JP2024513700A - 抗ワクシニアウイルス抗原抗体並びに関連する組成物及び方法 - Google Patents

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クオ―シャン リン、
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Abstract

ワクシニアウイルスＢ５抗原（ＶＶ Ｂ５）に特異的に結合する抗体が提供される。特定の実施形態では、抗ＶＶ Ｂ５抗体はヒト化抗体である。このような抗体を含む融合タンパク質及びコンジュゲートもまた提供される。本開示の抗体、融合タンパク質及びコンジュゲートを含む医薬組成物も提供され、例えば、治療、インビボイメージングなどのためにそのような組成物を使用する方法も提供される。特定の態様では、本開示の抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを個体に投与することを含み、当該個体が、ＶＶに感染した細胞を含み、当該抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートが、感染した細胞の表面上に発現するＶＶ Ｂ５抗原によって、感染した細胞に標的化される、方法が提供される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年６月１日に出願された米国仮特許出願第６３／１９５，５３６号、及び２０２１年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／１６２，１９９号の利益を主張するものであり、これらの出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
序論
免疫療法は、複数の悪性腫瘍に対する効果的な治療選択肢となっている。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、腫瘍組織内で選択的に複製して溶解すると同時に、正常な非腫瘍性宿主細胞を温存し、同時に抗腫瘍免疫を回復するように設計することができ、腫瘍治療のための次世代免疫療法アプローチを構成する。特定の抗原発現パターンに依存せずに悪性腫瘍を標的とするＯＶの独自の能力により、ＯＶは他の免疫療法アプローチの魅力的な代替手段となる。さらに、ＯＶは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の動員を促進し、免疫抑制性腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を再プログラムし、全身の抗腫瘍免疫を高めることができる。
遺伝子工学により、生きた複製ウイルスの設計は、細胞侵入及び転写標的化を通じて高度に腫瘍選択的であるだけでなく、ウイルス療法の薬物動態の非侵襲的監視のため、及び細胞傷害性活性若しくは免疫原性細胞死、又は免疫モジュレーターの増強のためのレポーター遺伝子を装備することが可能になった。臨床開発中のＯＶとしては、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ラブドウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス（ＶＶ）、ヘルペスウイルス、コクサッキーウイルス、レオウイルス、及びレトロウイルスが挙げられる。
ワクシニアウイルス（ＶＶ）は、長さが約１９０ｋｂの線形ゲノムを有する大きいエンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスの弱毒化又は腫瘍特異的標的化は、種々の欠失及び挿入変異を使用して達成されており、チミジンキナーゼ機能の喪失が臨床腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに共通する特徴である。ＪＸ－５９４はウイルスチミジンキナーゼを欠失し、ＴＧ６００２はチミジンキナーゼ及びウイルスリボヌクレオチドレダクターゼを二重欠失し、ＧＬ－ＯＮＣ１はそのチミジンキナーゼ（Ｊ２Ｒ）、血球凝集素ＨＡ（Ａ５６Ｒ）及びＦ１４．５Ｌ遺伝子に挿入変異を有する。ＴＫの機能喪失は、非分裂細胞中で複製するウイルスの能力を制限し、ウイルスリボヌクレオチドレダクターゼの欠失がこの能力をさらに制限する。腫瘍溶解効果を増強するように設計された２つの臨床ワクシニアベクターには、腫瘍細胞の殺滅を改善するように設計された導入遺伝子が含まれる。ＪＸ－５９４にはＴ－ＶＥＣと同様にＧＭ－ＣＳＦが含まれ、ＴＧ６００２には、感染細胞において５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を５－ＦＵに変換するヌクレオシド類似体変換酵素ＦＣＵ１が組み込まれている。
ＯＶベースの療法の最近の進歩にもかかわらず、がんの治療、緩和、及び／又は予防のための、並びにがんを有する対象の生存を改善する方法のための、新しく改善されたＯＶベースの方法が依然として必要である。
ワクシニアウイルスＢ５抗原（ＶＶ Ｂ５）に特異的に結合する抗体が提供される。特定の実施形態では、抗ＶＶ Ｂ５抗体はヒト化抗体である。このような抗体を含む融合タンパク質及びコンジュゲートもまた提供される。本開示の抗体、融合タンパク質及びコンジュゲートを含む医薬組成物も提供され、例えば、治療、インビボイメージングなどのためにそのような組成物を使用する方法も提供される。特定の態様では、本開示の抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを個体に投与することを含み、当該個体が、ＶＶに感染した細胞を含み、当該抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートが、感染した細胞の表面上に発現するＶＶ Ｂ５抗原によって、感染した細胞に標的化される、方法が提供される。
ＶＶ Ｂ５タンパク質へのヒト化抗体の結合を示す。抗体を、ＶＶ Ｂ５単量体タンパク質への結合についてＥＬＩＳＡによって評価した。ヒト化抗Ｂ５ ｈＩｇＧ１抗体を滴定したところ、Ａ０４８親陽性対照と比較して同程度のｐＭのＥＣ５０を示した。ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照では結合は観察されなかった。 ＶＶ感染細胞へのヒト化抗体の結合を示す。フローサイトメトリーによってＶＶ感染細胞への結合について抗体を評価した。ＨＴ２９細胞をＶＶｄｄｅＧＦＰウエスタンリザーブウイルス（「ＷＲ」）又はＶＶコペンハーゲン（ＹＦＰ）ウイルス（「Ｃｏｐ」）に感染させ、ＳＫＯＶ３細胞をＶＶｄｄｅＧＦＰウエスタンリザーブウイルス（「ＷＲ」）に感染させた。ヒト化抗Ｂ５ ｈＩｇＧ１抗体を滴定したところ、Ａ０４８親抗Ｂ５ ｈＩｇＧ１（陽性対照）と比較して同程度のｎＭのＥＣ５０を示した。陰性対照はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照であった。 ＶＶ感染細胞へのヒト化抗体の結合を示す。フローサイトメトリーによってＶＶ感染細胞への結合について抗体を評価した。ＨＴ２９細胞をＶＶｄｄｅＧＦＰウエスタンリザーブウイルス（「ＷＲ」）又はＶＶコペンハーゲン（ＹＦＰ）ウイルス（「Ｃｏｐ」）に感染させ、ＳＫＯＶ３細胞をＶＶｄｄｅＧＦＰウエスタンリザーブウイルス（「ＷＲ」）に感染させた。ヒト化抗Ｂ５ ｈＩｇＧ１抗体を滴定したところ、Ａ０４８親抗Ｂ５ ｈＩｇＧ１（陽性対照）と比較して同程度のｎＭのＥＣ５０を示した。陰性対照はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照であった。 ワクシニアウイルスに感染した異なる細胞株に対するヒト化抗体の経時的な結合レベルを示す。ＨＴ２９（Ａ）、ＳＫＯＶ３（Ｂ）、及びＯＶＣＡＲ３（Ｃ）細胞を、ワクシニアウイルス株ＶＶｄｄｅＧＦＰウエスタンリザーブ（「ＷＲ」）若しくはＶＶコペンハーゲン（ＹＦＰ）ウイルス（「Ｃｏｐ」）に、１若しくは０．１のＭＯＩで感染させたか、又はモック感染させた。示された時点で細胞を回収して、感染細胞におけるＡ０４８－Ｈ１Ｌ４及びＡ０４８－Ｈ３Ｌ２結合レベルを決定した。一次抗体をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７に結合させた。データをＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０によって取得し、ＦｌｏｗＪｏ １０．８．１ソフトウェアによって分析した。データは生物学的に３回繰り返したものを表す。ＭＯＩ、感染多重度。 ワクシニアウイルスに感染した異なる細胞株に対するヒト化抗体の経時的な結合レベルを示す。ＨＴ２９（Ａ）、ＳＫＯＶ３（Ｂ）、及びＯＶＣＡＲ３（Ｃ）細胞を、ワクシニアウイルス株ＶＶｄｄｅＧＦＰウエスタンリザーブ（「ＷＲ」）若しくはＶＶコペンハーゲン（ＹＦＰ）ウイルス（「Ｃｏｐ」）に、１若しくは０．１のＭＯＩで感染させたか、又はモック感染させた。示された時点で細胞を回収して、感染細胞におけるＡ０４８－Ｈ１Ｌ４及びＡ０４８－Ｈ３Ｌ２結合レベルを決定した。一次抗体をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７に結合させた。データをＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０によって取得し、ＦｌｏｗＪｏ １０．８．１ソフトウェアによって分析した。データは生物学的に３回繰り返したものを表す。ＭＯＩ、感染多重度。 ヒト化Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物の設計の概略図を示す（図４Ａ）。レンチウイルス形質導入及び初代ヒトＴ細胞の増殖後のヒト化ｓｃＦｖ ＣＡＲ検出を示すフローサイトメトリーデータ（図４Ｂ）。標的を発現しているＨＴ－２９－Ｂ５、ＳＫＯＶ３－Ｂ５、及びＨＥＫ２９３Ｔ－Ｂ５株と共培養したときの、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現するヒトＴ細胞の特異的活性化（図４Ｃ）。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞は、標的Ｂ５発現腫瘍株との共培養後に、ＣＤ１３７の上方制御を示した。ＷＴ標的細胞株と共に観察された最小限の交差反応性。 ヒト化Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物の設計の概略図を示す（図４Ａ）。レンチウイルス形質導入及び初代ヒトＴ細胞の増殖後のヒト化ｓｃＦｖ ＣＡＲ検出を示すフローサイトメトリーデータ（図４Ｂ）。標的を発現しているＨＴ－２９－Ｂ５、ＳＫＯＶ３－Ｂ５、及びＨＥＫ２９３Ｔ－Ｂ５株と共培養したときの、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現するヒトＴ細胞の特異的活性化（図４Ｃ）。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞は、標的Ｂ５発現腫瘍株との共培養後に、ＣＤ１３７の上方制御を示した。ＷＴ標的細胞株と共に観察された最小限の交差反応性。 Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現するヒトＴ細胞が、高い割合の特異的細胞傷害性を示したことを実証するデータを示す（図５Ａ）。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞は、相対発光単位（ＲＬＵ）の減少割合によって決定されるように、２４時間で特異的な細胞溶解を示した。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞が、標的Ｂ５発現腫瘍株との共培養の２４時間後に直接的な腫瘍殺滅の形態学的徴候を示したことを実証するデータ（図５Ｂ）。 Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現するヒトＴ細胞が、高い割合の特異的細胞傷害性を示したことを実証するデータを示す（図５Ａ）。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞は、相対発光単位（ＲＬＵ）の減少割合によって決定されるように、２４時間で特異的な細胞溶解を示した。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞が、標的Ｂ５発現腫瘍株との共培養の２４時間後に直接的な腫瘍殺滅の形態学的徴候を示したことを実証するデータ（図５Ｂ）。 Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現するヒトＴ細胞が、ワクシニアウイルス感染標的細胞株に対して高い割合の特異的細胞傷害性を示したことを実証するデータを示す。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞は、ワクシニアウイルス感染標的細胞に対する相対発光単位（ＲＬＵ）の減少割合によって決定されるように、２４時間で特異的細胞溶解を示した（図６Ａ）。図６Ａにおいて、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０、Ｂ５－ＣＡＲ－０５１及び親Ｂ５－ＣＡＲ－０４３は、それぞれＶＶ５０＿Ｂ５、ＶＶ５１＿Ｂ５及びＶＶ４３＿Ｂ５＿ｔＥＧＦＲとして同定される。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞が、ワクシニアウイルス感染腫瘍株との共培養の２４時間後に直接的な腫瘍殺滅の形態学的徴候を示したことを実証するデータ（図６Ｂ～図６Ｄ）。 Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現するヒトＴ細胞が、ワクシニアウイルス感染標的細胞株に対して高い割合の特異的細胞傷害性を示したことを実証するデータを示す。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞は、ワクシニアウイルス感染標的細胞に対する相対発光単位（ＲＬＵ）の減少割合によって決定されるように、２４時間で特異的細胞溶解を示した（図６Ａ）。図６Ａにおいて、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０、Ｂ５－ＣＡＲ－０５１及び親Ｂ５－ＣＡＲ－０４３は、それぞれＶＶ５０＿Ｂ５、ＶＶ５１＿Ｂ５及びＶＶ４３＿Ｂ５＿ｔＥＧＦＲとして同定される。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞が、ワクシニアウイルス感染腫瘍株との共培養の２４時間後に直接的な腫瘍殺滅の形態学的徴候を示したことを実証するデータ（図６Ｂ～図６Ｄ）。 Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現するヒトＴ細胞が、ワクシニアウイルス感染標的細胞株に対して高い割合の特異的細胞傷害性を示したことを実証するデータを示す。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞は、ワクシニアウイルス感染標的細胞に対する相対発光単位（ＲＬＵ）の減少割合によって決定されるように、２４時間で特異的細胞溶解を示した（図６Ａ）。図６Ａにおいて、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０、Ｂ５－ＣＡＲ－０５１及び親Ｂ５－ＣＡＲ－０４３は、それぞれＶＶ５０＿Ｂ５、ＶＶ５１＿Ｂ５及びＶＶ４３＿Ｂ５＿ｔＥＧＦＲとして同定される。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞が、ワクシニアウイルス感染腫瘍株との共培養の２４時間後に直接的な腫瘍殺滅の形態学的徴候を示したことを実証するデータ（図６Ｂ～図６Ｄ）。 Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現するヒトＴ細胞が、ワクシニアウイルス感染標的細胞株に対して高い割合の特異的細胞傷害性を示したことを実証するデータを示す。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞は、ワクシニアウイルス感染標的細胞に対する相対発光単位（ＲＬＵ）の減少割合によって決定されるように、２４時間で特異的細胞溶解を示した（図６Ａ）。図６Ａにおいて、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０、Ｂ５－ＣＡＲ－０５１及び親Ｂ５－ＣＡＲ－０４３は、それぞれＶＶ５０＿Ｂ５、ＶＶ５１＿Ｂ５及びＶＶ４３＿Ｂ５＿ｔＥＧＦＲとして同定される。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現する初代ヒトＴ細胞が、ワクシニアウイルス感染腫瘍株との共培養の２４時間後に直接的な腫瘍殺滅の形態学的徴候を示したことを実証するデータ（図６Ｂ～図６Ｄ）。 ヒト化Ｂ５－ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞が、異種移植腫瘍モデルを処置するために使用されるワクシニアウイルスと組み合わせて投与された場合に腫瘍増殖の減少をもたらすことを実証する予測データを示す（図７Ａ）。ヒト化Ｂ５－ＣＡＲとワクシニアウイルスとの併用療法の全生存期間の改善を実証する予測データ（図７Ｂ）。
本開示の抗体、組成物、及び方法をより詳細に記載する前に、抗体、組成物、及び方法は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、当然ながら変化し得ることを理解されたい。抗体、組成物、及び方法の範囲は添付の「特許請求の範囲」によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値は、文脈が別途明確に指示しない限り、下限の単位の１０分の１まで、抗体、組成物、及び方法内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従って、抗体、組成物、及び方法内にも包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も、抗体、組成物、及び方法に含まれる。
ある特定の範囲は、「約」という用語が先行する数値で本明細書に提示される。「約」という用語は、本明細書では、それが先行する正確な数、並びにその用語が先行する数に近いか又は近似している数に対する文字通りの裏付けを提供するために使用される。ある数が具体的に列挙された数に近いか、又は近似しているかどうかを決定する際に、その近いか、又は近似している列挙されていない数は、それが提示されている文脈において、具体的に列挙された数の実質的な等価物を提供する数であり得る。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、抗体、組成物、及び方法が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の抗体、組成物、及び方法もまた、抗体、組成物、及び方法の実施又は試験において使用することができるが、代表的な例示的な抗体、組成物、及び方法がここに記載される。
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が具体的かつ個々に参照により組み込まれることが示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されている材料及び／又は方法を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日より前のその開示のためであり、提供される刊行物の日付が、独立して確認される必要があり得る実際の公開日とは異なり得るので、本発明の抗体、組成物、及び方法がこのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように作成され得ることに更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して「単独で（solely）」、「のみ（only）」などの排他的用語の使用、又は「否定的」限定の使用のための先行詞としての役割を果たすことが意図される。
また、明確にするために、別個の実施形態の文脈において記載される抗体、組成物、及び方法のある特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈において記載される抗体、組成物、及び方法の様々な特徴はまた、別個に又は任意の好適な部分的組み合わせで提供されてもよい。実施形態の全ての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、このような組み合わせが実施可能なプロセス及び／又は組成物を包含する程度まで、ありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、このような変数を記載する実施形態において列挙される全ての部分的組み合わせもまた、本発明の抗体、組成物、及び方法によって具体的に包含され、ありとあらゆるこのような部分的組み合わせが、個々にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
本開示を読んだ後に当業者に明らかになるように、本明細書に記載及び例証される個々の実施形態は各々、本方法の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に分離され得るか、又はそれらと組み合わせられ得る別個の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。
抗ＶＶ Ｂ５抗体
本開示の態様は、ワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｂ５抗原（ＶＶ Ｂ５）に特異的に結合する抗体を含む。特定の実施形態では、抗体は、ＶＶ Ｂ５に特異的に結合するヒト化抗体である。ワクシニアウイルスは、ウイルスが宿主細胞機構から独立して複製することを可能にする多数のウイルス酵素及び因子をコードする約１９２ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを特徴とするポックスウイルスファミリーのメンバーである。ＶＶは、最大２５ｋｂのクローニングされた外因性ＤＮＡを安定して収容することができる。構造的に、ＶＶは、ウイルスＤＮＡと、リポタンパク質コア膜に包まれたＲＮＡポリメラーゼ及びポリＡポリメラーゼなどの様々なウイルス酵素と、で構成されるコア領域から構成される。ウイルスの外層は、二重脂質膜エンベロープから構成される。ＶＶには、腫瘍の自然向性、強力な溶解能力、細胞から細胞への急速な拡散を伴う短いライフサイクル、効率的な遺伝子発現、及び大きいクローニング能力など、ＶＶを腫瘍溶解性ウイルス療法での使用に適するようにする固有の特徴がある。ＶＶは、ゲノム統合のリスクを排除する細胞質で発生する約８時間の短いライフサイクルを有する。複製は通常、感染から約２時間後に始まり、その時点で宿主細胞の核酸合成が停止し、細胞資源がウイルス複製に向けられる。細胞溶解は１２時間～４８時間の間に起こり、パッケージ化されたウイルス粒子を放出する。ＶＶは、ｍＲＮＡ転写の宿主メカニズムに依存しないため、宿主細胞の生物学的変化の影響を受けにくくなる。他の腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）とは異なり、ＶＶは細胞侵入に特定の表面受容体を必要としないため、広範囲の細胞に感染することが可能になる。
ＶＶ Ｂ５タンパク質は、補体制御タンパク質に特徴的な４つの短いコンセンサスリピート（ＳＣＲ）で構成される細胞外ドメインを有する４２ｋＤａのＩ型膜貫通型糖タンパク質である。ＳＣＲの後、Ｂ５は膜貫通ドメインの前にストーク領域と、短い細胞質尾部（ＣＴ）と、を有する。ＳＣＲとＣＴはいずれも、Ｂ５を細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）膜に標的化するために不可欠であるが、後者は細胞表面へのその輸送及びエンドソームを介したリサイクルに影響を与える。Ｂ５は、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）のラッピングが細胞内エンベロープウイルス（ＩＥＶ）を形成するのに必要である。
「抗体」（更に、互換的に「免疫グロブリン」と共に使用される）という用語は、ポリクローナル（例えば、ウサギポリクローナル）及びモノクローナル抗体調製物を包含し、このとき抗体は、任意のアイソタイプの抗体又は免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）、全抗体（例えば、四量体から構成され、次いで、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの２つの二量体から構成される抗体）、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、（ｓｃＦｖ’）２、及び二重特異性抗体を含むがこれらに限定されない、化合物への特異的結合を保持する抗体の断片（例えば、全抗体又は単鎖抗体の断片）、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、並びに、抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、Ｆｖ、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦ（ａｂ’）から選択される。抗体は、特異的結合対の要素、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対の要素）などの他の部分に更にコンジュゲートされ得る。
免疫グロブリンのポリペプチドには、カッパ及びラムダの軽鎖、並びにアルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン及びミューの重鎖、又は他の種における等価物が含まれる。完全長の免疫グロブリン「軽鎖」（通常、約２５ｋＤａ又は約２１４アミノ酸の）は、ＮＨ２末端における約１１０アミノ酸の可変領域、及びＣＯＯＨ末端におけるカッパ又はラムダの定常領域を含む。完全長の免疫グロブリン「重鎖」（約１５０ｋＤａ又は約４４６アミノ酸の）は、同様に可変領域（約１１６アミノ酸の）及び前述の重鎖定常領域のうちの１つ、例えば、ガンマ（約３３０アミノ酸の）を含む。
免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変領域（それぞれＶＬ及びＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域（ＦＲ）で構成される。フレームワーク領域とＣＤＲの範囲が定義されている（Ｅ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９８７）；及びＬｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＩＭＧＴ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００５，３３，Ｄ５９３－Ｄ５９７））。異なる軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成要素である軽鎖及び重鎖の組み合わされたフレームワーク領域は、ＣＤＲを位置付け、整列させる働きをする。ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合を主に担う。本開示によって提供される抗体のＣＤＲは、特に明記しない限り、上記のＫａｂａｔに従って定義される。
したがって、「抗体」は、例えば、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片によって遺伝的にコード可能な１つ以上のポリペプチドを有するタンパク質を包含する。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパ又はラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンとして分類され、順にそれぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを定義する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体などのＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＦｃドメインを含む。
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０個以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖及び重鎖を指す。
抗体は、完全免疫グロブリン、及び様々なペプチダーゼで消化することによって遺伝的にコード又は産生される可能性のある、十分に特徴付けられた多数の断片を包含する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域内のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２（それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ－ＣＨＩに結合した軽鎖であるＦａｂの二量体）を産生する。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を切断し、それによって（Ｆａｂ’）２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は、本質的にヒンジ領域の一部を備えるＦａｂである（他の抗体断片のより詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。完全抗体の消化に関して様々な抗体断片が定義されているが、当業者は、そのようなＦａｂ’断片は、化学的に又は組換えＤＮＡ方法論を利用することによって新たに合成され得ることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用される場合、抗体という用語は、全抗体の改変によって産生されるか、又はＦａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ユニボディ、及びダイアボディを含むがこれらに限定されない、組換えＤＮＡ方法論を使用して新たに合成される抗体断片も含む。特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ、Ｆｖ、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦａｂ’から選択される。
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、モノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、微量で存在し得る天然に存在する変異を除いて個々の抗体が同一である集団から得られる１つ以上の抗体を含む組成物を指す。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して、一般的には抗原上の単一のエピトープに対して向けられている。改変因子「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるものとしての抗体の性質を示し、抗体が任意の特定の方法によって産生されること、又は組成物中の唯一の抗体であることを必要としない。
上記で要約したように、いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体はヒト化抗体である。特定の実施形態では、その開示が、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＣＡ２０２／０５１２３０号（国際公開第２０２１／０４６６５３号）に記載されているＡ０４８と称される親ウサギ抗体のヒト化バージョンである抗体が提供される。例えば、Ａ０４８抗体のＶＨに対してヒト化されているＶＨ、Ａ０４８抗体のＶＬに対してヒト化されているＶＬ、又はその両方を含む抗体が、本明細書において提供される。
本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体は、非ヒト（例えば、ウサギ、齧歯類など）抗体に由来し、ヒト抗体のフレームワーク及び／又は定常領域の少なくとも一部分を含有するように改変された組換えポリペプチドである。ヒト化抗体はまた、様々な領域が異なる種に由来し得るキメラ抗体及びＣＤＲグラフト化抗体を包含する。キメラ抗体は、ヒト定常領域（例えば、ヒトＦｃドメイン）に連結された任意の供給源からの可変領域を含む抗体であり得る。したがって、キメラ抗体では、可変領域は非ヒトであり得、定常領域はヒトである。ＣＤＲグラフト化抗体は、ヒト「レシピエント」抗体のフレームワーク領域に連結された非ヒト「ドナー」抗体からのＣＤＲを含む抗体である。例えば、ｓｃＦＶの形態である本開示の抗体は、ヒト定常領域（例えば、Ｆｃドメイン）に連結して、ヒト免疫グロブリンにしてもよい。
一般に、ヒト化抗体は、同じ抗体の非ヒト化バージョンと比較して、ヒト宿主において免疫応答を低下させる（低下した免疫原性を呈する）。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフト化、ベニヤリング又は表面再生、及び鎖シャッフリングなどを含む種々の技術を使用してヒト化することができる。特定の実施形態では、フレームワーク置換は、ＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって特定され、抗原結合及び配列比較に重要なフレームワーク残基を特定し、異常フレームワー残基を特定の位置で特定する。
ウサギ又はマウスＣＤＲをヒト可変ドメインフレームワークに置き換えると、それらの正しい空間的配向を保持することができ、例えば、ヒト可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲが由来するウサギ又はマウス可変フレームワークと同じ又は類似の立体構造を採用する。これは、そのフレームワーク配列が、ＣＤＲが由来するウサギ又はマウス可変フレームワークドメインと高度の配列同一性を示すヒト抗体からヒト可変ドメインを取得することによって達成することができる。重鎖及び軽鎖の可変フレームワーク領域は、同じ又は異なるヒト抗体配列に由来することができる。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であり得るか、又はいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であり得る。
ウサギ又はマウスドナー免疫グロブリン及び適切なヒトアクセプター免疫グロブリンの相補性決定領域を同定したら、次のステップは、もしあるとすれば、これらの成分のどの残基を置換して、得られるヒト化抗体の特性を最適化するかを決定することである。一般に、ヒトアミノ酸残基のウサギ又はマウスによる置換は最小限に抑える必要があり、これは、ウサギ又はマウス残基の導入により、抗体がヒトにおいてヒト抗ウサギ抗体（ＨＡＲＡ）又はヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発するリスクが高まるためである。免疫応答を決定する技術的に認められた方法は、特定の患者又は臨床試験中にＨＡＲＡ又はＨＡＭＡ応答を監視するために実行することができる。ヒト化抗体を投与された患者は、当該療法の投与の開始時及び投与全体を通して免疫原性評価を与えることができる。ＨＡＲＡ又はＨＡＭＡ応答は、例えば、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）及び／又は固相ＥＬＩＳＡ分析を含む当業者に知られている方法を使用して、患者からの血清試料中のヒト化治療試薬に対する抗体を検出することによって測定される。多くの実施形態では、対象ヒト化抗体は、ヒト対象においてＨＡＲＡ応答を実質的に誘発しない。
ヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸は、ＣＤＲ立体構造及び／又は抗原への結合に対するそれらの起こり得る影響に基づいて置換のために選択される。ウサギ又はマウスＣＤＲ領域とヒト可変フレームワーク領域の不自然な並置は、不自然な立体構造拘束をもたらす可能性があり、特定のアミノ酸残基の置換によって修正されない限り、結合親和性の喪失につながる。置換のためのアミノ酸残基の選択は、部分的に、コンピュータモデリングによって決定することができる。免疫グロブリン分子の三次元画像を生成するためのコンピュータハードウェア及びソフトウェアは、当該技術分野で知られている。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖又はそのドメインの解決された構造から開始して作成される。モデル化される鎖は、解決された三次元構造の鎖又はドメインとのアミノ酸配列類似性について比較され、最大の配列類似性を示す鎖又はドメインが、分子モデルの構築の開始点として選択される。少なくとも５０％の配列同一性を共有する鎖又はドメインがモデリングのために選択され、好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％以上の配列同一性を共有するものがモデリングのために選択される。解決された開始構造は、免疫グロブリン鎖又はモデル化されたドメインの実際のアミノ酸と開始構造のアミノ酸との違いを許容するように変更される。次に、修飾された構造が複合免疫グロブリンに組み立てられる。最後に、エネルギー最小化、及びすべての原子が互いに適切な距離内にあり、結合長と角度とが化学的に許容できる範囲内にあることを確認することにより、モデルが改良される。
例えば、Ｋａｂａｔによって定義されるフレームワーク残基が、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義される構造ループ残基を構成する場合、ウサギ又はマウス抗体に存在するアミノ酸を、ヒト化抗体への置換のために選択することができる。「ＣＤＲ領域に隣接する」残基には、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列中のＣＤＲのうちの１つ以上に直接隣接する位置、例えば、Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲ、又は、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義されるＣＤＲ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ ＪＭＢ １９６：９０１（１９８７）を参照されたい）に直接隣接する位置にあるアミノ酸残基が含まれる。これらのアミノ酸は、特にＣＤＲ内のアミノ酸と特に相互作用し、アクセプターから選択された場合、ドナーＣＤＲを歪め、親和性を減少させる可能性がある。さらに、隣接するアミノ酸は抗原と直接相互作用する可能性があり（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７（１９８６））、ドナーからこれらのアミノ酸を選択することは、元の抗体の親和性を提供するすべての抗原接触を維持するために望ましい場合がある。本明細書に記載の抗体のうちのいずれかをヒト化するために用いることができるアプローチとしては、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｄ．＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｈｕｍａｎｉｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ＣＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３１９－３３９（２０１０）ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－３－６４２－０１１４４－３＿２１、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｔ．，Ｉｇａｗａ，Ｔ．，Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｈ．＆ Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｋ．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０６０，１２３－３７（２０１４）、Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．，Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｃ．，Ｂｕｓｓ，Ｔ．Ｎ．，Ｔａｎ，Ｐ．＆ Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．Ｕｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ａ ＣＤＲ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，３５－４２（２００５）、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８，１３５－５９（２００４）、及びＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．Ｐ．，Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ，Ｆ．，Ｇｉｎｅｓｔｏｕｘ，Ｃ．，Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．＆ Ｄｕｒｏｕｘ，Ｐ．Ｕｓｅ ｏｆ ＩＭＧＴ（登録商標）ｄａｔａｂａｓｅｓ ａｎｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９０７，３－３７（２０１２）、に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されず、これらの開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の抗体は、ＶＶ Ｂ５抗原に特異的に結合する。抗体は、他の物質、例えば試料に結合するよりも、より高い親和性、結合力で、より容易に、及び／又はより長い持続時間で結合する場合、標的に「特異的に結合する」又は「優先的に結合する」。特定の実施形態では、抗体は、例えば、約１０４Ｍ－１以上の親和性又はＫａ（すなわち、１／Ｍの単位による特定の結合相互作用の平衡会合定数）で抗原に結合又は会合する場合、抗原と「特異的に結合」する。あるいは、親和性は、Ｍの単位で特定の結合相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）（例えば、１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ、又はそれ未満）として定義され得る。特定の態様では、特異的結合は、抗体が、約１０－５Ｍ以下、約１０－６Ｍ以下、約１０－７Ｍ以下、約１０－８Ｍ以下、又は約１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、若しくは１０－１２Ｍ以下のＫＤで抗原に結合することを意味する。抗原に対する抗体の結合親和性は、従来の技術を使用して、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、平衡透析によって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、製造業者によって概説された一般的な手順を使用するＢＩＡｃｏｒｅ ２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器）を使用することによって、ラジオイムノアッセイなどによって容易に決定することができる。
いくつかの実施形態によれば、ＶＶ Ｂ５抗原への結合について、本明細書の他の箇所に記載される抗体（非ヒト化又はヒト化）のいずれかと競合する抗体（非ヒト化又はヒト化）が提供される。本開示の抗体が、抗原に結合するために二次抗体と「競合する」かどうかは、当該技術分野で知られている競合結合アッセイを使用して容易に決定することができる。競合する抗体は、例えば、抗体競合アッセイを介して特定することができる。例えば、一次抗体の試料を固体支持体に結合させることができる。次に、そのような一次抗体と競合することができると疑われる二次抗体の試料を加える。２つの抗体のうちの１つを標識する。標識抗体と非標識抗体が抗原上の別々かつ別個の部位に結合する場合、競合すると疑われる抗体が存在するかどうかに関係なく、標識抗体は同じレベルに結合する。しかしながら、相互作用の部位が同一又は重複している場合、非標識抗体が競合し、抗原に結合する標識抗体の量が低下する。非標識抗体が過剰に存在する場合、標識抗体は、たとえあったとしてもごくわずかしか結合しない。
本開示の目的のために、競合する抗体は、抗原への抗体の結合を約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、又は約９９％以上減少させるものである。このような競合アッセイを実施するための手順の詳細は知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８，５６７－５６９，１９８８，ＩＳＢＮ ０－８７９６９－３１４－２に見出すことができる。このようなアッセイは、精製された抗体を使用して定量的に行うことができる。標準曲線は、１つの抗体をそれ自体に対して滴定することによって確立され得る。つまり、同じ抗体がラベルと競合物の両方に使用される。プレートへの標識抗体の結合を阻害する非標識競合抗体の能力を滴定することができる。結果をプロットし、所望の程度の結合阻害を達成するために必要な濃度を比較することができる。
特定の実施形態では、本開示の抗体は、国際出願第ＣＡ２０２／０５１２３０号に記載されているＡ０４８と称される親ウサギ抗体のヒト化バージョンである。親Ａ０４８抗体のＶＨ及びＶＬポリペプチドのアミノ酸配列、並びにそのようなＶＨ及びＶＬポリペプチドのヒト化バージョンの非限定的な例（Ａ０４８－Ｈ１～Ｈ５及びＡ０４８－Ｌ１～Ｌ５と称する）を、以下の表１に提供する（ＣＤＲに下線を付す）。
Figure 2024513700000002
Figure 2024513700000003
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、表１に示される可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド及び表１に示される可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドの任意の所望の組み合わせを含む。例として、本開示の抗体は、Ａ０４８－Ｈ１ ＶＨと、Ａ０４８－Ｌ１ ＶＬ、Ａ０４８－Ｌ２ ＶＬ、Ａ０４８－Ｌ３ ＶＬ、Ａ０４８－Ｌ４ ＶＬ、又はＡ０４８－Ｌ５ ＶＬのいずれかとの対を含み得る。そのような抗体は、それぞれ、Ａ０４８－Ｈ１Ｌ１、Ａ０４８－Ｈ１Ｌ２、Ａ０４８－Ｈ１Ｌ３、Ａ０４８－Ｈ１Ｌ４、又はＡ０４８－Ｈ１Ｌ５と称され得る。更に例として、本開示の抗体は、Ａ０４８－Ｈ２ ＶＨと、Ａ０４８－Ｌ１ ＶＬ、Ａ０４８－Ｌ２ ＶＬ、Ａ０４８－Ｌ３ ＶＬ、Ａ０４８－Ｌ４ ＶＬ、又はＡ０４８－Ｌ５ ＶＬのいずれかとの対を含み得る。そのような抗体は、それぞれ、Ａ０４８－Ｈ２Ｌ１、Ａ０４８－Ｈ２Ｌ２、Ａ０４８－Ｈ２Ｌ３、Ａ０４８－Ｈ２Ｌ４、又はＡ０４８－Ｈ２Ｌ５と称され得る。理解されるように、本開示の抗体は、Ａ０４８－Ｈ１ ＶＨ～Ａ０４８－Ｈ５ ＶＨ及びＡ０４８－Ｌ１ ＶＬ～Ａ０４８－Ｌ５ ＶＬの任意の組み合わせを含み得る。
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ワクシニアウイルスＢ５抗原（ＶＶ Ｂ５）と特異的に結合し、この抗体は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドを含み、ＶＨポリペプチドは、
Ｑ１Ｅ、Ｅ２Ｖ、Ｑ３Ｔ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｇ９Ｐ、Ｇ１０Ｖ、Ｋ１３Ｑ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｇ１６Ｅ、Ｓ１７Ｔ、Ｔ１９Ｒ、Ｔ２１Ｓ、Ｔ２３Ａ、Ａ４１Ｐ、Ｒ４４Ｋ、Ｇ４５Ａ、Ｔ７４Ｄ、Ｓ７５Ｎ／Ｔ、Ｓ７６＿Ｔ７７ｉｎｓＫ、Ｔ７７Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｑ、Ｖ７９Ｌ、Ｔ８０Ｙ／Ｖ、Ｑ８２Ｔ、Ｔ８４Ｎ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｌ８６Ｍ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８８Ｐ、Ａ８９Ｅ／Ｖ、Ｔ９３Ｖ、Ｆ９５Ｙ、Ｐ１１２Ｑ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の突然変異であって、ナンバリングは配列番号１に従う、突然変異と、
アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号１３）を含むＶＨ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡ（Ｎ／Ｄ）（Ｗ／Ｓ）（Ａ／Ｖ）ＫＧ（配列番号１４）を含むＶＨ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号１７）を含むＶＨ ＣＤＲ３と、を含む。
本明細書中で使用される場合、「突然変異」は、それぞれ、配列番号１及び配列番号７に示されるＡ０４８抗体の親ＶＨ及びＶＬポリペプチドに対するアミノ酸置換、１つ以上のアミノ酸の挿入、１つ以上のアミノ酸の欠失などを包含する。いくつかの実施形態によれば、そのような抗体のＶＨポリペプチドは、突然変異Ｅ２Ｖ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｒ４４Ｋ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８９Ｅ／Ｖ、及びＰ１１２Ｑのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む。例えば、そのような抗体のＶＨポリペプチドは、突然変異Ｅ２Ｖ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｒ４４Ｋ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８９Ｅ／Ｖ、Ｐ１１２Ｑの各々を含み得る。特定の実施形態では、Ｅ５Ｌ／Ｋ突然変異はＥ５Ｌであり、Ｅ１５Ｇ／Ｔ突然変異はＥ１５Ｇであり、Ｒ８５Ｓ／Ｎ突然変異はＲ８５Ｓであり、Ｔ８７Ｒ／Ｄ突然変異はＴ８７Ｒであり、かつ／又は、Ａ８９Ｅ／Ｖ突然変異はＡ８９Ｅである。いくつかの実施形態によれば、そのような抗体のＶＨポリペプチドは、突然変異Ｅ５Ｌ、Ｅ１５Ｇ、Ｒ８５Ｓ、Ｔ８７Ｒ、及びＡ８９Ｅを含む。特定の実施形態では、ＶＨポリペプチドは、突然変異Ｑ１Ｅ、Ｋ１３Ｑ、Ｔ１９Ｒ、Ｔ２１Ｓ、Ｔ２３Ａ、Ｔ８４Ｎ、Ｔ９３Ｖ、及びＦ９５Ｙのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む。いくつかの実施形態によれば、ＶＨポリペプチドは、突然変異Ｔ７４Ｄ、Ｓ７５Ｎ／Ｔ、Ｓ７６＿Ｔ７７ｉｎｓＫ、Ｔ７７Ｎ／Ｓ、Ｖ７９Ｌ、及びＴ８０Ｙ／Ｖのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む。本明細書で使用される場合、「Ｓ７６＿Ｔ７７ｉｎｓＫ」は、ＶＨポリペプチドが、親Ａ０４８ ＶＨと比較して、Ｓ７６とＴ７７との間にＫ（リジン残基）の挿入を含むことを意味する。特定の実施形態では、Ｔ７７Ｎ／Ｓ突然変異はＴ７７Ｎである。いくつかの実施形態によれば、Ｔ８０Ｙ／Ｖ突然変異はＴ８０Ｙである。いくつかの実施形態によれば、ＶＨポリペプチドは、アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）を含むＶＨ ＣＤＲ２を含む。
いくつかの実施形態によれば、そのような抗体のＶＨポリペプチドは、突然変異Ｑ３Ｔ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｇ９Ｐ、Ｇ１０Ｖ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｇ１６Ｅ、Ｓ１７Ｔ、Ａ４１Ｐ、Ｇ４５Ａ、Ｔ７４Ｄ、Ｓ７５Ｎ／Ｔ、Ｓ７６＿Ｔ７７ｉｎｓＫ、Ｔ７７Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｑ、Ｔ８０Ｙ／Ｖ、Ｑ８２Ｔ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｌ８６Ｍ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８８Ｐ及びＡ８９Ｅ／Ｖのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む。例えば、そのような抗体のＶＨポリペプチドは、突然変異Ｑ３Ｔ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｇ９Ｐ、Ｇ１０Ｖ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｇ１６Ｅ、Ｓ１７Ｔ、Ａ４１Ｐ、Ｇ４５Ａ、Ｔ７４Ｄ、Ｓ７５Ｎ／Ｔ、Ｓ７６＿Ｔ７７ｉｎｓＫ、Ｔ７７Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｑ、Ｔ８０Ｙ／Ｖ、Ｑ８２Ｔ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｌ８６Ｍ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８８Ｐ及びＡ８９Ｅ／Ｖの各々を含み得る。特定の実施形態では、Ｅ５Ｌ／Ｋ突然変異はＥ５Ｋであり、Ｅ１５Ｇ／Ｔ突然変異はＥ１５Ｔであり、Ｓ７５Ｎ／Ｔ突然変異はＳ７５Ｔであり、Ｔ７７Ｎ／Ｓ突然変異はＴ７７Ｓであり、Ｔ８０Ｙ／Ｖ突然変異はＴ８０Ｖであり、Ｒ８５Ｓ／Ｎ突然変異はＲ８５Ｎであり、Ｔ８７Ｒ／Ｄ突然変異はＴ８７Ｄであり、かつ／又は、Ａ８９Ｅ／Ｖ突然変異はＡ８９Ｖである。いくつかの実施形態によれば、そのような抗体のＶＨポリペプチドは、突然変異Ｅ５Ｋ、Ｅ１５Ｔ、Ｒ８５Ｎ、Ｔ８７Ｄ、及びＡ８９Ｖを含む。
特定の実施形態では、本開示のヒト化抗体のＶＨポリペプチドは、上記の突然変異の１つ又は所望の組み合わせを含み、配列番号２～６のうちの１つに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む。
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＶＶ Ｂ５と特異的に結合し、この抗体は、
配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含み、ＶＬポリペプチドは、
Ａ１Ｄ／Ｅ、Ｑ２Ｉ、Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ、Ｔ７Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｓ、Ｖ１１Ｌ、Ａ１３Ｌ、Ａ１４Ｓ、Ｖ１５Ｐ、Ｇ１７Ｄ／Ｅ、Ｔ１８Ｒ、Ｖ１９Ａ、Ｉ２１Ｌ、Ｓ２２Ｔ、Ｑ４４Ｋ、Ｐ４５Ａ／Ｖ、Ｎ４７Ｋ／Ｒ、Ｖ６０Ｉ、Ｓ６２Ａ、Ｋ６５Ｓ、Ｑ７２Ｅ／Ｄ、Ｄ７９Ｓ、Ｅ８１Ｑ、Ｃ８２Ｐ、Ｄ８３Ｅ、Ａ８５Ｆ／Ｖ、Ｔ８７Ｖ、Ｇ１０３Ｑ、Ｅ１０６Ｋ、Ｖ１０７Ｌ、Ｖ１０８Ｅ、Ｖ１０９Ｉ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の突然変異であって、ナンバリングは配列番号７に従う、突然変異と、
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号１８）を含むＶＬ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号１９）を含むＶＬ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号２０）を含むＶＬ ＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態によれば、そのような抗体のＶＬポリペプチドは、突然変異Ｔ７Ｓ、Ｐ１０Ｔ／Ｓ、Ｖ１１Ｌ、Ａ１４Ｓ、Ｇ１７Ｄ／Ｅ、Ｔ１８Ｒ、Ｐ４５Ａ／Ｖ、Ｎ４７Ｋ／Ｒ、Ｋ６５Ｓ、Ｑ７２Ｅ／Ｄ、Ｄ７９Ｓ、Ｃ８２Ｐ、Ａ８５Ｆ／Ｖ、Ｇ１０３Ｑ、Ｅ１０６Ｋ、Ｖ１０８Ｅ、及びＶ１０９Ｉのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む。例えば、そのような抗体のＶＬポリペプチドは、突然変異Ｔ７Ｓ、Ｐ１０Ｔ／Ｓ、Ｖ１１Ｌ、Ａ１４Ｓ、Ｇ１７Ｄ／Ｅ、Ｔ１８Ｒ、Ｐ４５Ａ／Ｖ、Ｎ４７Ｋ／Ｒ、Ｋ６５Ｓ、Ｑ７２Ｅ／Ｄ、Ｄ７９Ｓ、Ｃ８２Ｐ、Ａ８５Ｆ／Ｖ、Ｇ１０３Ｑ、Ｅ１０６Ｋ、Ｖ１０８Ｅ、及びＶ１０９Ｉの各々を含み得る。いくつかの実施形態によれば、そのような抗体のＶＬポリペプチドは、突然変異Ｇ１７Ｄ、Ｓ２２Ｔ、Ｑ４４Ｋ、Ｎ４７Ｋ、及びＥ８１Ｑのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む。特定の実施形態では、Ｐ１０Ｔ／Ｓ突然変異はＰ１０Ｔであり、Ｐ４５Ａ／Ｖ突然変異はＰ４５Ａであり、Ｑ７２Ｅ／Ｄ突然変異はＱ７２Ｅであり、かつ／又は、Ａ８５Ｆ／Ｖ突然変異はＡ８５Ｆである。そのような抗体のＶＬポリペプチドは、突然変異Ａ１Ｄ、Ｑ２Ｉ、Ｖ３Ｑ、及びＬ４Ｍのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含み得る。
特定の実施形態では、本開示の抗体のＶＬポリペプチドは、突然変異Ｄ８３Ｅを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｐ１０Ｔ／Ｓ突然変異はＰ１０Ｓであり、Ｐ４５Ａ／Ｖ突然変異はＰ４５Ｖであり、Ｑ７２Ｅ／Ｄ突然変異はＱ７２Ｄであり、かつ／又は、Ａ８５Ｆ／Ｖ突然変異はＡ８５Ｖである。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドは、突然変異Ａ１Ｄ、Ｑ２Ｉ、Ｖ３Ｑ、及びＬ４Ｍのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体のＶＬポリペプチドは、突然変異Ａ１Ｅ、Ｓ９Ａ、Ｐ１０Ｔ、Ａ１３Ｌ、Ｖ１５Ｐ、Ｇ１７Ｅ、Ｖ１９Ａ、Ｉ２１Ｌ、Ｐ４５Ａ、Ｎ４７Ｒ、Ｖ６０Ｉ、Ｓ６２Ａ、Ｑ７２Ｄ、Ｄ８３Ｅ、Ａ８５Ｆ、Ｔ８７Ｖ、及びＶ１０７Ｌのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む。例えば、ＶＬポリペプチドは、突然変異Ａ１Ｅ、Ｓ９Ａ、Ｐ１０Ｔ、Ａ１３Ｌ、Ｖ１５Ｐ、Ｇ１７Ｅ、Ｖ１９Ａ、Ｉ２１Ｌ、Ｐ４５Ａ、Ｎ４７Ｒ、Ｖ６０Ｉ、Ｓ６２Ａ、Ｑ７２Ｄ、Ｄ８３Ｅ、Ａ８５Ｆ、Ｔ８７Ｖ、及びＶ１０７Ｌの各々を含み得る。
特定の実施形態では、本開示のヒト化抗体のＶＬポリペプチドは、上記のＶＬ突然変異の１つ又は所望の組み合わせを含み、配列番号８～１２のうちの１つに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む。
また、本開示によって提供されるのは、ＶＶ Ｂ５に特異的に結合する抗体（非ヒト化又はヒト化抗体）であり、この抗体は、
可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドであって、
アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号１３）を含むＶＨ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）を含むＶＨ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号１７）を含むＶＨ ＣＤＲ３と、含む、可変重鎖ポリペプチドと、
可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドであって、
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号１８）を含むＶＬ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号１９）を含むＶＬ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号２０）を含むＶＬ ＣＤＲ３と、を含む、可変軽鎖ポリペプチドと、を含む。
本開示の抗体は、ＶＶ Ｂ５抗原に特異的に結合する。抗体のうち任意のものは、１つ以上のＶＶ株由来のＶＶ Ｂ５抗原に結合でき、その非限定的な例としては、ワイス株、ウエスタンリザーブ株及び／又はコペンハーゲン株のＢ５抗原が挙げられる。これらの株によってコードされるＢ５抗原のアミノ酸配列を以下の表２に提供する。
Figure 2024513700000004
 表２－ワイス、ウエスタンリザーブ及びコペンハーゲンＶＶのＢ５抗原配列
二重特異性抗体
二重特異性抗体もまた提供される。特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗体は、上記のような抗体などの本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体のうちのいずれかのＶＨポリペプチド－ＶＬポリペプチド対を含む第１の抗原結合ドメインを含む。二重特異性抗体は、第１の抗原結合ドメインによって結合されたＶＶ Ｂ５抗原と特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み得る。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、第１の抗原結合ドメインによって結合されたＶＶ Ｂ５抗原以外のＶＶ抗原と特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示の二重特異性抗体は、ＶＶ抗原以外の抗原と特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＶ抗原以外の抗原は、免疫細胞表面抗原である。免疫細胞表面抗原の非限定的な例としては、免疫エフェクター細胞表面抗原、例えば、Ｔ細胞表面抗原、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面抗原、マクロファージ細胞表面抗原などが挙げられる。第２の抗原結合ドメインによって結合され得るＴ細胞表面抗原の例としては、Ｔ細胞刺激分子、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８などが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の二重特異性抗体としては、全長抗体構造を有する抗体、及び二重特異性抗体断片が挙げられる。本明細書で使用される場合、「全長」は、２つの全長抗体重鎖及び２つの全長抗体軽鎖を有する抗体を指す。全長抗体重鎖（ＨＣ）は、既知の可変重鎖及び定常ドメインＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。全長抗体軽鎖（ＬＣ）は、既知の可変軽鎖及び定常ドメインＶＬ及びＣＬからなる。全長抗体は、一方又は両方の重鎖のいずれかにおいてＣ末端リジンを欠いていてもよい。用語「Ｆａｂアーム」は、抗原に特異的に結合する１つの重鎖：軽鎖対を指す。
全長二重特異性抗体は、例えば、２つの単一特異性二価抗体間のＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して、各半分子中の重鎖ＣＨ３界面に置換を導入して、別個の特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体形成に有利に働くようにすることによって、無細胞環境においてインビトロで、又は共発現を使用して生成され得る。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離－会合の結果である。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は、低減される。親単一特異性抗体のうちの１つの、得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖間ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインが解離－会合によって放出及び再形成される。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化に有利に働くように操作され得る。得られた生成物は、各々が異なるエピトープに結合する２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
「ノブ・イン・ホール（knob-in-hole）」戦略（例えば、ＷＯ２００６／０２８９３６を参照のこと）を使用して、全長二重特異性抗体を生成し得る。簡潔には、ヒトＩｇＧにおけるＣＨＳドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸を、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置で変異させて、ヘテロ二量体形成を促進することができる。小さな側鎖（ホール）を有するアミノ酸を、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖に導入し、大きな側鎖（ノブ）を有するアミノ酸を、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖に導入する。２つの抗体の共発現後、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的相互作用の結果として、ヘテロ二量体が形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換対は、（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として発現される）Ｔ３６６Ｙ７Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４５／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである。
米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、同第２００９／０１８２１２７号、同第２０１０／０２８６３７号、又は同第２０１１／０１２３５３２号に記載されるように、１つのＣＨ３表面で正に帯電した残基と第２のＣＨ３表面で負に帯電した残基とを置換することにより、静電相互作用を使用して重鎖ヘテロ二量体化を促進するなどの他の戦略を使用してもよい。他の戦略では、ヘテロ二量体化は、（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表される）以下の置換によって促進され得る：米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は同第２０１３／０１９５８４９号に記載されるようなＬ３５１ Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１ Ｙ＿Ｙ４０７Ａ’Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ若しくはＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。
単鎖二重特異性抗体も提供される。いくつかの実施形態において、本開示の単鎖二重特異性抗体は、二重特異性ｓｃＦｖである。二重特異性ｓｃＦｖに関する詳細は、例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ Ｃａｎｃｅｒ８（１８）：３６８９－３６９６に見出され得る。
本明細書に記載の抗体から多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を産生するために用いられ得るアプローチとしては、Ｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｄ．（２０１９）．「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ：Ｔｏｗａｒｄｓ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ．」Ｍｅｔｈｏｄｓ １５４：１０２－１１７、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１７）．「Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．」ｍＡｂｓ ９（２）：１８２－２１２、及びＳｕｕｒｓ，Ｆ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．「Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．」Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１：１０３－１１９、が挙げられるが、これらに限定されず、これらの開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
融合タンパク質
本開示の態様は、融合タンパク質を更に含む。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、異種（heterologous）アミノ酸配列に融合された、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体のうちのいずれかのＶＨポリペプチド、ＶＬポリペプチド、又は両方を含む。異種アミノ酸配列は、抗体の鎖のＣ末端又は抗体の鎖のＮ末端に融合され得る。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、抗体の鎖のＣ末端に異種配列と、抗体の鎖のＮ末端に異種配列と、を含み、異種配列は、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。核酸又はポリペプチドの文脈において使用される「異種」とは、一般的に、核酸又はポリペプチドが、核酸又はポリペプチドが結合又は連結されているものとは異なる起源（例えば、異なる配列の分子、異なる種起源など）に由来しており、その結果、核酸又はポリペプチドが天然に見出されないものであることを意味する。例えば、融合タンパク質では、軽鎖ポリペプチドとレポーターポリペプチド（例えば、ＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）、ルシフェラーゼなど）は、互いに「異種」であると言われている。同様に、ウサギ抗体由来のＣＤＲとヒト抗体由来の定常領域は互いに「異種」である。
