50mM碳酸氢铵(pH 7.8)中，使浓度为1μg/μL。将50μg样品与30单位PNGase F(Promega)在37℃下温育5小时。使用0.1％甲酸的水溶液和0.1％甲酸的乙腈溶液作为流动相，在Waters AcquityC4 BEH柱(1x100mm，1.7um粒径，300A孔径)上进行分离。在Ultimate 3000(Dionex)色谱系统和Q-Exactive(Thermo Fisher Scientific)质谱仪上进行LC-MS。使用BiopharmaFinder(Thermo Fisher Scientific)的默认ReSpect方法对光谱进行去卷积。
图15C-15F示出了LC-MS分析结果，表明在SDS-PAGE(图15B)中观察到的150kDa产物主要包含每种不同轻链中的一条(一种用于抗CD38 Fab，一种用于抗BCMA Fab)。所需双特异性物质在去糖基化后具有145,523Da的分子量，而具有两条抗BCMA轻链的构建体具有比所需物质低261Da的分子量，并且具有两条抗CD38轻链的构建体具有比所需物质高261Da的分子量。每个样品中的主要物质是包含每种轻链中的一条的145,523Da物质(图15C示出了图15B的泳道1的纯化构建体的主要LC-MS峰；图15D示出了图15B的泳道2的纯化构建体的主要LC-MS峰；图15E示出了图15B的泳道3的纯化构建体的主要LC-MS峰；并且图15F示出了图15B的泳道4的纯化构建体的主要LC-MS峰)。
实施例7.Fc-抗原结合结构域构建体22的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体22(图16)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链以及短Fc链的两个拷贝)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含两个串联的Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，每个Fc结构域单体具有通过引入选自表4的至少一个突起形成突变(例如，S354C和T366W突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，E357K)而产生的工程化突起。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有通过引入选自表4的至少一个空腔形成突变(例如，Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例8.Fc-抗原结合结构域构建体23的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体23(图17)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链以及短Fc链的三个拷贝)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含三个串联的Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，每个Fc结构域单体具有通过引入选自表4的至少一个突起形成突变(例如，S354C和T366W突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，E357K)而产生的工程化突起。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有通过引入选自表4的至少一个空腔形成突变(例如，Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例9.Fc-抗原结合结构域构建体24的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体24(图18)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝以及短Fc链的两个拷贝)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)，并与具有通过引入选自表4的至少一个突起形成突变(例如，S354C和T366W突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，E357K)而产生的工程化突起的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有通过引入选自表4的至少一个空腔形成突变(例如，Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例10.Fc-抗原结合结构域构建体25的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体25(图19)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝以及短Fc链的两个拷贝)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有通过引入选自表4的至少一个突起形成突变(例如，S354C和T366W突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，E357K)而产生的工程化突起，并与具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有通过引入选自表4的至少一个空腔形成突变(例如，Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例11.Fc-抗原结合结构域构建体26的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体26(图20)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝以及短Fc链的四个拷贝)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)，并与各自具有通过引入选自表4的至少一个突起形成突变(例如，S354C和T366W突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，E357K)而产生的工程化突起的两个Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有通过引入选自表4的至少一个空腔形成突变(例如，Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例12.Fc-抗原结合结构域构建体27的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体27(图21)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝以及短Fc链的四个拷贝)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有通过引入选自表4的至少一个突起形成突变(例如，S354C和T366W突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，E357K)而产生的工程化突起，并与具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)的Fc结构域单体、具有通过引入选自表4的至少一个突起形成突变(例如，S354C和T366W突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，E357K)而产生的工程化突起的另一个包含突起的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有通过引入选自表4的至少一个空腔形成突变(例如，Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例13.Fc-抗原结合结构域构建体28的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体28(图22)包括两个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝以及短Fc链的四个拷贝)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含两个Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，每个Fc结构域单体具有通过引入选自表4的至少一个突起形成突变(例如，S354C和T366W突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，E357K)而产生的工程化突起，并与具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)的Fc结构域单体串联。短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有通过引入选自表4的至少一个空腔形成突变(例如，Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(例如，K370D)而产生的工程化空腔。