BR112019021828B1 - Anticorpo anti-pd-l1, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira de levedura compreendendo a referida molécula de ácido nucleico, composição compreendendo o anticorpo anti-pdl1 e uso do referido anticorpo para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada à modulação da atividade da pd-l1 humana - Google Patents

Abstract

São divulgados anticorpos anti-PD-L1 totalmente humanos e suas aplicações correspondentes. Anticorpos totalmente humanos são capazes de se ligar especificamente à PD-L1 humana. Os anticorpos foram obtidos empregando-se uma técnica de seleção baseada em biblioteca de yeast display e também pela maturação por afinidade para melhorar ainda mais a afinidade à PD-L1. Os anticorpos anti-PD-L1 totalmente humanos divulgados apresentam boa especificidade, afinidade e estabilidade. Eles são capazes de melhorar a atividade das células T ligando-se às células T ativadas, enquanto inibem significativamente o crescimento tumoral. Os anticorpos anti-PD-L1 totalmente humanos divulgados podem ser utilizados no diagnóstico e tratamento de cânceres relacionados à PD-L1 e outras doenças associadas.

Description

CAMPO

[001] A presente divulgação refere-se ao campo da biomedicina e refere-se a anticorpos anti-PD-L1 totalmente humanos e usos farmacêuticos dos mesmos.

FUNDAMENTOS

[002] Quando as células T respondem a um antígeno exógeno, elas precisam de células apresentadoras de antígeno (APC) para fornecer dois sinais aos linfócitos T em repouso: o primeiro sinal é gerado quando as células T reconhecem peptídeos do antígeno ligados às moléculas de MHC com a ajuda do TCR, após o qual um sinal de reconhecimento antigênico é transmitido através de um complexo TCR/CD3; e o segundo sinal é fornecido por uma série de moléculas coestimulatórias; e dessa maneira, as células T podem ser ativadas normalmente, produzindo, assim, uma resposta imune normal. Essas moléculas coestimulatórias podem ser classificadas como moléculas coestimulatórias positivas ou moléculas coestimulatórias negativas, dependendo dos efeitos produzidos pelo segundo sinal, e a regulação dos sinais coestimulatórios positivos e negativos, bem como o equilíbrio relativo entre os referidos sinais, desempenham um importante papel regulador em toda a resposta imune do corpo.

[003] PD-1 é um membro da família de receptores CD28, e a referida família inclui também CTLA4, CD28, ICOS e BTLA. Os membros iniciais desta família, CD28 e ICOS, foram descobertos quando anticorpos monoclonais foram adicionados e observados mediante o aumento da proliferação de células T (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10: 247-260). Ligantes de PD-1 incluem PD-L1 e PD-L2, e os resultados do estudo já mostraram que a ligação do receptor a um ligante regula negativamente a ativação das células T e a secreção de citocinas relacionadas (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al. (2002) Eur J. Immunol 32: 634-43; Ohigashi et al. (2005) Clin Cancer Res 11: 2947-53).

[004] PD-L1 (B7-H1) é uma glicoproteína de superfície celular que pertence à família B7 e inclui regiões semelhantes a IgV e IgC, uma região transmembranar e uma região de cauda citoplasmática. O gene correspondente foi descoberto e clonado pela primeira vez em 1999 (Dong H, et al. (1999) Nat Med 5: 1365-1369) e determinou- se que a glicoproteína interage com PD-1, receptor de células T, e desempenha um papel importante na regulação negativa da resposta imune. Além de atuar sobre o PD- 1 expresso em células T, a PD-L1, quando expressa em células T, pode interagir com CD80 nas APCs para transmitir sinais negativos, funcionando como um inibidor de célula T. Além de ser expressa em células da linhagem de macrófagos, a PD-L1 também é expressa em níveis baixos em tecidos humanos normais, mas a glicoproteína apresenta uma expressão relativamente alta em certas linhagens de células tumorais, incluindo, por exemplo, de câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de cólon e melanoma (Iwai et al. (2002) PNAS 99: 12293-7; Ohigashi, et al. (2005) Clin Cancer Res 11: 2947-53). Os resultados do estudo sugeriram que o aumento da expressão de PD-L1 nas células tumorais aumenta a apoptose das células T, desempenhando um papel importante pois permite que as células tumorais escapem de uma resposta imune. Os pesquisadores descobriram que as linhagens de células tumorais P815 transfectadas com o gene PD-L1 podem apresentar resistência in vitro à lise por CTL específica, e as referidas células são extremamente tumorigênicas e invasivas quando inoculadas em camundongos. Essas propriedades biológicas podem ser revertidas através do bloqueio de PD-L1. Em camundongos knockout para PD-L1, a via PD-L1/PD-1 é bloqueada e as células tumorais inoculadas são incapazes de formar tumores (Dong H et al. (2002) Nat Med 8: 793-800).

[005] Ainda existe uma necessidade por um anticorpo anti-PD-L1 que seja capaz de se ligar a PD-L1 com alta afinidade e, deste modo, bloquear a ligação de PD-1 e PD-L1.

SUMÁRIO

[006] Em certos aspectos da presente invenção, um sistema de yeast display em conjunto com a seleção e maturação por afinidade foram utilizados para se obter um anticorpo anti-PD-L1 totalmente humano que apresenta boa especificidade, afinidade e estabilidade relativamente altas, realizando, desta forma, a presente invenção.

[007] O primeiro aspecto da presente invenção refere-se a um anticorpo anti- PD-L1 ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, que inclui um grupo de regiões CDR selecionadas de uma das seguintes: (1) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que correspondem às SEQ ID NO: 1-3, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve que correspondem às SEQ ID NO: 4-6, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente; (2) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que correspondem às SEQ ID NO: 7-9, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve que correspondem às SEQ ID NO: 10-12, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente; (3) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que correspondem às SEQ ID NO: 13-15, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve que correspondem às SEQ ID NO: 16-18, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente; (4) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que correspondem às SEQ ID NO: 1, 2 e 19, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve que correspondem às SEQ ID NO: 4-6, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente; (5) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que correspondem às SEQ ID NO: 7, 20 e 9, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve que correspondem às SEQ ID NO: 10-12, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente; (6) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que correspondem às SEQ ID NO: 13-15, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve que correspondem às SEQ ID NO: 21, 17 e 18, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente.

[008] Qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção também inclui um grupo de regiões de framework ou estruturais da região variável da cadeia pesada selecionadas de uma das seguintes: 1) sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 que correspondem às SEQ ID NO: 22-25, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente; 2) sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 que correspondem às SEQ ID NO: 30-33, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente; 3) Sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 que correspondem às SEQ ID NO: 38-41, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente; 4) Sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 que correspondem às SEQ ID NO: 30-33, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente.

[009] Qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção também inclui um grupo de regiões estruturais da região variável da cadeia leve selecionadas de uma das seguintes: 1) Sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 que correspondem às SEQ ID NO: 26-29, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente; 2) Sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 que correspondem às SEQ ID NO: 30-33, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente; 3) Sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 que correspondem às SEQ ID NO: 38-41, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente; 4) Sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 que correspondem às SEQ ID NO: 30-33, respectivamente, ou sequências que são mais de 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente.

[010] Qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção inclui um grupo de regiões variáveis da cadeia pesada selecionadas de uma das seguintes: 1) sequências correspondentes às SEQ ID NO: 47, 49, 51, 53 ou 54, ou uma sequência que é 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente.

[011] Qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno dos mesmos constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção inclui um grupo de regiões variáveis da cadeia leve selecionadas dentre as seguintes:(i) sequências correspondentes à SEQ ID NO: 48, 50, 52, 55 ou 56 ou uma sequência que é 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica a uma das sequências mencionadas acima, respectivamente.

[012] Qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção corresponde a um anticorpo completo, um anticorpo biespecífico, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 ou Fv.

[013] Em qualquer exemplo da presente invenção, quando a invenção é constituída por um scFv, um peptídeo de conexão também é incluído entre as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo anti-PD-L1 mencionado acima ou porção de ligação ao antígeno do mesmo.

[014] Em alguns exemplos específicos da presente invenção, a sequência do peptídeo de conexão mencionado acima é tal como mostrada na SEQ ID NO: 67.

[015] Qualquer exemplo dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno dos mesmos constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção corresponde a um anticorpo completo.

[016] Qualquer exemplo dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno dos mesmos constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção, em que a região constante da cadeia pesada é selecionada a partir de um grupo que compreende IgG, IgM, IgE, IgD e IgA.

[017] Em certos exemplos da presente invenção, a região constante da cadeia pesada é selecionada a partir de um grupo compreendendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

[018] Em exemplos específicos da presente invenção, a região constante da cadeia pesada corresponde a IgG1.

[019] Em certos exemplos específicos da presente invenção, a sequência de aminoácidos IgG1 é tal conforme mostrado na SEQ ID NO: 68.

[020] Qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção, em que a região constante da cadeia leve é uma região K ou uma região À.

[021] Em certos exemplos específicos da presente invenção, a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve k é tal como mostrada na SEQ ID NO: 70.

[022] Em certos exemplos específicos da presente invenção, a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve À é tal como mostrada na SEQ ID NO: 72.

[023] O segundo aspecto da presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que contém uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia pesada do anticorpo, em que a região variável da cadeia pesada do anticorpo mencionada acima inclui um grupo de sequências de aminoácidos selecionadas dentre as seguintes: (i) SEQ ID NO: 1-3; (ii) SEQ ID NO: 7-9; (iii) S EQ ID NO: 13-15; (iv) SEQ ID NO: 1, 2 e 19; (v) SEQ ID NO: 7, 20 e 9.

[024] Qualquer uma das moléculas de ácido nucleico constituídas pelo segundo aspecto da presente invenção, em que a região variável da cadeia pesada do anticorpo mencionada acima inclui um grupo de sequências de ácidos nucleicos que são selecionadas dentre as seguintes: SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 ou uma sequência criada pela substituição de um ou vários dos aminoácidos contidos na região estrutural de uma das sequências mencionadas acima.

[025] Em alguns exemplos da presente invenção, o ácido nucleico mencionado acima inclui uma sequência selecionada dentre as mostradas na SEQ ID NO: 57-61.

[026] Em alguns exemplos da presente invenção, o ácido nucleico mencionado acima contém também uma sequência de ácido nucléico que codifica uma região constante da cadeia pesada de anticorpo, em que a referida região constante da cadeia pesada é selecionada de um grupo compreendendo IgG, IgM, IgE, IgD e IgA.

[027] Em alguns exemplos da presente invenção, a região constante da cadeia pesada é selecionada de um grupo compreendendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

[028] Em um exemplo específico da presente invenção, a região constante da cadeia pesada corresponde a IgG1.

[029] Em um exemplo específico da presente invenção, a sequência de ácido nucleico IgG1 é tal como mostrada na SEQ ID NO: 69.

[030] O terceiro aspecto da presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que contém uma sequência de ácido nucleico capaz de codificar uma região variável da cadeia leve de anticorpo, em que a região variável da cadeia leve de anticorpo mencionada acima inclui um grupo de sequências de aminoácidos selecionadas dentre as seguintes: (ii) SEQ ID NO: 4-6; (iii) SEQ ID NO: 10-12; (iv) ) SEQ ID NO: 16-18; (v) ) SEQ ID NO: 21, 17 e 18.

[031] Qualquer uma das moléculas de ácido nucleico constituídas pelo terceiro aspecto da presente invenção, em que a região variável da cadeia leve do anticorpo mencionada acima inclui um grupo de sequências de ácidos nucleicos que são selecionadas dentre as seguintes: SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 ou uma sequência criada pela substituição de um ou vários dos aminoácidos contidos na região estrutural de uma das sequências mencionadas acima.

[032] Em alguns aspectos da presente invenção, o ácido nucleico mencionado acima inclui uma sequência selecionada dentre as mostradas na SEQ ID NO: 62-66.

[033] Em alguns aspectos da presente invenção, o ácido nucleico mencionado acima contém também uma sequência de ácido nucleico capaz de codificar uma região constante da cadeia leve de anticorpo, em que a referida região constante da cadeia leve é uma região K ou uma região À.

[034] Em um aspecto específico da presente invenção, a sequência de ácidos nucleicos da região constante da cadeia leve k é tal como mostrada na SEQ ID NO: 70.

[035] Em um aspecto específico da presente invenção, a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve À é tal como mostrada na SEQ ID NO: 72.

[036] O quarto aspecto da presente invenção refere-se a um vetor que contém qualquer um dos ácidos nucleicos constituídos pelo segundo ou terceiro aspecto da presente invenção.

[037] Qualquer um dos vetores constituídos pelo quarto aspecto da presente invenção contém qualquer um dos ácidos nucleicos constituídos pelo segundo aspecto da presente invenção e qualquer um dos ácidos nucleicos constituídos pelo terceiro aspecto da presente invenção.

[038] O quinto aspecto da presente invenção refere-se a uma célula hospedeira que contém qualquer um dos ácidos nucleicos constituídos pelo segundo ou terceiro aspecto da presente invenção ou qualquer um dos vetores constituídos pelo quarto aspecto da presente invenção.

[039] O sexto aspecto da presente invenção refere-se a um conjugado que contém qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção, bem como outras substâncias biologicamente ativas, em que o anticorpo anti-PD-L1 mencionado acima ou porção correspondente de ligação ao antígeno é conjugado com outra substância biologicamente ativa, diretamente ou através de um fragmento de conexão.

[040] Em alguns aspectos da presente invenção, a substância biologicamente ativa adicional mencionada acima é selecionada de um grupo composto por produtos químicos, toxinas, polipeptídeos, enzimas, isótopos, citocinas ou outras substâncias biologicamente ativas individuais ou suas misturas, que são capazes de, direta ou indiretamente, inibir o crescimento celular ou de matar células, ou inibir ou matar células de outra forma através da ativação de uma resposta imune, como Auristatina MMAE, Auristatina MMAF, Maitansina DM1, Maitansina DM4, caliqueamicina, duocarmicina MGBA, doxorrubicina, ricina, toxina diftérica e outras toxinas relacionadas, I131, interleucinas, fatores de necrose tumoral, quimiocinas, nanopartículas, etc.

[041] O sétimo aspecto da presente invenção refere-se a uma composição (como uma composição farmacêutica), que contém qualquer um dos anticorpos anti- PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção, qualquer um dos ácidos nucleicos constituídos pelo segundo ou terceiro aspecto da presente invenção, qualquer um dos vetores constituídos pelo quarto aspecto da presente invenção, qualquer uma das células hospedeiras constituídas pelo quinto aspecto da presente invenção ou qualquer um dos conjugados constituídos pelo sexto aspecto da presente invenção, bem como qualquer vetor ou excipiente farmaceuticamente aceitável e qual(is)quer outra(s) substância(s) biologicamente ativa(s).

[042] Qualquer uma das composições constituídas pelo sétimo aspecto da presente invenção (como uma composição farmacêutica), em que as substâncias biologicamente ativas adicionais mencionadas acima incluem, mas não estão limitadas a outros anticorpos, proteínas de fusão ou fármacos (por exemplo, fármacos antineoplásicos, como fármacos quimioterápicos e radioterapia).

[043] A presente invenção refere-se ainda a um reagente ou kit de reagentes que contém qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção, em que o reagente de detecção ou kit de reagentes mencionado acima é usado para detectar a presença ou ausência da proteína PD-L1 ou seus derivados.

[044] A presente invenção refere-se ainda a um reagente de diagnóstico ou kit de reagentes que contém qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção, em que o reagente de diagnóstico ou kit de reagentes mencionado acima é usado no diagnóstico in vitro (por exemplo, células ou tecidos) ou in vivo (por exemplo, humanos ou modelos animais) de doenças relacionadas à PD-L1 (por exemplo, tumores ou infecções virais, como casos de infecções virais que apresentam alta expressão de PD-L1 ou tumores que apresentam alta expressão de PD-L1).

[045] Em alguns aspectos da presente invenção, o anticorpo anti-PD-L1 mencionado acima ou a porção correspondente de ligação ao antígeno é acoplada ainda a um corante fluorescente, substância química, polipeptídeo, enzima, isótopo, marcador, etc. que podem ser utilizados na detecção ou que podem ser detectados por um reagente separado.

[046] Em alguns aspectos da presente invenção, os tumores mencionados incluem, mas não estão limitados ao câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer colorretal, melanomas, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de fígado, linfomas, neoplasias hematológicas, câncer de cabeça e pescoço, gliomas, câncer gástrico, câncer nasofaríngeo, câncer laríngeo, câncer cervical, câncer uterino, osteossarcomas, câncer de tireoide e câncer de próstata.

[047] Em alguns aspectos da presente invenção, as infecções virais mencionadas acima incluem, mas não estão limitadas às infecções agudas, subagudas ou crônicas por HBV, HCV ou HIV.

[048] A presente invenção refere-se ainda a aplicações em que qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção, qualquer um dos ácidos nucleicos constituídos pelo segundo ou terceiro aspecto da presente invenção, qualquer um dos vetores constituídos pelo quarto aspecto da presente invenção, qualquer uma das células hospedeiras constituídas pelo quinto aspecto da presente invenção, qualquer um dos conjugados constituídos pelo sexto aspecto da presente invenção ou qualquer uma das composições constituídas pelo sétimo aspecto da presente invenção é utilizada para preparar um fármaco que é utilizado na prevenção ou tratamento de doenças relacionadas à PD-L1 (por exemplo, tumores ou infecções virais, como casos de infecções virais que apresentam alta expressão de PD-L1 ou tumores que apresentam alta expressão de PD-L1).

[049] Em certos aspectos da presente invenção, os tumores mencionados acima referem-se a tumores relacionados à PD-L1, como tumores que apresentam um alto nível de expressão de PD-L1.

[050] Em aspectos específicos da presente invenção, os tumores mencionados acima incluem, mas não estão limitados ao câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer colorretal, melanomas, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de fígado, linfomas, neoplasias hematológicas, câncer de cabeça e pescoço, gliomas, câncer gástrico, câncer nasofaríngeo, câncer laríngeo, câncer cervical, câncer uterino, osteossarcomas, câncer de tireoide e câncer de próstata.

[051] Em alguns aspectos da presente invenção, as infecções virais mencionadas acima incluem, mas não estão limitadas às infecções agudas, subagudas ou crônicas por HBV, HCV ou HIV.

[052] A presente invenção refere-se ainda a aplicações nas quais qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídas pelo primeiro aspecto da presente invenção é utilizado para preparar um reagente ou kit de reagentes para o diagnóstico de doenças relacionadas à PD-L1 (por exemplo, tumores ou infecções virais, como casos de infecções virais que apresentam alta expressão de PD-L1 ou tumores que apresentam alta expressão de PD-L1).