ＶＨポリペプチド及び／又はＶＬポリペプチドは、目的の任意の異種配列に融合され得る。目的の異種ポリペプチドとしては、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン－アラニン－セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、異種ポリペプチドは、抗体がそれを必要とする個体に投与されたときに、異種配列に融合されていない同じ抗体と比較して、抗ＶＶ Ｂ５抗体の安定性及び／又は血清半減期を増加させる。
特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、単鎖抗体、例えば、上記のような抗体などの本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体のうちのいずれかのＶＨポリペプチド－ＶＬポリペプチド対を含む単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。本開示の実施形態によるヒト化ｓｃＦｖの非限定的な例のアミノ酸配列は、以下の表３に提供される。
Figure 2024513700000005
表３に記載されるが、ＶＨ及びＶＬの配向が逆である、すなわち、ＶＬがＶＨに対してＮ末端である、抗ＶＶ Ｂ５ｓｃＦｖもまた提供される。
いくつかの実施形態によれば、融合タンパク質が単鎖抗体（例えば、本明細書に記載のｓｃＦｖのうちのいずれかを含む、本開示の単鎖抗体のうちのいずれか）を含む場合、融合タンパク質は、単鎖抗体、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
本開示のＣＡＲは、様々なドメイン間に１つ以上のリンカー配列を含み得る。「可変領域連結配列」は、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に接続し、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサ機能を提供するアミノ酸配列であり、その結果、得られるポリペプチドは、同じ軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持する。可変領域連結配列の非限定的な例は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２６）を含むセリン－グリシンリンカーなどのセリン－グリシンリンカーである。特定の実施形態では、リンカーは、１つ以上の重鎖可変ドメイン若しくは軽鎖可変ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び／又は一次シグナル伝達ドメインを分離する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のリンカーを含む。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約１～約２５アミノ酸、約５～約２０アミノ酸、若しくは約１０～約２０アミノ酸、又は任意の介在する長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又はそれ以上のアミノ酸長である。
いくつかの実施態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインの後に、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面（例えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞の表面）から離して、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、及び／又は活性化を可能にする１つ以上のスペーサドメインが続く。スペーサドメイン（及び本明細書に記載される任意の他のスペーサドメイン、リンカーなど）は、天然源、合成源、半合成源、又は組換え源のいずれかに由来し得る。ある特定の実施形態において、スペーサドメインは、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２及びＣＨ３を含むがこれらに限定されない、免疫グロブリンの一部分である。スペーサドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域又は改変された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、スペーサドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、又はＩｇＤのＣＨ２及び／又はＣＨ３を含む。本明細書に記載のＣＡＲにおける使用に適した例示的なスペーサドメインは、ＣＤ８α及びＣＤ４などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これは、これらの分子又はそのバリアント由来の野生型ヒンジ領域であってもよい。ある特定の態様において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＰＤ－１ヒンジ又はＣＤ１５２ヒンジである。
「膜貫通ドメイン」（Ｔｍドメイン）は、細胞外結合部分と細胞内シグナル伝達ドメインとを融合し、ＣＡＲを細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）の原形質膜に固定するＣＡＲの一部分である。Ｔｍドメインは、天然源、合成源、半合成源、又は組換え源のいずれかに由来し得る。いくつかの実施形態において、Ｔｍドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖若しくはβ鎖、ＣＤ３５、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、又はＰＤ－１に由来する（例えば、少なくとも膜貫通領域（複数可）又はその機能部分を含む）。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴｍドメインを含む。ある特定の態様において、ＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴｍドメイン、及びＣＡＲのＴｍドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーを含む。このようなリンカーとしては、例えば、グリシン－セリンリンカーを用いてもよい。
ＣＡＲの「細胞内シグナル伝達」ドメインとは、標的分子／抗原へのＣＡＲ結合からのシグナルを免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖活性及び／若しくはＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害因子の放出を含む細胞傷害活性、又は細胞外ＣＡＲドメインへの標的分子／抗原結合で誘発される他の細胞応答を誘発することに関与するＣＡＲの一部を指す。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化した機能を実施させるタンパク質の一部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が使用される限り、このような短縮部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全長細胞内シグナル伝達ドメインの代わりに使用され得る。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）だけで生成されたシグナルは、Ｔ細胞を完全に活性化するには不十分であり、二次シグナル又は共刺激シグナルも必要である。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞内シグナル伝達ドメインである、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）を通じて抗原依存性一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメイン、及び抗原非依存的に作用して二次シグナル又は共刺激シグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインによって媒介される。したがって、本開示のＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」及び「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激的様式又は抑制的様式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的様式で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（又は「ＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）」）として知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。本開示のＣＡＲにおける使用に適したＩＴＡＭ含有一次シグナル伝達ドメインの非限定的な例としては、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、及びＣＤ６６δに由来するものが挙げられる。ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の有効性及び増殖を増強するために、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」又は「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子又はその活性断片の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。特定の実施形態において企図されるＣＡＲにおける使用に適した例示的な共刺激分子としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、及びＣＤ１３４からなる群より選択された１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、並びにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
本開示のＣＡＲは、リーダー配列、ヒンジ、スペーサ、及び／又はリンカードメイン（複数可）、膜貫通ドメイン（複数可）、共刺激ドメイン（複数可）、シグナルドメイン（複数可）（例えば、ＣＤ３ζドメイン（複数可））、リボソームスキップエレメント（複数可）、制限酵素配列（複数可）、レポータータンパク質ドメインなどを含むがこれに限定されない、任意の様々な好適なドメインを含み得る。本開示のＣＡＲに含まれ得るそのようなドメインの非限定的な例としては、以下の表４に示されるものが挙げられる。当業者によって理解されるように、表４に示されるドメインのうちの１つ以上のアミノ酸配列（例えば、リンカー、ヒンジ、膜貫通、共刺激、シグナル伝達、リボソームスキップエレメント、制限酵素配列、レポータータンパク質など）は、例えば、ＣＡＲの改善された機能性などのために、所望に応じて修飾され得る。
Figure 2024513700000006
Figure 2024513700000007
特定の態様では、本開示のＣＡＲは、ＶＶ Ｂ５抗原に特異的に結合する単鎖抗体（例えば、本開示のｓｃＦｖのいずれか）、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１５４、及びＰＤ－１からなる群から選択されたポリペプチド由来の膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、及びＣＤ１３４からなる群から選択されたポリペプチド由来の１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、並びにＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、及びＣＤ６６δからなる群から選択されたポリペプチド由来の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。このようなＣＡＲは、抗原結合部分と膜貫通ドメインとの間にスペーサドメイン、例えば、ＣＤ８αヒンジを更に含み得る。
いくつかの実施形態によれば、Ｎ末端からＣ末端に向かって、本明細書に記載される抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、リンカー、本明細書に記載される抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、ＣＤ８ヒンジ領域（いくつかの実施形態では、伸長ＣＤ８ヒンジ領域である）、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが提供される。特定の実施形態によれば、Ｎ末端からＣ末端に向かって、本明細書に記載される抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、リンカー、本明細書に記載される抗体の可変重鎖（ＶＨ）、ＣＤ８ヒンジ領域（いくつかの実施形態では、伸長ＣＤ８ヒンジ領域である）、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが提供される。特定の実施形態では、Ｎ末端からＣ末端に向かって、本明細書に記載される抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、リンカー、本明細書に記載される抗体の可変軽鎖（ＶＬ）、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが提供される。いくつかの実施形態によれば、Ｎ末端からＣ末端に向かって、本明細書に記載される抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、リンカー、本明細書に記載される抗体の可変重鎖（ＶＨ）、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが提供される。本開示のＣＡＲのいずれかは、ＶＨポリペプチドのＮ末端側にドメインを含み得る。例えば、リーダー配列（例えば、ＧＭ－ＣＳＦＲαリーダー配列）は、本開示のＣＡＲのＮ末端に存在し得る。
本開示の実施形態による抗ＶＶ Ｂ５ ＣＡＲの非限定的な例のアミノ酸配列を以下の表５に提供し、表５中のＣＡＲのアミノ酸配列は、Ｎ末端リーダー配列（ここでは、Ｎ末端ＧＭ－ＣＳＦＲαリーダー配列）のアミノ酸配列を含む。任意の所望のリーダー配列（例えば、ＧＭ－ＣＳＦＲαリーダー配列）は、そのようなＣＡＲのＮ末端に存在し得る。当業者によって理解されるように、表５に示されるドメインのうちの１つ以上（例えば、リンカー、ヒンジ、膜貫通、共刺激、シグナル伝達など）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＡＲの機能性などを改善するために、必要に応じて改変され得る。表５では、ＣＡＲのセグメント／ドメインが交互の下線で示され、セグメント／ドメインのＩＤが左側の列に示されている。
Figure 2024513700000008
本開示のＣＡＲは、必要に応じて、１つ以上の追加のドメインを含み得る。そのような追加のドメインの非限定的な例としては、リボソームスキップエレメント、酵素ドメイン（例えば、ヌクレアーゼ活性を有するドメイン、例えば、制限エンドヌクレアーゼ活性）、ＣＡＲの検出を可能にするドメイン（例えば、レポータータンパク質ドメイン（例えば、蛍光タンパク質（例えば、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）、発光タンパク質及び／又は同様のもの））などが挙げられる。例えば、特定の実施形態では、提供されるのは、リボソームスキップエレメント、制限酵素ドメイン及び／又はレポータータンパク質ドメインを含むＣＡＲである。
いくつかの実施形態によれば、本開示のＣＡＲは、単一のポリペプチドによって提供される。特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、２つ以上のポリペプチドによって提供される。ＣＡＲが２つ以上のポリペプチドによって提供される場合、ＣＡＲは、ビオチン結合免疫受容体（ＢＢＩＲ）フォーマット（例えば、Ｕｒｂａｎｓｋａ Ｋ，Ｐｏｗｅｌｌ ＤＪ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｏ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１（５）：７７７－７７９．ｄｏｉ：１０．４１６１／ｏｎｃｉ．１９７３０、及び、Ｕｒｂａｎｓｋａ Ｋ，Ｌａｎｉｔｉｓ Ｅ，Ｐｏｕｓｓｉｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．２０１３；７２（７）：１８４４－１８５２．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－１１－３８９０．Ａ参照）、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）を有する切り替え可能なＣＡＲフォーマット（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１５；１３７（８）：２８３２－２８３５、Ｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１３（４）：Ｅ４５０－８、Ｒｏｄｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１１３（４）：Ｅ４５９－Ｅ４６８、Ｖｉａｕｄ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１５（４６）：Ｅ１０８９８－Ｅ１０９０６参照）、ロイシンジッパーを有するＳＵＰＲＡ ＣＡＲフォーマット（例えば、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２１０８）Ｃｅｌｌ １７３（６）：１４２６－１４３８．ｅ１１参照）、ＦＩＴＣ－葉酸を有するＣＡＲ－Ｔアダプター分子（ＣＡＭ）ベースのフォーマット（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９（２）：３８７－３９６、及びＬｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．９：１５１参照）、抗ＦＩＴＣ－葉酸アダプターフォーマット（例えば、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｉｏｓｃｉ Ｔｒｅｎｄｓ．１２（３）：２９８－３０８参照）、抗ＦＩＴＣ抗体アダプターＣＡＲフォーマット（例えば、Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８（２３）：６４３６－６４４５参照）、Ｆｃ標的（例えば、抗ＣＤ１６）ＣＡＲ＋抗腫瘍抗体フォーマット（例えば、Ｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７４（１）：９３－１０３参照）などのユニバーサルＣＡＲフォーマットを含む、任意の有用な多ポリペプチドフォーマットで提供され得る。
コンジュゲート
本開示はまた、コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示のコンジュゲートは、本開示の抗体又は融合タンパク質のうちのいずれかと、抗体又は融合タンパク質にコンジュゲートされた薬剤と、を含む。「コンジュゲートされた」という用語は、一般的に、目的の１つの分子を目的の第２の分子と近位会合させる、共有結合又は非共有結合のいずれか、通常は共有結合の化学結合を指す。特定の実施形態では、抗体又は融合タンパク質にコンジュゲートされた薬剤は、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、放射性同位体（例えば、治療用放射性同位体）、検出可能な標識、及び半減期拡張部分から選択される。
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、治療薬、例えば、化学療法剤である。目的の治療薬は、コンジュゲートの抗体部分の細胞／組織の抗原への特異的結合を介してコンジュゲートが結合する細胞／組織の機能に影響を及ぼすことができる薬剤を含む。細胞／組織の機能が病理的である場合、細胞／組織の機能を低下させる薬剤を用いてもよい。特定の態様では、本開示のコンジュゲートは、細胞増殖の阻害及び／又は細胞／組織の殺滅によって標的細胞／組織の機能を低下させる薬剤を含む。そのような薬剤は、様々であり、細胞増殖抑制剤及び細胞傷害性剤、例えば、標的細胞への内在化あり又はなしで標的細胞組織を殺滅することができる薬剤を含み得る。
特定の態様では、治療薬は、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、及びビンカアルカロイドから選択される細胞傷害性剤である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ－１０６５、ＣＰＴ－１１（ＳＮ－３８）、トポテカン、ドキソルビシン、モルホリノ－ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、ドラスタチン－１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタンシン、メイタンシンＤＭ１、メイタンシンＤＭ４、ＤＭ－１、アウリスタチンＥ若しくはアウリスタチンＦのような、アウリスタチン若しくは他のドラスタチン誘導体、ＡＥＢ（ＡＥＢ－０７１）、ＡＥＶＢ（５－ベンゾイルバレリン酸－ＡＥエステル）、ＡＥＦＰ（抗体－エンドスタチン融合タンパク質）、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、エレウテロビン、ネットロプシン、又はこれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ＨＴＩ－２８６などのヘミアステリン及びヘミアステリン類似体（例えば、それらの全開示が参照により本明細書に組み込まれるＵＳＰＮ７，５７９，３２３、ＷＯ２００４／０２６２９３、及びＵＳＰＮ８，１２９，４０７を参照）、アブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、バトラコトキシン、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、コレラ毒素、ファルカリノール、フモニシンＢ１、フモニシンＢ２、アフラトキシン、マウロトキシン（maurotoxin）、アジトキシン、カリブドトキシン、マルガトキシン（margatoxin）、スロトキシン（slotoxin）、シラトキシン（scyllatoxin）、ヘフトキシン、カルシセプチン、タイカトキシン（taicatoxin）、カルシクルジン、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロタウストラリン、オクラトキシン（ocratoxin）Ａ、パツリン、リシン、ストリキニーネ、トリコテセン、ゼアラレノン（zearlenone）、及びテトラドトキシン（tetradotoxin）から選択されるタンパク質毒素である。用いることができる酵素的に活性な毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ－サルシン（sarcin）、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン（curcin）、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）及びトリコテセンが含まれる。
特定の実施形態では、薬剤は放射線増感剤である。本明細書で使用される場合、「放射線増感剤」は、腫瘍細胞を殺滅する放射線の能力を増強する薬剤である。抗体又は融合タンパク質にコンジュゲートされ得る放射線増感剤の非限定的な例としては、シスプラチン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ＡＺＤ７７６２、セルメチニブなどが挙げられる。
特定の実施形態では、薬剤は、例えば、療法及び／又は検出（例えば、イメージング）に有用な放射性同位体である。抗体又は融合タンパク質にコンジュゲートされ得る放射性同位体の非限定的な例としては、２２５Ａｃ、１１１Ａｇ、１１４Ａｇ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７７Ａｓ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、１１Ｃ、１３Ｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１８Ｆ、１９Ｆ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ｇａ、１５４－１５８Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１２０Ｉ、１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１９４Ｉｒ、８１ｍＫｒ、１７７Ｌｕ、５１Ｍｎ、５２Ｍｎ、９９Ｍｏ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９１ＰＴ、１９３ｍＰＴ、１９５ｍＰｔ、２２３Ｒａ、１４２Ｒｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、７５Ｓｅ、１５３Ｓｍ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、８３Ｓｒ、８９Ｓｒ、１６１Ｔｂ、９４Ｔｃ、９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ、２２７Ｔｈ、２０１Ｔｌ、１７２Ｔｍ、１２７Ｔｅ、９０Ｙ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１３３Ｘ及び８９Ｚｒが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、放射性同位体は、キレート剤、例えば、二機能性キレート剤を介して抗体又は融合タンパク質にコンジュゲートされる。二官能性キレート剤は、安定な配位錯体において放射性同位体と結合する金属キレート部分と、本開示の抗体又は融合タンパク質のうちのいずれかなどの標的化部分に共有結合している反応性官能基と、を含有し得、それにより、放射性同位体はインビボで望ましい分子標的に適切に向けられ得る。本開示の抗体又は融合タンパク質を放射性同位体にコンジュゲートするために用いられ得る二機能性キレート剤の非限定的な例としては、ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡ及びｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－デフェロキサミンが挙げられる。本開示の抗体又は融合タンパク質を放射性同位体にコンジュゲートするために用いられ得る二官能性キレート剤の追加の例としては、Ｐｒｉｃｅ ＆ Ｏｒｖｉｇ（２０１４）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４３：２６０、及びＢｒｅｃｈｂｉｅｌ（２００８）Ｑ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ５２（２）：１６６－１７３に記載のものが挙げられる。
いくつかの実施形態によれば、放射性同位体は治療用放射性同位体である。特定の実施形態では、放射性同位体は、アルファ放出放射性同位体、例えば、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ／２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、又は２２７Ｔｈである。他の実施形態では、放射性同位体は、ベータマイナス放出放射性同位体、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１３１Ｉ又は１７７Ｌｕである。
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、標識剤である。「標識剤」（又は「検出可能な標識」）とは、抗体又は融合タンパク質が目的の適用（例えば、インビトロ研究及び／若しくはインビボ研究並びに／又は臨床適用）において検出され得るように、抗体又は融合タンパク質を検出可能に標識する薬剤を意味する。目的の検出可能な標識としては、放射性同位体（例えば、γ放射体又は陽電子放射体）、検出可能な生成物を生成する酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなど）、蛍光タンパク質、常磁性原子などが挙げられる。ある特定の態様において、抗体又は融合タンパク質は、検出可能な標識の特異的結合パートナーにコンジュゲートされる、例えば、アビジン／ストレプトアビジンを含む検出可能な標識を介して検出が起こり得るようにビオチンにコンジュゲートされる。
ある特定の実施形態において、薬剤は、近赤外線（near-infrared、ＮＩＲ）光学イメージング、単一光子放射断層撮影（single-photon emission computed tomography、ＳＰＥＣＴ）±ＣＴイメージング、陽電子放出断層撮影（positron emission tomography、ＰＥＴ）±ＣＴイメージング、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法などのインビボイメージングにおいて使用を見出される標識剤である。このような用途に使用を見出される標識剤としては、蛍光標識、放射性同位体などが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、標識剤は、２つ以上のイメージング手法を使用してインビボイメージングを可能にするマルチモーダルインビボイメージング剤である（例えば、Ｔｈｏｒｐ－Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｏｏｇａｎ（２０１１年）Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．４０：６１２９－６１４３を参照のこと）。
ある特定の実施形態において、標識剤は、近赤外線（ＮＩＲ）イメージング用途に使用を見出されるインビボイメージング剤である。そのような薬剤は、Ｋｏｄａｋ Ｘ－ＳＩＧＨＴ色素、Ｐｚ ２４７、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０及び８００ Ｆｌｕｏｒｓ、Ｃｙ ５．５及び７ Ｆｌｕｏｒｓ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０及び７５０ Ｄｙｅｓ、ＩＲＤｙｅ ６８０及び８００ＣＷ Ｆｌｕｏｒｓを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、標識剤は、ＳＰＥＣＴイメージング用途に使用を見出されるインビボイメージング剤であり、その非限定的な例としては、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌ、及び１３３Ｘｅが挙げられる。ある特定の実施形態において、標識剤は、ＰＥＴイメージング用途に使用を見出されるインビボイメージング剤、例えば、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、６８Ｇａなどである。
半減期を延長するために、本開示の抗体及び融合タンパク質は、改善された薬物動態プロファイルを提供する薬剤にコンジュゲートされ得る（例えば、ＰＥＧ化、高グリコシル化などによる）。血清半減期を延長することができる修飾が、注目されている。対象の抗体又は融合タンパク質は、１つ以上のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分を含有するものとして「ＰＥＧ化」され得る。タンパク質のＰＥＧ化に適した方法及び試薬は、当技術分野でよく知られており、例えば米国特許第５，８４９，８６０号に見出され得る。タンパク質へのコンジュゲーションに好適なＰＥＧは一般に、室温で水溶性であり、一般式Ｒ（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎＯ－Ｒを有し、式中、Ｒは水素、又はアルキル基若しくはアルカノール基などの保護基であり、ｎは１～１０００の整数である。Ｒが保護基である場合、それは一般に１～８個の炭素を有する。対象の抗体又は融合タンパク質にコンジュゲートされたＰＥＧは線形であり得る。対象の抗体又は融合タンパク質にコンジュゲートされたＰＥＧはまた分岐であり得る。米国特許第５，６４３，５７５号に記載されているもの、「スターＰＥＧ」、及びマルチアームＰＥＧなどの分岐ＰＥＧ誘導体。スターＰＥＧは、例えば、米国特許第６、０４６，３０５号を含む当該技術分野において記載されている。
対象の抗体又は融合タンパク質が供給源から単離される場合、抗体又は融合タンパク質は、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）、レクチンなどの精製を容易にする１つ以上の部分にコンジュゲートされ得る。抗体はまた、ポリスチレンプレート又はビーズ、磁気ビーズ、試験ストリップ、膜などが挙げられるが、これらに限定されない固体支持体に結合（例えば、固定化）することができる。
抗体又は融合タンパク質がアッセイにおいて検出される場合、抗体又は融合タンパク質は、検出可能な標識、例えば、放射性同位体（例えば、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎなど）、検出可能な生成物を生成する酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光タンパク質、発色タンパク質、色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンなど）、ＥＤＴＡなどの金属キレート基を通じてタンパク質に結合された、蛍光発光金属、例えば、１５２Ｅｕ、又はランタニド系列の他の金属、化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩など、生物発光化合物、例えば、ルシフェリン、蛍光タンパク質などを含有し得る。間接標識は、対象タンパク質に特異的な抗体を含み、この抗体は二次抗体を介して検出され得、特異的結合対の要素、例えば、ビオチン－アビジンなどを含む。