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由两个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例14.Fc-抗原结合结构域构建体29的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体29(图23)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链，以及两个不同的短Fc链)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体，每个Fc结构域单体具有选自表4的一组不同的突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变，并与N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由三个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例15.Fc-抗原结合结构域构建体30的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体30(图24)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链，以及两个不同的短Fc链)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体，每个Fc结构域单体具有选自表4的一组不同的突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变，并与N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由三个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例16.Fc-抗原结合结构域构建体31的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的三特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体31(图25)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链，以及两个不同的短Fc链)以及三个或两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体，每个Fc结构域单体具有选自表4的一组不同的突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变，并与N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第三特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。氨基酸序列是由三个单独的质粒编码的短Fc链和长Fc链。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例17.Fc-抗原结合结构域构建体32的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体32(图26)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链、一个短Fc链的两个拷贝以及第二短Fc链的一个拷贝)以及两条不同的轻链多肽或一条共同的轻链多肽。长Fc链包含三个Fc结构域单体，每个Fc结构域单体具有选自表4的一组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(第三Fc结构域单体具有与前两个不同的一组异二聚化突变)，并与N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由三个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例18.Fc-抗原结合结构域构建体33的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体33(图27)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链，以及第一短Fc链的两个拷贝，以及第二短Fc链的一个拷贝)以及两条不同的轻链多肽或一条共同的轻链多肽。长Fc链包含三个Fc结构域单体，每个Fc结构域单体具有选自表4的一组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(第三Fc结构域单体具有与前两个不同的一组异二聚化突变)，并与N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由三个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例19.Fc-抗原结合结构域构建体34的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的三特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体34(图28)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链、第一短Fc链的两个拷贝以及第二短Fc链的一个拷贝)以及三条或两条不同的轻链多肽或一条共同的轻链多肽。长Fc链包含三个Fc结构域单体，每个Fc结构域单体具有选自表4的一组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变(第三Fc结构域单体具有与前两个不同的一组异二聚化突变)，并与N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第三特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由三个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例20.Fc-抗原结合结构域构建体35的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的三特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体35(图29)包括四个不同的含Fc单体的多肽(两个不同的长Fc链，以及两个不同的短Fc链)以及三个或两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。第一长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)，并与具有选自表4的第一组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变的Fc结构域单体串联。第二长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)，并与具有选自表4的与第一长Fc链中的第一组突变不同的第二组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变的Fc结构域单体串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第三特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由四个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例21.Fc-抗原结合结构域构建体36的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体36(图30)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝，以及两个不同短Fc链中每一者的两个拷贝)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变，并与具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)的Fc结构域单体、具有选自表4的第二组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变的第二Fc结构域单体串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由三个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例22.Fc-抗原结合结构域构建体37的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的三特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体37(图31)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝，以及两个不同短Fc链中每一者的两个拷贝)以及三个或两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变，并与具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)的Fc结构域单体、具有选自表4的第二组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表4的一个或多个反向电荷突变的第二Fc结构域单体串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第三特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由三个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例23.Fc-抗原结合结构域构建体38的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的三特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体38(图32)包括四个不同的含Fc单体的多肽(两个不同的长Fc链，以及两个不同的短Fc链)以及三个或两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。第一长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变，并与具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)的Fc结构域单体串联。