KR20170012351A - 다중 암 항원에 특이적으로 결합하는 삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법 - Google Patents

다중 암 항원에 특이적으로 결합하는 삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 삼중-특이적 결합 분자에 관한 것으로, 그것은 3개의 결합 도메인을 가짐으로써 3개의 에피토프에 대한 동조된 결합을 중재할 수 있는 다중-사슬 폴리펩티드 분자이다. 삼중-특이적 결합 분자는 바람직하게는 그것이 (1) 제 1 암 항원의 에피토프, (2) 제 2 암 항원의 에피토프 및 (3) 면역 시스템 이펙터 세포의 표면에 발현된 분자의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 것을 허용하고, 그로써 암 항원을 발현하는 세포에 면역 시스템 이펙터 세포를 정위시킬 수 있고, 그로 인해 그런 암세포의 살해를 용이하게 하는 결합 도메인을 가지는 것을 특징으로 한다.

Description

다중 암 항원에 특이적으로 결합하는 삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법{TRI-SPECIFIC BINDING MOLECULES THAT SPECIFICALLY BIND TO MULTIPLE CANCER ANTIGENS AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원에 대한 교차 -참조
본 출원은 미국 특허 출원 번호 62/107,824 (2015년 1월 26일 출원됨), 62/008,229 (2014년 6월 5일 출원됨; 계류중) 및 62/004,571 (2014년 5월 29일 출원됨; 계류중)에 대한 우선권을 주장하고, 이들 출원은 각각 본원에 전체 내용이 참조로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 37 C.F.R. 1.821 (이하 참조)에 따라 하나 이상의 서열 목록을 포함하고, 그것은 컴퓨터-판독가능한 매체 (파일명: 1301_0114PCT_Sequence_Listing_ST25.txt, 2015년 5월 18일에 생성되고, 244,021 바이트의 크기를 가짐)에 개시되며, 그 파일은 본원에 전체 내용이 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 삼중-특이적 결합 분자에 관한 것으로, 그것은 3개의 결합 도메인을 가지고 그러므로 3개의 에피토프에 대한 동조된 결합 (coordinated binding)을 중재할 수 있는 다중-사슬 폴리펩티드 분자이다. 삼중-특이적 결합 분자는 바람직하게는 (1) 제 1 암 항원의 에피토프, (2) 제 2 암 항원의 에피토프 및 (3) 면역 시스템 이펙터 세포의 표면에 발현된 분자의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 것을 허용하고, 그로써 암 항원을 발현하는 세포에 면역 시스템 이펙터 세포를 정위시킬 수 있고, 그로 인해 그런 암세포의 살해를 용이하게 하는 결합 도메인을 가진다는 점에서 특징적이다.
I. 포유류 면역 시스템
포유류 면역 시스템은 예컨대 손상, 감염 및 신생물 형성을 포함하여 다양한 상태에 대한 방어로서 작용한다. 인간 및 다른 포유류가 병원체, 외래 물질 및 암 항원에 대한 면역학적 반응을 발달시키는 효율은 두 가지 특징에 기초한다: 항원 인식에 대한 면역 반응의 정교한 특이성, 및 동일한 항원으로의 재-활성화시 더 빠르고 보다 격렬한 반응을 허용하는 면역학적 기억 (Portol P. et al. (2009) "The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination," Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex," Immunol Rev. 232(1):7-21).
포유류 면역 시스템은 두 개의 별도지만 상호관련된 시스템: 세포 및 체액 면역 시스템에 의해 중재된다. 일반적으로 말하면, 체액 시스템은 신체에 대해 외래인 것으로서 시스템에 의해 인식된 생성물과 조합하여 그것을 중화시키는 능력을 가지는 가용성 생성물 (항체 또는 면역글로불린)에 의해 중재된다. 대조적으로, 세포 면역 시스템은 "T 세포"로 불리는 특정 세포의 고정화를 포함한다. T 세포는 흉선으로부터 유도되고 조직, 림프계 및 순환계 사이를 순환하는 림프구이다. 외래 구조 (항원)의 존재 및 인식에 대한 반응으로, T 세포는 면역 반응을 개시하기 위해 "활성화"된다. 많은 경우에 이들 외래 항원들은 신생물 형성 또는 감염의 결과로서 숙주 세포 상에 발현된다. 비록 T 세포는 그 자체로는 항체를 분비하지는 않지만, 통상적으로 림프구의 제 2 부류, B 세포 (골수로부터 유도됨)에 의한 항체 분비에 요구된다. 중요하게도, T 세포는 한 항원을 다른 항원과 구별할 수 있게 되기 위해 보기 드문 면역학적 특이성을 나타낸다. T 세포의 두 유형, "T 헬퍼 세포" 및 "세포독성 T 세포"가 특히 관련된다.
T 헬퍼 세포는 그것들의 당단백질, CD4의 발현을 특징으로 한다 (즉 그것들은 "CD4+"임). CD4+ T 세포들은 대부분의 포유류 면역 및 자가면역 반응의 필수적인 조직자 (organizer)이다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48). CD4+ T 세포들의 활성화는 항원 제공 세포 (예컨대 B 세포, 대식세포 또는 수지상 세포)의 표면에 배열되는 항원:주요 조직적합성 부류 II (MHC II) 분자 복합체와 나이브 (naive) CD4+ T T세포의 표면에 배열되는, 두 분자, 즉 T 세포 수용체 ("TCR") 및 CD3 세포-표면 수용체 리간드의 복합체 사이의 공동-자극성 상호작용을 통해 중재되는 것으로 밝혀졌다. 활성화된 T 헬퍼 세포는 표적 세포에 대한 염증성 반응을 중재할 수 있는 Th1 세포로 증식할 수 있다.
세포독성 T 세포들은 CD8의 발현을 특징으로 한다 (즉 그것들은 CD3+뿐 아니라 "CD8+"이다). CD8+ T 세포들의 활성화는 표적 세포의 표면에 배열되는 항원:주요 조직적합성 부류 I (MHC I) 분자 복합체와 CD8+ T 세포의 표면에 배열되는, CD8과 T 세포의 복합체 사이의 공동-자극성 상호작용을 통해 중재되는 것으로 밝혀졌다. 단지 특정 면역 시스템 세포에 의해서만 발현되는 MHC II 분자와 달리, MHC I 분자들은 매우 광범위하게 발현된다. 그러므로, 세포독성 T 세포들은 광범위한 세포 유형들에 결합할 수 있다. 활성화된 세포독성 T 세포들은 세포독소 퍼포린, 그랜자임 및 그라눌라이신의 방출을 통해 세포 살해를 중재한다. 퍼포린의 작용을 통해서, 그랜자임은 표적 세포의 세포질로 들어가고 그것들의 세린 프로테아제 기능이 표적화된 세포의 아폽토시스 (프로그래밍되어 있는 세포 사망)를 궁극적으로 유도하는 일련의 시스테인 프로테아제인 카스파제 캐스케이드를 촉발시킨다.
T 세포 수용체 ("TCR")는 α 및 β 사슬의 공유 결합된 이종이량체이다 ("TCRαβ"). 이들 사슬은 길이가 259 (α) 및 296 (β) 아미노산인 부류 I 막 폴리펩티드이다. CD3 분자는 5개의 뚜렷한 폴리펩티드 사슬 (CD3 γ 사슬, CD3 δ 사슬, 2개의 ε CD3 사슬 및 2개의 제타 사슬)로 구성된 T 세포 공-수용체이다. 개별적인 폴리펩티드 사슬들은 결합하여 3개의 이량체 (εγ, εδ, ζζ)의 복합체를 형성한다 (Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology Of The T Cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14; Chetty, R. et al. (1994) "CD3: Structure, Function And The Role Of Immunostaining In Clinical Practice," J. Pathol. 173:303-307; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex," Immunol Rev. 232(1):7-21; Call, M.E. et al. (2007) "Common Themes In The Assembly And Architecture Of Activating Immune Receptors," Nat. Rev. Immunol. 7:841-850; Weiss, A. (1993) "T Cell Antigen Receptor Signal Transduction: A Tale Of Tails And Cytoplasmic Protein-Tyrosine Kinases," Cell 73:209-212). CD3 복합체는 T 림프구의 활성화 신호를 생성하기 위하여 TCR과 결합한다. CD3이 없을 때, TCR은 적절하게 조립하지 못하고 분해된다 (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T Cell Receptor Gene Transfer," Immunology 129(2):170-177). CD3은 모든 성숙한 T 세포의 막에 결합하고, 실제로 다른 세포 유형에는 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다 (Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease," 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214-216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer," Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR /CD3 Complex," Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139 참조).
TCR 및 CD3 복합체는 CD3 ζ 사슬 제타 사슬 (T 세포 수용체 T3 제타 사슬 또는 CD247로서도 알려져 있음)과 함께 TCR 복합체를 포함한다 (van der Merwe, P.A. etc. (epub Dec. 3, 2010) "Mechanisms For T Cell Receptor Triggering," Nat. Rev. Immunol. 11:47-55; Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology of the T cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, and Initiation of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140). 복합체는 그것이 큰 수 (10)의 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유하기 때문에 특히 중요하다.
T 세포 활성화에는 두 가지 상호작용이 필요하다 (Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation," Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339). 첫 번째 상호작용에서, 세포는 그 세포의 주요 조직적합성 복합체에 결합된 관련 표적 항원을 나타내서 나이브 T 림프구의 T 세포 수용체 ("TCR")에 결합할 수 있어야 한다. 두 번째 상호작용에서, 세포의 리간드는 T 림프구의 송-수용체에 결합하여야 한다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation," Immunol. Rev. 229:307-321). 두 가지 자극 신호를 모두 경험하는 T 세포는 그런 다음 사이토킨 (예컨대 인터류킨-2 및 인터류킨-12)에 반응할 수 있다. TCR 참여 (engagement) 중에 둘 다의 공-자극 신호가 없을 때, T 세포는 클론 무반응으로 언급되는, 기능적으로 무반응 상태에 들어간다 (Khawli, L.A. et al. (2008) "Cytokine, Chemokine , and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors," Exper. Pharmacol. 181:291-328). 병리적 상태에서, T 세포는 다양한 기관-특이적 자가면역 질환, 예컨대 제 1형 당뇨병, 류머티스성 관절염 및 다발성 경색의 핵심 주역이다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48). E
적응성 면역반응을 이루도록 T 세포를 활성화하기 위해 두 개의 신호를 필요로 하는 것은 T 세포에 의해 인식될 수 있는 시스템에서의 위치에서 항원 제공 세포 상에 존재할 수 있는 자체-항원에 대한 반응을 피하기 위한 메커니즘을 제공하는 것으로 여겨진다. T 세포의 세포와의 접촉이 두 가지 필요한 신호 중 하나만의 생성을 초래하는 경우, T 세포는 활성화되지 못하고 적응성 면역 반응을 일어나지 않는다.
II. 항체 및 다른 에피토프 -결합 분자
A. 항체
"항체"는 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에, 면역글로불린 분자의 가변 도메인에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통하여 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용되는 그 용어는 무상 다클론성 또는 단클론성 항체, 카멜화된 항체, 단일-사슬 항체 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예컨대 발명의 항체에 대한 항-Id 및 항-항-Id 항체를 포함함), 뿐만 아니라 그것들의 돌연변이, 자연 발생적인 변이체, 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 가지는 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체 및 키메라 항체, 및 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떠한 다른 변형된 형태를 포함한다. 본 출원의 전체를 통해, 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 잔기들의 넘버링은 Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242에서와 같이 EU 색인에 따른다. 본원에서 사용되는 바, "항체의 항원-결합 단편"은 적어도 하나의 항원 인식 부위를 가지는 항체의 부분이다. 본원에서 사용되는 바, 그 용어는 단편들 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 Fv), 이황화-결합된 이중특이성 Fvs (sdFv) 및 단일-사슬 분자 (예컨대 scFv)를 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 즉 항원-결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 어떠한 유형 (예컨대 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예컨대 IgG1, Ig2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다.
천연 항체 (예컨대 IgG 항체)는 두 개의 중쇄와 복합체화된 두 개의 경쇄로 구성된다. 각각의 경쇄는 가변 도메인 (VL) 및 불변 도메인 (CL)을 함유한다. 각각의 중쇄는 가변 도메인 (VH), 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3) 및 CH1과 CH2 도메인 사이에 위치한 힌지 도메인을 함유한다. 그러므로 자연 발생적인 면역글로불린 (예컨대 IgG)의 기본적인 구조 단위는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 가지고 보통 약 150,000 Da의 당단백질로서 발현되는 4량체이다. 각 사슬의 아미노-말단 ("N") 부분은 항원 인식에 주로 기여하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 ("C") 부분은 불변 영역을 규정하고, 단일 불변 도메인을 가지는 경쇄와 중쇄는 통상 불변 도메인과 힌지 영역을 가진다. 그러므로 IgG 분자의 경쇄의 구조는 n-VL-CL-c이고 IgG 중쇄의 구조는 n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c이다 (여기서 H는 힌지 영역이고, n 및 c는 각각 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단을 나타낸다).
항원의 에피토프에 결합하는 무상, 미변형 항체 (예컨대 IgG 항체)의 능력은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 상의 가변 도메인 (즉 각각 VL 도메인 및 VH 도메인)의 존재에 좌우된다. 항체 경쇄와 항체 중쇄의 상호작용 및, 특히 그것의 VL 및 VH 도메인의 상호작용은 항체의 에피토프-결합 부위들 중 하나를 형성한다. IgG 분자의 가변 영역은 에피토프와 접촉하는 잔기들을 함유한 상보성 결정 영역 (CDR), 및 프레임워크 절편 (FR)으로 언급되고, 일반적으로 구조를 유지하며 CDR 루프의 위치를 결정하여 그런 접촉을 허용하는 (비록 특정 프레임워크 잔기들이 또한 항원과 접촉할 수 있긴 하지만) 비-CDR 절편으로 구성된다. 그러므로, VL 및 VH 도메인은 구조 n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c를 가진다. 항체 경쇄의 제 1, 제 2 및 제 3 CDR인 (또는 그것들로서 작용할 수 있는) 폴리펩티드는 본원에서 각각 CDR L 1 도메인, CDR L 2 도메인 및 CDR L 3 도메인으로 표시된다. 유사하게, 항체 중쇄의 제 1, 제 2 및 제 3 CDR인 (또는 그것들로서 작용할 수 있는) 폴리펩티드는 본원에서 각각 CDR H 1 도메인, CDR H 2 도메인 및 CDR H 3 도메인으로 표시된다. 그러므로, 용어 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, CDRL3 도메인, CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 단백질에 통합될 때 그 단백질이 그런 단백질이 경쇄 및 중쇄를 가지는 항체이거나 또는 다이아바디 (diabody)이거나 단일-사슬 결합 분자 (예컨대 scFv, BiTe 등) 또는 단백질의 또 다른 유형인지의 여부에 관계없이 특이적 에피토프에 결합할 수 있게 되는 것을 유발하는 폴리펩티드에 대해 지시된다. 그런 항체들과는 대조적으로, scFv 구성물은 도메인들이 기능성 에피토프-결합 부위로의 두 개의 도메인의 자체-조립을 허용하기 위해 충분한 길이의 가요성 링커에 의해 분리되어 있는 단일 폴리펩티드 사슬에 함유된 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함한다. VL 및 VH 도메인들의 자체-조립이 불충분한 길이 (약 12 아미노산 잔기 미만)의 링커로 인해 불가능하게 되는 경우, scFv 구성물 중 두 개는 2가 분자를 형성하기 위하여 서로와 상호작용할 수 있는데, 한 사슬의 VL은 다른 사슬의 VH와 결합된다 (Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG -Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658에서 개관됨).
진단에서의 알려져 있는 용도에 더불어, 항체들은 치료제로서 유용한 것으로 밝혀졌다. 최근 수십년 동안 항체의 치료적 잠재력에서 관심이 다시 부흥되었고, 항체들은 생명공학-유도된 약물의 선두 부류 중 하나가 되었다 (Chan, C.E. et al. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases," Singapore Med. J. 50(7):663-666). 거의 200개의 항체-기반 약물이 사용할 수 있도록 승인되었거나 개발 중에 있다.
용어 "단클론성 항체"는 균일한 항체 집단을 나타내는데, 단클론성 항체는 항원의 선택적 결합에 포함되는 아미노산들 (자연 발생 및 비-자연 발생)로 구성된다. 단클론성 항체들은 고도로 특이적이며, 단일 에피토프 (또는 항원성 부위)에 대해 지시된다. 용어 "단클론성 항체"는 무상 단클론성 항체 및 전-길이 단클론성 항체뿐 아니라, 그것들의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 Fv), 단일 사슬 (scFv), 그것들의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 필요한 특이성 및 항원에 결합하는 능력의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떠한 다른 변형된 형태를 포함한다. 항체의 공급원 또는 그것이 만들어지는 방식 (예컨대 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 유전자이식 동물 등에 의해)과 관련하여 제한하고자 하는 의도는 없다. 그 용어는 상기에서 "항체"의 정의하에 기술된 단편등뿐 아니라 전체 면역글로불린을 포함한다. 단클론성 항체의 제조 방법은 기술분야에 공지되어 있다. 사용될 수 있는 한 방법은 Kohler, G. 등의 방법 (Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity," Nature 256:495-497) 또는 그것의 변형이다. 전형적으로, 단클론성 항체들은 마우스, 래트 또는 토끼에서 개발된다. 항체들은 동물을 면역원성 양의 세포, 세포 추출물 또는 원하는 에피토프를 함유한 단백질 제제로 면역시킴으로써 제조된다. 면역원은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 일차 세포, 배양된 셀라인, 암성 세포, 단백질, 펩티드, 핵산 또는 조직일 수 있다. 면역화에 사용된 세포들은 면역원으로서 사용되기 전에 일정 기간 동안 (예컨대 적어도 24시간) 배양될 수 있다. 세포들은 그 자체로 또는 비-변성 보조제, 예컨대 Ribi와 함께 면역원으로서 사용될 수 있다 (예컨대 Jennings, V.M. (1995) "Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production," ILAR J. 37(3):119-125 참조).
일반적으로, 세포들은 무상으로 유지되어야 하고 바람직하게는 면역원으로서 사용될 때 생존 가능해야 한다. 무상 세포들은 항원이 면역화된 동물에 의해 파괴된 세포들보다 잘 검출되도록 허용할 수 있다. 변성 또는 너무 강한 보조제, 예컨대 프로이드 보조제의 사용은 세포를 파괴할 수 있고, 따라서 사용이 만류된다. 면역원은 주기적 간격으로 여러 번, 예컨대 2주마다, 또는 주마다 투여될 수 있고, 또는 동물에서의 생존성을 유지하기 위한 그런 방법으로 (예컨대 조직 재조합체로) 투여될 수 있다. 다르게는, 기존의 단클론성 항체들 및 원하는 병원성 에피토프에 대해 면역특이적인 어떠한 다른 동등한 항체들이 서열화되고 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 수단에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 그런 항체는 서열화되고 그런 다음 폴리뉴클레오티드가 발현 또는 증식을 위한 벡터안에 클론된다. 관심의 항체를 코드화하는 서열은 숙주 세포의 벡터에서 유지될 수 있고 그런 다음 숙주 세포는 미래의 사용을 위해 연장되고 냉동될 수 있다. 그런 항체들의 폴리뉴클레오티드 서열은 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 개화된 (caninized) 항체를 생성하기 위한, 또는 친화성 또는 항체의 다른 특징을 개선하기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 용어 "인간화된" 항체는, 일반적으로 재조합 기법을 사용하여 제조된, 비-인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유도된 항원-결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열을 기반으로 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 가지는 키메라 분자를 나타낸다. 그런 항체들의 가변 도메인의 폴리뉴클레오티드 서열은 그런 유도체를 생성하고 그런 항체들의 친화성 또는 다른 특성들을 향상시키기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 항체의 인간화의 일반적인 원리는 항체의 항원-결합 부분의 염기 서열을 보유하는 한편, 항체의 비-인간 나머지 부분을 인간 항체 서열과 바꾸는 것을 포함한다. 단클론성 항체를 인간화하기 위해서는 4개의 일반적 단계가 있다. 그것들은: (1) 출발하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예측된 아미노산 서열을 측정하는 단계, (2) 인간화된 항체 또는 개화된 항체를 디자인하는 단계, 즉 인간화 또는 개화 과정 중에 어떠한 항체 프레임워크 영역을 사용할 것인지 결정하는 단계 (3) 실제로 인간화 또는 개화 방법론/기법 및 (4) 인간화된 항체를 형질전환하고 발현시키는 단계. 예를 들면 미국 특허 번호 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 및 6,331,415 참조.
그런 항체들의 에피토프-결합 도메인은 불변 도메인 위로 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인의 적절한 프레임워크 영역 위로 이식된 유일한 상보성 결정 영역 (CDR) 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 이것은 인간 개체에서 면역원으로서의 불변 영역을 제거하지만, 외래 가변 영역에 대한 면역 반응의 가능성은 남아있다 (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). 또 다른 접근법은 인간-유도된 불변 영역을 제공하는 것뿐 아니라, 가변 영역들을, 가능한 인간 형태에 밀접하게 그것을 개조하기 위해 변형하는 것에 집중한다. 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역들은 주어진 종에서 상대적으로 보존되고 추정적으로 CDR에 대한 스캐폴딩을 제공하는 4개의 프레임워크 영역 (FR)이 양옆에 있는, 의문의 항원에 대한 반응이 다르고 결합 능력을 결정하는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하고 있는 것이 알려져 있다. 비-인간 항체들이 특정 항원과 관련하여 제조될 때, 가변 영역은 변형될 인간 항체에 존재하는 FR 상의 비-인간 항체로부터 유도된 CDR을 이식함으로써 "개조"되거나 "인간화"될 수 있다. 다양한 항체에 이 접근법을 적용하는 것은 문헌에 기록되어 있다: Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR -Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity," Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo," Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti- p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; and Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol. 148:1149-1154. 일부 구체예에서, 인간화된 항체들은 모든 CDR 서열을 보존한다 (예를 들어, 인간화된 마우스 항체는 마우스 항체들로부터의 모든 6개의 CDR을 함유한다). 다른 구체예에서, 인간화된 항체들은 원래의 항체와 관련하여 서열이 상이한 하나 이상 CDR (1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 CDR을 가진다.
설치류 또는 변형된 설치류 V 영역 및 인간 불변 도메인에 융합된 그것들의 결합된 상보성 결정 영역 (CDR)을 가지는 키메라 항체를 포함하여, 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 항원-결합 부위를 포함하는 "인간화된" 항체 분자들이 많이 기술되었다 (예를 들어, Winter et al. (1991) "Man-made Antibodies," Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) "Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen," J. Immunol. 138:4534-4538 및 Brown et al. (1987) "Tumor-Specific Genetically Engineered Murine /Human Chimeric Monoclonal Antibody," Cancer Res. 47:3577-3583 참조). 다른 참고문헌들은 적절한 인간 항체 불변 도메인과의 융합 전에 인간 지지 프레임워크 영역 (FR)에 이식된 설치류 CDR을 기술한다 (예를 들면 Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; 및 Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse," Nature 321:522-525 참조). 또 다른 참고문헌은 재조합적으로 붙여진 (veneered) 설치류 프레임워크 영역에 의해 지지된 설치류 CDR을 기술한다. 예를 들어 유럽 특허 공개 번호 519,596 참조. 이들 "인간화된" 분자들은 설치류 항-인간 항체 분자들을 향한 원하지 않는 면역학적 반응을 최소화하기 위해 디자인되는데, 그런 원하지 않는 면역학적 반응은 인간 수용체에 그런 부분의 치료적 적용의 기간 및 유효성을 제한한다. 활용될 수 있는 항체들의 인간화를 위한 또 다른 방법들은 문헌 (Daugherty et al. (1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR -Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins," Nucl. Acids Res. 19:2471-2476) 및 미국 특허 번호 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 및 5,866,692에서 개시된다.
B. 이중-특이적 항체, 다중-특이적 다이아바디 및 DART TM 다이아바디
천연 항체들은 단지 하나의 에피토프 종에 결합할 수 있지만 (즉 그것들은 "단일-특이적"임), 그 종의 다수의 복사물에 결합할 수 있다 (즉 그것들은 2가 또는 다중가를 나타낼 수 있다). 광범위한 재조합 이중-특이적 항체 포맷이 개발되었는데 (예컨대 PCT 공개 번호 WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565 참조), 그것들 중 대부분은 항체 코어 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)를 항체 코어에 대해 또는 항체 코어 내에서 추가의 결합 단백질 (예컨대 scFv, VL VH 등)에 융합하기 위해, 또는 다수의 항체 부분을 융합하기 위해 또는 CH2-CH3 도메인과 같은 이종이량체화-촉진 도메인 또는 대체 폴리펩티드를 융합하기 위해 링커 펩티드를 사용한다 (WO 2005/070966, WO 2006/107786A WO 2006/107617A, WO 2007/046893). 전형적으로, 그런 접근법들은 절충과 균형을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2013/174873, WO 2011/133886 및 WO 2010/136172에는 링커의 사용이 치료 환경에 문제점들을 유발할 수 있다는 것이 개시되고, CL 및 CH1 도메인이 그것들의 각각의 자연적 위치로부터 전환되고 (switched), VL 및 VH 도메인이 하나 이상의 항원에 결합하는 것을 허용하기 위해 다양화되어 있는 것이 교시된다 (WO 2008/027236; WO 2010/108127). 그러므로, 이들 문서에 개시된 분자들은 결합 특이성을 추가의 항원 종들에 결합하는 능력과 교환 (trade)한다. PCT 공개 번호 WO 2013/163427 및 WO 2013/119903에는 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 부가물을 함유하도록 CH2 도메인을 변형시키는 것이 개시된다. 그 문헌은 CH2 도메인이 이펙터 기능을 중재하는 데 단지 최소 역할만을 하는 것으로 보인다고 지적한다. PCT 공개 번호 WO 2010/028797, WO2010028796 및 WO 2010/028795에는 그것의 Fc 도메인들이 추가의 VL 및 VH 도메인들로 대체되어서, 3-가 결합 분자를 형성하는 재조합 항체들이 개시된다. PCT 공개 번호 WO 2003/025018 및 WO2003012069에는 개별적인 사슬들이 scFv 도메인들을 함유하는 재조합 다이아바디들이 개시된다. PCT 공개 번호 WO 2013/006544에는 단일 폴리펩티드 사슬로서 합성된 후 단백질 가수분해되어 이종이량체 구조들을 생성하는 다중-가 Fab 분자들이 개시된다. 그러므로, 이들 문헌에 개시된 분자들은 이펙터 기능을 중재하는 능력의 전부 또는 일부를 추가의 항원에 결합하는 능력으로 교환한다. PCT 공개 번호 WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 및 WO 1991/003493에는 항체 또는 항체 부분에 추가의 결합 도메인 또는 기능성 기들을 첨가하는 것이 개시된다 (예컨대 다이아바디의 항체 경쇄에의 첨가, 또는 추가의 VL 및 VH 도메인들의 항체 경쇄 및 중쇄에의 첨가, 또는 이종성 융합 단백질의 첨가 또는 다중 Fab 도메인들의 상호간의 교체). 그러므로, 이들 문헌에 개시된 분자들은 천연 항체 구조를 추가의 항원 종들에 결합하는 능력으로 교환한다.
기술분야에는 둘 이상의 상이한 에피토프 종들과 결합할 수 있다 (즉 2-가 또는 다중-가에 더불어 이중-특이성 또는 다중 특이성을 나타낼 수 있다)는 점에서 그런 천연 항체들과 상이한 다이아바디를 제조하는 능력에 대해 추가로 주지된다 (예컨대 Holliger et al. (1993) "'Diabodies ': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti- CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single-chain Fv - Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange," Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944 참조).
다이아바디의 디자인은 단일-사슬 가변 도메인 단편 (scFv)의 구조를 기반으로 한다. 그런 분자들은 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인들을 짧은 연결 펩티드를 통해 서로에 연결시킴으로써 만들어진다. Bird 등은 한 가변 도메인의 카르복시 말단과 다른 가변 도메인의 아미노 말단 사이에서 대략 3.5 nm를 잇는 연결 펩티드의 한 실례를 기술하였다 (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426). 다른 서열들의 링커들이 디자인되었고 사용되었다 (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426). 링커들은 계속해서 추가의 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체에의 부착을 위해 변형될 수 있다. 단일-사슬 변이체들은 재조합적으로 또는 합성적으로 제조될 수 있다. scFv의 합성적 제조를 위해, 자동 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 제조를 위해, scFv를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가 적합한 숙주 세포, 즉 진핵, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포에, 또는 원핵, 예컨대 대장균에 도입될 수 있다. 관심의 scFv를 코드화하는 폴리뉴클레오티드들은 폴리뉴클레오티드의 결찰과 같은 기본적인 조작에 의해 만들어질 수 있다. 그 결과의 scFv는 기술분야에 알려져 있는 표준 단백질 정제 기법들을 사용하여 분리될 수 있다.
미국 특허 번호 7,585,952 및 미국 특허 공개 번호 2010-0173978은 ErbB2에 면역특이적인 scFv 분자들에 관련된다. scFv 분자의 유형인 이중-특이적 T 세포 참여자 (engager)("BiTE")가 기술되었다 (WO 05/061547; Baeuerle, P et al. (2008) "BiTE: A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells," Drugs of the Future 33:137-147; Bargou, et al. 2008) "Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody," Science 321:974-977). 그런 분자들은 두 개의 항원-결합 도메인을 가지는 단일 폴리펩티드 사슬 분자로 구성되는데, 그 중 하나는 CD3 에피토프에 면역특이적으로 결합하고 제 2는 표적 세포의 표면에 존재하는 항원에 면역특이적으로 결합한다.
비-단일-특이적 다이아바디의 제공은 상이한 에피토프들을 발현하는 세포를 공동-결찰하고 공동-정위시키는 능력이라는 유의미한 장점을 제공한다. 그러므로 2가 다이아바디는 치료법 및 면역진단을 포함하여 광범위한 용도를 가진다. 2-가는 다양한 용도에서의 다이아바디의 디자인 및 엔지니어링의 거대한 유연성을 허용함으로써, 다량체 항원에 대한 증강된 결합력, 상이한 항원의 교차-결합 및 두 가지 표적 항원의 존재에 따른 특이적 세포 유형들에 대해 지시된 표적화를 제공한다. 증가된 원자가, 낮은 분해 속도 및 순환계로부터의 신속한 클리어런스 (~50 kDa 이하의 작은 크기의 다이아바디에 대한)에 기인하여, 기술분야에 공지되어 있는 다이아바디 분자들은 또한 종양 영상화 분야에서 특정 용도를 나타냈다 (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris ," Protein Eng. 10:1221). 특히 중요한 것은 상이한 세포들의 공동-결찰, 예를 들면 세포독성 T 세포의 종양 세포에의 교차-결합이다 (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody ," Protein Eng. 9:299-305).
다이아바디 에피토프-결합 도메인들은 T 림프구, 자연 살해 (NK) 세포 또는 다른 단핵 세포들 상에서 발현되는 CD3, CD16, CD32, CD64 등과 같은 어떠한 면역 이펙터 세포의 표면 결정기에 대해 지시될 수 있다. 많은 연구에서, 이펙터 세포 결정기, 예컨대 Fcγ 수용체 (FcγR)에 결합하는 다이아바디가 또한 이펙터 세포를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다 (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody ," Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) " Carcinoembryonic Antigen ( CEA )-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti- CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti- CEA Bispecific Fusion Proteins," Cancer Res. 59:2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). 정상적으로, 이펙터 세포 활성화는 Fc-FcγR 상호작용을 통해 이펙터 세포에 대한 항원 결합된 항체의 결합에 의해 촉발된다; 그러므로, 이런 견지에서, 다이아바디 분자들은 그것들이 Fc 도메인을 포함하는 지의 여부와 관계없이 Ig-유사 기능성을 나타낼 수 있다 (예컨대 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 이펙터 기능 분석에서 분석되거나 본원에서 예시된 바와 같음 (예컨대 ADCC 분석)). 교차-결합 종양 및 이펙터 세포에 의해, 다이아바디는 이펙터 세포를 조양 세포와 근접한 곳으로 가져갈 뿐 아니라 효과적인 종양 사멸을 유도한다 (예컨대 Cao et al. (2003) " Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197 참조).
예를 들어, 미국 특허 번호 6,171,586은 2개의 항체를 그것들의 F(ab')2 단편을 얻기 위해 단백질 가수분해적으로 절단하고, 그런 단편들을 분자내 이황화 결합 형성을 방지하기 위한 조건하에서 환원시킨 후, 단편들을 혼합하여 이중-특이적 항체를 생성함으로써 이중-특이적 항체들을 제조하는 것에 관련된다. 미국 특허 번호 6,551,592; 6,994,853 및 8,277,806 및 PCT 공개 번호 WO 2012/156430, WO 2002/020039, WO 2000/018806 및 WO 1998/003670은 동시에 T 세포 및 종양 세포 상의 다른 항원들, 및 이중-특이적 항체의 Fc 부분을 통하여, 그런 수용체를 가지고 있는 세포들의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 삼중-특이적 항체들의 제조와 관련된다. PCT 공개 번호 WO 2000/018806, WO 1998/003670 및 WO 2006/072152는 T 세포 및 다른 항원들에 동시에 결합할 수 있는 삼중-특이적 항체들의 제조에 관련된다. 미국 특허 공개 번호 2008-0057054에는 아밀로이드 베타 올리고머에 대한 결합 요소 및 경막 단백질 텔렌케팔린 (telencephalin)에 대한 결합 요소에 특이적인 이중-특이적 콘쥬게이트가 개시된다. 미국 특허 공개 번호 2010-0291112는 하나 (또는 두개)의 종양 항원(들) 및 이펙터 세포 항원 (예컨대 CD3, CD16 CD32, CD64 등)에 특이적으로 결합하는 이중-특이적 및 삼중-특이적 단일-사슬 Fv 분자들에 관련된다.
PCT 공개 번호 WO 1999/042597 및 WO 1998/006749에는 결합된 MHC 결합 펩티드가 있거나 없이, 인간 주요 조직적합성 복합체 결합 도메인을 포함하는 항체 유도체가 개시된다. PCT 공개 번호 WO 02/072141은 그것의 온-속도 (분자들을 표적화하기 위해 결합하는 속도) 및 오프-속도 (표적 분자들을 방출하는 속도)가 달라서 다른 그런 표적 분자에 대한 결합과 비교하여 한 표적에 우선적으로 결합하게 되는 다중-특이적 결합 분자들에 관련된다. 삼중-특이적 분자는, 예를 들어 항-CD3 또는 항-CD28인 일가의 제 1 부분, 및 질환에 걸린 표적 세포 또는 면역 세포 상의 하나 이상의 표적 리간드에 면역특이적으로 결합하는 이가의 면역 기능 발휘 부분을 포함하는 제 2 부분을 가지는 분자이다.
미국 특허 번호 7,695,936 및 특허 공개공보 2007/ 0196363은 두 개의 항체의 중쇄로부터 형성된 이중-특이적 항체에 관련되는데, 그 중 하나는 그것의 중쇄로 엔지니어링된 융기된 부분을 가지고 제 2는 그것의 중쇄로 엔지니어링된 상보하는 공동을 가진다. 그런 상보하는 "손잡이" 및 "구멍"의 존재는 동일한 항체의 2개의 중쇄를 함유하는 단일-특이적 동종-항체와 관련하여 이중-특이적 이종-항체 (각각의 그런 항체의 하나의 중쇄를 가짐)를 우선적으로 형성하는 것으로 교시된다. CD3 및 종양 세포 항원에 면역특이적인 것들을 포함하여, 다양한 이중-특이적 이종-항체들이 제안된다. CD3, CD8 및 CD37 (T 세포 증식의 조절에 포함된 B 세포상에서 우세하게 발현된 경막 단백질)에 면역특이적인 일부를 포함하여, 다양한 삼중-특이적 이종-항체들 또한 제안되지만 (Robak, T. et al. (2014) "Anti-CD37 Antibodies For Chronic Lymphocytic Leukemia," Expert Opin. Biol. Ther. 14(5):651-661), 그러나, 그것들의 생성 메커니즘 및 그것들의 구조의 개시는 제공되지 않는다.
PCT 공보 WO2012-162561은 각각이 개재된 CH2-CH3 도메인에 의해 분리되어 있는 2개의 다이아바디 구조 를 포함하는 2개의 폴리펩티드를 포함하는 이중-특이적, 4가 결합 분자에 관련된다. 그 문헌은 또한 폴리펩티드 사슬들 중 2개가 2개 항원에 대한 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 함유하고, 다른 2개의 폴리펩티드 사슬은 항원들에 대한 상보하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인 및 말단 CH2-CH3 도메인을 함유하는 4개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 4가 결합 분자에 관련된다. 이중-특이적, 4가 결합 분자들은 그것들의 각각의 CH2-CH3 도메인의 회합 (association)을 통해 형성한다. 4개의 폴리펩티드 사슬 구성물에서, "경"쇄는 중쇄에 공유적으로 결합되지 않고, 따라서 불안정성을 유발한다 (Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG - Iike Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조). 그 문헌은 그런 공유 결합을 제공하기 위해 사슬들이 변경되지만, 이중-특이성이 제거되는 댓가를 치뤄야 하는 제 3 구성물 (즉 분자는 단일-특이적임)을 개시한다. CD2, CD3, CD4, CD8, CD161, 케모카인 수용체, CD95, CCR5 등에 대해 특이성을 가지는 분자들이 개시된다. CD3 및 CD8 둘 다에 결합할 수 있는 이중-특이적 분자는 개시되지 않는다.
그러나, 상기 장점들은 가장 중요한 비용에 직면한다. 그런 비-단일-특이적 다이아바디의 형성은 둘 이상의 뚜렷하고 상이한 폴리펩티드의 성공적인 조립을 필요로 한다 (즉 그런 형성은 다이아바디가 상이한 폴리펩티드 사슬 종들의 이종이량체화를 통해 형성될 것을 필요로 한다). 이 사실은 동일한 폴리펩티드 사슬의 동종이량체화를 통해 형성되는 단일-특이적 다이아바디와 대조적이다. 적어도 2개의 다른 폴리펩티드 (즉 두 개의 폴리펩티드 종)가 비-단일-특이적 다이아바디를 형성하기 위해 제공되어야 하기 때문에, 그리고 그런 폴리펩티드의 동종이량체화가 비활성 분자를 유도하기 때문에 (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588), 그런 폴리펩티드의 생성은 동일 종의 폴리펩티드 사이의 공유 결합을 방지하기 위한 그런 방식으로 이루어져야 한다 (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588). 그러므로 기술분야에는 그런 폴리펩티드들의 비-공유적 회합이 교시되어 있다 (예컨대 Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti- CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).
그러나, 기술분야는 비-공유적으로 결합된 폴리펩티드들로 구성된 이중-특이적 다이아바디가 불안정하고 비-기능적 단량체들로 쉽게 분해된다는 것을 인식하였다 (예컨대 Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).
이런 도전에 직면하여, 기술분야는 DART TM 로 명명된, 안정한, 공유적으로 결합된 이종이량체 비-단일-특이적 다이아바디를 개발하는 데 성공하였다 (예컨대 미국 특허 공개 번호 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽 특허 공개 번호 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; 및 Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb ( CD32B ) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv -Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449). 그런 다이아바디들은 둘 이상의 공유적으로 복합체화된 폴리펩티드를 포함하고 하나 이상의 시스테인 잔기를 이황화 결합이 형성되는 것을 허용하는 사용된 폴리펩티드 종의 각각으로 엔지니어링하고 그로써 2개의 폴리펩티드 사슬을 공유적으로 결합시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 그런 구성물의 C-말단에 시스테인 잔기를 첨가하는 것은 폴리펩티드 사슬 사이의 이황화 결합을 허용하여서, 결과적인 이종이량체를 2가 분자의 결합 특성을 간섭하지 않으면서 안정화시키는 것으로 밝혀졌다.
DARTTM 구체예들은 많이 있다. 가장 간단한 DARTTM 구체예의 2개의 폴리펩티드의 각각은 3개의 도메인을 포함한다 (도 1). 제 1 폴리펩티드는: (i) 제 1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL1)의 결합 영역을 포함하는 제 1 도메인, (ii) 제 2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH2)의 결합 영역을 포함하는 제 2 도메인 및 (iii) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 제 2 폴리펩티드 사슬과의 이종이량체화를 촉진하는 작용을 하는 이종이량체화-촉진 도메인을 함유하는 제 3 도메인을 포함한다. 제 3 도메인의 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인)는 다이아바디의 제 2 폴리펩티드에 대한 제 1 폴리펩티드 사슬의 공유 결합을 촉진하는 작용을 한다. 제 2 폴리펩티드는: (i) 상보하는 제 1 도메인 (VL2-함유 도메인), (ii) 상보하는 제 2 도메인 (VH1-함유 도메인) 및 (iii) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및, 임의로, 제 1 폴리펩티드 사슬과의 이종이량체화를 촉진하기 위해 제 1 폴리펩티드 사슬의 이종이량체화-촉진 도메인과 복합체를 형성하는 상보하는 이종이량체화-촉진 도메인을 함유한다. 제 2 폴리펩티드 사슬의 제 3 도메인의 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인)는 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬에 대한 제 2 폴리펩티드 사슬의 공유 결합을 촉진하는 작용을 한다. 그런 분자들은 안정하고, 강력하며 둘 이상의 항원에 동시에 결합하는 능력을 가진다. 그것들은 표적 항원들을 발현하는 세포들의 재-지시된 T 세포 중재된 살해를 촉진할 수 있다.
한 구체예에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 각각의 제 3 도메인은 시스테인 잔기를 함유하는데, 그것은 이황화 결합을 통해 함께 폴리펩티드에 결합하도록 작용한다. 하나 또는 둘 다의 폴리펩티드의 제 3 도메인은 추가로 CH2-CH3 도메인의 서열을 가짐으로써, 다이아바디 폴리펩티드의 복합체 형성이 세포 (예컨대 B 림프구, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 호중구, 호산성 세포, 호염기성 세포 및 비만 세포)의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 Fc 도메인을 형성하게 된다 (도 2a 및 2b).