[053] Em alguns aspectos da presente invenção, os tumores mencionados acima referem-se a tumores relacionados à PD-L1, como tumores que apresentam um alto nível de expressão de PD-L1.

[054] Em aspectos específicos da presente invenção, os tumores mencionados acima incluem, mas não estão limitados ao câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer colorretal, melanomas, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de fígado, linfomas, neoplasias hematológicas, câncer de cabeça e pescoço, gliomas, câncer gástrico, câncer nasofaríngeo, câncer laríngeo, câncer cervical, câncer uterino, osteossarcomas, câncer de tireoide e câncer de próstata.

[055] Em alguns aspectos da presente invenção, as infecções virais mencionadas acima incluem, mas não estão limitadas às infecções agudas, subagudas ou crônicas por HBV, HCV ou HIV.

[056] Em alguns aspectos da presente invenção, o anticorpo anti-PD-L1 mencionado acima ou a porção correspondente de ligação ao antígeno é acoplada ainda a um corante fluorescente, substância química, polipeptídeo, enzima, isótopo, marcador, etc. que podem ser utilizados na detecção ou que podem ser detectados por um reagente separado.

[057] A presente invenção refere-se ainda a aplicações nas quais qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção é utilizado para preparar um fármaco para a prevenção ou tratamento de doenças relacionadas ao CD80.

[058] No contexto da presente invenção, as doenças relacionadas ao CD80, tal como referidas acima, incluem as doenças que estão relacionadas à alta expressão de CD80.

[059] A presente invenção refere-se ainda a um método usado para prevenção ou tratamento de doenças relacionadas à PD-L1 (por exemplo, tumores ou infecções virais, como casos de infecções virais que apresentam alta expressão de PD-L1 ou tumores que apresentam alta expressão de PD-L1), em que o método mencionado acima inclui fornecer a um indivíduo uma dose de prevenção ou tratamento eficaz de qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção, qualquer um dos ácidos nucleicos constituídos pelo segundo ou terceiro aspecto da presente invenção, qualquer um dos vetores constituídos pelo quarto aspecto da presente invenção, qualquer uma das células hospedeiras constituídas pelo quinto aspecto da presente invenção, qualquer um dos conjugados constituídos pelo sexto aspecto da presente invenção, ou qualquer uma das composições constituídas pelo sétimo aspecto da presente invenção, em conjunto com a administração de radioterapia opcional (como o irradiação por raios-X).

[060] Em alguns aspectos da presente invenção, os tumores mencionados acima referem-se a tumores relacionados à PD-L1, como tumores que apresentam um alto nível de expressão de PD-L1.

[061] Em aspectos específicos da presente invenção, os tumores mencionados acima incluem, mas não estão limitados ao câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer colorretal, melanomas, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de fígado, linfomas, neoplasias hematológicas, câncer de cabeça e pescoço, gliomas, câncer gástrico, câncer nasofaríngeo, câncer laríngeo, câncer cervical, câncer uterino, osteossarcomas, câncer de tireoide e câncer de próstata.

[062] Em alguns aspectos da presente invenção, as infecções virais mencionadas acima incluem, mas não estão limitadas às infecções agudas, subagudas ou crônicas por HBV, HCV ou HIV.

[063] A presente invenção refere-se ainda a um método usado para prevenção ou tratamento de doenças relacionadas a CD80, em que o método mencionado acima fornece a um indivíduo uma dose de prevenção ou tratamento eficaz de qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídos pelo primeiro aspecto da presente invenção.

[064] No contexto da presente invenção, as doenças relacionadas a CD80, tal como referidas acima, incluem as doenças que estão relacionadas à alta expressão de CD80.

[065] A presente invenção é descrita ainda no texto abaixo:

[066] No contexto da presente invenção, salvo indicação em contrário, os termos científicos e técnicos utilizados neste texto devem corresponder aos seus respectivos significados comuns, tal como entendidos por um técnico no assunto. Além disso, termos relacionados à química de proteínas e ácidos nucleicos, biologia molecular, cultura de células e tecidos, microbiologia e imunologia, bem como procedimentos laboratoriais utilizados no texto, correspondem a termos e procedimentos padrão amplamente empregados em seus respectivos campos. No entanto, definições e explicações de termos relacionados são apresentadas abaixo a fim de esclarecer melhor a presente invenção.

[067] No contexto da presente invenção, o termo "anticorpo" refere-se a uma molécula de imunoglobulina que geralmente consiste em dois pares de cadeias polipeptídicas idênticas (com cada par contendo uma cadeia "leve" (L) e uma cadeia "pesada" (H)). As cadeias leves dos anticorpos podem ser classificadas como cadeias leves k ou À. As cadeias pesadas podem ser classificadas como μ, δ, Y, α ou ε e os respectivos isotipos de anticorpos correspondentes são definidos como sendo IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Para as cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são conectadas por aproximadamente 12 ou mais regiões de aminoácidos "J", enquanto as cadeias pesadas também contêm aproximadamente 3 ou mais regiões de aminoácidos "D". Cada cadeia pesada é composta por uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante da cadeia pesada (CH). A região constante da cadeia pesada é composta por três domínios estruturais (CH1, CH2 e CH3). Cada cadeia leve é composta por uma região variável da cadeia leve (VL) e uma região constante da cadeia leve (CL). A região constante da cadeia leve é composta por um domínio estrutural (CL). Uma região constante de um anticorpo pode mediar a ligação de uma imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo as várias células do sistema imune (por exemplo, as células efetoras), bem como o primeiro componente do sistema complemento clássico (C1q). As regiões VH e VL podem ser subdivididas ainda em regiões com alta variabilidade (conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs)), intercaladas com regiões mais conservadas, conhecidas como regiões estruturais (FRs). Cada VH e VL é composta por 3 CDRs e 4 FRs, dispostas da extremidade amino terminal à extremidade carbóxi terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As regiões variáveis (VH e VL) de cada par de cadeia pesada/ cadeia leve formam respectivamente cada um dos sítios de ligação do anticorpo. A designação dos aminoácidos para cada região ou domínio estrutural segue a Sequences of Proteins of Immunological Interest de Kabat (National Institutes of Health, Bethesda, Md (1987 e 1991)) ou a definição dada por Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 e Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883. O termo "anticorpo" não está sujeito a nenhuma imitação específica em termos do método utilizado para produzir o anticorpo. Por exemplo, inclui, em particular, anticorpos recombinantes, anticorpos monoclonais e anticorpos policlonais. Os anticorpos podem ser anticorpos de diferentes isotipos, incluindo, por exemplo, IgG (por exemplo, os subtipos IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), anticorpos IgA1, IgA2, IgD, IgE ou IgM.

[068] No contexto da presente invenção, a "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo refere-se a uma ou mais partes ao longo de todo o comprimento do anticorpo, em que a referida parte mantém a capacidade de se ligar ao mesmo antígeno ao qual o anticorpo se liga (por exemplo, PD-L1) e compete com anticorpos intactos para se ligar especificamente a um determinado antígeno. Vide Fundamental Immunology, cap. 7 (Paul, W., ed., 2- edição, Raven Press, NY (1989)), que é, para todos os fins, incorporado neste documento por meio da citação do texto completo. As porções de ligação ao antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante ou por quebra enzimática ou química dos anticorpos inteiros/completos. Em alguns casos, a porção de ligação ao antígeno inclui um fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, região determinante de complementaridade (CDR), anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv), anticorpo quimérico, diacorpo e polipeptídeos semelhantes, que incluem pelo menos uma porção de um anticorpo que é capaz de conferir uma capacidade de ligação ao antígeno polipeptídeo-específica.

[069] No contexto da presente invenção, o termo "fragmento Fd" refere-se a um fragmento de anticorpo composto pelos domínios estruturais VH e CH1; o termo "fragmento Fv" refere-se a um fragmento de anticorpo composto pelos domínios estruturais VL e VH do braço único de um anticorpo; o termo "fragmento dAb" refere- se a um fragmento de anticorpo composto por um domínio estrutural VH (Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)); o termo "fragmento Fab" refere-se a um fragmento de anticorpo composto pelos domínios estruturais VL, VH, CL e CH1; e o termo "fragmento F(ab')2" refere-se a um fragmento de anticorpo que inclui dois fragmentos Fab que estão conectados através de uma ponte dissulfeto na região de dobradiça.

[070] Em alguns casos, a porção de ligação ao antígeno do anticorpo é um anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv), em que os domínios estruturais VL e VH formam uma molécula monovalente via pareamento, permitindo que ela seja produzida como uma única cadeia polipeptídica por meio de um ligante (vide, por exemplo, Bird et al., Science 2 42: 423-426 (1988) e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). Tal molécula de scFv pode apresentar a estrutura geral de: NH2-VL-conector-VH-COOH ou NH2-VH-conector-VL-COOH. Conectores convencionais adequados (peptídeos de conexão) são compostos por sequências repetidas de aminoácidos GGGGS ou variantes das mesmas. Por exemplo, um conector com a sequência de aminoácidos (GGGGS)4 pode ser usado, mas também podem ser utilizadas variantes (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Outros conectores que podem ser utilizados para a presente invenção são descritos em Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Em um aspecto da presente invenção, a sequência do peptídeo de conexão mencionado acima é (GGGGS)3.

[071] Em alguns casos, o anticorpo é constituído por um anticorpo biespecífico capaz de ligar, respectivamente, dois tipos diferentes de antígeno ou epítopo antigênico e que inclui uma cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno primário, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, bem como uma cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno secundário, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo. Em alguns aspectos da presente invenção, a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno primário, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, incluídas no anticorpo biespecífico mencionado acima podem corresponder a qualquer um dos anticorpos ou porções correspondentes de ligação ao antígeno constituídas pela presente invenção, e a cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno secundário, ou uma porção de ligação ao antígeno, incluídas no anticorpo biespecífico mencionado acima, podem corresponder a um anticorpo anti-PD-L1 ou uma porção correspondente de ligação ao antígeno diferente, ou a um anticorpo direcionado a um antígeno ou porção correspondente de ligação ao antígeno diferente.

[072] Em alguns casos, os anticorpos correspondem a diacorpos, ou seja, anticorpos bivalentes, nos quais os domínios estruturais VH e VL são expressos em uma única cadeia polipeptídica, só que um ligante muito curto é utilizado, o que não permite o pareamento entre os dois domínios estruturais na mesma cadeia, forçando, assim, os domínios estruturais a parear com os domínios estruturais complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno (vide, por exemplo, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) e Poljak RJ et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)).

[073] Técnicas convencionais conhecidas pelos técnicos nos assunto (por exemplo, técnicas de DNA recombinante ou clivagem enzimática ou química) podem ser utilizadas para se obter a porção de ligação ao antígeno (por exemplo, um fragmento de anticorpo como descrito acima) de um determinado anticorpo (como o anticorpo monoclonal 2E12) e para selecionar seletivamente porções de ligação ao antígeno do anticorpo utilizando-se os mesmos métodos utilizados para anticorpos completos.

[074] No contexto da presente invenção, as porções de ligação ao antígeno, conforme mencionadas acima, incluem anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos quiméricos, diacorpos, moléculas bivalentes scFv-Fc, fragmentos de dAb e região determinante de complementaridade (CDR), fragmentos Fab, fragmentos Fd, fragmentos Fab' e fragmentos Fv e F(ab')2.

[075] No contexto da presente invenção, as regiões constantes da cadeia pesada de IgG1, conforme mencionadas acima, incluem alótipos, tais como G1m (f), G1m (z), G1m (z,a) e G1m (z,a,x). Em alguns aspectos da presente invenção, a região constante da cadeia pesada de IgG1 mencionada acima corresponde a G1m (f).

[076] No contexto da presente invenção, a região constante da cadeia leve k mencionada acima inclui vários alotipos, tais como Km1, Km1,2 e Km3. Em alguns aspectos da presente invenção, a região constante da cadeia leve k mencionada acima corresponde a uma região do tipo Km3.

[077] No contexto da presente invenção, a região constante da cadeia leve À mencionada acima inclui vários alotipos, como ÀI, ÀII, ÀIII e ÀVI. Em alguns aspectos da presente invenção, a região constante da cadeia leve À mencionada acima corresponde a uma região do tipo ÀII.

[078] Os ácidos nucleicos de anticorpos aos quais a presente invenção se refere também podem ser obtidos por meio de técnicas recombinantes convencionais de engenharia genética ou métodos de síntese química. Por um lado, as sequências de ácidos nucleicos de anticorpo às quais a presente invenção se refere incluem regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo anti-PD-L1 ou sequências de ácidos nucleicos parciais pertencentes às moléculas de anticorpo. Por outro lado, as sequências de ácidos nucleicos de anticorpo às quais a presente invenção se refere também incluem regiões variáveis da cadeia leve do anticorpo anti-PD-L1 ou sequências de ácido nucleico parciais pertencentes às moléculas de um anticorpo. Por outro lado, as sequências de ácidos nucleicos de anticorpos às quais a presente invenção se refere incluem ainda sequências de CDR pertencentes às regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve. A região determinante de complementaridade (CDR) é um local que se liga a um epítopo do antígeno e, dentro do contexto da presente invenção, as sequências de CDR são verificadas via IMGT/V- QUEST (http://imgt.cines.fr/textes/vquest/). No entanto, as sequências de CDR obtidas por diferentes métodos de análise são ligeiramente diferentes.

[079] Um aspecto da presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências da região variável das cadeias pesada e leve dos anticorpos B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 e B50. As moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências da região variável da cadeia pesada dos anticorpos B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 e B50 correspondem às SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 59, respectivamente. As moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências da região variável da cadeia leve dos anticorpos B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 e B50 correspondem às SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 66, respectivamente. A presente invenção também se refere às variantes ou análogos de moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências da região variável das cadeias pesada e leve dos anticorpos B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 e B50.

[080] Por outro lado, a presente invenção também se refere a diversas variantes de moléculas de ácido nucleico separadas; especificamente, a sequência das referidas variantes de ácido nucleico deve apresentar pelo menos 70% de similaridade com as seguintes sequências de ácido nucleico: SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 66, onde uma similaridade atingindo pelo menos 75% é preferível, uma similaridade atingindo pelo menos 80% é mais preferível, uma similaridade atingindo pelo menos 85% é ainda mais preferível, uma similaridade atingindo pelo menos 90% é muito mais preferível e uma similaridade atingindo pelo menos 95% é prioritária.

[081] A presente invenção refere-se ainda às moléculas de ácido nucleico separadas correspondentes que codificam as sequências da região variável da cadeia pesada dos anticorpos B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 e B50 na forma das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 47, 49, 51, 53, 54 e 51. A presente invenção também se refere às moléculas de ácido nucleico correspondentes que codificam as sequências da região variável da cadeia leve dos anticorpos B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 e B50 na forma das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 48, 50, 52, 48, 55 e 56.

[082] A presente invenção refere-se a um vetor de expressão recombinante que contém as moléculas de ácido nucleico mencionadas acima e refere-se ainda a uma célula hospedeira que foi transformada com as referidas moléculas. Além disso, a presente invenção refere-se a métodos que são utilizados para cultivar células hospedeiras que contêm as moléculas de ácido nucleico mencionadas acima sob condições específicas, seguidas de separação para se obter os anticorpos descritos pela invenção.

Sequências de Aminoácidos do Anticorpo

[083] As sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e leve dos anticorpos monoclonais B60-55mAb, BII61-62, B50-6, B60, BII61 e B50 podem ser derivadas das sequências correspondentes de ácido nucleico. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada dos anticorpos B60-55mAb, BII61-62, B50-6, B60, BII61 e B50 correspondem às SEQ ID NO: 47, 49, 51, 53, 54 e 51, respectivamente. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia leve dos anticorpos B60-55mAb, BII61-62, B50-6, B60, BII61 e B50 correspondem às SEQ ID NO: 48, 50, 52, 48, 55 e 56, respectivamente.

[084] Por outro lado, as sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada dos anticorpos proporcionados pela presente invenção devem apresentar pelo menos 70% de similaridade com as sequências indicadas na SEQ ID NO: 47, 49, 51, 53, 54 e 51, onde uma similaridade atingindo pelo menos 80% é preferível, uma similaridade atingindo pelo menos 85% é mais preferível, uma similaridade atingindo pelo menos 90% é muito mais preferível e uma similaridade atingindo pelo menos 95% é prioritária.

[085] Por outro lado, as sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia leve dos anticorpos proporcionados pela presente invenção devem apresentar pelo menos 70% de similaridade com as sequências indicadas na SEQ ID NO: 48, 50, 52, 48, 55 e 56, onde uma similaridade atingindo pelo menos 80% é preferível, uma similaridade atingindo pelo menos 85% é mais preferível, uma similaridade atingindo pelo menos 90% é muito mais preferível e uma similaridade atingindo pelo menos 95% é prioritária.

[086] As sequências de aminoácidos da CDR para as regiões variáveis da cadeia pesada e leve dos anticorpos B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 e B50 são determinadas da seguinte maneira:

[087] As sequências de aminoácidos para CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada do anticorpo B60-55 correspondem às SEQ ID NO: 1-3, respectivamente. As sequências de aminoácidos para CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve do anticorpo B60-55 correspondem às SEQ ID NO: 4-6, respectivamente.

[088] As sequências de aminoácidos para CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada do anticorpo BII61-62 correspondem às SEQ ID NO: 7-9, respectivamente. As sequências de aminoácidos para CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve do anticorpo BII61-62 correspondem às SEQ ID NO: 10-12, respectivamente.

[089] As sequências de aminoácidos para CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada do anticorpo B50-6 correspondem às SEQ ID NO: 13-15, respectivamente. As sequências de aminoácidos para CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve do anticorpo B50-6 correspondem às SEQ ID NO: 16-18, respectivamente.

[090] Por outro lado, uma sequência de aminoácidos contida na CDR da cadeia pesada de um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento do mesmo pode ser obtida por meio de uma ou mais mutações, adições ou deleções de aminoácidos das SEQ ID NO: 1-3, 7-9, 13-15, 19 e 20. De preferência, o número de aminoácidos submetidos à mutação, adição ou deleção não deve exceder a três. Mais preferencialmente, o número de aminoácidos submetidos à mutação, adição ou deleção não deve exceder a dois. Prioritariamente, o número de aminoácidos submetidos à mutação, adição ou deleção não deve exceder a um.

[091] Por outro lado, uma sequência de aminoácidos contida na CDR da cadeia leve de um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento do mesmo pode ser obtida por meio de uma ou mais mutações, adições ou deleções de aminoácidos das SEQ ID NO: 4-6, 10-12, 16-18 e 21. De preferência, o número de aminoácidos submetidos à mutação, adição ou deleção não deve exceder a três. Mais preferencialmente, o número de aminoácidos submetidos à mutação, adição ou deleção não deve exceder a dois. Prioritariamente, o número de aminoácidos submetidos à mutação, adição ou deleção não deve exceder a um.

