KR20190141169A - 항-pd-l1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 완전한 인간 항-PD-L1 항체 및 이의 상응하는 적용을 개시한다. 완전한 인간 항체는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있다. 효모 디스플레이 라이브러리-기반 스크리닝 기술을 사용하고 PD-L1에 대한 그들의 친화도를 추가로 개선하기 위해 친화도 성숙에 의해 항체를 수득하였다. 개시된 완전한 인간 항-PD-L1 항체는 우수한 특이도, 친화도 및 안정성을 나타낸다. 이들은 종양 성장을 유의하게 억제하면서 활성화된 T 세포에 결합함으로써 T 세포 활성을 향상시킬 수 있다. 개시된 완전한 인간 항-PD-L1 항체는 PD-L1 관련 암 및 다른 관련 질환의 진단 및 치료에 사용될 수 있다.

Description

항-PD-L1 항체 및 이의 용도
본 발명은 생물의학 분야에 관한 것이며, 완전한 인간 항-PD-L1 항체 및 이의 약학적 용도에 관한 것이다.
T 세포가 외인성 항원에 반응할 때, 휴면상태의 T 림프구에 두 가지의 신호를 제공하기 위해 항원-제시 세포(APC)가 필요하다: 첫 번째 신호는 항원 인식 신호가 TCR/CD3 복합체를 통해 전송된 후에, T 세포가 TCR의 도움으로 MHC 분자에 결합된 항원 펩티드를 인식할 때 생성된다; 두번째 신호는 일련의 공동 자극 분자(costimulatory molecules)에 의해 제공되며; 이러한 방식으로, T 세포는 정상적으로 활성화 될 수 있으며, 이는 정상적인 면역 반응을 생성한다. 이들 공동 자극 분자는 두번째 신호에 의해 생성된 효과에 따라 양성 공동 자극 분자 또는 음성 공동 자극 분자로 분류 될 수 있고, 양 및 음의 공동 자극 신호의 조절뿐만 아니라 상기 신호 사이의 상대적인 균형은 신체의 전체 면역 반응을 통틀어서 전체적으로 중요한 조절 역할을 한다.
PD-1은 CD28 수용체 패밀리의 구성원이며, 상기 패밀리는 또한 CTLA4, CD28, ICOS 및 BTLA를 포함한다. 이 군의 초기 구성원인 CD28 및 ICOS는 단일클론항체가 첨가되고 T 세포 증식이 증가하는 것으로 관찰되었을 때 발견되었다(Hutloff et al. (1999) Nature 397 : 263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10 : 247-260). PD-1의 리간드는 PD-L1 및 PD-L2를 포함하고, 연구 결과는 리간드와 수용체의 결합이 T 세포 활성화 및 관련 사이토카인의 분비를 하향 조절한다는 것을 이미 보여 주었다(Freeman et al. (2000) J Exp Med 192) : 1027-34; Latchman 등 (2001) Nat Immunol 2 : 261-8; Carter 등 (2002) Eur J Immunol 32 : 634-43; Ohigashi 등 (2005) Clin Cancer Res 11 : 2947 -53).
PD-L1(B7-H1)은 B7 패밀리에 속하고 IgV- 및 IgC- 유사 영역, 막 통과 영역 및 세포질 꼬리 영역을 포함하는 세포표면 당단백질이다. 상응하는 유전자는 1999년에 처음 발견되어 복제되었고(Dong H, et al. (1999) Nat Med 5:1365-1369), 당 단백질 자체는 T 세포 수용체 PD-1과 상호 작용하고 면역 반응의 부정적인 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 결정되었다. T 세포 상에서 발현된 PD-1에 작용하는 것에 더하여, PD 세포에서 T 세포 상에서 발현될 때, PD-L1은 APC 상의 CD80과 상호 작용하여 음성 신호를 전달하여 T 세포 억제제로서 기능 할 수 있다. PD-L1은 대식세포 계통 세포에서 발현될 뿐만 아니라 정상적인 인간 조직에서도 낮은 수준으로 발현되지만, 당 단백질은 폐암, 난소암, 결장암 및 흑색종과 같은 특정 종양 세포주에서 상대적으로 높은 발현을 보인다(Iwai et al. (2002) PNAS 99 : 12293-7; Ohigashi, et al. (2005) Clin Cancer Res 11 : 2947-53). 연구 결과는 종양 세포에서 PD-L1의 증가된 발현이 T 세포 세포자멸사(apoptosis)를 증가시켜 종양 세포가 면역 반응을 회피하는 데 중요한 역할을 한다고 제안하였다. 연구자들은 PD-L1 유전자가 형질 감염된 P815 종양 세포주는 특정 CTL 용해에 대한 시험관 내(in vitro) 저항성을 나타낼 수 있으며, 상기 세포는 마우스에 접종될 때 종양성이 높고 침습성이 높다는 것을 발견하였다. 이들 생물학적 특성은 PD-L1을 차단함으로써 역전될 수 있다. PD-1 녹아웃 마우스에서, PD-L1/PD-1 경로는 차단되고 접종된 종양 세포는 종양을 형성할 수 없다(Dong H et al. (2002) Nat Med 8: 793-800).