그런 분자들의 많은 변화가 기술되어 있다 (예컨대 미국 특허 공개 번호 2013-0295121; 2010-0174053 및2009-0060910; 유럽 특허 공개 번호 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538 참조). 이들 Fc-함유 DART는 3개의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다 (예컨대 도 2b). 그런 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬은 3개의 도메인을 함유한다: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 이종이량체화-촉진 도메인을 함유하는 도메인 및 (iv) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 CH2-CH3 도메인. 그런 DARTTM의 제 2 폴리펩티드 사슬은: (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 제 1 폴리펩티드 사슬과의 이종이량체화를 촉진하는 이종이량체화-촉진 도메인을 함유하는 도메인을 함유한다. 제 2 폴리펩티드 사슬의 제 3 도메인의 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인)는 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬에 대한 제 2 폴리펩티드 사슬의 공유 결합을 촉진하는 작용을 한다. 그런 DARTTM의 제 3 폴리펩티드 사슬은 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 CH2-CH3 도메인을 포함한다. 그러므로, 그런 DARTTM의 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 함께 결합하여 에피토프에 결합할 수 있는 VL1/VH1 결합 부위와, 뿐만 아니라 제 2 에피토프에 결합할 수 있는 VL2/포2 결합 부위를 형성한다. 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 그것들의 각각의 제 3 도메인에 시스테인 잔기들을 포함하고 있는 이황화 결합을 통해 서로에 결합된다. 주지할 것은, 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로 복합체화하여 이황화 결합을 통해 안정화되는 Fc 도메인을 형성한다. 그런 다이아바디들은 증강된 효능을 가진다. 그런 Fc-함유 DART TM 는 두 가지 배향 중 어느 것이든 가질 수 있다 (표 1).
Figure pct00001
Ig- DART TM (도 3a 및 3b) 및 Fc - DART TM 다이아바디 (도 3c)로 명명된 보다 복잡한 DARTTM 다이아바디들도 기술되어 있다 (WO 2012/018687). Fc-DARTTM는 4개의 폴리펩티드 사슬을 가진다. 그런 다이아바디의 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 3개의 도메인을 가진다: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인. Fc-DARTTM의 제 2 및 제 4 폴리펩티드는 (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) Fc-DARTTM 제 1 폴리펩티드 사슬과의 이종이량체화 및 공유 결합을 촉진하는 도메인을 함유한다. 제 3 및 제 4, 및 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 동일하거나 상이하여 단일-특이적, 이중-특이적 또는 사중-특이적인 4가 결합을 허용할 수 있다. 그런 보다 복잡한 DARTTM 분자는 또한 공유적으로 결합된 복합체를 형성하는 기능을 하는 시스테인-함유 도메인을 가진다. Fc-DARTTM 다이아바디는 CH1 및 CL 도메인을 함유한다.
또 다른 구성물은, 4가 분자가 바람직하지만 Fc는 필요하지 않은 용도, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, "TandAb"로도 언급되는 4가 탠덤 항체에 대해 기술분야에 공지되어 있는데 (예컨대 미국 특허 공개 번호 2005-0079170, 2007-0031436, 2010-0099853, 2011-020667 2013-0189263; 유럽 특허 공개 번호 EP 1078004, EP 2371866, EP 2361936 및 EP 1293514; PCT 공개 번호 WO 1999/057150, WO 2003/025018 및 WO 2013/013700), 그것들은 VH1, VL2, VH2 및 VL2 도메인을 각각 가지고 있는 두 개의 동일한 사슬의 동종-이량체화에 의해 형성된다.
그러나, 모든 선행 진보에도 불구하고, 암 또는 다른 질환 및 상태로 고생하는 환자들에게 향상된 치료적 가치를 제공할 수 있는 조성물에 대한 요구가 남아 있다. 본 발명은 이 목표 및 다른 목표들에 관련된다.
발명의 요약
본 발명은 3개의 결합 도메인을 가지고 그로써 3개의 에피토프에 대한 동조된 결합을 중재할 수 있는 다중-사슬 폴리펩티드 분자인, 삼중-특이적 결합 분자에 관한 것이다. 삼중-특이적 결합 분자는 바람직하게는 그것이 (1) 제 1 암 항원의 에피토프, (2) 제 2 암 항원의 에피토프 및 (3) 면역 시스템 이펙터 세포의 표면에 발현된 분자의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 것을 허용하고, 그로써 암 항원을 발현하는 세포에 면역 시스템 이펙터 세포를 정위시킬 수 있고, 그로 인해 그런 암세포의 살해를 용이하게 하는 결합 도메인을 가지는 것을 특징으로 한다.
상세하게 설명하면, 발명은 3개의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 삼중-특이적 결합 분자를 제공하는데, 상기 에피토프들은 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III이며, 3개의 에페토프 중 2개는 암 항원(들)의 에피토프이고, 상기 에피토프들 중 제 3은 이펙터 세포 항원의 에피토프이다.
발명은 특히 그런 삼중-특이적 결합 분자의 구체예들에 관련되는데, 구체예에서 분자는 함께 공유적으로 복합체화된 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬을 포함하고
(I) 제 1 항원에 존재하는 에피토프 I에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인 I 및 제 2 항원에 존재하는 에피토프 II에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인 II, 이때 항원-결합 도메인 I 및 항원-결합 도메인 II는 둘 다 다이아바디-형 결합 도메인이고;
(II) 제 3 항원에 존재하는 에피토프 III에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인 III; 및
(III) 2개의 CH2-CH3 도메인의 서로에의 복합체화에 의해 형성된 Fc 도메인을 포함하고,
에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 하나는 이펙터 세포 항원의 에피토프이고, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 제 2는 제 1 암 항원의 에피토프이며, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 제 3은 제 2 암 항원의 에피토프이고, 결합 분자의 항원-결합 도메인 I, II 및 III은 이펙터 세포 항원을 발현하는 면역 시스템 이펙터 세포 및 제 1 및 제 2 암 항원을 발현하는 암세포의 동조된 결합을 중재한다.
발명은 특히 Fc 도메인이 세포 표면에 배열된 Fc 수용체에 결합할 수 있는 그런 삼중-특이적 결합 분자의 구체예에 관련된다.
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자의 구체예에 관련되는데, 이때 이펙터 세포 항원은 이펙터 세포의 표면에 배열되고 암 항원은 암세포의 표면에 배열되며, 면역특이적 결합은 이펙터 세포 항원 및 암 항원을 공동-정위시키고, 그로써 암세포에 맞서 이펙터 세포의 활성화를 용이하게 하기에 충분하다.
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자의 구체예에 관련되는데, 이때 이펙터 세포 항원은 CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD22, CD32B, CD64, B 세포 수용체 (BDR), T 세포 수용체 (TCR) 및 NKG2D 수용체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자의 구체예에 관련되는데, 이때 제 1 및 제 2 항 항원은 독립적으로 대장암 항원 19.9; 위암 뮤신; 항원 4.2; 글리코단백질 A33 (gpa33); ADAM-9; 위암 항원 AH6; ALCAM; 악성 인간 림프구 항원 APO-1; 암 항원 B1; B7-H3; 베타-카테닌; 혈액 군 ALeb/Ley; 버킷 림프종 항원-38.13, 대장성 선암종 항원 C14; 난소 암종 항원 CA125; 카르복시펩티다제 M; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD30; CD33; CD36; CD45; CD46; CD52; CD79a/CD79b; CD103; CD317; CDK4; 암배아성 항원 (CEA); CEACAM5; CEACAM6; CO17-1A; CO-43 (혈액 군 Leb); CO-514 (혈액 군 Lea); CTA-1; CTLA4; 사이토케라틴 8; 항원 D1.1; 항원 D156-22; DR5; E1 시리즈 (혈액 군 B); EGFR (상피 성장 인자 수용체); 에프린 수용체 A2 (EphA2); ErbB1; ErbB3; ErbB4; GAGE-1; GAGE-2; GD2/GD3/GM2; 폐 선암종 항원 F3; 항원 FC10.2; G49, 강글리오시드 GD2; 강글리오시드 GD3; 강글리오시드 GM2; 강글리오시드 GM3; GD2; GD3; GICA 19-9; GM2; gp100; 인간 백혈병 T 세포 항원 Gp37; 흑색종 항원 gp75; gpA33; HER2 항원 (p185HER2); 인간 유지방 소체 항원 (HMFG); 인간 유두종 바이러스-E6/인간 유두종 바이러스-E7; 고분자량 흑색종 항원 (HMW-MAA); I 항원 (분화 항원) I(Ma); 인티그린 알파-V-베타-6 인티그린β6 (ITGB6); 인터류킨-13; 수용체 α2 (IL13Rα2); JAM-3; KID3; KID31; KS 1/4 pan-암종 항원; 인간 폐 암종 항원 L6 및 L20; LEA; LUCA-2; M1:22:25:8; M18; M39; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; Myl; N-아세틸글루코사미닐트란스페라제; 네오글리코단백질; NS-10; OFA-1; OFA-2; 온코스타틴 M; p15; 흑색종-관련 항원 p97; 다형태 상피 뮤신 (PEM); 다형태 상피 뮤신 항원 (PEMA); PIPA; 전립선-특이적 항원 (PSA); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 전립선 산 포스페이트; R24; ROR1; 스핑고지질; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn; T 세포 수용체 유도된 펩티드; T5A7; TAG-72; TL5 (혈액 군 A); TNF-α 수용체; TNF-β 수용체; TNF-γ 수용체; TRA-1-85 (혈액 군 H); 트란스페린 수용체; 종양-특이적 이식 항원 (TSTA), 암태아 항원-알파-페토단백질 (AFP); VEGF; VEGFR, VEP8; VEP9; VIM-D5; 및 Y 합텐, Ley로 구성되는 군으로부터 선택된다.
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자의 구체예에 관련되는데, 이때 제 1 및 제 2 암 항원은 CD2, CD317, CEACAM5, CEACAM6, DR5, EphA2, gpA33, Her2, B7-H3; EGF, EGFR, VEGF 및 VEGFR로 구성되는 군으로부터 선택된다.
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데, 이때 비-다이아바디-형 결합 도메인 III은 에피토프 III에 면역특이적으로 결합할 수 있는 Fab-형 결합 도메인 (VLIII/VHIII)을 포함하고, 분자는:
(A) N-말단에서 C-말단 방향으로:
(1) 3개의 에피토프 중 제 1에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLI);
(2) 3개의 에피토프 중 제 2에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHII);
(3) 이종이량체-촉진 도메인; 및
(4) IgG의 CH2 및 CH3 도메인
을 포함하는 제 1 폴리펩티드 사슬;
(B) N-말단에서 C-말단 방향으로:
(1) 3개의 에피토프 중 제 2에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLII);
(2) 3개의 에피토프 중 제 1에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHI); 및
(3) 상보하는 이종이량체-촉진 도메인
을 포함하는 제 2 폴리펩티드 사슬;
(C) N-말단에서 C-말단 방향으로:
(1) 3개의 에피토프 중 제 3에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHIII); 및
(2) CH1 도메인, 힌지 도메인 및 IgG의 CH2-CH3 도메인
을 포함하는 제 3 폴리펩티드 사슬; 및
(D) N-말단에서 C-말단 방향으로:
(1) 3개의 에피토프 중 제 3에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLIII); 및
(2) 경쇄 불변 도메인 (CL)
을 포함하는 제 4 폴리펩티드 사슬을 포함하며;
(i) VLI 및 VHI 도메인은 회합하여 제 1 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 형성하고;
(ii) VLII 및 VHII 도메인은 회합하여 제 2 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 형성하며;
(iii) VLIII 및 VHIII 도메인은 회합하여 제 3 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 형성하고;
(iv) 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 회합하여 Fc 도메인을 형성하며;
(v) 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합되고;
(vi) 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합되며; 및
(vii) 제 3 및 제 4 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합된다.
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예에 관련되는데:
(A) 이종이량체-촉진 도메인은 E-코일이고 상보하는 이종이량체-촉진 도메인은 K-코일이거나; 또는
(B) 이종이량체-촉진 도메인은 K-코일이고 상보하는 이종이량체-촉진 도메인은 E-코일이다.
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예에 관련되는데:
(A) 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인들은 각각 SEQ ID NO:1의 서열을 가져서, 그것들의 회합으로부터 형성된 Fc 도메인은 정상적인 FcγR-중재된 이펙터 기능을 나타내거나; 또는
(B) 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 SEQ ID NO:1의 서열과 관련하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 가져서, 그것들의 회합으로부터 형성된 Fc 도메인은 변경된 FcγR-중재된 이펙터 기능을 나타낸다.
발명은 추가적으로 적어도 하나의 아미노산 치환이 L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 그 넘버링이 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링인 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예에 관련된다.
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예에 관련되는데, 적어도 하나의 아미노산 치환은:
(A) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환;
(B) (1) F243L 및 P396L;
(2) F243L 및 R292P; 및
(3) R292P 및 V305I
로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 치환;
(C) (1) F243L, R292P 및 Y300L;
(2) F243L, R292P 및 V305I;
(3) F243L, R292P 및 P396L; 및
(4) R292P, V305I 및 P396L
로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 3개의 치환;
(D) (1) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및
(2) F243L, R292P, V305I 및 P396L
로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 4개의 치환; 또는
(E) (1) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L; 및
(2) L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L
로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 5개의 치환을 포함한다.
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데, 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 서로 상이하며 SEQ ID NO:52 및 SEQ ID NO:53으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데:
(A) 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 제 1 암 항원의 에피토프, 제 2 암 항원의 에피토프 및 이펙터 세포 항원의 에피토프이고;
(B) 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 제 1 암 항원의 에피토프, 이펙터 세포 항원의 에피토프 및 제 2 암 항원의 에피토프이며;
(C) 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 제 2 암 항원의 에피토프, 제 1 암 항원의 에피토프 및 이펙터 세포 항원의 에피토프이고;
(D) 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 제 2 암 항원의 에피토프, 이펙터 세포 항원의 에피토프 및 제 1 암 항원의 에피토프이며;
(E) 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 이펙터 세포 항원의 에피토프, 제 1 암 항원의 에피토프 및 제 2 암 항원의 에피토프이고; 및
(F) 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 이펙터 세포 항원의 에피토프, 제 2 암 항원의 에피토프 및 제 1 암 항원의 에피토프이다.
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자의 구체예에 관련되는데:
(A) 이펙터 세포 항원의 에피토프는 항체 Lo-CD2a에 의해 인식되는 CD2 에피토프이거나;
(B) 이펙터 세포 항원의 에피토프는 항체 OKT3, M291, YTH12.5, 항-CD3 mAb 1 또는 항-CD3 mAb 2에 의해 인식되는 CD3 에피토프이거나;
(C) 이펙터 세포 항원의 에피토프는 항체 3G8 또는 A9에 의해 인식되는 CD16 에피토프이거나;
(D) 이펙터 세포 항원의 에피토프는 항체 MD1342, MEDI-551, 블리나투모맙 또는 HD37에 인식되는 CD19 에피토프이거나;
(E) 이펙터 세포 항원의 에피토프는 항체 리툭시맙, 이브리투모맙, 오파투무맙 및 토시투모맙에 의해 인식되는 CD20 에피토프이거나;
(F) 이펙터 세포 항원의 에피토프는 항체 에프라투주맙에 의해 인식되는 CD22 에피토프이거나;
(G) 이펙터 세포 항원의 에피토프는 항체 CD32B mAb1에 의해 인식되는 CD32B 에피토프이거나;
(H) 이펙터 세포 항원의 에피토프는 항체 CD64 mAb 1에 의해 인식되는 CD64 에피토프이거나;
(I) 이펙터 세포 항원의 에피토프는 항체 CD79 mAb 1에 의해 인식되는 BCR/CD79 에피토프이거나;
(J) 이펙터 세포 항원의 에피토프는 항체 BMA 031에 의해 인식되는 TCR 에피토프이거나; 또는
(K) 이펙터 세포 항원의 에피토프는 항체 KYK-2.0에 의해 인식되는 NKG2D 수용체 에피토프이다.
발명은 추가적으로 상기-기술된 삼중-특이적 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관련된다.
발명은 추가적으로 삼중-특이적 결합 분자가 암의 치료에 사용되는 그런 약학 조성물 또는 어떠한 그런 삼중-특이적 결합 분자에 관련된다.
발명은 추가적으로 암이 다음의 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 암세포의 존재를 특징으로 하는 그런 약학 조성물 또는 그런 삼중-특이적 결합 분자의 구체예에 관련된다: 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종(alveolar soft part sarcoma), 성상 세포 종양, 방광암, 골암, 뇌 및 척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 명세포 암종, 대장암, 결장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 조직결합성 소원형 세포 종양, 뇌질피복 세포증, 유윙 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골섬유 불완전 형성증, 섬유성 골이형성, 담낭 또는 담관암, 위암, 임신성 영양 질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비 신생물 형성, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아과 암, 말초신경초 종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀성 혈액장애, 전이성 신장암, 횡문근양 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액막 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 전이성 갑상선암 또는 자궁암.
발명은 추가적으로 암이 결장암, 간세포 암종, 신경교종, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 방광암, 신경아세포종; 육종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암 또는 직장암인 그런 약학 조성물 또는 그런 삼중-특이적 결합 분자의 구체예에 관련된다.
발명은 추가적으로 암이 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 B 림프아성 백혈병 (B-ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 겸양세포 백혈병 (HCL), 모구형질세포양 수지상 세포 종양 (BPDCN), 비-호지킨 림프종 (NHL), 이를테면 외투막 세포 림프종 (MCL) 및 소 림프구성 림프종 (SLL), 호지킨 림프종, 전신성 비만세포증 또는 버킷 림프종인 그런 약학 조성물 또는 그런 삼중-특이적 결합 분자의 구체예에 관련된다.
도 1a 및 1b는 DARTTM 다이아바디의 도메인을 나타낸 다이아그램을 도시한다. 도 1a는 기본적인 DARTTM 다이아바디의 도메인을 나타낸 다이아그램을 도시한다. 도 1b는 각각 동일한 명암을 사용하여 도시된 동일한 에피토프를 인식하는 이종이량체-촉진 도메인 VL 및 VH 도메인을 가지는, 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 공유적으로 결합된 다이아바디의 개략도를 제시한다.
도 2a 및 2b는 각각 CH2 및 CH3 도메인을 가지거나 (도 2a) 단지 하나만이 CH2 및 CH3 도메인을 가져서 (도 2b), 회합된 사슬이 자연적으로 발생하는 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 공유적으로 결합된 다이아바디의 개략도를 제시한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 명암을 사용하여 도시된다.
도 3a 내지 3c는 2쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성된 4가 다이아바디를 도시하는 개략도를 제시한다. 쌍들은 상이하고, 따라서 두 개의 에피토프 각각에 대하여 2가인 이중-특이적 분자를 초래하며, 이때 한 에피토프는 DR5의 에피토프이고 다른 하나는 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자의 에피토프이다. 각 쌍의 한 폴리펩티드는 CH2 및 CH3 도메인을 가져서, 회합된 사슬들이 자연적으로 발생하는 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 Fc 도메인을 형성한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 명암을 사용하여 도시된다. 단지 한 쌍만의 에피토프 (동일한 명암으로 도시됨)가 DR5에 결합할 수 있다. 도 3a는 Ig 다이아바디를 도시한다. 도 3b는 E-코일 및 K-코일 이종이량체-촉진 도메인을 함유하는 Ig 다이아바디를 도시한다. 도 3c는 항체 CH1 및 CL 도메인을 함유하는 Fc-DARTTM 다이아바디를 도시한다. 표시 "VL1" 및 "VH1"은 각각 "제 1" 에피토프에 결합하는 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 표시한다. 유사하게, 표시 "VL2" 및 "VH2"는 각각 "제 2" 에피토프에 결합하는 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 표시한다.
도 4a 내지 4g는 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 도메인들을 나타내는 다이아그램을 제시한다. 도면은 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 구체예들의 도메인들의 순서 및 배향을 개략적으로 예시한다. 도 4a, 4b 및 4g는 삼중-특이적 결합 분자가 4개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 구체예들을 도시한다. 도 4c, 4d, 4e 및 4f는 결합 분자가 3개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 구체예들을 도시한다. 분자는 힌지 및/또는 CL 도메인을 가질 수 있거나 (도 4a, 4b, 4c, 4e) 또는 대체 링커 펩티드를 함유할 수 있다 (도 4d, 4f, 4g).
도 5a 내지 5e는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 대체 구체예의 도메인을 나타내는 다이아그램을 제시하는데, 이 구체예에서 이펙터 세포-결합 도메인은 다이아바디-형 결합 도메인 또는 Fab-형 결합 도메인보다는 오히려 이펙터 세포 수용체-형 결합 도메인으로 구성된다. 도 5a 및 5b는 삼중-특이적 결합 분자가 4개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 구체예를 도시한다. 도 5e는 결합 분자가 3개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 구체예를 도시한다. 도 5d는 결합 분자가 5개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 구체예를 도시한다. 분자는 힌지 및/또는 CL 도메인을 가지거나 대체 링커 펩티드를 함유할 수 있다.
도 6은 인간 DR5 및 사이노몰구스 원숭이의 DR5에 결합하는 항-인간 DR5 단클론성 항체 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 능력을 도시한다.
도 7, 패널 A 내지 H는 인간 DR5에 대한 (패널 A 내지 D) 및 사이노몰구스 원숭이 DR5에 대한 (패널 E 내지 H) DR5 mAb 1 (패널 A 및 E), DR5 mAb 2 (패널 B 및 F), DR5 mAb 3 (패널 C 및 G) 및 DR5 mAb 4 (패널 D 및 H)의 결합의 동역학을 도시한다.
도 8은 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 예상외의 월등성을 도시한다. 월등성은 A549 선암종성 인간 폐포 기준 상피 종양 세포의 세포독성을 중재하는 DR5 mAb 1, DR5 mAb 2, DR5 mAb 3 또는 DR5 mAb 4의 VL 및 VH 도메인을 가지는 DR5 x CD3 다이아바디의 능력을 비교함으로써 평가되었다.
도 9a 내지 9c는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 2개의 암 항원-결합 도메인이 둘 다 표적 세포에 결합할 수 있을 때 얻어지는 표적 세포 결합의 상조적 증대를 증명한다. 도 9a는 삼중특이적 분자: EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1; EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1; 및 gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1이 EphA2-발현 CHO 세포의 존재하에 인큐베이션될 때 얻어진 결합을 도시한다. 도 9b는 그런 삼중특이적 분자들이 DR5-발현 CHO 세포의 존재하에 인큐베이션될 때 얻어진 결합을 도시한다. 도 9c는 그런 삼중특이적 분자들이 EphA2 및 DR5를 발현하지만, gpA33은 발현하지 않는 DU145 인간 전립선 세포의 존재하에 인큐베이션될 때 얻어진 결합을 도시한다.
도 10a 내지 10c는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 2개의 암 항원-결합 도메인이 둘 다 표적 세포에 결합할 수 있을 때 얻어지는 표적 세포 세포독성의 상조적 증대를 증명한다. 도 10a는 삼중특이적 분자: EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1; EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1; 및 gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1이 EphA2-발현 CHO 세포 및 세포독성 림프구의 존재하에 인큐베이션될 때 얻어진 결합을 도시한다. 도 10b는 그런 삼중특이적 분자들이 DR5-발현 CHO 세포 및 세포독성 림프구의 존재하에 인큐베이션될 때 얻어진 결합을 도시한다. 도 10c는 그런 삼중특이적 분자들이 DU145 인간 전립선 세포 및 세포독성 림프구의 존재하에 인큐베이션될 때 얻어진 결합을 도시한다. DU145 세포는 EphA2 및 DR5를 발현하지만, gpA33은 발현하지 않는다. 세포독성은 세포 용해시 루시페라제의 방출에 의해 유발된 발광의 증가에 의해 측정되었다.
본 발명은 3개의 결합 도메인을 가지고 그러므로 3개의 에피토프에 대한 동조된 결합을 중재할 수 있는 다중-사슬 폴리펩티드 분자인 삼중-특이적 결합 분자에 관련된다. 삼중-특이적 결합 분자는 바람직하게는 (1) 제 1 암 항원의 에피토프, (2) 제 2 암 항원의 에피토프 및 (3) 면역 시스템 이펙터 세포의 표면에 발현된 분자의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 것을 허용하고, 그로써 암 항원을 발현하는 세포에 면역 시스템 이펙터 세포를 정위시킬 수 있고, 그로 인해 그런 암세포의 살해를 용이하게 하는 결합 도메인을 가진다는 점에서 특징적이다.
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 상기-논의된 항체, 예를 들면 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2의 인간화된, 키메라 또는 개화된 유도체의 에피토프-결합 도메인들을 포함할 수 있다.
I. 일반적 기법 및 일반적 정의
본 발명의 실시는, 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 숙련도 내에 있는, 분자 생물학 (재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기법들을 사용할 것이다. 그런 기법들은 문헌에서 전체적으로 설명된다. 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press, Totowa, NJ; Oligonucleotide Synthesis (Gait, M.J., Ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ; Cell Biology: A Laboratory Notebook (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, New York, NY; Animal Cell Culture (Freshney, R.I., Ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (Mather, J.P. and Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, New York, NY; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (Doyle, A. et al., Eds., 1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) New York, NY; Weir's Handbook of Experimental Immunology (Herzenberg, L.A. et al. Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, New York, NY; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller, J.M. et al. Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY; PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, K. et al., Eds., 1994) Birkhauser, Boston MA; Current Protocols in Immunology (Coligan, J.E. et al., eds., 1991) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ; Immunobiology 7 (Janeway, C.A. et al. 2007) Garland Science, London, UK; Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK; Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, USA, New York NY); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (Shepherd, P. et al. Eds., 2000) Oxford University Press, USA, New York NY; Using Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow, E. et al. Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; The Antibodies (Zanetti, M. et al. Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, London, UK); and DeVita, Hellman, and Rosenberg's Cancer: Principles & Practice of Oncology, Eighth Edition, DeVita, V. et al. Eds. 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.
II. 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자
A. 결합 능력
본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자는 3개의 상이한 에피토프에 동조적으로 및 동시에 결합할 수 있다. 본 발명의 그런 바람직한 삼중-특이적 결합 분자는:
(I) 제 1 항원에 존재하는 "에피토프 I"에 면역특이적으로 결합할 수 있는 "결합 도메인 I" 및 제 1 항원에 존재하는 "에피토프 II"에 면역특이적으로 결합할 수 있는 "결합 도메인 II", 여기서 상기 결합 도메인 I 및 결합 도메인 II는 둘 다 "다이아바디-형 결합 도메인"이고;
(II) 제 3 항원에 존재하는 "에피토프 III"에 면역특이적으로 결합할 수 있는 "결합 도메인 III"; 및
(III) 두 개의 CH2-CH3 도메인이 서로에 복합체화함으로써 형성된 Fc 도메인을 포함하고;
(A) 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 하나는 제 1 "암 항원" 의 에피토프이고;
(B) 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 제 2는 제 2 암 항원의 에피토프이며; 및
(C) 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 제 3는 면역 시스템 이펙터 세포의 표면에 발현된 분자의 에피토프 ("이펙터 세포 항원")이고;
결합 분자의 도메인 I, II 및 III은 면역 시스템 이펙터 세포 및 제 1 및 제 2 암 항원 둘 다를 발현하는 세포의 동조된 결합을 중재하고 그로써 그런 세포들을 공동-정위한다.
다이아바디 에피토프-결합 도메인들은 또한 B 세포의 표면 결정기, 예컨대 CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD40, 및 CD74에 대해 지시될 수 있다 (Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Cheson, B.D. et al. (2008) "Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non- Hodgkin's Lymphoma," N. Engl. J. Med. 359(6):613-626; Castillo, J. et al. (2008) "Newer monoclonal antibodies for hematological malignancies," Exp. Hematol. 36(7):755-768). 많은 연구에서, 이펙터 세포 결정기, 예컨대 Fcγ 수용체 (FcγR)에 대한 다이아바디 결합 또한 이펙터 세포를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다 (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bi -specific Diabody ," Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) " Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-Cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bi -specific Diabodies And B7 x Anti- CEA Bi -specific Fusion Proteins," Cancer Res. 59:2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). 정상적으로, 이펙터 세포 활성화는 Fc-FcγR 상호작용을 통해 이펙터 세포에 대한 항원 결합된 항체의 결합에 의해 촉발된다; 그로써 이런 관점에서, 다이아바디 분자는 그것들이 Fc 도메인을 포함하는가의 여부에 관계없이 Ig-유사 기능성을 나타낼 수 있다 (예컨대 기술분야에 공지된 또는 본원에 예시된 어떠한 이펙터 기능 분석 (예컨대 ADCC 분석)으로 분석됨). 종양과 이펙터 세포의 교차-결합에 의해, 다이아바디는 이펙터 세포를 종양 세포 가까이 가져올 뿐 아니라 효과적인 종양 살해를 유도한다 (예컨대 Cao et al. (2003) " Bi -specific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).
비록 그런 삼중-특이적 결합 분자가 특히 바람직하긴 하지만, 발명은 추가로 구체적으로, 그 중 2개는 암 항원에 대해 지시된 결합 특이성이고, 하나는 이펙터 세포 항원에 대해 지시된 결합 특이성인, 3개의 결합 특이성을 가지는 분자를 제조하기에 충분한 결합 도메인들의 어떠한 조합이든지 포함하는 삼중-특이적 결합 분자를 포함한다. 그러므로, 예를 들어, 발명은 3개의 Fab-형 결합 도메인을 포함하는 삼중-특이적 결합 분자, 하나의 2가, 이중-특이적 항체 도메인 (예를 들면 2개의 상이한 경쇄 및 2 개의 상이한 중쇄를 복합체화함으로써 형성됨) 및 하나의 Fab-형 결합 도메인을 포함하는 삼중-특이적 결합 분자, 2개의 2가, 이중-특이적 항체 도메인 (예를 들면 4개의 상이한 경쇄 및 2 개의 상이한 중쇄를 복합체화함으로써 형성됨)을 포함하지만, 항체 도메인 중 하나는 비활성이 된 삼중-특이적 결합 분자, 등을 포함한다.
용어 "폴리펩티드", "폴리펩티드 사슬" 및 "펩티드"는 본원에서 어떠한 길이의 아미노산, 그러나 특히 3, 5, 10, 15, 20 또는 25 아미노산 잔기보다 큰 길이의 아미노산의 중합체로, 이때 2개, 보다 바람직하게는 모든 아미노산 잔기가 아미드 (펩티드) 결합 (-NH-C(O)-)을 통해 결합되어 있는 중합체를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 그러나 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 방해될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들면 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 어떠한 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 콘쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한 그 정의에는, 예를 들면 아미노산의 하나 이상의 유사체 (이를테면 예를 들어 비자연 아미노산 등을 포함함), 뿐만 아니라 기술분야에 알려져 있는 다른 변형들을 함유하는 폴리펩티드도 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 단일-사슬로서 또는 복합체화된 사슬로서 발생할 수 있다.
"다이아바디 -형 결합 도메인"은 다이아바디, 특히 DART® 다이아바디의 에피토프-결합 도메인이다. 용어 "다이아바디" 및 "DART® 다이아바디"는 상기에서 논의되었고, 바람직하게 공유 상호작용을 통해 서로와 복합체를 형성하여 적어도 2개의 에피토프 결합 부위를 형성하고, 그것들은 동일하거나 상이한 에피토프를 인식할 수 있는 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 분자를 나타낸다. 다이아바디 또는 DART® 다이아바디의 폴리펩티드 사슬 중 2개는 각각 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하지만, 이들 영역은 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 상호작용하지 않는다 (즉 그것들은 상호간에 "상보하지" 않는다). 오히려, 다이아바디 또는 DART® 다이아바디 사슬들 중 하나 (예컨대 제 1)의 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상이한 (예컨대 제 2) 다이아바디 또는 DART® 다이아바디 폴리펩티드 사슬의 면역글로불린 경쇄 가변 영역과 상호작용하여 에피토프 결합 부위를 형성한다. 유사하게, 다이아바디 또는 DART® 다이아바디 폴리펩티드 사슬들 중 하나 (예컨대 제 1)의 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 상이한 (예컨대 제 2) 다이아바디 또는 DART® 다이아바디 폴리펩티드 사슬의 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 상호작용하여 에피토프 결합 부위를 형성한다. DART® 다이아바디 분자는 다음의 문헌들에서 개시된다: 미국 특허 공개 번호 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽 특허 공개 번호.EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665, WO 2008/157379 및 Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb ( CD32B ) Inhibitory Function With A Novel Bi -specific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; 및 Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv -Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449.
결합 도메인 III은 바람직하게 "비- 다이아바디 -형" 결합 도메인으로, 그것은 결합 도메인 III이 다이아바디-형 결합 도메인의 구조를 갖지 않는 것을 나타내기 위해 의도된다. 바람직하게, 결합 도메인 III은 Fab -형 결합 도메인 또는 이펙터 세포 수용체-형 결합 도메인인 비-다이아바디-형 결합 도메인이다. 그러므로, 도 4a 내지 4g에 예시된 한 구체예에서, 결합 도메인 III은 Fab-형 결합 도메인이다. 도 5a 내지 5e는 결합 도메인 III이 이펙터 세포 수용체-형 결합 도메인인 구체예를 예시한다. 본원에서 사용되는 용어 " Fab -형 결합 도메인"은 면역글로불린 경쇄의 VL 도메인과 면역글로불린 중쇄의 상보하는 VH 도메인의 상호작용에 의해 형성된 에피토프-결합 도메인을 나타낸다. Fab-형 결합 도메인은 Fab-형 결합 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬이 단지 단일 에피토프-결합 도메인만을 포함하는 반면, 다이아바디-형 결합 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬은 적어도 2개의 에피토프-결합 도메인을 포함한다는 점에서 다이아바디-형 결합 도메인과 상이하다. 그러므로, 본원에서 사용되는 Fab-형 결합 도메인은 다이아바디-형 결합 도메인과 구별된다. 결합 도메인이 Fab-형 결합 도메인 또는 다이아바디-형 결합 도메인일 때, 그것은 VL 도메인 및 VH 도메인으로 구성될 것이고, 동일하거나 상이한 폴리펩티드 사슬에 위치할 수 있다. 그런 VL 및 VH 도메인의 선택은 동조되어서, 도메인들은 에피토프 결합 도메인을 형성하게 된다. 본원에서 사용되는 용어 "이펙 터 세포 수용체-형 결합 도메인"은 T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 도메인과 T 세포 수용체 베타 사슬의 상호작용에 의해 형성되는 에피토프 결합 도메인을 나타낸다. 그런 수용체들은 MHC의 맥락에서 나타난 펩티드들을 인식하고, 그로써 세포내 에피토프들을 인식할 수 있다.
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 그러므로 4가 결합 분자, 예컨대 2가 항체의 이량체화로부터 생성된 것들과 구별되며, 바람직하게는 3 및 4개가 아닌 결합 도메인을 가진다. 아래에서 논의되는 것과 같이, 본 발명의 삼중특이적 분자들은 추가의 결합 도메인 (예컨대 알부민-결합 도메인, FcγR-결합 도메인 등)을 가질 수 있다.그런 추가의 결합 도메인들은 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 3개의 결합 분자들 중 하나로서 여겨지거나 카운트되는 것으로 의도되지 않는다.
본원에서 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 용어 "회합" 또는 "회합하는"은 (예컨대 하나의 다이아바디 폴리펩티드의 다른 것에 대한, 면역글로불린 경쇄의 면역글로불린 중쇄에 대한, 하나의 CH2-CH3 도메인의 다른 CH2-CH3 도메인에 대한, 등등) 폴리펩티드들의 비-공유 연합을 나타내기 위해 의도된다. 용어 "복합체" 또는 "복합체화"는 폴리펩티드들의 공유 연합을 나타내기 위해 의도된다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 발명의 결합 분자는 그것의 결합 도메인들 중 적어도 2개 및 결합 도메인들 중 적어도 전부가 그것들의 각각의 인식된 에피토프 또는 결합 리간드에 동시에 결합될 수 있다면 "동 조된 결합"을 중재한다고 말할 수 있다. 그런 결합은 동시적일 수 있다. 그러나, 본 발명의 한 측면은 그런 결합 도메인이 그것들의 인식된 에피토프에 결합하는 "온" 및/또는 "오프" 속도를 변형시키는 것에 관련된다. 여기서 사용되는 결합의 "온 속도"는 그런 결합 도메인들이 에피토프를 인식하고 그것들의 인식된 에피토프에 결합을 시작하는 친화성의 척도이다. 대조적으로, 결합의 "오프 속도"는 결합 도메인:에피토프 복합체의 안정성의 정도의 척도이다. 결합의 "온" 및/또는 "오프"속도는 결합 도메인의 CDR의 아미노산 서열을 변경시킴으로써 변형될 수 있다. 아래에서 논의되는 것과 같이, 어떠한 CDR 변형과 관계없이, 본 발명의 분자들의 동조된 결합의 정도는 그것들의 결합 도메인의 형태를, 특별한 결합 도메인 (즉 VLx/VHx 도메인)이 결합 도메인 III으로서 또는 결합 도메인 III에 대해 내부 또는 외부 다이아바디-형 결합 도메인으로서 존재하도록 바꿈으로써 조절될 수 있다 (하기에서 상세하게 논의됨).
본 발명의 결합 분자의 결합 도메인의 온- 및 오프-속도는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들, 예를 들면 Biacore® 분석에 의해 쉽게 측정될 수 있다 (Jason-Moller, L. et al. (2006) "Overview Of Biacore Systems And Their Applications," Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 19:Unit 19.13; Swanson, S.J. (2005) "Characterization Of An Immune Response," Dev. Biol. (Basel). 122:95-101; Buijs, J. et al. (2005) "SPR -MS In Functional Proteomics," Brief Funct. Genomic Proteomic. 4(1):39-47; Karlsson, R. et al. (2004) "SPR For Molecular Interaction Analysis: A Review Of Emerging Application Areas," J. Mol. Recognit. 17(3):151-161; Van Regenmortel, M.H. (2003) "Improving The Quality Of BIACORE -Based Affinity Measurements," Dev. Biol. (Basel) 112:141-151; Malmqvist, M. (1999) "BIACORE : An Affinity Biosensor System For Characterization Of Biomolecular Interactions," Biochem. Soc. Trans. 27(2):335-340; Malmqvist, M. et al. (1997) "Biomolecular Interaction Analysis: Affinity Biosensor Technologies For Functional Analysis Of Proteins," Curr. Opin. Chem. Biol. 1(3):378-383; Fivash, M. et al. (1998) "Biacore For Macromolecular Interaction," Curr. Opin. Biotechnol. 9(1):97-101; Malmborg, A.C. et al. (1995) "Biacore As A Tool In Antibody Engineering," J. Immunol. Methods. 183(1):7-13). 본 발명의 결합 분자의 결합 도메인의 온- 및 오프-속도는 그런 결합 도메인을 코드화하는 핵산 분자들의 무작위 또는 지시된 돌연변이생성에 의해 쉽게 변경될 수 있고, 이어서 그런 변경된 결합 동역학을 나타내는 돌연변이된 단백질들을 코드화하는 능력에 대해 회수된 핵산 분자들의 기본적인 스크리닝이 이어진다.
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 결합 도메인은 에피토프에 "면역특이적" 방식으로 결합한다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 항체, 다이아바디 또는 다른 에피토프-결합 분자는 만약 그것이 다른 분자 (즉 에피토프)의 영역에 보다 빈번하게, 보다 신속하게, 더 긴 기간 동안 및/또는 더 큰 친화성으로 다른 에피토프들과 관련하여 그 에피토프와 반응하거나 결합한다면, "면역특이적으로" 결합하는 것이라 말할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체는 이 바이러스 에피토프에, 그것이 다른 바이러스 에피토프 또는 비-바이러스 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력으로, 보다 쉽게 및/또는 더 긴 기간 동안 결합하는 항체이다. 또한 이 정의를 읽음으로써, 예를 들어 제 1 표적에 면역특이적으로 결합하는 항체 (또는 부분 또는 에피토프)는 제 2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 그렇지 못할 수 있다. 그 자체로, "특이적 결합"은 본질적으로는 독점적인 결합을 (비록 그것을 포함할 수는 있지만) 필요로 하지 않는다. 일반적으로, 반드시 그런 것은 아니나, 결합에 대한 언급은 "특이적" 결합을 의미한다. 2 개의 분자는 만약 결합이 그것들의 각각의 리간드에 결합하는 수용체들과의 특이성을 나타낸다면, "물리특이적" 방식으로 서로에 결합할 수 있는 것으로 말할 수 있다.
항체의 기능성은 2개의 별도의 및 구별되는 항원 (또는 동일한 항원의 상이한 에피토프)에 동시에 결합할 수 있는 다중특이적 항체-기반 분자를 생성함으로써 및/또는 동일한 에피토프 및/또는 항원에 대해 더 높은 결합가 (valency)를 가지는 항체-기반 분자를 생성함으로써 증강될 수 있다.
그러므로, 가장 간단한 구체예에서, 본 발명의 바람직한 결합 분자들은 적어도 삼중-특이적이다. 중요하게도, 그런 분자들은 항원에 결합할 수 있는 적어도 3개의 "부위": 결합 도메인 III으로부터 가장 멀리 위치한 "외부" 다이아바디-형 결합 도메인, 결합 도메인 III에 가장 가까이 위치한 "내부" 다이아바디-형 결합 도메인 및 결합 도메인 III 자체를 가진다. 그런 도메인들의 위치는 각각 "부위 A", "부위 B" 및 "부위 C"로서 표시된다 (도 4a 내지 4g; 도 5a 내지 5e).
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 3개의 결합 도메인을 포함함으로써 3개의 상이한 에피토프들에 동조적으로 결합할 수 있다. 그런 분자들의 결합 도메인들 중 2개는 "암 항원"의 에피토프들에 결합할 수 있어서, 분자는 2개의 상이한 암 항원에 결합할 수 있게 된다. 그런 분자들의 제 3 결합 도메인은 면역 시스템 이펙터 세포 (즉 " 이펙터 세포 항원")의 표면에 발현된 분자의 에피토프에 결합할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 2개의 암 항원을 발현하는 암세포 및 이펙터 세포 항원을 발현하는 면역 시스템 이펙터 세포에 대한 동조된 및 동시의 결합을 중재할 수 있다. 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들에 의해 인식된 에피토프는 연속성이거나 불연속성 (예컨대 형태학상)일 수 있다.