[092] As sequências de aminoácidos da FR para as regiões variáveis da cadeia pesada e leve dos anticorpos B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 e B50 são determinadas da seguinte forma:

[093] As sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 das regiões variáveis da cadeia pesada dos anticorpos B60-55 e B60 correspondem às SEQ ID NO: 22-25, respectivamente. As sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 das regiões variáveis da cadeia leve correspondem às SEQ ID NO: 26-29, respectivamente.

[094] As sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 das regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo BII61-62 correspondem às SEQ ID NO: 30-33, respectivamente. As sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 das regiões variáveis da cadeia leve correspondem às SEQ ID NO: 34-37, respectivamente.

[095] As sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 das regiões variáveis da cadeia pesada dos anticorpos B50-6 e B50 correspondem às SEQ ID NO: 38-41, respectivamente. As sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 das regiões variáveis da cadeia leve correspondem às SEQ ID NO: 42-45, respectivamente.

[096] As sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 das regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo BII61 correspondem às SEQ ID NO: 30-33, respectivamente. As sequências FR1, FR2, FR3 e FR4 das regiões variáveis da cadeia leve correspondem às SEQ ID NO: 34, 46, 36, 37, respectivamente.

[097] Por outro lado, uma sequência de aminoácidos contida na FR da região variável da cadeia pesada de um anticorpo anti-PD-L1 pode ser obtida por meio de uma ou mais mutações, adições ou deleções de aminoácidos da SEQ ID NO: 22-46. De preferência, o número de aminoácidos submetidos à mutação, adição ou deleção não deve exceder a três. Mais preferencialmente, o número de aminoácidos submetidos à mutação, adição ou deleção não deve exceder a dois. Prioritariamente, o número de aminoácidos submetidos à mutação, adição ou deleção não deve exceder a um.

[098] As variantes que são obtidas após a mutação, adição ou deleção de um aminoácido contido em uma região de anticorpo, CDR ou estrutural mencionada acima devem manter ainda a capacidade de se ligar especificamente à PD-L1 humana. A presente invenção também inclui essas variantes da porção de ligação ao antígeno.

[099] Uma variante dos anticorpos mencionados acima é o anticorpo B60-55- 1 que possui uma cadeia pesada completa da SEQ ID NO: 85 e uma cadeia leve completa da SEQ ID NO: 87, o resíduo lisina terminal na extremidade C terminal da cadeia pesada pode estar ausente. A cadeia pesada de B60-55-1 pode ser expressa utilizando-se uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 86. A sequência de ácido nucleico pode ser incorporada em um vetor de expressão para incorporação posterior em uma linhagem celular de expressão. A cadeia leve de B60-55-1 pode ser expressa utilizando-se uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 88. A sequência de ácido nucleico pode ser incorporada em um vetor de expressão para incorporação posterior em uma linhagem celular de expressão.

[0100] O anticorpo B60-55-1 pode ser formulado como uma composição farmacêutica adicionando-se um excipiente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. A composição pode conter cerca de 275 mM de serina, cerca de 10 mM de histidina e ter um valor de pH de cerca de 5,9. A composição pode conter cerca de 0,05% de polissorbato 80 , cerca de 1% de D-manitol, cerca de 120 mM de L-prolina, cerca de 100 mM de L-serina, cerca de 10 mM de L-histidina-HCl e com um pH de cerca de 5,8.

[0101] As variantes de anticorpos monoclonais constituídas pela presente invenção podem ser obtidas por métodos convencionais de engenharia genética. Os técnicos no assunto têm pleno conhecimento dos métodos que empregam mutação em ácido nucleico para modificar moléculas de DNA. Além disso, moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de cadeia pesada e cadeia leve também podem ser obtidas por síntese química.

[0102] No contexto da presente invenção, exemplos de algoritmos que são usados para determinar a identidade de sequência e o percentual de similaridade de sequência incluem o BLAST e BLAST 2.0, descritos em Altschul et al. (1977) Nucl. Acid. Res. 25: 3389-3402 e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. Utilizando-se, por exemplo, os parâmetros divulgados na literatura ou os parâmetros padrão, o BLAST e o BLAST 2.0 podem ser usados para determinar o percentual de similaridade das sequências de aminoácidos constituídas pela presente invenção. O software capaz de realizar uma análise BLAST pode ser adquirido por qualquer indivíduo por meio do National Center for Biotechnology Information.

[0103] No contexto da presente invenção, as sequências de aminoácidos que são pelo menos 70% idênticas a uma determinada sequência de aminoácidos, conforme declarado acima, incluem as sequências de polipeptídeos que são fundamentalmente idênticas à referida sequência de aminoácidos, tais como as sequências que são determinadas para serem pelo menos 70% idênticas a uma sequência polipeptídica constituída pela presente invenção quando os métodos descritos neste texto (por exemplo, análises BLAST empregando parâmetros padrão) são utilizados, em que as sequências que apresentam pelo menos 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais são preferenciais.

[0104] No contexto da presente invenção, o termo "vetor" refere-se a um tipo de veículo de entrega de ácido nucleico que inclui um polinucleotídeo que codifica uma determinada proteína e que permite que a referida proteína seja expressa. Um vetor permite a expressão do(s) componente(s) do material genético que ele carrega dentro de uma célula hospedeira após transformação, transdução ou transfecção da referida célula hospedeira. Por exemplo, os vetores incluem: plasmídeos; fagos; cosmídeos; cromossomos artificiais, como um cromossomo artificial de levedura (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromossomo artificial derivado de P1 (PAC); bacteriófagos, como um fago À ou M13 e vírus de animais. Exemplos de vírus de animais usados como vetor incluem os retrovírus (incluindo o lentivírus), adenovírus, vírus adeno-associados, vírus da herpes (como o vírus herpes simplex), poxvírus, baculovírus, papilomavírus e papovavírus (por exemplo, SV40). Um vetor pode conter vários elementos de controle de expressão, incluindo sequências promotoras, sequências de iniciação de transcrição, sequências potenciadoras ou aprimoradoras, elementos de seleção e repórteres. Além disso, o vetor pode conter uma origem de replicação. Os vetores podem incluir também componentes que facilitam a entrada em uma célula, como partículas virais, lipossomas ou um revestimento proteico, no entanto, os referidos componentes não estão limitados às substâncias acima.

[0105] No contexto da presente invenção, o termo "célula hospedeira" refere- se a uma célula na qual um vetor é introduzido, compreendendo vários tipos diferentes de células, incluindo células procarióticas, como E. coli ou B. subtilis, células fúngicas, tais como como células de levedura ou Aspergillus, células de insetos, tais como as células de Drosophila S2 ou Sf9, ou células animais, tais como fibroblastos, células CHO, células COS, células NSO, células HeLa, células BHK, células HEK 293 ou outras células humanas.

[0106] Os fragmentos de anticorpo constituídos pela presente invenção podem ser obtidos pela hidrólise das moléculas de anticorpo completas (vide Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992) e Brennan et al., Science 229: 81 (1985)). Além disso, esses fragmentos de anticorpo podem ser produzidos também diretamente pelas células hospedeiras recombinantes (revisado em Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999); Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)). Por exemplo, os fragmentos Fab' podem ser obtidos diretamente de células de E. coli ou acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). Como outro exemplo, os fragmentos F(ab')2 podem ser obtidos via conexão usando o zíper de leucina GCN4. Além disso, os fragmentos Fv, Fab ou F(ab')2 podem ser isolados também diretamente de um meio de cultura de células hospedeiras recombinantes. Um técnico no assunto teria pleno conhecimento de outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos.

[0107] No contexto da presente invenção, o termo "ligação específica" refere- se a uma reação de ligação não aleatória entre duas moléculas, como uma reação que ocorre entre um anticorpo e um antígeno correspondente. Aqui, a afinidade de ligação de um anticorpo que se liga um antígeno primário a um antígeno secundário é muito fraca ou indetectável. Em certos aspectos, um anticorpo específico para um determinado antígeno liga o referido antígeno com uma afinidade (KD) de < 10-5 M (por exemplo, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M), em que KD se refere à razão entre a taxa de dissociação e a taxa de ligação (koff/kon) e essa quantidade pode ser medida por métodos familiares a um técnico no assunto.

[0108] Em alguns aspectos da presente invenção, um anticorpo anti-PD-L1 constituído pela presente invenção é capaz de se ligar especificamente ao PD-L1 humano e simultaneamente também ao PD-L1 murino, mas não se liga ao PD-L2 ou B7H3.

[0109] Em alguns aspectos da presente invenção, um anticorpo anti-PD-L1 constituído pela presente invenção é capaz de se ligar a hPD-L1 competitivamente em relação à hPD-1.

[0110] No contexto da presente invenção, as doenças relacionadas ao PD-L1 incluem, por exemplo, tumores e infecções virais que estão ligadas ao PD-L1, particularmente tumores e infecções virais que estão associadas a um alto nível de expressão de PD-L1.

[0111] Em alguns aspectos da presente invenção, os tumores mencionados acima incluem, entre outros, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer colorretal, melanomas, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de fígado, linfomas, neoplasias hematológicas, câncer de cabeça e pescoço, gliomas, câncer gástrico, câncer nasofaríngeo, câncer laríngeo, câncer cervical, câncer uterino, osteossarcomas, câncer de tireoide e câncer de próstata.

[0112] Em alguns aspectos da presente invenção, as infecções virais mencionadas acima incluem, mas não estão limitadas às infecções agudas, subagudas ou crônicas por HBV, HCV ou HIV.

[0113] No contexto da presente invenção, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem o uso convencional. Vide Immunology - A Synthesis (2a Edição, ES Golub e DR Gren, Ed., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que é incorporado neste documento via citação.

Benefícios da Invenção

[0114] A invenção emprega a tecnologia de yeast display em conjunto com a seleção e maturação por afinidade para se obter um anticorpo anti-PD-L1 totalmente humano que apresenta boa especificidade e afinidade e estabilidade relativamente altas, em que o referido anticorpo é capaz de se ligar especificamente à PD-L1 humana ou simultaneamente também à PD-L1 murina e não se liga a B7H3 ou PD- L2; e o referido anticorpo se liga às células T ativadas para aumentar ainda mais a ativação das células T e provoca uma inibição significativa do crescimento tumoral.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0115] Figura 1: Inibição da ligação ao receptor-ligante hPD-L1 / hPD-1 por anti-hPD-L1 scFv purificado.

[0116] O eixo X representa a intensidade de fluorescência de EGFP, enquanto o eixo Y representa a intensidade de fluorescência de SA-PE. A - corresponde a um branco controle, B - corresponde a um controle negativo, C - corresponde a B50 scFv, D - corresponde a B60scFv e E - corresponde a BII61 scFv.

[0117] Figura 2: Levedura apresentando aumento da afinidade para hPD-L1 levedura após seleção pela maturação por afinidade. Aqui, o eixo X representa a intensidade de fluorescência de myc (myc positivo correspondendo a leveduras que expressam fragmentos de anticorpo completos) e o eixo Y representa a intensidade de fluorescência de SA-APC, que indica a capacidade de ligação ao antígeno.

[0118] Figura 3: Uma comparação da capacidade dos anticorpos obtidos após a maturação por afinidade de se ligarem a hPD-L1 em competição com a hPD-1. Aqui, o eixo horizontal corresponde à concentração de anticorpos (unidades: ng/mL) e o eixo vertical corresponde ao valor de DO.

[0119] A) ilustra uma comparação entre BII61-62 e BII61, B) ilustra uma comparação entre B50 e B50-6, e C) ilustra uma comparação entre B60e B60-55.

[0120] Figura 4: Medições por ELISA da capacidade de ligação do anticorpo anti-hPD-L1 e hPD-L1. Aqui, o eixo horizontal corresponde à concentração de anticorpos (unidades: ng/mL) e o eixo vertical corresponde ao valor de DO.

[0121] Figura 5: Medição por ELISA competitivo da ligação competitiva da hPD-L1 a anti-hPD-L1 e hPD-1. Aqui, o eixo horizontal corresponde à concentração de anticorpos (unidades: ng/mL) e o eixo vertical corresponde ao valor de DO. O gráfico #5 corresponde ao BII61-62mAb, o gráfico #2 corresponde ao B50-6mAb e o gráfico # 3 corresponde ao B60-55mAb.

[0122] Figura 6: Medição por ELISA competitivo da ligação competitiva da hPD-L1 a anti-hPD-L1 e CD80.

[0123] Figura 7: Detecção da especificidade do anticorpo anti-hPD-L1. Aqui, o eixo X representa a intensidade de fluorescência de EGFP, o eixo Y representa a intensidade de fluorescência da ligação do anticorpo correspondente, A - corresponde a um branco controle, B - corresponde a um controle negativo, C - corresponde a BII61-62mAb, D - corresponde ao B60-55mAb e E - corresponde ao B50-6mAb; (1) corresponde a uma proteína hPD-L1-EGFP, (2) corresponde a hB7H3-EGFP e (3) corresponde a uma proteína hPD-L2-EGFP.

[0124] Figura 8: Anticorpo anti-hPD-L1 e capacidade de ligação a mPD-L1. Aqui, o eixo X representa a intensidade de fluorescência de EGFP, o eixo Y representa a intensidade de fluorescência da ligação do anticorpo correspondente, A - corresponde a um branco controle, B - corresponde a um controle negativo, C - corresponde a B60-55mAb, D corresponde ao BII61-62mAb e E corresponde ao B50- 6mAb; (1) corresponde a uma proteína hPD-L1-EGFP e (2) corresponde a uma proteína mPD-L1-EGFP.

[0125] Figura 9: Anticorpo anti-hPD-L1 e capacidade de ligação ao PD-L1 de macaco cinomolgo

[0126] Figura 10: Ativação de células T CD4+ por anticorpos anti-hPD-L1

[0127] Figura 11: Atividade inibitória do anticorpo anti-hPD-L1 B50-6 no crescimento tumoral

[0128] Figura 12: Atividade inibitória dos anticorpos anti-hPD-L1 B60-55 e BII61-62 no crescimento tumoral. Aqui, A - corresponde à inibição do BII61-62mAb e B60-55 no crescimento tumoral quando uma dose de 3 mg/kg é utilizada; e B - corresponde aos efeitos inibitórios do BII61-62mAb no crescimento tumoral quando diferentes doses são utilizadas.

[0129] Figura 13: Uma comparação da estabilidade de B60-55 e do anticorpo 2.41H90P. Aqui, A - corresponde aos valores de IC50 de B60-55 e do anticorpo 2.41H90P ao longo do tempo; B - corresponde à proporção de dímeros de anticorpos ao longo do tempo; e C - corresponde aos resultados do ELISA competitivo obtidos no teste de estabilidade acelerado de B60-55.

[0130] Figura 14: Cromatografia de B60-55-1 em CaPure-HA; o tempo de retenção de B60-55-1 é de cerca de 45 min.

[0131] Figura 15: Análise pela cromatografia por exclusão de tamanho de B60-55-1 purificado pela coluna TSKgel G3000SWXL (Tosoh).

[0132] Figura 16: Análise por SDS-PAGE corada com Coomassie do B50-55- 1 purificado: linha 1 - sob condições reduzidas, linha 2 - sob condições não redutoras, linha 3 - marcadores de peso molecular.

[0133] Figura 17: Abordagens alternativas de captura para medições de SPR:

[0134] Painel A - O anti-IgG humano foi imobilizado no chip como anticorpos de captura; B60-55-1 ou atezolizumab foram capturados pelos anticorpos imobilizados e diferentes concentrações de ligante PD-L1-His foram aplicadas.

[0135] Painel B - A proteína de fusão PD-L1-Fc foi imobilizada diretamente no chip sensor e diferentes concentrações de B60-55-1 ou atezolizumab foram aplicadas.

[0136] Painel C - para estudar as interações com a proteína de fusão PD-L1- Fc e PD-L1-His, B60-55-1 ou atezolizumab foram imobilizados diretamente no chip; uma faixa de concentrações de PD-L1-His marcado ou PD-L1-Fc foram aplicadas.

[0137] Figura 18: Sensogramas de ligação do ligante PD-L1-His marcado ao anticorpo comparador imobilizado - atezolizumab ou B60-55-1; a abordagem é esquematicamente ilustrada no painel esquerdo e os parâmetros cinéticos encontram- se resumidos na tabela; os anticorpos de captura anti-humano foram imobilizados em um chip sensor e o atezolizumab ou B60-55-1 foram capturados, seguidos de várias concentrações do ligante PD-L1-His: Painel A - resultados para atezolizumab; Painel B - resultados para B60-55-1.

[0138] Figura 19: Sensogramas de ligação de atezolizumab ou B60-55-1 à proteína de fusão PD-L1-Fc imobilizada; a abordagem é esquematicamente mostrada no painel esquerdo e os parâmetros cinéticos encontram-se resumidos na tabela; várias concentrações de B60-55-1 ou atezolizumab foram aplicadas ao chip: Painel A - resultados para atezolizumab; Painel B - resultados para B60-55-1.

[0139] Figura 20: Sensogramas de ligação de PD-L1-His ou PD-L1-Fc a B60- 55-1 imobilizado; a abordagem é mostrada esquematicamente no painel esquerdo e os parâmetros cinéticos encontram-se resumidos na tabela.

[0140] Figura 21: Sensogramas de ligação de PD-L1-His ou PD-L1-Fc ao atezolizumab mobilizado; a abordagem é mostrada esquematicamente no painel esquerdo e os parâmetros cinéticos encontram-se resumidos na tabela.

[0141] Figura 22: B60-55-1 e atezolizumab não possuem atividades de ADCC comparadas aos anticorpos de controle do kit Promega ADCC Repórter Bioassay.

[0142] Figura 23: Avaliação da ligação de B60-55-1 e atezolizumab a C1q.

[0143] Figura 24: Potências dependentes da concentração de B60-55-1 e anticorpos comparadores na ativação de células T no ensaio de MLR.

[0144] Figura 25: Alteração do peso corporal após tratamento medicamentoso; as setas indicam o tempo de administração/dosagem.

[0145] Figura 26: Inibição do volume tumoral após tratamento medicamentoso; as setas indicam o tempo de administração.

[0146] Figura 27: Crescimento tumoral individual em três grupos durante observação de 29 dias após o agrupamento (n = 8).

[0147] Figura 28: Inibição do peso tumoral no dia 29 após a administração da dose.

[0148] Figura 29: Volume tumoral médio nos três grupos de teste do desenho experimental mostrado na Tabela 7 abaixo.