이에, 높은 친화도로 PD-L1에 결합할 수 있고 PD-1 및 PD-L1의 결합을 차단할 수 있는 항-PD-L1 항체에 대한 요구가 남아있다.
도 1: 정제된 항-hPD-L1 scFv에 의한 hPD-L1/hPD-1 리간드-수용체 결합의 억제.
X-축은 EGFP 형광 강도를 나타내고 Y-축은 SA-PE 형광 강도를 나타낸다. A-블랭크 대조군에 해당하고 B- 음성 대조군에 해당하고 C- B50 scFv에 해당하고 D- B60 scFv에 해당하고 E는 BII61 scFv에 해당한다.
도 2: 친화도 성숙 스크리닝 후 hPD-L1 효모에 대한 친화도가 증가된 효모.
여기서, X 축은 myc의 형광 강도(전체 항체 단편을 발현하는 효모에 대한 myc 양성)를 나타내고, Y 축은 항원 결합 능력을 나타내는 형광 강도 SA-APC를 나타낸다.
도 3: hPD-1과 경쟁하여 친화도 성숙 후 hPD-L1에 결합하는 항체의 능력 비교
여기서, 가로축은 항체 농도(단위 : ng/ml)에 해당하고 세로축은 OD 값에 해당한다.
A)는 BII61-62와 BII61의 비교를 나타내고, B)는 B50과 B50-6의 비교를 나타내고, C)는 B60과 B60-55의 비교를 나타낸다.
도 4: 항-hPD-L1 항체 및 hPD-L1 결합능의 ELISA 측정
여기서, 가로축은 항체 농도(단위 : ng/ml)에 해당하고 세로축은 OD 값에 해당한다.
도 5: hPD-L1의 항-hPD-L1 및 hPD-1 경쟁적 결합의 경쟁적 ELISA 측정
여기서, 가로축은 항체 농도(단위 : ng/ml)에 해당하고 세로축은 OD 값에 해당한다.
그래프 #5는 BII61-62 mAb에 해당하고 그래프 #2는 B50-6 mAb에 해당하며 그래프 #3은 B60-55 mAb에 해당한다.
도 6: hPD-L1의 항-hPD-L1 및 CD80 경쟁적 결합의 경쟁적 ELISA 측정
도 7: 항-hPD-L1 항체 특이도의 측정
여기서, X-축은 EGFP 형광 강도를 나타내고, Y-축은 상응하는 항체 결합의 형광 강도를 나타내고, A-블랭크 대조군에 해당하고, B-음성 대조군에 해당하고, C-BII61-62 mAb에 해당하며 D-B60-55 mAb에 해당하고 E는 B50-6 mAb에 해당하고;
(1)은 hPD-L1-EGFP 단백질, (2)는 hB7H3-EGFP, (3)은 hPD-L2-EGFP 단백질에 해당한다.
도 8: 항-hPD-L1 항체 및 mPD-L1 결합 능력
여기서, X-축은 EGFP 형광 강도를 나타내고, Y-축은 상응하는 항체 결합의 형광 강도를 나타내고, A-블랭크 대조군에 해당하고, B-음성 대조군에 해당하고, C-는 B60-55 mAb에 해당하고, D-는 BII61-62 mAb에 해당하고, E는 B50-6 mAb에 해당하고;
(1)은 hPD-L1-EGFP 단백질에 해당하고 (2)는 mPD-L1-EGFP 단백질에 해당한다.
도 9: 항-hPD-L1 항체 및 시노몰구스 원숭이 PD-L1 결합능
도 10: 항-hPD-L1 항체에 의한 CD4+ T 세포의 활성화
도 11: 종양 성장에 대한 항-hPD-L1 항체 B50-6의 억제 활성
도 12: 종양 성장에 대한 항-hPD-L1 항체 B60-55 및 BII61-62의 억제 활성
여기서, A-는 3 mg/kg의 용량이 사용될 때 BII61-62 mAb 및 B60-55 종양 성장 억제에 해당하고; B-는 상이한 용량이 사용될 때 종양 성장에 대한 BII61-62 mAb의 억제 효과에 해당한다.