본 발명의 삼중특이적 결합 분자들의 암 항원-결합 도메인들에 의해 결합된 제 1 및 제 2 암 항원은 암세포의 표면에 특징적으로 존재하는 어떠한 분자로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 한 측면은 "저발현 암 항원" (즉 효과적인 암 치료법을 제공하기 위해 단일특이적 결합 분자를 허용하기에는 너무 낮은 수준으로 암세포 상에 발현될 수 있는 암 항원)을 표적화하는 능력에 관련된다. 그런 단일특이적 결합 분자와는 대조적으로, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은, 하나 대신 2개의 암 항원을 표적화함으로써, 결합의 저친화성을 상쇄할 수 있는 상조적 및 협력적 증강된 결합 결합력을 나타내고, 그로써 저발현 암 항원을 특징으로 하는 암을 표적화하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 본 발명의 제 2 측면은 "저특이성 암 항원" (즉 암세포 상에 발현되는 것에 더불어 정상 세포 상에 발현될 수 있는 암 항원)을 표적화하는 능력에 관련된다. 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은, 2개의 암 항원에 대한 상조적이고 협력적인 증강된 결합 결합력을 제공함으로써, 저친화성 암 항원에 대한 결합의 더 높은 결합력을 나타내고 그로써 그런 암 항원을 특징으로 하는 암의 치료 수단을 제공한다. 그러므로, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 하나 또는 둘 다의 표적 암 항원이 자체로는 그런 치료법을 제공하기에 비효과적인 상황에서도 항암 치료법을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, CD32B (FcγRIIB 수용체)는 단핵세포, 대식세포, B 세포, NK 세포, 호중구, 비만 세포 및 혈소판을 포함하여 조혈세포 상에서 광범위하게 발현된다. IgG Fc 도메인에 결합할 때, CD32B는 숙주 면역 시스템을 억제하고 그로써 진행중인 면역 반응을 침체시킨다. 그런 억제가 염증성 반응으로부터 숙주 회복을 돕기에 바람직하긴 하지만, 암 또는 감염성 질환에 걸린 대상의 면역 결핍증을 악화시키는 작용을 한다. IgG Fc 분자의 결합을 차단하기 위해, CD32B에 결합하는 항체들은 그런 억제를 방지하고 그로써 암 및 감염성 질환의 치료에서 보조 분자로서 활용되는 작용을 한다 (Veri, M.C. et al. (2007) "Monoclonal Antibodies Capable Of Discriminating The Human Inhibitory Fcgamma -Receptor IIB ( CD32B ) From The Activating Fcgamma -Receptor IIA ( CD32A ): Biochemical, Biological And Functional Characterization," Immunology 121(3):392-404). 유감스럽게도, CD32B는 또한 간 사인곡선적 내피 세포 ("LSE 세포") 상에도 발현된다 (Shahani, T. et al. (2014) "Human Liver Sinusoidal Endothelial Cells But Not Hepatocytes Contain Factor VIII," J. Thromb. Haemost. 12(1):36-42; Geraud, C. et al. (2013) "Endothelial Transdifferentiation In Hepatocellular Carcinoma: Loss Of Stabilin -2 Expression In Peri - Tumourous Liver Correlates With Increased Survival," Liver Int. 33(9):1428-1440; Takabe, Y. et al. (2012) "Immunomagnetic Exclusion Of E-Cadherin-Positive Hepatoblasts In Fetal Mouse Liver Cell Cultures Impairs Morphogenesis And Gene Expression Of Sinusoidal Endothelial Cells," J. Anat. 221(3):229-239). 그러므로, CD32B에 결합하는 항체들은 LSE 세포를 공격한다. 그러나, CD32B에 및 LSE 세포 상에 발현되지 않는, 또는 그런 세포에 의해 저수준으로 발현되는 (즉 저발현 암 항원(들)) 또는 암세포 및 그런 LSE 세포 상에 저특이성으로 발현되는 (즉 저특이성 암 항원(들)) 항원 (즉 제 1 및 제 2 암 항원)에 결합하는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자를 형성함으로써, 본 발명은 CD32B-중재된 면역 시스템 억제를 침체시키기 위해 사용될 수 있을 조성물 및 방법을 제공한다.
B. 예시적인 암 항원-결합 도메인들
적합한 암 항원의 실례들은 다음을 포함한다: 대장암, 위암 뮤신에서 발견되는 19.9; 4.2; A33 (결장 암종 항원; Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov;33(8):991-998); ADAM-9 (미국 특허 공개 번호 2006/0172350; PCT 공개 번호 WO 06/084075); 위암에서 발견되는 AH6; ALCAM (PCT 공개 번호 WO 03/093443); APO-1 (악성 인간 림프구 항원) (Trauth et al. (1989) "Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis ," Science 245:301-304); B1 (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(1):6-9); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); B7-H3; 베타- 카테닌 (Prange W. et al. 2003 J Pathol . 201(2):250-9); 대장 선암종에서 발견된 혈액 군 ALe b / Le y ; 버킷 림 프종 항원-38.13, 대장 선암종에서 발견된 C14; CA125 (난소 암종 항원) (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81　; Yu et al. (1991) "Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants," Cancer Res. 51(2):468-475); 카르복시펩티다제 M (미국 특허 공개 번호 2006/0166291); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2):167-73; CD19 (Ghetie et al. 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Invest. 86:2136-2144); I 항원 (분화 항원) (Feizi (1985) "Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco -Developmental Antigens," Nature 314:53-57) 예컨대 위 선암종에서 발견되는 I(Ma); 인티그린 알파-V-베타-6 (PCT 공개 번호 WO 03/087340); JAM-3 (PCT 공개 번호 WO 06/084078); KID3 (PCT 공개 번호 WO 05/028498); KID31 (PCT 공개 번호 WO 06/076584); KS 1/4 pan- 암종 항원 (Perez et al. (1989) "Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The Ks1 /4 Epithelial Carcinoma Marker," J. Immunol. 142:3662-3667; M?ller et al. (1991) " Bi -specific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes," Cancer Immunol. Immunother. 33(4):210-216; Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); L6 및 L20 (인간 폐 암종 항원) (Hellstrom et al. (1986) "Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma," Cancer Res. 46:3917-3923); LEA; LUCA -2 (미국 특허 공개 번호 2006/0172349; PCT 공개 번호 WO 06/083852); M1:22 :25:8; M18; M39; MAGE (MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82; MUC-1 (Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1 (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); Myl; N- 아세틸글루코사미닐트란스페라제 (Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34); 네오글리코단백질; 선암종에서 발견되는 NS-10; OFA -1; OFA -2; 온코스타틴 M (온코스타틴 수용체 베타) (미국 특허 번호 7,572,896; PCT 공개 번호 WO 06/084092); p15 (Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); p97 (흑색종-관련 항원) (Estin et al. (1989) " Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97," J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-454); PEM ( 다형태 상피 뮤신) (Hilkens et al. 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Acids Res. 18(16):4928); 흑색종에서 발견되는 R 24 ; ROR1 (미국 특허 번호 5,843,749); 스핑고지질; SSEA -1; SSEA -3; SSEA -4; sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); 피부 T 세포 림프종으로부터의 T 세포 수용체 유도된 펩티드(Edelson (1998) "Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy ," Cancer J Sci Am. 4:62-71 참조); 골수 세포에서 발견된 T 5 A 7 ; TAG-72 (Yokota et al. (1992) "Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms," Cancer Res. 52:3402-3408); TL5 (혈액 군 A); TNF -수용체 (TNF-α 수용체, TNF-β 수용체; TNF-γ 수용체 (van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64); TRA -1-85 (혈액 군 H); 트란스페린 수용체 (미국 특허 번호 7,572,895; PCT 공개 번호 WO 05/121179); TSTA (종양-특이적 이식 항원), 예컨대 바이러스-유도된 종양 항원, 이를테면 T-항원 DNA 종양 바이러스 및 RNA 종양 바이러스의 외피 항원, 종양태아성 항원-알파-피토단백질, 예컨대 대장의 CEA, 방광 종양 종양태아성 항원 (Hellstrom et al. (1985) "Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas," Cancer. Res. 45:2210-2188); VEGF 수용체 (O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-998); VEP8; VEP9; VIM-D5; 및 배아 암종 세포에서 발견되는 Y hapten, Le y .
1. Campath -1 (CD52) 결합 도메인 ( 알렘투주맙 )
인간화된 항-CD52 항체 "알렘투주맙"의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:205)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQNID KYLN WYQQKP GKAPKLLIY N TNNLQT GVPS
RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYC LQ HISRPRT FGQ GTKVEIKR.
인간화된 항-CD52 항체 "알렘투주맙"의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:206)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQESGPG LVRPSQTLSL TCTVS GFTFT DFYMN WVRQP PGRGLEWIG F IRDKAKGYTT
EYNPSVKG RV TMLVDTSKNQ FSLRLSSVTA ADTAVYYCAR EGHTAAPFDY WGQGSLVTVS S.
2. CD317 ( BMST2 )-결합 도메인
CD317 (또한 골수 간질 세포 항원 2; BMST로도 알려져 있음)은 유방, 폐, 신장, 자궁 내막 및 피부로부터 분리된 다양한 암세포 상에 과잉발현된다 (Kawai, S. et al. (2008) "Interferon-α enhances CD317 expression and the antitumor activity of anti-CD317 monoclonal antibody in renal cell carcinoma xenograft models," Cancer Science 99(12):2461-2466; Cai, D. et al. (2009) "Up-Regulation Of Bone Marrow Stromal Protein 2 ( BST2 ) In Breast Cancer With Bone Metastasis," BMC Cancer 9:102, pp. 1-10; Wang, W. et al. (2009) HM1.24 (CD317) Is A Novel Target Against Lung Cancer For Immunotherapy Using Anti-HM1.24 Antibody," Cancer Immunology, Immunotherapy 58(6):967-976; Wang, W. et al. (2009) "Chimeric And Humanized Anti-HM1.24 Antibodies Mediate Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Lung Cancer Cells. Lung Cancer," 63(1):23-31; Sayeed, A. et al. (2013) "Aberrant Regulation Of The BST2 ( Tetherin ) Promoter Enhances Cell Proliferation And Apoptosis Evasion In High Grade Breast Cancer Cells," PLoS ONE 8(6)e67191, pp. 1-10; Yi, E.H. et al. (2013) "BST -2 Is A Potential Activator Of Invasion And Migration In Tamoxifen -Resistant Breast Cancer Cells," Biochem. Biophys. Res. Commun. 435(4):685-690; Staudinger, M. (2014) "The Novel Immunotoxin HM1.24-ETA' Induces Apoptosis In Multiple Myeloma Cells," Blood Cancer J. 13;4:e219, pp. 1-11). CD317에 면역특이적으로 결합하는 항체들은 상업적으로 입수 가능하다 (Novus Biologicals LLC; BioLegend, Inc.; 또한 미국 특허 번호 8,834,876 참조, 항체 HM1.24의 중쇄 및 경쇄의 FERM BP-5644 및 FERM BP-5646으로서의 기탁을 참조함; 또한 미국 특허 번호 8,394,374 참조). 항-CD317 항체 "HM1.24"의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:302)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCK KASQDV NTAVA WYQQK PGQSPKLLIY SASNRYT GVP
DRITGSGSGT DFTFTISSVQ AEDLALTTC Q QHYSTPFT FG SGTKLEIK.
항-CD317 항체 "HM1.24"의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:303)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT PYWMQ WVKQR PGQGLEWIG S IFPGDGDTRY
SQKFKG KATL TADKSSSTAY MQLSILAFED SAVYYCAR GL RRGGYYFDY W GQGTTLTVSS.
3. CEACAM5 - 및 CEACAM6 -결합 도메인
암배아성 항원-관련 세포 부착 분자 5 (CEACAM5) 및 6 (CEACAM6)은 다음을 포함하여 다양한 유형의 암과 관련된 것으로 밝혀졌다: 갑상성 수질암, 결장암, 췌장암, 간세포 암종, 위암, 폐암, 두경부암, 비뇨기 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁내막암, 유방암, 조혈세포암, 백혈병 및 난소암 (PCT 공개 번호 WO 2011/034660), 및 특히 결장, 위장, 췌장, 비-소세포 폐암 (NSCL), 유방, 갑상선, 위, 난소 및 자궁 암종 (Zheng, C. et al. (2011) "A Novel Anti- CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity," PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11).
CEACAM5는 위장, 결장 및 췌장 암의 90%, 비-소세포 폐 암세포의 70% 및 유방암의 50%에서 과잉발현되는 것으로 밝혀졌다 Thompson, J.A. et al. (1991) "Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives," J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366).
과잉발현된 암배아성 항원-관련된 세포 부착 분자 6 (CEACAM6)은 갑상선 수질암, 결장암, 췌장암, 간세포 암종, 위암, 폐암, 두경부암, 비뇨기 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁내막암, 유방암, 조혈세포암, 백혈병 및 난소암을 포함하여 다양한 인간 암의 침입 및 전이에서 중요한 역할을 한다 (PCT 공개 번호 WO 2011/034660; Deng, X. et al. (2014) "Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma," Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697; Cameron, S. et al. (2012) "Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis," Mol. Cancer 11:74, pp. 1-11; Chapin, C. et al. (2012) "Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung," Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25; Riley, C.J. et al. (2009) "Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti- CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer," Cancer Res. 69(5):1933-1940; Lewis-Wambi, J.S. et al. (2008) "Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells," Eur. J. Cancer 44(12):1770-1779; Blumenthal, R.D. et al. (2007) "Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers," BMC Cancer. 7:2, pp. 1-15). CEACAM5 및 CEACAM6에 면역특이적으로 결합하는 항체들은 상업적으로 입수 가능하다 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Novus Biologicals LLC; Abnova Corporation). 인간화된 항-CEACAM5 / 항-CEACAM6 항체 16C3 (EP 2585476)의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:304)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC GASENIY GALN WYQRKP GKSPKLLIW G ASNLAD GMPS
RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYY CQN VLSSPYT FGG GTKLEIK.
인간화된 항-CEACAM5 / 항-CEACAM6 항체 16C3 (EP 2585476)의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:305)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGS GYTFT DYAMH WVKQS HAKSLEWIG L ISTYSGDTKY
NQNFKG KATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAR GD YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S.
인간화된 항-CEACAM5 / CEACAM6 항체 hMN15 (WO 2011/034660)의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:306)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTC SASSRVS YIH WYQQKPG KAPKRWIY GT STLAS GVPAR
FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYC QQW SYNPPT FGQG TKVEIKR.
인간화된 항-CEACAM5 / CEACAM6 항체 hMN15 (WO 2011/034660)의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:307)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSG FALT DYYMS WVRQA PGKGLEWLG F IANKANGHTT
DYSPSVKG RF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S.
4. DR5-결합 도메인
DR5는 본 발명의 바람직한 암 항원이다. 본 발명의 바람직한 항-인간 DR5-결합 분자들은 쥐과 항-인간 DR5 단클론성 항체 "DR5 mAb 1" 및/또는 "DR5 mAb 2"의 VL 및/또는 VH 도메인들을 가지고, 보다 바람직하게는 그런 항-인간 DR5 단클론성 항체들의 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 및/또는 VH 도메인의 CDR의 1, 2 또는 3개를 가진다. 다르게는, 항-인간 DR5 단클론성 항체, 특히 드로지투맙 (본원에서 "DR5 mAb 3"으로서 표시됨), 코나투무맙 (본원에서 "DR5 mAb 4"로서 표시됨), 티가투무맙 (본원에서 "DR5 mAb 5"로서 표시됨), LBY135 -1 (본원에서 "DR5 mAb 6"으로서 표시됨), LBY135 -2 (본원에서 "DR5 mAb 7"로서 표시됨) 및 KMTR2 (본원에서 "DR5 mAb 8"로서 표시됨)가 사용될 수 있다.
a. 항-인간 DR5 항체 DR5 mAb 1
DR5는 광범위한 암의 치료에 잠재적으로 활용된다 (예컨대 결장암, 간세포 암종, 신경교종, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 방광암, 신경아세포종; 육종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암 및 직장암). 인간 DR5 전구체 (NCBI Sequence NP_003833.4)의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:2)은 다음과 같다:
MEQRGQNAPA ASGARKRHGP GPREARGARP GLRVPKTLVL VVAAVLLLVS AESALITQQD
LAPQQRVAPQ QKRSSPSEGL CPPGHHISED GRDCISCKYG QDYSTHWNDL LFCLRCTRCD
SGEVELSPCT TTRNTVCQCE EGTFREEDSP EMCRKCRTGC PRGMVKVGDC TPWSDIECVH
KESGTKHSGE APAVEETVTS SPGTPASPCS LSGIIIGVTV AAVVLIVAVF VCKSLLWKKV
LPYLKGICSG GGGDPERVDR SSQRPGAEDN VLNEIVSILQ PTQVPEQEME VQEPAEPTGV
NMLSPGESEH LLEPAEAERS QRRRLLVPAN EGDPTETLRQ CFDDFADLVP FDSWEPLMRK
LGLMDNEIKV AKAEAAGHRD TLYTMLIKWV NKTGRDASVH TLLDALETLG ERLAKQKIED
HLLSSGKFMY LEGNADSAMS.
DR5 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:3)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC RASKSVS SSGYSYMH WY QQKPGQPPKV LIF LSSNLDS
GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YC QHSRDLPP T FGGGTKLEI K.
DR5 mAb 1의 CDRL1 (SEQ ID NO:4): RASKSVSSSGYSYMH
DR5 mAb 1의 CDRL2 (SEQ ID NO:5):LSSNLDS
DR5 mAb 1의 CDRL3 (SEQ ID NO:6):QHSRDLPPT
DR5 mAb 1의 VL 도메인은 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:7)에 의해 코드화된다 (CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시됨):
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc
atctcatgc a gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcac tggtac
caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatcttt c tttcatccaa cctagattct
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat
cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgt cagc acagtaggga tcttcctccg
acg ttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa.
DR5 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:8)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨). C-말단 아미노산은 이 VH 도메인의 하위클로닝을 용이하게 하기 위해 알라닌으로 치환될 수 있다.
EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVAS GFDFS RYWMS WVRQA PGKGLEWIG E INPDSNTINY
TPSLKD KFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTR RA YYGNPAWFAY WGQGTLVTVSS.
DR5 mAb 1의 CDRH1 (SEQ ID NO:9): GFDFSRYWMS
DR5 mAb 1의 CDRH2 (SEQ ID NO:10): EINPDSNTINYTPSLKD
DR5 mAb 1의 CDRH3 (SEQ ID NO:11): RAYYGNPAWFAY
DR5 mAb 1의 VH 도메인은 바람직하게 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:12)에 의해 코드화된다 (CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시됨):
gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc
tcctgtgtag cctca ggatt cgattttagt agatactgga tgagt tgggt ccggcaggct
ccagggaaag ggctagaatg gattgga gaa attaatccag atagcaatac gataaactat
acgccatctc taaaggat aa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat
ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aaga agggcc
tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct tcc.
b. 항-인간 DR5 항체 DR5 mAb 2
(1) 쥐과 항-인간 항체 DR5 mAb 2
DR5 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:13)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITC KASQDVN TAVA WYQQKP GQSPKLLIY W ASTRHT GVPD
RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYC QQ HYITPWT FGG GTKLEIK.
DR5 mAb 2의 CDRL1 (SEQ ID NO:14): KASQDVNTAVA
DR5 mAb 2의 CDRL2 (SEQ ID NO:15): WASTRHT
DR5 mAb 2의 CDRL3 (SEQ ID NO:16): QQHYITPWT
DR5 mAb 2의 VL 도메인은 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:17)에 의해 코드화된다 (CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시됨):
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc
atcacctgc a aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cc tggtatca acaaaaacca
gggcaatctc ctaaactact gatttac tgg gcatccaccc ggcacact gg agtccctgat
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct
gaagacctga cactttatta ctgt cagcaa cactatatca ctccgtggac g ttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaaa.
DR5 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:18)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKAS GYTFT EYILH WVKQK SGQGLEWIG W FYPGNNNIKY
NEKFKD KATL TADKSSSTVY MELSRLTSED SAVYFCAR HE QGPGYFDY WG QGTTLTVS S.
DR5 mAb 2의 CDRH1 (SEQ ID NO:19): GYTFTEYILH
DR5 mAb 2의 CDRH2 (SEQ ID NO:20): WFYPGNNNIKYNEKFKD
DR5 mAb 2의 CDRH3 (SEQ ID NO:21): HEQGPGYFDY
DR5 mAb 2의 VH 도메인은 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:22)에 의해 코드화된다 (CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시됨):
aaggtccagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtgaaac ccggggcatc agtgaagctg
tcctgcaagg cttct gggta caccttcact gagtatattt tacac tgggt aaagcagaag
tctggacagg gtcttgagtg gattggg tgg ttttatcctg gaaataataa tataaagtac
aatgagaaat tcaaggac aa ggccacactg actgcggaca aatcctccag cacagtctat
atggaactta gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aaga cacgaa
caaggaccag gttactttga ctac tggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcc.
(2) 인간화된 DR5 mAb 2 (" hDR5 mAb 2")
상기-기술된 쥐과 항-인간 DR5 항체 DR5 mAb 2는 인간 수용체에 투여시 항원성을 감소시키기 위하여 항-인간 DR5 항체를 인간화하는 능력을 증명하기 위해 인간화되었다. 인간화는 본원에서 "hDR5 mAb 2 VL -2", "hDR5 mAb 2 VL -3", "hDR5 mAb 2 VL -4" 및 "hDR5 mAb 2 VL -5"로서 표시된 4개의 인간화된 VL 도메인 및 "hDR5 mAb 2 VH -2"로서 표시된 하나의 인간화된 VH 도메인을 유발하였다. 따라서, 인간화된 VH 도메인과 쌍을 이룬 인간화된 VL 도메인 중 하나를 포함하는 어떠한 항체든지 일반적으로 "hDR5 mAb 2"로서 언급되고 인간화된 VL/VH 도메인의 특별한 조합은 VL 도메인에 대한 언급에 의해 언급된다.
hDR5 mAb 2 VL -2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:23)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYC QQ HYITPWT FGG GTKLEIK.
hDR5 mAb 2 VL -2는 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:24)에 의해 코드화된다:
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact
attacttgta aagcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc
ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct
aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc
gaggatgtgg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa a.
hDR5 mAb 2 VL -3의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:25)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT IT CRASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPD
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQQ HYITPWT FGG GTKLEIK.
hDR5 mAb 2 VL -3은 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:26)에 의해 코드화된다:
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact
attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc
ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat
aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc
gaggatgtgg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa a.
hDR5 mAb 2 VL -4의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:27)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT IT CRASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ HYITPWT FGG GTKLEIK.
hDR5 mAb 2 VL -4는 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:28)에 의해 코드화된다:
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact
attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc
ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct
aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagcca
gaggatatcg ctacatacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa a.
hDR5 mAb 2 VL -5의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:29)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITC RASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPD
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ HYITPWT FGG GTKLEIK.
hDR5 mAb 2 VL -5는 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:30)에 의해 코드화된다:
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact
attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc
ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat
aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc
gaggatatcg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa a.
hDR5 mAb 2 VH -2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:31)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTF T EYILH WVRQA PGQGLEWMG W FYPGNNNIKY
NEKFKD RVTI TADKSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCAR HE QGPGYFDY WG QGTLVTVSS.
hDR5 mAb 2 VH -2는 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:32)에 의해 코드화된다:
caggtccagc tggtgcagag tggggcagag gtgaaaaagc caggggcatc agtgaaagtg
tcttgtaaag catcaggtta tacatttact gagtacatcc tgcactgggt gcgacaggca
ccaggacagg gactggaatg gatggggtgg ttctaccctg gcaacaacaa cattaagtac
aacgagaagt ttaaagaccg ggtgaccatc acagcggata agtctaccag tacagtctat
atggagctga gctccctgag aagcgaagac accgccgtct actattgcgc tcgccacgaa
cagggtccag gttactttga ttattggggg cagggaactc tggtcacagt cagctcc.
VL Domain of hDR5 mAb 2 VL-3, hDR5 mAb 2 VL-4 및 hDR5 mAb VL-5의 CDR1은 아미노산 서열: RASQDVNTAVA (SEQ ID NO:196)을 가진다.
c. 드로지투맙 ("DR5 mAb 3")
드로지투맙 ("DR5 mAb 3")의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:54)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
SELTQDPAVS VALGQTVRIT C SGDSLRSYY AS WYQQKPG QAPVLVIY GA NNRPS GIPDR
FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYC NSA DSSGNHVV FG GGTKLTVLG.
DR5 mAb 3의 CDRL1 (SEQ ID NO:55): SGDSLRSYYAS
DR5 mAb 3의 CDRL2 (SEQ ID NO:56): GANNRPS
DR5 mAb 3의 CDRL3 (SEQ ID NO:57): NSADSSGNHVV
드로지투맙 ("DR5 mAb 3")의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:58)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EVQLVQSGGG VERPGGSLRL SCAAS GFTFD DYAMS WVRQA PGKGLEWVSG INWQGGSTGY
ADSVKG RVTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAK IL GAGRGWYFDY WGKGTTVTVS S.
DR5 mAb 3의 CDRH1 (SEQ ID NO:59): GFTFDDYAMS
DR5 mAb 3의 CDRH2 (SEQ ID NO:60): INWQGGSTGYADSVKG
DR5 mAb 3의 CDRH3 (SEQ ID NO:61): ILGAGRGWYFDY
d. 코나투무맙 ("DR5 mAb 4")
코나투무맙 ("DR5 mAb 4")의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:62)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSC RASQGIS RSYLA WYQQK PGQAPSLLIY GASSRAT GIP
DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYC Q QFGSSPWT FG QGTKVEIK.
DR5 mAb 4의 CDRL1 (SEQ ID NO:63): RASQGISRSYLA
DR5 mAb 4의 CDRL2 (SEQ ID NO:64): GASSRAT
DR5 mAb 4의 CDRL3 (SEQ ID NO:65): QQFGSSPWT
코나투무맙 ("DR5 mAb 4")의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:66)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVS GGSIS SGDYFWS WIR QLPGKGLEWI G HIHNSGTTY
YNPSLKS RVT ISVDTSKKQF SLRLSSVTAA DTAVYYCAR D RGGDYYYGMD V WGQGTTVTV SS.
DR5 mAb 4의 CDRH1 (SEQ ID NO:67): GGSISSGDYFWS
DR5 mAb 4의 CDRH2 (SEQ ID NO:68): HIHNSGTTYYNPSLKS
DR5 mAb 4의 CDRH3 (SEQ ID NO:69): DRGGDYYYGMDV
e. 티가투무맙 ("DR5 mAb 5")
티가투무맙 ("DR5 mAb 5")의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:70)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVG TAVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YSSYRT FGQG TKVEIK.
DR5 mAb 5의 CDRL1 (SEQ ID NO:71): KASQDVGTAVA
DR5 mAb 5의 CDRL2 (SEQ ID NO:72): WASTRHT
DR5 mAb 5의 CDRL3 (SEQ ID NO:73): QQYSSYRT
티가투무맙 ("DR5 mAb5")의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:74)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS SYVMS WVRQA PGKGLEWVA T ISSGGSYTYY
PDSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAR RG DSMITTDY WG QGTLVTVSS.
DR5 mAb 5의 CDRH1 (SEQ ID NO:75): GFTFSSYVMS
DR5 mAb 5의 CDRH2 (SEQ ID NO:76): TISSGGSYTYYPDSVKG
DR5 mAb 5의 CDRH3 (SEQ ID NO:77): RGDSMITTDY
f. LBY135 -1 ("DR5 mAb 6")
LBY135 -1 ("DR5 mAb 6")의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:78)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIAMTQSHKF MSTLVGDRVS ITCKAS QDVN TAIA WYQQKP GQSPKLLIY W ASTRHT GVPD
RFYGSGSGTD YTLTISSMEA EDAATYYC QQ WSSNPLT FGA GTKLELKRA.
DR5 mAb 6의 CDRL1 (SEQ ID NO:79): QDVNTAIA
DR5 mAb 6의 CDRL2 (SEQ ID NO:80): WASTRHT
DR5 mAb 6의 CDRL3 (SEQ ID NO:81): QQWSSNPLT
LBY135 -1 ("DR5 mAb 6")의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:82)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKAS GYTFT DYTIH WVKQR SGQGLEWIG W FYPGGGYIKY
NEKFKD RATL TADKSSNTVY MELSRLTSEG SAVYFCAR HE EGIYFDY WGQ GTTLTVSS.
DR5 mAb 6의 CDRH1 (SEQ ID NO:83): GYTFTDYTIH
DR5 mAb 6의 CDRH2 (SEQ ID NO:84): WFYPGGGYIKYNEKFKD
DR5 mAb 6의 CDRH3 (SEQ ID NO:85): HEEGIYFDYCDRH3
g. LBY135 -2 ("DR5 mAb 7")
LBY135 -2 ("DR5 mAb 7")의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:86)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITC KASQDVN TAIA WYQQKP GQSPKLLIY W ASTRHT GVPD
RFTGSGSGTD YTLTISSVQA EDLALYYC QQ HYTTPFT FGS GTKL.
DR5 mAb 7의 CDRL1 (SEQ ID NO:87): KASQDVNTAIA
DR5 mAb 7의 CDRL2 (SEQ ID NO:88): WASTRHT
DR5 mAb 7의 CDRL3 (SEQ ID NO:89): QQHYTTPFT
LBY135 -2 ("DR5 mAb 7")의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:90)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKAS GYTFT DYTIH WVKQR SGQGLEWIG W FYPGGGYIKY
NEKFKD RATL TADKSSNTVY MELSRLTSED SAVYFCAR HE EGIYFDY WGQ GTTLTVSS.
DR5 mAb 7의 CDRH1 (SEQ ID NO:91): GYTFTDYTIH
DR5 mAb 7의 CDRH2 (SEQ ID NO:92): WFYPGGGYIKYNEKFKD
DR5 mAb 7의 CDRH3 (SEQ ID NO:93): HEEGIYFDY
h. KMTR2 ("DR5 mAb 8")
KMTR2 ("DR5 mAb 8")의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:94)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS SYLA WYQQKP GQAPRLLIY D ASNRAT GIPA
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ RSNWPLT FGG GTKVEIKR.
DR5 mAb 8의 CDRL1 (SEQ ID NO:95): RASQSVSSYLA
DR5 mAb 8의 CDRL2 (SEQ ID NO:96): DASNRAT
DR5 mAb 8의 CDRL3 (SEQ ID NO:97): QQRSNWPLT
KMTR2 ("DR5 mAb 8")의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:98)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE MKKPGASVKV SCKTS GYTFT NYKIN WVRQA PGQGLEWMG W MNPDTDSTGY
PQKFQG RVTM TRNTSISTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SY GSGSYYRDYY YGMDV WGQGT
TVTVSS.
DR5 mAb 8의 CDRH1 (SEQ ID NO:99): GYTFTNYKIN
DR5 mAb 8의 CDRH2 (SEQ ID NO:100): WMNPDTDSTGYPQKFQG
DR5 mAb 8의 CDRH3 (SEQ ID NO:101): SYGSGSYYRDYYYGMDV
5. EphA2 -결합 도메인
수용체 타이로신 키나아제, 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2)는 본 발명의 바람직한 암 항원이다. EphA2는 정상적으로 성인 상피 조직에서 세포-대-세포 접촉의 부위에 발현되지만, 최근의 연구들은 그것이 다양한 유형의 상피 암종에서, 전이 병변에서 관찰된 EphA2 발현의 가장 큰 수준으로 과잉발현되는 것을 밝혔다. EphA2의 고발현 수준은 전립선암, 유방암, 비-소세포 폐암 및 흑색종을 포함하여 광범위한 암 및 수많은 종양 셀라인에서 발견되었다 (Xu, J. et al. (2014) "High Epha2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome," Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2): 687-692; Miao, B. et al. (2014) "EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma," Cancer Discov. pii: CD-14-0295). EphA2는 단순히 암에 대한 마커인 것으로 나타나지는 않지만, 오히려 수많은 인간 암에서 끈질기게 과잉발현되고 기능적으로 변화되는 것으로 나타난다 (Chen, P. et al. (2014) "Epha2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of Lncap Prostate Cancer Cells," Oncol. Lett. 8(1):41-46).
발명은 특히 EphA2의 암 항원으로서의 선택 및 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 암 항원-결합 도메인을 제공하기 위해 항-EphA2 항체의 사용을 고려한다. 예시적인 항-EphA2 항체는 "EphA2 mAb 1", "EphA2 mAb 2" 및 "EphA2 mAb 3"이다.
a. EphA2 mAb 1
바람직한 항-인간 EphA2 항체 (" EphA2 mAb 1")의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:153)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS
RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GYTLYT FGGG TKLEIK.
EphA2 mAb 1의 CDRL1 (SEQ ID NO:154): RASQDISNYLN
EphA2 mAb 1의 CDRL2 (SEQ ID NO:155): YTSRLHS
EphA2 mAb 1의 CDRL3 (SEQ ID NO:156): QQGYTLYT
EphA2 mAb 1의 VL 도메인은 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:157)에 의해 코드화된다 (CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시됨):
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagaatcacc
atcagttgc a gggcaagtca ggacattagc aattatttaa ac tggtatca gcagaaacca
gatggaactg ttaaactcct gatctac tac acatcaagat tacactca gg agtcccatca
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa
gaagatattg ccacttactt ttgc caacag ggttatacgc tgtacacg tt cggagggggg
accaagctgg aaataaaa.
EphA2 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:158)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVS GFSLS RYSVH WVRQP PGKGLEWLG M IWGGGSTDYN
SALKS RLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCAR KHG NYYTMDY WGQ GTSVTVSS.
EphA2 mAb 1의 CDRH1 (SEQ ID NO:159): GFSLSRYSVH
EphA2 mAb 1의 CDRH2 (SEQ ID NO:160): MIWGGGSTDYNSALKS
EphA2 mAb 1의 CDRH3 (SEQ ID NO:161): KHGNYYTMDY
EphA2 mAb 1의 VH 도메인은 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:162)에 의해 코드화된다 (CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시됨):
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag cctgtccatc
acatgcactg tctct gggtt ctcattatcc agatatagtg tacac tgggt tcgccagcct
ccaggaaagg gtctggagtg gctggga atg atatggggtg gtggaagcac agactataat
tcagctctca aatcc agact gagtatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag a aaacatggt
aactactata ctatggacta c tggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcc.
b. EphA2 mAb 2
제 2 바람직한 항-인간 EphA2 항체 ("EphA2 mAb 2")의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:163)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSSGNTYLH W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP T FGSGTKLEI K.
EphA2 mAb 2의 CDRL1 (SEQ ID NO:164): RSSQSLVHSSGNTYLH
EphA2 mAb 2의 CDRL2 (SEQ ID NO:165): KVSNRFS
EphA2 mAb 2의 CDRL3 (SEQ ID NO:166): SQSTHVPT
EphA2 mAb 2의 VL 도메인은 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:318)에 의해 코드화된다 (CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시됨):
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc
atctcttgc a gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacat tgg
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ac aaagtttc caaccgattt
tct ggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgc t ctcaaagtac acatgttccc
acg ttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa.
EphA2 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:167)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKAS GFTFT NYGMN WVKQA PGKGLKWMG W INTYIGEPTY
ADDFKG RFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAR EL GPYYFDY WGQ GTTLTVSS.
EphA2 mAb 2의 CDRH1 (SEQ ID NO:168): GFTFTNYGMN
EphA2 mAb 2의 CDRH2 (SEQ ID NO:169): WINTYIGEPTYADDFKG
EphA2 mAb 2의 CDRH3 (SEQ ID NO:170): ELGPYYFDY
EphA2 mAb 2의 VH 도메인은 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:171)에 의해 코드화된다 (CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시됨):
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc
tcctgcaagg cttct gggtt taccttcaca aactatggaa tgaac tgggt gaagcaggct
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggc tgg ataaacacct atattggaga gccgacatat
gctgatgact tcaaggga cg gtttgtcttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggccacat atttctgtgc aaga gaactg
ggaccatact actttgacta c tggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcc.
c. EphA2 mAb 3
추가의 바람직한 항-인간 EphA2 항체 ("EphA2 mAb 3")의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:172)은 아래에 제시된다 (CDR 자기들은 밑줄로 표시됨):
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITC KASQDVT TAVA WYQQKP GQSPKLLIF W ASTRHA GVPD
RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYC QQ HYSTPYT FGG GTKLEIK.
EphA2 mAb 3의 CDRL1 (SEQ ID NO:173): KASQDVTTAVA
EphA2 mAb 3의 CDRL2 (SEQ ID NO:174): WASTRHA
EphA2 mAb 3의 CDRL3 (SEQ ID NO:175): QQHYSTPYT
EphA2 mAb 3의 VL 도메인은 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:176)에 의해 코드화된다 (CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시됨):
gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac
atcacctgc a aggccagtca ggatgtgact actgctgtag cc tggtatca acaaaaacca
gggcaatctc ctaaattact gattttc tgg gcatccaccc ggcacgct gg agtccctgat
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct
ggagacctgg cactttatta ctgt caacaa cattatagca caccgtacac a ttcggaggg
gggaccaagc tggaaataaa a.
EphA2 mAb 3의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:177)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAAS GFTFT DHYMY WVRQT PEKRLEWVA T ISDGGSFTSY
PDSVKG RFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTR DE SDRPFPY WGQ GTLVTVSS.
EphA2 mAb 3의 CDRH1 (SEQ ID NO:178): GFTFTDHYMY
EphA2 mAb 3의 CDRH2 (SEQ ID NO:179): TISDGGSFTSYPDSVKG
EphA2 mAb 3의 CDRH3 (SEQ ID NO:180): DESDRPFPY
EphA2 mAb 3의 VH 도메인은 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:319)에 의해 코드화된다 (CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시됨):
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc
tcctgtgcag cctct ggatt cactttcact gaccattaca tgtat tgggt tcgccagact
ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgca acc attagtgatg gcggtagttt cacctcctat
ccagacagtg tgaagggg cg attcaccatc tccagagaca ttgccaagaa caacctgtac
ctccaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aaga gatgag
agcgataggc cgtttcctta c tggggccaa gggactctgg tcactgtctc ctcc.
6. gpA33 -결합 도메인
gpA33은 또한 본 발명의 바람직한 암 항원이다. 결장암은 서구의 가장 흔한 악성 종양 중 하나이며 암 사망의 선두 원인이다 (Silverberg, E. et al. (1989) "Cancer Statistics, 1989," CA Cancer J Clin. 39(1):3-20). 대장암에 대한 하나의 잠재적으로 유용한 표적은 모든 결장 암종의 95%보다 많은 암종에서 발현되는 43kD의 경막 글리코단백질 A33 (gpA33)이다 (Heath, J.K. et al. (1997) "The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) "Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium," Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N.A. et al. (2006) "EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia," J. Clin. Pathol. 59(3):260-263). gpA33은 인간 췌장 암종 유도된 셀라인 ASPC1에 대해 발생된 단클론성 쥐과 항체들을 통해 처음 발견되었다.
발명은 특히 암 항원으로서의 gpA33의 선택 및 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 암 항원-결합 도메인을 제공하기 위한 항-gpA33 항체의 사용을 고려한다. 예시적인 항-gpA33 항체는 "gpA33 mAb 1"이다.
바람직한 항-인간 gpA33 항체 ("gpA33 mAb 1")의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:181)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC SARSSIS FMY WYQQKPG KAPKLLIY DT SNLAS GVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYC QQW SSYPLT FGQG TKLEIK.
gpA33 mAb 1의 CDRL1 (SEQ ID NO:182): SARSSISFMY
gpA33 mAb 1의 CDRL2 (SEQ ID NO:183): DTSNLAS
gpA33 mAb 1의 CDRL3 (SEQ ID NO:184): QQWSSYPLT
gpA33 mAb 1의 VL 도메인은 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:185)에 의해 코드화된다 (CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시됨):
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact
attacttgc t ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtac t ggtatcagca gaagcccggc
aaagcaccta agctgctgat ctac gacaca agcaacctgg cctcc ggggt gccatctcgg
ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa
gatgccgcta cctactattg c cagcagtgg agcagctatc ctctgacc tt cggacagggg
actaaactgg aaatcaag.
gpA33 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:186)은 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKAS GYTFT GSWMN WVRQA PGQGLEWIG R IYPGDGETNY
NGKFKD RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR IY GNNVYFDV WG QGTTVTVSS.
gpA33 mAb 1의 CDRH1 (SEQ ID NO:187): GYTFTGSWMN
gpA33 mAb 1의 CDRH2 (SEQ ID NO:188): RIYPGDGETNYNGKFKD
gpA33 mAb 1의 CDRH3 (SEQ ID NO:189): IYGNNVYFDV
gpA33 mAb 1의 VH 도메인은 바람직하게는 아래에 제시된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:190)에 의해 코드화된다 (CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시됨):
caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag cgtgaaggtc
tcctgcaaag catca ggcta tacatttaca ggcagctgga tgaac tgggt gaggcaggct
ccaggacagg gactggagtg gatcggg cgc atctaccctg gagacggcga aactaactat
aatggaaagt tcaaagac cg agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac
atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc taga atttac
ggaaacaatg tctattttga cgtg tggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctcc.
7. Her2 -결합 도메인
발명은 또한 암 항원으로서의 Her2의 선택 및 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 암 항원-결합 도메인을 제공하기 위한 항-Her2 항체의 사용을 고려한다. 예시적인 항-Her2 항체는 "Her2 mAb 1" 및 트라스투주맙을 포함한다.
a. Her2 mAb 1
항-Her2 항체 "Her2 mAb 1"의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:191)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASFLES GVPS
RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ HYTTPPT FGQ GTKVEIKRT.
항-Her2 항체 "Her2 mAb 1"의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:192)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTAS GFNIK DTYIH WVKQR PEQGLEWIG R IYPTNGYTRY
DPKFQD KATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGASVTVSS.
b. 트라스투주맙
인간화된 항-Her2 항체 "트라스투주맙"의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:193)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASFLYS GVPS
RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ HYTTPPT FGQ GTKVEIKR.
인간화된 항-Her2 항체 "트라스투주맙"의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:193)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAA SGFNIK DTYIH WVRQA PGKGLEWVA R IYPTNGYTRY
ADSVKG RFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGTLVTVSS.
8. B7-H3-결합 도메인
신경아세포종 세포 상에서의 발현에 더불어, 인간 B7-H3은 또한 다양한 다른 암세포 (예컨대 위, 난소 및 비-소세포 폐암) 상에서도 발현되는 것으로 알려져 있다. B7-H3 단백질 발현은 면역조직학적으로 종양 셀라인에서 검출되었다 (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN -? Production," Nature Immunol. 2:269-274; Saatian, B. et al. (2004) "Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation," Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225; Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig -B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645); Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes," J. Immunol. 168:6294-6297). mRNA 발현은 심장, 신장, 고환, 폐, 간, 췌장, 전립선, 결장 및 골아세포에서 발견되었다 (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7). 단백질 수준에서, B7-H3은 인간의 간, 폐, 방광, 고환, 전립선, 유방, 태반 및 림프양 기관에서 발견된다 (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).
발명은 또한 암 항원으로서의 B7-H3의 선택 및 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 암 항원-결합 도메인을 제공하기 위한 항-B7-H3 항체의 사용을 고려한다. 예시적인 항-B7-H3 항체는 "B7-H3 mAb 1", "B7-H3 mAb 2" 및 "B7-H3 mAb 3"을 포함한다.
a. B7-H3 mAb 1
항-B7-H3 항체 "B7-H3 mAb 1"의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:195)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTC KASQNVD TNVA WYQQKP GQSPKALIY S ASYRYS GVPD
RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFC QQ YNNYPFT FGS GTKLEIK.
항-B7-H3 항체 "B7-H3 mAb 1"의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:196)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAAS GFTFS SFGMH WVRQA PEKGLEWVA Y ISSDSSAIYY
ADTVKG RFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTLTV SS.
b. B7-H3 mAb 2
항-B7-H3 항체 "B7-H3 mAb 2"의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:197)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS
RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK.
항-B7-H3 항체 "B7-H3 mAb 2"의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:198)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKAS GYTFT SYWMQ WVKQR PGQGLEWIG T IYPGDGDTRY
TQKFKG KATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GAGTTVTVSS.
c. B7-H3 mAb 3
항-B7-H3 항체 "B7-H3 mAb 3"의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:199)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITC RASESIY SYLA WYQQKQ GKSPQLLVY N TKTLPE GVPS
RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYC QH HYGTPPWT FG GGTNLEIK.