[0149] Figura 30: Volume tumoral médio nos três grupos de teste do desenho experimental mostrado na Tabela 7 abaixo nos dias 21 e 41; três colunas para cada dia correspondem ao grupo 1 (esquerda), dois (centro) e 3 (direita).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0150] Na seção seguinte, os aspectos da presente invenção são ilustrados ainda mais através dos seguintes exemplos; no entanto, como deve ser entendido por qualquer técnico no assunto, os exemplos a seguir são usados apenas para ilustrar a presente invenção e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção. Quaisquer condições não especificadas nos exemplos a seguir devem ser definidas de acordo com aquelas usadas convencionalmente ou recomendadas pelo fabricante. Todos os reagentes ou instrumentos utilizados, cujo fabricante não está especificado, correspondem a produtos padrão que podem ser adquiridos comercialmente.

[0151] Exemplo 1: Expressão de PD-L1 e PD-1 humano recombinante e preparação de células EGFP relacionadas.

[0152] A sequência de aminoácidos do domínio extracelular da PD-L1 humana foi obtida com base em uma sequência de aminoácidos da PD-L1 (Q9NZQ7) contida no banco de dados de proteínas Uniprot (isto é, a sequência do Resíduo 1 ao Resíduo 238 contida na Q9NZQ7); a sequência de aminoácidos do domínio estrutural de IgG1-Fc foi obtida com base em uma sequência de aminoácidos da região constante da imunoglobulina gama 1 humana (IgG1) (P01857) contida no banco de dados de proteínas Uniprot (ou seja, a sequência do Resíduo 104 ao Resíduo 330 contida na P01857); e a sequência de aminoácidos do domínio estrutural de IgG1-Fc foi obtida com base em uma sequência de aminoácidos da região constante da imunoglobulina humana (IgG1) (P01868) contida no banco de dados de proteínas Uniprot (ou seja, a sequência do Resíduo 98 ao Resíduo 324 contida na P01868). A ferramenta online DNAworks (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) foi usada para desenhar as sequências codificantes de DNA correspondentes para obter os genes das proteínas de fusão hPD-L1-Fc e hPD-L1-muFc, e o mesmo método foi usado para obter um gene hPD-1-Fc. Uma sequência de aminoácidos para a proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) (C5MKY7), bem como uma sequência de aminoácidos para PD-L1 humana (Q9NZQ7), uma sequência de aminoácidos para PD-L1 murina (Q9EP73) e uma sequência de aminoácidos para PD-1 humano (Q15116) foram obtidas com base nas informações contidas no banco de dados de proteínas Uniprot. A ferramenta online DNAworks (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) foi usada para desenhar as sequências de DNA codificantes correspondentes para obter um gene da proteína de fusão PD-L1-EGFP, e o mesmo método foi usado para obter os genes hPD-1-EGFP e mPD-L1-EGFP. Os fragmentos de DNA correspondentes foram obtidos através da síntese artificial. As sequências genéticas sintetizadas foram digeridas duas vezes com HindIII e EcoRI fabricadas por Fermentas e clonadas no vetor comercial pcDNA4/myc-HisA (Invitrogen, V863-20); após isso, o sequenciamento foi realizado para verificar se o plasmídeo foi construído com precisão para se obter o DNA plasmidial recombinante; ou seja: pcDNA4-hPD- L1-Fc, pcDNA4-hPD-L1-muFc, pcDNA4-hPD1-Fc, pcDNA4-hPD-L1-EGFP, pcDNA4- hPD1-EGFP e pcDNA4-mPD-L1-EGFP.

[0153] A reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) foi usada para amplificar os genes humanos PD-L2 e B7H3 a partir de células dendríticas cultivadas em laboratório (células DC) (em que as referidas células DC foram obtidas via maturação por TNF-α das células mononucleares isoladas de PBMC) e os iniciadores de amplificação gênica utilizados foram os seguintes: PDL2-F HindlII:

[0154] O produto de PCR obtido foi então digerido duas vezes usando HindIII e EcoRI da Fermentas e clonado em um pcDNA4-hPD-L1-EGFP pré-construído; após isso, o sequenciamento foi realizado para verificar se o plasmídeo foi construído com precisão para se obter o DNA plasmidial recombinante; isto é: pcDNA4-hPD-L2-EGFP e pcDNA4-hB7H3-EGFP.

[0155] Um plasmídeo recombinante EGFP correspondente foi transfectado nas células HEK293 (ATCC, CRL-1573™) e a seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) foi realizada 48 horas após a transfecção para verificar a expressão de hPD-L1, mPD-L1, hPD-L2 e hB7H3.

[0156] pcDNA4-hPD-L1-Fc, pcDNA4-hPD-L1-muFc e pcDNA4-hPD1-Fc foram transitoriamente transfectados nas células HEK293 para a produção de proteínas. O plasmídeo de expressão recombinante foi diluído com um meio de cultura Freestyle293 e adicionado a uma solução de PEI (polietilenimina) necessária para a transformação; após isso, cada mistura de plasmídeo/PEI foi adicionada separadamente a uma suspensão de células e deixada em cultura a 37°C 10% de CO2 e 90 rpm; ao mesmo tempo, foi realizada uma adição suplementar de 50 μg/L de fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1). Quatro horas depois, foi realizada uma adição suplementar do meio de cultura EX293, glutamina a 2 mM e 50 μg/L de IGF-1 e a cultura foi mantida a 135 rpm. Após mais 24 horas, valproato de sódio a 3,8 mM (VPA) foi adicionado. Após 5-6 dias de cultura, o sobrenadante da cultura de expressão transitória foi coletado e a cromatografia de afinidade com Proteína A foi usada para purificar e obter inicialmente amostras de proteínas hPD-L1-Fc, hPD-L1- muFc e hPD-1-Fc para uso nos seguintes exemplos. As amostras de proteínas assim obtidas foram submetidas a testes preliminares usando SDS-PAGE, e as bandas alvo eram claramente visíveis.

[0157] Exemplo 2: Seleção de anticorpos anti-hPD-L1 na biblioteca de yeast display, expressão por clonagem e identificação.

[0158] A tecnologia de yeast display foi usada para selecionar anticorpos totalmente humanos para PD-L1. A clonagem de genes VH e VL contidos no cDNA de IgM e IgG do baço e linfonodo obtidos de 21 indivíduos humanos saudáveis foi realizada para construir uma biblioteca de yeast display scFV (a sequência de conexão entre VH e VL foi o peptídeo de conexão GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 67) e a capacidade de armazenamento do peptídeo de conexão da biblioteca foi de 5 x 108. Uma biblioteca de leveduras com capacidade de 10x foi retomada e as leveduras foram induzidas a expressar anticorpos em sua superfície; 100 nM de esferas magnéticas de antígeno hPD-L1 biotiniladas foram usadas para realizar duas rodadas de enriquecimento, após as quais foram realizadas mais duas rodadas de enriquecimento usando um anticorpo anti-myc e o flow sorting de hPD-L1 biotinilada. As leveduras assim obtidas foram plaqueadas e os clones únicos foram coletados. Leveduras monoclonais que foram submetidas à amplificação e indução de expressão foram ainda submetidas a uma análise por marcação usando um anticorpo anti-myc, bem como hPD-L1 biotinilado ou o antígeno de controle hPD-1 e leveduras que foram antígeno-positivas ou controle-negativas foram avaliadas como sendo levedura- positivas.

[0159] Os clones de levedura confirmadas pelo FACS foram submetidos a PCR e sequenciamento da colônia de leveduras utilizando-se os seguintes iniciadores de PCR:

em que o iniciador de sequenciamento utilizado foi pNL6-R. Os resultados da sequência obtidos após o sequenciamento foram submetidos a uma análise de alinhamento usando o pacote de software BioEdit.

[0160] O gene do anticorpo de cadeia única scFv obtido como descrito acima e um gene IgG1-Fc obtido anteriormente foram fundidos e clonados no vetor comercial pEE6.4 (Lonza) usando uma digestão dupla com as enzimas HindIII e EcoRI da Fermentas; após isso, a clonagem e o miniprep do plasmídeo foram realizados de acordo com os procedimentos padrão de clonagem molecular. Os plasmídeos extraídos foram expressos transitoriamente em células HEK293 e purificados usando a coluna com Proteína A.

[0161] As células HPD-L1-EGFP foram ressuspensas em tampão PBS-BSA a 0,5%; após isso, foram adicionados os anticorpos purificados mencionados acima anti-HPD-L1 scFv enquanto, ao mesmo tempo, os controles correspondentes foram estabelecidas com 2 μg de uma proteína hlgG1 utilizada como um controle negativo e hPD-1-Fc sendo adicionado ao controle positivo. O anticorpo secundário utilizado foi o anti-hlg-PE da eBioscience. A detecção foi realizada por citometria de fluxo após a marcação. O método acima foi utilizado para identificar anticorpos capazes de se ligar a antígenos PD-L1 da superfície celular.

[0162] As células hPD-L1-EGFP foram ressuspensas em tampão PBS-BSA a 0,5%; após isso, os anticorpos anti-hPD-L1 scFv purificados mencionados acima foram adicionados e, ao mesmo tempo, um controle negativo foi estabelecido com 2 μg de uma proteína hlgG1 usada como um controle negativo; 0,3 μg de hPD-1-Fc- biotina foram adicionados a todas as amostras e o SA-PE da eBioscience foi utilizado como anticorpo secundário; a detecção foi realizada por citometria de fluxo após a marcação e os resultados são mostrados na Figura 1. O método acima foi usado para identificar anticorpos capazes de bloquear os antígenos PD-L1 da superfície celular e a ligação a PD-1.

[0163] Após a seleção e identificação, foram obtidas três linhagens de anticorpos que apresentaram características favoráveis: B50, B60e BII61. Como pode ser visto nos resultados, todas as três linhagens de anticorpos anti-hPD-L1 foram capazes de bloquear a ligação com o receptor hPD-1.

[0164] A sequência do peptídeo de conexão: GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 67) estava contida entre as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo mencionado acima.

[0165] A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada B50 foi: QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKW YNDYADSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 51); em que as seções sublinhadas constituem CDR1, 2 e 3 e correspondem às SEQ ID NO: 13-15, respectivamente, e as seções não sublinhadas constituem FR1, 2, 3 e 4 e correspondem às SEQ ID NO: 38-41, respectivamente; a sequência de DNA correspondente foi: CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCT TCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCG ACTCTGTGAAAAGTCGATTAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAATT AAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTG ATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA (SEQ ID NO: 59); a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve foi: QSALIQPASVSGS PGQSITISCTGTSSDVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRF SGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO: 56); em que as seções sublinhadas constituem CDR1, 2 e 3 e correspondem às SEQ ID NO: 21, 17 e 18, respectivamente, e as seções não sublinhadas constituem FR1, 2, 3 e 4 e correspondem às SEQ ID NO: 42-45, respectivamente; e a sequência de DNA correspondente foi: CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTAT CTCCTGTACTGGCACCAGOAGTGATGTTGGAGGTTAOGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTAC CCGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCG CTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGAC GAGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCAC CCAGCTGACCGTCCTC (SEQ ID NO: 66).

[0166] A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada B60 foi: QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRF QGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFSYGWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53); em que as seções sublinhadas constituem CDR1, 2 e 3 e correspondem às SEQ ID NO: 1, 2 e 19, respectivamente, e as seções não sublinhadas constituem FR1, 2, 3 e 4 e correspondem às SEQ ID NO: 22-25, respectivamente; a sequência de DNA correspondente foi: CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCT GCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACA GGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCC AGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCTG ATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAGCTATGGCTGGTTTG ACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 60); a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve foi: EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSG SGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 48); em que as seções sublinhadas constituem CDR1, 2 e 3 e correspondem às SEQ ID NO: 4-6, respectivamente, e as seções não sublinhadas constituem FR1, 2, 3 e 4 e correspondem às SEQ ID NO: 26-29, respectivamente; e a sequência de DNA correspondente foi: GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCAC CCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGC CAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCA GTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAA TCAAA (SEQ ID NO : 62) .

[0167] A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de BII61 foi: QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYA VSVKSRISINPDTS KNQFS LQLNSVT PE DTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 54); em que as seções sublinhadas constituem CDR1, 2 e 3 e correspondem às SEQ ID NO: 7, 2 e 9, respectivamente, e as seções não sublinhadas constituem FR1, 2, 3 e 4 e correspondem às SEQ ID NO: 30-33, respectivamente; a sequência de DNA correspondente foi: CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCA TCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAG TATCTGTGAAAAGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTG AACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATATTTTG TCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO : 61) ; a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve foi: DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRESGi SGSGTDFILTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK (SEQ ID NO: 55); em que as seções sublinhadas constituem CDR1, 2 e 3 e correspondem às SEQ ID NO: 10-12, respectivamente, e as seções não sublinhadas constituem FR1, 2, 3 e 4 e correspondem às SEQ ID NO: 34, 46, 36 e 37, respectivamente; e a sequência de DNA correspondente foi: GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCA CTTGCCGGGCAAGTCAGAGCAITAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGC CCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTC-GGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCA GTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTAC TACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATA TCAAA (SEQ ID NO: 65) .

[0168] Exemplo 3: Construção da biblioteca de leveduras com afinidade melhorada de anti-hPD-L1 scFv.

[0169] Uma reação de PCR padrão foi realizada respectivamente utilizando os plasmídeos pEE6.4-B50-Fc, pEE6.4-B60-Fc e pEE6.4-BII61-Fc como modelos e pEE 6.4-F: TCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGC (SEQ ID NO: 80) p e cMyc-BBXhol: GCCAGATCTCGAGCTATTACAAGTCTTCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCTAGAATTCCG (SEQ ID NO: 81) como iniciadores. Os produtos de PCR foram purificados e clonados no vetor comercial pCT302 comercial (addgene: #41845) usando Nhel e BglII da Fermentas, para obter os plasmídeos recombinantes pCT302-B50, pCT302-B60 e pCT302-BII61. Em seguida, a PCR propensa a erros foi usada com base no método detalhado em Ginger et al. (2006) Nat Protoc 1 (2): 755 -68 para obter produtos de PCR de scFv mutados aleatoriamente. Os iniciadores utilizados foram

[0170] Os produtos de PCR assim obtidos foram purificados usando um kit de purificação de DNA GeneJET da Fermentas e depois concentrados por precipitação com etanol a uma concentração superior a 1 μg/μL. As Nhel e BamHI da Fermentas foram utilizadas para realizar uma digestão dupla do vetor comercial pCT302 e, ao mesmo tempo, a enzima de desfosforilação FastAP da Fermentas foi usada para realizar a desfosforilação do vetor; após isso, um Kit de Purificação de DNA GeneJET da Fermentas foi novamente usado para realizar purificação e a precipitação com etanol foi realizada para concentrar o produto a uma concentração superior a 1 μg/μL. A eletrotransformação da levedura e a recombinação in vivo foram realizadas de acordo com o método descrito em Ginger et al. (2006) Nat. Protoc. 1 (2): 755-68 para obter uma biblioteca de leveduras amadurecida por afinidade.

[0171] Exemplo 4: Seleção de leveduras que expressam scFv anti-hPD-L1 com afinidade melhorada.

[0172] A biblioteca de leveduras amadurecidas por afinidade obtida como descrito acima foi submetida a duas séries de flow sorting usando 10 nM e 1 nM de uma proteína hPD-L1-Fc, e os produtos de levedura assim obtidos foram plaqueados e os monoclones foram selecionados para identificação. A marcação do antígeno a baixa concentração foi usada para realizar a marcação para citometria de fluxo (flow staining) a fim de identificar os monoclones de leveduras que mostraram maior afinidade, ao se utilizar leveduras de tipo selvagem obtidas anteriormente como controle.

[0173] Os clones de leveduras que passaram na verificação pelo FACS foram submetidos a PCR e sequenciamento de colônias de leveduras utilizando-se a metodologia descrita acima. O gene scFv obtido após a maturação por afinidade e um gene IgG1-Fc obtido anteriormente foram fundidos e clonados no vetor comercial pEE6.4 usando uma digestão dupla pelas enzimas HindIII e EcoRI da Fermentas; após isso, a clonagem e o miniprep do plasmídeo foram realizados de acordo com os procedimentos padrão de clonagem molecular. Os plasmídeos extraídos foram expressos transitoriamente em células HEK293 e purificados usando a coluna com Proteína A.

[0174] A capacidade de ligação e a capacidade de bloqueio do anticorpo foram medidas usando o método descrito no Exemplo 2.

[0175] Vide a Figura 2 para obter os resultados do teste de capacidade de carga; os resultados mostram que as três linhagens de anticorpos obtidas após a maturação por afinidade apresentaram aumento significativo na afinidade.

[0176] Vide a Figura 3 para os resultados do teste de capacidade de bloqueio; os resultados mostram que os valores de IC50 para ligação competitiva a PD-L1 em competição com PD-1 obtidos para as três linhagens de anticorpos obtidas após a maturação por afinidade foram de 0,837 μg/mL para BII61-62 (0,884 μg/mL para BII61), 4,56 μg/mL para B50-6 (5,63 μg/mL para B50) e 1,14 μg/mL para B60-55 (16,8 μg/mL para B60), respectivamente.

[0177] Após a maturação por afinidade, foram obtidas três sequências de anticorpos anti-hPD-L1 scFv mostrando aumento de afinidade, isto é, B50-6, B60-55 e BII61-62. Comparado com B50, B50-6 mostrou uma mutação de aminoácido de D para N em sua VL CDR1; comparado com B60, B60-55 mostrou uma mutação de aminoácidos de S para N em sua VH CDR3; e comparado com BII61, BII61-62 mostrou uma mutação de aminoácido de S para G em sua VH CDR2, bem como uma mutação de aminoácido de I para V em sua VL FR2. A sequência do peptídeo de conexão GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 67) estava contida entre as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo mencionado acima.

