JP2020517239A - 抗pd−l1抗体とその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)配列番号1〜3にそれぞれ対応する重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに配列番号4〜6にそれぞれ対応する軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、もしくは95%を超えて同一である配列;
(2)配列番号7〜9にそれぞれ対応する重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに配列番号10〜12にそれぞれ対応する軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、もしくは95%を超えて同一である配列;
(3)配列番号13〜15にそれぞれ対応する重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに配列番号16〜18にそれぞれ対応する軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、もしくは95%を超えて同一である配列;
(4)配列番号1、2および19にそれぞれ対応する重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに配列番号4〜6にそれぞれ対応する軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、もしくは95%を超えて同一である配列;
(5)配列番号7、20および9にそれぞれ対応する重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに配列番号10〜12にそれぞれ対応する軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、もしくは95%を超えて同一である配列;
(6)配列番号13〜15にそれぞれ対応する重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに配列番号21、17および18にそれぞれ対応する軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、もしくは95%を超えて同一である配列。
1)配列番号22〜25にそれぞれ対応するFR1、FR2、FR3およびFR4配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、95%もしくは99%を超えて同一である配列;
2)配列番号30〜33にそれぞれ対応するFR1、FR2、FR3およびFR4配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、95%もしくは99%を超えて同一である配列;
3)配列番号38〜41にそれぞれ対応するFR1、FR2、FR3およびFR4配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、95%もしくは99%を超えて同一である配列;
4)配列番号30〜33にそれぞれ対応するFR1、FR2、FR3およびFR4配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、95%もしくは99%を超えて同一である配列。
1)配列番号26〜29にそれぞれ対応するFR1、FR2、FR3およびFR4配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、95%もしくは99%を超えて同一である配列;
2)配列番号30〜33にそれぞれ対応するFR1、FR2、FR3およびFR4配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、95%もしくは99%を超えて同一である配列;
3)配列番号38〜41にそれぞれ対応するFR1、FR2、FR3およびFR4配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、95%もしくは99%を超えて同一である配列;
4)配列番号30〜33にそれぞれ対応するFR1、FR2、FR3およびFR4配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、95%もしくは99%を超えて同一である配列。
1)配列番号47、49、51、53もしくは54に対応する配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、95%もしくは99%同一である配列。
1)配列番号48、50、52、55もしくは56に対応する配列、または前述の配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、95%もしくは99%同一である配列。
(i)配列番号1〜3;
(ii)配列番号7〜9;
(iii)配列番号13〜15;
(iv)配列番号1、2および19;
(v)配列番号7、20および9;
(i)配列番号4〜6;
(ii)配列番号10〜12;
(iii)配列番号16〜18;
(iv)配列番号21、17および18。
モノクローナル抗体mAb B60−55、BII61−62、B50−6、B60、BII61およびB50重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、対応する核酸配列に由来してもよい。抗体mAb B60−55、BII61−62、B50−6、B60、BII61およびB50重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号47、49、51、53、54および51に対応する。抗体mAb B60−55、BII61−62、B50−6、B60、BII61およびB50軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号48、50、52、48、55および56に対応する。
ヒトPD−L1の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、タンパク質データベースUniprotに含まれるPD−L1(Q9NZQ7)のアミノ酸配列(すなわち、Q9NZQ7に含まれる残基1から残基238の配列)に基づいて得られた;IgG1−Fcの構造ドメインのアミノ酸配列は、タンパク質データベースUniprotに含まれるヒト免疫グロブリンgamma1(IgG1)(P01857)の定常領域のアミノ酸配列に基づいて得られた(すなわち、P01857に含まれる残基104から残基330の配列);および、IgG1−Fcの構造ドメインのアミノ酸配列は、タンパク質データベースUniprotに含まれるヒト免疫グロブリンgamma1(IgG1)(P01868)の定常領域のアミノ酸配列に基づいて得られた(すなわち、P01868に含まれる残基98から残基324の配列)。オンラインツールDNAworks(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)を使用して、対応コードするDNA配列を設計し、hPD−L1−FcおよびhPD−L1−muFc融合タンパク質遺伝子を得て、同じ方法を使用してhPD−1−Fc遺伝子を得た。増強した緑色蛍光タンパク質(EGFP)のアミノ酸配列(C5MKY7)、ならびにヒトPD−L1のアミノ酸配列(Q9NZQ7)、マウスPD−L1のアミノ酸配列(Q9EP73)およびヒトのアミノ酸配列PD−1(Q15116)は、タンパク質データベースUniprotに含まれる情報に基づいて得られた。オンラインツールDNAworks(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)を使用して、対応コードするDNA配列を設計し、PD−L1−EGFP融合タンパク質遺伝子を得て、同じ方法を使用してhPD−1−EGFPおよびmPD−L1−EGFP遺伝子を得た。対応するDNA断片は、人工合成によって得られた。合成した遺伝子配列は、Fermentas製のHindIIIとEcoRIで二重切断され、市販のベクターpcDNA4/myc−HisA(Invitrogen、V863−20)にクローンし、その後、プラスミドが正確に構築されて組換えプラスミドDNA;すなわち、pcDNA4−hPD−L1−Fc、pcDNA4−hPD−L1−muFc、pcDNA4−hPD1−Fc、pcDNA4−hPD−L1−EGFP、pcDNA4−hPD1−EGFPおよびpcDNA4−mPD−L1−EGFPが得られたことを確認するために配列決定を行った。