第二长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一长Fc链中的第一组突变不同的第二组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变，并与具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)的Fc结构域单体串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第三特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由四个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例24.Fc-抗原结合结构域构建体39的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体39(图33)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝，以及两个不同短Fc链中每一者的两个拷贝)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)，并与具有选自表4的第一组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变的Fc结构域单体、具有选自表4的第二组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变的第二Fc结构域单体串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由三个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例25.Fc-抗原结合结构域构建体40的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的三特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体40(图34)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝，以及两个不同短Fc链中每一者的两个拷贝)以及三个或两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)，并与具有选自表4的第一组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变的Fc结构域单体、具有选自表4的第二组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变的第二Fc结构域单体串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第三特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由三个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例26.Fc-抗原结合结构域构建体41的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体41(图35)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝，以及两个不同短Fc链中每一者的两个拷贝)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含两个Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，每个Fc结构域单体具有选自表4的一组不同的突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变，并与具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)的Fc结构域单体串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含含有空腔的Fc结构域单体，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由三个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例27.Fc-抗原结合结构域构建体42的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的三特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体42(图36)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝，以及两个不同短Fc链中每一者的两个拷贝)以及三个或两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含两个Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，每个Fc结构域单体具有选自表4的一组不同的突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变，并与具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)的Fc结构域单体串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第三特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由三个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。
实施例28.用于表征Fc-抗原结合结构域构建体的实验分析
肽和糖肽液相色谱-MS/MS
将蛋白质(Fc构建体)在6M胍(Sigma)中稀释至1μg/μL。添加二硫苏糖醇(DTT)，使浓度为10mM，以在65℃的变性条件下还原二硫键30分钟。在冰上冷却后，将样品与30mM碘乙酰胺(IAM)一起在黑暗中温育1小时，以使游离硫醇烷基化(氨甲酰甲基化)。然后将蛋白质通过10-kDa膜透析到25mM碳酸氢铵缓冲液(pH 7.8)中，以除去IAM、DTT和胍。在Barocycler(NEP 2320；Pressure Biosciences,Inc.)中用胰蛋白酶消化蛋白质。使压力在37℃下在20,000psi与环境压力之间循环，1小时内总共进行30次循环。在Ultimate 3000(Dionex)色谱系统和Q-Exactive(Thermo Fisher Scientific)质谱仪上进行肽的LC-MS/MS分析。使用0.1％FA的水溶液和0.1％FA的乙腈溶液作为流动相，在BEH PepMap(Waters)柱上分离肽。
完整的质谱分析
使用10kDa旋转过滤器(EMD Millipore)将50μg蛋白质(Fc构建体)缓冲交换到50mM碳酸氢铵(pH 7.8)中，使浓度为1μg/μL。将30单位PNGase F(Promega)添加到样品中，并在37℃下温育5小时。使用0.1％FA的水溶液和0.1％FA的乙腈溶液作为流动相，在WatersAcquity C4 BEH谱(1x100mm，1.7um粒径，300A孔径)上进行分离。在Ultimate 3000(Dionex)色谱系统和Q-Exactive(Thermo Fisher Scientific)质谱仪上进行LC-MS。使用Biopharma Finder(Thermo Fisher Scientific)的默认ReSpect方法对光谱进行去卷积。
毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)测定
将样品稀释至1mg/mL，并与HT Protein Express变性缓冲液(PerkinElmer)混合。将混合物在40℃下温育20分钟。将样品用70μL水稀释且转移至96孔板。通过配备有HTProtein Express LabChip(PerkinElmer)的Caliper GXII仪器(PerkinElmer)分析样品。使用荧光强度来计算每种尺寸变体的相对丰度。
非还原性SDS-PAGE
将样品在95℃的Laemmli样品缓冲液(4％SDS，Bio-Rad)中变性10分钟。使样品在Criterion TGX无染色凝胶(4-15％聚丙烯酰胺，Bio-Rad)上运行。通过UV照射或考马斯蓝染色对蛋白质条带进行可视化。通过ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)对凝胶进行成像。使用Imagelab 4.0.1软件(Bio-Rad)执行条带的定量。
补体依赖性细胞毒性(CDC)
通过比色测定评估CDC，在该比色测定中，将Raji细胞(ATCC)用连续稀释的利妥昔单抗、Fc构建体或IVIg包被。将人血清补体(Quidel)以25％v/v添加到所有孔中，并且在37℃下温育2小时。在添加WST-1细胞增殖试剂(Roche Applied Science)后，将细胞在37℃下温育12小时。将板放置在振荡器上2分钟，并且测量450nm处的吸光度。
实施例29.Fc-抗原结合结构域替代构建体29的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域替代构建体29(图38A)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链，以及两个不同的短Fc链)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。可以看出，不是使用两个不同的突起/空腔异二聚化结构域，而是使用一个突起/空腔异二聚化结构域，并且使用一个静电转向异二聚化结构域。示例性序列在图38B中示出。
实施例30.Fc-抗原结合结构域替代构建体30的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域替代构建体30(图39A)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链，以及两个不同的短Fc链)以及两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。可以看出，不是使用两个不同的突起/空腔异二聚化结构域，而是使用一个突起/空腔异二聚化结构域，并且使用一个静电转向异二聚化结构域。示例性序列在图39B中示出。
实施例31.Fc-抗原结合结构域替代构建体31的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的三特异性构建体。Fc-抗原结合结构域替代构建体31(图40)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链，以及两个不同的短Fc链)以及三个或两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。可以看出，不是使用两个不同的突起/空腔异二聚化结构域，而是使用一个突起/空腔异二聚化结构域，并且使用一个静电转向异二聚化结构域。示例性序列在图40B中示出。
实施例32.Fc-抗原结合结构域替代构建体32的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域替代构建体32(图41A)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链、一个短Fc链的两个拷贝以及第二短Fc链的一个拷贝)以及两条不同的轻链多肽或一条共同的轻链多肽。可以看出，不是使用两个不同的突起/空腔异二聚化结构域，而是使用一个突起/空腔异二聚化结构域，并且使用一个静电转向异二聚化结构域(存在于两个Fc结构域中)。示例性序列在图41B中示出。