上記の薬剤はいずれも、リンカーを介して抗体又は融合タンパク質にコンジュゲートされ得る。存在する場合、リンカー分子は、抗体又は融合タンパク質及び連結薬剤（linked agent）が抗体又は融合タンパク質と連結薬剤との間でのいくらかの柔軟な動きを可能にするのに十分な長さであり得る。リンカー分子は、例えば、約６～５０原子の長さであり得る。リンカー分子はまた、例えば、アリルアセチレン、２～１０個の単量体単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、又はそれらの組み合わせであり得る。
リンカーがペプチドである場合、リンカーは、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０アミノ酸以上、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸（４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、又は７アミノ酸～８アミノ酸を含む）などの任意の好適な長さのものであることができ、長さが１、２、３、４、５、６、又は７アミノ酸であり得る。
柔軟なリンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当技術分野で知られている他の柔軟なリンカーが挙げられる。グリシンポリマー及びグリシン－セリンポリマーは、比較的構造化されていないアミノ酸が目的である場合に使用され得、成分間の中性テザーとして機能し得る。当業者は、上記の任意の薬剤にコンジュゲートされた抗体又は融合タンパク質の設計が全体的又は部分的に柔軟なリンカーを含み得、それにより、リンカーが柔軟なリンカー及び柔軟性の低い構造を付与する１つ以上の部分を含み得ることを認識するであろう。
いくつかの実施形態によれば、抗体又は融合タンパク質は、切断不可能なリンカーを介して薬剤にコンジュゲートされる。目的の切断不可能なリンカーとしては、チオエーテルリンカーが挙げられるが、これに限定されない。用いられ得るチオエーテルリンカーの例としては、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカーが含まれる。
ある特定の実施形態において、抗体は、切断可能なリンカーを介して薬剤にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態によれば、リンカーは、中性ｐＨ（血流ｐＨ７．３～７．５）で安定であるが、標的細胞（例えば、がん細胞）の弱酸性エンドソーム（ｐＨ５．０～６．５）及びリソソーム（ｐＨ４．５～５．０）への内部移行時に加水分解を受ける酸切断可能なリンカーなどの、化学的に不安定なリンカーである。化学的に不安定なリンカーとしては、ヒドラゾン系リンカー、オキシム系リンカー、カーボネート系リンカー、エステル系リンカーなどが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、リンカーは、血流中で安定であるが、例えば、標的細胞（例えば、がん細胞）のリソソーム中のリソソームプロテアーゼ（カテプシン又はプラスミンなど）によって標的細胞への内部移行時に酵素的切断を受ける、酵素不安定性リンカーなどの酵素不安定性リンカーである。酵素不安定性リンカーとしては、ペプチド結合を含むリンカー、例えば、バリン－シトルリン（valine-citrulline、ＶＣ）リンカー、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジル（ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ）リンカーなどのジペプチド系リンカー、バリル－アラニル－パラ－アミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ）リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。化学的に不安定なリンカー、酵素不安定性リンカー、及び切断不可能なリンカーが知られており、例えば、Ｄｕｃｒｙ ＆ Ｓｔｕｍｐ（２０１０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２１：５－１３；Ｎｏｌｔｉｎｇ，Ｂ．（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１０４５：７１－１００、Ｔｓｕｃｈｉｋａｍａ ａｎｄ Ａｎ（２０１８）Ｐｒｏｔｅｉｎ ＆ Ｃｅｌｌ ９（１）：３３－４６、及び他の箇所に詳細に記載されている。
薬剤を抗体又は融合タンパク質に直接、又はリンカーを介して間接的に連結するための多数の戦略が利用可能である。例えば、薬剤は、リンカーを薬剤に共有結合させることによって誘導体化されてもよく、リンカーは、抗体又は融合タンパク質上の「化学ハンドル」と反応することができる官能基を有する。リンカー上の官能基は、変化してもよく、抗体又は融合タンパク質上の化学ハンドルとの適合性に基づいて選択されてもよい。一実施形態によれば、抗体又は融合タンパク質上の化学ハンドルは、化学ハンドルを有する非天然アミノ酸を抗体又は融合タンパク質に組み込むことによって提供される。本開示のコンジュゲートを調製するために使用を見出される非天然アミノ酸としては、アジド、アルキン、アルケン、アミノ－オキシ、ヒドラジン、アルデヒド（例えば、ホルミルグリシン、例えば、Ｃａｔａｌｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ ＳｏｌｕｔｉｏｎｓからのＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術）、ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、ハロゲン化アリール、及びボロン酸官能基から選択される官能基を有する非天然アミノ酸が挙げられる。本開示のコンジュゲートの抗体に組み込まれ得る非天然アミノ酸であって、目的の官能基を提供するように選択され得る非天然アミノ酸が知られており、例えば、Ｍａｚａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２６（９）：１８８４－９、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：５９２－６０５、Ａｄｕｍｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ．（２）：１５３－６５、及び他の箇所に記載されている。そのような非天然アミノ酸は、例えば、化学合成又は組換え手法を介して、例えば、宿主細胞における抗体又は融合タンパク質の翻訳中に非天然アミノ酸を組み込むために好適な直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を使用して、抗体又は融合タンパク質に組み込むことができる。
抗体又は融合タンパク質中に存在する非天然アミノ酸の官能基は、アジド、アルキン、アルケン、アミノオキシ、ヒドラジン、アルデヒド、アスアルデヒド（asaldehyde）、ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、ハロゲン化アリール、ボロン酸、ジアゾ、テトラジン、テトラゾール、クアドロシクラン（quadrocyclane）、ヨードベンゼン、又は他の好適な官能基あってもよく、リンカー上の官能基は、非天然アミノ酸の官能基と反応するように選択される（逆もまた同様である）。ほんの一例として、アジドを有する非天然アミノ酸（例えば、５－アジド－Ｌ－ノルバリンなど）を抗体又は融合タンパク質に組み込んでもよく、リンカー－薬剤部分のリンカー部分は、抗体又は融合タンパク質とリンカー－薬剤部分とがアジド－アルキン環状付加により共有コンジュゲートされるように、アルキン官能基を含み得る。コンジュゲーションは、例えば、銅触媒アジド－アルキン環化付加反応を使用して行われ得る。
特定の実施形態では、抗体又は融合タンパク質上の化学的ハンドルは、非天然アミノ酸を含まない。非天然アミノ酸を含有しない抗体は、反応性脱離基又は他の求電子性基を有する部分との置換反応における求核試薬として、例えば、抗体又は融合タンパク質の求核性官能基（例えば、Ｎ末端アミン若しくはリジンの一級アミン、又は任意の他の求核性アミノ酸残基）を利用することによって、薬剤にコンジュゲートされ得る。例としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルを有する薬剤－リンカー部分を調製し、高ｐＨ（約１０）の水性条件下又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンなどの非求核性塩基が追加されたＤＭＳＯなどの極性有機溶媒中で、薬剤－リンカー部分を抗体又は融合タンパク質と反応させることである。
リンカー、薬剤、及び／又は抗体若しくは融合タンパク質を互いに結合させるための特定の手法は、特定のリンカー、薬剤、及び／又は抗体若しくは融合タンパク質、並びに様々な成分を互いにコンジュゲートするために選択及び使用される官能基に依存して変化し得ることが理解される。
抗体を産生する方法
本明細書に提供される情報を使用して、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体及び融合タンパク質は、当業者に既知の標準的な技術を使用して調製され得る。例えば、本開示の抗体又は融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を使用して、抗体又は融合タンパク質を発現させることができる。本明細書で提供されるポリペプチド配列（例えば、表１、３、４及び５を参照のこと）を使用して、抗体又は融合タンパク質をコードする適切な核酸配列を決定することができ、次いで、核酸配列を使用して、ＶＶ Ｂ５に特異的な１つ以上の抗体又は融合タンパク質を発現することができる。核酸配列は、当業者に周知の標準的な方法に従って、様々な発現系の特定のコドン「選好」を反映するように最適化することができる。提供された配列情報を使用して、当業者に知られているいくつかの標準的な方法に従って核酸を合成してもよい。
対象抗体又は融合タンパク質をコードする核酸が合成されると、それを標準的な方法に従って増幅及び／又はクローン化することができる。これらの目的を達成するための分子クローン化技術は、当該分野で知られている。組換え核酸の構築に適した多種多様なクローン化及びインビトロ増幅方法は、当業者に知られており、多数の教科書及び実験マニュアルの主題になっている。
本開示の抗体及び融合タンパク質をコードする天然又は合成の核酸の発現は、抗体又は融合タンパク質をコードする核酸をプロモータ（構成的又は誘導性のいずれか）に作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込んで組換え発現ベクターを生成することによって達成することができる。ベクターは、原核生物、真核生物、又はその両方における複製及び組込みに適する可能性がある。典型的なクローン化ベクターは、機能的に適切に配向された転写及び翻訳ターミネータ、開始配列、並びに抗体をコードする核酸の発現の調節に有用なプロモータを含有する。ベクターは、任意選択で、少なくとも１つの独立したターミネータ配列、例えば、シャトルベクターにおいて見出されるような、真核生物及び原核生物の両方においてカセットの複製を可能にする配列、並びに原核生物系及び真核生物系の両方についての選択マーカを含む、一般的な発現カセットを含む。
クローン化された核酸の高レベルの発現を得るために、典型的には、転写を指向する強力なプロモータ、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写／翻訳ターミネータを、各々、互いに対して、かつタンパク質コード配列に対して機能的な配向において含む発現プラスミドを構築することが一般的である。大腸菌におけるこの目的に好適な調節領域の例は、大腸菌トリプトファン生合成経路のプロモータ及びオペレータ領域、ファージλ（phage lambda、ＰＬ）の左方プロモータ、並びにＬ－アラビノース（ａｒａＢＡＤ）オペロンである。大腸菌中で形質転換されたＤＮＡベクターに選択マーカを含めることも有用である。このようなマーカの例としては、アンピシリン、テトラサイクリン、又はクロラムフェニコールに対する耐性を特定する遺伝子が挙げられる。抗体を発現するための発現系は、例えば、大腸菌、バシラス菌、及びサルモネラ菌を用いて利用可能である。大腸菌系も使用され得る。
抗体遺伝子（複数可）はまた、精製を容易にするために、抗体（例えば、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）のＣ末端又はＮ末端にタグ（例えば、ＦＬＡＧ、ヘキサヒスチジンなど）の付加を可能にする発現ベクターにサブクローン化され得る。哺乳類細胞において遺伝子をトランスフェクト及び発現させる方法は、当技術分野において知られている。細胞を核酸で形質導入することは、例えば、核酸を含有する脂質微粒子を細胞と共にインキュベートすること、又は核酸を含有するウイルスベクターをベクターの宿主範囲内の細胞と共にインキュベートすることを含み得る。組織（例えば、腫瘍）又は血液試料からの細胞株及び培養細胞を含む、本開示において使用される細胞の培養は、当技術分野においてよく知られている。
対象抗体又は融合タンパク質をコードする核酸が単離されクローン化されると、当業者に知られている様々な組換え操作された細胞において核酸を発現させることができる。このような細胞の例としては、細菌、酵母、糸状菌、昆虫（例えば、バキュロウイルスベクターを用いる昆虫）、及び哺乳類細胞が挙げられる。
対象抗体又は融合タンパク質の単離及び精製は、当技術分野で既知の方法に従って達成することができる。例えば、タンパク質は、構成的にかつ／又は誘導の際にタンパク質を発現するように遺伝子修飾された細胞の溶解物から、又は合成反応混合物から、免疫親和性精製（又はプロテインＬ若しくはＡを使用する沈殿）、非特異的に結合した物質を除去するための洗浄、及び特異的に結合した抗体の溶出によって単離することができる。単離された抗体又は融合タンパク質は、透析、及びタンパク質精製法において通常用いられる他の方法によって更に精製することができる。一実施形態では、抗体は、金属キレートクロマトグラフィー法を使用して単離され得る。本開示の抗体及び融合タンパク質は、上記で考察したように、単離を容易にするための修飾を含み得る。
抗体及び融合タンパク質は、実質的に純粋な形態又は単離された形態（例えば、他のポリペプチドを含まない）で調製されてもよい。タンパク質は、存在し得る他の成分（例えば、他のポリペプチド又は他の宿主細胞成分）と比較してポリペプチドが濃縮された組成物中に存在することができる。精製抗体及び融合タンパク質は、抗体又は融合タンパク質が他の発現タンパク質を実質的に含まない組成物中に存在するように、例えば、組成物の９０％未満、通常は６０％未満、より通常は５０％未満が他の発現タンパク質で構成されるように提供され得る。
原核細胞によって産生された抗体及び融合タンパク質は、適切な折り畳みのためにカオトロピック剤への曝露を必要とし得る。大腸菌からの精製中に、例えば、発現タンパク質は、任意選択で変性され得、次いで再生され得る。これは、例えば、グアニジンＨＣｌなどのカオトロピック剤中で細菌が産生した抗体及び融合タンパク質を可溶化することによって達成することができる。次いで、抗体又は融合タンパク質は、ゆっくりした透析又はゲル濾過のいずれかによって再生される。あるいは、抗体及び融合タンパク質をコードする核酸は、抗体及び融合タンパク質が正確に折り畳まれた形態で周辺質に分泌されるように、ｐｅｌＢなどの分泌シグナル配列に作動可能に連結され得る。
本開示はまた、本開示の抗体及び融合タンパク質を産生する細胞を提供し、好適な細胞は、真核細胞、例えば、哺乳類細胞を含む。例えば、本開示は、本開示の抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子修飾された組換え宿主細胞（本明細書では「遺伝子修飾宿主細胞」とも呼ばれる）を提供する。
ハイブリドーマの生成を回避する抗体分子の抗原結合領域の組換えＤＮＡバージョンを作製するための技術もまた、本明細書において企図される。ＤＮＡは、例えば、細菌発現系（例えば、バクテリオファージ）、酵母発現系（例えば、サッカロミセス又はピキア）、昆虫発現系又は哺乳類発現系にクローン化される。好適な技術の一例は、発現抗体（例えば、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ）を細胞膜周辺腔（細菌細胞膜と細胞壁との間）に移動させるか、又は分泌させるリーダー配列を有するバクテリオファージラムダベクター系を使用する。目的の抗原と結合するものに対して、多数の機能的断片（例えば、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ）を迅速に生成することができる。
ＶＶ Ｂ５を特異的に結合する抗体及び融合タンパク質は、組換え、ファージディスプレイ技術、選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野で知られている多種多様な技術を使用して調製することができる。例えば、抗体は、ファージディスプレイの方法を使用して作製及び単離され得る。ファージディスプレイは、タンパク質相互作用のハイスループットスクリーニングに使用される。ファージを利用して、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを表示してもよい。ＶＶ Ｂ５と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、ＶＶ Ｂ５を用いて、例えば、固体表面又はビーズに結合又は捕捉された標識ＶＶ Ｂ５を使用して選択又は同定することができる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖ（軽鎖又は重鎖由来の個々のＦｖ領域）、又はジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されるｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。大規模なファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換えと同様に、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の産生が知られている。別の実施形態では、リボソームディスプレイは、ディスプレイプラットフォームとしてバクテリオファージを置き換えるために使用することができる。細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングしてもよい。このような手順は、モノクローナル抗体の単離及びその後のクローン化のための従来のハイブリドーマ技術に対する代替法を提供する。
ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、全抗体又は任意の所望の抗原断片を生成するために使用し、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主において発現させることができる。例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦａｂ’断片を組換え的に産生するための技術は、当技術分野で既知の方法を使用して使用され得る。
核酸、発現ベクター、及び細胞
本開示の抗体及び融合タンパク質を産生する方法に関する上記のセクションを考慮して、本開示はまた、核酸、発現ベクター及び細胞を提供することが理解されるであろう。
特定の実施形態では、提供されるのは、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体又は融合タンパク質、例えば、上記のような抗体及び融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）のうちのいずれかの、可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、又はその両方をコードする核酸である。いくつかの実施形態によれば、抗体は単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、核酸は単鎖抗体をコードする。いくつかの実施形態によれば、提供されるのは、本開示のＣＡＲ、例えば、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体のＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドを含む単鎖抗体と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲをコードする核酸である。そのような単鎖抗体、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインの例は、上記で詳細に説明されている。
本開示の核酸のいずれかを含む発現ベクターも提供される。本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体及び融合タンパク質をコードする天然又は合成の核酸の発現は、抗体又は融合タンパク質をコードする核酸をプロモータ（構成的又は誘導性のいずれか）に作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込んで組換え発現ベクターを生成することによって達成することができる。ベクターは、原核生物、真核生物、又はその両方における複製及び組込みに適する可能性がある。典型的なクローン化ベクターは、機能的に適切に配向された転写及び翻訳ターミネータ、開始配列、並びに抗体をコードする核酸の発現の調節に有用なプロモータを含有する。ベクターは、任意選択で、少なくとも１つの独立したターミネータ配列、例えば、シャトルベクターにおいて見出されるような、真核生物及び原核生物の両方においてカセットの複製を可能にする配列、並びに原核生物系及び真核生物系の両方についての選択マーカを含む、一般的な発現カセットを含む。
本開示の核酸及び／又は発現ベクターのいずれかを含む細胞も提供される。いくつかの実施形態によれば、本開示の細胞は、抗体のＶＨポリペプチド及び抗体のＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む。特定のこのような実施形態では、抗体は、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、核酸は、単鎖抗体をコードする。いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドをコードする第１の核酸と、抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドをコードする第２の核酸と、を含む細胞が提供される。特定の実施形態では、例えば細胞は、第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む。
本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体又は融合タンパク質を作製する方法も提供され、この方法は、抗ＶＶ Ｂ５又は融合タンパク質を発現する細胞に好適な条件下で本開示の細胞を培養することを含み、このとき抗体又は融合タンパク質が産生される。抗体又は融合タンパク質が発現されるように細胞を培養するための条件は、変化し得る。そのような条件は、好適な容器（例えば、細胞培養プレート又はそのウェル）内で、好適な培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２などの細胞培養培地）において、好適な温度（例えば、３２℃～４２℃（３７℃など））及びｐＨ（例えば、ｐＨ７．０～７．７（ｐＨ７．４など））で、好適なＣＯ２のパーセンテージ、例えば、３％～１０％（５％など））を有する環境において、細胞を培養することを含み得る。
組成物
上で要約したように、本開示は組成物も提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示の組成物は、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを含む。例えば、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートは、上記の抗ＶＶ Ｂ５抗体のセクションに記載されている抗体、融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）又はコンジュゲートのうちのいずれかであり得、その記載は組み込まれるが、簡潔にするためにここでは繰り返されない。
特定の態様では、本開示の組成物は、液体培地中に存在する抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを含む。液体培地は、水、緩衝液などの水性液体培地であってもよい。塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（トリス緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など）、可溶化剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０などの非イオン性洗浄剤）、ヌクレアーゼ抑制剤、プロテアーゼ抑制剤、グリセロール、キレート剤などの、１つ以上の添加剤が、このような組成物中に存在してもよい。
本開示の態様は、医薬組成物を更に含む。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗原抗体（又はそれを含むコンジュゲート若しくは融合タンパク質）と、薬学的に許容可能な担体と、を含む。
抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）又はコンジュゲートは、治療投与のための種々の製剤に組み込むことができる。より具体的には、抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートは、適切な薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤との組み合わせによって、医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、注射剤、吸入剤、エアロゾルなどの固体、半固体、液体又はガス状形態の製剤に製剤化することができる。
個体への投与のための（例えば、ヒト投与に好適な）抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートの製剤は、一般に無菌であり、さらに、検出可能な発熱物質、又は選択された投与経路による患者への投与が禁忌である他の混入物を含んでいない状態であり得る。
薬学的剤形において、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートは、それらの薬学的に許容される塩の形態で投与することができるか、又はそれらは、単独で若しくは他の薬学的に活性な化合物との、適切な会合、及び組み合わせでも使用され得る。以下の方法及び担体／賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。
経口剤については、抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートは、単独で、又は錠剤、粉末、顆粒、若しくはカプセルを作製するための適切な添加剤、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、若しくはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、若しくはゼラチンなどの結合剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、若しくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、タルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、並びに必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、及び香味剤と組み合わせて使用することができる。
抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートは、非経口（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、大脳内、脳室内、髄腔内、皮下など）投与用に製剤化することができる。特定の態様では、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートは、植物油若しくは他の類似の油、合成脂肪族グリセリド、高級脂肪酸のエステル、又はプロピレングリコールなどの水性溶媒又は非水性溶媒に抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを溶解、懸濁若しくは乳化することによって、また必要であれば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤及び防腐剤等の通常の添加剤を用いて、注射用に製剤化することができる。
抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを含む医薬組成物は、所望の純度を有する抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤及び／又は等張化剤と混合することによって調製することができる。許容可能な担体、賦形剤、及び／又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン、及びクエン酸を含む抗酸化剤；（エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロル－ｍ－クレゾール、メチルパラベン若しくはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、又はこれらの組み合わせなどの）防腐剤；アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、及びこれらの組み合わせなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；ゼラチン若しくは血清アルブミンなどのタンパク質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコサミン、ガラクトサミン、及びノイラミン酸などの糖類、並びに／又はＴｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、又は凍結乾燥形態から再構成された液体形態であってもよく、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液で再構成される。凍結乾燥された組成物を再構成するための標準的な手順は、ある体積の（典型的には、凍結乾燥中に除去された体積に等しい）純水を添加し戻すことであるが、抗菌剤を含む溶液は、非経口投与用の医薬組成物の産生に使用され得る。
抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートの水性製剤は、例えば、約４．０～約７．０、又は約５．０～約６．０の範囲、又は代替的に、約５．５のｐＨで、ｐＨ緩衝溶液中で調製することができる。この範囲内のｐＨに好適な緩衝剤の例としては、リン酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、及び他の有機酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤濃度は、例えば、緩衝剤及び製剤の所望の張度に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、又は約５ｍＭ～約５０ｍＭであってもよい。
等張化剤は、製剤の張度を調節するために含まれてもよい。等張化剤の例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、及びアミノ酸、糖、並びにこれらの組み合わせの群からの任意の成分が挙げられる。いくつかの実施形態において、水性製剤は、等張液であるが、高張液又は低張液が好適であってもよい。「等張性」という用語は、生理的食塩水又は血清など、それが比較されるいくつかの他の溶液と同じ張度を有する溶液を意味する。等張化剤は、約５ｍＭ～約３５０ｍＭの量で、例えば、１００ｍＭ～３５０ｍＭの量で使用され得る。
また、界面活性剤を製剤に添加して、製剤中の凝集を低減させ、かつ／又は微粒子の形成を最小限に抑え、かつ／又は吸着を低減させてもよい。界面活性剤の例には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。好適なポリオキシエチレンソルビタン－脂肪酸エステルの例としては、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標）の商標で販売されている）及びポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標）の商標で販売されている）である。好適なポリエチレン－ポリプロピレンコポリマーの例としては、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８又はＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（商標）の名称で販売されているものである。好適なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例としては、Ｂｒｉｊ（商標）の商標で販売されているものである。界面活性剤の濃度の例は、約０．００１％～約１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。
凍結乾燥保護剤はまた、凍結乾燥プロセス中の不安定化条件から抗体及び／又はＴ細胞活性化剤を保護するために添加されてもよい。例えば、既知の凍結乾燥保護剤としては、糖（グルコース及びスクロースを含む）、ポリオール（マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールを含む）、及びアミノ酸（アラニン、グリシン、及びグルタミン酸を含む）が挙げられる。凍結乾燥保護剤は、約１０ｍＭ～５００ｎＭの量で含むことができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲート、及び上記で特定される成分（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤）のうちの１つ以上を含み、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチル又はプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及びこれらの組み合わせなどの、１つ以上の防腐剤を本質的に含まない。他の実施形態では、防腐剤は、例えば、約０．００１～約２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で製剤中に含まれる。