항-B7-H3 항체 "B7-H3 mAb 3"의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:200)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAAS GFTFS SYGMS WVRQT PDKRLEWVA T INSGGSNTYY
PDSLKG RFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCAR HD GGAMDY WGQG TSVTVSS.
9. EGF 수용체-결합 도메인 ( 세툭시맙 )
키메라 항-EGFR 항체 "세툭시맙"의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:201)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSC RASQSIG TNIH WYQQRT NGSPRLLIK Y ASESIS GIPS
RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYC QQ NNNWPTT FGA GTKLELKR.
키메라 항-EGFR 항체 "세툭시맙"의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:202)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVS GFSLT NYGVH WVRQS PGKGLEWLG V IWSGGNTDYN
TPFTS RLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCAR ALT YYDYEFAY WG QGTLVTVSA.
파니투무맙 (예컨대 Vectibix®, Amgen)은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 대체 EGF 수용체-결합 항체이다.
10. VEGF -결합 도메인 ( 베바시주맙 )
인간화된 항--VEGF 항체 "베바시주맙"의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:203)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC SASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKVLIY F TSSLHS GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YSTVPWT FGQ GTKVEIKR.
인간화된 항--VEGF 항체 "베바시주맙"의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:204)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GYTFT NYGMN WVRQA PGKGLEWVG W INTYTGEPTY
AADFKR RFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCA KYP HYYGSSHWYF DV WGQGTLVT VSS.
11. 5T4-결합 도메인
태아종양 단백질, 5T4는 신장, 대장, 전립선, 폐 암종 및 급성 림프아성 백혈병을 포함하여 많은 암종의 세포막에 나타난 종양-관련 단백질이다 (Boghaert, E.R. et al. (2008) "The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin," Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) "Naptumomab Estafenatox : Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin," Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6 참조). 예시적인 항-5T4 항체 ("5T4 mAb 1")의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨): (SEQ ID NO:308):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQGIS NYLA WFQQKP GKAPKSLIY R ANRLQS GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYC LQ YDDFPWT FGQ GTKLEIK.
그런 예시적인 항-5T4 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨): (SEQ ID NO:309):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKAS GYTFT SFWMH WVRQA PGQGLEWMG R IDPNRGGTEY
NEKAKS RVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAG GN PYYPMDY WGQ GTTVTVSS.
제 2 예시적인 항-5T4 항체 ("5T4 mAb 2")의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨): (SEQ ID NO:310):
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSIV YSNGNTYLE W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHVP FT FGSGTKLE IK.
그런 제 2 예시적인 항-5T4 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨): (SEQ ID NO:311):
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKAS GYTFT SYWIT WVKQR PGQGLEWIG D IYPGSGRANY
NEKFKS KATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCAR YG PLFTTVVDPN SYAMDY WGQG
TSVTVSS.
12. IL13Rα2 -결합 도메인
인터류킨-13 수용체 α2 (IL13Rα2)는 교아세포종, 결장암, 경부암, 췌장암, 다발성 흑색종, 골육종, 백혈병, 림프종, 전립선암 및 폐암을 포함하여 다양한 암에서 과잉발현된다 (PCT 공개 번호 WO 2008/146911; Brown, C.E. et al. (2013) "Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis," PLoS One. 18;8(10):e77769; Barderas, R. et al. (2012) "High Expression Of IL-13 Receptor A2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis," Cancer Res. 72(11):2780-2790; Kasaian, M.T. et al. (2011) "IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Rα2," J. Immunol. 187(1):561-569; Bozinov, O. et al. (2010) "Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas," Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621; Fujisawa, T. et al. (2009) "A novel role of interleukin-13 receptor alpha2 in pancreatic cancer invasion and metastasis," Cancer Res. 69(22):8678-8685). IL13Rα2에 면역특이적으로 결합하는 항체들은 면역특이적으로 입수 가능하다 (Abnova Corporation, Biorbyt, LifeSpan BioSciences, United States Biologicals; 또한 PCT 공개 번호 WO 2008/146911 참조). 예시적인 항-IL13Rα2 항체 ("hu08", PCT 공개 번호 WO 2014/072888)의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨): (SEQ ID NO:308):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVG TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRST GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYSAPWT FGG GTKVEIK.
그런 예시적인 항-IL13Rα2 항체 ("hu08", PCT 공개 번호 WO 2014/072888)의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨): (SEQ ID NO:309):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS RNGMS WVRQA PGKGLEWVA T VSSGGSYIYY
ADSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR QG TTALATRFFD V WGQGTLVTV SS.
13. 인티그린 베타6 -결합 도메인
인티그린β6 (ITGB6)은 상피 세포의 표면에 배타적으로 발현되고 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질들에 대한 수용체이다. ITGB6 발현은 종양 조직 (예컨대 대장 전립선, 신장암의 조직)에서 특이적으로 발현되지만, 일반적으로 건강한 상피 조직에서는 검출되지 않는다 (Liang, B. et al. (2014) "Integrinβ6 -targeted Immunoliposomes Mediate Tumor Specific Drug Delivery and Enhance Therapeutic Efficacy in Colon Carcinoma," Clin. Cancer Res. Dec 30. pii: clincanres.1194.2014). ITGB6에 면역특이적으로 결합하는 단클론성 항체들은 상업적으로 입수 가능하다 (예컨대 MAB2075Z 클론 R6G9,EMD Millipore; 또한 Weinacker, A. et al. (1994) "Role Of The Integrin Alpha V Beta 6 In Cell Attachment To Fibronectin . Heterologous Expression Of Intact And Secreted Forms Of The Receptor," J. Biol. Chem. 269:6940-6948 참조). 항-ITGB6 단클론성 항체들 3G9 및 8G6, 및 그것들의 변이체들은 PCT 공개 공보 WO 03/100033 및 WO 2007/008712에서 개시된다.
예시적인 인간화된 항-ITGB6 항체 (항체 3G9로부터 유도됨, PCT 공개 번호 WO 2007/008712)의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨): (SEQ ID NO:312):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC SASSSVS SSYLY WYQQK PGQAPRLLIY STSNLAS GIP
ARFSGSGSGT GFTLTISSLE PEDFAVYYC H QWSTYPPT FG GGTKVEIK.
그런 예시적인 인간화된 항-ITGB6 항체 (항체 3G9로부터 유도됨, PCT 공개 번호 WO 2007/008712)의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨): (SEQ ID NO:313):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS RYWMS WVRQA PGKGLEWVA S ISSGGRMYYP
FTVKG RFTIS RDNAKNSLYL QMNSLRAEDT AVYYCAR GSI YDGYYVFPY W GQGTLVTVSS.
예시적인 항-ITGB6 항체 (항체 8G6으로부터 유도됨, PCT 공개 번호 WO 2007/008712)의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨): (SEQ ID NO:314):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS TSSYSYMY WY QQKPGQAPRL LIY YASNLES
GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YC QHNWEIPF T FGGGTKVEI K.
그런 예시적인 항-ITGB6 항체 (항체 8G6으로부터 유도됨, PCT 공개 번호 WO 2007/008712)의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨): (SEQ ID NO:315):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTDYAMH WVRQAPGQGLEWMG VISTYYGNTNYNQKFKG RVTMT
RDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR GGLRRGDRPSLQYAMDY WGQGTLVTVSS.
14. 추가의 항암 항원-결합 도메인
본 발명에 따라 사용될 수 있는 추가의 항암 항원 항체들은 다음의 상업적으로 입수 가능한 항체들을 포함한다: CD30에 결합하는 브렌툭시맙 (예컨대 Adcetris®); CD33에 결합하는 겜투주맙 (예컨대 Mylotarg®, Wyeth); 및 CTLA-4에 결합하는 이필리무맙 (예컨대 Yervoy®).
C. 예시적인 이펙터 세포-결합 도메인
면역 시스템 이펙터 세포에 결합할 수 있는 항체들은 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들의 이펙터 세포-결합 도메인을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 특히 적합한 것은 CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD22, CD32B, CD64, B 세포 수용체 (BCR), T 세포 수용체 (TCR) 및 NKG2D 수용체에 결합하는 항체들이다.
1. CD2-결합 도메인
CD2는 T 세포 및 자연 살해 (NK) 세포의 표면에서 발견된 세포 부착 분자이다. CD2는 아마도 NK 세포 나노튜브 형성의 촉진제로서, NK 세포 세포독성을 증강시킨다 (Mace, E.M. et al. (2014) "Cell Biological Steps And Checkpoints In Accessing NK Cell Cytotoxicity," Immunol. Cell. Biol. 92(3):245-255; Comerci, C.J. et al. (2012) "CD2 Promotes Human Natural Killer Cell Membrane Nanotube Formation," PLoS One 7(10):e47664:1-12). 항-CD2 항체 (Lo-CD2a; ATCC 승인 번호: 11423)의 VL 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:102)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISC RSSQSLL HSSGNTYLN W LLQRTGQSPQ PLIY LVSKLE
S GVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYC MQFTHYP YT FGAGTKLE LK.
항-CD2 항체 (Lo-CD2a; ATCC 승인 번호: 11423)의 VH 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:103)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMY WVKQR PKQGLELVG R IDPEDGSIDY
VEKFKK KATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCAR GK FNYRFAY WGQ GTLVTVSS.
2. CD3-결합 도메인
바람직한 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들에 의해 결합된 제 2 에피토프는 CD3의 에피토프일 것이다. CD3은 4개의 구별되는 사슬로 구성된 T 세포 공동-수용체이다 (Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14). 포유류에서, 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬 및 2개의 CD3ε 사슬을 함유한다. 이들 사슬은 T 림프구의 활성화 신호를 생성하기 위하여 T 세포 수용체 (TCR)로서 알려져 있는 분자와 결합된다. CD3이 없을 때, TCR은 적절하게 조립되지 못하고 분해된다 (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer," Immunology 129(2):170-177). CD3은 모든 성숙한 T 세포의 막에 결합되는 것으로 발견되고, 실제로 다른 세포 유형에는 결합되지 않는다 (Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease," 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214-216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer," Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR /CD3 Complex," Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139 참조).
아래에서 논의되는 것과 같이, 본 발명을 예시하기 위하여, 이중-특이적 항-인간 CD3 x 항-인간 DR5-결합 분자들이 제조되었다. 그런 구성물에 사용된 항-인간 CD3 항체는 본원에서 "CD3 mAb 2"로서 표시된다. CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG.
CD3 mAb 2의 CDRL1 (SEQ ID NO:105): RSSTGAVTTSNYAN
CD3 mAb 2의 CDRL2 (SEQ ID NO:106): GTNKRAP
CD3 mAb 2의 CDRL3 (SEQ ID NO:107): ALWYSNLWV
CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:108)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK DRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS.
CD3 mAb 2의 CDRH1 (SEQ ID NO:109): TYAMN
CD3 mAb 2의 CDRH2 (SEQ ID NO:110): RIRSKYNNYATYYADSVK D
CD3 mAb 2의 CDRH3 (SEQ ID NO:111): HGNFGNSYVSWFAY
CD3 구성물의 일부에서, 변이체 VH 도메인이 CD3 mAb 2에 대해 사용되었다. 변이체 VH 도메인은 D65G 치환을 가지며, 그로써 아래에 제시된 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)을 가진다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK GRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS.
치환은 CDRH2가 아미노산 서열 (SEQ ID NO:113) RIRSKYNNYATYYADSVKG을 가지도록 유발한다. 치환된 위치 (D65G)는 이중 밑줄로 표시된다.
본원에서 사용된 제 2 항-CD3 항체는 항체 무로모납-CD3 "OKT3"이다 (Xu et al. (2000) "In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26); Norman, D.J. (1995) "Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3," Ther. Drug Monit. 17(6):615-620; Canafax, D.M. et al. (1987) "Monoclonal Antilymphocyte Antibody ( OKT3 ) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection," Pharmacotherapy 7(4):121-124; Swinnen, L.J. et al. (1993) "OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin -6 And Interleukin -10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation," Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670-678). OKT3의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:114)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTC SASSSVS YMN WYQQKSG TSPKRWIY DT SKLAS GVPAH
FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYC QQW SSNPFTF GSG TKLEINR.
OKT3의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:115)이 아래에 제시된다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMH WVKQR PGQGLEWIG Y INPSRGYTNY
NQKFKD KATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCAR YY DDHYCL DYWG QGTTLTVSS.
3. CD16-결합 도메인
CD16은 FcγRIIIA 수용체이다. CD16은 결합하여 응집하지만 단량체 인간 IgG는 아닌 호중구, 호산성 세포, 자연 살해 (NK) 세포 및 조직 대식세포에 의해 발현된다 (Peltz, G.A. et al. (1989) "Human Fc Gamma RIII : Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013-1017; Bachanova, V. et al. (2014) "NK Cells In Therapy Of Cancer," Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141; Miller, J.S. (2013) "Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic," Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253; Youinou, P. et al. (2002) "Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases," Autoimmun Rev. 1(1-2):13-19; Peipp, M. et al. (2002) "Bi -specific Antibodies Targeting Cancer Cells," Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511).
항-CD16 항체 3G8의 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:116)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC KASQSVD FDGDSFMN WY QQKPGQPPKL LIY TTSNLES
GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YC QQSNEDPY T FGGGTKLEI K.
항-CD16 항체 3G8의 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:117)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLR TSGMGVG WIR QPSGKGLEWL A HIWWDDDKR
YNPALKS RLT ISKDTSSNQV FLKIASVDTA DTATYYCAQ I NPAWFAY WGQ GTLVTVSA.
항-CD16 항체 A9의 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:118)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQAVVTQES ALTTSPGETV TLTC RSNTGT VTTSNYAN WV QEKPDHLFTG LIG HTNNRAP
GVPARFSGSL IGDKAALTIT GAQTEDEAIY FC ALWYNNHW V FGGGTKLTVL.
항-CD16 항체 A9의 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:119)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLQQSGAE LVRPGTSVKI SCKASGYTFT NYWLG WVKQR PGHGLEWIG D IYPGGGYTNY
NEKFKG KATV TADTSSRTAY VQVRSLTSED SAVYFCAR SA SWYFD VWGAR TTVTVSS.
4. CD19-결합 도메인
CD19 항원은 면역글로불린 Ig 수퍼패밀리에 속하는 유형 I 경막 글리코단백질이다. CD19는 여포성 수지상 세포 및 B 세포 상에 발현된다. pan B 세포 마커는 전체적인 B 세포 발달을 통해 발현되지만 미성숙 B 세포에 비교하여 성숙 세포에서 3배 더 높게 발현되는 것으로 여겨진다 (Raufi A. et al. (2013) "Targeting CD19 In B-Cell Lymphoma: Emerging Role Of SAR3419," Cancer Manag. Res. 5:225-233). 많은 CD19 항체들이 기술되었다 (예컨대 MD1342, MEDI-551 등) (Mei, H.E. et al. (2012) "Rationale Of Anti-CD19 Immunotherapy : An Option To Target Autoreactive Plasma Cells In Autoimmunity," Arthritis Res. Ther. 14(Suppl 5):S1:1-16). 항-CD19 결합 분자 "블리나투모맙"이 EP 2186527에 개시된다.
바람직한 항-CD19 항체 (HD37)의 VL 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:120)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DILITQSPKS MSMSVGERVT LTC KASENVV TYVS WYQQKP EQSPKLLIY G ASNRYT GVPD
RFTGSGSATD FTLTISSVQA EDLADYHC GQ GYSYPYT FGG GTKLEIKR.
항-CD19 항체 HD37의 VH 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:121)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLQQSGAE LVRPGSSVKI SCKAS GYAFS SYWMN WVKQR PGQGLEWIG Q IWPGDGDTNY
NGKFKG KATL TADESSSTAY MQLSSLASED SAVYFCAR RE TTTVGRYYYA MDY WGQGTSV TVSS.
5. CD20-결합 도메인
CD20은 성숙한 B 세포 상에 및 대부분의 B 세포 비-호지킨 림프종에서 발현되지만 초기 B 세포 선구 세포 또는 후기 성숙 원형질 세포 상에서는 발현되지 않는 B 세포-특이적 분화 항원이다 (Maloney, D.G. (2012) "Anti-CD20 Antibody Therapy for B-Cell Lymphomas," N. Engl. J. Med. 366:2008-2016). 리툭시맙은 예시적인 항-인간 CD20 항체이다. 키메라 항-CD20 항체 (리툭시맙)의 VL 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:122)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTC RASSSVS YIH WFQQKPG SSPKPWIY AT SNLAS GVPVR
FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYC QQW TSNPPT FGGG TKLEIKR.
항-CD20 항체 (리툭시맙)의 VH 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:123)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKAS GYTFT SYNMH WVKQT PGRGLEWIG A IYPGNGDTSY
NQKFKG KATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCAR ST YYGGDWYFNV WGAGTTVTVS A.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 대체 항-CD20 항체들은 다음의 상업적으로 입수 가능한 항체들을 포함한다: 이브리투모맙 (예컨대 Zevalin®, Spectrum Pharmaceuticals, Inc.), 오파투무맙 (예컨대 Arzerra®, SmithKlineGlaxo) 및 토 시투모맙 (예컨대 Bexxar®, GlaxoSmithKline).
6. CD22-결합 도메인
CD22는 성숙한 B 세포의 표면에서 및 더 적은 정도로 일부 미성숙 B 세포 상에서 발견되는 당 결합 경막 단백질이다 (WO 2011/032633; Poe, J.C. et al. (2012) "CD22 And Siglec -G In B Cell Function And Tolerance," Trends Immunol. 33(8):413-420; Chen, W.C. et al. (2012) "Targeting B Lymphoma With Nanoparticles Bearing Glycan Ligands Of CD22," Leuk. Lymphoma 53(2):208-210; Walker, J.A. (2008) "CD22: An Inhibitory Enigma," Immunology 123(3):314-325; Coleman, M. et al. (2003) "Epratuzumab : Targeting B-Cell Malignancies Through CD22," Clin. Cancer Res. 9(10 Pt 2):3991S-3994S).
항-CD22 항체 (에프라투주맙)의 VL 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:124)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MSC KSSQSVL YSANHKNYLA WYQQKPGKAP KLLIY WASTR
ES GVPSRFSG SGSGTDFTFT ISSLQPEDIA TYYC HQYLSS WT FGGGTKVQ IKR.
항-CD22 항체 (에프라투주맙)의 VH 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:125)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKAS GYTFT SYWLH WVRQA PGQGLEWIG Y INPRNDYTEY
NQNFKD KATI TADESTNTAY MELSSLRSED TAFYFCAR RD ITTFY WGQGT TVTVSS.
7. CD32B -결합 도메인
인간 CD32B에 결합하는 항체의 VL 도메인에 대한 바람직한 서열은 CD32B mAb 1 (SEQ ID NO:126)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTC RASQEIS GYLS WLQQKP DGTIKRLIY A ASTLDS GVPK
RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYC LQ YFSYPLT FGA GTKLELK.
인간 CD32B에 결합하는 CD32B mAb 1의 VH 도메인에 대한 바람직한 서열은 (SEQ ID NO:127)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEAS GFTFS DAWMD WVRQS PEKGLEWVA E IRNKAKNHAT
YYAESVIG RF TISRDDSKSS VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDY WGQGT TLTVSS.
8. CD64-결합 도메인
CD64는 FcγRI 수용체이고 단핵세포/대식세포, 수지상 세포 및 활성화된 과립구 상에 발현된다. 발현은 IFN-γ 자극에 의해 상향조절된다. CD64는 IgG 면역 복합체에 결합한다. CD64는 항원 포획, IgG/항원 복합체의 식세포 작용 및 항체-의존성 세포의 세포독성에서 역할을 담당한다 (WO 2006/002438).
인간 CD64에 결합하는 항체의 VL 도메인에 대한 아미노산 서열은 CD64 mAb 1 (SEQ ID NO:128)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS SYLA WYQQKP GQAPRLLIY D ASSRAT GIPA
RFGGSGSGGT DFTLTISSLE PEDFAVYYC Q LRSNWPPYT F GQGTKLEIK.
인간 CD64에 결합하는 항체의 VH 도메인에 대한 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:129)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFIFS GYGMH WVRQA PGKGLEWVT V IWYDGSNKYY
ADSVKG RFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAR DT GDRFFDY WGQ GTLVTVSS.
9. BCR /CD79-결합 도메인
BCR은 CD79의 비-공유적으로 결합된 α 및 β 하위유닛 (각각 "CD79a" 및 "CD79b")과 함께 BCR 복합체를 형성하는 막 면역글로불린으로 구성된다. CD79a 및 CD79b는 신호 변환에 필요한 보존된 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프 ("ITAM")을 함유하는 신호 변환 하위유닛이다 (Dylke, J. et al. (2007) "Role Of The Extracellular And Transmembrane Domain Of Ig-Alpha/Beta In Assembly Of The B Cell Antigen Receptor ( BCR )," Immunol. Lett. 112(1):47-57; Cambier, J.C. (1995) "New Nomenclature For The Reth Motif (or ARH1/TAM/ARAM/YXXL)," Immunol. Today 16:110). 다가 항원에 의한 BCR 복합체의 응집은 CD79a 및 CD79b ITAM의 트랜스인산화 및 수용체-결합된 키나아제의 활성화를 시작하게 한다 (DeFranco, A.L. (1997) "The Complexity Of Signaling Pathways Activated By The BCR," Curr. Opin. Immunol. 9:296-308; Kurosaki, T. (1997) "Molecular Mechanisms In B Cell Antigen Receptor Signaling," Curr. Opin. Immunol. 9:309-318; Kim, K.M. et al. (1993) "Signalling Function Of The B-Cell Antigen Receptors," Immun. Rev. 132:125-146). 인산화된 ITAM은 추가의 이펙터, 예컨대 PI3K, PLC-γ 및 Ras/MAPK 경로의 구성원들을 충원한다. 이들 신호화 사건들은 B 세포 증식 및 T 헬퍼 ("Th") 세포와의 후속적인 상호작용에 대한 B 세포를 프라임하기 위해 필요한 활성화 마커 (예컨대 MHCII 및 CD86)의 증가된 발현 둘 다에 기여한다.
인간 B 세포 수용체 (CD79)에 결합하는 항체의 VL 도메인에 대한 바람직한 서열은 CD79 mAb 1 (SEQ ID NO:130)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISC KSSQSLL DTDGKTYLN W LLQRPQGSPN RLIY LVSKLD
S GVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYC WQGTHFP LT FGAGTKLE LK.
인간 B 세포 수용체 (CD79)에 결합하는 CD79 mAb 1 항체의 VH 도메인에 대한 바람직한 서열은 (SEQ ID NO:131)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKA SGYTFT SYWMN WVKQR PGQGLEWIG M VDPSDSETHY
NQMFKD KATL TVDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARAM GYWGQGTSVT VSS.
10. T 세포 수용체-결합 도메인
대체 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들에 의해 결합된 제 2 에피토프는 T 세포 수용체 (TCR)의 에피토프일 것이다. T 세포 수용체는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의해 자연적으로 발현되며, 그런 세포들이 항원 제공 세포의 부류 I 또는 부류 II MHC 단백질들에 의해 결합되고 제공되는 항원성 펩티드를 인식하는 것을 허용한다. TCR에 의한 pMHC (펩티드-MHC) 복합체의 인식은 사이토킨의 생성 및 항원 제공 세포의 용해를 유도하는 세포 면역 반응의 증식을 개시한다 (예컨대 Armstrong, K.M. et al. (2008) "Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide- MHC Complexes," Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) "Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy," Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) "Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation," Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes," Am. J. Ther. 12(6):534-550 참조). CD3은 TCR에 결합하는 수용체이다 (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer," Immunology 129(2):170-177; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex," Immunol. Rev. 232(1):7-21; St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) "Novel Targeted Therapies For Autoimmunity," Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657; Baeuerle, P.A. et al. (Epub 2009 Jun 9) "Bi-specific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944; Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) "T Cell Activation," Annu. Rev. Immunol. 27:591-619; Renders, L. et al. (2003) "Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression," Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309).
T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체들은 항-TCR 항체 BMA 031을 포함한다 (EP 0403156; Kurrle, R. et al. (1989) "BMA 031 - A TCR -Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application," Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019; Nashan, B. et al. (1987) "Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex," Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human ?/β T Cell," J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human ?/β T Cell Receptor," J. Immunol. 147(12):4366-4373).
항-TCR 항체 BMA 031의 VL 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:132) 이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC SATSSVS YMH WYQQKPG KAPKRWIY DT SKLAS GVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYC QQW SSNPLT FGQG TKLEIK.
항-TCR 항체 BMA 031의 VH 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:133) 이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYKFT SYVMH WVRQA PGQGLEWIG Y INPYNDVTKY
NEKFKG RVTI TADKSTSTAY LQMNSLRSED TAVHYCAR GS YYDYDGFVY W GQGTLVTVSS.
11. NKG2D 수용체-결합 도메인
대체 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들에 의해 결합된 제 2 에피토프는 NKG2D 수용체의 에피토프일 것이다. NKG2D 수용체는 모든 인간 (및 다른 포유류) 자연 살해 세포 상에 (Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D , A Receptor For Stress-Inducible MICA," Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing," Immunity 17(1):19-29) 뿐만 아니라 모든 CD8+ T 세포 상에 (Groh, V. et al. (2001) "Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells," Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing," Immunity 17(1):19-29) 발현된다. 그런 결합 리간드, 및 특히 정상 세포상에는 발현되지 않는 것들은 조직적합성 60 (H60) 분자, 레틴산 초기 유도성 유전자-1 (RAE-1)의 생성물 및 쥐과 UL16-결합 단백유사 전사물 1 (MULT1)을 포함한다 (Raulet D.H. (2003) "Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands," Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) "Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand -Expressing Tumor Cells," Blood 106:1711-1717). NKG2D 수용체에 특이적으로 결합하는 항체들은 KYK-2.0을 포함한다 (Kwong, KY et al. (2008) "Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity," J. Mol. Biol. 384:1143-1156; 및 PCT/US09/54911).
항-NKG2D 항체 KYK-1.0의 VL 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:134)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QPVLTQPSSV SVAPGETARI PC GGDDIETK SVH WYQQKPG QAPVLVIY DD DDRPS GIPER
FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYC QVW DDNNDEWV FG GGTQLTVL.
항-NKG2D 항체 KYK-1.0의 VH 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:135)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMH WVRQA PGKGLEWVA F IRYDGSNKYY
ADSVKG RFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAK DR FGYYLDY WGQ GTLVTVSS.
항-NKG2D 항체 KYK-2.0의 VL 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:136)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QSALTQPASV SGSPGQSITI SC SGSSSNIG NNAVN WYQQL PGKAPKLLIY YDDLLPS GVS
DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYC A AWDDSLNGPV FGGGTKLTVL.
항-NKG2D 항체 KYK-2.0의 VH 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:137)이다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMH WVRQA PGKGLEWVA F IRYDGSNKYY
ADSVKG RFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK DR GLGDGTYFDY WGQGTTVTVS S.
D. 본 발명의 바람직한 삼중특이적 결합 분자들
1. 바람직한 Fc 도메인
2개의 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인은 세포 Fc 수용체 ( FcγR )에 의해 인식되는 도메인인 Fc 도메인을 형성하기 위해 상호작용한다. 본원에서 사용되는 용어 "Fc 도메인"은 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 규정하기 위해 사용된다. 예시적인 인간 IgG1의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:1)이다:
Figure pct00002
본 명세서 전체를 통해, IgG 중쇄의 잔기들의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) (분명히 본원에 참조로 포함됨)에서와 같이 EU 색인의 넘버링이다. "Kabat에서와 같은 EU 색인"은 인간 IgG1 EU 항체의 넘버링을 나타낸다. 면역글로불린의 성숙한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로부터의 아미노산들은 사슬의 아미노산의 위치에 의해 표시된다. Kabat은 항체들에 대한 수많은 아미노산 서열을 기술하고 있고, 각 하위그룹에 대해 아미노산 일치 서열을 확인하였으며, 각 아미노산에 대해 잔기 번호르 배정하였다. Kabat의 넘버링 도식은 보존된 아미노산에 대한 참조에 의해 Kabat의 일치 서열들 중 하나와 의문의 항체를 일렬배열함으로써 그의 개요서에 포함되지 않는 항체들에도 확장될 수 있다. 잔기 번호를 배정하기 위한 이 방법은 그 분야애서 표준이 되었고 키메라 또는 인간화된 변이체들을 포함하여 상이한 항체들의 동등한 위치에 있는 아미노산들을 쉽게 확인한다. 예를 들어, 인간 항체 경쇄의 위치 50에 있는 아미노산은 마우스 항체 경쇄의 위치 50에 있는 아미노산과 동등한 위치를 차지한다.
경계가 약간 달라질 수 있긴 하지만, 인간 IgG Fc 도메인의 CH2 도메인은 통상 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 인간 IgG의 아미노산 231로부터 아미노산 341까지 뻗어있다. 인간 IgG의 CH3 도메인은 통상 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 아미노산 342로부터 아미노산 447까지 뻗어있다. "힌지 영역" 또는 "힌지 도메인"은 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216으로부터 Pro230까지 신장되는 것으로 규정된다.
다형태는 항체 불변 영역 내에서 많은 상이한 위치 (예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만, Kabat에서 나타난 바와 같은 EU 색인에 의해 넘버링된 위치 270, 272, 312, 315, 356 및 358을 포함하는 Fc 위치들)에서 관찰되었고, 그로써 제공된 서열과 선행기술의 서열 사이에 약간의 차이가 있을 수 있다. 인간 면역글로불린의 다형태는 잘-특성화되어 있다. 현재, 18 Gm의 알로타입이 알려져 있다: G1m (1, 2, 3, 17) 또는 G1m (a, x, f, z), G2m (23) 또는 G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) 또는 G3m (b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.:50, 199-211). 특히 본 발명의 항체들이 어떠한 면역글로불린 유전자의 어떠한 알로타입, 아이소알로타입 또는 하플로타입을 포함할 수 있고, 본원에 제공된 서열들의 알로타입, 아이소알로타입 또는 하플로타입에 한정되지 않는 것으로 고려된다.
활성화 및 억제 신호는 그것들이 Fc 도메인에 결찰된 후에 Fc 수용체 (FcγR)를 통해 변환된다. 이들 정반대되는 반대 기능은 상이한 수용체 아이소형태들 중의 구조적 차이로부터 유발된다. 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 또는 면역수용체 타이로신-기반 억제 모티프 (ITIM)으로 불리는 수용체의 세포질 신호화 도메인 내의 두 개의 구별되는 도메인들은 상이한 반응을 설명해준다. 이들 구조에 대한 상이한 세포질 효소들의 충원은 FcγR-중재된 세포 반응의 결과를 나타낸다. ITAM-함유 FcγR 복합체는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA를 포함하는 반면, ITIM-함유 복합체는 FcγRIIB만을 포함한다. 인간 호중구는 FcγRIIA 유전자를 발현한다. 면역 복합체 또는 특이적인 항체 교차-결합을 통한 FcγRIIA 클러스터링은 ITAM 인산화를 용이하게 하는 수용체-결합된 키나아제를 따라 ITAM을 응집시키는 작용을 한다. ITAM 인산화는 Syk 키나아제에 대한 도킹 (docking) 부위로서 작용하고, 그것의 활성화는 하류 기질 (예컨대 PI3K)의 활성화를 초래한다. 세포 활성화는 전염증성 중재자의 방출을 유도한다. FcγRIIB 유전자는 B 림프구 상에 발현된다; 그것의 세포외 도메인은 FcγRIIA에 96% 동일하고 구별할 수 없는 방식으로 IgG 복합체에 결합한다. FcγRIIB의 세포질 도메인에서의 ITIM의 존재는 FcγR의 이런 억제 하위부류를 규정한다. 최근 이런 억제의 분자적 기초가 수립되었다. 활성화 FcγR과 함께 공동-결찰될 때, FcγRIIB의 ITIM은 인산화되고 이노시톨 폴리포스페이트 5'-포스파타제의 SH2 도메인 (SHIP)을 끌어당기는데, 그것은 ITAM-함유 FcγR-중재된 타이로신 키나아제 활성화의 결과로서 방출된 포스포이노시톨 메신저를 가수분해하고, 따라서 세포내 Ca++의 유입을 방지한다. 그로써 FcγRIIB의 교차-결합은 FcγR 결찰에 대한 활성화 반응을 약화시키고 세포 반응성을 억제한다. 그로써 B 세포 활성화, B 세포 증식 및 항체 분비는 중지된다.
본 발명의 결합 분자들의 Fc 도메인은 완전한 Fc 도메인 (예컨대 완전한 IgG Fc 도메인) 또는 완전한 Fc 도메인의 단지 단편일 수 있다. 비록 본 발명의 이중-특이적 일가 Fc 다이아바디의 Fc 도메인이 하나 이상의 Fc 수용체 (예컨대 FcγR(들))에 결합하는 능력을 갖고 있긴 하지만, 보다 바람직하게 그런 Fc 도메인은 FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)에 대해 변경된 결합을 유발하거나 (야생형 Fc 도메인에 의해 나타나는 결합에 관련하여) 또는 억제 수용체(들)에 결합하는 그런 Fc 도메인의 능력을 실질적으로 제거할 것이다. 그러므로, 본 발명의 Fc 도메인-함유 다이아바디의 Fc 도메인은 완전한 Fc 도메인의 일부 또는 전부의 CH2 도메인 및/또는 일부 또는 전부의 CH3 도메인을 포함하거나, 또는 변이체 CH2 및/또는 변이체 CH3 서열 (예를 들어 완전한 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 도메인과 관련하여 하나 이상의 삽입 및/또는 하나 이상의 결실을 포함할 수 있음)을 포함할 수 있다. 그런 Fc 도메인들은 비-Fc 폴리펩티드 부분을 포함하거나, 또는 비-자연적으로 완전한 Fc 도메인의 부분을 포함하거나, 또는 CH2 및/또는 CH3 도메인의 비-자연적으로 발생하는 배향 (예컨대, 예를 들면 2개의 CH2 도메인 또는 2개의 CH3 도메인, 또는 N-말단에서 C-말단 방향으로, CH2 도메인에 연결된 CH3 도메인 등)을 포함할 수 있다.
활성화 수용체 (예컨대 FcγRIIA (CD16A))에 대한 결합을 증가시키는 변형 및 억제 수용체 (예컨대 FcγRIIB (CD32B))에 대한 결합을 감소시키는 변형을 포함하여, 이펙터 기능을 변경시키는 것으로서 확인된 Fc 도메인 변형은 기술분야에 잘 알려져 있다 (예컨대 Stavenhagen, J.B. et al. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors," Cancer Res. 57(18):8882-8890).
특히, 본 발명의 Fc 도메인-함유 다이아바디의 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)에 대한 감소된 (또는 실질적으로는 없는) 결합 (야생형 Fc 도메인 (SEQ ID NO:1)에 의해 나타난 결합에 관련하여)을 나타내는 것이 바람직하다. 그런 변경된 결합을 중재할 수 있는 Fc 변이체 및 돌연변이 형태는 상기에서 기술된다. 바람직한 구체예에서 그런 다이아바디늬 제 1 및/또는 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 치환: L234A, L235A, F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L 중 어떠한 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개를 포함한다. CD32B에 대한 감소된 결합 및/또는 CD16A에 대한 증가된 결합을 가지는 인간 IgG1 Fc 도메인의 예시적인 변이체들은 F243L, R292P, Y300L, V305I 또는 P296L 치환을 함유한다. 이들 아미노산 치환은 인간 IgG1 Fc 도메인에 어떠한 조합으로든지 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 F243L, R292P 및 Y300L 치환을 함유한다. 다른 구체예에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P296L 치환을 함유한다. 한 구체예에서 그런 다이아바디의 제 1 및/또는 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 치환: L234A, L235A, N297G, N297Q 중 어떠한 1, 2 또는 3개를 포함한다. 다른 구체예에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 N297Q 치환, L234A 및 L235A 치환 또는 D265A 치환을 함유하고, 이들 치환은 FcR 결합을 없앤다. 다르게는, 고유하게 FcγRIIIA (CD16a)에 대한 감소된 (또는 실질적으로는 없는) 결합 및/또는 감소된 이펙터 기능 (야생형 IgG1 Fc 도메인 (SEQ ID NO:1)에 의해 나타난 결합에 관련하여)을 나타내는 CH2-CH3 도메인이 사용된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인-함유 다이아바디는 IgG2 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함한다. IgG4 Fc 도메인은 본 발명에 사용된 경우에 또한 가닥 교환의 발생률을 감소시키기 위하여, Kabat에 나타난 것과 같은 EU 색인에 의해 넘버링된 것과 같이 (Lu et al., (2008) "The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation," J Pharmaceutical Sciences 97:960-969) S228P와 같은 안정화 돌연변이의 도입을 포함한다. 기술분야에 알려져 있는 다른 돌연변이들이 IgG4 Fc 도메인 안에 도입될 수 있다 (Peters, P et al., (2012) "Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability," J. Biol. Chem., 287:24525-24533; PCT Patent Publication No: WO 2008/145142). N297A, L234A, L235A 및 D265A 치환이 이펙터 기능을 없애기 때문에, 이펙터 기능이 바람직한 상황에서, 이들 치환은 바람직하게는 사용되지 않을 것이다.
그런 폴리펩티드 사슬의 CH2 및/또는 CH3 도메인들은 서열에서 동일할 필요는 없고, 유리하게도 2개의 폴리펩티드 사슬 사이의 복합체화를 조성하기 위하여 변형된다. 예를 들어, 아미노산 치환 (바람직하게는 "손잡이 (knob)"를 형성하는 벌키 측면기를 포함하는 아미노산, 예컨대 트립토판으로의 치환)은 CH2 또는 CH3 도메인에 도입되어서 입체적 간섭이 유사하게 돌연변이된 도메인과의 상호작용을 방지하고 상보하는, 또는 수용하는 돌연변이가 엔지니어링되어 있는 (예컨대 글리신으로의 치환) 도메인, 즉 "구멍 (hole)"과 쌍을 이루도록 돌연변이된 도메인을 강요하게 될 것이다. 그런 돌연변이 세트는 삼중-특이적 결합 분자의 어떠한 2개의 폴리펩티드로 엔지니어링될 수 있다. 동종이량체화를 뛰어넘어 이종이량체화를 선호하도록 단백질을 엔지니어링하는 방법은, 특히 면역글로불린-유사 분자의 엔지니어링과 관련하여 기술분야에 잘 알려져 있고, 특히 면역글로불린-유사 분자의 엔지니어링과 관련하여, 본원에 포함된다 (예컨대 Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization ," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library," J. Mol. Biol. 270: 26-35, and Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization , Expression And Tumor Cell Lysis ," J. Immunol. Methods 296:95-101; 이 문헌들은 각각 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨). 바람직하게 "손잡이"는 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인 안에 엔지니어링되고 "구멍"은 다른 CH2-CH3-함유 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인 안에 엔지니어링될 수 있다. 그로써, "손잡이"는 그것의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 통해 제 1 폴리펩티드 사슬이 동종이량체화되는 것을 방지하는 것을 도울 것이다. CH2-CH3 "구멍-포함" 폴리펩티드 사슬은 CH2-CH3 "손잡이-포함" 폴리펩티드 사슬과 이종이량체화할 것이고, 또한 자체적으로 동종이량체화할 것이다. 바람직한 손잡이는 변형 T366W를 함유하도록 천연 IgG Fc 도메인을 변형시킴으로써 생성된다. 바람직한 구멍은 변형 T366S, L368A 및 Y407V를 함유하도록 천연 IgG Fc 도메인을 변형시킴으로써 생성된다. 최종 삼중-특이적 결합 분자로부터 "구멍-포함" 폴리펩티드 사슬 동종이량체를 정제하는 것을 보조하기 위하여, "구멍-포함" Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인의 단백질 A 결합 부위는 바람직하게는 위치 435에서의 아미노산 치환 (H435R)에 의해 돌연변이된다. 그러므로, "구멍-포함" Fc 도메인 동종이량체는 단백질 A에 결합하지 않을 것인 반면, 바람직한 삼중-특이적 결합 분자는 제 1 폴리펩티드 사슬 상의 단백질 A 결합 부위를 통해 단백질 A와 결합하는 능력을 보유할 것이다.
본 발명의 Fc 도메인-함유 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 바람직한 서열은 "손잡이-포함" 서열 (SEQ ID NO:52)을 가질 것이다:
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSL W C L VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN H YTQKS LSLSPGK.
2개의 폴리펩티드 사슬을 가지는 본 발명의 Fc 도메인-함유 다이아바디의 제 2 폴리펩티드 사슬 (또는 3개의 폴리펩티드 사슬을 가지는 Fc 도메인-함유 다이아바디의 제 3 폴리펩티드 사슬)의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 바람직한 서열은 "구멍-포함" 서열 (SEQ ID NO:53)을 가질 것이다:
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPGK.
주지하게 되는 바와 같이, SEQ ID NO:52 및 SEQ ID NO:53의 CH2-CH3 도메인은 알라닌으로의 위치 234에서의 치환 및 알라닌으로의 235에서의 치환을 포함하고, 그로써 FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)에 대한 감소된 (또는 실질적으로는 없는) (야생형 Fc 도메인 (SEQ ID NO:1)에 의해 나타난 결합에 관련하여) 결합을 나타내는 Fc 도메인을 형성한다.
제 1 폴리펩티드 사슬은 "손잡이-포함" CH2-CH3 서열, 예컨대 SEQ ID NO:52의 서열을 가지는 것이 바람직하다. 그러나, 인식되는 것과 같이, "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (예컨대 SEQ ID NO:53)이 제 1 폴리펩티드 사슬에 사용될 수 있을 것이고, 그 경우, "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (예컨대 SEQ ID NO:52)은 2개의 폴리펩티드 사슬을 가지는 본 발명의 Fc 도메인-함유 다이아바디의 제 2 폴리펩티드 사슬 (또는 3개의 폴리펩티드 사슬을 가지는 Fc 도메인-함유 다이아바디의 제 3 폴리펩티드 사슬)에 사용될 것이다.
2. 바람직한 제 1 폴리펩티드 사슬
본 발명의 바람직한 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬은 에피토프 I에 결합할 수 있는 가변 경쇄 도메인 (VL I ), 에피토프 II에 결합할 수 있는 가변 중쇄 도메인 (VH II ), 이종이량체-촉진 도메인 및 CH2-CH3 도메인을 포함할 것이다.
제 1 폴리펩티드의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인이 상이한 에피토프들을 향해 지시되기 때문에, 그것들은 에피토프 I 또는 에피토프 II 중 어느 하나에 결합할 수 있는 결합 도메인을 형성하기 위해 함께 결합할 수 없다. 제 1 폴리펩티드의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인은 이들 도메인의 회합을 실질적으로 방지하기에 충분히 짧은 개재 링커 펩티드에 의해 서로 떨어져 있다. "링커 1"로 명명된, 예시적인 링커는 서열 (SEQ ID NO:33): GGGSGGGG를 가진다.