实施例33.Fc-抗原结合结构域替代构建体33的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的双特异性构建体。Fc-抗原结合结构域替代构建体33(图42A)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链，以及第一短Fc链的两个拷贝，以及第二短Fc链的一个拷贝)以及两条不同的轻链多肽或一条共同的轻链多肽。可以看出，不是使用两个不同的突起/空腔异二聚化结构域，而是使用一个突起/空腔异二聚化结构域，并且使用一个静电转向异二聚化结构域(存在于两个Fc结构域中)。示例性序列在图42B中示出。
实施例34.Fc-抗原结合结构域替代构建体34的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的三特异性构建体。Fc-抗原结合结构域替代构建体34(图43A)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链、第一短Fc链的两个拷贝以及第二短Fc链的一个拷贝)以及三条或两条不同的轻链多肽或一条共同的轻链多肽。可以看出，不是使用两个不同的突起/空腔异二聚化结构域，而是使用一个突起/空腔异二聚化结构域，并且使用一个静电转向异二聚化结构域(存在于两个Fc结构域中)。示例性序列在图43B中示出。
实施例35.Fc-抗原结合结构域构建体35的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的三特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体35(图44A)包括四个不同的含Fc单体的多肽(两个不同的长Fc链，以及两个不同的短Fc链)以及三个或两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。第一长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)，并与具有选自表4的第一组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变的Fc结构域单体串联。第二长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)，并与具有选自表4的与第一长Fc链中的第一组突变不同的第二组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变的Fc结构域单体串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第三特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。将DNA序列优化以在哺乳动物细胞中表达，并克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中。将DNA质粒构建体经由脂质体转染到人胚肾(HEK)293细胞中。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由四个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。示例性序列在图44B中示出。
实施例36.Fc-抗原结合结构域构建体37的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的三特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体37(图45A)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝，以及两个不同短Fc链中每一者的两个拷贝)以及三个或两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变，并与具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)的Fc结构域单体、具有选自表4的第二组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表4的一个或多个反向电荷突变的第二Fc结构域单体串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第三特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。短Fc链和长Fc链的氨基酸序列由三个单独的质粒编码。按实施例5纯化表达的蛋白质。示例性序列在图45B中示出。
实施例37.Fc-抗原结合结构域构建体40的设计和纯化
如下所述制备使用具有不同抗原结合结构域以及两组不同的异二聚化突变的长Fc链和短Fc链形成的三特异性构建体。Fc-抗原结合结构域构建体40(图46A)包括三个不同的含Fc单体的多肽(长Fc链的两个拷贝，以及两个不同短Fc链中每一者的两个拷贝)以及三个或两个不同的轻链多肽或一个共同的轻链多肽。长Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第一特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表5或表5的反向电荷突变(例如，K409D/D399K突变)，并与具有选自表4的第一组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变的Fc结构域单体、具有选自表4的第二组突起形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变的第二Fc结构域单体串联。第一短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第二特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的第一组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。第二短Fc链包含Fc结构域单体和N末端处具有第三特异性的抗原结合结构域，该Fc结构域单体具有选自表4的与第一短Fc链中的第一组突变不同的第二组空腔形成突变(异二聚化突变)以及任选的选自表5的一个或多个反向电荷突变。按实施例5纯化表达的蛋白质。示例性序列在图46B中示出。
其他实施方案
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，其程度如同每个独立的出版物或专利申请具体地且个别地指出以引用的方式并入。
虽然本公开已结合其具体实施方案进行描述，但应理解，进一步的修改是可能的行，并且本专利申请预期覆盖一般而言遵循本公开的原理的本公开的任何变化、用途或适应，并且包括与本公开的此类偏离，所述偏离在本公开所属领域内的已知或惯常实践内，并且可以应用于上文所述的基本特征，并且落入权利要求的范围内。
其他实施方案在权利要求内。

Claims (170)

1.一种多肽，其包含：具有第一特异性的抗原结合结构域；第一接头；第一IgG1 Fc结构域单体，其包含第一异二聚化选择性模块；第二接头；第二IgG1 Fc结构域单体，其包含第二异二聚化选择性模块；任选的第三接头；以及任选的第三IgG1 Fc结构域单体，其中所述第一异二聚化选择性模块和所述第二异二聚化选择性模块是不同的。
2.如权利要求1所述的多肽，其包含第三接头和第三IgG Fc结构域单体，其中所述第三IgG1 Fc结构域单体包含同二聚化选择性模块或与所述第一异二聚化选择性模块或所述第二异二聚化选择性模块相同的异二聚化选择性模块。
3.如权利要求1所述的多肽，其按以下顺序包含：所述具有第一特异性的抗原结合结构域；所述第一接头；所述第一IgG1 Fc结构域单体，其包含第一异二聚化选择性模块；所述第二接头；所述第二IgG1 Fc结构域单体，其包含第二异二聚化选择性模块；任选的第三接头；以及第三IgG1 Fc结构域单体。
4.如权利要求1所述的多肽，其按以下顺序包含：所述具有第一特异性的抗原结合结构域；所述第一接头；所述第一IgG1 Fc结构域单体，其包含第一异二聚化选择性模块；第三接头；第三IgG1 Fc结构域单体；所述第二接头；以及所述第二IgG1 Fc结构域单体，其包含第二异二聚化选择性模块。
5.如权利要求1所述的多肽，其按以下顺序包含：所述具有第一特异性的抗原结合结构域；第三接头；第三IgG1 Fc结构域单体；所述第一接头；所述第一IgG1 Fc结构域单体，其包含第一异二聚化选择性模块；所述第二接头；以及所述第二IgG1 Fc结构域单体，其包含第二异二聚化选择性模块。
6.如权利要求1所述的多肽，其包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中所述第一IgG1 Fc结构域单体和所述第二IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变，并且所述第三IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
7.如权利要求1所述的多肽，其包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中所述第一IgG1 Fc结构域单体和所述第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变，并且所述第二IgG1结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
8.如权利要求1所述的多肽，其包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中所述第二IgG1 Fc结构域单体和所述第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变，并且所述第一IgG1结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
9.如权利要求1所述的多肽，其包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中两个所述IgG1 Fc结构域单体各自包含两个或四个反向电荷突变，并且一个IgG1 Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变。
10.如权利要求1所述的多肽，其包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中两个所述IgG1 Fc结构域单体各自包含形成工程化突起的突变，并且一个IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