[0178] A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada B50- 6 foi: QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKWYNDYA DSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 51); em que as seções sublinhadas constituem CDR1, 2 e 3 e correspondem às SEQ ID NO: 13-15, respectivamente, e as seções não sublinhadas constituem FR1, 2, 3 e 4 e correspondem às SEQ ID NO: 38-41, respectivamente; a sequência de DNA correspondente foi: CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCT TCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCG ACTCTGTGAAAAGTCGATOAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAATT AAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTG ATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA (SEQ ID NO: 59); a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve foi: QSALIQPASVSGS PGQSITIS CTGTSSNVGGYDLVSWYQQYPGQAPRL11YEVIKRPSG ISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO: 52) ; em que as seções sublinhadas constituem CDR1, 2 e 3 e correspondem às SEQ ID NO: 16-18, respectivamente, e as seções não sublinhadas constituem FR1, 2, 3 e 4 e correspondem às SEQ ID NO: 42-45, respectivamente; a sequência de DNA correspondente foi: CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCT GTACTGGCACCAGTAGTAATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGG CCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTC TCTGGTTCCAAGTCTGGCACACGGCCTCCCTGACAA7CTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGC TGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTOCAIGGTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAG CTGACCGTCCTC(SEQ ID NO: 64); a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada B60-55 foi: QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTK YAQRFQGRVTITADES TTOAYMELSSLISDDTALYYCT TSRGFNYGWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 47); em que as seções sublinhadas constituem CDR1, 2 e 3 e correspondem respectivamente à SEQ ID NO: 1-3 e as seções não sublinhadas constituem FR1, 2, 3 e 4 e correspondem às SEQ ID NO: 22-25, respectivamente; a sequência de DNA correspondente foi: CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCT GCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACA GGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCC AGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCTG ATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAACTATGGCTGGTTTG ACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 57); a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve foi: EIVMIQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIP< DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 48) ; em que as seções sublinhadas constituem CDR1, 2 e 3 e correspondem às SEQ ID NO: 4-6, respectivamente, e as seções não sublinhadas constituem FR1, 2, 3 e 4 e correspondem às SEQ ID NO: 26-29, respectivamente; a sequência de DNA correspondente foi: GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCAC CCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGC CAGGTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAG TGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA GTGATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAAT CftAA (SEQ ID NO: 62); a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de BII61-62 foi: QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKW YDDYAVSVKGRISINPDTS KNQ FS LQLNSVTPE DTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO: 49) ; em que as seções sublinhadas constituem CDR1, 2 e 3 e correspondem às SEQ ID NO: 7-9, respectivamente, e as seções não sublinhadas constituem FR1, 2, 3 e 4 e correspondem às SEQ ID NO: 30-33, respectivamente; a sequência de DNA correspondente foi: CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACT' CACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAG; ÍTCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTA TGCAGTATCTGTGAAAGGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGi CAGTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATA TTTTGTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQID NO: 58) ; a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve foi: DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLVYGASSLQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK (SEQ ID NO: 50); em que as seções sublinhadas constituem CDR1, 2 e 3 e correspondem às SEQ ID NO: 10-12, respectivamente, e as seções não sublinhadas constituem FR1, 2, 3 e 4 e correspondem às SEQ ID NO: 34-37, respectivamente; e a sequência de DNA correspondente foi: GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCAC CATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGG AAAGCCCTAAGCTCCTGGTCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAG TGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCA ACTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGT GGATATCAAA (SEQ ID NO: 63).

[0179] Exemplo 5: Formatação do anticorpo scFv para o anticorpo IgG.

[0180] Uma sequência de aminoácidos da região constante de IgG1 humana foi obtida com base na sequência de aminoácidos da região constante da imunoglobulina gama 1 humana (IgG1) contida no banco de dados de proteína Uniprot (P01857). A ferramenta online DNAworks (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) foi usada para desenhar as sequências de DNA codificantes correspondentes para obter um gene da região constante da IgG1 humana e as sequências VH das regiões variáveis da cadeia pesada de B50-6, B60-55 e BII61-61 obtidas por seleção foram submetidas ao splice juntamente com o gene da região constante de IgG1 humana, enquanto, ao mesmo tempo, a sequência de peptídeo sinal abaixo foi adicionada à extremidade 5' da VH: ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCIGGGTTCCAGGTTCCACCGGT (SEQ ID NO: 84); o gene modificado por splice foi sintetizado e a digestão dupla foi realizada utilizando-se as enzimas HindIII e EcoRI da Fermentas para clonar o gene no vetor pEE6.4 para obter pEE6.4-B50-6HC; pEE6.4-B60-55HC; e pEE6.4-BII61-62HC. Uma sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve kappa humana foi obtida com base na sequência de aminoácidos da região constante kappa da imunoglobulina humana contida no banco de dados da proteína Uniprot (P01834). A ferramenta online DNAworks (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) foi usada para desenhar as sequências de DNA codificantes correspondentes para obter um gene da região constante da cadeia leve kappa humana e as sequências VL das regiões variáveis da cadeia pesada de B60-55 e BII61-61 obtidas por seleção foram submetidas ao splice juntamente com o gene da região constante da cadeia leve kappa humana, enquanto, ao mesmo tempo, a sequência de peptídeo sinal abaixo foi adicionada à extremidade 5' da VL: ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT (SEQ ID NO: 84); a ferramenta online DNAworks (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) foi usada para desenhar as sequências de DNA codificantes correspondentes para obter um gene da região constante da cadeia leve lambda (A) humana e a sequência VL da região variável da cadeia leve de B50-6 obtida por seleção foram submetidas ao splice juntamente com o gene da região constante da cadeia leve lambda humana, enquanto ao mesmo tempo a seguinte sequência peptídica de sinal foi adicionada à extremidade 5 'da VL: ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT (SEQ ID NO: 84); e o gene modificado por splice foi sintetizado e a digestão dupla foi realizada utilizando-se as enzimas HindIII e EcoRI da Fermentas para clonar o gene no vetor pEE12.4 (Lonza) para obter pEE12.4-B50-6LC; pEE12.4-B60-55LC; e pEE12.4-BII61- 62LC.

[0181] Os plasmídeos de cadeia pesada e cadeia leve obtidos como descrito acima foram preparados usando um Kit AidLab Maxiprep (PL14). Os plasmídeos de cadeia leve e pesada construídos recombinantemente foram cotransfectados em células HEK293 para expressar o anticorpo. O plasmídeo de expressão recombinante foi diluído com um meio de cultura Freestyle293 e adicionado a uma solução de PEI (polietilenimina) necessária para a transformação; após isso, cada mistura de plasmídeo/PEI foi adicionada separadamente a uma suspensão de células e deixada em cultura a 37°C 10% de CO2 e 90 rpm; ao mesmo tempo, foi realizada uma adição suplementar de 50 μg/L de IGF-1. Quatro horas depois, foi realizada uma adição suplementar do meio de cultura EX293, glutamina a 2 mM e 50 μg/L de IGF-1 e a cultura foi mantida a 135 rpm. Após mais 24 horas, VPA a 3,8 mM foi adicionado. Após GAGCCATGAAGATCCAGAAGTTAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGGGTCGAGGTGCACAATGCT c r 5-6 AAACAAAGCCCAGGGAGGAGCAATATAACTCCACATACAGAGTGGTGTCCGTTCTGACAGTCCT GCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCACTGCCAGCC CCATAGAGAAGACAATCTCTAAAGCTAAAGGCCAACCACGCGAGCCTCAGGTCTACACACTGCC ACCATCCAGGGACGAACTGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACTTGTCTCGTCAAAGGATTCTAC CAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAACGGCCAACCAGAGAACAACTACAAGACCACCCC ACCAGTCCTGGACTCTGATGGGAGCTTTTTCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGT GGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCATAACCACTATACCCA GAAAAGCCTCAGCCTGTCCCCCGGGAAATAATGA (SEQ ID NO: 69); dias de cultura, o sobrenadante da cultura de expressão transitória foi coletado e a cromatografia de afinidade com Proteína A foi usada para purificar e obter anticorpos mAb anti-hPD-L1 B50-6, B60-55 e BII61-62. a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia IgG1 foi: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 68); a sequência de ácido nucleico da região da cadeia constante de IgG1 foi: GCCAGCACTAAGGGGCCCTCTGTGTTTCCACTCGCCCCTTCTAGCAAAAGCACTTCCGG AGGCACTGCAGCACTCGGGTGTCTGGTCAAAGATTAGTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGAGCTGG AACTTGGCGCCCTCACCTCCGGGGTTCACACCTTTCCAGCCGTCCTGCAGTCCTCCGGCCTGTA. CTCCCTGAGCAGCGTCGTTACCGTGCCATCCTCTTCTCTGGGGACCCAGACATACATCTGCAAT GTCACCATAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTCGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGAC ACACACCTGCCCTCCATGCCCCGCACCTGAACTCCTGGGCGGGCCTTCCGTTTTCCTGTTTCCT CCAAGCCCAAGGATACACTGATGATTAGCCGCACCCCCGAAGTCACTTGCGTGGTGGTGGATGT a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia kappa foi: RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 70) ; a sequência de ácido nucleico da região constante da cadeia kappa foi: CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATC TGGTACCGCTAGCGTTGIGIGCCTGCTGAATAACTTTIATCCACGGGAGGCTAAGGTGCAGTGG AAAGGGACAATGCCCTCCAGAGCGGAAATAGCCAAGAGTCCGTTACCGAACAGGACTCTAAAGA CTCTACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTCTCCAAGGCCGACTATGAGAAACACAAGGTT TACCATGCGAGGTCACACACCAGGGACTCTCCTCTCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGAGA ATGC (SEQ ID NO: 71); a sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve (lambda) de B50-6 foi: GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNN KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS (SEQ ID NO: 72); e a sequência de ácido nucleico da região constante da cadeia leve (lambda) de B50-6 foi: GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCA ACAAGGCCACACTGGIGTGTCTCGTAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAG GCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGTGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAAAGCAACAACA AGTATGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACGC TGCCGGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTGCAGAATGCTCT (SEQ ID NO: 73).

[0182] Exemplo 6: Verificação das propriedades do mAb anti-hPD-L1.

Medição da capacidade de ligação do anticorpo anti-hPD-LI purificado e hPD- L1 (método ELISA):

[0183] Um tampão de revestimento (tampão de carbonato-bicarbonato, 50 mM, pH 9,6) foi usado para diluir o hPD-L1-muFc a 2 μg/mL, em seguida, a solução foi aliquotada a 100 pL/poço e deixada em repouso a 4°C durante a noite. O líquido na placa foi então retirado e a lavagem foi realizada usando PBST (pH 7,4, 0,05% de Tween-20, V/V) e a amostra foi selada em 3% de BSA-PBS por 1 hora. Os anticorpos B50-6mAb, B60-55mAb e BII61-62mAb foram submetidos a diluição seriada de duas vezes a partir de 2.000 ng/mL até um total de 11 concentrações diferentes, sendo o diluente (1% de BSA-PBS) utilizado como controle e a incubação foi realizada por 2 horas a 37°C. Foi adicionado IgG-HRP anti-humano de cabra (IgG-HRP anti-humano de cabra conjugado) e a incubação foi realizada durante 1 hora. Adicionou-se então a solução de substrato cromogênico TMB de componente único solúvel e cada amostra foi desenvolvendo a cor à temperatura ambiente em um ambiente escuro por 5-10 minutos. H2SO4 a 2 N foi adicionado a 50 μL/poço para interromper a reação de cor. Cada amostra foi então colocada em um leitor de microplacas MD SpectraMax Plus384 e os valores de DO 450nm-650nm foram lidos; após isso, o pacote de software SoftMax Pro v5.4 foi usado para executar a análise de processamento e mapeamento de dados; os resultados são mostrados na Figura 4.

[0184] Usando o método acima, os valores de EC50 de ligação ao antígeno das três linhagens de anticorpos foram determinados em 40 μg/mL (B60-55 mAb), 18,3 μg/mL (BII61-62 mAb) e 28,1 μg/mL (B50-6 mAb).

Medição da cinética de ligação do anticorpo anti-hPD-L1 purificado e hPD-L1 (SPR):

[0185] As medições da cinética de ligação dos anticorpos anti-PD-L1 B50- 6mAb, BII61-62mAb e B60-55mAb em relação ao PD-L1 humano recombinante foram medidas usando ressonância de plasmon de superfície (SRP) realizada usando o Biacore X100. O hPD-L1-Fc recombinante foi diretamente colocado sobre um chip biossensor CM5 para obter aproximadamente 1000 unidades de resposta (RU). Para medições cinéticas, o anticorpo foi diluído em uma diluição seriada de três vezes em tampão HBS-EP+1x (GE, Cat #: BR-1006-69) (de 1,37 nm a 1000 nm), a amostragem foi realizada a 25°C por 120 segundos, com um tempo de dissociação de 30 minutos, e a regeneração foi realizada com 10 mM de glicina-HCl (pH 2,0) por 120 segundos. Um modelo de ligação simples um-a-um de Langmuir (Biacore Evaluation Software - Versão 3.2) foi usado para calcular a taxa de associação (kon) e a taxa de dissociação (koff). As constantes de dissociação de equilíbrio (kD) foram calculadas como a razão de koff/kon.

[0186] Vide a Tabela 1 para obter os valores de afinidade de ligação medidos do anti-PD-L1.TABELA 1. Medição da cinética de ligação do anticorpo anti-hPD-L1 e hPD-L1

Medição da capacidade de ligação do anticorpo anti-hPD-L1 purificado a hPD- L1 em competição com hPD-1:

[0187] Um tampão de revestimento (tampão de carbonato-bicarbonato, 50 mM, pH 9,6) foi usado para diluir hPD-L1-hlgG a 5 μg/mL; após isso, a solução foi deixada em repouso a 4°C durante a noite. A lavagem foi realizada utilizando PBST (pH 7,4, 0,05% de Tween-20, V/V) e a amostra foi selada em 3% de BSA-PBS por 1 hora. A concentração de mAb anti-hPD-L1 que aguardava a medição foi diluída para 100 μg/mL; após isso, foi realizada uma diluição seriada de 1: 6 usando 1% de BSA- PBST-0,05% de Tween-20 (contendo 10 μg/mL de hPD-1-hlgG-biotina) até um total de 9 diluições diferentes, e as diluições foram deixadas em repouso por 2 horas a 37°C. Após a lavagem da placa, a estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano silvestre (SA-HRP) foi adicionada e a amostra foi deixada em incubação à temperatura ambiente durante 1,5 horas. Adicionou-se então a solução de substrato cromogênico TMB de componente único solúvel e cada amostra foi desenvolvendo a cor à temperatura ambiente em um ambiente escuro por 5-10 minutos, após o qual, H2SO4 a 2 N foi adicionado para interromper a reação de cor. Cada amostra foi então colocada em um leitor de microplacas MD SpectraMax Plus384 e os valores de DO 450nm-650nm foram lidos; após isso, o pacote de software SoftMax Pro v5.4 foi usado para executar a análise de processamento e mapeamento de dados; e a competitividade do anticorpo foi analisada com base nos dados medidos e nos valores de IC50 e os resultados são mostrados na Figura 5.

[0188] Usando o método acima, os valores de IC50 da ligação competitiva ao antígeno para PD-L1 das três linhagens de anticorpos em relação à PD-1 foram determinados como 0,255 μg/mL 1,7 nM (B60-55), 0,24 μg/mL 1,6 nM (BII61-62) e 1,76 μg/mL 11,7 nM (B50-6).

Medição da capacidade de ligação do anticorpo anti-hPD-L1 purificado a hPD- L1 em competição com CD80:

[0189] Três linhagens de anticorpos obtidas por seleção, B60-55, BII61-62 e B50-6, foram avaliadas para determinar se eram capazes ou não de bloquear a ligação de PD-L1 e CD80 através de um método de ELISA competitivo. O método específico usado foi o seguinte: um tampão de revestimento (tampão de carbonato-bicarbonato, 50 mM, pH 9,6) foi usado para diluir hPD-L1-hFc a 5 μg/mL, em seguida, a solução foi deixada em repouso em repouso a 4°C durante a noite. A lavagem foi realizada utilizando-se PBST (pH 7,4, 0,05% de Tween-20, V/V) e a amostra foi selada em 3% de BSA-PBS por 1 hora. A concentração de mAb anti-hPD-L1 que aguardava a medição foi diluída para 100 μg/mL; após isso, foi realizada uma diluição seriada de 1:6 usando 1% de BSA-PBST-0,05% de Tween-20 (contendo 100 μg/mL de hCD80- hFc-biotina, R&D: 140-B1-100) até um total de 9 diluições diferentes, e as diluições foram deixadas em repouso por 2 horas a 37°C. Após a lavagem da placa, estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano silvestre (SA-HRP) foi adicionada e a amostra foi deixada em incubação à temperatura ambiente durante 1,5 horas. Adicionou-se então a solução de substrato cromogênico TMB de componente único solúvel e cada amostra foi desenvolvendo a cor à temperatura ambiente em um ambiente escuro por 5-10 minutos, após o qual, H2SO4 a 2 N foi adicionado para interromper a reação de cor. Cada amostra foi então colocada em um leitor de microplacas MD SpectraMax Plus384 e os valores de DO 450nm-650nm foram lidos; após isso, o pacote de software SoftMax Pro v5.4 foi usado para executar a análise de processamento e mapeamento de dados; e a competitividade do anticorpo foi analisada com base nos dados medidos e nos valores de IC50 e os resultados são mostrados na Figura 6.

[0190] Usando o método acima, os valores de IC50 de ligação competitiva ao antígeno para PD-L1 das três linhagens de anticorpos em relação à CD80 foram determinados como 0,543 μg/mL (B60-55), 0,709 μg/mL (BII61-62) e 0,553 μg/mL 11,7 nM (B50-6).

Verificação para determinar se PD-L1 é ou não reconhecido especificamente: ligação de anti-hPD-L1 purificado a hPD-L1, hPD-L2 e hB7H3

[0191] As células HEK293 contendo hPD-L1-EGFP, hB7H3-EGFP e hPD-L2- EGFP que foram construídas no Exemplo 1 foram suspensas em um tampão PBS- BSA a 0,5%; após isso, a proteína mAb anti-hPD-L1 (com hlgG Fc usado como controle negativo) foi adicionada, e a incubação em gelo foi realizada por 20 minutos. Após a lavagem, o anticorpo secundário anti-hlg-PE da eBioscience foi adicionado e as amostras foram deixadas em repouso no gelo por 20 minutos. Após a lavagem, as células foram ressuspensas em 500 μL de um tampão PBS-BSA a 0,5% e submetidas à medição em um citômetro de fluxo.

[0192] Os resultados são mostrados na Figura 6. Conforme mostrado nos resultados, todos os três anticorpos foram capazes de se ligar às células hPD-L1- EGFP, mas não foram capazes de se ligar às células hB7H3-EGFP e hPD-L2-EGFP, demonstrando boa especificidade.

Ligação de anti-hPD-L1 purificado a PD-L1 murino (mPD-L1):

[0193] As células HEK293 contendo hPD-L1-EGFP e mPD-L1-EGFP que foram construídas no Exemplo 1 foram suspensas em um tampão PBS-BSA a 0,5%; após isso, o mAb anti-hPD-L1 alvo (com hlgG Fc usado como controle negativo) foi adicionado e a incubação em gelo foi realizada por 20 minutos; a lavagem foi então realizada, o anticorpo secundário anti-hlg-PE da eBioscience foi adicionado e as amostras foram deixadas em repouso em gelo por 20 minutos. Após a lavagem, as células foram ressuspensas em um tampão PBS-BSA a 0,5% e submetidas à medição em um citômetro de fluxo. Os resultados são mostrados na Figura 7. Conforme mostrado nos resultados, o B50-6mAb foi capaz de se ligar ao PD-L1 murino (mPD- L1), enquanto o B60-55 e o BII61-62 não foram capazes de se ligar ao mPD-L1.