キット
本開示の態様は、キットをさらに含む。特定の実施形態では、キットは、本開示の方法、例えば、抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）又はコンジュゲートを、個体のワクシニアウイルス感染細胞（非限定的にがん細胞を含む）に標的化するために、本開示の医薬組成物を個体に投与することを含む方法を実施する際の使用が見出される。
したがって、特定の実施形態では、本開示のキットは、本開示の医薬組成物のうちのいずれかと、医薬組成物をそれを必要とする個体に投与するための説明書と、を含む。キットに含まれる医薬組成物は、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質、及び／又はコンジュゲートのうちのいずれか、例えば、上記の抗体、融合タンパク質、及び／又はコンジュゲートのうちのいずれかを含み得る。理解されるように、本開示のキットは、簡潔にするために本明細書で繰り返されない、対象とする抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質、コンジュゲート及び組成物に関連するセクションで上記に記載された薬剤及び特徴のうちのいずれかを含み得る。
本開示のキットは、単位投与量、例えば、アンプル、又は複数回投与量形式で存在する、ある量の組成物を含み得る。したがって、特定の実施形態では、キットは、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質、及び／又はコンジュゲートを含む組成物の１つ以上の（例えば、２つ以上の）単位投与量（例えば、アンプル）を含み得る。「単位用量」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト及び動物対象のための単位用量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果を生じるのに十分な量で計算された所定の量の組成物を含有する。単位投与量の量は、用いられる特定の抗体、融合タンパク質及び／又はコンジュゲート、達成されるべき効果、並びに個体における抗体、融合タンパク質及び／又はコンジュゲートと関連する薬力学などの様々な要因に依存する。更に他の実施形態では、キットは、組成物の単回複数回投与量を含み得る。
特定の実施形態では、本開示のキットは、医薬組成物中に存在する抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを、個体中のＶＶ感染細胞に標的化するための説明書を含む。いくつかの実施形態によれば、感染細胞は、例えば、医薬組成物を個体に投与することにより、（例えば、個体のがんを治療するための）がんを有する個体のＶＶ感染がん細胞であり、個体はＶＶに感染したがん細胞を含み、抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）又はコンジュゲートは、感染したがん細胞の表面上に発現するＶＶ抗原によって感染したがん細胞に標的化される。
いくつかの実施形態によれば、本開示のキットは、ＶＶ（例えば、ＪＸ－５９４、ＧＬ－ＯＮＣ１、ウエスタンリザーブ、ワイス、リスター、コペンハーゲン、天壇、パトワダンガル、及び改変ワクシニアウイルスアンカラなどから選択されるＶＶの株）を含む医薬組成物を更に含み得る。そのようなキットは、例えば、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを含む医薬組成物を投与する前に、個体の細胞に感染する（例えば、がんを有する個体のがん細胞に感染する）のに有効な量のＶＶを含む医薬組成物を、がんを有する個体に投与するための説明書を更に含み得る。
本キットに含まれる説明書（例えば、使用説明書（ＩＦＵ））は、好適な記録媒体に記録され得る。例えば、説明書は、紙又はプラスチックなどの基材上に印刷することができる。そのようなものとして、説明書は、添付文書としてキット内に、キットの容器又はその構成要素のラベル（すなわち、包装又は副包装に関連）などに存在し得る。他の実施形態では、説明書は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどの適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する、電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキットには存在しないが、例えばインターネットを介してリモートソースから説明書を取得するための手段が提供される。本実施形態の一例は、説明書を見ることができ、かつ／又は説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るための手段は、好適な基材上に記録される。
方法
本開示の態様は、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）及びコンジュゲートを使用する方法を更に含む。本方法は、インビトロ及び／若しくはインビボ研究並びに／又は臨床用途を含む種々の状況で有用である。
特定の態様では、提供されるのは、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体（そのような抗体を含む融合タンパク質又はコンジュゲートのうちのいずれかを含む）のうちのいずれかを含む有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む方法であり、個体は、抗体が結合するＶＶ Ｂ５抗原をコードするＶＶに感染した細胞を含み、抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートは、感染した細胞の表面上に発現するＶＶ Ｂ５抗原によって感染した細胞に標的化される。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、医薬組成物を個体に投与する前に、有効量のＶＶを個体に投与することによって細胞に感染させることを更に含む。
感染した細胞表面（例えば、感染したがん細胞表面）上に結合すると、抗ＶＶ Ｂ５抗体（又は融合タンパク質又はそれを含むコンジュゲート）は、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）で補体を動員することによって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＰ）を介して、エピトープ拡散を介して、又は他の何らかのメカニズムによって、細胞傷害を誘導する可能性がある。抗体は、Ｆｃ領域において改変されて、所望の又は増強されたエフェクター機能を提供し得る。これは、抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成することができる。代替的に、副作用又は治療上の合併症を最小限に抑えるために、エフェクター機能を排除又は低減することが望ましい場合、特定の他のＦｃ領域を使用することができる。
いくつかの実施形態によれば、提供されるのは、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体（そのような抗体を含む融合タンパク質又はコンジュゲートのうちのいずれかを含む）のうちのいずれかを含む有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む方法であり、個体は、抗体が結合するＶＶ Ｂ５抗原をコードするＶＶに感染したがん細胞を含み、抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートは、感染したがん細胞の表面上に発現するＶＶ Ｂ５抗原によって感染したがん細胞に標的化される。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、医薬組成物を個体に投与する前に、有効量のＶＶを個体に投与することによってがん細胞に感染させることをさらに含む。そのような方法は、例えば、個体のがんを治療する上での使用が見出される。
特定の実施形態では、医薬組成物は、本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体コンジュゲートのうちのいずれかを含む。例えば、医薬組成物は、抗ＶＶ Ｂ５抗体が、インビボイメージング剤である検出可能な標識又は放射性同位体にコンジュゲートされているコンジュゲートを含み得る。そのような方法は、インビボイメージング剤を使用して、個体の感染した細胞（例えば、感染したがん細胞）をイメージングすることを更に含み得る。検出可能な標識又は放射性同位体を含むコンジュゲートを個体に投与する方法は、例えば、診断、予後及び／又は治療（例えば、抗がん療法）を監視する目的で、個体の細胞（例えば、がん細胞）をイメージングする上での使用が見出される。
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、本開示のコンジュゲートを含み得、抗ＶＶ Ｂ５抗体は、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、治療用放射性同位体、及び抗体のインビボイメージングを可能にする放射性同位体から選択される薬剤にコンジュゲートされている。薬剤は、上記のコンジュゲートのセクションで説明されているような薬剤であればいずれでもよい。
特定の実施形態では、ＶＶ Ｂ５抗原に特異的に結合するＣＡＲを、個体のＶＶ感染細胞（例えば、ＶＶ感染がん細胞）に標的化する方法が提供される。そのような方法は、本開示のＣＡＲを含む有効量の医薬組成物を個体に投与することを含み、個体の標的細胞は、ＶＶに感染し、それらの表面上にＶＶ Ｂ５抗原を発現する。ＣＡＲは、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージなどのような免疫細胞の表面上に発現され得る。例えば、ＣＡＲは、Ｔ細胞の表面上に存在する可能性があり、本方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞を個体の感染した細胞（例えば、がん細胞）に標的化する方法である。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、医薬組成物を個体に投与する前に、有効量のＯＶを個体に投与することによって細胞（例えば、がん細胞）に感染させることを更に含む。そのような方法は、例えば、個体のがんを治療する上での使用が見出される。
表面上にＣＡＲを発現する細胞を含む医薬組成物は、種々の方法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで細胞をトランスフェクトすることによって産生される。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞であり、その結果、ＣＡＲ Ｔ細胞を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、そのような方法は、Ｔ細胞の集団（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法が投与される個体から得られるＴ細胞）を活性化することと、Ｔ細胞の集団を刺激して増殖させることと、ＣＡＲをコードするウイルスベクターをＴ細胞に形質導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターを、Ｔ細胞に形質導入する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入される。
本開示の細胞は、自家（autologous）／自己（autogeneic）（「自己（self）」）又は非自家（non-autologous）（「非自己（non-self）」、例えば、同種異系、同系若しくは異種）であり得る。本明細書で使用される「自家（autologous）」は、同じ個体からの細胞を指す。本明細書で使用される「同種異系」は、比較して細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同系」は、比較して細胞と遺伝的に同一である異なる個体の細胞を指す。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物から得られたＴ細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は霊長目である。いくつかの実施形態では、霊長目はヒトである。
Ｔ細胞は、末梢血、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織、及び腫瘍を含むがこれらに限定されない多くの供給源から得ることができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、沈降、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの任意の数の既知の技術を使用して、個体から収集された血液の単位から得ることができる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の単離又は精製された集団が使用される。いくつかの実施形態では、ＴＣＴＬ及びＴＨリンパ球は、ＰＢＭＣから精製される。いくつかの実施形態では、ＴＣＴＬ及びＴＨリンパ球は、活性化、増殖、及び／又は遺伝子改変の前又は後のいずれかで、ナイーブ（ＴＮ）、メモリー（ＴＭＥＭ）、及びエフェクター（ＴＥＦＦ）Ｔ細胞亜集団に分類される。このような選別のための適切なアプローチは公知であり、例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）が挙げられ、ここで、ＴＮは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５－であり、ＴＳＣＭはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋であり、ＴＣＭはＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋であり、ＴＥＭはＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ９５＋である。このような選別のアプローチ例は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｂｌｏｏｄ １２７（２４）：２９８０－９０に記載されている。
いくつかの実施形態では、以下のマーカ：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団は、陽性又は陰性選択技術によってさらに単離され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、又はＣＤ３８若しくはＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つ以上のマーカを発現する、Ｔ細胞の特定の亜集団は、陽性選択又は陰性選択技術によって更に分離される。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞組成物は、以下のマーカのうちの１つ以上を発現しない：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞組成物は、以下のマーカのうちの１つ以上を実質的に発現しない：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３。
Ｔ細胞組成物の治療上有効な用量を達成するために、Ｔ細胞は、１回以上の刺激、活性化及び／又は増殖に供され得る。Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、及び同第６，８６７，０４１号に記載されているような方法を一般的に使用して、活性化及び増殖させることができ、これらの開示は全ての目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、約１～２１日間、例えば、約５～２１日間活性化及び増殖される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）をＴ細胞に導入する前に、約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約３日、約２日～約４日、約３日～約４日、又は約１日、約２日、約３日若しくは約４日間活性化及び増殖される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）をＴ細胞に導入する前に、約６時間、約１２時間、約１８時間、又は約２４時間活性化及び増殖される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）がＴ細胞に導入されると同時に活性化される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞培養に適切な条件には、適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又は、Ｘ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））、並びに血清（例えば、ウシ胎児又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ及びＴＮＦ－α、又は当業者に知られている細胞の成長に好適な他の任意の添加剤を含むが、これらに限定されない、増殖及び生存に必要な１つ以上の因子が含まれる。細胞培養培地のさらなる例示的な例には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及びビタミンが添加され、無血清であるか、あるいは適切な量の血清（若しくは血漿）又は定義されたホルモンのセット、及び／又はＴ細胞の成長と増殖に十分な量のサイトカインが補充されているＲＰＭＩ １６４０、Ｃｌｉｃｋ、ＡＥＶＩ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５及びＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）は、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、ヒートショック、エレクトロポレーション、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストランを介した移入などによって細胞（例えば、Ｔ細胞）内に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）は、ＡＡＶ形質導入によって細胞（例えば、Ｔ細胞）内に導入される。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からのＩＴＲ、及びＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶ１０のいずれか１つからの血清型を含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からのＩＴＲ及びＡＡＶ６からの血清型を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸（例えば、発現ベクター）は、レンチウイルス又はレトロウイルスの形質導入によって細胞（例えば、Ｔ細胞）内に導入される。レンチウイルスベクターバックボーンは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、又はサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来し得る。レンチウイルスベクターは、組込み能力があるか、又はインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＴＤＬＶ）であり得る。一実施形態では、ＨＩＶベースのベクターバックボーン（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列要素）を含むＩＤＬＶベクターが使用される。
特定の態様では、ＶＶ Ｂ５抗原に特異的に結合するコンジュゲートを、個体におけるＶＶ感染細胞（例えば、ＶＶ感染がん細胞）に標的化する方法が提供される。そのような方法は、抗ＶＶ Ｂ５抗体を含むコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を個体に投与することを含み、標的細胞（例えば、がん細胞）は、ＶＶに感染し、それらの表面上にＶＶ Ｂ５抗原を発現する。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、医薬組成物を個体に投与する前に、有効量のＶＶを個体に投与することによって細胞（例えば、がん細胞）に感染させることを更に含む。そのような方法は、例えば、個体のがんを治療する上での使用が見出される。
特定の態様では、ＶＶに感染した細胞（例えば、がん細胞）を含む医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。医薬組成物は、感染細胞、例えば、がん細胞によって発現されるＶＶ Ｂ５抗原と特異的に結合する本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体、コンジュゲート又は融合タンパク質を更に含み得る。細胞（例えば、がん細胞）は、手術中に個体から除去されている可能性がある。細胞（例えば、がん細胞）は、患者に投与されたときに免疫系によって攻撃される可能性が高くなるように、実験室で変更（及び殺滅）されている可能性がある。次に、患者の免疫系は、体内に残っている細胞及び同様の細胞を攻撃する。本開示の抗体、コンジュゲート又は融合タンパク質をこのアプローチに従って用いて、プロフェッショナルＡＰＣ上のＦｃ受容体による腫瘍粒子／抗原の取り込みを促進し、腫瘍に対する免疫応答を増強することができる。
本医薬組成物は、様々な個体のうちのいずれかに投与され得る。特定の態様では、個体は、「哺乳動物」又は「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食動物（例えば、イヌ及びネコ）、齧歯類（例えば、マウス、モルモット、及びラット）、及び霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、及びサル）を含む哺乳綱内にある生物を記載するために広く使用される。いくつかの実施形態において、個体は、ヒトである。特定の態様では、個体は、がんなどの細胞増殖性障害の動物モデル（例えば、マウスモデル、霊長類モデルなど）である。
それを必要としている個体は、細胞増殖性障害を有する可能性がある。「細胞増殖性障害」とは、多細胞生物の細胞における１つ以上のサブセットの望ましくない細胞増殖が起こり、生物にとっての害（例えば、痛み又は平均余命の低下）をもたらす障害を意味する。細胞増殖性障害には、がん、前がん、良性腫瘍、血管増殖性障害（例えば、関節炎、再狭窄など）、線維性障害（例えば、肝性肝硬変、アテローム性動脈硬化症など）、乾癬、表皮及び類皮嚢胞、脂肪腫、腺腫、毛細血管及び皮膚血管腫、リンパ管腫、損傷性母斑（nevi lesions）、奇形腫、腎腫、筋線維腫症、骨形成腫瘍、形成異常腫瘤（dysplastic masses）、メサンギウム細胞増殖性障害などが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、個体はがんを有する。対象の方法は、多種多様ながんの治療に用いることができる。本明細書で使用される「腫瘍」は、悪性又は良性にかかわらず、全ての新生物細胞の増殖及び増殖、並びに全ての前がん性及びがん性の細胞及び組織を指す。「がん」及び「がん性」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか又は説明する。主題の方法を使用して治療することができるがんの例には、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、及び肉腫が含まれるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例には、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、胆管がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、大腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん若しくは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰外陰部がん、甲状腺がん、肝臓がん、様々なタイプの頭頸部がんなどが挙げられる。特定の実施形態では、個体は、固形腫瘍、再発性多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、非小細胞肺がん、転移性黒色腫、黒色腫、腹膜がん、上皮性卵巣がん、多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、転移性結腸直腸がん、結腸直腸がん、膵管腺がん、扁平上皮がん、食道がん、胃がん、神経芽細胞腫、ファロピウス管がん、膀胱がん、転移性乳がん、膵臓がん、軟組織肉腫、再発性頭頸部がん扁平上皮がん、頭頸部がん、未分化星状細胞腫、悪性胸膜中皮腫、乳がん、扁平上皮非小細胞肺がん、横紋筋肉腫、転移性腎細胞がん、基底細胞がん（基底細胞上皮腫）、及び神経膠肉腫から選択されるがんを有する。特定の態様では、個体は、黒色腫、ホジキンリンパ腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、膀胱がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、及び頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）から選択されるがんを有する。
本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質及びコンジュゲートは、経口（例えば、錠剤形態、カプセル形態、液体形態など）、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、筋肉内、若しくは硬膜外注射）、局所、鼻腔内、又は腫瘍内投与から選択される投与経路を介して投与され得る。
本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質及びコンジュゲートは、治療有効量で医薬組成物として投与することができる。「治療有効量」とは、所望の結果をもたらすのに十分な用量を意味し、例えば、対照と比較して、症状の軽減などの有益な又は所望の治療結果（予防的な結果を含む）をもたらすのに十分な量を意味する。がんに関して、いくつかの実施形態では、治療有効量は、腫瘍の成長を遅らせる、腫瘍のサイズを縮小する、及び／又は同様のことをするのに十分である。有効量は、１回以上の投与で投与することができる。
上記のように、本開示の態様は、固体、例えば、個体のがんを治療するための方法を含む。治療とは、少なくとも個体の病状（例えば、がん）と関連する１つ以上の症状の改善を意味し、改善は、パラメータ、例えば、少なくとも治療される病状（例えば、がん）と関連する症状の程度の軽減を指すために広義で使用される。したがって、治療はまた、個体が、病状（例えば、がん）又は少なくとも病状（例えば、がん）を特徴付ける症状にそれ以上苦しむことがないように、病状（例えば、がん）又は少なくとも１つ以上のそれと関連付けられる症状が、完全に阻害された、例えば、発生することを防止された、又は停止された、例えば、中止された状況も含む。
本開示の抗ＶＶ Ｂ５抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートは、単独で、又は第２の薬剤と組み合わせて、個体に投与することができる。目的の第２の薬剤には、がんの治療に使用するために米国食品医薬品局及び／又は欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって承認された薬剤が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。目的の免疫チェックポイント阻害剤には、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）阻害剤、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）阻害剤、プログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）阻害剤、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）阻害剤、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）阻害剤、インドールアミン（２，３）－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）阻害剤を含むＴ細胞免疫受容体、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）阻害剤、Ｂ７－Ｈ３阻害剤、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本開示の抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートが第２の薬剤とともに投与される場合、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲート及び第２の薬剤は、任意の好適な投与レジメンに従って個体に投与され得る。特定の実施形態によれば、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲート及び第２の治療剤は、個々の使用のために承認された投薬レジメンに従って投与される。いくつかの実施形態では、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートの投与は、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを投与せずに第２の薬剤が投与される場合に使用されるのと比較して、１回以上の低用量及び／又は低頻度の投与、及び／又はサイクル数の減少を伴う投薬レジメンに従って投与されるよう、第２の薬剤を個体に投与することを可能にする。特定の態様では、第２の薬剤の投与は、第２の薬剤を投与せずに抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートが投与される場合に使用されるのと比較して、抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートが、１回以上の低用量及び／又は低頻度の投与、及び／又はサイクル数の減少を伴う投薬レジメンに従って投与されることを可能にする。
いくつかの実施形態では、１回以上の用量の抗体、融合タンパク質又はコンジュゲート及び第２の薬剤は、個体に同時に投与される。「同時に」とは、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートと第２の薬剤が同じ医薬組成物中に存在するか、又は抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートと第２の薬剤が１時間以下、３０分以下、又は１５分以下以内に別個の医薬組成物として投与されることを意味する。
いくつかの実施形態では、１回以上の用量の抗体、融合タンパク質又はコンジュゲート及び第２の薬剤は、個体に連続して投与される。
いくつかの実施形態において、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲート及び第２の薬剤は、異なる組成で及び／又は異なる時間に個体に投与される。例えば、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートは、第２の治療剤の投与の前に（例えば、特定のサイクルで）投与されてもよい。代替的に、第２の治療剤は、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートの投与の前に（例えば、特定のサイクルで）投与されてもよい。投与され得る第２の薬剤は、投与され得る第１の薬剤投与後の少なくとも１時間後、３時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、又は最長５日以上後に開始する期間に投与されてもよい。
一例では、第２の薬剤は、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートの投与前に、望ましい期間、個体に投与される。特定の態様では、そのようなレジメンは、がん細胞を「プライミング」して、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートの抗がん効果を増強する。抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを投与するステップから第２の薬剤を投与するステップを分離するそのような期間は、望ましくは、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートの抗がん効果が増加するように、がん細胞のプライミングを可能にするのに十分な長さである。
いくつかの実施形態では、１つの薬剤の投与は、別の薬剤の投与に対して特異的なタイミングである。例えば、いくつかの実施形態では、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートは、特定の効果が観察される（又は、例えば、所与の投薬レジメンと目的の特定の効果との間の相関を示す集団研究に基づいて観察されると予想される）ように投与される。
ある特定の態様では、組み合わせて投与される薬剤の所望の相対的投与計画は、例えば、エクスビボの、インビボの、及び／又はインビトロのモデルを使用して、評価又は経験的に決定され得る。いくつかの実施形態では、このような評価又は経験的決定は、（例えば、相関が確立されるように）患者集団においてインビボで、又は代替的に、目的の特定の個体において行われる。
いくつかの実施形態では、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲート及び第２の薬剤は、少なくとも２サイクルを含む断続的な投薬レジメンに従って投与される。２つ以上の薬剤が組み合わされて投与され、各々がこのような断続的、周期的な計画によって投与される場合、異なる薬剤の個々の用量は、互いに組み合わせられ得る。特定の態様では、第２の薬剤の１回以上の用量は、第１の薬剤の１回の用量後、ある期間に投与される。いくつかの実施形態では、第２の薬剤の各用量は、第１の薬剤の用量の一定期間後に投与される。特定の態様において、第１の薬剤の各用量の後の一定期間後に、第２の薬剤の用量が続く。いくつかの実施形態において、第１の薬剤の２回以上の用量は、第２の薬剤の少なくとも一対の用量の間に投与され、特定の態様では、第２の薬剤の２回以上の用量は、第１の薬剤の少なくとも一対の用量の間に投与される。いくつかの実施形態において、同じ薬剤の異なる用量は、共通の時間間隔によって隔てられ、いくつかの実施形態において、同じ薬剤の異なる用量間の時間間隔は、変化する。特定の態様では、異なる用量の抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲート及び第２の薬剤は、共通の時間間隔によって互いに隔てられており、いくつかの実施形態において、異なる薬剤の異なる用量は、異なる時間間隔によって互いに隔てられている。