PDL2−F HindIII:GCGCAAGCTTGCCACCATGATCTTCCTCCTGCTAATG(配列番号74)、
PDL2−R EcoI:
GCCGAATTCGATAGCACTGTTCACTTCCCTC(配列番号75);
hB7H3−F HindIII:GCGCAAGCTTGCCACCATGCTGCGTCGGCGGGGCAGC(配列番号76);
hB7H3−R BamHI:GCGCGAATTCGGCTATTTCTTGTCCATCATCTTC(配列番号77)
酵母ディスプレイ技術を使用して、PD−L1についての完全ヒト抗体をスクリーニングした。21人の健康なヒト対象から得られた脾臓およびリンパ節IgMおよびIgG cDNAに含まれるVHおよびVL遺伝子のクローニングを行って、scFV酵母ディスプレイライブラリーを構築した(VHとVL間の連結配列は連結ペプチド
GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号67)
および連結ペプチドであった)ライブラリーのストレージ容量は5×108であった。10倍容量の酵母ライブラリーを起こし、その表面に抗体が発現するように酵母を誘導した。100nMのビオチン化hPD−L1抗原磁気ビーズを使用して2ラウンドの濃縮を行い、その後、抗myc抗体とビオチン化hPD−L1フローソーティングを使用してさらに2ラウンドの濃縮を行った。このようにして得られた酵母をプレーティングし、単一クローンを採った。増幅および発現の誘導に供されたモノクローナル酵母は、抗myc抗体ならびにビオチン化hPD−L1または対照抗原hPD−1を使用した染色分析にさらに供され、抗原−陽性または対照−陰性である酵母は陽性酵母として評価された。
pNL6−F:
GTACGAGCTAAAAGTACAGTG(配列番号78);
pNL6−R:
TAGATACCCATACGACGTTC(配列番号79);
ここで、使用された配列決定プライマーはpNL6−Rであった。配列決定後に得られた配列結果は、BioEditソフトウェアパッケージを使用したアライメント解析に供した。
GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号67)
は前述の抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間に含まれていた。
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKWYNDYADSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS(配列番号51);
ここで、下線部はCDR1、2および3を構成し、それぞれ配列番号13〜15に対応し、非下線部はFR1、2、3および4を構成し、それぞれ配列番号38〜41に対応する;
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCTTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCGACTCTGTGAAAAGTCGATTAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAATTAAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA(配列番号59);
QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL(配列番号56);
ここで、下線部はCDR1、2および3を構成し、それぞれ配列番号21、17および18に対応し、非下線部はFR1、2、3および4を構成し、それぞれ配列番号42〜45に対応する;
CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCTGTACTGGCACCAGTAGTGATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTC(配列番号66)
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFSYGWFDYWGQGTLVTVSS(配列番号53);
ここで、下線部はCDR1、2および3を構成し、それぞれ配列番号1、2および19に対応し、非下線部はFR1、2、3および4を構成し、それぞれ配列番号22〜25に対応する;
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAGCTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(配列番号60);
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK(配列番号48);
ここで、下線部はCDR1、2および3を構成し、それぞれ配列番号4〜6に対応し、非下線部はFR1、2、3および4を構成し、それぞれ配列番号26〜29に対応する;
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA(配列番号62)
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYAVSVKSRISINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTVSS(配列番号54);
ここで、下線部はCDR1、20および3を構成し、それぞれ配列番号7、2および9に対応し、非下線部はFR1、2、3および4を構成し、それぞれ配列番号30〜33に対応する。
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATATTTTGTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(配列番号61);
DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK(配列番号55);
ここで、下線部はCDR1、2および3を構成し、それぞれ配列番号10〜12に対応し、非下線部はFR1、2、3および4を構成し、それぞれ配列番号34、46、36および37に対応する;
GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATA TCAAA(配列番号65)
テンプレートとしてpEE6.4−B50−Fc、pEE6.4−B60−FcおよびpEE6.4−BII61−Fcプラスミド、ならびに:
pEE6.4−F:
TCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGC(配列番号80)および
cMyc−BBXhoI:GCCAGATCTCGAGCTATTACAAGTCTTCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCTAGAATTCCG(配列番号81)
をプライマーとして使用して、標準PCR反応をそれぞれ行った。PCR産物を精製し、Fermentas NheIおよびBglIIを用いて市販のpCT302ベクター市販(addgene:#41845)にクローニングして、組換えプラスミドpCT302−B50、pCT302−B60およびpCT302−BII61を得た。次に、Ginger et al. (2006) Nat Protoc 1(2):755-68に詳述されている方法に基づいて、エラープローンPCRを使用し、scFvランダム変異PCR産物を得た。使用したプライマーは:
T7プロショート:
TAATACGACTCACTATAGGG(配列番号82)および
スプライス4/L:
GGCAGCCCCATAAACACACAGTAT(配列番号83)
上記のように得られた親和性成熟酵母ライブラリーを10nMおよび1nMのhPD−L1−Fcタンパク質を使用した2ラウンドのフローソーティングに供し、このようにして得られた酵母産物をプレーティングし、同定のためにモノクローンを採った。低濃度の抗原染色を使用してフロー染色を行い、以前に得た野生型酵母を対照として使用することにより、親和性が増加した酵母モノクローンを同定した。
GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号67)
が前述の抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間に含まれていた。
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKWYNDYADSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS(配列番号51);
ここで、下線部はCDR1、2および3を構成し、それぞれ配列番号13〜15に対応し、非下線部はFR1、2、3および4を構成し、それぞれ配列番号38〜41に対応する;
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCTTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCGACTCTGTGAAAAGTCGATTAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAATTAAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA(配列番号59);
QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL(配列番号52);
ここで、下線部はCDR1、2および3を構成し、それぞれ配列番号16〜18に対応し、非下線部はFR1、2、3および4を構成し、それぞれ配列番号42〜45に対応する。
CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCTGTACTGGCACCAGTAGTAATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAG CTGACCGTCCTC(配列番号64);
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFNYGWFDYWGQGTLVTVSS(配列番号47);
ここで、下線部はCDR1、2および3を構成し、それぞれ配列番号1〜3に対応し、非下線部はFR1、2、3および4を構成し、それぞれ配列番号22〜25に対応する;
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAACTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(配列番号57);
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK(配列番号48);
ここで、下線部はCDR1、2および3を構成し、それぞれ配列番号4〜6に対応し、非下線部はFR1、2、3および4を構成し、それぞれ配列番号26〜29に対応する;
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGCCAGGTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAAT CAAA(配列番号62);
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYAVSVKGRISINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTV SS(配列番号49);
ここで、下線部はCDR1、2および3を構成し、それぞれ配列番号7〜9に対応し、非下線部はFR1、2、3および4を構成し、それぞれ配列番号30〜33に対応する;
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAGTATCTGTGAAAGGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATATTTTGTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(配列番号58);
DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLVYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK(配列番号50);
ここで、下線部はCDR1、2および3を構成し、それぞれ配列番号10〜12に対応し、非下線部はFR1、2、3および4を構成し、それぞれ配列番号34〜37に対応する;
GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCTAAGCTCCTGGTCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA(配列番号63)
Uniprotタンパク質データベース(P01857)に含まれるヒト免疫グロブリンgamma1(IgG1)の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、ヒトIgG1定常領域のアミノ酸配列が得られた。ヒトIgG1定常領域遺伝子を得るため、オンラインツールDNAworks(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)を使用して対応するエンコードDNA配列を設計し、スクリーニングにより得られたB50−6、B60−55およびBII61−61の重鎖可変領域のVH配列をヒトIgG1定常領域遺伝子とともにスプライスし、同時にVHの5’末端に以下のシグナルペプチド配列を加えた:
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT(配列番号84);
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT(配列番号84);
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT(配列番号84);
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号68);