Ligação de anti-hPD-L1 purificado ao PD-L1 de macaco cinomolgo:

[0194] As PBMCs de macaco cinomolgo foram separadas utilizando-se um meio de separação de linfócitos humanos (Tianjin Hao Yang) e as células foram ressuspensas em meio RPMI completo, sendo ajustada, em seguida, a densidade celular para 1 milhão de células/mL; subsequentemente, 2 milhões de PBMCs de macaco cinomolgo foram adicionados a uma placa de 24 poços, enquanto a fito- hemaglutinina (PHA) foi adicionada simultaneamente a uma concentração final de 2 μg/mL; as células foram estimuladas por 48 horas, sendo coletadas em seguida, lavadas em tampão FACS e submetidas à marcação com anticorpo. O isotipo Ctrl (anti-KLH) foi usado como controle negativo e os anticorpos comerciais anti-PD1- humanos marcados com PE comercial (Biolegend: 329705) foram usados como controle positivo. Utilizando nossos anticorpos internos como anticorpos primários, a marcação com anticorpo foi realizada utilizando-se anti-hlg-PE como anticorpo secundário após a lavagem. Cada etapa de marcação foi seguida por incubação a 4°C por trinta minutos e, após a coloração, um tampão FACS foi usado para lavar as células duas vezes por centrifugação; após isso, os anticorpos secundários foram adicionados ou as células foram fixadas diretamente em paraformaldeído a 2% seguido por uma análise usando Guava. Os resultados são mostrados na Figura 8. Os resultados mostraram que as células T de macaco cinomolgo expressaram PD-L1 após serem estimuladas com PHA e as três linhagens de anticorpos que foram produzidas foram capazes de se ligar às células T de macaco cinomolgo ativadas.

[0195] Exemplo 7: Medição da ativação do anticorpo PD-L1 de células T CD4+ em uma reação linfocitária mista de células T-células dendríticas.

[0196] O meio de separação de linfócitos humanos (Tianjin Hao Yang) foi utilizado para separar as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) dos glóbulos brancos periféricos enriquecidos obtidos de doadores saudáveis por meio de centrifugação em gradiente de densidade. Em seguida, as referidas células foram ressuspensas em RPMI1640 sem soro e cultivadas em uma placa de 10 cm por 1-2 horas; após isso, as células não aderentes foram removidas e as células foram cultivadas em RPMI contendo 10% de SFB. Foram adicionadas citocinas em concentrações finais de 250 ng/mL para GM-CSF (Shanghai Primegene: 102-03) e 100 ng/mL para IL-4 (Shanghai Primegene: 101-04) e, em seguida, foi adicionado um meio fresco contendo citocinas a cada 2-3 dias. No dia 6 da cultura, 50 ng/mL de TNF- alfa (Shanghai Primegene: 103-01) foi usado para induzir a maturação celular e as células foram incubadas por mais 24 horas. Células dendríticas maduras foram coletadas e coradas com anticorpo HLA-DR para verificar a maturação. As células foram então ressuspensas em um meio completo RPMI a uma concentração de 200.000 células/mL. Adicionaram-se 50 μL da suspensão resultante a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em U (Costar: 3799) e as células foram deixadas em cultura em uma estufa.

[0197] Um kit de isolamento com esferas magnéticas (Miltenyi Biotec: 130096-533) foi usado para isolar as células T CD4+ das PBMCs obtidas de outro doador, de acordo com as instruções fornecidas. As células foram contadas e ressuspensas em meio RPMI completo a uma concentração de 2 milhões de células/mL; após isso, elas foram adicionadas à placa de 96 poços contendo células dendríticas, com 50 μL sendo adicionados a cada poço. Foram adicionados 100 μL de anticorpos PD-L1, que foram diluídos em série em meio RPMI completo, em cada poço para se obter as concentrações finais de anticorpos de 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 e 0 μg/mL. As células foram então cultivadas por cinco dias, o sobrenadante foi coletado e um kit de detecção ELISA para IFN-Y (eBioscience) foi usado para detectar os níveis de IFN-Y no sobrenadante. Os resultados são mostrados na Figura 9.

[0198] Os resultados mostram que os anticorpos PD-L1 podem aumentar a secreção de IFN-Y pelas células T CD4+ em uma reação linfocitária mista; isto é, os anticorpos PD-L1 aumentaram a ativação das células T. O valor de EC50 obtido para BII61-62 foi de 0,078 μg/mL (equivalente a 0,5 nM) e o valor de EC50 obtido para B60- 55 foi de 0,189 μg/mL (equivalente a 1,2 nM).

[0199] Exemplo 8: Atividade inibitória dos anticorpos anti-hPD-L1 no crescimento tumoral.

[0200] Já está claro que muitos tumores expressam ligantes de PD-1 como uma maneira de enfraquecer as respostas das células T antitumorais do corpo. Foi descoberto um nível característico de expressão aumentada de PD-L1 em tumores e leucócitos infiltrantes de tumor em muitos indivíduos diferentes, e a referida expressão aumentada de PD-L1 está frequentemente associada a um mau prognóstico. Os modelos de tumores murinos mostraram aumentos semelhantes na expressão de PD- L1 em tumores e também demonstraram o papel da via PD-1/PD-L1 na inibição da imunidade tumoral.

[0201] Neste documento, fornecemos resultados experimentais que mostram que o bloqueio de PD-L1 afeta o crescimento do tumor de células MC38 (células de câncer colorretal murino) encontradas em camundongos C57B6 singênicos.

[0202] No dia 0, 1 milhão de células MC38 (generosamente fornecidas pelo professor Yangxin Fu da Universidade de Chicago) foram inoculadas subcutaneamente em camundongos C57B6; os camundongos foram então submetidos a uma injeção intraperitoneal de 10 mg/kg de anti-PD-L1 (B50-6) ou PBS nos dias 0, 3, 7 e 10. As dimensões do tumor foram medidas no dia 3 e o volume tumoral foi calculado para gerar uma curva de crescimento tumoral (vide Figura 10); os resultados mostram que o anti-PD-L1 (B50-6) é capaz de inibir significativamente o crescimento tumoral.

[0203] Camundongos imunodeficientes NOD/SCID (diabéticos não obesos/ imunodeficiência combinada grave) foram usados para estudar a atividade in vivo dos anticorpos anti-PD-L1 B60-55 e BII61-62, que foram incapazes de reconhecer o PD- L1 murino. Experimentos utilizando a linhagem celular de melanoma A375 (ATCC, CRL-1619™), que expressa PD-L1 humana quando transplantadas subdermicamente em camundongos NOD/SCID e células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs), foram utilizados para alcançar o objetivo acima. As células A375 e PBMCs foram misturadas na proporção de 5:1 antes da injeção e foi realizada uma injeção subcutânea com um volume total de 100 μL (contendo 5 milhões de células A375 e 1 milhão de PBMCs); os anticorpos foram administrados intraperitonealmente nos dias 0, 7, 14, 21 e 28 após a inoculação no tumor (a dose de anticorpo foi de 3 mg/kg para a Figura 11-A e as doses de anticorpos são mostradas diretamente na Figura 11 para a Figura 11-B), com PBS sendo usado como controle negativo. Cada grupo experimental foi composto por 4-6 camundongos. A formação do tumor foi observada duas vezes por semana, as dimensões foram medidas usando paquímetro Vernier e o volume tumoral foi calculado para gerar uma curva de crescimento tumoral (vide Figura 11); os resultados mostram que os anticorpos B60-55 e BII-61-62 são capazes de inibir significativamente o crescimento tumoral.

[0204] Exemplo 9: Uma comparação da estabilidade do anticorpo B60-55 e 2.41H90P (Medimmune).

[0205] Um teste de estabilidade acelerada do anticorpo anti-PD-L1 B60-55 e do anticorpo Medimmune LLC 2.41H90P foi realizado a 45°C e o procedimento de teste específico usado foi o seguinte: o anticorpo anti-PD-L1 B60-55 e anticorpo anti- PD-L1 LLC 2.41H90P da Medimmune (preparado de acordo com o método para a preparação de 2.14H9 dado na Patente US No. 20130034559, o anticorpo sendo renomeado em seguida como 2.41H90P) foi enriquecido até uma concentração de 10 mg/mL; após isso, 100 μg de anticorpo foram adicionados a um tubo de PCR de 200 μg e colocados em um lote a 45°C; amostras nos dias 0, 10, 20 e 30 foram coletadas; após isso, testes de análise por ELISA competitivo e SE-HPLC foram realizados, em que o método de ELISA competitivo utilizado foi o mesmo que o descrito no Exemplo 6 para se obter os valores de IC50. A SE-HPLC foi realizada utilizando-se um cromatógrafo Shimadzu LC LC20AT HPLC; as amostras foram concentradas a 1 mg/mL e as amostras foram carregadas a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, para um volume total de amostra de 50 μg; e a eluição isocrática foi realizada por 30 minutos após o carregamento da amostra e os resultados são mostrados na Figura 12.

[0206] Na Figura 12, A ilustra uma comparação gráfica dos valores de IC50 ao longo do tempo para B60-55 e o anticorpo 2.41H90P, e os dados indicam que não houve mudanças significativas na competitividade da amostra em diferentes pontos no tempo; B ilustra a proporção de dímeros de anticorpos ao longo do tempo, e os dados indicam que a proporção de dímeros diminuiu ao longo do tempo para ambos B60-55 e 2.41H90P; no entanto, a taxa na qual 2.41H90P mostrou uma diminuição mais rápida que B60-55, indicou que B60-55 é mais estável; e C ilustra a curva do ELISA competitivo obtida para os testes de estabilidade acelerada de B60-55 e os dados mostram que B60-55 é capaz de manter uma atividade e estabilidade relativamente boas.

[0207] Exemplo 10: Preparação em escala e estabilidade da formulação da variante de anticorpo B60-55-1.

[0208] Para avaliar o potencial para preparação em escala dos anticorpos, um exemplo de variante do anticorpo B50-55-1 foi clonado essencialmente como descrito na divulgação anterior. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada completa de B60-55-1 foi: QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRF QGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFNYGWFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 85); a sequência de DNA correspondente foi: CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCT1 GCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACA. AGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTC: CAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCC: TGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAACTATGGCTGGTT' TGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCAGCACTAAGGGGCCCTCTGTGi TTTCCACTCGCCCCTTCTAGCAAAAGCACTTCCGGAGGCACTGCAGCACTCGGGTGTCTGGTCA, AAGATTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGAGCTGGAACTCTGGCGCCCTCACCTCCGGGGTTCAJ CACCTTTCCAGCCGTCCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTCGTTACCGTGCCA. TCCTCTTCTCTGGGGACCCAGACATACATCTGCAATGTCAACCATAAGCCTAGCAACACCAAGG; TGGACAAAAAGGTCGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACACACACCTGCCCTCCATGCCCCGCACC: TGAACTCCTGGGCGGGCCTTCCGTTTTCCTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATT' AGCCGCACCCCCGAAGTCACTTGCGTGGTGGTGGAIGTGAGCCATGAAGATCCAGAAGTTAAGT' TTAACTGGTATGTGGACGGGGTCGAGGTGCACAATGCTAAAACAAAGCCCAGGGAGGAGCAATA. TGCCTCCACATACAGAGTGGTGTCCGTTCTGACAGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAGi GAATACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCACTGCCAGCCCCCATAGAGAAGACAATCTCTAAAGi CTAAAGGCCAACCACGCGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCATCCAGGGAGGAAATGACCAA. GAATCAGGTGAGCCTGACTTGTCTCGTCAAAGGATTCTACCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGG; GAATCCAACGGCCAACCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCAGTCCTGGACTCTGATGGGA. GCTTTTTCCTGTATTCCAAGCrGACAGTGGACAAGTCTCGGTGGCAACAGGGCAACGTGTTCAG: CTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCATAACCACTATACCCAGAAAAGCCTCAGCCTGTCCCCC GGGAAATAATGA (SEQ ID NO: 86); a sequência de aminoácidos da cadeia leve completa foi: EIVNTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSG SGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS S PVTKS FKRGEC (SEQ ID NO: 87); a sequência de DNA correspondente foi: GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCT CCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCTGGCCAGGC TCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGC AGT GGGT CTGGGACAGACT T CAC T C TCAC CAT CAGCAGAC TGGAGC CT GAAGATT T T GCAGT GT ATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAA ACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGT ACCGCTAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTATCCACGGGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAAG TGGACAAT GC CC T CCAGAGC GGAAATAGC CAAGAG T CC GT TAC C GAACAGGACT C TAAAGAC T C TACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTCTCCAAGGCCGACTATGAGAAACACAAGGTTTAC GCATGCGAGGTCACACACCAGGGACTCTCCTCTCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGAGAAT GC (SEQ ID NO: 88);

[0209] B60-55-1 foram produzidos em células CHO cultivadas em um biorreator usando tanto o meio ActiCHO (GE) ou Dynamis (Thermo Fisher Scientific). Inicialmente, B60-55-1 foram purificados a partir de fluido de cultura celular clarificado usando resina de cromatografia de afinidade com Proteína A MabSelect Sure LX, GE seguida por duas outras etapas de cromatografia - cromatografia de troca aniônica na membrana Q-adsorber (GE) em um modo de fluxo e cromatografia em coluna em resina de hidroxiapatita (CaPure-HA, Tosoh), que foi a etapa final de polimento.

[0210] O rendimento observado da etapa de purificação do B60-55-1 em resina de Proteína A foi de cerca de 95-98%. O rendimento observado da etapa para a cromatografia Q-adsorvente foi de cerca de 93%-95%. A etapa final de purificação do B60-55-1, na qual os dímeros, oligômeros e agregados de B60-55-1, vestígios de DNA residual e a proteína A que vaza da coluna de Proteína A são removidos, é a cromatografia de polimento em CaPure-HA, que também serve como uma boa etapa de depuração viral. O rendimento final da etapa de hidroxiapatita foi de cerca de 77%- 85%. O cromatograma da purificação de B60-55-1 em CaPure-HA é mostrado na Figura 14.

[0211] A homogeneidade de B60-55-1 após a cromatografia em CaPure-HA, tal como avaliada por HPLC por exclusão de tamanho, não foi inferior a 99%. O cromatograma de exclusão de tamanho analítico é mostrado na Figura 15.

[0212] A eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS- PAGE) sob condições reduzidas e não redutoras também demonstrou alta pureza da preparação de B60-55-1. Imagens de géis corados com Coomassie são mostradas na Figura 16.

[0213] A análise de mapeamento de peptídeo tríptico LC-MS de B50-55-1 purificado mostrou que a cadeia pesada do anticorpo purificado não possui o resíduo de lisina C-terminal, o que não afeta as propriedades de ligação ao antígeno do anticorpo purificado (vide Exemplo 11).

[0214] Várias formulações líquidas desenvolvidas para B60-55-1 foram testadas em estudos de estabilidade em condições forçadas (stressed stability studies). Durante estes estudos, amostras estéreis de diferentes formulações de B60- 55-1 com B60-55-1 em concentrações de cerca de 50 mg/mL foram incubadas a 40°C por 6 semanas. As amostras foram reunidas e analisadas em sete pontos no tempo durante a incubação: 0, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas e 6 semanas. Testes subsequentes foram realizados em amostras agrupadas para medir a concentração de proteínas (concentração de B60-55-1), pureza, integridade, turbidez e osmolalidade. A concentração de proteínas foi medida pela absorbância a 280 nm, a identidade e a integridade das proteínas foram avaliadas por SDS-PA GE, a turbidez foi medida por A600, a osmolalidade foi medida por osmômetro calibrado. Com base nos resultados dos experimentos de estabilidade em condições forçadas, utilizou-se a seguinte formulação para os estudos subsequentes: serina a 275 mM, histidina a 10 mM, pH 5,9. Nesta formulação, após incubação a 40°C por 5 semanas, a pureza de B60-55-1 excedeu 95%. Além disso, a seguinte formulação produziu uma estabilidade proteica substancialmente semelhante: polissorbato 80 a 0,05%, D- manitol a 1%, L-prolina a 120 mM, L-serina a 100 mM, L-serina a 100 mM, L-histidina- HCl a 10 mM, pH 5,8.

[0215] Exemplo 11: Estudos de cinética de ligação de B60-55-1 e hPD-L1 purificados por SPR.

[0216] O objetivo do estudo foi avaliar comparativamente os parâmetros de ligação da interação de B60-55-1 versus atezolizumab com a PD-L1 humana utilizando-se o método SPR. O ensaio foi realizado utilizando-se várias abordagens e duas versões de PD-L1 humana foram utilizadas, proteína de fusão PD-L1-Fc e PD- L1-His marcado. Séries de diferentes concentrações de ligantes PD-L1 foram utilizadas para se calcular as constantes de dissociação (Kd). Foram utilizados os seguintes equipamentos: R75000DC, espectrômetro de ressonância de plasmon, Reichert Technologies, Instrumento # 00478-1115, com os pacotes de software SPRAutolink Control e TraceDrawer Evaluation Software. Chip Sensor SR7000 Gold Sensor Slide, 500 kDa Carboximetil dextrano, Reichert, Inc, Prt: 13206066. A seguir, foram utilizados os reagentes: Solução estoque B60-55-1 a 32 mg/mL em D-manitol a 1%, Na-Acetato a 10 mM, pH 5,4 com; atezolizumab (Tecentriq), 60 mg/mL, em histidina a 20 mM, ácido acético a 14 mM, polissorbato 20 a 0,04%, sacarose a 4%, lote 3109904, Genentech Inc; PD-L1-His marcado, recombinante humano, derivado de HEK293, Phe19-Thr239, No. de acesso Q9NZQ7, R&D Systems, Cat # 9049-B7- 100, Lote # DDIW0116081; PD-L1-Fc, proteína de fusão IgG Fc humana, recombinante humano, derivado de HEK293, Phe19-Thr239, No. de acesso Q9NZQ7, R&D Systems, Cat # 156-B7-100, Lote # DKL2116031; Kit de Captura de Anticorpos Humanos, GE Healthcare, Cat # BR-1008-39, Lote # 10247121; Tampão de Corrida: PBS 1x suplementado com 0,005% de Tween-20, desgaseificado e filtrado através de filtro de 0,2μm.