제 1 폴리펩티드의 가변 중쇄 도메인 및 그 폴리펩티드의 이종이량체-촉진 도메인은 바람직하게는 1, 2, 3 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 개재된 링커 펩티드에 의해 서로 떨어져 있다. 바람직한 시스테인-함유 스페이서 펩티드 ("링커 2")는 SEQ ID NO:34: GGCGGG의 서열을 가진다.
본 발명의 분자들의 폴리펩티드 사슬에 CH2-CH3 도메인을 연결시키기 위해 사용될 수 있는 링커들은 ASTKG (SEQ ID NO:47), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48), LEPKSS (SEQ ID NO:49) 및 APSSSPME (SEQ ID NO:50), APSSS (SEQ ID NO:152) 및 GGG 또는 GCG를 포함한다. SEQ ID NO:49는 클로닝을 쉽게 하기 위해 GGG 또는 GCG 대신 사용될 수 있다. 추가로, SEQ ID NO:49는 SEQ ID NO:47 바로 뒤에 이어져서 대체 링커 (LEPKSSDKTHTCPPCP; SEQ ID NO:51)를 형성할 수 있다.
제 1 폴리펩티드의 이종이량체-촉진 도메인 및 제 2 폴리펩티드의 이종이량체-촉진 도메인은 동조적으로 선택된다. 도메인들은 서로 상이하며 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 회합을 촉진하기 위하여 서로와 결합하도록 디자인된다. 예를 들어, 이종이량체-촉진 도메인들 중 하나는 pH 7에서 음전하를 가지도록 엔지니어링될 것이고, 한편 두 개의 폴리펩티드 사슬 중 다른 것은 pH 7에서 양전하를 가지도록 엔지니어링될 것이다. 그런 하전된 도메인들의 존재는 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사이의 회합을 촉진하고, 그로써 이종이량체화를 조성한다. 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬에 사용된 도메인들이 그런 사슬들 사이의 이종이량체화를 조성하기 위해 서로 다른 한, 어떤 이종이량체-촉진 도메인이 어떤 사슬에 제공되는지는 중요하지 않다.
이종이량체-촉진 도메인들은 IgG CL 및 CH1 도메인이거나 또는 인간 IgG의 힌지 도메인으로부터 유도된 아미노산 서열 GVEPKSC (SEQ ID NO:35) 또는 VEPKSC (SEQ ID NO:36)를 가지는 펩티드일 수 있고, CL 도메인 대신에, 당업자는 인간 카파 경쇄의 C-말단의 6개의 아미노산 GFNRGEC (SEQ ID NO:37) 또는 FNRGEC (SEQ ID NO:38)를 사용할 수 있다.
그러나, 보다 바람직하게는, 그런 다이아바디의 이종이량체-촉진 도메인들은 적어도 6, 적어도 7 또는 적어도 8개의 하전된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 반대 전하의 1, 2, 3 또는 4개의 나란히 반복된 코일 도메인으로부터 형성된다 (Apostolovic, B. et al. (2008) "pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil," Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) "Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain," J. Molec. Biol. 312:221-228; Arndt, K.M. et al. (2002) "Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils," Structure 10:1235-1248; Boucher, C. et al. (2010) "Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions," Analytical Biochemistry 399:138-140; Cachia, P.J. et al. (2004) "Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy," J. Mol. Recognit. 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) "Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding," Biochemistry 42:1754-1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al. (2012) "Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag," Protein Science 21:511-519; Ghosh, T.S. et al. (2009) "End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures," Acta Crystallographica D65:1032-1041; Grigoryan, G. et al. (2008) "Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions," Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) "Designing Heterodimeric Two-Stranded ?-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity," J. Biol. Chem. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) "The d'--d--d′' Vertical Triad is Less Discriminating Than the a'--a--a' Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif," J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) "Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface," J. Molec. Biol. 366:1232-1242; Tripet, B. et al. (2002) "Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance," J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) "The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies," Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) "A Ligand -Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism," J. Gene Med. 10:355-367).
그런 반복된 코일 도메인은 정확한 반복이거나 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 제 1 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인은 8개의 음으로 하전된 아미노산 잔기의 서열을 포함할 수 있고 제 2 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인은 8개의 음으로 하전된 아미노산 잔기의 서열을 포함할 수 있다. 반대 전하의 코일이 다른 폴리펩티드 사슬에 대해 사용된다면, 어떤 코일이 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 사슬에 제공되는지는 중요하지 않다. 양으로 하전된 아미노산은 라이신, 아르기닌, 히스티딘 등일 수 있고 및/또는 음으로 하전된 아미노산은 글루탐산, 아스파르트산 등일 수 있다. 양으로 하전된 아미노산은 바람직하게는 라이신이고 및/또는 음으로 하전된 아미노산은 바람직하게는 글루탐산이다. 단일 이종이량체-촉진 도메인만이 사용되는 것이 가능하지만 (그런 도메인은 동종이량체화를 나타내고 그로써 이종이량체화를 촉진할 것이기 때문에), 본 발명의 다이아바디의 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬 둘 다 이종이량체-촉진 도메인을 함유하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 이종이량체-촉진 도메인들 중 하나는 4개의 나란한 "E-코일" 나선 도메인 (SEQ ID NO:39: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)을 포함할 것이고, 그것의 글루타메이트 잔기는 pH 7에서 음전하를 형성할 것인 한편, 이종이량체-촉진 도메인 중 다른 것은 4개의 나란한 "K-코일" 도메인 (SEQ ID NO:40: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)을 포함할 것이고, 그것의 라이신 잔기는 pH 7에서 양전하를 형성할 것이다. 그런 하전된 도메인의 존재는 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사이에서의 회합을 촉진하고, 그로써 이종이량체화를 조성한다. 특히 바람직한 것은 SEQ ID NO:39의 4개의 나란한 "E-코일" 나선 도메인 중 하나가 시스테인 잔기를 함유하도록 변형되어 있는 이종이량체-촉진 도메인: E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:41)이다. 마찬가지로, 특히 바람직한 것은 SEQ ID NO:40의 4개의 나란한 "K-코일" 나선 도메인 중 하나가 시스테인 잔기를 함유하도록 변형되어 있는 이종이량체-촉진 도메인: K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:42)이다.
WO 2012/018687에 개시된 것과 같이, 다이아바디의 생체 내 약물동역학적 특성을 향상시키기 위하여, 다이아바디는 그 다이아바디의 하나 이상의 말단에서 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분을 함유하도록 변형될 수 있다. 가장 바람직하게, 혈청-결합 단백질의 그런 폴리펩티드 부분은 다이아바디의 C-말단에 자리잡을 수 있다. 알부민은 혈장에서 가장 풍부한 단백질이고 인간에서 19일의 반감기를 가진다. 알부민은 다른 단백질에 비-공유적으로 결합하고 그로써 혈청 반감기를 연장시키는 것을 허용하는 여러 작은 분자 결합 부위를 가진다. 스트렙토코쿠스 스트레인 G418의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)은 안정한 3-나선 번들을 형성하는 46개의 아미노산 잔기로 구성되고 넓은 알부민-결합 특이성을 가진다 (Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules," J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). 그로써, 다이아바디의 생체 내 약물동역학적 특성을 향상시키기 위한 혈청-결합 단백질의 특히 바람직한 폴리펩티드 부분은 스트렙토코쿠스 단백질 G로부터의 알부민-결합 도메인 (ABD)이고, 보다 바람직하게는 스트렙토코쿠스 스트레인 G418의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3) (SEQ ID NO:43): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP이다.
WO 2012/162068 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것과 같이, SEQ ID NO:43의 "탈면역화된" 변이체는 MHC 부류 II 결합을 약화시키거나 제거하는 능력을 가진다. 조합적인 돌연변이 결과를 기반으로, 치환들의 다음의 조합이 그런 탈면역화된 알부민-결합 도메인을 형성하기 위해 바람직한 치환인 것으로 여겨진다: 66S/70S +71A; 66S/70S +79A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. 변이체 ABD는 변형 L64A, I65A 및 D79A 또는 변형 N66S, T70S 및 D79A를 가진다. 다음의 아미노산 서열:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65NNAKT VEGVKALI A 79E ILAALP (SEQ ID NO: 44),
또는 아미노산 서열:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66NAK S 70 VEGVKALI A 79E ILAALP (SEQ ID NO: 45)를 가지는 변이체 탈면역화된 ABD가 특히 바람직한데, 그런 탈면역화된 알부민-결합 도메인이 실질적으로 야생형 결합을 나타내는 한편 약화된 MHC 부류 II 결합을 제공하기 때문이다. 그러므로, 알부민-결합 도메인을 가지는 그런 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬은 E-코일 (또는 K-코일) 도메인과 알부민-결합 도메인 (바람직하게는 탈면역화된 알부민-결합 도메인) 사이에 개재하기 위해 그런 폴리펩티드 사슬의 E-코일 (또는 K-코일)에 대해 바람직하게 C-말단에 위치한 제 3 링커 (링커 3)를 함유한다. 그런 링커 3에 대한 바람직한 서열은 SEQ ID NO:46: GGGS이다.
그러므로, 요약하면, 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 바람직한 제 1 폴리펩티드 사슬은 다음 도메인 및 링커를 포함할 것이다: ( VL I 도메인)--(링커 1)--( VH II 도메인)-(링커 2)-(E-코일 이종이량체 -촉진 도메인)-(링커 3)-(손잡이-포함 CH2-CH3 도메인).
3. 대체 제 1 폴리펩티드 사슬
한 구체예에서, 상기-기술된 도메인의 배향은 N-말단에서 C-말단 방향으로일 것이다. 그러나, 본 발명은 또한 그것의 변이를 포함하며, 이때 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인들의 배향은 다음과 같다: NH 2 -(손잡이-포함 CH3-CH2 도메인)-( VL I 도메인)-(링커 1)─( VH II 도메인)-(시스테인-함유 도메인 링커 2)-(E-코일 이종이량체 -촉진 도메인). 바람직하게, 시스테인-함유 도메인은 그런 CH2-CH3 도메인에 대해 N-말단에 존재한다. 예시적인 펩티드의 서열은 (SEQ ID NO:48): DKTHTCPPCP이다. 바람직하게 이런 구체예에서, CH3 도메인은 개재하는 펩티드 링커 (링커 4), 예컨대 (SEQ ID NO:152): APSSS의 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:50) APSSSPME를 가지는 링커에 의해 VLI 도메인으로부터 떨어져 있다.
4. 바람직한 제 2 폴리펩티드 사슬
그런 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 에피토프 II에 결합할 수 있는 가변 경쇄 도메인 (VL II ), 에피토프 I에 결합할 수 있는 가변 중쇄 도메인 (VH I ) 및 이종이량체-촉진 도메인을 포함할 것이다.
제 2 폴리펩티드의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인은 상이한 에피토프들을 향해 지시되기 때문에, 그것들은 에피토프 I 또는 에피토프 II 중 어느 하나에 결합할 수 있는 결합 도메인을 형성하기 위해 함께 결합할 수 없다. 제 2 폴리펩티드의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인은 이들 도메인의 회합을 실질적으로 방지하기 위해 충분히 짧은 개재하는 링커 펩티드에 의해 서로 떨어져 있다. 서열 (SEQ ID NO:33): GGGSGGGG를 가지는 "링커 1"은 이 목적에 대한 예시적인 링커이다.
제 1 폴리펩티드 사슬의 경우에서와 같이, 제 2 폴리펩티드의 가변 중쇄 도메인 및 그 폴리펩티드의 이종이량체-촉진 도메인은 1, 2, 3 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 개재하는 링커 펩티드에 의해 바람직하게 서로로부터 떨어져 있다. 서열 (SEQ ID NO:34) GGCGGG를 가지는 "링커 2"는 이 목적에 대한 예시적인 링커이다. 그런 시스테인 잔기는 제 1 폴리펩티드의 가변 중쇄 도메인과 그 폴리펩티드의 이종이량체-촉진 도메인을 분리시키는 시스테인-함유 스페이서 펩티드의 시스테인 잔기와 이황화 결합을 형성할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 결합 분자의 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 서로에 공유적으로 결합된다.
상기에서 논의된 것과 같이, 제 2 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인은 제 1 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인과 동조하기 위하여 선택된다. 그러므로, 바람직한 구체예에서, 제 1 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인은 "K-코일" 도메인 (예컨대 SEQ ID NO:40) 또는 "E-코일" 도메인 (예컨대 SEQ ID NO:39) 중 어느 하나이다. 만약 시스테인-함유 E-코일 (SEQ ID NO:41)이 제 1 폴리펩티드 사슬에 사용된다면, 시스테인-함유 K-코일 (SEQ ID NO:42)이 바람직하게 제 2 폴리펩티드 사슬에 사용된다. 역으로, 만약 시스테인-함유 K-코일 (SEQ ID NO:42)이 제 1 폴리펩티드 사슬에 사용된다면, 시스테인-함유 E-코일 (SEQ ID NO:41)이 바람직하게 제 2 폴리펩티드 사슬에 사용된다. 제 1 폴리펩티드 사슬은 바람직하게 "E-코일" 도메인을 가질 것이기 때문에, 제 2 폴리펩티드 사슬은 바람직하게 "K-코일" 도메인을 가질 것이다.
제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 다이아바디의 폴리펩티드 사슬이기 때문에, 그것들은 에피토프 I을 인식하고 면역특이적으로 결합하는 도메인 I 결합 도메인 (VLA/VHA) 및 에피토프 II를 인식하고 면역특이적으로 결합하는 도메인 II 결합 도메인 (VLB/VHB)을 형성하기 위하여 함께 결합할 수 있다.
그러므로, 요약하면, 본 발명의 바람직한 결합 분자의 바람직한 제 2 폴리펩티드 사슬은 다음의 도메인 및 링커를 포함할 것이다: ( VL II 도메인)-(링커 1)─(VH I 도메인)-(링커 2)-(K-코일 이종이량체 -촉진 도메인).
5. 바람직한 제 3 폴리펩티드 사슬
본 발명의 바람직한 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 결합 도메인, 임의의 CH1-힌지 도메인 및 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다. 본 발명의 바람직한 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 결합 도메인은 에피토프 III에 결합할 수 있는 가변 중쇄 도메인 (VH III )일 수 있고, 그 경우, 본 발명의 바람직한 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬 (하기 논의됨)은 에피토프 III에 결합할 수 있는 가변 경쇄 도메인 (VL III )을 포함하는 폴리펩티드여서, 결합 도메인은 에피토프 III을 가지는 항원에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 바람직한 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 결합 도메인은 이펙터 세포 수용체-형 결합 도메인을 포함할 수 있고, 그 경우, 본 발명의 바람직한 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬 (하기 논의됨)은 상보하는 이펙터 세포 수용체-형 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드여서, 2개의 폴리펩티드 사슬의 상호작용은 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자에 물리특이적으로 결합할 수 있는 결합 도메인을 형성하게 된다. 제 3 폴리펩티드 사슬은 자연적으로 발생하는 항체들로부터 분리될 수 있다. 다르게는, 재조합적으로 구성될 수 있다. 예시적인 CH1 도메인은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:207):
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV
를 가지는 인간 IgG1 CH1 도메인이다.
SEQ ID NO:207의 인간 IgG1 CH1 도메인의 변이체는 (SEQ ID NO:208)이다:
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV.
예시적인 힌지 도메인은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:209): EPKSCDKTHTCPPCP를 가지는 인간 IgG1 힌지 도메인이다. 앞으로 인지되는 것과 같이, 예시적인 힌지 도메인은 사슬내 공유 결합에 참여할 수 있는 다중 시스테인 잔기를 포함한다 (Elkabetz et al. (2005) "Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains," J. Biol. Chem. 280:14402-14412).
야생형 CH2-CH3 도메인이 사용될 수 있긴 하지만, 상기에서 기술된 대로, 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인과의 이종이량체화를 촉진하는 변형된 CH2-CH3 도메인을 사용하는 것이 바람직하다.
그러므로 바람직하게, 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 그것의 아미노산 서열이 제 1 폴리펩티드에 사용된 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:52)에 상보하는 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인일 것이다. 상기에서 논의된 것과 같이, 구멍-포함 CH2-CH3 도메인은 바람직하게 단백질 A 결합 부위를 제거하기 위하여 위치 435에서 치환 (H435R)을 포함해야 한다. 제 3 폴리펩티드에 대한 H435R을 가지는 예시적인 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인은 SEQ ID NO:53이다.
앞으로 인지하게 되는 바, "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (예컨대 SEQ ID NO:52)은 제 3 폴리펩티드 사슬에 사용될 수 있었고, 그 경우 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (예컨대 SEQ ID NO:53)은 제 1 폴리펩티드 사슬에 사용될 것이다.
본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 (및 제 4) 폴리펩티드 사슬이 각각 이펙터 세포 수용체-형 결합 도메인의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 구체예에서, 부류 I MHC의 맥락에서 세포 표면에 나타난 항원을 인식하였다. 상기-기술된 T 세포 수용체-형 결합 도메인을 제조하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다 (예컨대 US2012/0294874A1).
그러므로, 요약하면, 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬은 다음의 도메인 및 링커를 포함할 것이다: ( VH III 도메인)-(임의의 CH1 도메인)--(임의의 힌지 도메인)-("구멍-포함" CH2-CH3 도메인) 또는 (T 세포 수용체-형 결합 도메인; 그것의 제 1 또는 제 2 폴리펩티드)-(임의의 CH1 도메인)--(임의의 힌지 도메인)-("구멍-포함" CH2-CH3 도메인).
6. 바람직한 제 4 폴리펩티드 사슬
본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬은 이펙터 세포 수용체-형 결합 도메인 (제 3 및 제 4 폴리펩티드 사슬이 이펙터 세포의 표면에서 발견되는 수용체에 대한 리간드를 형성함) 또는, 보다 바람직하게는, 에피토프 III에 면역특이적으로 결합하는 또는 제 3 폴리펩티드 사슬의 결합 도메인에 상보하는 상기-표시된 항체의 경쇄 중 어느 하나이다.
그러므로, 제 3 및 제 4 폴리펩티드가 Fab-형 결합 도메인을 형성하는 경우, 그런 제 4 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 에피토프 III에 결합할 수 있는 가변 경쇄 도메인 (VL III ), 및 제 3 폴리펩티드 사슬에의 공유 결합을 촉진하기 위한 도메인 또는 결합 도메인 및 제 3 폴리펩티드 사슬에의 공유 결합을 촉진하기 위한 그런 도메인을 포함한다. 그런 도메인은 CL 도메인 또는 그것의 시스테인-함유 부분, 예컨대 (SEQ ID NO:38) FNRGEC 또는 링커, 예컨대 링커 2 (서열 (SEQ ID NO:34) GGCGGG를 가짐)일 수 있다. 그런 링커 2와 이황화 결합을 형성하는 예시적인 시스테인-함유 펩티드는 아미노산 서열 VEPKSC ( SEQ ID NO:36) 또는 힌지 도메인을 포함한다.
제 4 폴리펩티드 사슬은 자연적으로 발생하는 항체들로부터 분리될 수 있다. 다르게는, 재조합적으로 구성될 수 있다. 바람직한 CL 도메인은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:210):
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD
SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
를 가지는 인간 IgG1 카파 도메인이다.
다르게는, 예시적인 CL 도메인은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:211):
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS
NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS
를 가지는 인간 IgG1 CL 람다2 도메인이다.
주지하게 되는 것처럼, 제 4 폴리펩티드 사슬의 CL 도메인 또는 다른 시스테인-함유 도메인은 시스테인 잔기를 포함한다. 그런 시스테인 잔기는 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH1 도메인의 시스테인 잔기에 공유적으로 결합할 수 있고 그로써 본 발명의 결합 분자의 제 3 및 제 4 폴리펩티드 사슬들은 서로에 대해 공유적으로 복합체를 형성한다.
추가적으로, 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인의 시스테인 잔기들은 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인의 시스테인 잔기들과 이황화 결합을 형성할 수 있다. 그로써 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합된다.
E. 변이체 Fc 도메인들
전통적인 면역 기능에서, 항체-항원 복합체와 면역 시스템의 세포들과의 상호작용은 항체-의존성 세포독성, 비만 세포 탈과립화 및 식세포 작용과 같은 이펙터 기능으로부터 면역조절 신호, 예컨대 림프구 증식 및 항체 분비를 조절하는 것에 이르기까지의 광범위한 반응을 초래한다. 이들 상호작용은 모두 조혈 세포 상의 특수화된 세포 표면 수용체에의 항체 또는 면역 복합체의 Fc 도메인의 결합을 통해 개시된다. 항체 및 면역 복합체에 의해 촉발된 세포 반응의 다양성은 3개의 Fc 수용체: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)의 구조적 이질성으로부터 유발된다. FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) 및 FcγRIII (CD16)는 활성화 (즉 면역 시스템 증강) 수용체이다; FcγRIIB (CD32B)는 억제 (WR 면역 시스템 약화) 수용체이다. 예시적인 IgG1 Fc 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:1)은 상기에서 제공된다.
Fc 도메인의 변형은 정상적으로 변경된 표현형, 예를 들면 변경된 혈청 반감기, 변경된 안정성, 세포 효소들에 대한 변경된 민감성 또는 변경된 이펙터 기능을 유도한다. 예를 들어 암을 치료하는데 있어 항체의 유효성을 증강시키기 위하여, 이펙터 기능과 관련하여 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이펙터 기능의 감소 또는 제거는 특정 경우에, 예를 들어 그것의 작용 메커니즘이 차단 또는 길항작용을 포함하지만 표적 항원을 포함하고 있는 세포의 살해는 아닌 항체의 경우에 바람직하다. 증가된 이펙터 기능은 일반적으로 비바람직한 세포, 예컨대 종양 및 외래 세포들에 대해 지시될 때 바람직한데, 이때 FcγR은 저 수준, 예를 들면 종양 특이적 B 세포에서 저 수준의 FcγRIIB로 발현된다 (예컨대 비-호지킨 림프종, CLL 및 버킷 림프종). 상기 구체예들에서, 부여된 또는 증강된 이펙터 기능 활성을 가지는 발명의 분자들은 이펙터 기능 활성의 증강된 효능이 바람직한 질환, 장애 또는 감염의 치료 및/또는 방지에 유용하다.
특정 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 야생형 Fc 도메인의 아미노산의 서열 (SEQ ID NO:1)에 대해 하나 이상의 변형 (예컨대 치환, 결실 또는 삽입)을 가지는 Fc 도메인을 포함하며, 그것은 하나 이상의 FcγR 수용체에 대해, Fc 도메인 및, 그로써 발명의 분자의 친화성 및 결합력을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 발명의 분자들은 야생형 Fc 도메인의 아미노산들에 대해 하나 이상의 변형을 가지는 Fc 도메인을 포함하며, 그것은 하나 이상의 FcγR 수용체에 대해, Fc 도메인 및, 그로써 발명의 분자의 친화성 및 결합력을 증가시킨다. 또 다른 구체예에서, 분자들은 상기 변이체가 Fc 도메인을 포함하지 않거나 야생형 Fc 도메인을 포함하는 분자와 관련하여, 증가된 ADCC 활성 및/또는 FcγRIIA에 대한 증가된 결합을 부여하거나 중재하는 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 대체 구체예에서, 분자들은 상기 변이체가 Fc 도메인을 포함하지 않거나 야생형 Fc 도메인을 포함하는 분자와 관련하여, 감소된 ADCC 활성 (또는 다른 이펙터 기능) 및/또는 FcγRIIB에 대한 증가된 결합을 부여하거나 중재하는 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 발명은 변이체 Fc 도메인을 포함하는 삼중-특이적 결합 분자들을 포함하며, 그 변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비교용 분자와 관련하여 어떠한 FcγR에 대한 검출 가능한 결합을 나타내지 않는다. 다른 구체예에서, 발명은 변이체 Fc 도메인을 포함하는 삼중-특이적 결합 분자들을 포함하며, 그 변이체 Fc 도메인은 단일 FcγR, 바람직하게는 FcγRIIA, FcγRIIB 또는 FcγRIIIA 중 하나에만 결합한다. 어떠한 그런 증가된 친화성 및/또는 결합력은 바람직하게는 원래의 분자 (변형된 Fc 도메인이 없는)가 세포에서 검출될 수 없을 때 저수준의 FcγR을 발현하는 세포에서, 또는 비-FcγR 수용체 표적 항원을 30,000 내지 20,000 분자/세포의 밀도로, 20,000 내지 10,000 분자/세포의 밀도로, 10,000 내지 5,000 분자/세포의 밀도로, 5,000 내지 1,000 분자/세포의 밀도로, 1,000 내지 200 분자/세포의 밀도로 또는 200 분자/세포 또는 그 미만 (그러나 적어도 10, 50, 100 또는 150 분자/세포)의 밀도로 발현하는 세포에서, FcγR 또는 FcγR-관련 활성에 대한 검출 가능한 결합의 정도를 시험관 내에서 측정함으로써 평가된다.
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 활성화 및/또는 억제성 Fcγ 수용체에 대한 변경된 친화성을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항체 또는 분자는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비교용 분자와 관련하여, FcγRIIB에 대한 증가된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된 친화성을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비교용 분자와 관련하여, FcγRIIB에 대한 감소된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 증가된 친화성을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비교용 분자와 관련하여, FcγRIIB에 대한 감소된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된 친화성을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 야생형 Fc 도메인을 가지는 비교용 분자와 관련하여, FcγRIIB에 대한 변하지 않는 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된 (또는 증가된) 친화성을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 면역글로불린이 증강된 이펙터 기능, 예컨대 항체-의존성 세포-중재된 세포독성을 가지도록 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 변경된 친화성을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 이펙터 세포 기능의 비-제한적 실례는 항체-의존성 세포-중재된 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 식세포작용, 식세포작용, 옵소닌화, 옵소닌성 식세포작용, 세포 결합, 로세팅 (rosetting), C1q 결합 및 보체 의존성 세포-중재된 세포독성을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 친화성 또는 이펙터 기능의 변경은 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비교용 분자와 관련하여, 적어도 2-배, 바람직하게는 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배, 적어도 10-배, 적어도 50-배 또는 적어도 100-배이다. 발명의 다른 구체예에서, 변이체 Fc 도메인은 하나 이상의 FcR에 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비교용 분자와 관련하여 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225% 또는 250% 더 큰 친화성으로 특이적으로 결합한다. 그런 측정은 생체 내 또는 시험관 내 분석에서 이루어질 수 잇고, 바람직한 구체예에서는 ELISA 또는 표면 플라스몬 공명 분석과 같은 시험관 내 분석일 수 있다.
상이한 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 변이체가 FcγR 수용체의 적어도 한 가지의 활성을 아고나이즈하거나, 또는 FcγR 수용체의 적어도 한 가지의 활성을 길항하는 그런 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 분자들은 FcγRIIB의 하나 이상의 활성, 예를 들면 B 세포 수용체-중재된 신호화, B 세포의 활성화, B 세포 증식, 항체 생성, B 세포의 세포내 칼슘 유입, 세포 주기 진전, FcγRI 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제, FcγRIIB의 인산화, SHIP 보충, SHIP 인산화 및 Shc와의 회합, 또는 FcγRIIB 신호 전환 경로에서 하나 이상의 하류 분자들 (예컨대 MAP 키나아제, JNK, p38 또는 Akt)의 활성을 길항하는 변이체를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 FcεRI의 하나 이상의 활성, 예를 들면 비만 세포 활성화, 칼슘 고정, 탈과립화, 사이토킨 생성 또는 세로토닌 방출을 아고나이즈하는 변이체를 포함한다.
특정 구체예에서, 분자들은 둘 이상의 IgG 아이소타입 (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)으로부터 Fc 도메인-포함 도메인을 포함한다. 다양한 IgG 아이소타입은 예를 들면 문헌들에 기술된 것과 같이, 그것들의 힌지 및/또는 Fc 도메인들의 아미노산 서열의 차이로 인해 혈청 반감기, 보충물-고정, FcγR 결합 친화성 및 이펙터 기능 활성 (예컨대 ADCC, CDC 등)을 포함한 상이한 물리적 및 기능적 특성들을 나타낸다 (Flesch and Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; 또는 Bruggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166:1351-1361). 이 유형의 변이체 Fc 도메인은 Fc-중재된 이펙터 기능 및/또는 결합 활성에 영향을 미치기 위해, 단독으로 사용되거나, 또는 아미노산 변형과 함께 사용될 수 있다. 그것과 함께, 아미노산 변형 및 IgG 힌지/Fc 도메인은 유사한 기능성 (예컨대 FcγRIIA에 대해 증가된 친화성)을 나타낼 수 있고 야생형 Fc 도메인을 포함하는 발명의 분자와 관련하여, 발명의 분자의 이펙터 기능성을 조절하기 위하여 중독적으로, 또는 보다 바람직하게는 상조적으로 작용할 수 있다. 다른 구체예에서, 아미노산 변형 및 IgG Fc 도메인은 반대의 기능성 (예컨대 각각 FcγRIIA에 대해 증가된 및 감소된 친화성)을 나타낼 수 있고, Fc 도메인을 포함하지 않거나 또는 동일한 아이소타입의 야생형 Fc 도메인을 포함하는 발명의 분자와 관련하여, 발명의 분자의 특이적인 기능성을 선택적으로 완화시키거나 감소시키기 위하여 작용할 수 있다.
바람직한 특정 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 변이체 Fc 도메인을 포함하고, 상기 변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 관련하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하여서, 그 분자는 FcR에 대한 변경된 친화성을 가지게 되고, 단 상기 변이체 Fc 도메인은 Sondermann, P. 등에 의해 개시된 것들과 같은 (Sondermann, P. et al. (2000) Nature 406:267-73) Fc-FcR 상호작용의 결정학상의 및 구조적 분석을 기반으로 하여 FcγR과의 직접적인 접촉을 만드는 위치에서 치환을 갖지 않아야 한다. FcγR과의 직접적인 접촉을 만드는 Fc 도메인 내의 위치들의 실례는 아미노산 잔기 234 내지 239 (힌지 영역), 아미노산 잔기 265 내지 269 (B/C 루프), 아미노산 잔기 297 내지 299 (C'/E 루프) 및 아미노산 산지 327 내지 332 (F/G 루프)이다. 일부 구체예에서, 발명의 분자들은 구조적 및 결정학상의 분석을 기반으로 FcγR과의 직접적인 접촉을 만들지 않는, 예컨대 Fc-FcγR 결합 부위 내에 있지 않는, 적어도 하나의 잔기의 변형을 포함하는 변이체 Fc 도메인들을 포함한다.
변이체 Fc 도메인들은 기술분야에 잘 알려져 있고, 어떠한 공지된 Fc 변이체든지, 기능적으로 분석된, 예컨대 NK 의존성 또는 대식세포 의존성 분석으로 분석되는 바 Fc 도메인 (또는 그것들의 일부)을 포함하는 발명의 분자에 의해 나타난 이펙터 기능을 부여하거나 변형시키기 위해 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이펙터 기능을 변경시키는 것으로서 확인된 Fc 도메인 변이체들은 안티바디 엔지니어링 테크놀로지 아트 (Antibody Engineering Technology Art)에 개시되어 있고, 그 문헌들에 개시된 어떠한 적합한 변이체든지 본 분자들에 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 하나 이상의 부위에 하나 이상의 아미노산 변형을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함하며, 그 변형(들)은 억제하는 FcγR (예컨대 FcγRIIB)과 관련하여 활성화 FcγR (예컨대 FcγRIA 또는 FcγRIIIA)에 대한 변이체 Fc 도메인의 친화성 비율을 (야생형 Fc 도메인과 관련하여) 변경시킨다.
Figure pct00003
특히 바람직한 것은 Fc 변이체가 1보다 큰 친화성 비율을 가지는 변이체 Fc 도메인 (야생형 Fc 도메인과 관련하여)을 가지는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들이다. 그런 분자들은 FcγR에 의해 중재된 이펙터 세포 기능 (예컨대 ADCC)의 증강된 효능이 바람직한 경우, 예컨대 암 또는 감염성 질환의 경우, 질환, 장애 또는 감염의 치료적 또는 예방적 치료 또는 그것들의 증상의 완화를 제공하는 데 특별히 사용될 수 있다. 대조적으로, 1 미만의 친화성 비율을 가지는 Fc 변이체는 이펙터 세포 기능의 감소된 효능을 중재한다. 하기 표 1은 친화성 비율이 1보다 크거나 작은 경우의 예시적인 단일, 이중, 삼중, 사중 및 오중 돌연변이를 열거한 것이다.
친화성 비율에 의해 열거된 예시적인 단일 및 다중 돌연변이들
친화성 비율에 의해 열거된 예시적인 단일 및 다중 돌연변이
단일 이중 삼중 사중 오중
친화성 비율 > 1
F243L
D270E
R292G
R292P		 F243L & R292P
F243L & Y300L
F243L & P396L
D270E & P396L
R292P & Y300L
R292P & V305I
R292P & P396L
Y300L & P396L
P396L & Q419H		 F243L, P247L & N421K
F243L, R292P & Y300L
F243L, R292P & V305I
F243L, R292P & P396L
F243L, Y300L & P396L
P247L, D270E & N421K
R255L, D270E & P396L
D270E, G316D & R416G
D270E, K392T & P396L
D270E, P396L & Q419H
V284M, R292L & K370N
R292P, Y300L & P396L		 L234F, F243L, R292P & Y300L
L235I, F243L, R292P & Y300L
L235Q, F243L, R292P & Y300L
F243L, P247L, D270E & N421K
F243L, R255L, D270E & P396L
F243L, D270E, G316D & R416G
F243L, D270E, K392T & P396L
F243L, D270E, P396L & Q419H
F243L, R292P, Y300L, & P396L
F243L, R292P, V305I & P396L
P247L, D270E, Y300L & N421K
R255L, D270E, R292G & P396L
R255L, D270E, Y300L & P396L
D270E, G316D, P396L & R416G		 L235V, F243L, R292P, Y300L & P396L
L235P, F243L, R292P, Y300L & P396L
F243L, R292P, V305I, Y300L & P396L
친화성 비율 < 1
Y300L
P396L		 F243L & P396L
P247L & N421K
R255L & P396L
R292P & V305I
K392T & P396L
P396L & Q419H		 F243L, R292P & V305I
특정 구체예에서, 변이체 Fc 도메인에서, 위치 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328 또는 330 중 어떠한 위치에서의 어떠한 아미노산 변형 (예컨대 치환) 및 바람직하게는 다음 잔기들: A240, I240, L241, L243, H244, N298, I328 또는 V330 중 하나 이상. 상이한 특정 구체예에서, 변이체 Fc 도메인에서, 위치 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 어떠한 위치에서의 어떠한 아미노산 변형 (또는 치환) 및 바람직하게는 다음의 잔기들: H280, Q280, Y280, G290, S290, T290, Y290, N294, K295, P296, D298, N298, P298, V298, I300 또는 L300 중 하나 이상.
바람직한 구체예에서, 변경된 친화성으로 FcγR에 결합하는 변이체 Fc 도메인에서, 위치 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 어떠한 위치에서의 어떠한 아미노산 변형 (예컨대 치환). 바람직하게, 변이체 Fc 도메인은 다음 잔기들 중 어느 것을 가진다: A256, N268, Q272, D286, Q286, S286, A290, S290, A298, M301, A312, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, N326, S326, K330, T339, A333, A334, E334, H334, L334, M334, Q334, V334, K335, Q335, A359, A360 또는 A430.
상이한 구체예에서, 감소된 친화성으로 FcγR에 (그것의 Fc 도메인을 통해) 결합하는 변이체 Fc 도메인에서, 위치 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 어느 위치에서의 어떠한 아미노산 변형 (예컨대 치환).
상이한 구체예에서, 증강된 친화성으로 FcγR에 (그것의 Fc 도메인을 통해) 결합하는 변이체 Fc 도메인에서, 위치 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 또는 430 중 어느 위치에서의 어떠한 아미노산 변형 (예컨대 치환). 상이한 구체예에서, 증강된 친화성으로 FcγR에 결합하는 변이체 Fc 도메인에서, 다음의 잔기들 중 어떠한 잔기: A255, A256, A258, A267, A268, N268, A272, Q272, A276, A280, A283, A285, A286, D286, Q286, S286, A290, S290, M301, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, S326, K330, A331, Q335, A337 또는 A430.
바람직한 변이체는 다음의 어떠한 위치에서의 하나 이상의 변형을 포함한다: 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 또는 332.
특히 바람직한 변이체는 다음 A 내지 AI 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다:
Figure pct00004
또한 보다 특히 바람직한 변이체는 다음의 1 내지 105 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다:
Figure pct00005
Figure pct00006
한 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들은 Fc 도메인에 적어도 하나의 변형을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함할 것이다. 특정 구체예에서, 변이체 Fc 도메인은 L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하며, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링이다. 특정 구체예에서, 변이체 Fc 도메인은 다음을 포함한다:
(A) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환;
(B) (1) F243L 및 P396L;
(2) F243L 및 R292P; 및
(3) R292P 및 V305I
로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 치환;
(C) (1) F243L, R292P 및 Y300L;
(2) F243L, R292P 및 V305I;
(3) F243L, R292P 및 P396L; 및
(4) R292P, V305I 및 P396L
로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 3개의 치환;
(D) (1) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및
(2) F243L, R292P, V305I 및 P396L
로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 4개의 치환; 또는
(E) (1) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L; 및
(2) L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L
로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 5개의 치환.
다른 특정 구체예에서, 변이체 Fc 도메인은:
(A) F243L, R292P, 및 Y300L;
(B) L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 또는
(C) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L의 치환을 포함한다.
다른 구체예에서, 발명은 기술분야에 공지된 어떠한 Fc 변이체, 예컨대 Jefferis, B.J. et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG - Fc For FcgammaR : Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function," Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII , Fc Gamma RIII , And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R," J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc," J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4," J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities," Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3 -Core Oligosaccharide Interactions," Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains," J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath -1H," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44:111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide -Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors," FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11," Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564; 미국 특허 번호 5,624,821; 5,885,573; 6,194,551; 7,276,586; 및 7,317,091; 및 PCT 공개 번호 WO 00/42072 및 PCT WO 99/58572에 개시된 것들의 용도를 포함한다.
일부 구체예에서, 발명의 분자들은 추가로 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하여서, 하나 이상의 탄수화물 부분이 분자에 공유적으로 부착되게 할 수 있다. 바람직하게, Fc 도메인에 하나 이상의 글리코실화 부위 및/또는 하나 이상의 변형을 가지는 발명의 분자들은, 원래의 항체에 비하여, 증강된 항체-중재된 이펙터 기능, 예컨대 증강된 ADCC 활성을 부여하거나 가진다. 일부 구체예에서, 발명은 추가로 직접 또는 간접적으로 항체의 탄수화물 부분과 상호작용하는 것으로 알려진 아미노산들, 이를테면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 위치 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299 및 301에서의 아미노산들의 하나 이상의 변형을 포함하는 분자들을 포함한다. 직접 또는 간접적으로 항체의 탄수화물 부분과 상호작용하는 아미노산들은 기술분야에 알려져 있다. 예컨대 Jefferis et al. 1995 Immunology Letters, 44:111-7 참조 (본원에 전체 내용이 참조로 포함됨).
다른 구체예에서, 발명은 하나 이상의 글리코실화 부위를 분자의 하나 이상의 부위에 도입함으로써, 바람직하게는 분자의 기능성, 예컨대 항원 또는 FcR을 표적화하기 위한 결합 활성을 변경시키지 않으면서 변형된 분자들을 포함한다. 글리코실화 부위는 발명의 분자의 가변 및/또는 불변 영역 안에 도입될 수 있다. 본원에서 사용되는, "글리코실화 부위"는 올리고당 (즉 함께 연결되어 있는 둘 이상의 단순 당을 함유하는 탄수화물)이 특이적으로 및 공유적으로 부착될 항체에 어떠한 특수한 아미노산 서열을 포함한다. 올리고당 측쇄는 전형적으로 N- 또는 O-연쇄의 어느 하나를 통해 항체의 골격에 연결된다. N-연결된 글리코실화는 아스파라긴 잔기의 측쇄에의 올리고당 부분의 부착을 나타낸다. O-연결된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 예컨대 세린, 트레오닌에 대한 올리고당 부분의 부착을 나타낸다. 발명의 분자들은 N-연결된 및 O-연결된 글리코실화 부위를 포함하여, 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함할 수 있다. 기술분야에 공지되어 있는 N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화를 위한 어떠한 글리코실화 부위든지 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예시적인 N-연결된 글리코실화 부위는 아미노산 서열: Asn-X-Thr/Ser이고, 이때 X는 어떠한 아미노산일 수 있고 Thr/Ser는 트레오닌 또는 세린을 나타낸다. 그런 부위 또는 부위들은 본 발명에 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들을 사용하여 발명의 분자 안에 도입될 수 있다 (예를 들면 In vitro Mutagenesis, Recombinant DNA: A Short Course, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116 참조, 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨). 글리코실화 부위를 발명의 분자에 도입시키기 위한 예시적인 방법은 분자의 아미노산을 변형 또는 돌연변이시켜서 원하는 Asn-X-Thr/Ser 서열이 얻어지는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 발명은 글리코실화 부위를 첨가하거나 결실시킴으로써 발명의 분자의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법을 포함한다. 항체들 (및 항체 도메인을 포함하는 분자들)의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있고 발명에 포함된다. 예컨대 미국 특허 번호 6,218,149; EP 0 359 096 B1; 미국 특허 공개 번호 US 2002/0028486; WO 03/035835; 미국 특허 공개 번호 2003/0115614; 미국 특허 번호 6,218,149; 미국 특허 번호 6,472,511; 문헌들은 모두 참조로 전체 내용이 본원에 포함됨. 다른 구체예에서, 발명은 분자의 하나 이상의 내인성 탄수화물 부분을 결실시킴으로써 발명의 분자의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 발명은 297에 인접한 위치들을 변형시킴으로써, 항체의 Fc 도메인의 글리코실화 부위를 이동시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 발명은 위치 296을 변형시켜서 위치 297이 아닌 위치 296이 글리코실화되는 것을 포함한다.
이펙터 기능은 하나 이상의 시스테인 잔기를 Fc 도메인 안에 도입시키는 것과 같은 기법에 의해 변형될 수 있고, 그로써 이 영역에서 사슬간 이황화 결합 형성이 허용됨으로써 향상된 내재화 능력 및/또는 증가된 보충물-중재된 세포 살해 및 ADCC를 가지는 동종이량체 항체의 생성이 초래된다 (Caron, P.C. et al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies," J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) "A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity," J. Immunol. 148(9):2918-2922). 증강된 항종양 활성을 가지는 동종이량체 항체들은 또한 문헌 (Wolff, E.A. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers : Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice," Cancer Research 53:2560-2565)에 기술된 이종이중기능성 교차-결합제를 사용하여 제조될 수 있다. 다르게는, 이중 Fc 도메인을 가지는 항체가 엔지니어링될 수 있고 그로써 증강된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다 (Stevenson, G.T. et al. (1989) "A Chimeric Antibody With Dual Fc Domains ( bisFabFc ) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge," Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).