GCCAGCACTAAGGGGCCCTCTGTGTTTCCACTCGCCCCTTCTAGCAAAAGCACTTCCGGAGGCACTGCAGCACTCGGGTGTCTGGTCAAAGATTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGAGCTGGAACTTGGCGCCCTCACCTCCGGGGTTCACACCTTTCCAGCCGTCCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTCGTTACCGTGCCATCCTCTTCTCTGGGGACCCAGACATACATCTGCAATGTCACCATAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTCGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACACACACCTGCCCTCCATGCCCCGCACCTGAACTCCTGGGCGGGCCTTCCGTTTTCCTGTTTCCTCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATTAGCCGCACCCCCGAAGTCACTTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCAGAAGTTAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGGGTCGAGGTGCACAATGCTAAACAAAGCCCAGGGAGGAGCAATATAACTCCACATACAGAGTGGTGTCCGTTCTGACAGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCACTGCCAGCCCCATAGAGAAGACAATCTCTAAAGCTAAAGGCCAACCACGCGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCATCCAGGGACGAACTGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACTTGTCTCGTCAAAGGATTCTACCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAACGGCCAACCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCAGTCCTGGACTCTGATGGGAGCTTTTTCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCATAACCACTATACCCAGAAAAGCCTCAGCCTGTCCCCCGGGAAATAATGA(配列番号69);
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号70);
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGTACCGCTAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTATCCACGGGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAAGGGACAATGCCCTCCAGAGCGGAAATAGCCAAGAGTCCGTTACCGAACAGGACTCTAAAGACTCTACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTCTCCAAGGCCGACTATGAGAAACACAAGGTTTACCATGCGAGGTCACACACCAGGGACTCTCCTCTCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGAGAATGC(配列番号71);
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS(配列番号72);
GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCGTAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGTGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTATGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACGCTGCCGGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTGCAGAATGCTCT(配列番号73)
精製抗hPD−LI抗体およびhPD−L1結合能の測定(ELISA法):
コーティング緩衝液(50mM炭酸塩−重炭酸塩緩衝液、pH9.6)を使用してhPD−LI−muFcを2μg/mlに希釈し、その後、溶液を100μL/ウェルに分注し、4℃で一晩静置した。次に、プレート上の液体を捨て、PBST(pH7.4、0.05%Tween−20、V/V)を使用して洗浄を行い、サンプルを3%BSA−PBSで1時間シールした。抗体B50−6mAb、B60−55mAb、およびBII61−62mAbは、対照として使用される希釈液(1%BSA−PBS)で、それぞれ2000ng/mlから始まる2倍連続希釈に供して合計11種類の濃度とし、37℃で2時間、インキュベーションを行った。次いで、ヤギ抗ヒトIgG−HRP(ヤギ抗ヒトIgG−HRPコンジュゲート)を添加し、1時間、インキュベーションを行った。次に、可溶性の単一成分TMB発色基質溶液を添加し、各サンプルを室温で暗い環境で5〜10分間展開した。2NH2SO4を50μL/ウェルで添加して、展開反応を停止した。次に、各サンプルをMD SpectraMax Plus384マイクロプレートリーダー上に置き、OD450nm−650nmの値を読み取り、その後、SoftMax Pro v5.4ソフトウェアパッケージを使用してデータ処理とマッピング分析を行った;結果を図4に示す。
組換えヒトPD−L1に関する抗PD−L1抗体B50−6 mAb、BII61−62 mAbおよびB60−55 mAbの結合キネティクスの測定は、Biacore X100を使用して行われた表面プラズモン共鳴(SRP)を使用して測定された。およそ1000応答単位(RU)を得るために、組換えhPD−L1−FcをCM5バイオセンサーチップに直接コーティングした。キネティクス測定のために、HBS−EP+1×緩衝液(GE、カタログ番号:BR−1006−69)での3倍連続希釈(1.37nmから1000nm)で抗体を希釈し、サンプリングを25℃で120秒間行い、30分の解離時間で、再生は10mMグリシン−HCl(pH2.0)で120秒間行った。単純な1対1のLanguir結合モデル(Biacore評価ソフトウェアバージョン3.2)を使用して、結合率(kon)と解離率(koff)を計算した。平衡解離定数(kD)は、koff/konの比として計算した。
コーティング緩衝液(50mM炭酸塩−重炭酸塩緩衝液、pH9.6)を使用してhPD−L1−hIgGを5μg/mlに希釈した後、溶液を4℃で一晩静置した。PBST(pH7.4、0.05%Tween−20、V/V)を使用して洗浄を行い、サンプルを3%BSA−PBSで1時間シールした。測定待ちの抗hPD−L1 mAbの濃度を100μg/mlに希釈し、その後1%BSA−PBST−0.05%Tween−20(10μg/mlのhPD−1−hIgG−ビオチンを含む)を用い、合計9種類の希釈液で1:6連続希釈し、希釈液を37℃で2時間静置した。プレートを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン(SA−HRP)を添加し、サンプルを室温で1.5時間インキュベートした。次に、可溶性の単一成分TMB発色基質溶液を加え、各サンプルを室温、暗室環境で5〜10分間展開し、その後2NH2SO4を加えて展開反応を停止した。次に、各サンプルをMD SpectraMax Plus384マイクロプレートリーダー上に置き、OD450nm−650nmの値を読み取り、その後、SoftMax Pro v5.4ソフトウェアパッケージを使用してデータ処理とマッピング分析を行った;また、測定データとIC50値に基づいて抗体の競合性を分析し、結果を図5に示す。