[0217] Uma das abordagens padrão para medir os parâmetros de ligação é a imobilização dos anticorpos de captura em um chip com carregamento subsequente dos anticorpos de teste, seguido pela aplicação do ligante. No entanto, devido à presença no fragmento IgG Fc humano na proteína de fusão PD-L1-Fc, a captura mediada por anticorpos anti-humanos não pôde ser utilizada para este ligante. Portanto, para PD-L1-Fc, uma abordagem alternativa foi utilizada e ilustrada na Figura 17. Para a versão do ligante PD-L1-His marcado, a abordagem com anticorpos de captura foi utilizada e ilustrada na Figura 17, painel A. Para testar a ligação da proteína de fusão PD-L1-Fc, foram utilizados dois métodos alternativos: (1) imobilização direta do próprio PD-L1-Fc ilustrado na Figura 17, painel B e (2) imobilização dos anticorpos de teste, B60-55-1 e o comparador atezolizumab ilustrado na Figura 17, painel C.

[0218] Todas as proteínas foram covalentemente ligadas ao chip utilizando- se a mesma química e protocolo. As proteínas conjugadas ao chip incluíram anticorpos monoclonais IgG anti-humanos, ligante PD-L1-Fc, B60-55-1 e atezolizumab. A anti-IgG humana e a PD-L1-Fc foram utilizados em tampões compatíveis com o procedimento de conjugação, enquanto as preparações de B60- 55-1 e atezolizumab foram extensamente dialisadas contra 0,1x de PBS antes do acoplamento. O Gold Sensor Slide SR7000 colocado no instrumento e preparado com Tampão de Corrida, PBS 1x suplementado com 0,005% de Tween 20, por 5 min a 250 μL/min e depois estabilizado a 25 μL/min. Todas as etapas foram realizadas a 25°C. As preparações proteicas foram diluídas com tampão de imobilização (acetato de Na, 10 mM, pH 5,0) até uma concentração final de 25 μg/mL. Os reagentes para o procedimento de imobilização foram preparados da seguinte forma: Agente de ativação EDC/NHS consistindo em EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) a 40 mg/mL e NHS (N-hidroxissuccinimida) a 10 mg/mL em água, etanolamina-HCl a 1 M, pH 8,5 em água. Ativação: Agente de ativação EDC/NHS foi injetado no chip a 10 μL/min por 8 min, seguido por 5 min de lavagem com Tampão de Corrida. Imobilização: anti-IgG humana a uma concentração final de 25 μg/mL foi injetada no chip a 10 μL/min por 8 min. Desativação: os grupos ativos que não reagiram na superfície do chip foram bloqueados pela injeção de etanolamina-HCl a 1 M a 10 μL/min por 7 min. Após a conjugação do anticorpo, o chip foi lavado com Tampão de Corrida por 15 min a 25 μL/min.

[0219] Para estudar a interação do ligante PD-L1-His marcado com B60-55-1 e atezolizumab, a abordagem com anticorpos de captura foi utilizada. A anti-IgG humana foi covalentemente ligada ao chip e usada para capturar os anticorpos de teste, conforme ilustrado na Figura 17, painel A. O chip com anti-IgG humana imobilizada foi balanceado com o Tampão de Corrida a uma taxa de fluxo de 25 μL/min por 10-15 min. Os anticorpos de teste, B60-55-1 ou atezolizumab, foram carregados a 25 μL/min por 2 m; em seguida, o chip foi lavado por 3 min para remover os anticorpos não ligados. As diluições de duas vezes do ligante PD-L1-His foram preparadas utilizando-se Tampão de Corrida a partir da concentração de 100 nM. Foram utilizadas sete concentrações: 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3.125 e 1,56 nM. O ligante foi carregado a 25 μL/min por 3 min. Após o carregamento do ligante, a fase de dissociação do experimento foi realizada utilizando-se o Tampão de Corrida a uma taxa de fluxo de 25 μL/min por 5 min. A dissociação dos complexos de proteína ligada pela anti-IgG humana imobilizada foi realizada por uma corrida de MgCl2 a 3 M através do chip a 25 μL/min durante 30 seg. Séries de sensogramas para B60-55-1 capturado ou atezolizumab em diferentes concentrações do ligante PD-L1-His foram geradas conforme mostrado na Figura 18 e usadas para análise. Uma avaliação cinética do modelo de ligação 1: 1 foi usada para a análise da interação de PD-L1-His com os anticorpos de teste. Os seguintes valores de Kd foram obtidos: B60-55-1 Kd = 40,2 nM; atezolizumab Kd = 0,67 nM

[0220] Os resultados do estudo mostraram que a afinidade de ligação do PD- L1 monomérico para o comparador atezolizumab foi de cerca de 2-log maior que para B60-55-1, 0,67 nM vs. 40,2 nM, respectivamente. A afinidade de interação mais baixa de B60-55-1-PD-L1-His deveu-se a uma maior taxa de dissociação, enquanto a fase de associação para B60-55-1 e atezolizumab foi essencialmente idêntica à da tabela da Figura 18.

[0221] Para investigar as propriedades de ligação do ligante PD-L1-Fc com B60-55-1 e seu comparador atezolizumab, a proteína de fusão PD-L1-Fc foi diretamente imobilizada no chip, conforme ilustrado na Figura 17, painel B. Para identificar as condições para a regeneração eficaz do chip, foram realizados experimentos de observação (scouting). Verificou-se que MgCl2 a 3 M não dissociou os anticorpos ligados (nem B60-55-1 nem atezolizumab) a partir do PD-L1-Fc imobilizado. Várias condições de regeneração foram testadas, incluindo tampões de glicina-HCl a 10 mM com pH 3,0, pH 2,5, pH 2,0 e NaOH a 10 mM. Foi determinado que os tampões em pH 3,0 e pH 2,5 não removeram efetivamente os anticorpos ligados, enquanto o tratamento com NaOH inativou o ligante, resultando em perda de ligação. Concluiu-se posteriormente que a glicina-HCl, pH 2,0, era adequada para essas séries de experimentos.

[0222] O ligante PD-L1-Fc foi imobilizado no chip como descrito anteriormente neste exemplo, e foram aplicadas séries de concentrações de B60-55-1 ou atezolizumab. As diluições de duas vezes de B60-55-1 ou atezolizumab foram preparadas utilizando-se o Tampão de Corrida a partir da concentração de 100 nM. Foram utilizadas sete concentrações: 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 e 1,56 nM. O ligante foi carregado a 25 μL/min por 3 min. Após o carregamento do ligante, a fase de dissociação do experimento foi realizada utilizando-se o Tampão de Corrida a uma taxa de fluxo de 25 μL/min por 5 min. Séries de sensogramas para PD-L1-Fc imobilizado em diferentes concentrações de B60-55-1 ou atezolizumab foram geradas ,conforme mostrado na Figura 19, e utilizadas para análise. Uma avaliação cinética do modelo de ligação 1: 1 foi usada para a análise das interações de PD-L1- Fc imobilizado com os anticorpos de teste. Os seguintes valores de Kd foram obtidos: B60-55-1 Kd = 0,66 nM; atezolizumab Kd = 0,26 nM.

[0223] Os resultados do estudo mostraram que a afinidade de ligação do PD- L1-Fc dimérico imobilizado foi semelhante para B60-55-1 e para o comparador atezolizumab, 0,6 nM vs. 0,26 nM, respectivamente, conforme mostrado na tabela na Figura 19. A similaridade observada das afinidades de ambos os anticorpos refletem as interações com o ligante dimérico, que aparentemente foram diferentes das interações com a versão monomérica do ligante marcado com His.

[0224] Para avaliar ainda as propriedades de ligação dos anticorpos de teste, o B60-55-1 ou atezolizumab foram reticulados covalentemente no chip, conforme ilustrado na Figura 17, painel C. Essa abordagem permitiu a comparação direta de ambas as versões do ligante PD-L1, proteínas de fusão Fc e marcadas com His. As condições de regeneração deste sistema de ligação foram reavaliadas e verificou-se que glicina-HCl a 10 mM, pH 2,0 proporcionou uma recuperação satisfatória. B60-55- 1 e atezolizumab foram imobilizados em chips sensores separados, como descrito anteriormente neste exemplo, e várias concentrações das proteínas de fusão PD-L1- Fc ou PD-L1-His foram sequencialmente aplicadas em anticorpos imobilizados. As diluições de duas vezes de PD-L1-His ou PD-L1-Fc foram preparadas utilizando-se Tampão de Corrida a partir da concentração de 100 nM. Foram utilizadas sete concentrações: 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 e 1,56 nM. Os ligantes foram carregados a 25 μL/min por 3 min. Após o carregamento do ligante, a fase de dissociação do experimento foi realizada utilizando-se o Tampão de Corrida a uma taxa de fluxo de 25 μL/min por 5 min. Séries de sensogramas para B60-55-1 ou atezolizumab imobilizado em diferentes concentrações de proteína de fusão PD-L1-His ou PD-L1- Fc foram geradas, conforme mostrado nas Figuras 20 e 21, e utilizadas para análise. Uma avaliação cinética do modelo de ligação 1: 1 foi usada para a análise da interação de B60-55-1 imobilizado com ambas as versões de ligantes, PD-L1-His e PD-L1-Fc. Os seguintes valores de Kd foram obtidos para B60-55-1: para o ligante monomérico PD-L1-His Kd = 14,3 nM; para o ligante dimérico PD-L1-Fc Kd = 0,45 nM; para atezolizumab: para o ligante monomérico PD-L1-His Kd = 0,62 nM enquanto para o ligante dimérico PD-L1-Fc Kd = 0,19 nM.

[0225] Assim, a comparação das afinidades de ligação de PD-L1-His monomérico e PD-L1-Fc dimérico a B60-55-1 e seu comparador atezolizumab, revelou que B60-55-1 exibe uma afinidade cerca de 2 log maior com PD-L1-Fc do que com PD-L1-His, enquanto o atezolizumab tem afinidade semelhante a PD-L1-His e PD-L1-Fc. O último indica que o atezolizumab não consegue distinguir entre as formas monoméricas e diméricas do ligante.

[0226] A avaliação das propriedades de ligação de B60-55-1 e atezolizumab revelaram inesperadamente que B60-55-1 pode diferenciar substancialmente entre uma forma dimérica e uma monomérica de seu alvo cognato PD-L1, em oposição a um anticorpo comparador atualmente presente no uso clínico.

[0227] Exemplo 12: Comparabilidade das funções efetoras do anticorpo B60- 55-1 e atezolizumab.

[0228] Este exemplo descreve ainda uma análise e comparação das funções efetoras do anticorpo B60-55-1 com um anticorpo comparador atezolizumab. A presente divulgação inclui avaliações de ligação aos receptores gama Fc: CD16a, CD32a e CD64; avaliações de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) utilizando células PD-L1 positivas; atividade de citotoxicidade induzida por complemento (CDC), ligação a C1q e ligação a FcRn.

[0229] Além de seu papel na ligação ao antígeno, os anticorpos podem regular as respostas imunes pela interação com os receptores gama Fc por meio das interações com a região Fc do anticorpo. Essas interações com os receptores presentes nas células natural killer (NK) e em outras células mieloides induzem essas células a liberar citocinas como IFNy e grânulos citotóxicos contendo perforina e granzimas, que culmina na ADCC.

[0230] Os estudos realizados revelaram que o anticorpo B60-55-1 não exibiu ligação detectável ao receptor CD16a enquanto o Kd de atezolizumab em relação ao CD16a foi de 1,6E-5 M; B60-55-1 não demonstrou ligação detectável ao receptor CD32a, enquanto o Kd de atezolizumab em relação ao CD32a foi de 4,1E-5 M; B60- 55-1 possui uma ligação dez vezes menor aos receptores CD64 em comparação com outros anticorpos IgG1, no entanto, possui uma ligação semelhante ao CD64 quando comparado ao atezolizumab.

[0231] A citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) é um mecanismo de ação dos anticorpos através do qual as células infectadas por vírus ou outras células doentes são direcionadas para a destruição pelos componentes do sistema imune mediado por células, como as células natural killer. O ADDC Reporter Bioassay Core Kit da Promega (Cat # G7014) é um ensaio repórter bioluminescente para quantificação da ADCC. O ensaio combina células efetoras que expressam receptores FcyRIIIa na superfície celular que ligam fragmentos Fc de anticorpos de teste ligados à superfície das células que expressam o receptor alvo. A ligação das células alvo às células efetoras através dos resultados biológicos na ativação da transcrição gênica pela via NFAT nas células efetoras, direcionando a expressão da luciferase de vaga-lume, que pode ser quantificada por luminescência. Uma vez que B60-55-1 não mostrou nenhuma ligação a CD16a e CD32a, não se esperava que a molécula demonstrasse atividade ADCC. O ensaio foi realizado usando a linhagem celular PD-L1 positiva A2058. A atividade ADCC de B60-55-1 e atezolizumab foi comparada à ADCC de rituximab, um anticorpo conhecido por exibir forte atividade ADCC.

[0232] Como esperado para este anticorpo IgG1 construído, o B60-55-1 não exibiu uma atividade ADCC substancial em comparação ao rituximab (controle na Figura 22), enquanto exibiu uma atividade ADCC comparável ao atezolizumab.

[0233] B60-55-1 e atezolizumab são anticorpos direcionados para PD-L1, e a ligação de ambos os anticorpos a C1q foi comparada. Empregou-se um ELISA de dois sítios de ligação ao antígeno para examinar a afinidade com a qual ambos os anticorpos anti-PD-L1 interagem com C1q. Neste ensaio, ambos os anticorpos foram revestidos na placa a 25, 20, 15, 10, 8, 4, 2, 1,0,5 e 0 μg/mL durante a noite a 4°C. A placa foi então lavada e bloqueada com solução SuperBlock, seguida pela adição de C1q (Sigma, Cat # C1740) a 2 pg/mL em tampão de ligação e incubado por 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi então lavada e o conjugado anti-C1q-HRP (Thermo, Cat. # PA1-84324) foi adicionado à placa na diluição de 1: 250 em tampão de ligação (100 μL/poço) durante 1 hora à temperatura ambiente. O anticorpo conjugado com HRP não ligado foi removido por lavagem com Tampão de Lavagem. A atividade da HRP foi detectada utilizando-se o substrato cromogênico TMB. A reação de cor foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico e a placa foi lida a 450 nm. Após um ajuste na curva de 3 parâmetros, o EC50 foi calculado para a amostra e para o padrão de referência. O valor relatável é% EC50 do EC50 do padrão de referência em relação ao EC50 da amostra, de modo que o % mais alto significa uma potência mais alta para a amostra. O objetivo desses experimentos foi determinar a ligação de atezolizumab e B60-55-1 a C1q usando o formato ELISA.

[0234] Os resultados do ensaio ELISA são mostrados na Figura 23. Foi determinado que a EC-50 da ligação de atezolizumab a C1q foi de 14,9 μg/mL, enquanto a EC-50 da ligação de B60-55-1 a C1q foi de 6,9 μg/mL. Portanto, essas características de ligação são comparáveis.

[0235] Além disso, a capacidade de induzir CDC em células PD-L1 positivas (células A2058) foi comparada entre B60-55-1 e atezolizumab. Nesta análise de lise celular, os 'fantasmas celulares' (células lisadas) podem ser observados microscopicamente e quantificados através do reagente luminescente CytoTox-Glo adicionado às células por 1 hora.

[0236] Ambos os produtos exibiram atividade CDC muito baixa. Para atezolizumab, a EC50 foi de 0,09 μg/mL, enquanto a EC50 de B60-55-1 foi de 0,05 μg/mL.

[0237] A meia-vida da IgG é dependente do receptor Fc neonatal (FcRn), que, entre outras funções, protege a IgG do catabolismo. O FcRn liga o domínio Fc da IgG a um pH ácido, garantindo que a IgG endocitada não seja degradada nos compartimentos lisossômicos e, então, será liberada na corrente sanguínea. B60-55- 1 e atezolizumab foram comparados quanto à ligação ao receptor FcRn que foi expresso de maneira estável pelas células CHO.

[0238] O estudo mostrou que B60-55-1 se liga ao FcRn a uma Kd de 4,7E-7 M, o que é típico para anticorpos, enquanto o atezolizumab mostrou uma afinidade pouco maior a FcRn com uma Kd de 1E-7 M.

[0239] Exemplo 13: Avaliação comparativa das potências do anticorpo B60- 55-1, atezolizumab e pembrolizumab pela Reação Linfocitária Mista.

[0240] O ensaio de reação linfocitária mista (MLR) foi realizado para avaliar as potências de B60-55-1 e atezolizumab em ativar as células T. A ativação das células T foi medida pela concentração de interleucina 2 (IL-2) secretada pelas células T.

[0241] As células dendríticas (DC) e as células T CD4+ foram isoladas das células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC). A potência do pembrolizumab na ativação das células T na MLR foi usada como controle interno para monitorar o desempenho do ensaio. Valores da concentração que induz metade do efeito máximo (EC50) foram analisados com o ajuste da regressão não linear de dose-resposta sigmoidal do GraphPad Prsim.

[0242] Reagentes e Materiais

[0243] RPMI 1640: Gibco, Invitrogen (Cat # 22400); SFB, Gibco, (Cat # 10099); Penicilina-Estreptomicina (P/S): Gibco, Invitrogen (Cat # 10378); Solução tampão fosfato salino (PBS): Gibco, Invitrogen (Cat # 10010-023); Anticorpos QC para células dendríticas: Anti-CD1a [HI149] (FITC), Abcam (ab18231), Anti-CD83 [HB15e] (FITC), Abcam (ab134491), Anti-CD86 [BU63] (FITC), Abcam (ab77276), anti-HLA DR [GRB1] (FITC), Abcam (ab91335); Kit de Isolamento de Células T CD4+: Miltenyi Biotec, (Cat # 130-096-533); Pan Monocyte Isolation Kit: Miltenyi Biotec, (Cat # 130-096-537).

Linhagem celular

[0244] Células dendríticas, preparadas a partir de sangue humano recém- isolado (mais de 20 doadores saudáveis); Células T CD4+, preparadas a partir de sangue humano recém-isolado (mais de 20 doadores saudáveis). Kit de ensaio Kit de IL2 HTRF humano (Cisbio, Cat # 64IL2PEB). Dispositivo de detecção PHERAstarPlus, BMG Labtech.

Preparação celular

[0245] As células T CD4+ foram purificadas pelo Kit de Isolamento de Células T CD4+. As PBMCs foram preparadas com centrifugação em gradiente de densidade usando Lymphoprep, as células mantidas em meio completo a 37°C /5% de CO2 de acordo com o protocolo da GenScript.

[0246] As células dendríticas foram purificadas pelo Pan Monocyte Isolation Kit. As PBMCs foram preparadas com centrifugação em gradiente de densidade usando Lymphoprep, as células mantidas em meio completo a 37°C /5% de CO2 de acordo com o protocolo da GenScript. A pureza das células dendríticas foi validada por meio dos seus marcadores de superfície por FACS (CD1a, CD83, CD86 e HLA- DR).