III. 예시적인 삼중특이적 결합 분자들
F. gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1
4개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 예시적인 삼중-특이적 결합 분자가 구성되었다. 삼중-특이적 결합 분자는 gpA33 mAb 1의 VL 및 VH 도메인, 항체 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 및 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 포함하고, 따라서 "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1"로 표시되었다. 이 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:212)이다:
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG
GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
SEQ ID NO:212에서, 아미노산 잔기 1 내지 106은 gpA33 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:181)에 해당하고, 잔기 107 내지 114는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 115 내지 239는 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 240 내지 245는 GGCGGG 링커 (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 246 내지 273은 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:39))에 해당하고, 잔기 274 내지 276은 링커 GGG이며, 잔기 277 내지 286은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48)이고, 잔기 287 내지 503은 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:52)이다.
SEQ ID NO:212를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:213이다:
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact
attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc
aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg
ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa
gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag
tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga
ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag
tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg
aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat
tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga
ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag
gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac
acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaaa.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:214)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG
KFKDRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC
GGGKVAALKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E.
SEQ ID NO:214에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 237은 gpA33 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:186)에 해당하고, 잔기 238 내지 243은 링커 GGCGGG (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 244 내지 271은 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)이다.
SEQ ID NO:214를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:215)이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc
cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc
aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga
cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga
aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag
ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac
aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt
ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc
gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:216)이다:
EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE INPDSNTINY
TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS
SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG
GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE
EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR
WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG K.
SEQ ID NO:216에서, 아미노산 잔기 1 내지 121은 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:8)에 해당하고, 잔기 122 내지 219는 변형된 CH1 도메인 (SEQ ID NO:208)에 해당하며, 잔기 220 내지 234는 링커 (SEQ ID NO:209)에 해당하고, 잔기 235 내지 451은 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:53)에 해당한다.
SEQ ID NO:216을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:217)이다:
gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc
tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct
ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat
acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat
ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc
tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct
tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag
gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:218)이다:
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV LIFLSSNLDS
GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC.
SEQ ID NO:218에서, 아미노산 잔기 1 내지 111은 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:3)에 해당하고, 잔기 112 내지 218은 CL 카파 도메인 (SEQ ID NO:210)에 해당한다.
SEQ ID NO:218을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:219)이다:
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac
caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat
cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt.
G. gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2
4개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 제 2 예시적인 삼중-특이적 결합 분자가 구성되었다. 삼중-특이적 결합 분자는 gpA33 mAb 1의 VL 및 VH 도메인, 항체 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 및 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 포함하고, 따라서 "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2"로 표시되었다. 이 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:220)이다:
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG
GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
SEQ ID NO:220에서, 아미노산 잔기 1 내지 106은 gpA33 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:181)에 해당하고, 잔기 107 내지 114는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 115 내지 239는 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 240 내지 245는 GGCGGG 링커 (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 246 내지 273은 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:39)에 해당하고, 잔기 274 내지 276은 링커 GGG이며, 잔기 277 내지 286은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48)이고, 잔기 287 내지 503은 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:52)이다.
SEQ ID NO:220을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:221)이다:
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact
attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc
aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg
ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa
gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag
tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga
ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag
tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg
aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat
tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga
ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag
gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac
acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaaa.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:222)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG
KFKDRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC
GGGKVAALKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E.
SEQ ID NO:222에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 237은 gpA33 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:186)에 해당하고, 잔기 238 내지 243은 링커 GGCGGG (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 244 내지 271은 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)이다.
SEQ ID NO:222를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:223)이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc
cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc
aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga
cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga
aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag
ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac
aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt
ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc
gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:224)이다:
KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT EYILHWVKQK SGQGLEWIGW FYPGNNNIKY
NEKFKDKATL TADKSSSTVY MELSRLTSED SAVYFCARHE QGPGYFDYWG QGTTLTVSSA
STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG
LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK.
SEQ ID NO:224에서, 아미노산 잔기 1 내지 119는 DR5 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:18)에 해당하고, 잔기 120 내지 127은 변형된 CH1 도메인 (SEQ ID NO:208)에 해당하며, 잔기 218 내지 232는 링커 (SEQ ID NO:209)에 해당하고, 잔기 233 내지 449는 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:53)에 해당한다.
SEQ ID NO:224를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:225)이다:
aaggtccagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtgaaac ccggggcatc agtgaagctg
tcctgcaagg cttctgggta caccttcact gagtatattt tacactgggt aaagcagaag
tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg ttttatcctg gaaataataa tataaagtac
aatgagaaat tcaaggacaa ggccacactg actgcggaca aatcctccag cacagtctat
atggaactta gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagacacgaa
caaggaccag gttactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctccgcc
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg
accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg
gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:226)이다:
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW ASTRHTGVPD
RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC.
SEQ ID NO:226에서, 아미노산 잔기 1 내지 107은 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:13)에 해당하고, 잔기 108 내지 214는 CL 카파 도메인 (SEQ ID NO:210)에 해당한다.
SEQ ID NO:226을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:227)이다:
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc
atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaacca
gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct
gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat cggtcttcat cttcccgcca
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt.
H. EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1
4개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 추가의 예시적인 삼중-특이적 결합 분자가 구성되었다. 삼중-특이적 결합 분자는 EphA2 mAb 1의 VL 및 VH 도메인, 항체 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 및 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 포함하고, 따라서 "EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1"로 표시되었다. 이 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:228)이다:
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS
RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG
GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
SEQ ID NO:228에서, 아미노산 잔기 1 내지 106은 EphA2 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:153)에 해당하고, 잔기 107 내지 114는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 115 내지 239는 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 240 내지 245는 GGCGGG 링커 (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 246 내지 273은 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:39)에 해당하고, 잔기 274 내지 276은 링커 GGG이며, 잔기 277 내지 286은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48)이고, 잔기 287 내지 503은 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:52)이다.
SEQ ID NO:228을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:229)이다:
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagaatcacc
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg
accaagctgg aaataaaagg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag
tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga
ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag
tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg
aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat
tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga
ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag
gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac
acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaa.
EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산은 (SEQ ID NO:230)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLKESGPGLV APSQSLSITC TVSGFSLSRY SVHWVRQPPG KGLEWLGMIW GGGSTDYNSA
LKSRLSISKD NSKSQVFLKM NSLQTDDTAM YYCARKHGNY YTMDYWGQGT SVTVSSGGCG
GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
SEQ ID NO:230에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 236은 EphA2 mAb1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:158)에 해당하고, 잔기 237 내지 242는 링커 GGCGGG (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 243 내지 270은 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)이다.
SEQ ID NO:230을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:231)이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtg
cagctgaagg agtcaggacc tggcctggtg gcaccctcac agagcctgtc catcacatgc
actgtctctg ggttctcatt atccagatat agtgtacact gggttcgcca gcctccagga
aagggtctgg agtggctggg aatgatatgg ggtggtggaa gcacagacta taattcagct
ctcaaatcca gactgagtat cagcaaggac aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg
aacagtctgc aaactgatga cacagccatg tactactgtg ccagaaaaca tggtaactac
tatactatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctccgg aggatgtggc
ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca
cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag.
EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:232)이다:
EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE INPDSNTINY
TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS
SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG
GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE
EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR
WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG K.
SEQ ID NO:232에서, 아미노산 잔기 1 내지 121은 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:8)에 해당하고, 잔기 122 내지 219는 변형된 CH1 도메인 (SEQ ID NO:208)에 해당하며, 잔기 220 내지 234는 링커 (SEQ ID NO:209)에 해당하고, 잔기 235 내지 451은 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:53)에 해당한다.
SEQ ID NO:232를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:233)이다:
gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc
tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct
ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat
acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat
ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc
tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct
tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag
gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa.
EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:234)이다:
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV LIFLSSNLDS
GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC.
SEQ ID NO:234에서, 아미노산 잔기 1 내지 111은 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:3)에 해당하고, 잔기 112 내지 218은 CL 카파 도메인 (SEQ ID NO:210)에 해당한다.
SEQ ID NO:234를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:235)이다:
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac
caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat
cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt.
I. EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1
4개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 추가의 예시적인 삼중-특이적 결합 분자가 구성되었다. 삼중-특이적 결합 분자는 EphA2 mAb 2의 VL 및 VH 도메인, 항체 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 및 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 포함하고, 따라서 "EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1"로 표시되었다. 이 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:236)이다:
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP TFGSGTKLEI KGGGSGGGGE
VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY
YADSVKGRFT ISRDDSKNSL YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV
TVSSGGCGGG EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK.
SEQ ID NO:236에서, 아미노산 잔기 1 내지 111은 EphA2 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:163)에 해당하고, 잔기 112 내지 119은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 120 내지 244는 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 245 내지 250은 GGCGGG 링커 (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 251 내지 278은 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:39)에 해당하고, 잔기 279 내지 281은 링커 GGG이며, 잔기 282 내지 291은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48)이고, 잔기 292 내지 508은 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:52)이다.
SEQ ID NO:236을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:237)이다:
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacattgg
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaaggtggag gatccggcgg cggaggcgag
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gagggtccct gagactctcc
tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca tacgctatga attgggtccg ccaggctcca
gggaaggggc tggagtgggt tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac
tatgccgact ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg
tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg tgtgagacac
ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt ggggacaggg gacactggtg
actgtgtctt ccggaggatg tggcggtgga gaagtggccg cactggagaa agaggttgct
gctttggaga aggaggtcgc tgcacttgaa aaggaggtcg cagccctgga gaaaggcggc
ggggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc
aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag
agcctctccc tgtctccggg taaa.
EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:238)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQI
QLVQSGPELK KPGETVKISC KASGFTFTNY GMNWVKQAPG KGLKWMGWIN TYIGEPTYAD
DFKGRFVFSL ETSASTAYLQ INNLKNEDMA TYFCARELGP YYFDYWGQGT TLTVSSGGCG
GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
SEQ ID NO:238에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 236은 EphA2 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:167)에 해당하고, 잔기 237 내지 242는 링커 GGCGGG (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 243 내지 270은 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)이다.
SEQ ID NO:238을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:239)이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacagatc
cagttggtgc agtctggacc tgagctgaag aagcctggag agacagtcaa gatctcctgc
aaggcttctg ggtttacctt cacaaactat ggaatgaact gggtgaagca ggctccagga
aagggtttaa agtggatggg ctggataaac acctatattg gagagccgac atatgctgat
gacttcaagg gacggtttgt cttctctttg gaaacctctg ccagcactgc ctatttgcag
atcaacaacc tcaaaaatga ggacatggcc acatatttct gtgcaagaga actgggacca
tactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctccgg aggatgtggc
ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca
cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag.
EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:240)이다:
EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE INPDSNTINY
TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS
SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG
GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE
EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR
WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG K.
SEQ ID NO:240에서, 아미노산 잔기 1 내지 121은 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:8)에 해당하고, 잔기 122 내지 219는 변형된 CH1 도메인 (SEQ ID NO:208)에 해당하며, 잔기 220 내지 234는 링커 (SEQ ID NO:209)에 해당하고, 잔기 235 내지 451은 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:53)에 해당한다.
SEQ ID NO:240을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:241)이다:
gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc
tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct
ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat
acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat
ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc
tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct
tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag
gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa.
EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:242)이다:
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV LIFLSSNLDS
GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC.
SEQ ID NO:242에서, 아미노산 잔기 1 내지 111은 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:3)에 해당하고, 잔기 112 내지 218은 CL 카파 도메인 (SEQ ID NO:210)에 해당한다.
SEQ ID NO:242를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:243)이다:
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac
caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat
cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt.
J. EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1
4개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 추가의 예시적인 삼중-특이적 결합 분자가 구성되었다. 삼중-특이적 결합 분자는 EphA2 mAb 3의 VL 및 VH 도메인, 항체 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 및 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 포함하고, 따라서 "EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1"로 표시되었다. 이 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:244)이다:
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW ASTRHAGVPD
RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS
GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV
SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK.
SEQ ID NO:244에서, 아미노산 잔기 1 내지 107은 EphA2 mAb 3의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:172)에 해당하고, 잔기 108 내지 115는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 116 내지 240은 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 241 내지 246은 GGCGGG 링커 (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 247 내지 274는 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:39)에 해당하고, 잔기 275 내지 277은 링커 GGG이며, 잔기 278 내지 287은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48)이고, 잔기 288 내지 504는 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:52)이다.
SEQ ID NO:244를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:245)이다:
gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac
atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag cctggtatca acaaaaacca
gggcaatctc ctaaattact gattttctgg gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct
ggagacctgg cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg
gggaccaagc tggaaataaa aggtggagga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg
gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct
ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg
gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct
gtgaagggta gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg
aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc
aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc
ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag
gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc
agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg
tctccgggta aa.
EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:246)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV
QLVESGGGSV KPGGSLKLSC AASGFTFTDH YMYWVRQTPE KRLEWVATIS DGGSFTSYPD
SVKGRFTISR DIAKNNLYLQ MSSLKSEDTA MYYCTRDESD RPFPYWGQGT LVTVSSGGCG
GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
SEQ ID NO:246에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mab 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 236은 EphA2 mAb 3의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:177)에 해당하고, 잔기 237 내지 242는 링커 GGCGGG (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 243 내지 270은 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)이다.
SEQ ID NO:246을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:247)이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggagaagtg
cagctggtgg agtctggggg aggctcagtg aagcctggag ggtccctgaa actctcctgt
gcagcctctg gattcacttt cactgaccat tacatgtatt gggttcgcca gactccggaa
aagaggctgg agtgggtcgc aaccattagt gatggcggta gtttcacctc ctatccagac
agtgtgaagg ggcgattcac catctccaga gacattgcca agaacaacct gtacctccaa
atgagcagtc tgaagtctga ggacacagcc atgtattact gtacaagaga tgagagcgat
aggccgtttc cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctcctccgg aggatgtggc
ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca
cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag.
EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:248)이다:
EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE INPDSNTINY
TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS
SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG
GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE
EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR
WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG K.
SEQ ID NO:248에서, 아미노산 잔기 1 내지 121은 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:8)에 해당하고, 잔기 122 내지 219는 변형된 CH1 도메인 (SEQ ID NO:208)에 해당하며, 잔기 220 내지 234는 링커 (SEQ ID NO:209)에 해당하고, 잔기 235 내지 451은 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:53)에 해당한다.
SEQ ID NO:248을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:249)이다:
gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc
tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct
ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat
acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat
ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc
tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct
tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag
gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa.
EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:250)이다:
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV LIFLSSNLDS
GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC.
SEQ ID NO:250에서, 아미노산 잔기 1 내지 111은 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:3)에 해당하고, 잔기 112 내지 218은 CL 카파 도메인 (SEQ ID NO:210)에 해당한다.
SEQ ID NO:250을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:251)이다:
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac
caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat
cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt.
비록 상기 기술된 예시적인 삼중-특이적 결합 분자들이 각각의 결합 도메인에 대해 3개의 경쇄 (VL) CDR 및 3개의 중쇄 (VH) CDR을 포함하긴 하지만, 발명은 또한 다음을 가지는 삼중-특이적 결합 분자들도 포함하는 것이 인지될 것이다:
(1) 어떠한 그런 결합 도메인의 VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나;
(2) 어떠한 그런 결합 도메인의 VL 도메인의 CDR 중 적어도 2개;
(3) 어떠한 그런 결합 도메인의 VL 도메인의 3개의 CDR;
(4) 어떠한 그런 결합 도메인의 VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나;
(5) 어떠한 그런 결합 도메인의 VH 도메인의 CDR 중 적어도 2개;
(6) 어떠한 그런 결합 도메인의 VH 도메인의 3개의 CDR;
(7) 어떠한 그런 결합 도메인의 VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나 및 그 결합 도메인의 VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나;
(8) 어떠한 그런 결합 도메인의 VL 도메인의 CDR 중 적어도 2개 및 그 결합 도메인의 VH 도메인의 CDR 중 적어도 2개;
(9) 어떠한 그런 결합 도메인의 VL 도메인의 3개의 CDR 및 그 결합 도메인의 VH 도메인의 3개의 CDR;
(10) 어떠한 그런 결합 도메인의 VL 도메인;
(11) 어떠한 그런 결합 도메인의 VH 도메인; 또는
(12) 어떠한 그러 결합 도메인의 VL 및 VH 도메인.
K. gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 1
4개의 폴리펩티드 사슬로 구성되고 gpA33 mAb 1의 VL 및 VH 도메인, 항체 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 및 EphA2 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 삼중-특이적 결합 분자가 구성되었다. 삼중-특이적 결합 분자는 따라서 "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 1"로 표시되었다. 이 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:252)이다:
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG
GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
SEQ ID NO:252에서, 아미노산 잔기 1 내지 106은 gpA33 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:181)에 해당하고, 잔기 107 내지 114는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 115 내지 239는 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 240 내지 245는 GGCGGG 링커 (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 246 내지 273은 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:39)에 해당하고, 잔기 274 내지 276은 링커 GGG이며, 잔기 277 내지 286은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48)이고, 잔기 287 내지 503은 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:52)이다.
SEQ ID NO:252를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:253)이다:
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact
attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc
aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg
ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa
gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag
tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga
ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag
tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg
aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat
tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga
ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag
gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac
acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaaa.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 1의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:254)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG
KFKDRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC
GGGKVAALKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E.
SEQ ID NO:254에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 237은 gpA33 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:186)에 해당하고, 잔기 238 내지 243은 링커 GGCGGG (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 244 내지 271은 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)이다.
SEQ ID NO:254를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:255)이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc
cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc
aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga
cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga
aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag
ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac
aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt
ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc
gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 1의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:256)이다:
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVHWVRQP PGKGLEWLGM IWGGGSTDYN
SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARKHG NYYTMDYWGQ GTSVTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK.
SEQ ID NO:256에서, 아미노산 잔기 1 내지 118은 EphA2 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:158)에 해당하고, 잔기 119 내지 216은 변형된 CH1 도메인 (SEQ ID NO:208)에 해당하며, 잔기 217 내지 231은 링커 (SEQ ID NO:209)에 해당하고, 잔기 232 내지 448은 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:53)에 해당한다.
SEQ ID NO:256을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:257)이다:
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag cctgtccatc
acatgcactg tctctgggtt ctcattatcc agatatagtg tacactgggt tcgccagcct
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaagcac agactataat
tcagctctca aatccagact gagtatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aaaacatggt
aactactata ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctccgcctcc
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc
aagaaccagg tcagcctgag ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac
tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgcta cacgcagaag
agcctctccc tgtctccggg taaa.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 1의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:258)이다:
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS
RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG TKLEIKRTVA APSVFIFPPS
DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL
SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC.
SEQ ID NO:258에서, 아미노산 잔기 1 내지 106은 EphA2 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:153)에 해당하고, 잔기 107 내지 213은 CL 카파 도메인 (SEQ ID NO:210)에 해당한다.
SEQ ID NO:258을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:259)이다:
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagaatcacc
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg
accaagctgg aaataaaacg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt.
L. gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2
4개의 폴리펩티드 사슬로 구성되고 gpA33 mAb 1의 VL 및 VH 도메인, 항체 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 및 EphA2 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 삼중-특이적 결합 분자가 구성되었다. 삼중-특이적 결합 분자는 따라서 "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2"로 표시되었다. 이 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:260)이다:
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG
GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
SEQ ID NO:260에서, 아미노산 잔기 1 내지 106은 gpA33 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:181)에 해당하고, 잔기 107 내지 114는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 115 내지 239는 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 240 내지 245는 GGCGGG 링커 (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 246 내지 273은 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:39)에 해당하고, 잔기 274 내지 276은 링커 GGG이며, 잔기 277 내지 286은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48)이고, 잔기 287 내지 503은 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:52)이다.
SEQ ID NO:260을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:261)이다:
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact
attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc
aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg
ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa
gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag
tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga
ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag
tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg
aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat
tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga
ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag
gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac
acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaaa.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:262)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG
KFKDRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC
GGGKVAALKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E.
SEQ ID NO:262에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 237은 gpA33 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:186)에 해당하고, 잔기 238 내지 243은 링커 GGCGGG (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 244 내지 271은 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)이다.
SEQ ID NO:262를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:263)이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc
cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc
aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga
cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga
aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag
ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac
aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt
ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc
gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2 의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:264)이다:
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW INTYIGEPTY
ADDFKGRFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAREL GPYYFDYWGQ GTTLTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK.
SEQ ID NO:264에서, 아미노산 잔기 1 내지 118은 EphA2 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:167)에 해당하고, 잔기 119 내지 216은 변형된 CH1 도메인 (SEQ ID NO:208)에 해당하며, 잔기 217 내지 231은 링커 (SEQ ID NO:209에 해당하고, 잔기 232 내지 448은 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:53)에 해당한다.
SEQ ID NO:264를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:265)이다:
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc
tcctgcaagg cttctgggtt taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct atattggaga gccgacatat
gctgatgact tcaagggacg gtttgtcttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggccacat atttctgtgc aagagaactg
ggaccatact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctccgcctcc
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc
aagaaccagg tcagcctgag ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac
tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgcta cacgcagaag
agcctctccc tgtctccggg taaa.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:266)이다:
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP TFGSGTKLEI KRTVAAPSVF
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC.
SEQ ID NO:266에서, 아미노산 잔기 1 내지 111은 EphA2 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:163)에 해당하고, 잔기 112 내지 218은 CL 카파 도메인 (SEQ ID NO:210)에 해당한다.
SEQ ID NO:266을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:267)이다:
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacattgg
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt.
M. gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 3
4개의 폴리펩티드 사슬로 구성되고 gpA33 mAb 1의 VL 및 VH 도메인, 항체 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 및 EphA2 mAb 3의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 삼중-특이적 결합 분자가 구성되었다. 삼중-특이적 결합 분자는 따라서 " gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 3"으로 표시되었다. 이 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:268)이다:
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG
GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
SEQ ID NO:268에서, 아미노산 잔기 1 내지 106은 gpA33 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:181)에 해당하고, 잔기 107 내지 114는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 115 내지 239는 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 240 내지 245는 GGCGGG 링커 (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 246 내지 273은 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:39)에 해당하고, 잔기 274 내지 276은 링커 GGG이며, 잔기 277 내지 286은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48)이고, 잔기 287 내지 503은 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:52)이다.
SEQ ID NO:268을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:269)이다:
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact
attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc
aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg
ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa
gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag
tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga
ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag
tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg
aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat
tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga
ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag
gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac
acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaaa.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 3의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:270)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG
KFKDRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC
GGGKVAALKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E.
SEQ ID NO:270에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 237은 gpA33 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:186)에 해당하고, 잔기 238 내지 243은 링커 GGCGGG (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 244 내지 271은 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)이다.
SEQ ID NO:270을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:271)이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc
cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc
aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga
cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga
aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag
ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac
aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt
ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc
gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag.
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 3의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:272)이다:
EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMYWVRQT PEKRLEWVAT ISDGGSFTSY
PDSVKGRFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTRDE SDRPFPYWGQ GTLVTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK.
SEQ ID NO:272에서, 아미노산 잔기 1 내지 118은 EphA2 mAb 3의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:177)에 해당하고, 잔기 119 내지 216은 변형된 CH1 도메인 (SEQ ID NO:208)에 해당하며, 잔기 217 내지 231은 링커 (SEQ ID NO:209)에 해당하고, 잔기 232 내지 448은 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:53)에 해당한다.
SEQ ID NO:272를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:273)이다:
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc
tcctgtgcag cctctggatt cactttcact gaccattaca tgtattgggt tcgccagact
ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gcggtagttt cacctcctat
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca ttgccaagaa caacctgtac
ctccaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagatgag
agcgataggc cgtttcctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ctccgcctcc
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc
aagaaccagg tcagcctgag ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac
tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgcta cacgcagaag
agcctctccc tgtctccggg .
gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 3의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:274)이다:
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW ASTRHAGVPD
RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC.
SEQ ID NO:274에서, 아미노산 잔기 1 내지 107은 EphA2 mAb 3의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:172)에 해당하고, 잔기 108 내지 214는 CL 카파 도메인 (SEQ ID NO:210)에 해당한다.
SEQ ID NO:274를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:275)이다:
gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac
atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag cctggtatca acaaaaacca
gggcaatctc ctaaattact gattttctgg gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct
ggagacctgg cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg
gggaccaagc tggaaataaa acgtacggtg gctgcaccat cggtcttcat cttcccgcca
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt.
N. EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1
대체 EphA2 / CD3 / gpA33 삼중-특이적 결합 분자가 구성되었다. 분자는 4개의 폴리펩티드 사슬로 구성되고 EphA2 mAb 1의 VL 및 VH 도메인, 항체 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 및 gpA33 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 분자는 "EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1"로 표시되었다. 이 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:276)이다:
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS
RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG
GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
SEQ ID NO:276에서, 아미노산 잔기 1 내지 106은 EphA2 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:153)에 해당하고, 잔기 107 내지 114는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 115 내지 239는 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 240 내지 245는 GGCGGG 링커 (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 246 내지 273은 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:39)에 해당하고, 잔기 274 내지 276은 링커 GGG이며, 잔기 277 내지 286은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48)이고, 잔기 287 내지 503은 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:52)이다.
SEQ ID NO:276을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:277)이다:
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagaatcacc
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg
accaagctgg aaataaaagg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag
tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga
ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag
tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg
aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat
tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga
ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag
gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac
acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaaa.
EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:278)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLKESGPGLV APSQSLSITC TVSGFSLSRY SVHWVRQPPG KGLEWLGMIW GGGSTDYNSA
LKSRLSISKD NSKSQVFLKM NSLQTDDTAM YYCARKHGNY YTMDYWGQGT SVTVSSGGCG
GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
SEQ ID NO:278에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 236은 EphA2 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:158)에 해당하고, 잔기 237 내지 242는 링커 GGCGGG (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 243 내지 270은 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)에 해당한다.
SEQ ID NO:278을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:279)이다:
aggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtg
cagctgaagg agtcaggacc tggcctggtg gcaccctcac agagcctgtc catcacatgc
actgtctctg ggttctcatt atccagatat agtgtacact gggttcgcca gcctccagga
aagggtctgg agtggctggg aatgatatgg ggtggtggaa gcacagacta taattcagct
ctcaaatcca gactgagtat cagcaaggac aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg
aacagtctgc aaactgatga cacagccatg tactactgtg ccagaaaaca tggtaactac
tatactatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctccgg aggatgtggc
ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca
cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag.
EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:280)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR IYPGDGETNY
NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY GNNVYFDVWG QGTTVTVSSA
STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG
LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK.
SEQ ID NO:280에서, 아미노산 잔기 1 내지 119는 gpA33 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:186)에 해당하고, 잔기 120 내지 217은 변형된 CH1 도메인 (SEQ ID NO:208)에 해당하며, 잔기 218 내지 232는 링커 (SEQ ID NO:209)에 해당하고, 잔기 233 내지 449는 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:53)에 해당한다.
SEQ ID NO:280을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:281)이다:
caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag cgtgaaggtc
tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga tgaactgggt gaggcaggct
ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc atctaccctg gagacggcga aactaactat
aatggaaagt tcaaagaccg agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac
atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac
ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctccgcc
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg
accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg
gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa.
EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:282)이다:
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKRTVA APSVFIFPPS
DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL
SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC.
SEQ ID NO:282에서, 아미노산 잔기 1 내지 106은 gpA33 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:181)에 해당하고, 잔기 107 내지 213은 CL 카파 도메인 (SEQ ID NO:210)에 해당한다.
SEQ ID NO:282를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:283)이다:
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact
attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc
aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg
ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa
gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaagcg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt.
O. EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1
대체 EphA2 / CD3 / gpA33 삼중-특이적 결합 분자가 구성되었다. 분자는 4개의 폴리펩티드 사슬로 구성되고 EphA2 mAb 2의 VL 및 VH 도메인, 항체 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 및 gpA33 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 분자는 "EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1"로 표시되었다. 이 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:284)이다:
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP TFGSGTKLEI KGGGSGGGGE
VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY
YADSVKGRFT ISRDDSKNSL YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV
TVSSGGCGGG EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK.
SEQ ID NO:284에서, 아미노산 잔기 1 내지 111은 EphA2 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:163)에 해당하고, 잔기 112 내지 119는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 120 내지 244는 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 245 내지 250은 GGCGGG 링커 (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 251 내지 278은 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:39)에 해당하고, 잔기 279 내지 281은 링커 GGG이며, 잔기 282 내지 291은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48)이고, 잔기 292 내지 508은 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:52)이다.
SEQ ID NO:284를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:285)이다:
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacattgg
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaaggtggag gatccggcgg cggaggcgag
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gagggtccct gagactctcc
tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca tacgctatga attgggtccg ccaggctcca
gggaaggggc tggagtgggt tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac
tatgccgact ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg
tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg tgtgagacac
ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt ggggacaggg gacactggtg
actgtgtctt ccggaggatg tggcggtgga gaagtggccg cactggagaa agaggttgct
gctttggaga aggaggtcgc tgcacttgaa aaggaggtcg cagccctgga gaaaggcggc
ggggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc
aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag
agcctctccc tgtctccggg taaa.
EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:286)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQI
QLVQSGPELK KPGETVKISC KASGFTFTNY GMNWVKQAPG KGLKWMGWIN TYIGEPTYAD
DFKGRFVFSL ETSASTAYLQ INNLKNEDMA TYFCARELGP YYFDYWGQGT TLTVSSGGCG
GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
SEQ ID NO:286에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 236은 EphA2 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:167)에 해당하고, 잔기 237 내지 242는 링커 GGCGGG (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 243 내지 270은 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)에 해당한다.
SEQ ID NO:286을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:287)이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacagatc
cagttggtgc agtctggacc tgagctgaag aagcctggag agacagtcaa gatctcctgc
aaggcttctg ggtttacctt cacaaactat ggaatgaact gggtgaagca ggctccagga
aagggtttaa agtggatggg ctggataaac acctatattg gagagccgac atatgctgat
gacttcaagg gacggtttgt cttctctttg gaaacctctg ccagcactgc ctatttgcag
atcaacaacc tcaaaaatga ggacatggcc acatatttct gtgcaagaga actgggacca
tactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctccgg aggatgtggc
ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca
cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag.
EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:288)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR IYPGDGETNY
NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY GNNVYFDVWG QGTTVTVSSA
STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG
LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK.
SEQ ID NO:288에서, 아미노산 잔기 1 내지 119는 gpA33 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:186)에 해당하고, 잔기 120 내지 217은 변형된 CH1 도메인 (SEQ ID NO:208)에 해당하며, 잔기 218 내지 232는 링커 (SEQ ID NO:209)에 해당하고, 잔기 233 내지 449는 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:53)에 해당한다.
SEQ ID NO:288을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:289)이다:
caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag cgtgaaggtc
tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga tgaactgggt gaggcaggct
ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc atctaccctg gagacggcga aactaactat
aatggaaagt tcaaagaccg agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac
atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac
ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctccgcc
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg
accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg
gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa.
EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:290)이다:
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKRTVA APSVFIFPPS
DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL
SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC.
SEQ ID NO:290에서, 아미노산 잔기 1 내지 106은 gpA33 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:181)에 해당하고, 잔기 107 내지 213은 CL 카파 도메인 (SEQ ID NO:210)에 해당한다.
SEQ ID NO:290을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:291)이다:
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact
attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc
aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg
ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa
gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaagcg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt.
P. EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1
제 3 대체 EphA2 / CD3 / gpA33 삼중-특이적 결합 분자가 구성되었다. 분자는 4개의 폴리펩티드 사슬로 구성되었고 EphA2 mAb 3의 VL 및 VH 도메인, 항체 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 및 gpA33 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 분자는 "EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1"로 표시되었다. 이 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:292)이다:
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW ASTRHAGVPD
RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS
GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV
SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK.
SEQ ID NO:292에서, 아미노산 잔기 1 내지 107은 EphA2 mAb 3의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:172)에 해당하고, 잔기 108 내지 115는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 116 내지 240은 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 241 내지 246은 GGCGGG 링커 (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 247 내지 274는 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:39)에 해당하고, 잔기 275 내지 277은 링커 GGG이며, 잔기 278 내지 287은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48)이고, 잔기 288 내지 504는 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:52)이다.
SEQ ID NO:292를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:293)이다:
gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac
atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag cctggtatca acaaaaacca
gggcaatctc ctaaattact gattttctgg gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct
ggagacctgg cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg
gggaccaagc tggaaataaa aggtggagga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg
gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct
ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg
gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct
gtgaagggta gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg
aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc
aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc
ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag
gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc
agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg
tctccgggta aa.
EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:294)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV
QLVESGGGSV KPGGSLKLSC AASGFTFTDH YMYWVRQTPE KRLEWVATIS DGGSFTSYPD
SVKGRFTISR DIAKNNLYLQ MSSLKSEDTA MYYCTRDESD RPFPYWGQGT LVTVSSGGCG
GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
SEQ ID NO:294에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 3의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 236은 EphA2 mAb 3의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:177)에 해당하고, 잔기 237 내지 242는 링커 GGCGGG (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 243 내지 270은 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)에 해당한다.
SEQ ID NO:294를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:295)이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggagaagtg
cagctggtgg agtctggggg aggctcagtg aagcctggag ggtccctgaa actctcctgt
gcagcctctg gattcacttt cactgaccat tacatgtatt gggttcgcca gactccggaa
aagaggctgg agtgggtcgc aaccattagt gatggcggta gtttcacctc ctatccagac
agtgtgaagg ggcgattcac catctccaga gacattgcca agaacaacct gtacctccaa
atgagcagtc tgaagtctga ggacacagcc atgtattact gtacaagaga tgagagcgat
aggccgtttc cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctcctccgg aggatgtggc
ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca
cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag.
EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:296)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR IYPGDGETNY
NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY GNNVYFDVWG QGTTVTVSSA
STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG
LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK.
SEQ ID NO:296에서, 아미노산 잔기 1 내지 119는 gpA33 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:186)에 해당하고, 잔기 120 내지 217은 변형된 CH1 도메인 (SEQ ID NO:208)에 해당하며, 잔기 218 내지 232는 링커 (SEQ ID NO:209)에 해당하고, 잔기 233 내지 449는 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:53)에 해당한다.
SEQ ID NO:296을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:297)이다:
caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag cgtgaaggtc
tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga tgaactgggt gaggcaggct
ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc atctaccctg gagacggcga aactaactat
aatggaaagt tcaaagaccg agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac
atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac
ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctccgcc
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg
accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg
gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa.
EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:298)이다:
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKRTVA APSVFIFPPS
DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL
SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC.
SEQ ID NO:298에서, 아미노산 잔기 1 내지 106은 gpA33 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:181)에 해당하고, 잔기 107 내지 213은 CL 카파 도메인 (SEQ ID NO:210)에 해당한다.
SEQ ID NO:298을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 (SEQ ID NO:299)이다:
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact
attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc
aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg
ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa
gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaagcg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt.
IV. 참조 항체 및 다이아바디들
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들의 특성확인을 보조하기 위하여, 다음의 참조 다이아바디들이 구성되었다.
Q. DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 다이아바디
항-인간 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인 및 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 가지는, 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 예시적인 이중-특이적 다이아바디가 구성되었다. 다이아바디는 "DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 다이아바디"로 표시되었다. 이 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:140)이다:
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV LIFLSSNLDS
GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE
VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY
YADSVKGRFT ISRDDSKNSL YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV
TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK.
SEQ ID NO:140에서, 아미노산 잔기 1 내지 111은 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:3)에 해당하고, 잔기 112 내지 119는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 120 내지 244는 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 245 내지 249는 ASTKG 링커 (SEQ ID NO:47)에 해당하며 잔기 250 내지 277은 시스테인-함유 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:41)에 해당한다. SEQ ID NO:140을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:141이다:
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac
caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat
cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggaggcg gatccggcgg cggaggcgag
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gagggtccct gagactctcc
tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca tacgctatga attgggtccg ccaggctcca
gggaaggggc tggagtgggt tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac
tatgccgact ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg
tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg tgtgagacac
ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt ggggacaggg gacactggtg
actgtgtctt ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct
ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa a.
DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 다이아바디의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:142)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV
KFLESGGGLV QPGGSLKLSC VASGFDFSRY WMSWVRQAPG KGLEWIGEIN PDSNTINYTP
SLKDKFIISR DNAKNTLYLQ MTKVRSEDTA LYYCTRRAYY GNPAWFAYWG QGTLVTVSAA
STKGKVAACK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE.
SEQ ID NO:142에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 239는 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:8)에 해당하고 (단 SEQ ID NO:8의 C-말단의 세린 잔기는 알라닌 잔기로 대체되어 있음), 잔기 240 내지 244는 ASTKG 링커 (SEQ ID NO:47)에 해당하며, 잔기 245 내지 272는 시스테인-함유 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:42)에 해당한다. SEQ ID NO:142를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:143이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga ggtggtggat ccggcggcgg aggcgaggtg
aagtttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt
gtagcctcag gattcgattt tagtagatac tggatgagtt gggtccggca ggctccaggg
aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca atacgataaa ctatacgcca
tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca aaaatacgct gtatctgcaa
atgaccaaag tgagatctga ggacacagcc ctttattatt gtacaagaag ggcctactat
ggtaacccgg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc
tccaccaagg gcaaagtggc cgcatgtaag gagaaagttg ctgctttgaa agagaaggtc
gccgcactta aggaaaaggt cgcagccctg aaagag.
R. DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 다이아바디
항-인간 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 및 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 가지는, 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 예시적인 이중-특이적 다이아바디가 구성되었다. 다이아바디는 "DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 다이아바디"로 표시되었다. 이 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:144)이다:
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW ASTRHTGVPD
RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS
ASTKGEVAAC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK.
SEQ ID NO:144에서, 아미노산 잔기 1 내지 107은 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:13)에 해당하고, 잔기 108 내지 115는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 116 내지 240은 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 241 내지 245는 ASTKG 링커 (SEQ ID NO:47)에 해당하며 잔기 246 내지 273은 시스테인-함유 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:41)에 해당한다. SEQ ID NO:144를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:145이다:
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc
atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaacca
gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct
gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg
gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct
ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg
gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct
gtgaagggta gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg
aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc
aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc
gcctccacca agggcgaagt ggccgcatgt gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag
gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaa.
DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 다이아바디의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:146)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGKV
QLQQSGAELV KPGASVKLSC KASGYTFTEY ILHWVKQKSG QGLEWIGWFY PGNNNIKYNE
KFKDKATLTA DKSSSTVYME LSRLTSEDSA VYFCARHEQG PGYFDYWGQG TTLTVSSAST
KGKVAACKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
SEQ ID NO:146에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 237은 DR5 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:18)에 해당하고, 잔기 238 내지 242는 ASTKG 링커 (SEQ ID NO:47)에 해당하며, 잔기 243 내지 270은 시스테인-함유 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:42)에 해당한다. SEQ ID NO:146을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:147이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggcgg aggcaaggtc
cagctgcagc agtctggagc tgaactggtg aaacccgggg catcagtgaa gctgtcctgc
aaggcttctg ggtacacctt cactgagtat attttacact gggtaaagca gaagtctgga
cagggtcttg agtggattgg gtggttttat cctggaaata ataatataaa gtacaatgag
aaattcaagg acaaggccac actgactgcg gacaaatcct ccagcacagt ctatatggaa
cttagtagat tgacatctga agactctgcg gtctatttct gtgcaagaca cgaacaagga
ccaggttact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc cgcctccacc
aagggcaaag tggccgcatg taaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca
cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag.
S. DR5 mAb 3 x CD3 mAb 2 다이아바디
항-인간 DR5 항체 DR5 mAb 3의 VL 및 VH 도메인 및 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 가지는, 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 예시적인 이중-특이적 다이아바디가 구성되었다. 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 서열 (SEQ ID NO:148)을 가졌다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
SELTQDPAVS VALGQTVRIT C SGDSLRSYY AS WYQQKPGQ APVLVIY GAN NRPS GIPDRF
SGSSSGNTAS LTITGAQAED EADYYC NSAD SSGNHVV FGG GTKLTVLGGG GSGGGGEVQL
VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFS TYAM N WVRQAPGKG LEWVG RIRSK YNNYATYYAD
SVKG RFTISR DDSKNSLYLQ MNSLKTEDTA VYYCVR HGNF GNSYVSWFAY WGQGTLVTVS
SASTKGEVAA CEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEK.
SEQ ID NO:148에서, 아미노산 잔기 1 내지 108은 DR5 mAb 3의 VL 도메인 (SEQ ID NO:54)에 해당하고, 잔기 109 내지 116은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 117 내지 241은 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 242 내지 246은 ASTKG 링커 (SEQ ID NO:47)에 해당하며, 잔기 247 내지 275는 시스테인-함유 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:42)에 해당한다.
다이아바디의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 서열 (SEQ ID NO:149)을 가졌다 (CDR은 밑주로 표시됨):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV
QLVQSGGGVE RPGGSLRLSC AAS GFTFDDY AMS WVRQAPG KGLEWVSG IN WQGGSTGYAD
SVKG RVTISR DNAKNSLYLQ MNSLRAEDTA VYYCAK ILGA GRGWYFDY WG KGTTVTVSSA
STKGKVAACK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE.
SEQ ID NO:149에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 239는 DR5 mAb 3의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:58)에 해당하고, 잔기 240 내지 244는 ASTKG 링커 (SEQ ID NO:47)에 해당하며, 잔기 245 내지 272는 시스테인-함유 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:42)에 해당한다.
T. DR5 mAb 4 x CD3 mAb 2 다이아바디
항-인간 DR5 항체 DR5 mAb 4의 VL 및 VH 도메인 및 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 가지는, 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 예시적인 이중-특이적 다이아바디가 구성되었다. 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 서열 (SEQ ID NO:150)을 가졌다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSC RASQGIS RSYLA WYQQK PGQAPSLLIY GASSRAT GIP
DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYC Q QFGSSPWT FG QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL
VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFS TYAM N WVRQAPGKG LEWVG RIRSK YNNYATYYAD
SVKG RFTISR DDSKNSLYLQ MNSLKTEDTA VYYCVR HGNF GNSY VSWFAY WGQGTLVTVS
SASTKGEVAA CEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEK.
SEQ ID NO:150에서, 아미노산 잔기 1 내지 108은 DR5 mAb 4의 VL 도메인 (SEQ ID NO:62)에 해당하고, 잔기 109 내지 116은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 117 내지 241은 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 242 내지 246은 ASTKG 링커 (SEQ ID NO:47)에 해당하며, 잔기 247 내지 275는 시스테인-함유 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:41)에 해당한다.