２つの断続的な周期投与レジメンを組み合わせるための１つの例示的なプロトコールは、（ａ）治療有効量の抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートが個体に投与される第１の投与期間、（ｂ）第１の休止期間、（ｃ）治療有効量の第２の薬剤が個体に投与される第２の投与期間、及び（ｄ）第２の休止期間を含み得る。２つの断続的な周期投与レジメンを組み合わせるための第２の例示的なプロトコールは、（ａ）治療有効量の第２の薬剤が個体に投与される第１の投与期間、（ｂ）第１の休止期間、（ｃ）治療有効量の抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートが個体に投与される第２の投与期間、及び（ｄ）第２の休止期間を含み得る。
いくつかの実施形態では、第１の休止期間及び第２の休止期間は、同一の時間数又は日数に対応し得る。あるいは、いくつかの実施形態において、第１の休止期間と第２の休止期間とは異なり、第１の休止期間が第２の休止期間よりも長いか、又は、その逆である。いくつかの実施形態において、休止期間の各々は、１２０時間、９６時間、７２時間、４８時間、２４時間、１２時間、６時間、３０時間、１時間、又はそれ未満に対応する。いくつかの実施形態において、第２の休止期間が第１の休止期間よりも長い場合、それは、時間ではなく日数又は週数（例えば、１日、３日、５日、１週間、２週間、４週間、又はそれ以上）として定義することができる。
第１の休止期間の長さが、特定の生物学的事象又は治療事象の存在又は発生によって決定される場合、第２の休止期間の長さは、異なる要因に基づいて、別々に又は組み合わせて決定され得る。例示的なそのような因子には、治療が投与されるがんのタイプ及び／又は病期、抗体、融合タンパク質若しくはコンジュゲートの特性（例えば、薬物動態特性）、及び／又は抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートによる療法に対する患者の応答のうちの１つ以上の特徴が含まれ得る。いくつかの実施形態では、一方又は両方の休止期間の長さは、投与薬剤の一方又は他方の（例えば、血漿濃度レベルを介して評価されるような）薬物動態特性に照らして調整され得る。例えば、関連薬剤の血漿濃度が、任意選択で個体の応答の１つ以上の特徴の評価又は他の考慮時に所定のレベルを下回る場合、関連休止期間は完了したとみなされ得る。
特定の態様では、特定の薬剤が投与されるサイクル数は、経験的に決定され得る。また、いくつかの実施形態において、従った正確な計画（例えば、用量の数、用量の間隔（例えば、互いに対して、又は別の治療の投与などの別の事象に対して）、用量の量など）は、１つ以上の他のサイクルと比較して、１つ以上のサイクルについて異なり得る。
抗体、融合タンパク質又はコンジュゲート及び第２の薬剤は、任意の好適な投与経路を介して一緒に又は独立して投与することができる。抗体、融合タンパク質又はコンジュゲート及び第２の薬剤は、経口、（例えば、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、若しくは硬膜外注射による）局所、又は鼻腔内投与から独立して選択される投与経路を介して投与され得る。特定の実施形態によれば、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲート及び第２の薬剤は両方とも、経口的に（例えば、錠剤形態、カプセル形態、液体形態などで）同時（同じ医薬組成物若しくは別個の医薬組成物において）又は連続してかのいずれかで投与される。
ＶＶを個体に投与することによって標的細胞（例えば、がん細胞）に感染させることを方法が更に含む場合、がん細胞に感染させるために任意の好適な投与レジメンを用いることができる。特定の実施形態では、そのような方法は、ＶＶ及び医薬組成物を個体に同時に投与することを含む。同時投与は、様々な形態をとることができ、別々の組成物として、ＶＶを含む第１の組成物と、抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートを含む医薬組成物とを投与することを包含する。いくつかの実施形態によれば、同時投与は、同じ組成物中に存在する、ＶＶ及び抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートを投与することを含む。１つの非限定的な例において、融合タンパク質を発現する細胞（例えば、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞）は、ＶＶと同時に投与され、同時投与は、ＶＶに感染した細胞を個体に投与することを含む。例として、ＶＶに感染した本開示のＣＡＲ Ｔ細胞を個体に投与して、個体へのＶＶ及びＣＡＲ Ｔ細胞の同時投与を達成することができる。
特定の実施形態では、個体にＶＶを投与することによって標的細胞（例えば、がん細胞）を感染させることを方法が更に含む場合、標的細胞は、個体に医薬組成物を投与する前に個体にＶＶを投与することによって感染される。
任意の適切なアプローチが、個体における標的細胞（例えば、がん細胞）を感染させるために使用され得る。ポックスウイルスの複製は細胞質で起こり、これは、ウイルスが十分に複雑で、ゲノム複製に必要なすべての機能を獲得しているからである。細胞質に入ると、遺伝子発現はコアと会合するウイルス酵素によって実施される。発現は２つの段階に分けられる：初期遺伝子は約５０％のゲノムを表し、ゲノム複製の前に発現され、後期遺伝子はゲノム複製の後に発現される。発現の一時的な制御は、活性のＤＮＡ複製に依存する後期プロモータによって提供される。ゲノム複製は、自己プライミングすることにより、高分子量コンカテマーが形成され、その後、切断及び修復されてウイルスゲノムを作製すると考えられている。ウイルスの集合は細胞骨格で起こり、おそらく細胞骨格タンパク質（例えば、アクチン結合タンパク質）との相互作用を伴う。ウイルス粒子に成熟する細胞質に内包物が形成される。ワクシニアウイルスは、宿主細胞の細胞質でのみ複製するため、ＤＮＡウイルスの中でも独特である。したがって、ウイルスＤＮＡ複製に必要な様々な酵素やタンパク質をコードするには、大きいゲノムが必要である。複製中、ワクシニアは外膜が異なるいくつかの感染型を生成する：細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープビリオン（ＩＥＶ）、細胞関連エンベロープビリオン（ＣＥＶ）、及び細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ）。
標的細胞（例えば、がん細胞）をＶＶに感染させるために、ＶＶは好適な投与経路を使用して投与される。投与経路は、がんの位置及び性質によって異なり得、例えば、皮内、経皮、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、局所（例えば、腫瘍の近く、特に腫瘍の血管系若しくは隣接する血管系））、経皮、気管内、腹腔内、動脈内、膀胱内、腫瘍内、吸入、灌流、洗浄、並びに経口投与及び製剤化を含み得る。腫瘍内注射、又は腫瘍血管系への直接注射は、個別の、固形の、アクセス可能な腫瘍のために特に企図されている。局所（local）、局所（regional）又は全身投与も適切な場合がある。ウイルス粒子は、例えば、約１ｃｍ間隔で、腫瘍に複数回の注射を投与することによって有利に接触させることができる。連続投与はまた、適切な場合、例えば、腫瘍又は腫瘍血管系にカテーテルを移植することによって適用され得る。そのような連続灌流は、例えば、投与開始後、約１～２時間、約２～６時間、約６～１２時間、又は約１２～２４時間の期間にわたって起こり得る。投与レジメンは様々であり得、多くの場合、腫瘍のタイプ、腫瘍の位置、疾患の進行、及び患者の健康と年齢に依存する。特定のタイプの腫瘍はより積極的な治療を必要とするが、同時に、特定の患者はより多くの負担となるプロトコールに耐えることができない。臨床医はそのような決定を下すのに最も適している。
核酸構築物の注射は、発現構築物が注射に必要な針の特定のゲージを通過することができる限り、注射器又は溶液の注射に使用される任意の他の方法によって送達することができる。ＶＶの投与に使用され得る例示的な無針注射システムは、米国特許第５，８４６，２３３号に例示されている。このシステムは、溶液を保持するためのアンプルチャンバーを画定するノズルと、溶液をノズルから送達部位に押し出すためのエネルギーデバイスと、を特徴とする。別の例示的な注射器システムは、任意の深さで正確に所定量の溶液の複数回の注射を可能にするものである（米国特許第５，８４６，２２５号）。ＶＶ粒子又はそれをコードする核酸の混合物は、１つ以上の賦形剤、担体、又は希釈剤と好適に混合された水中で調製してもよい。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物、並びに油中で調製されてもよい。
医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルでＶＶベクターの用量を製剤化し始め、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させてもよい。代替的に、医師は、１回の用量のＶＶベクターを投与することによって治療レジメンを開始し、その後、治療効果が達成されるまで、例えば、１つ以上の腫瘍の体積の減少まで、漸進的により低い用量を投与してもよい。
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の実施形態によっても定義される。
１．ワクシニアウイルスＢ５抗原（ＶＶ Ｂ５）に特異的に結合する抗体であって、
配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドであって、ＶＨポリペプチドは、
Ｑ１Ｅ、Ｅ２Ｖ、Ｑ３Ｔ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｇ９Ｐ、Ｇ１０Ｖ、Ｋ１３Ｑ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｇ１６Ｅ、Ｓ１７Ｔ、Ｔ１９Ｒ、Ｔ２１Ｓ、Ｔ２３Ａ、Ａ４１Ｐ、Ｒ４４Ｋ、Ｇ４５Ａ、Ｔ７４Ｄ、Ｓ７５Ｎ／Ｔ、Ｓ７６＿Ｔ７７ｉｎｓＫ、Ｔ７７Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｑ、Ｖ７９Ｌ、Ｔ８０Ｙ／Ｖ、Ｑ８２Ｔ、Ｔ８４Ｎ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｌ８６Ｍ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８８Ｐ、Ａ８９Ｅ／Ｖ、Ｔ９３Ｖ、Ｆ９５Ｙ、Ｐ１１２Ｑ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の突然変異であって、ナンバリングは配列番号１に従う、突然変異と、
アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号１３）を含むＶＨ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡ（Ｎ／Ｄ）（Ｗ／Ｓ）（Ａ／Ｖ）ＫＧ（配列番号１４）を含むＶＨ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号１７）を含むＶＨ ＣＤＲ３と、含む、可変重鎖ポリペプチドと、
配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドであって、ＶＬポリペプチドは、
Ａ１Ｄ／Ｅ、Ｑ２Ｉ、Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ、Ｔ７Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｓ、Ｖ１１Ｌ、Ａ１３Ｌ、Ａ１４Ｓ、Ｖ１５Ｐ、Ｇ１７Ｄ／Ｅ、Ｔ１８Ｒ、Ｖ１９Ａ、Ｉ２１Ｌ、Ｓ２２Ｔ、Ｑ４４Ｋ、Ｐ４５Ａ／Ｖ、Ｎ４７Ｋ／Ｒ、Ｖ６０Ｉ、Ｓ６２Ａ、Ｋ６５Ｓ、Ｑ７２Ｅ／Ｄ、Ｄ７９Ｓ、Ｅ８１Ｑ、Ｃ８２Ｐ、Ｄ８３Ｅ、Ａ８５Ｆ／Ｖ、Ｔ８７Ｖ、Ｇ１０３Ｑ、Ｅ１０６Ｋ、Ｖ１０７Ｌ、Ｖ１０８Ｅ、Ｖ１０９Ｉ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の突然変異であって、ナンバリングは配列番号７に従う、突然変異と、
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号１８）を含むＶＬ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号１９）を含むＶＬ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号２０）を含むＶＬ ＣＤＲ３と、を含む、可変軽鎖ポリペプチドと、を含む、抗体。
２．ＶＨポリペプチドが、突然変異Ｅ２Ｖ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｒ４４Ｋ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８９Ｅ／Ｖ、及びＰ１１２Ｑのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、実施形態１に記載の抗体。
３．ＶＨポリペプチドが、突然変異Ｅ２Ｖ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｒ４４Ｋ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８９Ｅ／Ｖ、Ｐ１１２Ｑの各々を含む、実施形態２に記載の抗体。
４．Ｅ５Ｌ／Ｋ突然変異がＥ５Ｌである、実施形態２又は実施形態３に記載の抗体。
５．Ｅ１５Ｇ／Ｔ突然変異がＥ１５Ｇである、実施形態２～４のいずれか１つに記載の抗体。
６．Ｒ８５Ｓ／Ｎ突然変異がＲ８５Ｓである、実施形態２～５のいずれか１つに記載の抗体。
７．Ｔ８７Ｒ／Ｄ突然変異がＴ８７Ｒである、実施形態２～６のいずれか１つに記載の抗体。
８．Ａ８９Ｅ／Ｖ突然変異がＡ８９Ｅである、実施形態２～７のいずれか１つに記載の抗体。
９．ＶＨポリペプチドが、突然変異Ｑ１Ｅ、Ｋ１３Ｑ、Ｔ１９Ｒ、Ｔ２１Ｓ、Ｔ２３Ａ、Ｔ８４Ｎ、Ｔ９３Ｖ、及びＦ９５Ｙのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、実施形態２～８のいずれか１つに記載の抗体。
１０．ＶＨポリペプチドが、アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）を含むＶＨ ＣＤＲ２を含む、実施形態２～９のいずれか１つに記載の抗体。
１１．ＶＨポリペプチドが、突然変異Ｔ７４Ｄ、Ｓ７５Ｎ／Ｔ、Ｓ７６＿Ｔ７７ｉｎｓＫ、Ｔ７７Ｎ／Ｓ、Ｖ７９Ｌ、及びＴ８０Ｙ／Ｖのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、実施形態２～９のいずれか１つに記載の抗体。
１２．Ｔ７７Ｎ／Ｓ突然変異がＴ７７Ｎである、実施形態１１に記載の抗体。
１３．Ｔ８０Ｙ／Ｖ突然変異がＴ８０Ｙである、実施形態１１又は実施形態１２に記載の抗体。
１４．ＶＨポリペプチドが、アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）を含むＶＨ ＣＤＲ２を含む、実施形態１１～１３のいずれか１つに記載の抗体。
１５．ＶＨポリペプチドが、突然変異Ｑ３Ｔ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｇ９Ｐ、Ｇ１０Ｖ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｇ１６Ｅ、Ｓ１７Ｔ、Ａ４１Ｐ、Ｇ４５Ａ、Ｔ７４Ｄ、Ｓ７５Ｎ／Ｔ、Ｓ７６＿Ｔ７７ｉｎｓＫ、Ｔ７７Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｑ、Ｔ８０Ｙ／Ｖ、Ｑ８２Ｔ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｌ８６Ｍ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８８Ｐ及びＡ８９Ｅ／Ｖのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、実施形態２又は実施形態３に記載の抗体。
１６．Ｅ５Ｌ／Ｋ突然変異がＥ５Ｋである、実施形態１５に記載の抗体。
１７．Ｅ１５Ｇ／Ｔ突然変異がＥ１５Ｔである、実施形態１５又は実施形態１６に記載の抗体。
１８．Ｓ７５Ｎ／Ｔ突然変異がＳ７５Ｔである、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載の抗体。
１９．Ｔ７７Ｎ／Ｓ突然変異がＴ７７Ｓである、実施形態１５～１８のいずれか１つに記載の抗体。
２０．Ｔ８０Ｙ／Ｖ突然変異がＴ８０Ｖである、実施形態１５～１９のいずれか１つに記載の抗体。
２１．Ｒ８５Ｓ／Ｎ突然変異がＲ８５Ｎである、実施形態１５～２０のいずれか１つに記載の抗体。
２２．Ｔ８７Ｒ／Ｄ突然変異がＴ８７Ｄである、実施形態１５～２１のいずれか１つに記載の抗体。
２３．Ａ８９Ｅ／Ｖ突然変異がＡ８９Ｖである、実施形態１５～２２のいずれか１つに記載の抗体。
２４．ＶＨポリペプチドが、配列番号２～６のうちの１つに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の抗体。
２５．ＶＨポリペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、実施形態２～９のいずれか１つに記載の抗体。
２６．ＶＨポリペプチドが、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、実施形態１０に記載の抗体。
２７．ＶＨポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、実施形態１１～１３のいずれか１つに記載の抗体。
２８．ＶＨポリペプチドが、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、実施形態１４に記載の抗体。
２９．ＶＨポリペプチドが、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、実施形態１５～２３のいずれか１つに記載の抗体。
３０．ＶＬポリペプチドが、突然変異Ｔ７Ｓ、Ｐ１０Ｔ／Ｓ、Ｖ１１Ｌ、Ａ１４Ｓ、Ｇ１７Ｄ／Ｅ、Ｔ１８Ｒ、Ｐ４５Ａ／Ｖ、Ｎ４７Ｋ／Ｒ、Ｋ６５Ｓ、Ｑ７２Ｅ／Ｄ、Ｄ７９Ｓ、Ｃ８２Ｐ、Ａ８５Ｆ／Ｖ、Ｇ１０３Ｑ、Ｅ１０６Ｋ、Ｖ１０８Ｅ、及びＶ１０９Ｉのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の抗体。
３１．ＶＬポリペプチドが、突然変異Ｔ７Ｓ、Ｐ１０Ｔ／Ｓ、Ｖ１１Ｌ、Ａ１４Ｓ、Ｇ１７Ｄ／Ｅ、Ｔ１８Ｒ、Ｐ４５Ａ／Ｖ、Ｎ４７Ｋ／Ｒ、Ｋ６５Ｓ、Ｑ７２Ｅ／Ｄ、Ｄ７９Ｓ、Ｃ８２Ｐ、Ａ８５Ｆ／Ｖ、Ｇ１０３Ｑ、Ｅ１０６Ｋ、Ｖ１０８Ｅ、及びＶ１０９Ｉの各々を含む、実施形態３０に記載の抗体。
３２．ＶＬポリペプチドが、突然変異Ｇ１７Ｄ、Ｓ２２Ｔ、Ｑ４４Ｋ、Ｎ４７Ｋ、及びＥ８１Ｑのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、実施形態３０又は実施形態３１に記載の抗体。
３３．Ｐ１０Ｔ／Ｓ突然変異がＰ１０Ｔである、実施形態３０～３２のいずれか１つに記載の抗体。
３４．Ｐ４５Ａ／Ｖ突然変異がＰ４５Ａである、実施形態３０～３３のいずれか１つに記載の抗体。
３５．Ｑ７２Ｅ／Ｄ突然変異がＱ７２Ｅである、実施形態３０～３４のいずれか１つに記載の抗体。
３６．Ａ８５Ｆ／Ｖ突然変異がＡ８５Ｆである、実施形態３０～３５のいずれか１つに記載の抗体。
３７．ＶＬポリペプチドが、突然変異Ａ１Ｄ、Ｑ２Ｉ、Ｖ３Ｑ、及びＬ４Ｍのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載の抗体。
３８．ＶＬポリペプチドが突然変異Ｄ８３Ｅを含む、実施形態３０～３２のいずれか１つに記載の抗体。
３９．Ｐ１０Ｔ／Ｓ突然変異がＰ１０Ｓである、実施形態３０～３２又は３８のいずれか１つに記載の抗体。
４０．Ｐ４５Ａ／Ｖ突然変異がＰ４５Ｖである、実施形態３０～３２、３８、又は３９のいずれか１つに記載の抗体。
４１．Ｑ７２Ｅ／Ｄ突然変異がＱ７２Ｄである、実施形態３０～３２又は３８～４０のいずれか１つに記載の抗体。
４２．Ａ８５Ｆ／Ｖ突然変異がＡ８５Ｖである、実施形態３０～３２又は３８～４１のいずれか１つに記載の抗体。
４３．ＶＬポリペプチドが、突然変異Ａ１Ｄ、Ｑ２Ｉ、Ｖ３Ｑ、及びＬ４Ｍのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、実施形態３８～４２のいずれか１つに記載の抗体。
４４．ＶＬポリペプチドが、突然変異Ａ１Ｅ、Ｓ９Ａ、Ｐ１０Ｔ、Ａ１３Ｌ、Ｖ１５Ｐ、Ｇ１７Ｅ、Ｖ１９Ａ、Ｉ２１Ｌ、Ｐ４５Ａ、Ｎ４７Ｒ、Ｖ６０Ｉ、Ｓ６２Ａ、Ｑ７２Ｄ、Ｄ８３Ｅ、Ａ８５Ｆ、Ｔ８７Ｖ、及びＶ１０７Ｌのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、実施形態３０又は実施形態３１に記載の抗体。
４５．ＶＬポリペプチドが、突然変異Ａ１Ｅ、Ｓ９Ａ、Ｐ１０Ｔ、Ａ１３Ｌ、Ｖ１５Ｐ、Ｇ１７Ｅ、Ｖ１９Ａ、Ｉ２１Ｌ、Ｐ４５Ａ、Ｎ４７Ｒ、Ｖ６０Ｉ、Ｓ６２Ａ、Ｑ７２Ｄ、Ｄ８３Ｅ、Ａ８５Ｆ、Ｔ８７Ｖ、及びＶ１０７Ｌの各々を含む、実施形態４４に記載の抗体。
４６．ＶＬポリペプチドが、配列番号８～１２のうちの１つに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、実施形態１、３０又は３１に記載の抗体。
４７．ＶＬポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載の抗体。
４８．ＶＬポリペプチドが、配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、実施形態３７に記載の抗体。
４９．ＶＬポリペプチドが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、実施形態３８～４２のいずれか１つに記載の抗体。
５０．ＶＬポリペプチドが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、実施形態４３に記載の抗体。
５１．ＶＬポリペプチドが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、実施形態４４又は実施形態４５に記載の抗体。
５２．ワクシニアウイルスＢ５抗原（ＶＶ Ｂ５）に特異的に結合する抗体であって、
可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドであって、
アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号１３）を含むＶＨ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）を含むＶＨ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号１７）を含むＶＨ ＣＤＲ３と、含む、可変重鎖ポリペプチドと、
可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドであって、
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号１８）を含むＶＬ ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号１９）を含むＶＬ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号２０）を含むＶＬ ＣＤＲ３と、を含む、可変軽鎖ポリペプチドと、を含む、抗体。
５３．抗体が、ヒト化抗体である、実施形態５２に記載の抗体。
５４．抗体が、ＩｇＧである、実施形態１～５３のいずれか１つに記載の抗体。
５５．抗体が、ヒトＦｃドメインを含む、実施形態５４に記載の抗体。
５６．抗体が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦ（ａｂ’）からなる群から選択される、実施形態１～５３のいずれか１つに記載の抗体。
５７．抗体が、単鎖抗体である、実施形態１～５３のいずれか１つに記載の抗体。
５８．単鎖抗体が、ｓｃＦｖである、実施形態５７に記載の抗体。
５９．抗体が、実施形態１～５３のいずれか１つに定義されるＶＨポリペプチド－ＶＬポリペプチド対を含む第１の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体である、実施形態１～５８のいずれか１つに記載の抗体。
６０．二重特異性抗体が、ワクシニアウイルスＢ５抗原以外の抗原と特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、実施形態５９に記載の抗体。
６１．ワクシニアウイルスＢ５抗原以外の抗原が、免疫細胞表面抗原である、実施形態６０に記載の抗体。
６２．免疫細胞表面抗原が、免疫エフェクター細胞表面抗原である、実施形態６１に記載の抗体。
６３．免疫細胞表面抗原が、Ｔ細胞表面抗原である、実施形態６２に記載の抗体。
６４．抗原が、Ｔ細胞刺激分子である、実施形態６３に記載の抗体。
６５．Ｔ細胞刺激分子が、ＣＤ３又はＣＤ２８である、実施形態６４に記載の抗体。
６６．免疫細胞表面抗原が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面抗原である、実施形態６２に記載の抗体。
６７．免疫細胞表面抗原が、マクロファージ細胞表面抗原である、実施形態６２に記載の抗体。
６８．融合タンパク質であって、
アミノ酸の異種配列に融合された、実施形態１～５３のいずれか１つに記載の抗体の鎖を含む、融合タンパク質。
６９．アミノ酸の異種配列が、抗体の鎖のＣ末端に融合されている、実施形態６８に記載の融合タンパク質。
７０．抗体が、実施形態５７又は５８に記載の単鎖抗体である、実施形態６８又は実施形態６９に記載の融合タンパク質。
７１．融合タンパク質が、
単鎖抗体と、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態７０に記載の融合タンパク質。
７２．コンジュゲートであって、
実施形態１～６７のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態６８～７１のいずれか１つに記載の融合タンパク質と、
抗体又は融合タンパク質にコンジュゲートされた薬剤と、を含む、コンジュゲート。
７３．薬剤が、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、放射性同位体、検出可能な標識、及び半減期延長部分からなる群から選択される、実施形態７２に記載のコンジュゲート。
７４．放射性同位体が、治療用放射性同位体である、実施形態７３に記載のコンジュゲート。
７５．検出可能な標識が、放射性標識である、実施形態７３に記載のコンジュゲート。
７６．放射性標識が、ジルコニウム－８９（８９Ｚｒ）である、実施形態７５に記載のコンジュゲート。
７７．薬剤が、切断不可能なリンカーを介して抗体又は融合タンパク質にコンジュゲートされている、実施形態７２～７６のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
７８．薬剤が、切断可能なリンカーを介して抗体又は融合タンパク質にコンジュゲートされている、実施形態７２～７６のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
７９．切断可能なリンカーが、酵素切断可能なリンカーである、実施形態７８に記載のコンジュゲート。
８０．リンカーが、リソソームプロテアーゼによって切断可能である、実施形態７９に記載のコンジュゲート。
８１．リンカーが、カテプシン又はプラスミンによって切断可能である、実施形態８０に記載のコンジュゲート。
８２．実施形態１～６７のいずれか１つに記載の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、又はその両方をコードする、核酸。
８３．実施形態６８～７１のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
８４．実施形態８２又は実施形態８３に記載の核酸を含む、発現ベクター。
８５．細胞であって、
実施形態８２若しくは実施形態８３に記載の核酸、又は
実施形態８４に記載の発現ベクター、を含む、細胞。
８６．細胞が、実施形態８３に記載の核酸又は実施形態８３に記載の核酸を含む発現ベクターを含む、実施形態８５に記載の細胞。
８７．核酸が、実施形態７１に記載のＣＡＲをコードし、細胞がその表面上にＣＡＲを発現する、実施形態８６に記載の細胞。
８８．細胞が、免疫細胞である、実施形態８７に記載の細胞。
８９．細胞が、免疫エフェクター細胞である、実施形態８８に記載の細胞。
９０．細胞が、Ｔ細胞である、実施形態８９に記載の細胞。
９１．細胞が、ＮＫ細胞である、実施形態８９に記載の細胞。
９２．細胞が、マクロファージである、実施形態８９に記載の細胞。
９３．細胞であって、
実施形態１～５３のいずれか１つに記載の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドをコードする第１の核酸と、
抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドをコードする第２の核酸と、を含む、細胞。
９４．
第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む、実施形態９３に記載の細胞。
９５．実施形態８５～９４のいずれか１つに記載の細胞を含む、医薬組成物。
９６．実施形態８７～９２のいずれか１つに記載の細胞を含む、実施形態９５に記載の医薬組成物。
９７．薬学的に許容される担体を更に含む、実施形態９５又は実施形態９６に記載の医薬組成物。
９８．実施形態１～５３のいずれか１つに記載の抗体を産生する方法であって、実施形態８５～９４のいずれか１つに記載の細胞を、細胞が抗体を発現するのに好適な条件下で培養することを含み、抗体が産生される、方法。
９９．医薬組成物であって、
実施形態１～６７のいずれか１つに記載の抗体と、
薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
１００．医薬組成物であって、
実施形態６８～７１のいずれか１つに記載の融合タンパク質と、
薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
１０１．医薬組成物であって、
実施形態７２～８１のいずれか１つに記載のコンジュゲートと、
薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
１０２．キットであって、
実施形態９５～９７又は９９～１０１のいずれか１つに記載の医薬組成物と、
医薬組成物をそれを必要とする個体に投与するための説明書と、を含む、キット。
１０３．医薬組成物が、１つ以上の単位用量で存在する、実施形態１０２に記載のキット。
１０４．医薬組成物が、２つ以上の単位用量で存在する、実施形態１０２に記載のキット。
１０５．方法であって、
実施形態９５～９７又は９９～１０１のいずれか１つに記載の医薬組成物を、がんを有する個体に投与することを含み、個体は、ワクシニアウイルス（ＶＶ）に感染したがん細胞を含み、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートは、感染したがん細胞の表面上に発現するＶＶ Ｂ５抗原によって感染したがん細胞に標的化される、方法。
１０６．医薬組成物を個体に投与する前に、ＶＶを個体に投与することによって、がん細胞に感染させることを更に含む、実施形態１０５に記載の方法。
１０７．方法が、個体のがんを治療する方法である、実施形態１０５又は１０６に記載の方法。
１０８．実施形態１０１に記載の医薬組成物が個体に投与され、コンジュゲートが、インビボイメージング剤である検出可能な標識又は放射性同位体にコンジュゲートされた抗体を含み、方法が、インビボイメージング剤を使用して、個体中の感染したがん細胞をイメージングすることを含む、実施形態１０５～１０７のいずれか１つに記載の方法。
以下の実施例は、説明のために提供され、限定のために提供されるものではない。
実験
実施例１－ヒト化Ｖ領域配列の設計及び発現
本実施例は、ウサギ抗ＶＶ Ｂ５抗体Ａ０４８のヒト化可変領域の設計及び発現について記載する。親Ａ０４８抗体は、国際出願第ＣＡ２０２／０５１２３０号に記載されている。配列ベースのＣＤＲグラフティングを使用して、Ａ０４８可変領域（Ｖ領域）をヒト化した。インシリコホモロジーモデリングツール（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｂｉｏｌｕｍｉｎａｔｅ）を使用して、各可変（Ｖ）ドメインについて最も近く整列するヒト生殖系列配列由来の最もフィットする候補鋳型を分析し、ウサギＣＤＲを非ヒト化Ａ０４８親ウサギ抗体及び生殖系列抗体にグラフトして、それらと比較した。相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク（ＦＷ）配列を、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び社内のＣＤＲアノテーションの組み合わせを考慮に入れて検討し、抗原相互作用への関与を定義した。ＦＷ１の開始は、ＩＭＧＴデータベースウサギ抗体配列に基づいて選択した。ホモロジーモデルの構造分析は、ＣＤＲの安定性及び高次構造に影響を与え得る高次構造又は配列の逸脱を評価し、適切な逆突然変異を同定した。
ＩＧＨＶ３＿２３は、Ａ０４８可変重鎖（ＶＨ）ドメインの配列相同性に最もフィットすることが分かった。共通生殖系列ＩＧＨＪ４＿１は、高い配列相同性に起因してＡ０４８ ＶＨ ＦＷ４に最もフィットすることが見出された。ＩＧＫＶ１＿５は、ＶＬドメイン配列相同性に最もフィットすることが見出された。更に、いくつかのアミノ酸位置（ＩＧＫＶ１＿５～ＩＧＫＶ１＿２７、Ｔ１０Ｓ、Ａ４５Ｖ、Ｅ７２Ｄ、Ｄ８３Ｅ、Ｆ８５Ｖ）は、インシリコモデリングに基づいてＣＤＲの安定性に影響を及ぼし得るため、５つのアミノ酸が異なるＩＧＫＶ１＿２７を選択した。ＩＧＫＪ４＿１を、高い配列相同性によってＶＬ ＦＷ４について選択した。２つのＶＨ候補（Ａ０４８＿Ｈ３及びＡ０４８＿Ｈ４）において、３つのアミノ酸を、ＣＤＲ２の伸長末端においてヒト配列Ｎ６３Ｄ、Ｗ６４Ｓ、Ａ６５Ｖウサギからヒト）に突然変異させ、それによってＣＤＲ２をよりヒト型にした。この領域はＶＨＣＤＲ３から比較的離れているので、抗原結合に関与しない可能性が高いが、溶媒への曝露により免疫原性に潜在的な影響を及ぼす。２つのＶＨ候補（Ａ０４８＿Ｈ２及びＡ０４８＿Ｈ４）において、ＦＷ３におけるヒトからウサギへの逆突然変異（ＨＶ４ループとしても知られる）を導入して（ヒトからウサギ：Ｄ７４Ｔ、Ｎ７５Ｓ、Ｓ７６＿Ｔ７７ｄｅｌＫ、Ｎ７７Ｔ、Ｌ７９Ｖ、Ｙ８０Ｔ）、結合に対する潜在的な影響を評価した。２つのＶＬ候補（Ａ０４８＿Ｌ２及びＡ０４８＿Ｌ４）において、ヒトからウサギへのＦＷ１におけるｎ末端交換を導入して（Ｄ１Ａ、Ｉ２Ｑ、Ｑ３Ｖ、Ｍ４Ｌ）、結合に対する潜在的な影響を評価した。