Preparação dos anticorpos

[0247] As amostras foram entregues em equipamento do tipo dry shipper e armazenadas a 4°C antes do teste. As amostras foram diluídas com RPMI 1640 e aplicadas aos testes. Reação linfocitária mista para teste de anticorpos - Coleta de células efetoras (células T CD4+) por centrifugação a 1000 rpm por 3 min; - Diluição seriada das amostras com tampão de ensaio; - Plaquear o estoque de células efetoras em placa de ensaio de 96 poços e adicionar a amostra de teste; - Coletar as células alvo (células dendríticas) por centrifugação a 1000 rpm por 3 min; - Adicionar as células alvo para iniciar a reação e misturar gentilmente; - Incubar a placa em estufa a 37°C/5% de CO2 por 3 dias; - Realizar o teste de IL-2 humana e leitura da placa; - Faixa de concentração do teste para B60-55-1 e atezolizumab: a partir de 300 nM, diluição 3 vezes, 10 pontos em triplicata; - Faixa de concentração de teste para o pembrolizumab: a partir de 10 μg/mL, diluição 5 vezes, 6 pontos em triplicata.

Ensaio de reação linfocitária mista (MLR)

[0248] Os resultados do ensaio de MLR são mostrados na Figura 24, B60-55- 1 e atezolizumab foram capazes de ativar células T na MLR com diferentes secreções de IL-2. Os dados de ativação das células T para o pembrolizumab usados como controle foram consistentes com os dados prévios. A análise dos dados de MLR é mostrada na Tabela 2. Os valores de EC50 para B60-55-1 e atezolizumab no ensaio de MLR foram de 0,4665 nM e 21,53 nM. Assim, B60-55-1 ativa as células T no ensaio de MLR com potência substancialmente mais alta. Tabela 2. Resumo do melhor valor de ajuste para MLR

[0249] Exemplo 14: Avaliação da eficácia de B60-55-1 no tratamento do modelo de carcinoma de cólon murino MC38-hPD-L1 subcutâneo em camundongos PD-L1 humanizados

[0250] O objetivo deste estudo foi testar a eficácia in vivo de B60-55-1 e seu comparador atezolizumab, ambos administrados a 10 mg/kg, no tratamento do carcinoma de cólon murino MC38-hPD-L1 subcutâneo enxertado em camundongos PD-L1 humanizados.

Reagentes e equipamentos

[0251] Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM): Cellgro, No. de catálogo 10-013-CVR, armazenado a 4°C. Soro Fetal Bovino (SFB): Excell, No. de catálogo FSP500, armazenado a -20°C. Tampão fosfato salino (PBS): Gibco, No. de catálogo 20012027, armazenado a 4°C. Balança: Shanghai Shun Yu Heng Ping Science and Equipment Co. Ltd, N° de Catálogo MP5002. Paquímetro: Hexagon Metrolog, No. de catálogo 00534220.

Artigos de teste e controle

[0252] O anticorpo B50-55-1 foi armazenado em PBS na concentração de 50 mg/mL; controle negativo IVIG: Guang Dong Shuang Lin BIO-Pharmacy Co. Ltd, Lote No. 20160407, armazenado em PBS a 50 mg/mL; anticorpo de controle positivo, Atezolizumab: Genentech/Roche, Lote No. 3109904, a 60 mg/mL foi armazenado em um tampão contendo ácido acético glacial (16,5 mg), L-histidina (62 mg), polissorbato 20 (8 mg) e sacarose (821,6 mg).

Preparação da solução de administração

[0253] Os artigos de teste e controle foram diluídos com PBS antes da dosagem, armazenados temporariamente a 2 ~ 8°C e usados à temperatura ambiente em 4 horas. Os demais artigos de teste e controle que não haviam sido diluídos foram armazenados a 2 ~ 8°C.

Animais

[0254] Quarenta camundongos machos B-hPD-L1 humanizados, cepa C57BL/6, foram fornecidos por Beijing Biocytogen Co. Ltd. (certificado de qualidade No. 201716816)

Gerenciamento do alojamento dos animais

[0255] Os animais foram alojados em uma barreira específica livre de patógenos no Centro Animal da Beijing Biocytogen Co., Ltd. com 5 animais por gaiola ventilada individual (IVC). Os animais foram aclimatados por três dias a uma semana após a sua chegada.

[0256] A temperatura foi mantida a 20-26°C e a umidade foi mantida a 40-70%. As gaiolas eram feitas de policarbonato, com tamanho de 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material da cama era de madeira macia esterilizada sob pressão, a qual foi trocada uma vez por semana. Os marcadores de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, cepa, data de recebimento, tratamento, número do grupo e data de início do tratamento. Os animais tiveram livre acesso a alimento granulado seco autoclavado e água durante todo o período do estudo. A comida era do grau SPF e foi obtida da Beijing Keao Xieli Feed Co., Ltd. A água foi purificada por ultrafiltração. Os animais foram marcados com codificação auricular.

Métodos e procedimentos experimentais

[0257] A linhagem celular parental de carcinoma de cólon murino MC38 foi adquirida da Shunran Shanghai Biological Technology Co. Ltd. A linhagem cellular MC38-hPD-L1 foi construída substituindo o PD-L1 de camundongo por PD-L1 humana da Biocytogen Co, Ltd. As células foram mantidas em cultura em monocamada em DMEM suplementado com 10% de SFB inativado por calor e foram subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram coletadas e contadas para inoculação de tumores.

[0258] Cada camundongo recebeu, por injeção subcutânea, células tumorais MC38-HPD-L1 (5 x 105) com 0,1 mL de PBS no flanco dianteiro direito para o desenvolvimento do tumor. Os animais portadores de tumor foram aleatoriamente incluídos em três grupos de estudo quando o tamanho tumoral médio atingiu aproximadamente 100 mm3. Cada grupo foi composto por oito camundongos. Os artigos de teste e controle foram administrados aos 15 camundongos portadores de tumor de acordo com regimes predeterminados, conforme mostrados abaixo.Regime de Administração

[0259] Se a perda de peso corporal de um camundongo excedeu em 10%, o esquema de tratamento foi ajustado e o volume de administração foi reduzido proporcionalmente ou o animal foi retirado do estudo.

[0260] Após a conclusão da administração, o monitoramento do volume tumoral e do peso corporal continuou duas vezes por semana por até 2 semanas.

[0261] Os animais foram sacrificados com CO2, seguido de lesão medular para confirmar a eutanásia.

Índice das medições tumorais

[0262] O tamanho tumoral foi medido duas vezes por semana em duas dimensões pelo uso de um paquímetro, e o volume foi expresso em mm3 utilizando- se a fórmula: V = 0,5 axb2, onde a e b são os maiores e menores diâmetros do tumor, respectivamente.

[0263] Os animais foram pesados antes da inoculação do tumor e do agrupamento de animais duas vezes por semana durante o experimento e, finalmente, antes da eutanásia dos animais no ponto final do experimento. Os animais foram pesados quando a morte acidental aconteceu ou os animais estavam à beira da morte.

[0264] Durante todo o período do experimento, os animais foram verificados duas vezes por dia (manhã e tarde) quanto ao seu comportamento e estado, incluindo, entre outros, o aparecimento de úlceras tumorais, estado mental do animal, estimativa visual do consumo de alimentos e água, etc.

[0265] Os tumores foram coletados e pesados no momento do término do estudo. As fotos foram tiradas tanto dos animais sacrificados quanto dos tumores coletados, e as mesmas foram anexadas ao relatório posteriormente.

Índice de avaliação do fármaco

[0266] Inibição relativa do crescimento tumoral (TGI%): TGI% = (1-T/C) x 100%. T e C referem-se ao volume tumoral médio relativo (RTV) dos grupos tratado e veículo, respectivamente, em um determinado dia. T/C% representa a taxa relativa de proliferação tumoral[1], e a equação é: T/C% = TRTV/CRTV x 100% (TRTV: RTV médio dos grupos tratados; CRTV: RTV médio do grupo de veículo; RTV = Vt/V0, V0 refere-se ao volume tumoral durante o agrupamento, Vt refere-se ao volume tumoral medido em cada ponto no tempo indicado após o tratamento).

[0267] Razões de inibição do peso tumoral (IRTw%): No ponto final, os tumores dos animais foram pesados, o peso tumoral médio em cada grupo foi determinado e o IRTW% foi calculado pela fórmula: IRTW% = (Wgrupo controle - Wgrupo tratamento) / Wgrupo controle x 100 W refere-se ao peso tumoral médio.

[0268] Os dados foram analisados pelo teste t de Student/ Two-Way ANOVA, e P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Tanto a análise estatística quanto as observações biológicas foram levadas em consideração.

Resultados

[0269] Não foram observados sinais clínicos óbvios durante toda o experimento. O peso corporal da maioria dos animais aumentou gradualmente durante o estudo. O peso corporal médio e o percentual médio de alterações no peso corporal ao longo do tempo foram mostrados na Figura 25 e Tabela 3. Os animais do grupo B60-55-1 não mostraram diferença estatística no peso corporal em comparação com os do grupo controle (P> 0,05).Tabela 3. Alterações no peso corporal em camundongos B-hPD-L1 humanizados com enxerto tumoral de câncer de cólon murino MC38-hPD-L1

[0270] Todos os camundongos foram monitorados de perto quanto ao crescimento tumoral durante todo o experimento, onde o tamanho tumoral foi medido e registrado duas vezes por semana. A inibição do crescimento tumoral (TGI%) foi calculada e analisada no melhor ponto terapêutico (23 dias após o agrupamento). Os resultados da análise estatística são mostrados nas Tabelas 4 e 5. O crescimento tumoral individual em camundongo nos três grupos foi representado na Figura 26 e Figura 27. A redução da taxa de crescimento tumoral foi observada após administração de atezolizumab e B60-55-1. A regressão tumoral distinta no grupo atezolizumab e B60-55-1 foi observada separadamente em 2/8 e 1/8 camundongos. Tabela 4. Inibição do crescimento tumoral de B60-55-1 no dia 23 após o agrupamento

Tabela 5. Análise estatística do volume tumoral entre os vários grupos de B60- 55-1

[0271] Todos os tumores foram dissecados de camundongos sacrificados,fotografados e pesados no dia 29 após o agrupamento. Os resultados da análise estatística dos pesos tumorais são mostrados na Tabela 6 e na Figura 28. Como os tumores ainda cresciam após o término da administração, a taxa de inibição do crescimento tumoral (TGITV%) foi comprometida em comparação com a do dia 23. Assim, os pesos tumorais nos grupos tratados no ponto do final do estudo (dia 23) não apresentaram diferenças significativas em relação ao grupo de veículo (P > 0,05).Tabela 6. Inibição do peso tumoral de B60-55-1 no dia 29 após o início da administração

[0272] Neste estudo, os pesos corporais da maioria dos animais aumentaram gradualmente. Os animais do grupo B60-55-1 não apresentaram diferença estatística no peso corporal em comparação com os do grupo controle (P > 0,05), indicando que o B60-55-1 é seguro na presente dosagem. Taxas reduzidas de crescimento tumoral foram observadas após a administração de atezolizumab e B60-55-1. No melhor ponto de inibição do crescimento tumoral (dia 23 pós agrupamento), o volume tumoral médio do grupo de veículo controle foi de 2078±459 mm3, enquanto que nos grupos tratados com controle positivo, o volume tumoral médio foi de 10461±336 mm3, e nos tratados com B60-55-1, o volume tumoral médio foi de 1022±552 mm3. A inibição do crescimento tumoral TGITV% foi de 52,7% e 53,9%, respectivamente. No ponto final deste estudo (dia 29 após o agrupamento), observou-se uma regressão tumoral distinta nos grupos atezolizumab e B60-55-1 em 2/8 e 1/8 camundongos, e a inibição do peso tumoral IRTW% foi de 44,2% e 31,8%, respectivamente. Comparando com o grupo controle, os volumes tumorais dos animais no grupo B60-55-1, o composto apresentou atividade antitumoral, mas sem diferença significativa.

[0273] Assim, neste estudo, o B60-55-1 mostrou uma eficácia antitumoral comparável ao atezolizumab em doses de 10 mg/kg, sem afetar negativamente o peso corporal do animal ou induzir observações clínicas anormais.

[0274] Exemplo 15: Avaliação de B60-55-1 em um modelo de xenoenxerto para câncer de mama usando camundongos NSG™ humanizados.

[0275] Com a exceção do câncer de pele, o câncer de mama é a forma mais prevalente de câncer em mulheres, afetando cerca de 7% das mulheres quando atingem os 70 anos de idade (CDC). De acordo com as estimativas da American Cancer Society, haverá 252.710 novos casos diagnosticados e 40.610 mortes nos Estados Unidos em 2017. A taxa de sobrevida relativa em 5 anos em 2006-2012 foi de aproximadamente 90% para todos os estágios combinados. O câncer de mama triplo negativo é um subtipo único e agressivo de câncer de mama, com expressão clinicamente negativa para os receptores de estrogênio e progesterona e proteína HER2. Atualmente, não existem terapias direcionadas para tratar essa forma de câncer de mama. O desenvolvimento de um modelo murino de câncer humano primário é relevante para a doença humana, pois representa um modelo de câncer clinicamente relevante em camundongos que recapitula a doença humana. O Jackson Laboratory estabeleceu modelos de câncer de mama com xenoenxerto derivado de paciente (PDX), bem como modelos de xenoenxerto de linhagem celular na cepa de camundongo NSG™ altamente imunodeficiente, bem como as cepas derivadas de NSG™, como NSG™-SGM3. O camundongo NSG™ (NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlWj1/SzJ) foi desenvolvido pela sua capacidade de enxertar eficientemente células e tecidos humanos. A eficiência do enxerto é significativamente melhorada em relação a outras cepas de camundongos devido às deficiências inatas do sistema imunológico. Camundongos NSG™ humanizados (hu-CD34 NSG™) são camundongos NSG™ injetados com células-tronco hematopoiéticas humanas CD34+ e tornaram-se ferramentas importantes para estudar a função imune humana in vivo. Esses camundongos fornecem uma forte plataforma pré-clínica para a aplicação de novas imunoterapias, particularmente aquelas que são específicas para humanos e que não apresentam reação cruzada com camundongo. Além disso, esses modelos são utilizados para o perfil genômico de doenças e/ou para o desenvolvimento pré- clínico de fármacos. Neste estudo, o modelo de xenoenxerto da linhagem celular MDA-MB-231 para câncer de mama estabelecido em camundongos NSG™ humanizados foi utilizado para avaliar um novo anticorpo.

Camundongos e Alojamento

[0276] Camundongos fêmeas hu-CD34 NSG™ enxertados com células humanas CD34+, que tinham > 25% de células CD45+ humanas no sangue periférico 16 semanas após o enxerto, foram utilizados para este estudo. Foram utilizadas coortes de camundongos hu-CD34 NSG™ enxertados com células CD34+ de dois doadores. Os camundongos foram alojados em gaiolas de polisulfona ventiladas individualmente com ar filtrado com filtro HEPA a uma densidade de até 5 camundongos por gaiola. A sala dos animais era totalmente iluminada com iluminação artificial fluorescente, com um ciclo controlado de 12 horas de luz/ escuridão (das 6h às 18h). A temperatura normal e as faixas de umidade relativa do ar nos quartos dos animais eram de 22-26°C e 30-70%, respectivamente. As salas dos animais foram ajustadas para ter até 15 trocas de ar por hora. Água da torneira filtrada, acidificada até um pH de 2,5 a 3,0, e comida padrão para roedores foram fornecidas à vontade.

Métodos e Registros

[0277] Trinta e oito (38) camundongos hu-CD34 NSG™ de dois doadores individuais receberam o implante de células MDA-MB-231 a 5x106 em uma mistura de 1: 1 com Matrigel no panículo adiposo mamário. Os pesos corporais e as observações clínicas foram registrados 1x-2x por semana após o implante e as medições do paquímetro digital foram usadas para determinar o volume tumoral, 2x por semana, depois que os tumores se tornaram palpáveis. Os camundongos foram randomizados com base nos volumes tumorais quando os volumes atingiram ~ 62-98 mm3 e administrados de acordo com a Tabela 7 a partir do dia 0. Os pesos corporais, observações clínicas e as medições dos paquímetros digitais foram registrados 2x por semana após o início da administração. Os animais que atingiram uma pontuação de condição corporal < 2, uma perda de peso corporal > 20% ou um volume tumoral > 2000 mm3 foram sacrificados antes do término do estudo. Animais com tumores ulcerados também foram sacrificados antes do término do estudo. Todos os animais restantes foram sacrificados por asfixia com CO2 no Dia de Estudo 41.Tabela 7. Desenho do Experimento

Resultados

[0278] Os resultados do estudo encontram-se resumidos na Figura 29 e Figura 30. Os resultados indicam que o anticorpo B60-55-1 apresenta eficácia comparável à do Pembrolizumab no modelo de xenoenxerto para câncer de mama usado no estudo.

[0279] Tecentriq é uma marca registrada da Genentech USA, Inc.

[0280] Embora as formas de realização específicas da presente invenção tenham sido descritas em detalhes neste documento, os técnicos no assunto compreenderão que é possível realizar várias modificações e substituições dos aspectos mais detalhados com base nas diretrizes e ensinamentos já publicados; e as ditas alterações encontram-se todas dentro do escopo da presente invenção. O escopo completo da invenção é dado pelas reivindicações anexas e por qualquer documentação equivalente.

Claims (5)

1. Anticorpo anti-PD-L1 CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 ou uma variante do mesmo, em que a variante tem os aminoácidos 1 a 449 da SEQ ID NO: 85, e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87.

2. Molécula de ácido nucleico CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos capaz de codificar o anticorpo anti- PD-L1, como definido na reivindicação 1, e em que a referida molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 86 e SEQ ID NO: 88.

3. Célula hospedeira de levedura CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 2.

4. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo anti-PD-L1, como definido na reivindicação 1, e um excipiente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável; e que, opcionalmente, compreende cerca de 275 mM de serina, cerca de 10 mM de histidina, tendo um pH de cerca de 5,9; ou que compreende cerca de 0,05% de polissorbato 80, cerca de 1% de D- manitol, cerca de 120 mM de L-prolina, cerca de 100 mM de L-serina, cerca de 10 mM de L-histidina-HCl, tendo pH de cerca de 5,8.

5. Uso do anticorpo anti-PD-L1, como definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada à modulação da atividade da PD-L1 humana, em que a referida doença é um câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer colorretal, melanomas, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de fígado, linfomas, neoplasias hematológicas, câncer de cabeça e pescoço, gliomas, câncer gástrico, câncer nasofaríngeo, câncer laríngeo, câncer cervical, câncer uterino ou osteossarcomas; ou em que a referida doença é uma infecção por HBV, HCV ou HIV.

Images