다이아바디의 제 2 폴리펩티드사슬의 아미노산 서열은 서열 (SEQ ID NO:151)을 가졌다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLQESGPGLV KPSQTLSLTC TVS GGSISSG DYFWS WIRQL PGKGLEWIG H IHNSGTTYYN
PSLKS RVTIS VDTSKKQFSL RLSSVTAADT AVYYCAR DRG GDYYYGMDV W GQGTTVTVSS
ASTKGKVAAC KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE.
SEQ ID NO:151에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 240은 DR5 mAb 4의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:65)에 해당하고, 잔기 241 내지 245는 ASTKG 링커 (SEQ ID NO:47)에 해당하며, 잔기 246 내지 273은 시스테인-함유 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:42)에 해당한다.
U. 참조 gpA33 x CD3 mAb 2 다이아바디
본 발명의 이중-특이적 삼중-특이적 결합 분자들을 추가로 예시하기 위하여, gpA33 mAb 1의 VL 및 VH 도메인 및 CD3 mAb 2를 사용하여 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 다이아바디를 구성하였다. 다이아바디의 제 1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 (SEQ ID NO:316)을 가졌다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC SARSSIS FMY WYQQKPG KAPKLLIY DT SNLAS GVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYC QQW SSYPLT FGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFS TYAMN W VRQAPGKGLE WVG RIRSKYN NYATYYADSV
KG RFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVR HGNFGN SYVSWFAY WG QGTLVTVSSA
STKGEVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK.
SEQ ID NO:316에서, 아미노산 잔기 1 내지 106은 gpA33 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:181)에 해당하고, 잔기 107 내지 114는 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 115 내지 239는 D65G 치환을 가지는 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)에 해당하고, 잔기 240 내지 244는 ASTKG 링커 (SEQ ID NO:47)에 해당하며, 잔기 245 내지 272는 시스테인-함유 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:41)에 해당한다.
다이아바디의 제 2 폴리펩티드사슬의 아미노산 서열은 서열 (SEQ ID NO:137)을 가졌다 (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KAS GYTFTGS WMN WVRQAPG QGLEWIG RIY PGDGETNYNG
KFKD RVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCAR IYGN NVYFDV WGQG TTVTVSSAST
KGKVAACKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
SEQ ID NO:317에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 237은 gpA33 mAb 1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:186)에 해당하고, 잔기 238 내지 242는 ASTKG 링커 (SEQ ID NO:47)에 해당하며, 잔기 243 내지 270은 시스테인-함유 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:42)에 해당한다.
V. 참조 항-플루오레세인 항체
대조 다이아바디에 항-플루오레세인 항체 4-4-20을 사용하였다 (Gruber, M. et al. (1994) "Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bi-specific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli," J. Immunol. 152(11):5368-5374; Bedzyk, W.D. et al. (1989) "Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family," J. Biol. Chem. 264(3): 1565-1569). 항-플루오레세인 항체 4-4-20의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열들은 다음과 같다:
항-플루오레세인 항체 4-4-20의 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:138) (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSNGNTYLR W YLQKPGQSPK VLIY KVSNRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP W TFGGGTKLE IK.
항-플루오레세인 항체 4-4-20의 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:139) (CDR 잔기들은 밑줄로 표시됨):
EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVA SGFTFS DYWMN WVRQS PEKGLEWVA Q IRNKPYNYET
YYSDSVKG RF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG SYYGMDY WGQ GTSVTVSS.
V. 제조 방법
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 DR5, 원하는 암 항원 및 원하는 이펙터 세포에 대해 면역특이적인 항체들의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열들로부터 기술분야에 공지되어 있는 방법들에 의해, 예를 들면 합성적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있다. 그런 펩티드 아고니스트, 길항체 및 조절제를 제조하는 한 가지 방법은 폴리펩티드의 화학적 합성, 이어서 천연 형태,즉 정확한 이황화 결합 연쇄를 얻기 위해 적절한 산화 조건하에서의 처리를 포함한다. 이것은 기술분야의 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법론들을 사용하여 이루어질 수 있다 (예컨대 Kelley, R. F. et al. (1990) In: Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; 또한 미국 특허 번호 4,105,603; 3,972,859; 3,842,067; 및 3,862,925 참조).
발명의 폴리펩티드는 고체 상 (phase) 펩티드 합성을 사용하여 편리하게 제조될 수 있다 (Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis," Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century," Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).
또 다른 대체예에서, 원하는 항-DR5 항체, 항암 항원 항체 또는 항-이펙터 세포 항체의 하나 이상의 CDR을 가지는 적합한 항체는 특이적인 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 엔지니어링되어 있는 상업적으로 입수 가능한 마우스의 사용을 통해 얻어질 수 있다. 보다 바람직한 (예컨대 전체 인간 항체) 또는 보다 왕성한 면역 반응을 나타내도록 디자인된 유전자 도입 동물들은 또한 인간화된 또는 인간 항체의 제조를 위해 사용될 수 있다. 그런 기술의 실례는 Xenomouse™ (Abgenix, Inc., Fremont, CA) 및 HuMAb-Mouse® 및 TC Mouse™ (both from Medarex, Inc., Princeton, NJ)이다.
다른 예에서, 항체는 기술분야에 알려져 있는 어떠한 방법이든지 사용하여 재조합적으로 제조되고 발현될 수 있다. 항체들은 먼저 숙주 동물로부터 만들어진 항체들을 분리하고, 유전자 서열을 얻고, 그 유전자 서열을 사용하여 항체를 숙주 세포 (예컨대 CHO 세포)에서 재조합적으로 발현시킴으로써 재조합적으로 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 식물 (예컨대 담배)에서 또는 유전자 도입된 우유에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 우유에서 항체들을 재조합적으로 발현시키기에 적합한 방법들은 문헌에 개시되어 있다 (예를 들면 Peeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; 및 Pollock et al.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231:147-157 참조). 항체들의 유도체, 예컨대 키메라, 인간화된, 단일-사슬 등을 제조하기에 적합한 방법들은 기술분야에 알려져 있다. 또 다르게는, 항체들은 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150; 및 Winter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455 참조).
관심의 항체들 또는 단백질은 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있는 에드만 분해 (Edman degradation)에 의해 서열화될 수 있다. 질량 분석법 또는 에드만 분해로부터 생성된 펩티드 정보는 관심의 단백질을 클론하기 위해 사용된 프로브들 또는 프라이머들을 디자인하기 위해 사용될 수 있다.
관심의 단백질을 클로닝하는 대체 방법은 정제된 DR5, 및/또는 암 항원, 및/또는 원하는 이펙터 세포의 표면에 발현된 분자 (또는 어떠한 그런 분자의 부분)을 사용하여, 하나 이상의 CDR을 가지는 관심의 항체 또는 단백질을 발현하는 세포에 대해, DR5, 또는 그런 원하는 암 항원 또는 이펙터 세포 분자에 결합할 수 있게 하기 위해 "패닝 (panning)"하는 것에 의한다. "패닝" 과정은 DR5를 발현하는 조직 또는 세포로부터 cDNA 라이브러리를 얻고, 그 cDNA를 제 2 세포 유형에서 과잉발현시키고, 제 2 세포 유형의 트랜스펙션된 세포를 그런 분자에 결합할 수 있는 공지 항체 (예컨대 새로운 항-DR5 항체에 대한 패닝의 경우에 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2, 등등)의 존재 또는 부재하에 DR5에의 특이적인 결합에 대해 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. "패닝"에 의해 세포-표면 단백질을 코딩하는 포유류 유전자들을 클로닝하는 데 사용된 방법에 대한 상세한 설명은 기술분야에서 찾아볼 수 있다 (예를 들면 Aruffo, A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 및 Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation," Endocrinol. 140:5841-5854 참조).
관심의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 많은 적절한 수단, 이를테면 일렉트로포레이션, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산 칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용하는 트랜스펙션; 미세사출법 (microprojectile bombardment); 리포펙션; 및 감염 (예컨대 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염체인 경우) 중 어떠한 것에 의해 숙주 세포 안에 도입될 수 있다. 도입시키는 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 자주 숙주 세포의 특징에 좌우될 것이다.
이종성 DNA를 과잉-발현할 수 있는 어떠한 숙주 세포든지 관심의 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코드화하는 유전자를 분리하는 목적에 대해 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 비-제한적 실례는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함한다. 바람직하게, 숙주 세포는, 존재하는 경우 숙주 세포에서 관심의 해당하는 내인성 항체 또는 단백질의 그것보다 약 5-배 더 높은, 보다 바람직하게는 10-배 더 높은, 더욱 바람직하게는 20-배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. 원하는 단백질에 대한 특이적 결합에 대해 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 바람직하게는 면역분석 또는 FACS에 의해 이루어진다. 관심의 항체 또는 단백질을 과잉-발현하는 세포가 확인될 수 있다.
발명은 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 기술분야에 공지된 과정들에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질 가수분해 또는 다른 분해에 의해, 상기 기술된 것과 같은 재조합 방법 (즉 단일 또는 융합 폴리펩티드)에 의해 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 약 50 아미노산까지의 더 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 기술분야에 알려져 있고 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 항-DR5 폴리펩티드는 고체-상 방법을 사용하여 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 제조될 수 있었다.
발명은 어떠한 그런 항체 (또는, 경우에 따라, DR5, 암 항원 또는 이펙터 세포에 결합하는 그것들의 폴리펩티드 단편들의 어느 것)에 대해 및 그런 분자들의 아고니스트, 길항체 및 조절제들, 이를테면 그런 분자들의 특성에 유의미하게 영향을 미치지 않은 기능적으로 동등한 항체 및 융합 폴리펩티드뿐만 아니라 증강된 또는 감소된 활성을 가지는 변이체들에 대한 변형을 포함한다. 폴리펩티드의 변형은 기술분야에서 기본적인 관례이고 본원에서 상세하게 기술될 필요는 없다. 변형된 폴리펩티드의 실례는 기능적 활성을 유의미하게 유해하게 변화시키지 않는 아미노산 잔기들의 보존성 치환, 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 첨가, 또는 화학적 유사체의 용도를 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 서로에 대해 보존적으로 치환될 수 있는 아미노산 잔기들은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다: 글리신/알라닌; 발린/아이소로이신/로이신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌; 라이신/아르기닌 및 페닐알라닌/타이로신. 이들 폴리펩티드는 또한 글리코실화된 및 비-글리코실화된 폴리펩티드, 뿐만 아니라 다른 번역후 변형, 예컨대, 예를 들면 상이한 당으로의 글리코실화, 아세틸화 및 인산화를 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 아미노산 치환은 보존성일 것이다, 즉 치환된 아미노산은 원래의 아미노산의 것과 같은 유사한 화학적 특성을 가질 것이다. 그런 보존성 치환은 기술분야에 알려져 있고, 그것들의 실례는 상기에서 제공되었다. 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산을 변화시키거나 변형시키는 것으로부터 영역, 예컨대 가변 도메인의 완전한 재디자인하는 것에 이르기까지 다양할 수 있다. 가변 도메인의 변화는 결합 친화성 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 변형의 다른 방법은 기술분야에 알려져 있는 커플링 기법들, 이를테면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 효소적 수단, 산화성 치환 및 킬레이트화를 사용하는 것을 포함한다. 변형은 예를 들면, 면역분석을 위한 표지의 부착, 예컨대 방사성 면역분석을 위한 방사성 부분의 부착을 위해 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 기술분야에서 수립된 과정을 사용하여 제조되고 기술분야에 공지된 표준 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
발명은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄, 중쇄 또는 경쇄 및 중쇄 둘 다를 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 이종성 면역글로불린 불변 영역을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 대중적으로-기탁된 하이브리도마로부터 제조된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 함유한다. 본 발명의 목적에 대해, 항체 융합 단백질은 DR5, 암 항원 또는 이펙터 세포 (경우에 따라) 및 천연 분자에서 그것에 부착되지 않는 다른 아미노산 서열, 예를 들면 이종성 서열 또는 또 다른 영역으로부터의 상동성 서열에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 도메인을 함유한다.
VI. 본 발명의 삼중특이적 결합 분자들의 용도
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 암에 대한 일반적인 치료법을 제공한다. 그런 분자들에 의해 치료될 수 있는 암들은 다음의 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 암세포의 존재를 특징으로 하는 암을 포함한다: 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광암, 골암, 뇌 및 척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 명세포 암종, 대장암, 결장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 조직결합성 소원형 세포 종양, 뇌질피복 세포증, 유윙 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골섬유 불완전 형성증, 섬유성 골이형성, 담낭 또는 담관암, 위암, 임신성 영양 질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비 신생물 형성, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아과 암, 말초신경초 종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀성 혈액장애, 전이성 신장암, 횡문근양 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액막 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 전이성 갑상선암 또는 자궁암. 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 결장암, 간세포 암종, 신경교종, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 방광암, 신경아세포종; 육종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암 및 직장암의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 표적 종양의 세포들의 특징인 암 항원에 대해 지시된 항체에 의해 제공된 암 치료법을, 추가적으로 그런 종양 세포의 표면에 배열된 DR5 분자에 결합할 수 있게 됨으로써 증대시킨다. 발명의 활용성은 특히 암 항원의 밀도가 낮은 상황에서, 또는 항-암 항원 항체의 결합 동역학이 임상적으로 충분한 치료적 반응을 촉진하기에는 차선인 (또는 불충분한) 때에 볼 수 있다. 그런 경우들에서, 본 발명의 분자가 종양 세포의 암 항원 및 DR5 둘 다에 결합하는 능력은 임상적으로 충분한 치료적 반응을 촉진하기에 충분한 증강된 결합 (결합력을 통하여)을 제공한다. 추가적으로, 또한 면역 시스템 이펙터 세포의 표면에서 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인을 가짐으로써, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 그런 면역 시스템 세포들이 종양 세포에 공동-정위되는 것을 허용하고, 그로써 재지시된 살해를 통해 종양 세포에 대한 세포독성 반응을 촉진하게 된다.
표 2에서 알 수 있는 것과 같이, 암 항원-결합 도메인의 특별한 조합을 가지는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 특정 암의 치료에서 바람직한 활용성을 가진다.
암 항원-결합 도메인 바람직한 활용성
gpA33 DR5 결장암의 치료
gpA33 EphA2
gpA33 B7-H3
gpA33 BST2
5T4 EphA2 많은 유형의 암의 치료에 광범위하게 적용될 수 있음
5T4 CEACAM5
5T4 B7-H3
5T4 DR5
B7-H3 CEACAM5
B7-H3 CEACAM6
B7-H3 IL1Rγ2 교아세포종, 흑색종
EphA2 IL1R?2
EphA2 DR5 많은 유형의 암의 치료에 광범위하게 적용될 수 있음
EphA2 CEACAM5
EphA2 CEACAM6
ITGB6 B7-H3
ITGB6 DR5
ITGB6 BST2
BST2 CEACAM5
BST2 EGFR
VII. 약학 조성물
본 발명의 조성물은 약학 조성물의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물 (예컨대 불순하거나 비-멸균 조성물) 및 단위 단위용량 형태의 제조에 사용될 수 있는 약학 조성물 (즉 대상 또는 환자에게 투여하기에 적합한 조성물)을 포함한다. 그런 조성물은 예방적으로 또는 치료적으로 유효량의 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들, 또는 그런 제제들의 조합 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직하게, 발명의 조성물은 예방적으로 또는 치료적으로 유효량의 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 발명은 특히 삼중-특이적 결합 분자가 다음의 DR5-결합 도메인을 가지고 있는 그런 약학 조성물을 포함한다:
(1) DR5 mAb 1 항체;
(2) DR5 mAb 2 항체;
(3) DR5 mAb 3 항체;
(4) DR5 mAb 4 항체;
(5) DR5 mAb 5 항체;
(6) DR5 mAb 6 항체;
(7) DR5 mAb 7 항체; 또는
(8) DR5 mAb 8 항체
(또는 어떠한 그런 항체들의 인간화된 유도체).
발명은 추가로 특히 삼중-특이적 결합 분자가 다음과 같은 암 항원-결합 도메인을 가지는 그런 약학 조성물을 포함한다:
(A) EphA2의 에피토프에 결합함, 특히 이때 삼중-특이적 결합 분자는 EphA2 mAb 1, EphA2 mAb 2 또는 EphA2 mAb 3, 또는 그것의 인간화된 또는 키메라 변이체의 암 항원-결합 도메인을 가진다; 또는
(B) gpA33의 에피토프에 결합함, 특히 이때 삼중-특이적 결합 분자는 gpA33 mAb 1, 또는 그것의 인간화된 또는 키메라 변이체의 암 항원-결합 도메인을 가진다; 또는
(C) Her2의 에피토프에 결합함, 특히 이때 삼중-특이적 결합 분자는 Her2 mAb 1 또는 트라스투주맙, 또는 그것의 인간화된 또는 키메라 변이체의 암 항원-결합 도메인을 가진다; 또는
(D) B7-H3의 에피토프에 결합함, 특히 이때 삼중-특이적 결합 분자는 B7-H3 mAb 1, B7-H3 mAb 2 또는 B7-H3 mAb 3, 또는 그것의 인간화된 또는 키메라 변이체의 암 항원-결합 도메인을 가진다.
발명은 추가로 특히 삼중-특이작 결합 분자가 CD2, CD3, CD17, CD20, CD22, CD32B, CD64, BCR/CD79, T 세포 수용체 또는 NKG2D 수용체에 결합하는 이펙터 세포-결합 도메인을 가지는 그런 약학 조성물을 포함한다. 발명은 추가로 특히 삼중-특이작 결합 분자가 항체: Lo-CD2a, CD3 mAb 2, OKT3, 3G8, A9, HD37, 리툭시맙, 에프라투주맙, CD32B mAb 1, CD64 mAb 1, CD79 mAb 1, BMA 031, KYK-1.0 또는 KYK-2.0의 이펙터 세포-결합 도메인을 가지는 그런 약학 조성물을 포함한다.
발명은 구체적으로 삼중-특이적 결합 분자, 그런 결합 분자를 포함하는 약학 조성물 및 그런 삼중-특이적 결합 분자의 용도를 포함하고, 여기서:
(1) DR5 결합 도메인은 어떠한 항-DR5 항체의 DR5 결합 도메인이고;
(2) 암 결합 도메인은 본원에 개시된 암 항원들 중 어느 것이며; 및
(3) 이펙터 세포-결합 도메인은 CD2, CD3, CD17, CD20, CD22, CD32B, CD64, BCR/CD79, T 세포 수용체 또는 NKG2D 수용체 중 어느 것에 결합한다.
발명은 추가로 구체적으로 삼중-특이적 결합 분자, 그런 결합 분자를 포함하는 약학 조성물 및 그런 삼중-특이적 결합 분자의 용도를 포함하고, 여기서:
(1) DR5 결합 도메인은 어떠한 항-DR5 항체의 DR5 결합 도메인이고;
(2) 암 결합 도메인은 EphA1, gpA33, Her2 또는 B7-H3 중 어느 것이며; 및
(3) 이펙터 세포-결합 도메인은 CD2, CD3, CD17, CD20, CD22, CD32B, CD64, BCR/CD79, T 세포 수용체 또는 NKG2D 수용체 중 어느 것에 결합한다.
발명은 특히 삼중-특이적 결합 분자의 각각, 뿐만 아니라 그런 결합 분자를 포함하는 약학 조성물 및 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 용도를 포함하고, 여기서:
(1) DR5 결합 도메인은 DR5 mAb 1 항체, DR5 mAb 2 항체, DR5 mAb 3 항체, DR5 mAb 4 항체, DR5 mAb 5 항체, DR5 mAb 6 항체, DR5 mAb 7 항체 또는 DR5 mAb 8 항체 중 어느 것의 DR5 결합 도메인이고;
(2) 암 항원-결합 도메인은 EphA2 mAb 1, EphA2 mAb 2, EphA2 mAb 3, gpA33 mAb 1, Her2 mAb 1, 트라스투주맙, B7-H3 mAb 1, B7-H3 mAb 2 또는 B7-H3 mAb 3 중 어느 것의 결합 도메인이며; 및
(3) 이펙터 세포-결합 도메인은 Lo-CD2a, CD3 mAb 2, OKT3, 3G8, A9, HD37, 리툭시맙, 에프라투주맙, CD32B mAb 1, CD64 mAb 1, CD79 mAb 1, BMA 031, KYK-1.0 또는 KYK-2.0 중 어느 것의 결합 도메인이다.
8개의 항-DR5 결합 도메인 항체, 9개의 항-암 항원-결합 도메인 항체 및 14개의 항-이펙터 세포-결합 도메인 항체가 열거되어 있기 때문에, 그런 구체적인 고려는 그런 결합 도메인의 모든 (8 x 9 x 14 =) 1,008 조합을 포함한다.
발명은 또한 추가적으로 특별한 암 항원에 특이적인 제 2 치료 항체 (예컨대 종양-특이적 단클론성 항체), 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 그런 약학 조성물을 포함한다.
특정 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용되는"은 미연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인된 또는 미국 약전 또는 동물, 보다 구체적으로는 인간에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인지된 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제 (예컨대 프로인트 보조제 (완전 및 불완전)), 부형제 또는 비히클을 나타낸다. 그런 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일, 이를테면 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등일 수 있다. 물은 약학 조성물이 정맥 내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서, 특히 주사 가능한 용액에 대해 사용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 필요하다면 또한 미량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 환, 캡슐, 분말, 지속성 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다.
일반적으로, 발명의 조성물의 성분들은 별도로 또는 함께 단위 단위용량 형태로, 예를 들면 건조한 동결건조 분말 또는 수분이 없는 농축물로서 밀폐 밀봉된 용기, 예컨대 활성제의 양을 표시하는 앰풀 또는 봉지로 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 조성물은 멸균된 약학 등급의 물 또는 식염수를 함유하고 있는 주입 병으로 제공될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰풀이 제공되어 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있게 된다.
발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로서 제형될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 음이온으로 형성되ㅎ는 것들, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들, 및 양이온으로 형성된 것들, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 철 수산화물, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것들을 포함한다.
발명은 또한 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자 (및 바람직하게는 상기에서 논의된 또는 예시된 특정 결합 분자들 중 어느 것)로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 추가로, 질환의 치료를 위해 유용한 하나 이상의 다른 예방 또는 치료제가 또한 약학적 팩 또는 키트에 포함될 수 있다. 발명은 또한 발명의 약학 조성물의 하나 이상의 성분들로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 의약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 공지사항이 정부 기관에 의해 처방된 형태로 그런 용기(들)과 임의로 결합되며, 그 공지사항은 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다.
본 발명은 상기 방법에 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 키트는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들 중 어느 것을 포함할 수 있다. 키트는 암의 치료를 위해 유용한 하나 이상의 다른 예방 및/또는 치료제를, 하나 이상의 용기에 더 포함할 수 있고; 및/또는 키트는 암과 관련된 하나 이상의 암 항원에 결합하는 하나 이상의 세포독성 항체를 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 다른 예방 또는 치료제는 화학요법제이다. 또 다른 구체예에서, 예방 또는 치료제는 생물학적 또는 호르몬 치료제이다.
VIII. 투여 방법
본 발명의 조성물은 유효량의 발명의 융합 단백질 또는 콘쥬게이트된 분자, 또는 발명의 융합 단백질 또는 콘쥬게이트된 분자를 포함하는 약학 조성물을 대상에게 투여함으로써 질환, 장애 또는 감염과 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및 개선을 위해 제공될 수 있다. 바람직한 측면으로, 그런 조성물은 실질적으로 정제된다 (즉, 실질적으로 조성물의 효과를 제한하거나 바람직하지 않은 부작용을 유발하는 물질들이 없다). 특정 구체예에서, 대상은 동물, 바람직하게는 비-영장류 (예컨대 소, 말, 고양이, 개, 설치류 등) 또는 영장류 (예컨대 사이노몰구스 원숭이와 같은 원숭이, 인간 등)와 같은 포유류이다. 바람직한 구체예에서, 대상은 인간이다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있고 발명의 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있는데, 예를 들면 리포솜에의 캡슐화, 미소입자, 미소캡슐, 항체 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-중재된 엔도사이토시스 (예컨대 Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산의 구성 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 분자의 투여 방법은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 비경구 투여 (예컨대 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 및 피하), 경막 외 및 점막 경유 (예컨대 비강 내 및 경구 경로)를 포함한다. 특정 구체예에서, 발명의 삼중-특이적 결합 분자들은 근육 내로, 정맥 내로 또는 피하로 투여된다. 조성물은 어떠한 편리한 경로에 의하여, 예를 들면 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점액피부 라이닝 (예컨대 구강 점막, 직장 및 소장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적 활성 제제들과 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 또한, 폐 투여가, 예컨대 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제로의 제형의 사용에 의해 또한 사용될 수 있다. 예컨대 미국 특허 번호 6,019,968; 5,985, 320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; 및 4,880,078; 및 PCT 공개 번호 WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 및 WO 99/66903 참조 (이것들은 각각 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨).
발명은 또한 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자가 분자의 양을 표시하는 앰풀 또는 봉지와 같은 밀폐 밀봉된 용기에 패키징되는 것을 제공한다. 한 구체예에서, 그런 분자는 밀폐 밀봉된 용기 안의 건조한 멸균된 동결건조 분말로서 또는 수분 없는 농축물로서 공급될 수 있고, 대상에게 투여하기에 적절한 농도로, 예컨대 물 또는 식염수를 사용하여 복원될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 밀폐 밀봉된 용기 안의 건조한 멸균 동결건조 분말로서 적어도 5 μg, 보다 바람직하게는 적어도 10 μg, 적어도 15 μg, 적어도 25 μg, 적어도 50 μg, 적어도 100 μg 또는 적어도 200 μg의 단위 단위용량으로 공급된다.
본 발명의 동결건조된 삼중-특이적 결합 분자는 그것의 원래의 용기에 2 내지 8℃에서 저장되어야 하고, 분자들은 복원된 후 12시간 이내, 바람직하게는 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내 또는 1시간 이내에 투여되어야 한다. 대체 구체예에서, 그런 분자는 분자, 융합 단백질 또는 콘쥬게이트된 분자의 양 및 농도를 표시하는 밀폐 밀봉된 용기 안에 액체 형태로 공급된다. 바람직하게, 그런 삼중-특이적 결합 분자는 액체 형태로 제공될 때 분자가 최소한 1 μg/ml, 보다 바람직하게는 적어도 2.5 μg/ml, 적어도 5 μg/ml, 적어도 10 μg/ml, 적어도 50 μg/ml 또는 적어도 100 μg/ml의 농도로 존재하는 밀폐 밀봉된 용기로 공급된다.
장애와 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 방지 또는 개선에 효과적일 발명의 조성물의 양은 표준 임상 기법에 의해 측정될 수 있다. 제형에 사용될 정확한 양은 또한 투여 경로 및 상태의 심각성에 따라 좌우될 것이고, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
발명에 포함된 삼중-특이적 결합 분자 1가 다이아바디에 대해, 환자에게 투여된 단위용량은 바람직하게 수용 환자의 체중 (kg)을 기준으로 측정된다. 투여되는 단위용량은 전형적으로 적어도 약 0.3 ng/kg/일 내지 약 0.9 ng/kg/일, 적어도 약 1 ng/kg/일 내지 약 3 ng/kg/일, 적어도 약 3 ng/kg/일 내지 약 9 ng/kg/일, 적어도 약 10 ng/kg/일 내지 약 30 ng/kg/일, 적어도 약 30 ng/kg/일 내지 약 90 ng/kg/일, 적어도 약 100 ng/kg/일 내지 약 300 ng/kg/일, 적어도 약 200 ng/kg/일 내지 약 600 ng/kg/일, 적어도 약 300 ng/kg/일 내지 약 900 ng/kg/일, 적어도 약 400 ng/kg/일 내지 약 800 ng/kg/일, 적어도 약 500 ng/kg/일 내지 약 1000 ng/kg/일, 적어도 약 600 ng/kg/일 내지 약 1000 ng/kg/일, 적어도 약 700 ng/kg/일 내지 약 1000 ng/kg/일, 적어도 약 800 ng/kg/일 내지 약 1000 ng/kg/일, 적어도 약 900 ng/kg/일 내지 약 1000 ng/kg/일 또는 적어도 약 1,000 ng/kg/일이다.
다른 구체예에서, 환자는 발명에 포함된 그런 예방적 또는 치료적 유효량의 삼중-특이적 결합 분자의 1회 이상의 용량을 포함하는 치료 처방이 투여되는데, 이때 치료 처방은 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일에 걸쳐 투여된다. 특정 구체예에서, 치료 처방은 발명에 포함된 예방적 또는 치료적 유효량의 삼중-특이적 결합 분자의 용량을 간헐적으로 투여하는 것을 포함한다 (예를 들어, 주어진 주간의 1일, 2일, 3일 및 4일에 용량을 투여하는 것과 동일한 주간의 5일, 6일 및 7일에 발명에 포함된 예방적 또는 치료적 유효량의 삼중-특이적 결합 분자의 용량을 투여하지 않는 것).
특히 상기 논의된 DR5 결합 도메인, 암 항원-결합 도메인 및 이펙터 세포-결합 도메인의 특정 조합들 중 어느 것이든지 포함하는 그런 삼중-특이적 결합 분자들의, 동일한 주의 5일, 6일 및 7일에서의 투여가 포함된다. 전형적으로, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 치료 과정이 있다. 각 과정은 동일한 양생법이거나 상이한 양생법일 수 있다.
다른 구체예에서, 투여된 용량은 삼중-특이적 결합 분자의 예방적으로 또는 치료적으로 유효량이 매일 이루어질 때까지 양생법(들)의 처음 1/4, 처음 절반 또는 처음 2/3 또는 3/4 동안에 (예컨대 4과정 치료의 제 1, 제 2 또는 제 3 양생법 동안에) 증가된다. 표 3은 전형적인 치료 과정 동안 상기 기술된 상이한 투여 양생법의 5가지 실례를 제공한다.
양생법 일 다이아바디 단위용량 (ng 다이아바디 / kg 대상 체중 / 일)
1 1, 2, 3, 4 100 100 100 100 100
5, 6, 7 없음 없음 없음 없음 없음
2 1, 2, 3, 4 300 500 700 900 1,000
5, 6, 7 없음 없음 없음 없음 없음
3 1, 2, 3, 4 300 500 700 900 1,000
5, 6, 7 없음 없음 없음 없음 없음
4 1, 2, 3, 4 300 500 700 900 1,000
5, 6, 7 없음 없음 없음 없음 없음
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 투여의 단위용량 및 빈도는 예를 들면 지질화와 같은 변형에 의해 분자의 흡수 및 조직 침투를 증강시킴으로써 감소되거나 변경될 수 있다.
환자에게 투여되는 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 단위용량은 단일 제제 요법으로서 사용하기 위해 계산될 수 있다. 다르게는, 분자는 다른 치료 조성물과 함께 사용될 수 있고 환자에게 투여되는 단위용량은 상기 분자가 단일 제제 요법으로서 사용되는 때보다 낮다.
발명의 약학 조성물은 치료가 필요한 지역에 국소적으로 투여되는 것이 바람직할 수 있다; 이것은 예를 들면, 제한하는 것이 아닌, 국소 주입, 주사 또는 이식에 의해 이루어질 수 있고, 상기 이식은 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질, 이를테면 막, 예컨대 실라스틱 막 또는 섬유로 된 것이다. 바람직하게, 발명의 분자를 투여할 때 그 분자를 흡수하지 않는 물질을 사용하기 위한 배려가 취해져야 한다.
발명의 조성물은 소포체, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 (Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327 참조).
발명의 조성물은 제어된 방출 또는 지속성 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 어떠한 기법이든지 발명의 하나 이상의 삼중-특이적 결합 분자(들)을 포함하는 지속성 방출 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대 미국 특허 번호 4,526,938; PCT 공개 WO 91/05548; PCT 공개 WO 96/20698; Ning et al. (1996) " Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al. (1997) " Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조. 이것들은 각각 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다. 한 구체예에서, 제어된 방출 시스템에 펌프가 사용될 수 있다 (Langer, supra; Sefton, (1987) " Implantable Pumps," CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis," Surgery 88:507-516; 및 Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery," N. Engl. J. Med. 321:574-579 참조). 다른 구체예에서, 중합체 물질이 항체의 제어된 방출을 이루기 위해 사용될 수 있다 (예컨대 Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate," Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization," Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) " Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits," J. Neurosurg. 7(1):105-112); 미국 특허 번호 5,679,377; 미국 특허 번호 5,916,597; 미국 특허 번호 5,912,015; 미국 특허 번호 5,989,463; 미국 특허 번호 5,128,326; PCT 공개 번호 WO 99/15154; 및 PCT 공개 번호 WO 99/20253 참조). 지속성 방출 제형에 사용된 중합체의 실례는, 그것들에 한정되지 않지만, 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리코라이드 (PLG), 다가무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드 (PLA), 폴리(락타이드-코-글리코라이드) (PLGA) 및 폴리오르토에스테르를 포함한다. 제어된 방출 시스템은 치료 표적 (예컨대 폐)에 가깝게 위치될 수 있고, 그로써 단지 전신 용량의 부분만을 필요로 한다 (예컨대 Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 제어된 방출 이식편으로서 유용한 중합체 조성물은 Dunn 등에 따라 사용된다 (U.S. 5,945,155 참조). 이 특별한 방법은 중합체 시스템으로부터 생체활성 물질의 인시튜-제어된 방출의 치료 효과를 기반으로 한다. 이식은 일반적으로 치료적 치료를 필요로 하는 환자의 신체의 어느 곳에서든지 발생할 수 있다. 비-중합체 지속성 전달 시스템이 사용될 수 있고, 그로써 대상의 신체에서 비-중합체 이식편은 약물 전달 시스템으로서 사용된다. 신체에 이식될 때, 이식편의 유기 용매는 조성물로부터 주변의 조직 유체로 소멸되거나, 분산되거나 또는 침출되고, 비-중합체 물질은 점차적으로 응집되거나 침전되어 고형, 미소공성 매트릭스를 형성한다 (U.S. 5,888,533 참조).
제어된 방출 시스템은 Langer에 의해 개관에서 논의된다 (Langer (1990), "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533). 기술분야의 숙련자에 공지된 어떠한 기법이든지 발명의 하나 이상의 치료제를 포함하는 지속성 방출 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대 미국 특허 번호 4,526,938; 국제 공개 번호 WO 91/05548 및 WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조. 이들 문헌은 각각 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
발명의 조성물이 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자를 코드화하는 핵산인 경우에, 핵산은 생체 내에서 그것의 코딩된 삼중-특이적 결합 분자의 발현을 촉진하기 위해, 그것을 예컨대 레트로바이러스 벡터를 사용하여 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고 투여하여서 그것이 세포 내적인 것이 되게 함으로써 (미국 특허 번호 4,980,286 참조), 또는 직접적인 주입에 의해, 또는 마이크로입자 폭발 (예컨대 유전자 총; Biolistic, Dupont)을 사용함으로써, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질전환제로의 코팅에 의해, 또는 핵에 들어가는 것으로 알려져 있는 호메오박스(homeobox)-유사 펩티드에 연결시켜 투여함으로써 (예컨대 Joliot et al. (1991) " Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis ," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868 참조), 등등의 방법에 의해 투여될 수 있다. 다르게는, 핵산은 상동 재조합에 의해 세포 내로 도입될 수 있고 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내에 통합될 수 있다.
본 발명의 치료적 또는 예방적 유효량의 삼중-특이적 결합 분자로 대상을 치료하는 것은 단일 치료를 포함하고 또는, 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 실례에서, 대상은 약 1 내지 10주, 바람직하게는 2 내지 8주, 보다 바람직하게는 약 3 내지 7주, 더욱 바람직하게는 약 4, 5 또는 6주 동안 주 1회 그런 다이아바디로 치료된다. 발명의 약학 조성물은 1일에 1회, 1일에 2회 또는 1일에 3회 투여될 수 있다. 다르게는, 약학 조성물은 주 1회, 주 2회, 2주마다 1회, 월 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 1년에 2회 또는 1년에 1회 투여된다. 또한 치료를 위해 사용된 분자의 유효한 단위용량은 특정 치료 과정에 걸쳐 증가하거나 감소할 수 있다는 것이 인지될 것이다.
실시예 :
이제까지 발명은 일반적으로 기술되었는데, 발명은 다음의 실시예들을 참조로 더욱 쉽게 이해될 것이며, 실시예들은 예시에 의해 제공되며 명시되지 않는 한 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 재료 및 방법 둘 다에 대한 많은 변형이 본 개시의 범주로부터 벗어나지 않으면서 실시될 수 있다는 것이 당업자들에게 드러날 것이다.
W. 실시예 1: 항-인간 DR5 단클론성 항체 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 특성확인
단일클론성 항체들을 인간 DR5에 면역특이적으로 결합할 수 있는 것이라서 분리하였고, 표시 "DR5 mAb 1" 및 "DR5 mAb 2"를 부여하였다. 상기에서 논의된 것과 같이, 이들 항체의 CDR은 상이한 것으로 나타났다. 항체들이 상이한 DR5 에피토프에 결합하는지를 측정하기 위하여, 인간 DR5-Fc 융합 단백질을 제조하였고 고정된 표면에 코팅하였다. DR5 mAb 1 (1 μg/mL)을 비오티닐화하였고 대조 IgG 또는 DR5 mAb 2 (10 μg/mL)와 함께 인큐베이션하였고, IgG 또는 DR5 mAb 2 항체의 DR5 mAb 1과의 결합 (인간 DR5-Fc 융합 단백질에 대해)에 대해 경합하는 능력을 고정된 비오티닐화된 항체의 양을 측정함으로써 평가하였다. 추가적으로, IgG 또는 DR5 mAb 2 항체의 비오티닐화된 DR5 mAb 2와의 결합에 대해 경합하는 능력을 평가하였다. 이 실험의 결과를 표 4에 나타낸다.

1 μg/mL의 DR5-Fc 융합 코트		 10 μg/mL의 경합자 mAb
mIgG DR5 mAb 2 DR5 mAb 2
1 μg/mL의 비오티닐화된 DR5 mAb DR5 mAb 1 2.162 자체 0.826
DR5 mAb 2 2.102 2.377 자체
이 실험의 결과는 비오티닐화된 항체가 과잉량의 비-비오티닐화된 항체의 존재하에서도 DR5 단백질에 대해 결합할 수 있었음을 나타낸다. 그러므로, 결과는 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2가 DR5의 상이한 에피토프에 결합하는 것을 나타낸다.
추가로 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2 항체를 특성화하기 위하여, 그것들의 DR5와 TRAIL 리간드 사이의 결합을 차단하는 능력을 평가하였다. 그러므로, 비오티닐화된 DR5 mAb 2 또는 비오티닐화된 DR5-Fc 융합 (각각 2 μg/mL)을 별도로, 고정된 DR5-Fc 융합 (1 μg/mL)과 함께 완충제 또는 히스티딘 태그된 TRAIL (20 μg/mL)의 존재하에 인큐베이션하였다. 고정된 비오티닐화된 항체의 양을 평가하였다. 이 실험의 결과를 표 5에 나타낸다.
2 μg/mL 비오티닐화된 DR5 mAb 1 μg/mL DR5-Fc 융합 코트 1 μg/mL TRAIL-His 코트
20 μg/mL TRAIL-His 완충제
DR5 mAb 1 1.939 2.118 0.007
DR5 mAb 2 2.052 2.052 0.008
DR5-Fc 융합 -- -- 0.288
결과는 고정된 DR5-Fc에 결합된 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2의 양이 히스티딘 태그된 TRAIL의 존재에 의해 영향을 받지 않았음을 나타내고, 그로써 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2 중 어느 것도 DR5의 TRAIL 리간드 결합 부위를 차단하지 않음을 나타낸다. 추가적으로, 어느 항체도 히스티딘 태그된 TRAIL 리간드에 결합할 수 없었다.
X. 실시예 2: 항-인간 DR5 단클론성 항체 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 종 특이성
항-인간 DR5 단클론성 항체 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 종 특이성을 평가하기 위하여, 항체들의 인간 DR5에 결합하는 능력을 사이노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis) DR5에 결합하는 능력과 비교하였다. 이 실험의 결과를 도 6에 나타낸다. 결과는 두 항체 모두 사이노몰구스 원숭이 DR5에 결합할 수 있지만, 인간 DR5에 대해 더 높은 결합 친화성을 나타내는 것을 보여준다.
결합의 동역학을, 도 7에 도시된 것과 같이, Biacore 분석을 사용하여 연구조사하였다. 이중-특이적 DR5 x CD3 다이아바디를 His-태그된 DR5와 함께 인큐베이션하였고, 결합의 동역학을 Biacore 분석을 통해 측정하였다. 사용한 다이아바디는 DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 (도 7, 패널 A 및 E), DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 (도 7, 패널 B 및 F), DR5 mAb 3 x CD3 mAb 2 (도 7, 패널 C 및 G) 및 DR5 mAb 4 x CD3 mAb 2 (도 7, 패널 D 및 H)이었다. 도 7, 패널 A 내지 D는 인간 DR5에 대한 결과를 나타낸다. 도 7, 패널 E 내지 H는 사이노몰구스 원숭이 DR5에 대한 결과를 나타낸다. 계산된 ka, kd 및 KD를 표 6에 나타낸다.
항-DR 항체 인간 사이노몰구스 원숭이
ka kd KD (nM) ka kd KD (nM)
DR mAb 1 8.5 x 106 1.2 x 10-3 0.14 4.0 x 106 1.3 x 10-1 32.5
DR mAb 2 3.4 x 105 2.1 x 10-4 0.62 2.4 x 105 1.0 x 10-4 0.42
DR mAb 3 4.2 x 106 3.7 x 10-2 8.8 3.3 x 106 4.4 x 10-2 13.3
DR mAb 4 5.4 x 106 1.7 x 10-2 3.2 2.5 x 106 4.1 x 10-2 16.4
결과는 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2가 참조 항체 DR5 mAb 3 및 DR5 mAb 4에 관련하여 결합의 변경된 동역학을 나타내는 것을 증명한다.
Y. DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 예상 외의 월등성
본 발명의 DR5-결합 분자 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 세포독성을 중재하는 능력을 참조 항-DR5 항체: DR5 mAb 3 및 DR5 mAb 4의 능력과 비교하였다. 그런 비교를 이루기 위하여, 이들 항체의 VL 및 VH 도메인과 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 함유하는 이중-특이성 DR5 x CD3 다이아바디를 제조하였다. 제조한 항체는 DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2; DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2; DR5 mAb 3 x CD3 mAb 2; 및 DR5 mAb 4 x CD3 mAb 2이었다.
사용한 대조 다이아바디는 항-플루오레세인 항체 4-4-20의 VL 및 VH 도메인 (각각 SEQ ID NO:138 및 139), 및 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인 (각각 SEQ ID NO:102 및 108)을 함유하였고, 항-플루오레세인 x 항-CD3 대조 항체 "4-4-20 x CD3 mAb 2"로 표시하였다. 다이아바디는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되었다. 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:300)을 가졌다 (CDR은 밑줄로 표시됨):
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSNGNTYLR W YLQKPGQSPK VLIY KVSNRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP W TFGGGTKLE IKGGGSGGGG
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMN WVRQA PGKGLEWVA R IRSKYNNYAT
YYADSVKD RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK.