11.如权利要求1-10中任一项所述的多肽，其中包含形成工程化突起的突变的所述IgG1 Fc结构域单体还包含一个、两个或三个反向电荷突变。
12.如权利要求1-3、6-8、10和11中任一项所述的多肽，其中所述多肽的包含形成工程化突起的突变的IgG1 Fc结构域单体各自具有相同的突起形成突变。
13.如权利要求1-3和9中任一项所述的多肽，其中所述多肽的包含两个或四个反向电荷突变但不包含突起形成突变的所述IgG1 Fc结构域单体各自具有相同的反向电荷突变。
14.如权利要求1-13中任一项所述的多肽，其中所述形成工程化突起的突变和所述反向电荷突变在所述CH3结构域中。
15.如权利要求14所述的多肽，其中所述突变在从EU位置G341到EU位置K447的序列内，包括端点。
16.如权利要求1-14中任一项所述的多肽，其中所述突变是单一氨基酸变化。
17.如权利要求1所述的多肽，其中所述第二接头和所述任选的第三接头包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成：
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG和GGGGGGGGGGGGGGGG。
18.如权利要求1所述的多肽，其中所述第二接头和所述任选的第三接头是甘氨酸间隔物。
19.如权利要求1所述的多肽，其中所述第二接头和所述任选的第三接头独立地由4至30、4至20、8至30、8至20、12至20或12至30个甘氨酸残基组成。
20.如权利要求1所述的多肽，其中所述第二接头和所述任选的第三接头由20个甘氨酸残基组成。
21.如权利要求1-20所述的多肽，其中至少一个所述Fc结构域单体在EU位置I253处包含单一氨基酸突变。
22.如权利要求21所述的多肽，其中EU位置I253处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组：I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y。
23.如权利要求22所述的多肽，其中位置I253处的每个氨基酸突变是I253A。
24.如权利要求1-23中任一项所述的多肽，其中至少一个所述Fc结构域单体在EU位置R292处包含单一氨基酸突变。
25.如权利要求24所述的多肽，其中EU位置R292处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组：R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y。
26.如权利要求25所述的多肽，其中R292位置处的每个氨基酸突变是R292P。
27.如权利要求1-26中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述铰链独立地包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成：EPKSCDKTHTCPPCPAPELL和DKTHTCPPCPAPELL。
28.如权利要求27所述的多肽，其中所述第二Fc结构域单体和所述第三Fc结构域单体的所述铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL。
29.如权利要求27所述的多肽，其中所述第一Fc结构域单体的所述铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL。
30.如权利要求27所述的多肽，其中所述第一Fc结构域单体的所述铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL，并且所述第二Fc结构域单体和所述第三Fc结构域单体的所述铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL。
31.如权利要求1-30中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH2结构域独立地包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK，其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换。
32.如权利要求1-30中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK，其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换。
33.如权利要求1-30中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK，其具有不超过两个单一氨基酸置换。
34.如权利要求1-30中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK。
35.如权利要求1-30中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过10个单一氨基酸置换。
36.如权利要求1-30中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过8个单一氨基酸置换。
37.如权利要求1-30中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过6个单一氨基酸置换。
38.如权利要求1-30中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过5个单一氨基酸置换。
39.如权利要求31-38中任一项所述的多肽，其中所述单一氨基酸置换选自由以下项组成的组：S354C、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
40.如权利要求1-30中任一项所述的多肽，其中每个所述Fc结构域单体独立地包含SEQID NO:42、43、45和47中任一者具有多至10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。
41.如权利要求40所述的多肽，其中多至6个所述单一氨基酸置换是所述CH3结构域中的反向电荷突变或是形成工程化突起的突变。
42.如权利要求40所述的多肽，其中所述单一氨基酸置换在从EU位置G341到EU位置K447的序列内，包括端点。
43.如权利要求1所述的多肽，其中至少一个所述形成工程化突起的突变选自由以下项组成的组：S354C、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T和T394F。
44.如权利要求1所述的多肽，其中所述两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
45.如权利要求1-44中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合结构域是scFv。
46.如权利要求1-44中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含VH结构域和CH1结构域。
47.如权利要求44所述的多肽，其中所述抗原结合结构域还包含VL结构域。
48.如权利要求46所述的多肽，其中所述VH结构域包含表1A或表1B中列出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列。
49.如权利要求46所述的多肽，其中所述VH结构域包含含有表2中列出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
50.如权利要求46所述的多肽，其中所述VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VH序列不包括所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中列出的抗体的所述VH序列具有至少95％或98％的同一性。
51.如权利要求46所述的多肽，其中所述VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列。
52.如权利要求46所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含表1A或表1B中列出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
53.如权利要求46所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含来自表2中列出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
54.如权利要求46所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL结构域包含表2中列出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中所述VH结构域和所述VL结构域序列不包括所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中列出的抗体的所述VH序列和所述VL序列具有至少95％或98％的同一性。
55.如权利要求46所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含表2中列出的抗体的一组VH和VL序列。
56.如权利要求1-44所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含IgG CL抗体恒定结构域和IgG CH1抗体恒定结构域。
57.如权利要求1-44所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含VH结构域和CH1结构域，并且可以与包含VL结构域和CL结构域的多肽结合以形成Fab。
58.一种多肽复合物，其包含如权利要求1-57中任一项所述的多肽的两个拷贝，所述两个拷贝通过每个多肽的IgG1 Fc结构域单体的所述铰链内的半胱氨酸残基之间的二硫键连接。
59.如权利要求58所述的多肽复合物，其中所述多肽的每个拷贝相同地包含具有选自以下项的两个或四个反向电荷突变的Fc结构域单体：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K，其中所述多肽的所述两个拷贝在具有这些反向电荷突变的所述Fc结构域单体处连接。