ヒト化ＶＨドメイン（Ａ０４８＿Ｈ１、Ａ０４８＿Ｈ２、Ａ０４８＿Ｈ３、Ａ０４８＿Ｈ４）及びヒト化ＶＬドメイン（Ａ０４８＿Ｌ１、Ａ０４８＿Ｌ２、Ａ０４８＿Ｌ３、Ａ０４８＿Ｌ４）を組み合わせて、評価のための１６種類のヒト化ＩｇＧを生成した。
１つの追加のヒト化抗体を構造ホモロジーモデリングを使用して生成し、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｂｉｏｌｕｍｉｎａｔｅソフトウェアを用いる複合スコア及び解像度に基づいて最良の鋳型を最初に同定した。ＣＤＲがグラフトされたプロトタイプＶドメインの構造分析は、高次構造及び配列逸脱について確認した。ヒトＦｖ＃３Ｌ７Ｆ鋳型を、Ａ０４８のウサギＣＤＲの構造的グラフトのために選択した。３Ｌ７Ｆに最もマッチするヒト生殖系列は、ＶＨについてはＩＧＨＶ２であったが、優位なＩＧＫＶファミリーは同定されなかった。ＣＤＲの安定性及び立体構造に潜在的に影響を及ぼし得る立体構造又は配列の逸脱は、インシリコで観察されなかった。したがって、Ａ０４８＿Ｈ５Ｌ５によって記載されるように、Ａ０４８ウサギＣＤＲを＃３Ｌ７Ｆ ＶＨ及びＶＬにグラフトした後、逆突然変異を導入しなかった。
親及びヒト化ＶＨ及びＶＬドメインの配列を表１に示す。
ヒト化ＶＨ及びＶＬ配列を合成し、ヒトＩｇＧ１重鎖又はヒトκ軽鎖の定常領域のいずれかを含有するｐｔｔ５発現ベクター（ＮＲＣ）にクローニングした。組換え抗体を産生するために、ＶＨ及びＶＬ鎖プラスミドをＦｅｃｔｏＰｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、カタログ番号１１６－００１）を使用してＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。１２０時間の分泌後、遠心分離及び滅菌濾過（０．２２μｍ）により、抗体を含有する上清から細胞を除去した。プロテインＡ（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｒａｅｓｔｏ Ｊｅｔｔｅｄ Ａ０５０）樹脂を用いて抗体を精製した。精製された抗体の濃度及び収量を、バイオ分光光度計を使用して２８０ｎｍ（Ａ２８０）でのＵＶ吸光度測定によって決定した。濃度値は、個々のｍＡｂ配列について決定されたＡ２８０吸光係数を用いて計算した。Ａ２８０測定によって決定された収量（ｍｇ／Ｌ馴化培地「ＣＭ」）を表９に示す。親キメラ抗体の収量よりも４～８倍高いヒト化抗体の収量は、ヒト化抗体の良好な製造可能性を示唆する。抗体の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって試験した。完全抗体の割合をＨＰＬＣ－ＳＥＣによって決定した。抗体（１２μＬ）を、標準的なＨＰＬＣバイアル中のガラスバイアルインサートに添加した。試料（１０μＬ）を、ＷＣＬ００６ ＳＥＣカラム（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号：ＷＴＣ－０１０Ｓ５）を備えたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）に注入し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて流速０．５ｍＬ／分で４０分間溶出した。完全抗体の割合を、他のピーク（存在する場合）のピーク面積中のｍＡｂピークのピーク面積によって決定した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣの結果を表９に示す。
実施例２－ヒト化抗体のＶＶ Ｂ５への結合
ヒト化抗体を、ＶＶ Ｂ５タンパク質への結合についてＥＬＩＳＡによって評価した。ワイスワクシニア株（Ｄｒ．Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｌ ＯＨＲＩ）のＢ５配列を用いて、Ｂ５タンパク質を生成した。ｐｔｔ５発現ベクター（ＮＲＣ）中で、ビオチン化のためのＣ末端ＡＶＩタグ及び精製のためのＨＩＳ６タグを有するＢ５遺伝子を合成し、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１２３４７０１９）を使用してＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞（ＮＲＣ）にトランスフェクトした。分泌の９６時間後、タンパク質含有上清を回収し、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣシステムを使用してＩＭＡＣ及びＳＥＣによって精製した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ、カタログ番号：２９１４８７２１）と接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ、カタログ番号：２８９９０９４４）をＰＢＳ、ｐＨ７．４と共に使用するＳＥＣによって、タンパク質を更に精製した。単量体タンパク質を含有する画分を合わせ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心濾過装置、１０ｋ ＭＷＣＯによって濃縮した。
結合ＥＬＩＳＡのために、Ｂ５モノマーを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬで９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ）にコーティングし、４℃で一晩保存した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液で洗浄した後、プレートをブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、各抗Ｂ５ ｈＩｇＧ１抗体をブロッキング緩衝液中１００ｎｍからの連続滴定で添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを３回洗浄し、二次抗体（ウサギ抗ｈＩｇＧ ＨＲＰ）を１時間添加した。プレートを洗浄し、ＴＭＢを添加し、続いて２Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止溶液を添加した。ＯＤ４５０を分光光度計で読み取った。全てのヒト化抗体は、以下の表６及び図１に示されるように、Ａ０４８ウサギ親抗体と同様のＥＣ５０でＢ５タンパク質に結合した。
Figure 2024513700000009
実施例３－ヒト化抗体のワクシニアウイルス感染細胞への結合
ワクシニアウイルスに感染したがん細胞への結合をフローサイトメトリーによって決定した。ＨＴ２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３８）及びＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ－７７）細胞を、Ｔ１７５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５３１１２）において、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６６００－０８２）＋１０％ウシ胎児血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５－０１５－ＣＶ）中に２７．３×１０６細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩接着させた。翌日、培養培地を吸引し、細胞を、ＶＶｄｄ（ｅＧＦＰ）又はＶＶコペンハーゲン（ＹＦＰ）（それぞれワクシニアウイルス株ウエスタンリザーブ及びコペンハーゲン、両方ともＤｒ．Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｌ（ＯＨＲＩ）より寄贈）のいずれかに、２７．３ｍＬの無血清ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（１×１０４ＰＦＵ／ｍＬ）中、３７℃、５％ＣＯ２において、感染多重度（ＭＯＩ）０．１で感染させるか、又はモック感染させた。感染２時間後に感染培地を２７．３ｍＬのＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ＋１０％ウシ胎児血清と交換し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。感染後４８時間で、各フラスコの培養培地を別の５０ｍＬファルコンチューブに吸引した。細胞を１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００１０－０２３）でリンスし、洗浄液を対応するチューブに加えた。１０ｍＬの細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１３１５１０１４）／フラスコ中、３７℃で６０分間インキュベートすることによって、細胞を解離させた。一方、培養上清中の細胞は、チューブを４００×ｇで５分間遠心分離することによってペレット化し、上清を廃棄した。解離後、細胞を１０ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、対応するチューブに移した後、４００×ｇで５分間遠心分離することによってペレット化した。上清を廃棄し、細胞の生存率について、２７．３ｍＬのＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９５５）中で１：１０００に希釈したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎを使用して、４℃で３０分間染色した。染色後、細胞を４００×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、２７．３ｍＬの染色緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．５％ウシ血清アルブミン）に再懸濁した。細胞を９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３８９４）に５０μＬ／ウェル（５×１０４細胞／ウェル）で播種し、４００×ｇで５分間遠心分離した。細胞を、０．００３４、０．０１７、０．０８５、０．４３、２．１、１０．７、５３．６、又は２６８ｎＭの濃度で２５μＬ／ウェルのヒト抗Ｂ５抗体（Ａ０４８－Ｈ１Ｌ１、Ａ０４８－Ｈ１Ｌ２、Ａ０４８－Ｈ１Ｌ３、Ａ０４８－Ｈ１Ｌ４、Ａ０４８－Ｈ２Ｌ１、Ａ０４８－Ｈ２Ｌ２、Ａ０４８－Ｈ２Ｌ３、Ａ０４８－Ｈ２Ｌ４、Ａ０４８－Ｈ３Ｌ１、Ａ０４８－Ｈ３Ｌ２、Ａ０４８－Ｈ３Ｌ３、Ａ０４８－Ｈ３Ｌ４、Ａ０４８－Ｈ４Ｌ１、Ａ０４８－Ｈ４Ｌ２、Ａ０４８－Ｈ４Ｌ３、Ａ０４８－Ｈ４Ｌ４、Ａ０４８－Ｈ５Ｌ５、Ａ０４８、又はヒトＩｇＧ１ｋアイソタイプ対照）に再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした後、１００μＬの染色緩衝液を加え、４００×ｇで５分間遠心分離した。
試料を２５μＬの２μｇ／ｍＬ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－６０５－０９８）と共に染色緩衝液中で４℃で３０分間インキュベートすることによって、一次抗体結合を検出した。次いで、細胞を５０μＬ／ウェルのＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１９９４３－Ｋ２）中で室温にて１５分間固定した後、１００μＬの染色緩衝液で洗浄した。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳフローサイトメーターでのデータ取得及びＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＦｏｒｅＣｙｔソフトウェアを使用する分析のために、試料を５０μＬの染色緩衝液に再懸濁した。１７種類のヒト化抗体及びＡ０４８親抗Ｂ５抗体は全て、以下の表７及び図２Ａ～図２Ｃに示すように、ワクシニアウイルスに感染したがん細胞に対して同様の結合を示した。ウエスタンリザーブＶＶ株に感染したＨＴ２９細胞、コペンハーゲンＶＶ株に感染したＨＴ２９細胞、及びウエスタンリザーブＶＶ株に感染したＳＫＯＶ３細胞に対するヒト化抗体の結合を、それぞれ図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃに示す。
Figure 2024513700000010
実施例４－ヒト化抗体のＶＶ Ｂ５に対する親和性
ヒト化抗体の親和性を、標準的なプロトコールに従って、ＯｃｔｅｔＲｅｄ９６Ｅ（登録商標）バイオレイヤー干渉計での無標識バイオレイヤー干渉法を使用して評価した。ヒト化抗Ｂ５抗体を、抗ヒト捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、６００秒間のローディングで捕捉した。次いで、ロードされたセンサーを、Ｂ５モノマー分析物（４０ｎＭ、１：２で滴定）中に、会合について６００秒及び解離について１８００秒間浸漬した。センサーを３０秒間再生した。抗体捕捉を行っていない対照バイオセンサーを二重参照を差し引くために使用した。Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアｖ１１．１を用いてデータを分析した。親Ａ０４８抗体は９．５ｎＭのＫＤを有し、１７種類全てのヒト化抗体は類似しており、３～１２ｎＭのＫＤの範囲であった（表８）。
Figure 2024513700000011
実施例５－ヒト化抗体の自己会合の決定
抗体の自己会合の傾向を、金ナノ粒子（Ａｕ－ＮＰ）（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、カタログ番号：１５７０５）を使用して、親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ－ＳＩＮＳ）から決定した（１、２）。簡潔には、ヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：００５－０００－００３）及びヤギ抗ヒトＦｃ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１０９－００５－０９８、１：４モル比）を使用して、Ａｕ－ＮＰをコーティングした。混合物を回転させながら室温で１時間インキュベートした。最終濃度のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルチオールを添加して反応をクエンチした。次いで、コンジュゲートしたＡｕ－ＮＰを、１３，０００×ｇでの５分間の遠心分離によって濃縮した。元の体積の１／２０部のＰＢＳを使用して、Ａｕ－ＮＰを再懸濁した。１００μＬの５０μｇ／ｍＬの各抗体を４ヶ所ずつ、９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｎｕｎｃ（商標）９６ウェルポリプロピレンＭｉｃｒｏＷｅｌｌ（商標）プレート（カタログ番号：１２５６５３６９））上で１０μＬの濃縮したＡｕ－ＮＰと混合した。混合物を室温で２時間インキュベートした。波長スキャンをＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２プレートリーダーで測定した。最大吸光度の差（Δλｍａｘ）は、各反応のλｍａｘをＰＢＳ緩衝液のもので減算することによって計算した。データを、二次多項式フィッティングを用いてＥｘｃｅｌのＬｉｎｅｓｔ関数で分析した。データを表９に示す。セツキシマブ（ＤＩＮ：０２２７１２４９、Ｌｉｌｙ）、トラスツズマブ（ＤＩＮ：０２２４０６９２、Ｒｏｃｈｅ）及びインフリキシマブ（ＤＩＮ：０２４１９４７５、Ｈｏｓｐｉｒａ）を対照として使用した。インフリキシマブは、高いＡＣ－ＳＩＮを有することがこれまで報告されており（１）、文献に基づいて、＜１１がカットオフスコアとして使用される。
実施例６－ヒト化抗体の多反応性の決定
負に荷電した生体分子に対するヒト化抗体の多反応性を、ＥＬＩＳＡによって決定した（３）。簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）平底、Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：４４－２４０４－２１）を、５μｇ／ｍＬのヒトインスリン（ＳｉｇｍａＡｌｒｉｃｈ、カタログ番号：Ｉ９２７８）及び１０μｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ（ＳｉｇｍａＡｌｒｉｃｈ、カタログ番号：Ｄ１６２６－２５０ＭＧ）で一晩コーティングした。プレートをＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）でブロッキングした。１０μｇ／ｍＬの試験抗体をプレート上に４ヶ所ずつ入れ、２時間インキュベートした。次いで、０．０１μｇ／ｍＬのＨＲＰとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＦｃを添加し、プレートを１時間インキュベートした。シグナルをＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｔ０４４０－１Ｌ）で発色させ、Ａ４５０吸光度をＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２プレートリーダーで測定した。シグナルを、試験した各抗体について、コーティングされていないウェルのシグナルで補正した。データを表９に示す。セツキシマブ（ＤＩＮ：０２２７１２４９、Ｌｉｌｙ）、トラスツズマブ（ＤＩＮ：０２２４０６９２、Ｒｏｃｈｅ）及びインフリキシマブ（ＤＩＮ：０２４１９４７５、Ｈｏｓｐｉｒａ）を対照として使用した。これらの対照抗体は、低い多反応性を有することがこれまで報告されており、ヒト化抗ＶＶ Ｂ５抗体は同等である。
実施例７－ヒト化抗体の変性温度
抗体の変性温度（Ｔｍ）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈｉｆｔ Ｄｙｅ Ｋｉｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４４６１１４６）を使用した示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）によって決定した。簡単に説明すると、３１μｇ／ｍＬの抗体を各反応で使用した。抗体の融解曲線は、キットのマニュアルに記載されている推奨設定で、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して生成した。次に、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔソフトウェア（ｖ．１．３）を使用して、各抗体のＴｍを決定した。セツキシマブ（ＤＩＮ：０２２７１２４９、Ｌｉｌｙ）、トラスツズマブ（ＤＩＮ：０２２４０６９２、Ｒｏｃｈｅ）及びインフリキシマブ（ＤＩＮ：０２４１９４７５、Ｈｏｓｐｉｒａ）を対照として使用した。文献に基づいて、≧６５℃のＴｍ１が許容可能なカットオフとして使用される。ヒト化抗体のＤＳＦ、並びにＨＰＬＣ－ＳＥＣ、ＡＣ－ＳＩＮＳ及び多反応性データを表９に提供する。
Figure 2024513700000012
実施例８－ヒト化抗体のワクシニアウイルス感染細胞への経時的な結合
本実施例では、本開示の例示的なヒト化抗Ｂ５抗体のワクシニアウイルス感染細胞への経時的な結合の決定について記載する。
ＨＴ２９、ＳＫＯＶ３、及びＯＶＣＡＲ３細胞を、完全培養培地中の透明平底９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５３０７２）に２０，０００細胞／ウェルで播種した。ＨＴ２９及びＳＫＯＶ３細胞については、完全培養培地はＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６６００－０８２）＋１０％ウシ胎児血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５－０１５－ＣＶ）であった。ＯＶＣＡＲ３細胞については、完全培養培地は、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１０４９１－０１）＋０．０１ｍｇ／ｍＬウシインスリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ０５１６－５ＭＬ）＋２０％ウシ胎児血清であり、３７℃、５％ＣＯ２で一晩接着させた。翌日、培養培地を吸引し、１００μＬの無血清ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ中、３７℃、５％ＣＯ２において、ＶＶｄｄｅＧＦＰウエスタンリザーブ（「ＷＲ」）若しくはＶＶコペンハーゲン（ＹＦＰ）ウイルス（「Ｃｏｐ」）のいずれかに、細胞を０．１若しくは１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させるか、又はモック感染させた。
感染２時間後に感染培地を１００μＬの上記の完全培養培地と交換し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。感染２、２４、４８、７２、及び１６８時間後に、培養上清をＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３８９４）に移した。次いで、細胞を５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ｌ３４９５５）で洗浄し、洗浄液を上清と共にプールした。次いで、細胞を、ウェル当たり２５μＬの細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１３１５１０１４）中、３７℃で３０分間インキュベートすることによって解離させた。一方、培養上清中の細胞は、Ｖ底プレートを４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄することによってペレット化した。解離後、細胞を１００μＬ／ウェルのＰＢＳに再懸濁し、回収した上清と共にＶ底プレートにプールした。細胞を４００×ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９５５）中で１：１０００に希釈した５０μＬ／ウェルのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎに４℃で３０分間再懸濁した。染色後、細胞を１００μＬ／ウェルの染色緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．５％ウシ血清アルブミン）で洗浄し、４００×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化した。細胞を５０μＬ／ウェルのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７にコンジュゲートさせたヒト化抗ワクシニアウイルスＢ５抗体（Ａ０４８－Ｈ１Ｌ４又はＡ０４８－Ｈ３Ｌ２）に１０ｎＭの濃度で再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした後、１００μＬの染色緩衝液を添加し、４００×ｇで５分間遠心分離した。次いで、細胞を５０μＬ／ウェルのＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１９９４３－Ｋ２）中、室温で１５分間固定した後、１００μＬの染色緩衝液で洗浄した。Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０でのデータ取得及びＦｌｏｗＪｏ １０．８．１ソフトウェアを使用する分析のために、試料を５０μＬの染色緩衝液に再懸濁した。
結果は、Ａ０４８－Ｈ１Ｌ４及びＡ０４８－Ｈ３Ｌ２の両方が、ワクシニアウイルス感染細胞に同様に結合することを示す（図３Ａ－ＨＴ２９細胞、図３Ｂ－ＳＫＯＶ３細胞、図３Ｃ－ＯＶＣＡＲ３細胞）。データは、両方の抗体が、異なるがん徴候由来の複数のワクシニアウイルス感染細胞株、及び異なるワクシニアウイルス株に感染した細胞に結合することを実証する。更に、データは、ワクシニアウイルス感染細胞へのＡ０４８－Ｈ１Ｌ４及びＡ０４８－Ｈ３Ｌ２の結合が、長期間にわたって起こり得ることを示す。
実施例９－ヒト化抗ＶＶ Ｂ５キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の設計、検出、及びヒトＴ細胞のレンチウイルス形質導入後の活性化
本実施例では、本明細書の他の箇所に記載されるヒト化抗ＶＶ Ｂ５抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が記載される。この特定の実施例では、図４Ａに概略的に示されるように、ヒト化抗ＶＶ Ｂ５ ＣＡＲ構築物は、ＧＭ－ＣＳＦＲαリーダー配列、ヒト化Ｂ５ ｓｃＦｖ（この実施例では、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０と称するＡ０４８＿Ｈ３及びＡ０４８＿Ｌ２、又はＢ５－ＣＡＲ－０５１と称するＡ０４８＿Ｈ１及びＡ０４８＿Ｌ４）、ヒトＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメイン、ヒト４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、並びにヒトＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかのＣＡＲ構築物は、リボソームスキップ配列、例えば、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列によって分離されたレポータータンパク質（例えば、ｅＧＦＰ又は切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ））も含み得る。ＣＡＲのアミノ酸配列を表５に示す。
Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１をコードする遺伝子断片は、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成された。遺伝子断片を、第２世代トランスファープラスミド（Twist Biosciences）にクローニングした。ＶＶ－ＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００トランスフェクション試薬プロトコール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ３０００１５）及び第２世代パッケージングベクター（ＡｄｄＧｅｎｅ）を使用して生成する。ＣＡＲ形質導入を最適化するため、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団を、健康なドナーＰＢＭＣ試料から単離した。１×１０６個の健康なドナーＴ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０）で活性化し、３％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４５２２）、硫酸ゲンタマイシン（Ｓａｎｄｏｚ、ＤＩＮ：０２２６８５３１）、並びにヒトインターロイキン－７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９５－３６７）及びインターロイキン－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９５－７６４））（１０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＭｉｌｔｅｎｙｉ ＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１７０－０７６－３０９）培地で成長させた。活性化の２４時間後、Ｔ細胞に１．０～５．０のＭＯＩでＢ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１レンチウイルスを形質導入した。細胞は、１ｍＬ当たり１×１０６個未満の細胞密度で更に１２日間増殖させた。図４Ｂに示すのは、ストレプトアビジン－ＰＥに結合した可溶性Ｂ５タンパク質によって検出されたＣＤ３＋及びＣＡＲ発現データである。順番に言うと、ＣＡＲ発現は、非形質導入Ｔ細胞及びｔＥＧＦＲ（配列番号５４）ベクターのみで形質導入されたＴ細胞上に存在しない。抗ＶＶ Ｂ５ ＣＡＲは、親ウサギＢ５－ＣＡＲ－０４３ ＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスで形質導入されたＴ細胞上で検出される。しかしながら、ＣＡＲ発現は、２種類のヒト化ＣＡＲ構築物（Ｂ５－ＣＡＲ－０５０、Ｂ５－ＣＡＲ－０５１）において最大である。
ＶＶ Ｂ５抗原（例えば、ワイスＶＶ株由来のＢ５抗原）を発現する安定な細胞株（この実施例では、がん細胞株）を作製して、ＣＡＲの特徴付けを可能にした。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＨＴ－２９－Ｂ５及びＨＴ－２９－ＷＴ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３８）細胞、ＳＫＯＶ３－Ｂ５及びＳＫＯＶ３－ＷＴ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－７７）細胞、又はＨＥＫ２９３Ｔ－Ｂ５及びＨＥＫ２９３Ｔ－ＷＴ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）のいずれかとの共培養アッセイにおいてプレーティングした。細胞を、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で一晩（１６時間）培養した（総２×１０５細胞）。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｈｕｍａｎ Ｔｒｕｓｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２３０２）でブロッキングし、ＣＤ８ ＰｅｒＣＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４７０８）、ＣＤ３ ＢＶ７５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４８４６）、ＣＤ１３７ ＡＰＣ（ＢＤ、カタログ番号５６１７０２）、及びＣＤ４ ＡＦ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４６２２）について染色した。データを図４Ｃに示す。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０及びＢ５－ＣＡＲ－０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、適切な標的抗原を発現する細胞と共培養した場合、ＣＤ１３７の発現の増加を示したが、ＷＴ細胞と共培養した場合、ＣＤ１３７の発現は最小限であり、これは標的特異的活性化を示す。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０及びＢ５－ＣＡＲ－０５１ ＣＡＲ Ｔ細胞の両方が、親Ｂ５－ＣＡＲ－０４３ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＣＤ１３７の発現の増強を示した。この分析は、初代ＰＢＭＣ由来のヒトＴ細胞がＶＶ－ＣＡＲ構築物を発現するように容易に形質導入され、形質導入後に増殖され得ることを示す。更に、これらのデータは、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１ ＣＡＲを発現するように形質導入されたエフェクターＴ細胞が、ＶＶ Ｂ５抗原を有する標的細胞に遭遇すると活性化を受けることを実証する。
実施例１０－Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現するヒトＴ細胞は、ＶＶ Ｂ５を発現する標的細胞に対して細胞傷害性を示す
ホタルルシフェラーゼをコードする哺乳類発現伝達プラスミドｐＣＣＬ Ｌｕｃピューロマイシンを使用して、実施例９で記載したようにレンチウイルスを生成した。ＨＴ－２９、ＳＫＯＶ３、並びにＨＥＫ２９３Ｔ－ＷＴ及び－Ｂ５株は、このルシフェラーゼをコードするレンチウイルスで形質導入し、ピューロマイシン（１．５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８８３３）に対する耐性について２週間にわたって選択した。増殖したピューロマイシン耐性細胞培養物を、ＶＶ－ＣＡＲ殺滅アッセイのための標的集団として使用した。ルシフェラーゼを発現する標的ＨＴ２９、ＳＫＯＶ３、及びＨＥＫ２９３Ｔ株を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９１７）のウェル当たり１００μＬ、２×１０４個の細胞で播種し、一晩インキュベートして接着させた。増殖させた初代ヒトＢ５－ＣＡＲ－０５０、Ｂ５－ＣＡＲ－０５１、親Ｂ５－ＣＡＲ－０４３、及びベクター対照ｔＥＧＦＲ Ｔ細胞の集団を、９６ウェルプレートに３ヶ所ずつ播種し（１００μＬ／ウェル）、２倍希釈系列で希釈して、ＣＡＲ発現全体に対して２０：１～０．６２５：１のＥ：Ｔ比を確立した。次に、Ｔ細胞懸濁液を付着性の腫瘍細胞に移して、総量を２００μＬにした。更に、それぞれ最大及び最小の相対発光単位（ＲＬＵ）を決定するために、標的細胞のみの３ウェルと培地のみの３ウェルをプレーティングした。細胞を、５％ＣＯ２中３７℃で２４～３６時間培養した。インキュベーション後、２２μＬのＸｅｎｏｌｉｇｈｔ（商標）Ｄ－ルシフェリンの１０×ストック（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号１２２７９９）を各ウェルに添加し、暗所にて室温で１０分間インキュベートした。次いで、プレートを発光プレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｌｕｘプレートリーダー）上でスキャンした。３つのウェルを平均し、特異的細胞傷害性パーセントを次の式で決定した：特異的細胞傷害性パーセント＝１００×（最大発光ＲＬＵ－試験発光ＲＬＵ）／（最大発光ＲＬＵ－最小発光ＲＬＵ）。図５Ａに示されるように、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０、Ｂ５－ＣＡＲ－０５１、親Ｂ５－ＣＡＲ－０４３、及びベクター対照ｔＥＧＦＲの１．２５：１のＥ：Ｔ共培養ウェルについての特異的細胞傷害性パーセント及び相対発光は、Ｂ５標的細胞株に特異的な高い細胞傷害性パーセント、及びｔＥＧＦＲベクター対照条件によるバックグラウンドを超える細胞傷害性を示した。更に、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０及びＢ５－ＣＡＲ－０５１は、親Ｂ５－ＣＡＲ－０４３と比較して改善された全体的な細胞傷害性を示すようであった。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１ Ｔ細胞と１０：１のＥ：Ｔで共培養したＢ５を発現する標的細胞についても、２４時間での細胞死の形態学的徴候についてイメージングし、ＷＴ腫瘍細胞と共に培養したＢ５ ＣＡＲと比較した。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０及びＢ５－ＣＡＲ－０５１は、Ｂ５標的を発現する腫瘍細胞株と共に培養した場合、明らかな細胞クラスター化及び細胞毒性の徴候を示した（図５Ｂ）。更に、ＣＡＲクラスター化の程度は、親Ｂ５－ＣＡＲ－０４３のものよりも大きいようであった。これらの結果は、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１ Ｔ細胞が、Ｂ５を発現する腫瘍細胞を効率的かつ特異的に殺滅することを示す。更に、腫瘍細胞の表面上に発現するＯＶ抗原を標的とすることにより、標的細胞をヒト化ＶＶ－ＣＡＲによって破壊されやすくすることができる。