スクリーニングによって得られた3つの抗体株、B60−55、BII61−62およびB50−6を競合ELISA法により、PD−L1およびCD80結合をブロックできるか否かを判定するために評価した。使用した特定の方法は以下の通りである:コーティング緩衝液(50mM炭酸塩−重炭酸塩緩衝液、pH9.6)を使用してhPD−L1−hFcを5μg/mlに希釈し、その後、溶液を4℃で一晩静置した。PBST(pH7.4、0.05%Tween−20、V/V)を使用して洗浄を行い、サンプルを3%BSA−PBSで1時間シールした。測定待ちの抗hPD−L1 mAbの濃度を100μg/mlに希釈し、その後1%BSA−PBST−0.05%Tween−20(100μg/mlのhCD80−hFc−ビオチン、R&D:140−B1−100を含む)を使用して、合計9種類の希釈液に1:6連続希釈を行い、希釈液を37℃で2時間静置した。プレートを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン−ビオチン(SA−HRPコンジュゲート)を加え、サンプルを室温で1.5時間インキュベートした。次に、可溶性の単一成分TMB発色基質溶液を加え、各サンプルを室温、暗室環境で5〜10分間展開し、その後2NH2SO4を加えて展開反応を停止した。次に、各サンプルをMD SpectraMax Plus384マイクロプレートリーダー上に置き、OD450nm−650nmの値を読み取り、その後、SoftMax Pro v5.4ソフトウェアパッケージを使用してデータ処理とマッピング分析を行った;また、測定データとIC50値に基づいて抗体の競合性を分析し、結果を図6に示す。
実施例1で構築されたhPD−L1−EGFP、hB7H3−EGFPおよびhPD−L2−EGFPを含むHEK293細胞を0.5%PBS−BSA緩衝液に懸濁し、その後、抗hPD−L1 mAbタンパク質を添加し(陰性対照として使用したhIgG Fcとともに)、氷上でインキュベーションを20分間行った。洗浄後、eBioscience二次抗体抗−hIg−PEを加え、サンプルを氷上に20分間静置した。洗浄後、細胞を500μlの0.5%PBS−BSA緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターでの測定に供した。
実施例1で構築されたhPD−L1−EGFPおよびmPD−L1−EGFPを含むHEK293細胞を0.5%PBS−BSA緩衝液に懸濁し、その後、標的抗hPD−L1 mAbを添加し(陰性対照として使用したhIgG Fcとともに)、氷上でインキュベーションを20分間行った;次に洗浄を行い、eBioscience二次抗体抗hIg−PEを加え、サンプルを氷上に20分間静置した。洗浄後、細胞を0.5%PBS−BSA緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターでの測定に供した。結果を図7に示す。結果に示すように、B50−6 mAbはマウスPD−L1(mPD−L1)と結合可能であったが、B60−55およびBII61−62はmPD−L1と結合できなかった。
カニクイザルPBMCはヒトリンパ球分離培地(Tianjin Hao Yang)を使用して分離し、細胞をRPMI完全培地に再懸濁し、その後、細胞密度を100万細胞/mlに調整した;続けて、200万のカニクイザルPBMCを24ウェルプレートに加え、同時にフィトヘマグルチニン(phytohaemagglutinin;PHA)を最終濃度2μg/mlで加えた;細胞を48時間刺激した後、収集し、FACS緩衝液で洗浄し、抗体染色に供した。アイソタイプctrl(抗KLH)を陰性対照として使用し、市販のPE標識抗ヒトPD−L1抗体(Biolegend:329705)を陽性対照として使用した。自家抗体を一次抗体として使用し、洗浄を行った後、二次抗体として抗hIg−PEを使用して抗体染色を行った。各染色工程の後、4℃で30分間インキュベートし、染色を行った後、FACS緩衝液を使用して遠心分離で細胞を2回洗浄し、その後、二次抗体を加えるか、または細胞を2%パラホルムアルデヒドで直接固定し、その後、グアバ(Guava)を使用して分析した。結果を図8に示す。結果は、カニクイザルT細胞がPHAで刺激された後にPD−L1を発現し、産生された3つの抗体株が活性化したカニクイザルT細胞と結合可能であることを示した。
ヒトリンパ球分離培地(Tianjin Hao Yang)を使用して、密度勾配遠心を介して健康なドナーから得られた濃縮末梢白血球細胞から末梢血単核細胞(PBMC)を分離した。次に、前記細胞を無血清RPMI1640に再懸濁し、10cmディッシュで1〜2時間培養した後、非接着細胞を除去し、10%FBSを含むRPMI内で細胞を培養した。GM−CSF(Shanghai Primegene:102−03)については250ng/ml、IL−4(Shanghai Primegene:101−04)については100ng/mlの最終濃度でサイトカインを加え、その後、2〜3日毎に新鮮なサイトカイン含有培地を加えた。培養6日目、50ng/ml TNF−alpha(Shanghai Primegene:103−01)を使用して細胞成熟を誘導し、細胞をさらに24時間インキュベートした。成熟樹状細胞を採取し、HLA−DR抗体で染色して、成熟を確認した。その後、細胞を200000細胞/mlの濃度でRPMI完全培地に再懸濁した。得られた懸濁液50μlを96ウェルU底プレート(Costar:3799)の各ウェルに加え、インキュベーター内で細胞を培養させた。
体の抗腫瘍T細胞応答を弱める方法として、多くの腫瘍がPD−1リガンドを発現することはすでに明らかである。PD−L1の発現レベルの特徴的な増加は、多くの異なる対象の腫瘍および腫瘍浸潤白血球において発見され、前記のPD−L1発現の増加はしばしば予後不良と関連している。マウス腫瘍モデルは、腫瘍におけるPD−L1発現の同様の増加を示しており、腫瘍免疫の阻害におけるPD−1/PD−L1経路の役割もまた実証している。
抗PD−L1抗体B60−55とMedImmune LLCの抗体2.41H90Pの加速安定性試験を45℃で行った。使用した具体的な試験手順は以下の通りであった:抗PD−L1抗体B60−55とMedImmune LLCの抗−PD−L1抗体2.41H90P(米国特許20130034559に記載されている2.14H9の調製方法に従って調製され、その後抗体は2.41H90Pと名付け直した)を10mg/mlの濃度に濃縮し、その後100μgの抗体を200μgのPCRチューブに加え、45℃のバッチに設置した;0、10、20、30日目にサンプルを取り、その後、競合ELISAおよびSE−HPLC分析試験を行った。ここで、IC50値を得るために使用した競合ELISA法は、実施例6に記載したものと同じであった。SE−HPLCはShimadzu LC LC20AT HPLCクロマトグラフを使用して行った;サンプルを1mg/mlに濃縮し、50μgの総サンプル容量について、サンプルを0.5ml/分の流量でロードした;サンプルのロード後30分間、アイソクラティック溶出を行い、結果を図12に示した。
抗体の調製スケールアップの可能性を評価するために、前に記載されるように例示的な抗体変異体B50−55−1を本質的にクローン化した。B60−55−1完全重鎖のアミノ酸配列は:
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFNYGWFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
(配列番号85);
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAACTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCAGCACTAAGGGGCCCTCTGTGTTTCCACTCGCCCCTTCTAGCAAAAGCACTTCCGGAGGCACTGCAGCACTCGGGTGTCTGGTCAAAGATTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGAGCTGGAACTCTGGCGCCCTCACCTCCGGGGTTCACACCTTTCCAGCCGTCCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTCGTTACCGTGCCATCCTCTTCTCTGGGGACCCAGACATACATCTGCAATGTCAACCATAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTCGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACACACACCTGCCCTCCATGCCCCGCACCTGAACTCCTGGGCGGGCCTTCCGTTTTCCTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATTAGCCGCACCCCCGAAGTCACTTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCAGAAGTTAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGGGTCGAGGTGCACAATGCTAAAACAAAGCCCAGGGAGGAGCAATATGCCTCCACATACAGAGTGGTGTCCGTTCTGACAGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCACTGCCAGCCCCCATAGAGAAGACAATCTCTAAAGCTAAAGGCCAACCACGCGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCATCCAGGGAGGAAATGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACTTGTCTCGTCAAAGGATTCTACCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAACGGCCAACCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCAGTCCTGGACTCTGATGGGAGCTTTTTCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGGTGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCATAACCACTATACCCAGAAAAGCCTCAGCCTGTCCCCCGGGAAATAATGA
(配列番号86);
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(配列番号87);
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGTACCGCTAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTATCCACGGGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAATGCCCTCCAGAGCGGAAATAGCCAAGAGTCCGTTACCGAACAGGACTCTAAAGACTCTACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTCTCCAAGGCCGACTATGAGAAACACAAGGTTTACGCATGCGAGGTCACACACCAGGGACTCTCCTCTCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGAGAATGC
(配列番号88);
この調査の目的は、SPR法を使用して、B60−55−1とアテゾリズマブのヒトPD−L1との相互作用の結合パラメータを比較評価することであった。いくつかのアプローチを使用してアッセイを行い、PD−L1−Hisタグ付きタンパク質とPD−L1−Fc融合タンパク質の2つのバージョンのヒトPD−L1を使用した。一連の異なる濃度のPD−L1リガンドを使用して、解離定数(Kd)を計算した。以下の機器を用いた:R75000DC、プラズモン共鳴分光計、Reichert Technologies、SPRAutolinkコントロールおよびTraceDrawer評価ソフトウェアパッケージを備えた機器番号00478−1115。センサーチップSR7000ゴールドセンサースライド、500kDaカルボキシメチルデキストラン、Reichert、Inc、Prt No:13206066
この例では、B60−55−1抗体のエフェクター機能の比較薬抗体アテゾリズマブとのさらなる分析と比較を開示している。本開示は、Fcガンマ受容体への結合の評価を含む:CD16a、CD32a、およびCD64;PD−L1陽性細胞を使用した抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)活性;補体誘導細胞毒性(CDC)活性、C1q結合、およびFcRn結合評価。
混合リンパ球反応(MLR)アッセイを行い、T細胞の活性化に対するB60−55−1およびアテゾリズマブの効力を評価した。T細胞の活性化は、T細胞によって分泌されるインターロイキン2(IL−2)の濃度によって測定された。樹状細胞(DC)およびCD4+ T細胞は、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)から単離された。MLRにおけるT細胞活性化に対するペンブロリズマブの効力を、アッセイ性能を監視するための内部対照として使用した。GraphPad PrismによるS字型用量反応非線形回帰フィットを用いて、半最大有効濃度(EC50)値を分析した。
RPMI 1640:Gibco、Invitrogen(カタログ番号22400);FBS、Gibco、(カタログ番号10099);ペニシリン−ストレプトマイシン(P/S):Gibco、Invitrogen(カタログ番号10378);リン酸緩衝生理食塩水(PBS):Gibco、Invitrogen(カタログ番号10010−023);樹状細胞のQC抗体:抗CD1a[HI149](FITC)、Abcam(ab18231)、抗CD83[HB15e](FITC)、Abcam(ab134491)、抗CD86[BU63](FITC)、Abcam(ab77276)、抗HLA DR[GRB1](FITC)、Abcam(ab91335);CD4+ T細胞単離キット:Miltenyi Biotec、(カタログ番号130−096−533);パン単球単離キット:Miltenyi Biotec、(カタログ番号130−096−537)。
単離されたばかりのヒト血液から調製された樹状細胞(20人を超える健康なドナー);単離されたばかりのヒト血液から調製されたCD4+ T細胞(20人を超える健康なドナー)。
ヒトIL2 HTRFキット(Cisbio、カタログ番号64IL2PEB)。
PHERAstarPlus、BMG Labtech。
CD4+ T細胞は、CD4+ T細胞単離キットによって精製された。PBMCは、Lymphoprepを使用して密度勾配遠心分離で調製した。GenScriptのプロトコルに従って、細胞を完全培地で37℃/5%CO2に維持した。
サンプルはドライシッパーで配送され、試験前に4℃で保管された。サンプルをRPMI 1640で希釈し、試験に適用した。
− 1000rpm、3分間の遠心分離によるエフェクター細胞(CD4+ T細胞)の収穫。
− アッセイ緩衝液での試験サンプルの連続希釈;
− エフェクター細胞ストックを96ウェルアッセイプレートに播種し、試験サンプルを加える;
− 1000rpmで3分間の遠心分離による標的細胞(樹状細胞)の収穫;
− 標的細胞を加えて反応を開始し、穏やかに混合する;
− プレートを37℃/5%CO2インキュベーターで3日間インキュベートする;
− ヒトIL−2試験を行い、プレートを読み取る;
− B60−55−1およびアテゾリズマブの濃度範囲を試験する:300nMから開始して、3倍希釈、3重に10ポイント;
− ペンブロリズマブの試験濃度範囲:10μg/mlから開始、5倍希釈、3重で6ポイント。
MLRアッセイの結果を図24に示す。B60−55−1とアテゾリズマブは、異なるIL−2分泌物でのMLRにおけるT細胞を活性化することができた。対照として使用したペンブロリズマブのT細胞活性化データは、過去のデータと一致していた。MLRデータの分析を表2に示す。MLRアッセイにおけるB60−55−1およびアテゾリズマブのEC50値は、0.4665nMおよび21.53nMであった。したがって、B60−55−1は、MLRアッセイでT細胞を実質的に高い効力で活性化する。
この調査の目的は、ヒト化PD−L1マウスに移植された皮下MC38−hPD−L1マウス結腸癌の治療において、B60−55−1とその比較薬アテゾリズマブのインビボでの効力を、共に10mg/kgの用量で、試験することであった。
ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM):Cellgro、カタログ番号10−013−CVR、4℃で保存。ウシ胎児血清(FBS):Excell、カタログ番号FSP500、−20℃で保存。リン酸緩衝生理食塩水(PBS):Gibco、カタログ番号20012027、4℃で保存。バランス:Shanghai Shun Yu Heng Ping Science and Equipment Co. Ltd、カタログ番号MP5002。キャリパー:Hexagon Metrolog、カタログ番号00534220。
抗体B50−55−1は、濃度50mg/mlでPBSに保存した;陰性対照IVIG:Guang Dong Shuang Lin BIO−Pharmacy Co. Ltd、ロット番号20160407、PBSに50mg/mlで保存。陽性対照抗体アテゾリズマブ:Genentech/Roche、ロット番号3109904、60mg/mlを、氷酢酸(16.5mg)、L−ヒスチジン(62mg)、ポリソルベート20(8mg)およびスクロース(821.6mg)を含む緩衝液に保存した。
試験品および対照品は、投与前にPBSで希釈し、2〜8℃で一時的に保存し、室温で4時間以内に使用した。希釈されていない残りの試験品および対照品は、2〜8℃で保存された。
40匹の雄B−hPD−L1ヒト化マウス株C57BL/6は、Beijing Biocytogen Co. Ltd.から供給された(品質証明書番号:201716816)。
動物はBeijing Biocytogen Co., Ltd.の動物センターの特定の病原体フリーバリアで、個々の換気ケージ(IVC)あたり5匹の動物が飼育された。動物は到着後3日間から1週間気候順化させた。
親のMC38マウス結腸癌細胞株は、Shunran Shanghai Biological Technology Co.Ltdから購入した。MC38−hPD−L1細胞株は、Biocytogen Co、LtdによるマウスPD−L1をヒトPD−L1に置き換えることにより構築した。細胞は、10%熱不活性化FBSを補充したDMEM中の単層培養で維持し、週2回継代培養した。対数増殖期で増殖する細胞を収穫し、腫瘍接種についてカウントした。
腫瘍の大きさは、キャリパーを使用して2次元で週に2回測定され、容量は式:V=0.5 a*b2を使用してmm3と表した。ここで、aおよびbはそれぞれ腫瘍の長径と短径である。
相対的な腫瘍成長阻害(TGI%):TGI%=(1−T/C)x100%。TおよびCは、それぞれ、所与の日の治療群および媒体群の平均相対腫瘍容量(RTV)を指す。T/C%は相対腫瘍増殖率[1]を表し、その式は:T/C%=TRTV/CRTV×100%(TRTV:治療群の平均RTV;CRTV:媒体群の平均RTV;RTV=Vt/V0、V0はグループ分け時の腫瘍容量を指し、Vtは治療後に示された各時点で測定された腫瘍容量を指す。)
IRTW%=(W対照群−W治療群)/W対照群×100で計算した。Wは平均腫瘍重量を指す。
実験の全体の間で明らかな臨床徴候は観察されなかった。ほとんどの動物の体重は、調査の間、徐々に増加した。経時的な平均体重と平均体重変化率を図25と表3に示した。B60−55−1群の動物は、対照群の動物と比較して、体重に統計的差異を示さなかった(P>0.05)。
皮膚がんを除いて、乳がんは女性で最も一般的ながんの形態であり、70歳(CDC)に達するまでに女性の約7%が発症している。米国がん協会の推定によると、2017年は米国で新たに診断された患者は252,710人、死者は40,610人となるであろう。2006年から2012年までの5年間の相対生存率は、すべてのステージあわせておよそ90%であった。トリプルネガティブ乳がんは、エストロゲンとプロゲステロン受容体とHER2タンパク質の発現が臨床的に陰性である、乳がんのユニークで攻撃的なサブタイプである。現在、この形態の乳がんに対処する標的療法はない。原発性ヒトがんのマウスモデルは、ヒト疾患を再現する、マウスにおける臨床的に重要ながんモデルとなるため、その開発は、ヒト疾患にとって重要である。ジャクソン研究所(Jackson Laboratory)は、患者由来の異種移植(PDX)乳がんモデルと、高度免疫不全NSG(商標)マウス系統およびNSG(商標)−SGM3のようなNSG(商標)由来系統における細胞株異種移植モデルを確立した。NSG(商標)(NOD.Cg−Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウスは、ヒトの細胞と組織を効率的に移植するその能力について開発された。移植効率は、免疫系の先天性欠損症のため、他のマウス系統よりも大幅に改善されている。ヒト化NSG(商標)[hu−CD34 NSG(商標)]マウスは、ヒトCD34+造血幹細胞を注射したNSG(商標)マウスであり、インビボでヒトの免疫機能を調査するための重要なツールとなってきた。これらのマウスは、新規の免疫療法、特にヒト特異的であり、マウスと十分に交差反応しないものの応用のための強力な前臨床プラットフォームを提供する。さらに、これらのモデルは、疾患のゲノムプロファイリングおよび/または前臨床薬開発のために使用される。この調査においては、ヒト化NSG(商標)マウスで確立された乳がんのMDA−MB−231細胞株異種移植モデルを使用し、新規の抗体を評価した。
移植後16週間の末梢血に>25%のヒトCD45+細胞を有するヒトCD34+細胞を移植した雌hu−CD34 NSG(商標)マウスをこの調査に使用した。2人のドナーからのCD34+細胞を移植したhu−CD34 NSG(商標)マウスのコホートを使用した。マウスは、1つのケージにつき5匹までのマウスの密度で、HEPAろ過した空気で個別に換気されたポリスルホンケージで飼育された。動物室は、制御された12時間の明暗サイクル(午前6時から午後6時)で、人工蛍光灯で全体を照らされた。動物室の通常温度と相対湿度の範囲は、それぞれ22〜26℃と30〜70%であった。動物室は、1時間あたり15までの空気交換されるように設定された。ろ過された水道水をpH2.5〜3.0に酸性化し、標準的なげっ歯類用固形飼料が自由に提供された。
2人の個々のドナーからの38匹のhu−CD34 NSG(商標)マウスを、マトリゲルとの1:1混合物中、5x106のMDA−MB−231細胞を用いて、乳房脂肪体に移植した。体重と臨床所見は、移植後週に1X〜2X記録され、腫瘍が触知可能になったら、デジタルキャリパー測定を使用して腫瘍容量を週に2X決定した。腫瘍容量が〜62−98mm3に達した時、腫瘍容量に基づいてマウスを無作為化し、0日目から始めて表7に従って投与した。体重、臨床所見およびデジタルキャリパー測定は、投与開始後週に2X記録した。≦2の身体状態スコア、≧20%の体重減少、または≧2000mm3の腫瘍容量に達した動物は、調査終了前に安楽死させた。潰瘍性腫瘍のある動物も調査終了前に安楽死させた。残りの動物はすべて、調査41日目にCO2窒息により安楽死させた。
この調査の結果を図29および図30に要約する。この結果は、調査において使用した乳がんの異種移植モデルにおいて、抗体B60−55−1がペンブロリズマブと同等の効力を示すことを示している。
Claims (25)
- (1)配列番号1、2および3にそれぞれ対応するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖、ならびに配列番号4、5および6にそれぞれ対応するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖;
(2)配列番号7、8および9にそれぞれ対応するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖、ならびに配列番号10、11および12にそれぞれ対応するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖;