60.一种多肽复合物，其包含与第二多肽连接的如权利要求1-57中任一项所述的多肽，所述第二多肽包含IgG1 Fc结构域单体，其中所述多肽和所述第二多肽通过所述多肽的第一IgG1 Fc结构域单体、第二IgG1 Fc结构域单体或第三IgG1 Fc结构域单体的所述铰链结构域内的半胱氨酸残基与所述第二多肽的所述铰链结构域内的半胱氨酸残基之间的二硫键连接。
61.如权利要求60所述的多肽复合物，其中所述第二多肽IgG1 Fc单体包含形成工程化空腔的突变。
62.如权利要求61所述的多肽复合物，其中所述形成工程化空腔的突变选自由以下项组成的组：Y407T、Y407A、F405A、T394S、T394W/Y407A、T366W/T394S、T366S/L368A/Y407V/Y349C、S364H/F405A。
63.如权利要求61所述的多肽复合物，其中所述第二多肽单体还包含至少一个反向电荷突变。
64.如权利要求63所述的多肽复合物，其中所述至少一个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
65.如权利要求60所述的多肽复合物，其中所述第二多肽单体包含两个或四个反向电荷突变，其中所述两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
66.如权利要求60-66中任一项所述的多肽复合物，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有多至10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。
67.如权利要求60-66中任一项所述的多肽复合物，其中所述第二多肽还包含具有第一特异性或第二特异性的抗原结合结构域。
68.如权利要求67所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域具有第二特异性。
69.如权利要求67或68所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域包含抗体重链可变结构域。
70.如权利要求67或68所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域。
71.如权利要求67或68所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域是scFv。
72.如权利要求67或68所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域包含VH结构域和CH1结构域。
73.如权利要求72所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域还包含VL结构域。
74.如权利要求72所述的多肽复合物，其中所述VH结构域包含表1A或表1B中列出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列。
75.如权利要求72所述的多肽复合物，其中所述VH结构域包含含有表2中列出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
76.如权利要求72所述的多肽复合物，其中所述VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VH序列不包括所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中列出的抗体的所述VH序列具有至少95％或98％的同一性。
77.如权利要求72所述的多肽复合物，其中所述VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列。
78.如权利要求72所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域包含表1A或表1B中列出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
79.如权利要求72所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域包含来自表2中列出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
80.如权利要求72所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL结构域包含表2中列出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中所述VH结构域和所述VL结构域序列不包括所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中列出的抗体的所述VH序列和所述VL序列具有至少95％或98％的同一性。
81.如权利要求72所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域包含表2中列出的抗体的VH和VL序列。
82.如权利要求67或68所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域包含IgG CL抗体恒定结构域和IgG CH1抗体恒定结构域。
83.如权利要求67或68所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域包含VH结构域和CH1结构域，并且可以与包含VL结构域和CL结构域的多肽结合以形成Fab。
84.如权利要求60-83中任一项所述的多肽复合物，其中所述多肽复合物还与第三多肽连接，所述第三多肽包含IgG1 Fc结构域单体，所述IgG1 Fc结构域单体包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中所述多肽和所述第三多肽通过所述多肽的第一IgG1 Fc结构域单体、第二IgG1 Fc结构域单体或第三IgG1 Fc结构域单体的所述铰链结构域内的半胱氨酸残基与所述第三多肽的所述铰链结构域内的半胱氨酸残基之间的二硫键连接，其中所述第二多肽和所述第三多肽与所述多肽的不同IgG1 Fc结构域单体连接。
85.如权利要求85所述的多肽复合物，其中所述第三多肽单体包含两个或四个反向电荷突变，其中所述两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
86.如权利要求85或86所述的多肽复合物，其中所述第三多肽包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有多至10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。
87.如权利要求85-87中任一项所述的多肽复合物，其中所述第三多肽还包含具有第二特异性或第三特异性的抗原结合结构域。
88.如权利要求88所述的多肽复合物，其中所述抗原结合结构域具有第三特异性。
89.如权利要求58-89中任一项所述的多肽复合物，其相对于具有单个Fc结构域和至少两个具有不同特异性的抗原结合结构域的多肽复合物在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中包含增强的效应子功能。
90.一种多肽，其包含：第一IgG1 Fc结构域单体，其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域；第二接头；第二IgG1 Fc结构域单体，其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域；任选的第三接头；以及任选的第三IgG1 Fc结构域单体，其包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，
其中至少一个Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变，并且
其中至少一个Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
91.如权利要求91所述的多肽，其中所述第一IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变，并且所述第二IgG1 Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变。
92.如权利要求91所述的多肽，其中所述第一IgG1 Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变，并且所述第二IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
93.如权利要求91所述的多肽，其包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中所述第一IgG1 Fc结构域单体和所述第二IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变，并且所述第三IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
94.如权利要求91所述的多肽，其包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中所述第一IgG1 Fc结构域单体和所述第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变，并且所述第二IgG1结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
95.如权利要求91所述的多肽，其包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中所述第二IgG1 Fc结构域单体和所述第三IgG1 Fc结构域单体各自均包含形成工程化突起的突变，并且所述第一IgG1结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
96.如权利要求91所述的多肽，其包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中两个所述IgG1 Fc结构域单体各自包含两个或四个反向电荷突变，并且一个IgG1 Fc结构域单体包含形成工程化突起的突变。
97.如权利要求911所述的多肽，其包含第三接头和第三IgG1 Fc结构域单体，其中两个所述IgG1 Fc结构域单体各自包含形成工程化突起的突变，并且一个IgG1 Fc结构域单体包含两个或四个反向电荷突变。
98.如权利要求91-99中任一项所述的多肽，其中包含形成工程化突起的突变的所述IgG1 Fc结构域单体还包含一个、两个或三个反向电荷突变。
99.如权利要求91、94-96和99中任一项所述的多肽，其中所述多肽的包含形成工程化突起的突变的IgG1 Fc结构域单体各自具有相同的突起形成突变。