SEQ ID NO:300에서, 아미노산 잔기 1 내지 112는 항-플루오레세인 항체 4-4-20의 VL 도메인 (SEQ ID NO:138)에 해당하고, 잔기 113 내지 120은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 121 내지 245는 CD3 mAb 2의 VH 도메인 (SEQ ID NO:108)에 해당하고, 잔기 246 내지 251은 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (GGCGGG) (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 252 내지 280은 E-코일 도메인 (SEQ ID NO:39)에 해당한다.
다이아바디의 제 2 폴리펩티드 사슬은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:301)을 가졌다 (CDR은 밑줄로 표시됨):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV
KLDETGGGLV QPGRPMKLSC VA SGFTFSDY WMN WVRQSPE KGLEWVA QIR NKPYNYETYY
SDSVKG RFTI SRDDSKSSVY LQMNNLRVED MGIYYCTG SY YGMDY WGQGT SVTVSSGGCG
GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
SEQ ID NO:301에서, 아미노산 잔기 1 내지 110은 CD3 mAb 2의 VL 도메인 (SEQ ID NO:104)에 해당하고, 잔기 111 내지 118은 개재하는 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1) (SEQ ID NO:33)에 해당하며, 잔기 119 내지 236은 항-플루오레세인 항체 4-4-20의 VH 도메인 (SEQ ID NO:139)에 해당하고, 잔기 237 내지 242는 시스테인-함유 스페이서 펩티드 (GGCGGG) (SEQ ID NO:34)에 해당하며, 잔기 243 내지 270은 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)에 해당한다.
표적 종양 세포를 이들 다이아바디 중 하나 또는 대조 항체 (4-4-20 x CD3 mAb 2)와 함께 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 A549 선암종 인간 포상 기저 상피 세포의 존재하에 24시간 동안 20:1의 이펙터 대 표적 세포 비율에서 인큐베이션하였다. 백분율 세포독성을 손상된 세포에 의한 락테이트 데하이드로게나제 (LDH)의 배지로의 방출을 측정함으로써 측정하였다.
이 연구조사의 결과를 도 8에 도시한다. 유사한 결과를 SKMES 인간 폐암 세포, DU145 인간 전립선암 세포, A375 인간 악성 흑색종 세포, SKBR3 인간 HER2-과잉발현 유방 암종 세포 및 JIMT 인간 유방 암종 세포를 사용하여 얻었다. 결과는 DR5 mAb1 및 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인이 참조 DR5 mAb의 도메인들보다 세포독성을 유도함에 있어 유의미하게 그리고 예상 외로 더 강력한 것을 나타낸다.
Z. 실시예 4: 삼중특이적 결합 분자들은 표적 세포에 대한 동조된 및 동시의 결합을 중재한다
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들의 표적 세포에 결합하는 능력을 연구조사하였다. 사용한 삼중특이적 분자들은 다음과 같았다: EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1; EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1; 및 gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1. 도 9a에 도시된 것과 같이, EphA2 암 항원-결합 도메인을 포함하는 그런 삼중-특이적 결합 분자들은 EphA2-발현 CHO 표적 세포에 결합할 수 있는 것으로 나타났다. 도 9b에 도시된 것과 같이, DR5 암 항원-결합 도메인을 포함하는 그런 삼중-특이적 결합 분자들은 DR5-발현 CHO 표적 세포에 결합할 수 있는 것으로 나타났다. 도 9c에 도시된 것과 같이, EphA2 암 항원-결합 또는 DR5 암 결합 도메인을 포함하는 그런 삼중-특이적 결합 분자들은 DU145 세포에 결합할 수 있는 것으로 나타났다. DU145 세포는 EphA2 및 DR5 둘 다를 발현하지만 gpA33은 발현하지 않는 인간 전립선 셀라인이다. 상기-기술된 참조 gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 다이아바디를 대조표준으로서 사용하였다.
중요하게도, 데이터는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 2개의 암 항원-결합 도메인 둘 다 표적 세포에 결합할 수 있고, 그런 이중 결합은 표적 결합의 상조적 (예컨대 5 내지 25배) 증대와 관련되는 것을 보여준다.
AA. 실시예 5: 삼중특이적 결합 분자들은 결합된 표적 세포의 세포독성을 중재한다
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자들의 세포독성 림프구의 존재하에서의 결합된 표적 세포의 세포독성을 중재하는 능력을 연구조사하였다. 사용한 삼중특이적 분자들은 다음과 같았다: EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1; EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1; 및 gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1. 상기-기술된 참조 gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 다이아바디 및 4-4-20 x CD3 mAb 2 다이아바디를 대조표준으로서 사용하였다.
도 10a에 도시된 것과 같이, EphA2 암 항원-결합 도메인을 포함하고, 그로써 EphA2-발현 CHO 세포에 결합할 수 있었던 그런 삼중-특이적 결합 분자들은 세포독성 림프구의 존재하에 그런 세포들의 세포독성을 중재할 수 있었다. 도 10b에 도시된 것과 같이, DR5 암 항원-결합 도메인을 포함하고, 그로써 DR5-발현 CHO 세포에 결합할 수 있었던 그런 삼중-특이적 결합 분자들은 세포독성 림프구의 존재하에 DR5-발현 CHO 표적 세포들의 세포독성을 중재할 수 있는 것으로 나타났다.
도 10c에 도시된 것과 같이, EphA2 암 항원-결합 도메인 또는 DR5 암 결합 도메인을 포함하고, 그로써 DU145 세포에 결합할 수 있는 그런 삼중-특이적 결합 분자들은 세포독성 림프구의 존재하에 그런 세포들의 세포독성을 중재할 수 있었다. 중요하게도, 데이터는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 2개의 암 항원-결합 도메인 둘 다 표적 세포에 결합할 수 있을 때, 그런 이중 결합은 표적 결합의 상조적 증대와 관련되는 것을 보여준다. 그러므로, EphA2 및 DR5 둘 다에 결합할 수 있는 EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1은 DU145 세포의 EphA2 또는 DR5 분자에만 결합할 수 있었던 (그런 세포는 gpA33이 결핍되어 있기 때문에) EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1 또는 gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1보다 실질적으로 더 큰 세포독성을 중재하였다.
이런 관점에서, EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 대략 EC50에서, EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1 또는 gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 어느 것에 대해서도 세포독성 림프구 반응을 볼 수 없었다. EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1의 대략 EC90에서, EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1은 단지 EC15를 나타내고, gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1은 전혀 세포독성 림프구 반응을 나타내지 않는다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개물 및 특허는 각각의 개별적인 공개물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 전체 내용이 참조로 포함된 것을 나타내는 것과 동일한 정도로 참조로 본원에 포함된다. 발명이 그것의 특정 구체예들과 관련하여 기술된 한편으로, 추가의 변형이 가능하고, 일반적으로, 본 개시로부터의 그런 일탈을 포함하여 발명의 원리를 따르는 발명의 어떠한 변화, 용도 또는 적응을, 발명이 속하는 기술분야 내에서 공지되거나 관습적인 실시의 범위 안에 있는 것으로서 및 지금까지 설명된 본질적인 특징들에도 적용될 수 있는 것으로서 포함하는 것으로 의도된 것임이 인지될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MacroGenics, Inc. Bonvini, Ezio Moore, Paul A. Li, Jonathan C. Johnson, Leslie S. Shah, Kalpana <120> Tri-Specific Binding Molecules That Specifically Bind to Multiple Cancer Antigens and Methods of Use Therof <130> 1301.0119PCT <150> US 62/107,824 <151> 2015-01-26 <150> US 62/008,229 <151> 2014-06-05 <150> US 62/004,571 <151> 2014-05-29 <160> 319 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> Human Wild-Type IgG CH2-CH3 Domain <400> 1 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 2 <211> 440 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(440) <223> Human DR5 Precursor (NCBI Sequence NP_003833.4) <400> 2 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu 20 25 30 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu 35 40 45 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 50 55 60 Gln Arg Val Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser 85 90 95 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe 100 105 110 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro 115 120 125 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 130 135 140 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Ala Pro 180 185 190 Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro 195 200 205 Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val 210 215 220 Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val 225 230 235 240 Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu 245 250 255 Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Leu 260 265 270 Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu 275 280 285 Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn Met Leu Ser 290 295 300 Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg Ser 305 310 315 320 Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu 325 330 335 Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp 340 345 350 Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile 355 360 365 Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr 370 375 380 Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His 385 390 395 400 Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln 405 410 415 Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu 420 425 430 Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 435 440 <210> 3 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(111) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 1") Light Chain Variable Domain <400> 3 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Val Leu Ile Phe Leu Ser Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Asp Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 1") Light Chain Variable Domain CDRL1 <400> 4 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 1") Light Chain Variable Domain CDRL2 <400> 5 Leu Ser Ser Asn Leu Asp Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 1") Light Chain Variable Domain CDRL3 <400> 6 Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 7 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(333) <223> Polynucleotide Encoding Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 1") Light Chain Variable Domain <400> 7 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 8 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(121) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 1") Heavy Chain Variable Domain <400> 8 Glu Val Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Asn Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 1") Heavy Chain Variable Domain CDRH1 <400> 9 Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 1") Heavy Chain Variable Domain CDRH2 <400> 10 Glu Ile Asn Pro Asp Ser Asn Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Asp <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 1") Heavy Chain Variable Domain CDRH3 <400> 11 Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(363) <223> Polynucleotide Encoding Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 1") Heavy Chain Variable Domain <400> 12 gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc 60 tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct 120 ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat 180 acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat 240 ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc 300 tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360 tcc 363 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(107) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 2") Light Chain Variable Domain <400> 13 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Lys Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Thr Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 2") Light Chain Variable Domain CDRL1 <400> 14 Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 2") Light Chain Variable Domain CDRL2 <400> 15 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 2") Light Chain Variable Domain CDRL3 <400> 16 Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 17 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> Polynucleotide Encoding Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 2") Light Chain Variable Domain <400> 17 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaacca 120 gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct 240 gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(119) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 2") Heavy Chain Variable Domain <400> 18 Lys Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Ile Leu His Trp Val Lys Gln Lys Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 2") Heavy Chain Variable Domain CDRH1 <400> 19 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Leu His 1 5 10 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 2") Heavy Chain Variable Domain CDRH2 <400> 20 Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 2") Heavy Chain Variable Domain CDRH3 <400> 21 His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(357) <223> Polynucleotide Encoding Murine Anti-Human DR5 Antibody ("DR5 mAb 2") Heavy Chain Variable Domain <400> 22 aaggtccagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtgaaac ccggggcatc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctgggta caccttcact gagtatattt tacactgggt aaagcagaag 120 tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg ttttatcctg gaaataataa tataaagtac 180 aatgagaaat tcaaggacaa ggccacactg actgcggaca aatcctccag cacagtctat 240 atggaactta gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagacacgaa 300 caaggaccag gttactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcc 357 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human DR5 Antibody ("hDR5 mAb 2 VL-2") Light Chain Variable Domain <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys 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Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human DR5 Antibody ("hDR5 mAb 2 VL-3") Light Chain Variable Domain <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Humanized Anti-Human DR5 Antibody ("hDR5 mAb 2 VL-3") Light Chain Variable Domain <400> 26 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat 180 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gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagcca 240 gaggatatcg ctacatacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa a 321 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human DR5 Antibody ("hDR5 mAb 2 VL-5") Light Chain Variable Domain <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 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Human IgG Fc Domain <400> 53 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln 195 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Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(108) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody (Conatumumab; "DR5 mAb 4") Light Chain Variable Domain <400> 62 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody (Conatumumab; "DR5 mAb 4") Light Chain Variable Domain CDRL1 <400> 63 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> 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Chain Variable Domain CDRH2 <400> 100 Trp Met Asn Pro Asp Thr Asp Ser Thr Gly Tyr Pro Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> Murine Anti-Human DR5 Antibody (KMTR2; "DR5 mAb 8") Heavy Chain Variable Domain CDRH3 <400> 101 Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Arg Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 102 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> Murine Anti-Human CD2 Antibody (Lo-CD2A mAb ) Light Chain Variable Domain <400> 102 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Leu Ala Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Thr Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Pro Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Phe 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musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Murine Anti-Human CD3 Antibody ("CD3 mAb 2") Light Chain Variable Domain CDRL3 <400> 107 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val 1 5 <210> 108 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> Murine Anti-Human CD3 Antibody ("CD3 mAb 2") Heavy Chain Variable Domain <400> 108 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 109 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> 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(1)..(113) <223> Murine Anti-Human CD22 Antibody (Epratuzumab) Light Chain Variable Domain <400> 124 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ala Asn His Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Leu Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Gln Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 125 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(116) <223> Murine Anti-Human CD22 Antibody (Epratuzumab) Heavy Chain Variable Domain <400> 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 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Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Thr Gly Asp Arg Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 130 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> Murine Anti-Human CD79 Antibody ("CD794 mAb 1") Light Chain Variable Domain <400> 130 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Asn Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Thr 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gln Gly Ser 35 40 45 Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 131 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(113) <223> Murine Anti-Human CD79 Antibody ("CD794 mAb 1") Heavy Chain Variable Domain <400> 131 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Val Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Met Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 132 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(106) <223> Murine Anti-Human TCR Antibody (BMA 031) Light Chain Variable Domain <400> 132 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 133 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(120) <223> Murine Anti-Human TCR Antibody (BMA 031) Heavy Chain Variable Domain <400> 133 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 134 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(108) <223> Murine Anti-Human NKG2D Antibody (KYK-1.0) Light Chain Variable Domain <400> 134 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Pro Cys Gly Gly Asp Asp Ile Glu Thr Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Phe Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Ser Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asp Asn Asn Asp Glu 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 135 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(118) <223> Murine Anti-Human NKG2D Antibody (KYK-1.0) Heavy Chain Variable Domain <400> 135 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Lys Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Phe Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 136 <211> 110 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(110) <223> Murine Anti-Human NKG2D Antibody (KYK-2.0) Light Chain Variable Domain <400> 136 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 137 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(121) <223> Murine Anti-Human NKG2D Antibody (KYK-2.0) Heavy Chain Variable Domain <400> 137 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 138 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> Murine Anti-Fluorescein Antibody 4-4-20 Light Chain Variable Domain <400> 138 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 139 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(118) <223> Murine Anti-Fluorescein Antibody 4-4-20 Heavy Chain Variable Domain <400> 139 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 140 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of "DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 Diabody" <400> 140 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Val Leu Ile Phe Leu Ser Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Asp Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 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tttcatccaa cctagattct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggaggcg gatccggcgg cggaggcgag 360 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gagggtccct gagactctcc 420 tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca tacgctatga attgggtccg ccaggctcca 480 gggaaggggc tggagtgggt tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac 540 tatgccgact ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg 600 tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg tgtgagacac 660 ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt ggggacaggg gacactggtg 720 actgtgtctt ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct 780 ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa a 831 <210> 142 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of "DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 Diabody" <400> 142 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 225 230 235 240 Ser Thr Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu 245 250 255 Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 265 270 <210> 143 <211> 816 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Second Polypeptide Chain of "DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 Diabody" <400> 143 caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg 60 acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag 120 aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc 180 cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca 240 caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc 300 gggggtggca caaaactgac tgtgctggga ggtggtggat ccggcggcgg aggcgaggtg 360 aagtttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt 420 gtagcctcag gattcgattt tagtagatac tggatgagtt gggtccggca ggctccaggg 480 aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca atacgataaa ctatacgcca 540 tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca aaaatacgct gtatctgcaa 600 atgaccaaag tgagatctga ggacacagcc ctttattatt gtacaagaag ggcctactat 660 ggtaacccgg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 720 tccaccaagg gcaaagtggc cgcatgtaag gagaaagttg ctgctttgaa agagaaggtc 780 gccgcactta aggaaaaggt cgcagccctg aaagag 816 <210> 144 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of "DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 Diabody" <400> 144 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Lys Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Thr Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 115 120 125 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 130 135 140 Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr 165 170 175 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 180 185 190 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 195 200 205 Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val 210 215 220 Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala 245 250 255 Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu 260 265 270 Lys <210> 145 <211> 819 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding First Polypeptide Chain of "DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 Diabody" <400> 145 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaacca 120 gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct 240 gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg 360 gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct 420 ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg 480 gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct 540 gtgaagggta gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg 600 aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc 660 aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc 720 gcctccacca agggcgaagt ggccgcatgt gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag 780 gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaa 819 <210> 146 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of "DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 Diabody" <400> 146 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Lys Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu 115 120 125 Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly 130 135 140 Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Leu His Trp Val Lys Gln Lys Ser Gly 145 150 155 160 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile 165 170 175 Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys 180 185 190 Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp 195 200 205 Ser 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gggtaaagca gaagtctgga 480 cagggtcttg agtggattgg gtggttttat cctggaaata ataatataaa gtacaatgag 540 aaattcaagg acaaggccac actgactgcg gacaaatcct ccagcacagt ctatatggaa 600 cttagtagat tgacatctga agactctgcg gtctatttct gtgcaagaca cgaacaagga 660 ccaggttact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc cgcctccacc 720 aagggcaaag tggccgcatg taaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca 780 cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag 810 <210> 148 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of "DR5 mAb 3 x CD3 mAb 2 Diabody" <400> 148 Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr 1 5 10 15 Val Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly 35 40 45 Ala Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 65 70 75 80 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ala Asp Ser Ser Gly Asn His Val 85 90 95 Val Phe 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musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> Murine Anti-Human EphA2 Antibody ("EphA2 mAb 2") Light Chain Variable Domain CDRL1 <400> 164 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 165 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Murine Anti-Human EphA2 Antibody ("EphA2 mAb 2") Light Chain Variable Domain CDRL2 <400> 165 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 166 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> Murine Anti-Human EphA2 Antibody ("EphA2 mAb 2") Light Chain Variable Domain CDRL3 <400> 166 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Thr 1 5 <210> 167 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(118) <223> Murine Anti-Human EphA2 Antibody ("EphA2 mAb 2") Heavy Chain Variable Domain <400> 167 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly 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gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg 300 actaaactgg aaatcaag 318 <210> 186 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(119) <223> Murine Anti-Human gpA33 Antibody ("gpA33 mAb 1") Heavy Chain Variable Domain <400> 186 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 187 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> Murine Anti-Human gpA33 Antibody ("gpA33 mAb 1") Heavy Chain Variable Domain CDRH1 <400> 187 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser Trp Met Asn 1 5 10 <210> 188 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> Murine Anti-Human gpA33 Antibody ("gpA33 mAb 1") Heavy Chain Variable Domain CDRH2 <400> 188 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 189 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> Murine Anti-Human gpA33 Antibody ("gpA33 mAb 1") Heavy Chain Variable Domain CDRH3 <400> 189 Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 190 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(357) <223> Polynucelotide Encoding Murine Anti-Human gpA33 Antibody ("gpA33 mAb 1") Heavy Chain Variable Domain <400> 190 caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag cgtgaaggtc 60 tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga tgaactgggt gaggcaggct 120 ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc atctaccctg gagacggcga aactaactat 180 aatggaaagt tcaaagaccg agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac 240 atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac 300 ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctcc 357 <210> 191 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(109) <223> Murine Anti-Human Her2 Antibody ("Her2 mAb 1") Light Chain Variable Domain <400> 191 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 192 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(120) <223> Murine Anti-Human Her2 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(Cetuximab) Heavy Chain Variable Domain <400> 202 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 203 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human VEGF Antibody (Bevacizumab) Light Chain Variable Domain <400> 203 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu 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ctctgacctt cggacagggg 300 actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag 360 tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga 420 ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag 480 tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg 540 aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac 600 agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat 660 tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga 720 ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag 780 gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac 840 acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 900 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1260 ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1380 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500 ccgggtaaa 1509 <210> 214 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 214 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 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Encoding Second Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 215 caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg 60 acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag 120 aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc 180 cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca 240 caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc 300 gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc 360 cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc 420 aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga 480 cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga 540 aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag 600 ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac 660 aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt 720 ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc 780 gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag 813 <210> 216 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Third Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 216 Glu Val Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Asn Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp 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Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 217 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Third Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 217 gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc 60 tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct 120 ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat 180 acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat 240 ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc 300 tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360 tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 218 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fourth Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 218 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Val Leu Ile Phe Leu Ser Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Asp Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 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catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654 <210> 220 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2" Tri-Specific Binding Molecule <400> 220 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly 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ggagaaggag 780 gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac 840 acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 900 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1260 ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1380 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500 ccgggtaaa 1509 <210> 222 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 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caagcgtgaa ggtctcctgc 420 aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga 480 cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga 540 aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag 600 ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac 660 aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt 720 ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc 780 gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag 813 <210> 224 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Third Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2" Tri-Specific Binding Molecule <400> 224 Lys Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Ile Leu His Trp Val Lys Gln Lys Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser 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acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 226 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fourth Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2" Tri-Specific Binding Molecule <400> 226 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly 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cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaacca 120 gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct 240 gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat cggtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 228 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 228 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 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gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag 480 tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg 540 aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac 600 agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat 660 tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga 720 ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag 780 gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac 840 acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 900 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1260 ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1380 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500 ccgggtaa 1508 <210> 230 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 230 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly 115 120 125 Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly 130 135 140 Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly 145 150 155 160 Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp 165 170 175 Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser 180 185 190 Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr 195 200 205 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys His Gly Asn Tyr Tyr Thr Met Asp 210 215 220 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly 225 230 235 240 Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 245 250 255 Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 265 270 <210> 231 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Second Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 231 caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg 60 acatgcagat ccagcacagg 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Binding Molecule <400> 232 Glu Val Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Asn Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 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Artificial Sequence <220> <223> Fourth Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 234 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Val Leu Ile Phe Leu Ser Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Asp Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 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atatgctgat 540 gacttcaagg gacggtttgt cttctctttg gaaacctctg ccagcactgc ctatttgcag 600 atcaacaacc tcaaaaatga ggacatggcc acatatttct gtgcaagaga actgggacca 660 tactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctccgg aggatgtggc 720 ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca 780 cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag 810 <210> 240 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Third Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 240 Glu Val Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Asn Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Ala Trp Phe Ala 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ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 242 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fourth Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 242 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Val Leu Ile Phe Leu Ser Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu 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caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654 <210> 244 <211> 504 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 244 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser His Arg Ser Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 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tgccgactct 540 gtgaagggta gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg 600 aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc 660 aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc 720 ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag 780 gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact 840 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc 900 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 960 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1020 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1080 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1140 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1200 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1260 agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1320 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1380 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1440 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1500 tctccgggta aa 1512 <210> 246 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 246 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 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acaaaagggc tccctggacc 180 cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca 240 caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc 300 gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggagaagtg 360 cagctggtgg agtctggggg aggctcagtg aagcctggag ggtccctgaa actctcctgt 420 gcagcctctg gattcacttt cactgaccat tacatgtatt gggttcgcca gactccggaa 480 aagaggctgg agtgggtcgc aaccattagt gatggcggta gtttcacctc ctatccagac 540 agtgtgaagg ggcgattcac catctccaga gacattgcca agaacaacct gtacctccaa 600 atgagcagtc tgaagtctga ggacacagcc atgtattact gtacaagaga tgagagcgat 660 aggccgtttc cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctcctccgg aggatgtggc 720 ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca 780 cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag 810 <210> 248 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Third Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 248 Glu Val Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 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gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 250 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fourth Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x 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cctccggggt gccatctcgg 180 ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa 240 gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg 300 actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag 360 tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga 420 ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag 480 tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg 540 aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac 600 agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat 660 tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga 720 ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag 780 gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac 840 acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 900 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1260 ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1380 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500 ccgggtaaa 1509 <210> 254 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 254 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu 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gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac 660 aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt 720 ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc 780 gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag 813 <210> 256 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Third Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 256 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Lys His Gly Asn Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro 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240 aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aaaacatggt 300 aactactata ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctccgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca 720 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgag ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgcta cacgcagaag 1320 agcctctccc tgtctccggg taaa 1344 <210> 258 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fourth Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 258 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 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ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaacg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct 360 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 639 <210> 260 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2" Tri-Specific Binding Molecule <400> 260 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr 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gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc 360 cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc 420 aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga 480 cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga 540 aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag 600 ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac 660 aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt 720 ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc 780 gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag 813 <210> 264 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Third Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2" Tri-Specific Binding Molecule <400> 264 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly 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Third Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2" Tri-Specific Binding Molecule <400> 265 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctgggtt taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct atattggaga gccgacatat 180 gctgatgact tcaagggacg gtttgtcttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggccacat atttctgtgc aagagaactg 300 ggaccatact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctccgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca 720 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgag ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgcta cacgcagaag 1320 agcctctccc tgtctccggg taaa 1344 <210> 266 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Fourth Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2" Tri-Specific Binding Molecule <400> 266 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 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Fourth Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2" Tri-Specific Binding Molecule <400> 267 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc 300 acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654 <210> 268 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 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aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag 360 tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga 420 ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag 480 tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg 540 aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac 600 agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat 660 tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga 720 ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag 780 gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac 840 acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 900 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1260 ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1380 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500 ccgggtaaa 1509 <210> 270 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 3" Tri-Specific Binding Molecule <400> 270 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 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"gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 3" Tri-Specific Binding Molecule <400> 271 caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg 60 acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag 120 aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc 180 cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca 240 caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc 300 gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc 360 cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc 420 aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga 480 cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga 540 aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag 600 ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac 660 aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt 720 ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc 780 gcacttaagg 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agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca 720 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgag ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgcta cacgcagaag 1320 agcctctccc tgtctccggg taaa 1344 <210> 274 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fourth Polypeptide Chain of "gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 3" Tri-Specific Binding Molecule <400> 274 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser His Arg Ser Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Trp Ala Ser Thr Arg His Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Gly Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 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ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 276 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 276 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 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acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 900 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1260 ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1380 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500 ccgggtaaa 1509 <210> 278 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 278 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu 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gcctccagga 480 aagggtctgg agtggctggg aatgatatgg ggtggtggaa gcacagacta taattcagct 540 ctcaaatcca gactgagtat cagcaaggac aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg 600 aacagtctgc aaactgatga cacagccatg tactactgtg ccagaaaaca tggtaactac 660 tatactatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctccgg aggatgtggc 720 ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca 780 cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag 810 <210> 280 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Third Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 280 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 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catcaggcta tacatttaca ggcagctgga tgaactgggt gaggcaggct 120 ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc atctaccctg gagacggcga aactaactat 180 aatggaaagt tcaaagaccg agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac 240 atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac 300 ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctccgcc 360 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg 720 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 282 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fourth Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 282 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu 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Fourth Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 290 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 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gattttctgg gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct 240 ggagacctgg cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa aggtggagga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg 360 gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct 420 ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg 480 gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct 540 gtgaagggta gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg 600 aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc 660 aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc 720 ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag 780 gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact 840 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc 900 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 960 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1020 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1080 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1140 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1200 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1260 agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1320 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1380 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1440 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1500 tctccgggta aa 1512 <210> 294 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 294 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 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ggacacagcc atgtattact gtacaagaga tgagagcgat 660 aggccgtttc cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctcctccgg aggatgtggc 720 ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca 780 cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag 810 <210> 296 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Third Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 296 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro 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taccgcctac 240 atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac 300 ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctccgcc 360 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg 720 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 298 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fourth Polypeptide Chain of "EphA2 mAb 3 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1" Tri-Specific Binding Molecule <400> 298 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 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ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg 300 actaaactgg aaatcaagcg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct 360 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 639 <210> 300 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of "4-4-20 x CD3 mAb 2" Diabody <400> 300 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 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<211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(120) <223> Murine Anti-Human CD317 Antibody ("HM1.24 mAb 1") Heavy Chain Variable Domain <400> 303 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ile Leu Ala Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 304 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine Anti-Human CEACAM5 / CEACAM6 Antibody (16C3; EP 2585476) Light Chain Variable Domain <400> 304 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr 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<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> Murine Anti-Human 5T4 Antibody ("5T4 mAb 2") Light Chain Variable Domain <400> 310 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 311 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(127) <223> Murine Anti-Human 5T4 Antibody ("5T4 mAb 2") Heavy Chain Variable Domain <400> 311 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Asn Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Pro Leu Phe Thr Thr Val Val Asp Pro Asn Ser Tyr 100 105 110 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 312 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human ITGB6 Antibody (Derived from Antibody 3G9, PCT Publication No. WO 2007/008712) Light Chain Variable Domain <400> 312 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 313 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human ITGB6 Antibody (Derived from Antibody 3G9, PCT Publication No. WO 2007/008712) Heavy Chain Variable Domain <400> 313 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Phe Thr Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 314 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human ITGB6 Antibody (Derived from Antibody 8G6; PCT Publication No. WO 2007/008712) Light Chain Variable Domain <400> 314 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Asn Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 315 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-Human ITGB6 Antibody (Derived from Antibody 8G6; PCT Publication No. WO 2007/008712) Heavy Chain Variable Domain <400> 315 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Arg Gly Asp Arg Pro Ser Leu Gln Tyr Ala 100 105 110 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 316 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of "gpA33 x CD3 mAb 2" Diabody <400> 316 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 115 120 125 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr 165 170 175 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys 180 185 190 Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala 195 200 205 Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser 210 215 220 Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 225 230 235 240 Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu 245 250 255 Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 260 265 270 <210> 317 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of "gpA33 x CD3 mAb 2" Diabody <400> 317 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 115 120 125 Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 130 135 140 Tyr Thr Phe Thr Gly Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 145 150 155 160 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr 165 170 175 Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys 180 185 190 Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 195 200 205 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe 210 215 220 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 225 230 235 240 Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 245 250 255 Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 265 270 <210> 318 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(333) <223> Polynucleotide encoding Murine Anti-Human EphA2 Antibody ("EphA2 mAb 2") Light Chain Variable Domain (SEQ ID NO:163) <400> 318 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc 300 acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa 333 <210> 319 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(354) <223> Polynucelotide Encoding Murine Anti-Human EphA2 Antibody ("EphA2 mAb 3") Heavy Chain Variable Domain (SEQ ID NO:177) <400> 319 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcact gaccattaca tgtattgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gcggtagttt cacctcctat 180 ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca ttgccaagaa caacctgtac 240 ctccaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagatgag 300 agcgataggc cgtttcctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ctcc 354

Claims (20)

  1. 3개의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 삼중-특이적 결합 분자로서, 상기 에피토프는 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III이고, 상기 3개의 에피토프 중 2개는 암 항원(들)의 에피토프이며, 상기 3개의 에피토프 중 제 3은 이펙터 세포 항원의 에피토프인 삼중-특이적 결합 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 3개의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있고, 상기 결합 분자는 함께 공유적으로 복합체화된 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬을 포함하며
    (I) 제 1 항원에 존재하는 에피토프 I에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인 I 및 제 2 항원에 존재하는 에피토프 II에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인 II, 이때 상기 항원-결합 도메인 I 및 상기 항원-결합 도메인 II는 둘 다 다이아바디-형 결합 도메인이고;
    (II) 제 3 항원에 존재하는 에피토프 III에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인 III; 및
    (III) 2개의 CH2-CH3 도메인의 서로에의 복합체화에 의해 형성된 Fc 도메인을 포함하고,
    에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 하나는 이펙터 세포 항원의 에피토프이고, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 제 2는 제 1 암 항원의 에피토프이며, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 제 3은 제 2 암 항원의 에피토프이고, 결합 분자의 항원-결합 도메인 I, II 및 III은 상기 이펙터 세포 항원을 발현하는 면역 시스템 이펙터 세포 및 상기 제 1 및 제 2 암 항원을 발현하는 암세포의 동조된 결합을 중재하는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 세포의 표면에 배열된 Fc 수용체에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 세포 항원은 이펙터 세포의 표면에 배열되고 상기 암 항원은 암세포의 표면에 배열되며, 상기 면역특이적 결합은 상기 이펙터 세포 항원 및 상기 암 항원을 공동-정위시키기에 충분하고, 그로써 상기 암세포에 대한 상기 이펙터 세포의 활성화를 용이하게 하는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 세포 항원은 CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD22, CD32B, CD64, B 세포 수용체 (BCR), T 세포 수용체 (TCR) 및 NKG2D 수용체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 암 항원은 다음으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자: 대장암 항원 19.9; 위암 뮤신; 항원 4.2; 글리코단백질 A33 (gpA33); ADAM-9; 위암 항원 AH6; ALCAM; 악성 인간 림프구 항원 APO-1; 암 항원 B1; B7-H3; 베타-카테닌; 혈액 군 ALeb/Ley; 버킷 림프종 항원-38.13, 대장성 선암종 항원 C14; 난소 암종 항원 CA125; 카르복시펩티다제 M; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD30; CD33; CD36; CD45; CD46; CD52; CD79a/CD79b; CD103; CD317; CDK4; 암배아성 항원 (CEA); CEACAM5; CEACAM6; CO17-1A; CO-43 (혈액 군 Leb); CO-514 (혈액 군 Lea); CTA-1; CTLA4; 사이토케라틴 8; 항원 D1.1; 항원 D156-22; DR5; E1 시리즈 (혈액 군 B); EGFR (상피 성장 인자 수용체); 에프린 수용체 A2 (EphA2); ErbB1; ErbB3; ErbB4; GAGE-1; GAGE-2; GD2/GD3/GM2; 폐 선암종 항원 F3; 항원 FC10.2; G49, 강글리오시드 GD2; 강글리오시드 GD3; 강글리오시드 GM2; 강글리오시드 GM3; GD2; GD3; GICA 19-9; GM2; gp100; 인간 백혈병 T 세포 항원 Gp37; 흑색종 항원 gp75; gpA33; HER2 항원 (p185HER2); 인간 유지방 소체 항원 (HMFG); 인간 유두종 바이러스-E6/인간 유두종 바이러스-E7; 고분자량 흑색종 항원 (HMW-MAA); I 항원 (분화 항원) I(Ma); 인티그린 알파-V-베타-6 인티그린β6 (ITGB6); 인터류킨-13; 수용체 α2 (IL13Rα2); JAM-3; KID3; KID31; KS 1/4 pan-암종 항원; 인간 폐 암종 항원 L6 및 L20; LEA; LUCA-2; M1:22:25:8; M18; M39; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; Myl; N-아세틸글루코사미닐트란스페라제; 네오글리코단백질; NS-10; OFA-1; OFA-2; 온코스타틴 M; p15; 흑색종-관련 항원 p97; 다형태 상피 뮤신 (PEM); 다형태 상피 뮤신 항원 (PEMA); PIPA; 전립선-특이적 항원 (PSA); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 전립선 산 포스페이트; R24; ROR1; 스핑고지질; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn; T 세포 수용체 유도된 펩티드; T5A7; TAG-72; TL5 (혈액 군 A); TNF-α 수용체; TNF-β 수용체; TNF-γ 수용체; TRA-1-85 (혈액 군 H); 트란스페린 수용체; 종양-특이적 이식 항원 (TSTA), 암태아 항원-알파-페토단백질 (AFP); VEGF; VEGFR, VEP8; VEP9; VIM-D5; 및 Y 합텐, Ley.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 암 항원은 CD2, CD317, CEACAM5, CEACAM6, DR5, EphA2, gpA33, Her2, B7-H3; EGF, EGFR, VEGF 및 VEGFR로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-다이아바디-형 결합 도메인 III은 에피토프 III에 면역특이적으로 결합할 수 있는 상기 Fab-형 결합 도메인 (VLIII/VHIII)을 포함하고, 상기 분자는
    (A) N-말단에서 C-말단 방향으로:
    (1) 상기 3개의 에피토프 중 제 1에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLI);
    (2) 상기 3개의 에피토프 중 제 2에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHII);
    (3) 이종이량체-촉진 도메인; 및
    (4) IgG의 CH2 및 CH3 도메인
    을 포함하는 제 1 폴리펩티드 사슬;
    (B) N-말단에서 C-말단 방향으로:
    (1) 상기 3개의 에피토프 중 상기 제 2에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLII);
    (2) 상기 3개의 에피토프 중 상기 제 1에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHI); 및
    (3) 상보하는 이종이량체-촉진 도메인
    을 포함하는 제 2 폴리펩티드 사슬;
    (C) N-말단에서 C-말단 방향으로:
    (1) 상기 3개의 에피토프 중 제 3에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHIII); 및
    (2) CH1 도메인, 힌지 도메인 및 IgG의 CH2-CH3 도메인
    을 포함하는 제 3 폴리펩티드 사슬; 및
    (D) N-말단에서 C-말단 방향으로:
    (1) 상기 3개의 에피토프 중 상기 제 3에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLIII); 및
    (2) 경쇄 불변 도메인 (CL)
    을 포함하는 제 4 폴리펩티드 사슬을 포함하며;
    (i) 상기 VLI 및 VHI 도메인은 회합하여 상기 제 1 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 형성하고;
    (ii) 상기 VLII 및 VHII 도메인은 회합하여 상기 제 2 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 형성하며;
    (iii) 상기 VLIII 및 VHIII 도메인은 회합하여 상기 제 3 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 형성하고;
    (iv) 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 상기 CH2-CH3 도메인 및 상기 제 3 폴리펩티드 사슬의 상기 CH2-CH3 도메인은 회합하여 Fc 도메인을 형성하며;
    (v) 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합되고;
    (vi) 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합되며; 및
    (vii) 상기 제 3 및 제 4 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합되는
    것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  9. 제 8항에 있어서,
    (A) 상기 이종이량체-촉진 도메인은 E-코일이고 상기 상보하는 이종이량체-촉진 도메인은 K-코일이거나; 또는
    (B) 상기 이종이량체-촉진 도메인은 K-코일이고 상기 상보하는 이종이량체-촉진 도메인은 E-코일인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  10. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A) 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 상기 CH2-CH3 도메인들은 각각 SEQ ID NO:1의 서열을 가져서, 그것들의 회합으로부터 형성된 Fc 도메인은 정상적인 FcγR-중재된 이펙터 기능을 나타내거나; 또는
    (B) 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 상기 CH2-CH3 도메인은 SEQ ID NO:1의 서열과 관련하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 가져서, 그것들의 회합으로부터 형성된 Fc 도메인은 변경된 FcγR-중재된 이펙터 기능을 나타내는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은:
    (A) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환;
    (B) (1) F243L 및 P396L;
    (2) F243L 및 R292P; 및
    (3) R292P 및 V305I
    로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 치환;
    (C) (1) F243L, R292P 및 Y300L;
    (2) F243L, R292P 및 V305I;
    (3) F243L, R292P 및 P396L; 및
    (4) R292P, V305I 및 P396L
    로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 3개의 치환;
    (D) (1) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및
    (2) F243L, R292P, V305I 및 P396L
    로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 4개의 치환; 또는
    (E) (1) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L; 및
    (2) L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L
    로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 5개의 치환을 포함하는
    것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  13. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 상기 CH2-CH3 도메인은 서로 상이하고 SEQ ID NO:52 및 SEQ ID NO:53으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  14. 제 7항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A) 상기 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 상기 제 1 암 항원의 에피토프, 상기 제 2 암 항원의 에피토프 및 상기 이펙터 세포 항원의 에피토프이고;
    (B) 상기 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 상기 제 1 암 항원의 에피토프, 상기 이펙터 세포 항원의 에피토프 및 상기 제 2 암 항원의 에피토프이며;
    (C) 상기 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 상기 제 2 암 항원의 에피토프, 상기 제 1 암 항원의 에피토프 및 상기 이펙터 세포 항원의 에피토프이고;
    (D) 상기 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 상기 제 2 암 항원의 에피토프, 상기 이펙터 세포 항원의 에피토프 및 상기 제 1 암 항원의 에피토프이며;
    (E) 상기 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 상기 이펙터 세포 항원의 에피토프, 상기 제 1 암 항원의 에피토프 및 상기 제 2 암 항원의 에피토프이고; 및
    (F) 상기 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 상기 이펙터 세포 항원의 에피토프, 상기 제 2 암 항원의 에피토프 및 상기 제 1 암 항원의 에피토프인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A) 이펙터 세포 항원의 상기 에피토프는 항체 Lo-CD2a에 의해 인식되는 CD2 에피토프이거나;
    (B) 이펙터 세포 항원의 상기 에피토프는 항체 OKT3, M291, YTH12.5, 항-CD3 mAb 1 또는 항-CD3 mAb 2에 의해 인식되는 CD3 에피토프이거나;
    (C) 이펙터 세포 항원의 상기 에피토프는 항체 3G8 또는 A9에 의해 인식되는 CD16 에피토프이거나;
    (D) 이펙터 세포 항원의 상기 에피토프는 항체 MD1342, MEDI-551, 블리나투모맙 또는 HD37에 인식되는 CD19 에피토프이거나;
    (E) 이펙터 세포 항원의 상기 에피토프는 항체 리툭시맙, 이브리투모맙, 오파투무맙 및 토시투모맙에 의해 인식되는 CD20 에피토프이거나;
    (F) 이펙터 세포 항원의 상기 에피토프는 항체 에프라투주맙에 의해 인식되는 CD22 에피토프이거나;
    (G) 이펙터 세포 항원의 상기 에피토프는 항체 CD32B mAb1에 의해 인식되는 CD32B 에피토프이거나;
    (H) 이펙터 세포 항원의 상기 에피토프는 항체 CD64 mAb 1에 의해 인식되는 CD64 에피토프이거나;
    (I) 이펙터 세포 항원의 상기 에피토프는 항체 CD79 mAb 1에 의해 인식되는 BCR/CD79 에피토프이거나;
    (J) 이펙터 세포 항원의 상기 에피토프는 항체 BMA 031에 의해 인식되는 TCR 에피토프이거나; 또는
    (K) 이펙터 세포 항원의 상기 에피토프는 항체 KYK-2.0에 의해 인식되는 NKG2D 수용체 에피토프인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 삼중-특이적 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  17. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항 또는 제 15항에 있어서, 상기 분자가 암의 치료에 사용되는 삼중-특이적 결합 분자 또는 약학 조성물.
  18. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항 또는 제 15항에 있어서, 상기 암이 다음의 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 암세포의 존재를 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자 또는 약학 조성물: 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광암, 골암, 뇌 및 척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 명세포 암종, 대장암, 결장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 조직결합성 소원형 세포 종양, 뇌질피복 세포증, 유윙 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골섬유 불완전 형성증, 섬유성 골이형성, 담낭 또는 담관암, 위암, 임신성 영양 질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비 신생물 형성, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아과 암, 말초신경초 종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀성 혈액장애, 전이성 신장암, 횡문근양 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액막 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 전이성 갑상선암 또는 자궁암.
  19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 암이 결장암, 간세포 암종, 신경교종, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 방광암, 신경아세포종; 육종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암 또는 직장암인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자 또는 약학 조성물.
  20. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 암이 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 B 림프아성 백혈병 (B-ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 겸양세포 백혈병 (HCL), 모구형질세포양 수지상 세포 종양 (BPDCN), 비-호지킨 림프종 (NHL), 이를테면 외투막 세포 림프종 (MCL) 및 소 림프구성 림프종 (SLL), 호지킨 림프종, 전신성 비만세포증 또는 버킷 림프종인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자 또는 약학 조성물.
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