(3)配列番号13、14および15にそれぞれ対応するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖、ならびに配列番号16、17および18にそれぞれ対応するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖;
(4)配列番号1、2および19にそれぞれ対応するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖、ならびに配列番号4、5および6にそれぞれ対応するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖;
(5)配列番号7、20および9にそれぞれ対応するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖、ならびに配列番号10、11および12にそれぞれ対応するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖;ならびに
(6)配列番号13、14および15にそれぞれ対応するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖、ならびに配列番号21、17および18にそれぞれ対応するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖
からなる群から選択されるポリペプチドの群を含む、抗PD−L1抗体またはその抗原結合部分。 - 以下の中から選択される配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗PD−L1抗体またはその対応する抗原結合部分:配列番号47、49、51、53もしくは54、または前記配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、95%もしくは99%同一である配列。
- 以下の中から選択される配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗PD−L1抗体またはその対応する抗原結合部分:配列番号48、50、52、55もしくは56、または前記配列の1つとそれぞれ70%、80%、85%、90%、95%または99%同一である配列。
- 抗体全体、二重特異性抗体、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2またはFvに対応する、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗PD−L1抗体またはその対応する抗原結合部分。
- 重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に連結ペプチドをさらに含むscFvである、請求項4に記載の抗PD−L1抗体またはその対応する抗原結合部分。
- 前記連結ペプチドが配列番号67の配列を含む、請求項5に記載の抗PD−L1抗体またはその対応する抗原結合部分。
- 重鎖定常領域が、IgG、IgM、IgE、IgDおよびIgAを含む群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗PD−L1抗体またはその対応する抗原結合部分。
- 重鎖定常領域が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む群から選択される、請求項7に記載の抗PD−L1抗体またはその対応する抗原結合部分。
- 軽鎖定常領域がκ領域またはλ領域である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の抗PD−L1抗体またはその対応する抗原結合部分。
- 抗体重鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子であって、前記抗体重鎖可変領域が、
(i)配列番号1〜3;
(ii)配列番号7〜9;
(iii)配列番号13〜15;
(iv)配列番号1、2および19;ならびに
(v)配列番号7、20および9
からなる群から選択されるアミノ酸配列の群を含む、核酸分子。 - 前記抗体重鎖可変領域が以下の中から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の核酸分子:配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、および配列番号54。
- 抗体軽鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子であって、前記抗体軽鎖可変領域が:
(i)配列番号4〜6;
(ii)配列番号10〜12;
(iii)配列番号16〜18;ならびに
(iv)配列番号21、17、および18
からなる群から選択されるアミノ酸配列の群を含む、核酸分子。 - 前記抗体重鎖可変領域が以下の中から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の核酸分子:配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号55、配列番号56。
- 抗体重鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子を含むベクターであって、前記抗体重鎖可変領域が:
(i)配列番号1〜3;
(ii)配列番号7〜9;
(iii)配列番号13〜15;
(iv)配列番号1、2および19;ならびに
(v)配列番号7、20および9
からなる群から選択されるアミノ酸配列の群を含む、ベクター。 - 抗体軽鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子をさらに含み、前記抗体軽鎖可変領域が:
(i)配列番号4〜6;
(ii)配列番号10〜12;
(iii)配列番号16〜18;ならびに
(iv)配列番号21、17、および18
からなる群より選択されるアミノ酸配列の群を含む、請求項14に記載のベクター。 - 配列番号85のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号87のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗PD−L1抗体、または抗体の抗原結合部分。
- 配列番号85および配列番号87からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードすることができる核酸配列を含む核酸分子。
- 配列番号86または配列番号88の配列を含む、請求項17に記載の核酸分子。
- 配列番号85および配列番号87からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードすることができる核酸を含む宿主細胞。
- 配列番号85の重鎖および配列番号87の軽鎖を有する抗体、または抗体の抗原結合部分;ならびに医薬的に許容される賦形剤またはアジュバントを含む組成物。
- 約5.9のpHを有する、約275mMのセリン、約10mMのヒスチジンを含む、請求項21に記載の組成物。
- 約5.8のpHを有する、約0.05%のポリソルベート80、約1%のD−マンニトール、約120mMのL−プロリン、約100mMのL−セリン、約10mMのL−ヒスチジン−HClを含む、請求項21に記載の組成物。
- ヒトPD−L1の活性の調節に関連する疾患を治療または予防する必要がある患者に配列番号85の重鎖および配列番号87の軽鎖を有する抗体、または抗体の抗原結合部分を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、ヒトPD−L1の活性の調節に関連する疾患または状態を治療または予防する方法。
- 前記疾患が肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がんまたは骨肉腫である、請求項23に記載の方法。
- 前記疾患がHBV、HCVまたはHIV感染である、請求項24に記載の方法。
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