実施例１１－Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１を発現するヒトＴ細胞は、ワクシニアウイルスに感染した腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示す
ルシフェラーゼを発現する標的ＨＴ２９、ＳＫＯＶ３、及びＨＥＫ２９３Ｔ ＷＴ株を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９１７）のウェル当たり２×１０４個の細胞／１００μＬで播種し、一晩インキュベートして接着させた。翌日、腫瘍細胞を、１ウェル当たり５０μＬの無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５－０４０）中、０．０１～１．０の範囲の感染多重度でワクシニアウイルス（その非限定的な例には、ウエスタンリザーブ株、コペンハーゲン株などが含まれる）に感染させ、３７℃、５％ＣＯ２中で２４時間インキュベートした。対応するモック非感染ウェルを陰性対照として設定する。増殖させた初代ヒトＢ５－ＣＡＲ－０５０、Ｂ５－ＣＡＲ－０５１、親Ｂ５－ＣＡＲ－０４３、及びベクター対照ｔＥＧＦＲ Ｔ細胞の集団を、ワクシニア感染プレートに３ヶ所ずつプレーティングし（５０μＬ／ウェル）、１０：１のＥ：Ｔ比、及びウェルあたり総量２００μＬを達成した。更に、標的細胞のみ（＋／－感染）の３ウェルとＴ細胞のみ（＋／－感染）の３ウェルをプレーティングし、最大及び最小の相対発光単位（ＲＬＵ）を決定した。細胞を、５％ＣＯ２中３７℃で更に２４～４８時間培養した。各ウェルにＸｅｎｏｌｉｇｈｔ（商標）Ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号１２２７９９）の１０Ｘストック２２μＬを入れ、暗所にて室温で１０分間インキュベートした。次いで、プレートを発光プレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｌｕｘプレートリーダー）上でスキャンした。３ヶ所のウェルのＲＬＵを平均し、特異的細胞傷害性パーセントを実施例１０に記載のように決定した。図６Ａに示されるように、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０、Ｂ５－ＣＡＲ－０５１、親Ｂ５－ＣＡＲ－０４３、及びベクター対照ｔＥＧＦＲの１０：１のＥ：Ｔ共培養ウェルについての特異的細胞傷害性パーセント及び相対発光は、ワクシニアウイルス感染標的細胞株に特異的な細胞傷害性パーセントが増加すること、ｔＥＧＦＲベクター対照条件で存在するバックグラウンドを超える細胞傷害性を示した。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０又はＢ５－ＣＡＲ－０５１ Ｔ細胞と１０：１のＥ：Ｔで共培養したワクシニアウイルス感染標的細胞についても、２４時間での細胞死の形態学的徴候についてイメージングし、非感染腫瘍細胞と共に培養したＢ５ ＣＡＲと比較した（図６Ｂ～６Ｄ）。Ｂ５－ＣＡＲ－０５０及びＢ５－ＣＡＲ－０５１は、ワクシニアウイルス感染腫瘍細胞株と共に培養した場合、明らかな細胞クラスター化及び細胞傷害性の徴候を示した。これらの知見は、Ｂ５－ＣＡＲ－０５０及びＢ５－ＣＡＲ－０５１が、ワクシニアウイルスに感染した腫瘍細胞を特異的に検出し、殺滅できることを実証する。
実施例１２－ワクシニアウイルスに感染した異種移植腫瘍モデルに対するヒト化Ｂ５－ＣＡＲの抗腫瘍効果
ＨＴ－２９腫瘍を有するマウスを、ワクシニアウイルス及びヒト化Ｂ５－ＣＡＲの組み合わせで処置する。ＮＳＧマウスに対し、０日目に１×１０６個の細胞を皮下移植し、腫瘍増殖について観察する。腫瘍が処置可能なサイズ（約３０～４０ｍｍ２）に達したとき、マウスに１×１０７ＰＦＵのワクシニアウイルスを、合計１～３回、腫瘍内注射する。最後のワクシニアウイルス注入の約１～３日後に、マウスに５×１０６個のＢ５－ＣＡＲ陽性Ｔ細胞を、尾静脈注射によって与える。腫瘍測定値を２～３日毎に記録し、動物を生存について観察する。対照群は、尾静脈注射により送達される、腫瘍内ＰＢＳ注射及び／又は空ベクターモック形質導入Ｔ細胞のいずれかの組み合わせを与えられる。図７Ａ：様々な処置条件における予測腫瘍面積。図７Ｂ：様々な処置条件における予想全生存期間。
参考文献
１．Ｌｉｕ Ｙ，Ｃａｆｆｒｙ Ｉ，Ｗｕ Ｊ，Ｇｅｎｇ ＳＢ，Ｊａｉｎ Ｔ，Ｓｕｎ Ｔ，Ｒｅｉｄ Ｆ，Ｃａｏ Ｙ，Ｅｓｔｅｐ Ｐ，Ｙｕ Ｙ，Ｖａｓｑｕｅｚ Ｍ，Ｔｅｓｓｉｅｒ ＰＭ，Ｘｕ Ｙ．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｆ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．ＭＡｂｓ．２０１４ Ｍａｒ－Ａｐｒ；６（２）：４８３－９２．ｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２７４３１．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｄｅｃ ６．ＰＭＩＤ：２４４９２２９４；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３９８４３３６．
２．Ｓｈａｎ Ｌ，Ｍｏｄｙ Ｎ，Ｓｏｒｍａｎｉ Ｐ，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ＫＬ，Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒ ＭＭ，Ｅｓｆａｎｄｉａｒｙ Ｒ．Ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｕｓｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｔｏｏｌｓ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１８ Ｄｅｃ ３；１５（１２）：５６９７－５７１０．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｍｏｌｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．８ｂ００８６７．Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｎｏｖ １５．ＰＭＩＤ：３０３９５４７３．
３．Ａｖｅｒｙ ＬＢ，Ｗａｄｅ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｍ，Ｔａｍ Ａ，Ｋｉｎｇ Ａ，Ｐｉｃｈｅ－Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｎ，Ｋａｖｏｓｉ ＭＳ，Ｐｅｎｎ Ｓ，Ｃｉｒｅｌｌｉ Ｄ，Ｋｕｒｚ ＪＣ，Ｚｈａｎｇ Ｍ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ｏ，Ｊｏｎｅｓ Ｒ，Ｆｅｎｎｅｌｌ ＢＪ，ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ Ｂ，Ｓａｋｏｒａｆａｓ Ｐ，Ａｐｇａｒ Ｊ，Ｆｉｎｌａｙ ＷＪ，Ｌｉｎ Ｌ，Ｂｌｏｏｍ Ｌ，Ｏ’Ｈａｒａ ＤＭ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｆａｖｏｒａｂｌｅ ｈｕｍａｎ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ．ＭＡｂｓ．２０１８ Ｆｅｂ／Ｍａｒ；１０（２）：２４４－２５５．ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１７．１４１７７１８．Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｊａｎ ２９．ＰＭＩＤ：２９２７１６９９；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５８２５１９５．
したがって、上記は、単に本開示の原理を説明するものである。当業者であれば、本明細書に明示的に記載又は図示されていないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨及び範囲内に含まれる様々な構成を考案することができることが理解されよう。更に、本明細書に列挙された全ての例及び条件付き言語は、主に、本発明の原理及び本発明者らが当該技術を促進するのに寄与した概念を読者が理解するのを助けることを意図しており、そのような具体的に列挙された例及び条件に限定されないと解釈されるべきである。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態、並びにそれらの特定の例を記載する本明細書における全ての記述は、それらの構造的均等物及び機能的均等物の両方を包含することが意図される。更に、そのような均等物は、現在知られている均等物及び将来開発される均等物、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を実行する開発された任意の要素の両方を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され説明された例示的な実施形態に限定されるものではない。

Claims (108)

  1. ワクシニアウイルスＢ５抗原（ＶＶ Ｂ５）に特異的に結合する抗体であって、前記抗体は、
    配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドであって、
    Ｑ１Ｅ、Ｅ２Ｖ、Ｑ３Ｔ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｇ９Ｐ、Ｇ１０Ｖ、Ｋ１３Ｑ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｇ１６Ｅ、Ｓ１７Ｔ、Ｔ１９Ｒ、Ｔ２１Ｓ、Ｔ２３Ａ、Ａ４１Ｐ、Ｒ４４Ｋ、Ｇ４５Ａ、Ｔ７４Ｄ、Ｓ７５Ｎ／Ｔ、Ｓ７６＿Ｔ７７ｉｎｓＫ、Ｔ７７Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｑ、Ｖ７９Ｌ、Ｔ８０Ｙ／Ｖ、Ｑ８２Ｔ、Ｔ８４Ｎ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｌ８６Ｍ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８８Ｐ、Ａ８９Ｅ／Ｖ、Ｔ９３Ｖ、Ｆ９５Ｙ、Ｐ１１２Ｑ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、ここでナンバリングは配列番号１に従う、１つ以上の突然変異と、
    アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号１３）を含むＶＨ ＣＤＲ１と、
    アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡ（Ｎ／Ｄ）（Ｗ／Ｓ）（Ａ／Ｖ）ＫＧ（配列番号１４）を含むＶＨ ＣＤＲ２と、
    アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号１７）を含むＶＨ ＣＤＲ３と、
    を含む、ＶＨポリペプチド、及び、
    配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドであって、
    Ａ１Ｄ／Ｅ、Ｑ２Ｉ、Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ、Ｔ７Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｓ、Ｖ１１Ｌ、Ａ１３Ｌ、Ａ１４Ｓ、Ｖ１５Ｐ、Ｇ１７Ｄ／Ｅ、Ｔ１８Ｒ、Ｖ１９Ａ、Ｉ２１Ｌ、Ｓ２２Ｔ、Ｑ４４Ｋ、Ｐ４５Ａ／Ｖ、Ｎ４７Ｋ／Ｒ、Ｖ６０Ｉ、Ｓ６２Ａ、Ｋ６５Ｓ、Ｑ７２Ｅ／Ｄ、Ｄ７９Ｓ、Ｅ８１Ｑ、Ｃ８２Ｐ、Ｄ８３Ｅ、Ａ８５Ｆ／Ｖ、Ｔ８７Ｖ、Ｇ１０３Ｑ、Ｅ１０６Ｋ、Ｖ１０７Ｌ、Ｖ１０８Ｅ、Ｖ１０９Ｉ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、ここでナンバリングは配列番号７に従う、１つ以上突然変異と、
    アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号１８）を含むＶＬ ＣＤＲ１と、
    アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号１９）を含むＶＬ ＣＤＲ２と、
    アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号２０）を含むＶＬ ＣＤＲ３と、
    を含む、ＶＬポリペプチド
    を含む、抗体。
  2. 前記ＶＨポリペプチドが、突然変異Ｅ２Ｖ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｒ４４Ｋ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８９Ｅ／Ｖ、及びＰ１１２Ｑのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記ＶＨポリペプチドが、突然変異Ｅ２Ｖ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｒ４４Ｋ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８９Ｅ／Ｖ、Ｐ１１２Ｑの各々を含む、請求項２に記載の抗体。
  4. 前記Ｅ５Ｌ／Ｋ突然変異がＥ５Ｌである、請求項２又は請求項３に記載の抗体。
  5. 前記Ｅ１５Ｇ／Ｔ突然変異がＥ１５Ｇである、請求項２～４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 前記Ｒ８５Ｓ／Ｎ突然変異がＲ８５Ｓである、請求項２～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 前記Ｔ８７Ｒ／Ｄ突然変異がＴ８７Ｒである、請求項２～６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 前記Ａ８９Ｅ／Ｖ突然変異がＡ８９Ｅである、請求項２～７のいずれか一項に記載の抗体。
  9. 前記ＶＨポリペプチドが、突然変異Ｑ１Ｅ、Ｋ１３Ｑ、Ｔ１９Ｒ、Ｔ２１Ｓ、Ｔ２３Ａ、Ｔ８４Ｎ、Ｔ９３Ｖ、及びＦ９５Ｙのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、請求項２～８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 前記ＶＨポリペプチドが、アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）を含むＶＨ ＣＤＲ２を含む、請求項２～９のいずれか一項に記載の抗体。
  11. 前記ＶＨポリペプチドが、突然変異Ｔ７４Ｄ、Ｓ７５Ｎ／Ｔ、Ｓ７６＿Ｔ７７ｉｎｓＫ、Ｔ７７Ｎ／Ｓ、Ｖ７９Ｌ、及びＴ８０Ｙ／Ｖのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、請求項２～９のいずれか一項に記載の抗体。
  12. 前記Ｔ７７Ｎ／Ｓ突然変異がＴ７７Ｎである、請求項１１に記載の抗体。
  13. 前記Ｔ８０Ｙ／Ｖ突然変異がＴ８０Ｙである、請求項１１又は請求項１２に記載の抗体。
  14. 前記ＶＨポリペプチドが、アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）を含むＶＨ ＣＤＲ２を含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の抗体。
  15. 前記ＶＨポリペプチドが、突然変異Ｑ３Ｔ、Ｅ５Ｌ／Ｋ、Ｇ９Ｐ、Ｇ１０Ｖ、Ｅ１５Ｇ／Ｔ、Ｇ１６Ｅ、Ｓ１７Ｔ、Ａ４１Ｐ、Ｇ４５Ａ、Ｔ７４Ｄ、Ｓ７５Ｎ／Ｔ、Ｓ７６＿Ｔ７７ｉｎｓＫ、Ｔ７７Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｑ、Ｔ８０Ｙ／Ｖ、Ｑ８２Ｔ、Ｒ８５Ｓ／Ｎ、Ｌ８６Ｍ、Ｔ８７Ｒ／Ｄ、Ａ８８Ｐ及びＡ８９Ｅ／Ｖのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、請求項２又は請求項３に記載の抗体。
  16. 前記Ｅ５Ｌ／Ｋ突然変異がＥ５Ｋである、請求項１５に記載の抗体。
  17. 前記Ｅ１５Ｇ／Ｔ突然変異がＥ１５Ｔである、請求項１５又は請求項１６に記載の抗体。
  18. 前記Ｓ７５Ｎ／Ｔ突然変異がＳ７５Ｔである、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の抗体。
  19. 前記Ｔ７７Ｎ／Ｓ突然変異がＴ７７Ｓである、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の抗体。
  20. 前記Ｔ８０Ｙ／Ｖ突然変異がＴ８０Ｖである、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の抗体。
  21. 前記Ｒ８５Ｓ／Ｎ突然変異がＲ８５Ｎである、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の抗体。
  22. 前記Ｔ８７Ｒ／Ｄ突然変異がＴ８７Ｄである、請求項１５～２１のいずれか一項に記載の抗体。
  23. 前記Ａ８９Ｅ／Ｖ突然変異がＡ８９Ｖである、請求項１５～２２のいずれか一項に記載の抗体。
  24. 前記ＶＨポリペプチドが、配列番号２～６のうちの１つに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
  25. 前記ＶＨポリペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、請求項２～９のいずれか一項に記載の抗体。
  26. 前記ＶＨポリペプチドが、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、請求項１０に記載の抗体。
  27. 前記ＶＨポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の抗体。
  28. 前記ＶＨポリペプチドが、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、請求項１４に記載の抗体。
  29. 前記ＶＨポリペプチドが、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、請求項１５～２３のいずれか一項に記載の抗体。
  30. 前記ＶＬポリペプチドが、突然変異Ｔ７Ｓ、Ｐ１０Ｔ／Ｓ、Ｖ１１Ｌ、Ａ１４Ｓ、Ｇ１７Ｄ／Ｅ、Ｔ１８Ｒ、Ｐ４５Ａ／Ｖ、Ｎ４７Ｋ／Ｒ、Ｋ６５Ｓ、Ｑ７２Ｅ／Ｄ、Ｄ７９Ｓ、Ｃ８２Ｐ、Ａ８５Ｆ／Ｖ、Ｇ１０３Ｑ、Ｅ１０６Ｋ、Ｖ１０８Ｅ、及びＶ１０９Ｉのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の抗体。
  31. 前記ＶＬポリペプチドが、突然変異Ｔ７Ｓ、Ｐ１０Ｔ／Ｓ、Ｖ１１Ｌ、Ａ１４Ｓ、Ｇ１７Ｄ／Ｅ、Ｔ１８Ｒ、Ｐ４５Ａ／Ｖ、Ｎ４７Ｋ／Ｒ、Ｋ６５Ｓ、Ｑ７２Ｅ／Ｄ、Ｄ７９Ｓ、Ｃ８２Ｐ、Ａ８５Ｆ／Ｖ、Ｇ１０３Ｑ、Ｅ１０６Ｋ、Ｖ１０８Ｅ、及びＶ１０９Ｉの各々を含む、請求項３０に記載の抗体。
  32. 前記ＶＬポリペプチドが、突然変異Ｇ１７Ｄ、Ｓ２２Ｔ、Ｑ４４Ｋ、Ｎ４７Ｋ、及びＥ８１Ｑのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、請求項３０又は請求項３１に記載の抗体。
  33. 前記Ｐ１０Ｔ／Ｓ突然変異がＰ１０Ｔである、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の抗体。
  34. 前記Ｐ４５Ａ／Ｖ突然変異がＰ４５Ａである、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の抗体。
  35. 前記Ｑ７２Ｅ／Ｄ突然変異がＱ７２Ｅである、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の抗体。
  36. 前記Ａ８５Ｆ／Ｖ突然変異がＡ８５Ｆである、請求項３０～３５のいずれか一項に記載の抗体。
  37. 前記ＶＬポリペプチドが、突然変異Ａ１Ｄ、Ｑ２Ｉ、Ｖ３Ｑ、及びＬ４Ｍのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の抗体。
  38. 前記ＶＬポリペプチドが突然変異Ｄ８３Ｅを含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の抗体。
  39. 前記Ｐ１０Ｔ／Ｓ突然変異がＰ１０Ｓである、請求項３０～３２又は３８のいずれか一項に記載の抗体。
  40. 前記Ｐ４５Ａ／Ｖ突然変異がＰ４５Ｖである、請求項３０～３２、３８、又は３９のいずれか一項に記載の抗体。
  41. 前記Ｑ７２Ｅ／Ｄ突然変異がＱ７２Ｄである、請求項３０～３２又は３８～４０のいずれか一項に記載の抗体。
  42. 前記Ａ８５Ｆ／Ｖ突然変異がＡ８５Ｖである、請求項３０～３２又は３８～４１のいずれか一項に記載の抗体。
  43. 前記ＶＬポリペプチドが、突然変異Ａ１Ｄ、Ｑ２Ｉ、Ｖ３Ｑ、及びＬ４Ｍのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の抗体。
  44. 前記ＶＬポリペプチドが、突然変異Ａ１Ｅ、Ｓ９Ａ、Ｐ１０Ｔ、Ａ１３Ｌ、Ｖ１５Ｐ、Ｇ１７Ｅ、Ｖ１９Ａ、Ｉ２１Ｌ、Ｐ４５Ａ、Ｎ４７Ｒ、Ｖ６０Ｉ、Ｓ６２Ａ、Ｑ７２Ｄ、Ｄ８３Ｅ、Ａ８５Ｆ、Ｔ８７Ｖ、及びＶ１０７Ｌのうちの１つ、これらの任意の組み合わせ、又は各々を含む、請求項３０又は請求項３１に記載の抗体。
  45. 前記ＶＬポリペプチドが、突然変異Ａ１Ｅ、Ｓ９Ａ、Ｐ１０Ｔ、Ａ１３Ｌ、Ｖ１５Ｐ、Ｇ１７Ｅ、Ｖ１９Ａ、Ｉ２１Ｌ、Ｐ４５Ａ、Ｎ４７Ｒ、Ｖ６０Ｉ、Ｓ６２Ａ、Ｑ７２Ｄ、Ｄ８３Ｅ、Ａ８５Ｆ、Ｔ８７Ｖ、及びＶ１０７Ｌの各々を含む、請求項４４に記載の抗体。
  46. 前記ＶＬポリペプチドが、配列番号８～１２のうちの１つに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、請求項１、３０又は３１に記載の抗体。
  47. 前記ＶＬポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の抗体。
  48. 前記ＶＬポリペプチドが、配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、請求項３７に記載の抗体。
  49. 前記ＶＬポリペプチドが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の抗体。
  50. 前記ＶＬポリペプチドが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、請求項４３に記載の抗体。
  51. 前記ＶＬポリペプチドが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を含む、請求項４４又は請求項４５に記載の抗体。
  52. ワクシニアウイルスＢ５抗原（ＶＶ Ｂ５）に特異的に結合する抗体であって、前記抗体は、
    可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドであって、
    アミノ酸配列ＳＳＹＹＭＣ（配列番号１３）を含むＶＨ ＣＤＲ１と、
    アミノ酸配列ＣＩＹＴＳＳＧＳＡＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）を含むＶＨ ＣＤＲ２と、
    アミノ酸配列ＮＡＶＧＳＳＹＹＬＹＬ（配列番号１７）を含むＶＨ ＣＤＲ３と、
    を含む、ＶＨポリペプチド、及び、
    可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドであって、
    アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＶＡＧＮＮＹＬＳ（配列番号１８）を含むＶＬ ＣＤＲ１と、
    アミノ酸配列ＳＶＳＴＬＡＳ（配列番号１９）を含むＶＬ ＣＤＲ２と、
    アミノ酸配列ＱＧＹＹＮＤＧＩＷＡ（配列番号２０）を含むＶＬ ＣＤＲ３と、
    を含む、ＶＬポリペプチド
    を含む、抗体。
  53. 前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項５２に記載の抗体。
  54. 前記抗体が、ＩｇＧである、請求項１～５３のいずれか一項に記載の抗体。
  55. 前記抗体が、ヒトＦｃドメインを含む、請求項５４に記載の抗体。
  56. 前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦ（ａｂ’）からなる群から選択される、請求項１～５３のいずれか一項に記載の抗体。
  57. 前記抗体が、単鎖抗体である、請求項１～５３のいずれか一項に記載の抗体。
  58. 前記単鎖抗体が、ｓｃＦｖである、請求項５７に記載の抗体。
  59. 前記抗体が、請求項１～５３のいずれか一項に定義されるＶＨポリペプチド－ＶＬポリペプチド対を含む第１の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体である、請求項１～５８のいずれか一項に記載の抗体。
  60. 前記二重特異性抗体が、ワクシニアウイルスＢ５抗原以外の抗原と特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、請求項５９に記載の抗体。
  61. 前記ワクシニアウイルスＢ５抗原以外の抗原が、免疫細胞表面抗原である、請求項６０に記載の抗体。
  62. 前記免疫細胞表面抗原が、免疫エフェクター細胞表面抗原である、請求項６１に記載の抗体。
  63. 前記免疫細胞表面抗原が、Ｔ細胞表面抗原である、請求項６２に記載の抗体。
  64. 前記抗原が、Ｔ細胞刺激分子である、請求項６３に記載の抗体。
  65. 前記Ｔ細胞刺激分子が、ＣＤ３又はＣＤ２８である、請求項６４に記載の抗体。
  66. 前記免疫細胞表面抗原が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面抗原である、請求項６２に記載の抗体。
  67. 前記免疫細胞表面抗原が、マクロファージ細胞表面抗原である、請求項６２に記載の抗体。
  68. 融合タンパク質であって、
    アミノ酸の異種配列に融合された、請求項１～５３のいずれか一項に記載の抗体の鎖を含む、融合タンパク質。
  69. 前記アミノ酸の異種配列が、前記抗体の前記鎖のＣ末端に融合されている、請求項６８に記載の融合タンパク質。
  70. 前記抗体が、請求項５７又は５８に記載の単鎖抗体である、請求項６８又は請求項６９に記載の融合タンパク質。
  71. 前記融合タンパク質が、
    前記単鎖抗体と、
    膜貫通ドメインと、
    細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項７０に記載の融合タンパク質。
  72. コンジュゲートであって、
    請求項１～６７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項６８～７１のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、
    前記抗体又は前記融合タンパク質にコンジュゲートされた薬剤と、を含む、コンジュゲート。
  73. 前記薬剤が、化学療法剤、毒素、放射線増感剤、放射性同位体、検出可能な標識、及び半減期延長部分からなる群から選択される、請求項７２に記載のコンジュゲート。
  74. 前記放射性同位体が、治療用放射性同位体である、請求項７３に記載のコンジュゲート。
  75. 前記検出可能な標識が、放射性標識である、請求項７３に記載のコンジュゲート。
  76. 前記放射性標識が、ジルコニウム－８９（８９Ｚｒ）である、請求項７５に記載のコンジュゲート。
  77. 前記薬剤が、切断不可能なリンカーを介して前記抗体又は前記融合タンパク質にコンジュゲートされている、請求項７２～７６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  78. 前記薬剤が、切断可能なリンカーを介して前記抗体又は前記融合タンパク質にコンジュゲートされている、請求項７２～７６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  79. 前記切断可能なリンカーが、酵素切断可能なリンカーである、請求項７８に記載のコンジュゲート。
  80. 前記リンカーが、リソソームプロテアーゼによって切断可能である、請求項７９に記載のコンジュゲート。
  81. 前記リンカーが、カテプシン又はプラスミンによって切断可能である、請求項８０に記載のコンジュゲート。
  82. 請求項１～６７のいずれか一項に記載の抗体の可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド、又はその両方をコードする、核酸。
  83. 請求項６８～７１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
  84. 請求項８２又は請求項８３に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  85. 細胞であって、
    請求項８２若しくは請求項８３に記載の核酸、又は
    請求項８４に記載の発現ベクター、を含む、細胞。
  86. 前記細胞が、請求項８３に記載の核酸又は請求項８３に記載の核酸を含む発現ベクターを含む、請求項８５に記載の細胞。
  87. 前記核酸が、請求項７１に記載のＣＡＲをコードし、前記細胞が、その表面上に前記ＣＡＲを発現する、請求項８６に記載の細胞。
  88. 前記細胞が、免疫細胞である、請求項８７に記載の細胞。
  89. 前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項８８に記載の細胞。
  90. 前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項８９に記載の細胞。
  91. 前記細胞が、ＮＫ細胞である、請求項８９に記載の細胞。
  92. 前記細胞が、マクロファージである、請求項８９に記載の細胞。
  93. 細胞であって、
    請求項１～５３のいずれか一項に記載の抗体の前記可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドをコードする第１の核酸と、
    前記抗体の前記可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドをコードする第２の核酸と、を含む、細胞。
  94. 前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
    前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む、請求項９３に記載の細胞。
  95. 請求項８５～９４のいずれか一項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
  96. 請求項８７～９２のいずれか一項に記載の細胞を含む、請求項９５に記載の医薬組成物。
  97. 薬学的に許容される担体を更に含む、請求項９５又は請求項９６に記載の医薬組成物。
  98. 請求項１～５３のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、前記細胞が前記抗体を発現するのに好適な条件下で、請求項８５～９４のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含み、前記抗体が産生される、方法。
  99. 医薬組成物であって、
    請求項１～６７のいずれか一項に記載の抗体と、
    薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
  100. 医薬組成物であって、
    請求項６８～７１のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、
    薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
  101. 医薬組成物であって、
    請求項７２～８１のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、
    薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
  102. キットであって、
    請求項９５～９７又は９９～１０１のいずれか一項に記載の医薬組成物と、
    前記医薬組成物をそれを必要とする個体に投与するための説明書と、を含む、キット。
  103. 前記医薬組成物が、１つ以上の単位用量で存在する、請求項１０２に記載のキット。
  104. 前記医薬組成物が、２つ以上の単位用量で存在する、請求項１０２に記載のキット。
  105. 方法であって、
    請求項９５～９７又は９９～１０１のいずれか一項に記載の医薬組成物を、がんを有する個体に投与することを含み、前記個体は、ワクシニアウイルス（ＶＶ）に感染したがん細胞を含み、前記抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートは、前記感染したがん細胞の表面上に発現するＶＶ Ｂ５抗原によって、前記感染したがん細胞に標的化される、方法。
  106. 前記医薬組成物を前記個体に投与する前に、ＶＶを前記個体に投与することによって、前記がん細胞に感染させることを更に含む、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記方法が、前記個体の前記がんを治療する方法である、請求項１０５又は１０６に記載の方法。
  108. 請求項１０１に記載の医薬組成物が前記個体に投与され、前記コンジュゲートが、インビボイメージング剤である検出可能な標識又は放射性同位体にコンジュゲートされた前記抗体を含み、前記方法が、前記インビボイメージング剤を使用して、前記個体中の前記感染したがん細胞をイメージングすることを含む、請求項１０５～１０７のいずれか一項に記載の方法。
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