100.如权利要求91或97所述的多肽，其中所述多肽的包含两个或四个反向电荷突变但不包含突起形成突变的所述IgG1 Fc结构域单体各自具有相同的反向电荷突变。
101.如权利要求91-101中任一项所述的多肽，其中所述形成工程化突起的突变和所述反向电荷突变在所述CH3结构域中。
102.如权利要求102所述的多肽，其中所述突变在从EU位置G341到EU位置K447的序列内，包括端点。
103.如权利要求1-103中任一项所述的多肽，其中所述突变是单一氨基酸变化。
104.如权利要求91所述的多肽，其中所述第二接头和所述任选的第三接头包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成：
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、GGGGS、GGSG、SGGG、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS、GSGSGSGSGSGS、GGSGGS、GGSGGSGGS、GGSGGSGGSGGS、GGSG、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS、GGGSGGGSGGGS、SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG、GGSGGGSGGGSGGGSGGS、GGGG、GGGGGGGG、GGGGGGGGGGGG和GGGGGGGGGGGGGGGG。
105.如权利要求91所述的多肽，其中所述第二接头和所述任选的第三接头是甘氨酸间隔物。
106.如权利要求91所述的多肽，其中所述第二接头和所述任选的第三接头独立地由4至30、4至20、8至30、8至20、12至20或12至30个甘氨酸残基组成。
107.如权利要求91所述的多肽，其中所述第二接头和所述任选的第三接头由20个甘氨酸残基组成。
108.如权利要求91-108所述的多肽，其中至少一个所述Fc结构域单体在EU位置I253处包含单一氨基酸突变。
109.如权利要求109所述的多肽，其中EU位置I253处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组：I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W和I253Y。
110.如权利要求110所述的多肽，其中位置I253处的每个氨基酸突变是I253A。
111.如权利要求91-111中任一项所述的多肽，其中至少一个所述Fc结构域单体在EU位置R292处包含单一氨基酸突变。
112.如权利要求112所述的多肽，其中EU位置R292处的每个氨基酸突变独立地选自由以下项组成的组：R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T和R292Y。
113.如权利要求113所述的多肽，其中R292位置处的每个氨基酸突变是R292P。
114.如权利要求91-114中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述铰链独立地包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成：EPKSCDKTHTCPPCPAPELL和DKTHTCPPCPAPELL。
115.如权利要求115所述的多肽，其中所述第二Fc结构域单体和所述第三Fc结构域单体的所述铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL。
116.如权利要求115所述的多肽，其中所述第一Fc结构域单体的所述铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL。
117.如权利要求115所述的多肽，其中所述第一Fc结构域单体的所述铰链部分具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEL，并且所述第二Fc结构域单体和所述第三Fc结构域单体的所述铰链部分具有氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELL。
118.如权利要求91-118中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH2结构域独立地包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK，其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换。
119.如权利要求91-118中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK，其具有不超过两个单一氨基酸缺失或置换。
120.如权利要求91-118中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK，其具有不超过两个单一氨基酸置换。
121.如权利要求91-118中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH2结构域是相同的并且包含以下氨基酸序列：GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK。
122.如权利要求91-118中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过10个单一氨基酸置换。
123.如权利要求91-118中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过8个单一氨基酸置换。
124.如权利要求91-118中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过6个单一氨基酸置换。
125.如权利要求91-118中任一项所述的多肽，其中每个Fc结构域单体的所述CH3结构域独立地包含以下氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG，其具有不超过5个单一氨基酸置换。
126.如权利要求119-126中任一项所述的多肽，其中所述单一氨基酸置换选自由以下项组成的组：S354C、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
127.如权利要求91-118中任一项所述的多肽，其中每个所述Fc结构域单体独立地包含SEQ ID NO:42、43、45和47中任一者具有多至10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。
128.如权利要求128所述的多肽，其中多至6个所述单一氨基酸置换是所述CH3结构域中的反向电荷突变或是形成工程化突起的突变。
129.如权利要求128所述的多肽，其中所述单一氨基酸置换在从EU位置G341到EU位置K447的序列内，包括端点。
130.如权利要求91所述的多肽，其中至少一个所述形成工程化突起的突变选自由以下项组成的组：S354C、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T和T394F。
131.如权利要求91所述的多肽，其中所述两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
132.一种多肽复合物，其包含如权利要求91-132中任一项所述的多肽，其中所述多肽与第二多肽连接，所述第二多肽包含具有第一特异性的抗原结合结构域和IgG1 Fc结构域单体，所述IgG1 Fc结构域单体包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中所述多肽和所述第二多肽通过所述多肽的第一IgG1 Fc结构域单体、第二IgG1 Fc结构域单体或第三IgG1 Fc结构域单体的所述铰链结构域内的半胱氨酸残基与所述第二多肽的所述铰链结构域内的半胱氨酸残基之间的二硫键连接，并且其中所述多肽还与第三多肽连接，所述第三多肽包含具有第二特异性的抗原结合结构域和IgG1 Fc结构域单体，所述IgG1 Fc结构域单体包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中所述多肽和所述第三多肽通过所述多肽的第一IgG1 Fc结构域单体、第二IgG1 Fc结构域单体或第三IgG1 Fc结构域单体的未被所述第二多肽连接的铰链结构域内的半胱氨酸残基与所述第三多肽的所述铰链结构域内的半胱氨酸残基之间的二硫键连接。
133.如权利要求134所述的多肽复合物，其中所述第二多肽单体或所述第三多肽单体包含形成工程化空腔的突变。
134.如权利要求135所述的多肽复合物，其中所述形成工程化空腔的突变选自由以下项组成的组：Y407T、Y407A、F405A、T394S、T394W/Y407A、T366W/T394S、T366S/L368A/Y407V/Y349C、S364H/F405A。
135.如权利要求135所述的多肽复合物，其中所述第二多肽单体包含形成工程化空腔的突变，并且还包含至少一个反向电荷突变。
136.如权利要求135所述的多肽复合物，其中所述第三多肽单体包含形成工程化空腔的突变，并且还包含至少一个反向电荷突变。
137.如权利要求137或138所述的多肽复合物，其中所述至少一个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
138.如权利要求134所述的多肽复合物，其中所述第二多肽单体或所述第三多肽单体包含两个或四个反向电荷突变，其中所述两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
139.如权利要求137所述的多肽复合物，其中所述第三多肽单体包含两个或四个反向电荷突变，其中所述两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
140.如权利要求138所述的多肽复合物，其中所述第二多肽单体包含两个或四个反向电荷突变，其中所述两个或四个反向电荷突变选自：K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R和D356K。
141.如权利要求134-142中任一项所述的多肽复合物，其中所述第二多肽包含SEQ IDNO:42、43、45和47中任一者具有多至10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。
142.如权利要求134-142中任一项所述的多肽复合物，其中所述第三多肽包含SEQ IDNO:42、43、45和47中任一者具有多至10个单一氨基酸置换的氨基酸序列。
143.如权利要求134-144中任一项所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域包含抗体重链可变结构域。
144.如权利要求134-144中任一项所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域。
145.如权利要求134-144中任一项所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域是scFv。
146.如权利要求134-144中任一项所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域包含VH结构域和CH1结构域。
147.如权利要求148所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域还包含VL结构域。
148.如权利要求148所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域的所述VH结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域的所述VH结构域包含表1A或表1B中列出的一组CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列。
149.如权利要求148所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域的所述VH结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域的所述VH结构域包含含有表2中列出的抗体的序列的VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
150.如权利要求148所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域的所述VH结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域的所述VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VH序列不包括所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列时与表2中列出的抗体的所述VH序列具有至少有95％或98％的同一性。
151.如权利要求148所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域包含表1A或表1B中列出的一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
152.如权利要求148所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域包含来自表2中列出的抗体的一组VH和VL序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
153.如权利要求148所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含表2中列出的抗体的VH序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL结构域包含表2中列出的抗体的VL序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中所述VH结构域和所述VL结构域序列不包括所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列时与表2中列出的抗体的所述VH和VL序列具有至少95％或98％的同一性。
154.如权利要求148所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域包含表2中列出的抗体的VH和VL序列。
155.如权利要求134所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域包含IgG CL抗体恒定结构域和IgG CH1抗体恒定结构域。
156.如权利要求134所述的多肽复合物，其中所述具有第一特异性的抗原结合结构域和/或所述具有第二特异性的抗原结合结构域包含VH结构域和CH1结构域，并且可以与包含VL结构域和CL结构域的多肽结合以形成Fab。
157.如权利要求134-158中任一项所述的多肽复合物，其相对于具有单个Fc结构域和至少两个具有不同特异性的抗原结合结构域的多肽复合物在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中包含增强的效应子功能。160.一种核酸分子，其编码如权利要求1-159中任一项所述的多肽。
158.一种表达载体，其包含如权利要求160所述的核酸分子。
159.一种宿主细胞，其包含如权利要求160所述的核酸分子。
160.一种宿主细胞，其包含如权利要求161所述的表达载体。
161.一种产生如权利要求1-159中任一项所述的多肽的方法，其包括在表达所述多肽的条件下培养如权利要求162或权利要求163所述的宿主细胞。
162.如权利要求162所述的宿主细胞，其还包含编码包含抗体VL结构域的多肽的核酸分子。
163.如权利要求163所述的宿主细胞，其还包含编码包含抗体VL结构域的多肽的核酸分子。
164.如权利要求162所述的宿主细胞，其还包含编码包含抗体VL结构域和抗体CL结构域的多肽的核酸分子。
165.如权利要求163所述的宿主细胞，其还包含编码包含抗体VL结构域和抗体CL结构域的多肽的核酸分子。
166.如权利要求162所述的宿主细胞，其还包含编码包含具有不超过10个单一氨基酸突变的IgG1 Fc结构域单体的多肽的核酸分子。
167.如权利要求163所述的宿主细胞，其还包含编码包含具有不超过10个单一氨基酸突变的IgG1 Fc结构域单体的多肽的核酸分子。
168.如权利要求169或170所述的宿主细胞，其中所述IgG1 Fc结构域单体在所述CH3结构域中包含SEQ ID No:42、43、45和47中任一者具有不超过10、8、6或4个单一氨基酸突变的氨基酸序列。
169.一种药物组合物，其包含如权利要求1-159中任一项所述的多肽。
170.如权利要求172所述的药物组合物，其中少于40％、30％、20％、10％、5％、2％的所述多肽在Fc结构域单体上具有至少一个岩藻糖修饰。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102369214A (zh) * 2009-04-07 2012-03-07 罗氏格黎卡特股份公司 三价、双特异性抗体
US20150307628A1 (en) * 2012-11-27 2015-10-29 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Ch3 domain variant pair inducing formation of heterodimer of heavy chain constant region of antibody at high efficiency, method for preparing same, and use thereof
WO2016087416A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
WO2017151971A2 (en) * 2016-03-02 2017-09-08 Momenta Pharmaceuticals, Inc. METHODS RELATED TO ENGINEERED Fc CONSTRUCTS
US20180177873A1 (en) * 2015-04-24 2018-06-28 Genentech, Inc. Multispecific antigen-binding proteins

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017518965A (ja) * 2014-05-02 2017-07-13 モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッ エンジニアリングされたＦｃ構築物に関連する組成物および方法
US11623964B2 (en) * 2016-05-23 2023-04-11 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods related to engineered Fc constructs
EP3565595A4 (en) * 2017-01-06 2021-03-17 Momenta Pharmaceuticals, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS ASSOCIATED WITH DOMAIN CONSTRUCTIONS OF BINDING TO MANIPULATED FC ANTIGEN

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102369214A (zh) * 2009-04-07 2012-03-07 罗氏格黎卡特股份公司 三价、双特异性抗体
US20150307628A1 (en) * 2012-11-27 2015-10-29 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Ch3 domain variant pair inducing formation of heterodimer of heavy chain constant region of antibody at high efficiency, method for preparing same, and use thereof
WO2016087416A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
US20180177873A1 (en) * 2015-04-24 2018-06-28 Genentech, Inc. Multispecific antigen-binding proteins
WO2017151971A2 (en) * 2016-03-02 2017-09-08 Momenta Pharmaceuticals, Inc. METHODS RELATED TO ENGINEERED Fc CONSTRUCTS

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