도 13: B60-55와 항체 2.41H90P의 안정성 비교
여기서, A-는 시간에 따른 B60-55의 IC50 값 및 항체 2.41H90P에 해당하고; B-시간에 따른 항체 이량체의 비율에 해당하고; C는 B60-55 가속 안정성 시험에서 얻은 경쟁적 ELISA 결과에 해당한다.
도 14: CaPure-HA에서 B60-55-1의 크로마토그래피; B60-55-1 머무름 시간(retention time)은 약 45분이다.
도 15: TSKgel G3000SWXL(Tosoh) 컬럼에서 정제된 B60-55-1의 크기 배제 크로마토그래피 분석.
도 16: 정제된 B50-55-1의 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 분석: 레인 1-감소된 조건 하에서, 레인 2-비환원 조건 하에서, 레인 3-분자량 마커.
도 17: SPR 측정을 위한 대체 포획 방법 :
패널 A-항-인간-IgG를 포획 항체로서 칩 상에 고정시켰다; B60-55-1 또는 아테졸리주맙을 고정화된 항체에 의해 포획하고 다양한 농도의 PD-L1-His 리간드를 적용하였다.
패널 B-PD-L1-Fc 융합 단백질을 센서칩 상에 직접 고정시키고 상이한 농도의 B60-55-1 또는 아테졸리주맙을 적용하였다.
패널 C-PD-L1-Fc 융합 단백질 및 PD-L1-His와의 상호 작용을 연구하기 위해, B60-55-1 또는 아테졸리주맙을 칩 상에 직접 고정시켰다; PD-L1-His 태그 또는 PD-L1-Fc의 농도 범위가 적용되었다.
도 18: 고정화된 비교기 항체 아테졸리주맙 또는 B60-55-1에 대한 PD-L1-His 태그 리간드의 결합 센소그램; 접근 방식은 왼쪽 패널에 개략적으로 표시되어 있으며 동역학 파라미터가 표에 요약되어 있다. 항-인간 포획 항체를 센서 칩에 고정시키고, 아테졸리주맙 또는 B60-55-1을 포획한 후 다양한 농도의 PD-L1-His 리간드를 수득하였다 :
패널 A-아테졸리주맙에 대한 결과;
패널 B-B60-55-1에 대한 결과.
도 19: 고정화 된 PD-L1-Fc 융합 단백질에 대한 아테졸리주맙 또는 B60-55-1의 결합 센소그램; 접근 방식은 왼쪽 패널에 개략적으로 표시되어 있으며 동역학 파라미터가 표에 요약되어 있다. 다양한 농도의 B60-55-1 또는 아테졸리주맙을 칩에 적용하였다 :
패널 A-아테졸리주맙에 대한 결과;
패널 B-B60-55-1에 대한 결과.
도 20: 고정화 된 B60-55-1에 대한 PD-L1-His 또는 PD-L1-Fc의 결합 센소그램; 접근 방식은 왼쪽 패널에 개략적으로 표시되어 있으며 동역학 파라미터가 표에 요약되어 있다.
도 21: 고정화 된 아테졸리주맙에 대한 PD-L1-His 또는 PD-L1-Fc의 결합 센소그램; 접근 방식은 왼쪽 패널에 개략적으로 표시되어 있으며 동역학 파라미터가 표에 요약되어 있다.
도 22: B60-55-1 및 아테졸리주맙은 Promega ADCC Reporter Bioassay Kit의 대조군 항체와 비교하여 ADCC 활성이 없다.
도 23: C1q에 대한 B60-55-1 및 아테졸리주맙 결합의 평가.
도 24: MLR 분석에서 T 세포 활성화에 대한 B60-55-1 및 비교기 항체의 농도 의존성 효능.
도 25: 약물 치료시 체중 변화; 화살표는 투약 시간을 나타냈다.
도 26: 약물 치료시 종양 부피 억제; 화살표는 투약 시간을 나타냈다.
도 27: 그룹화 후 29일 관찰 동안 3개의 그룹에서 개별 종양 성장(n = 8).
도 28: 투약 후 29 일째에 종양 중량 억제.
도 29: 하기 표 7에 나타낸 실험 설계로부터 3개의 시험 그룹에서의 평균 종양 부피.
도 30: 21일 및 41 일에 하기 표 7에 나타낸 실험 설계로부터 3개의 시험 그룹에서의 평균 종양 부피; 매일 3개의 열이 그룹 1(왼쪽), 2(가운데) 및 3(오른쪽)에 해당한다.
본 발명의 특정 측면에서, 스크리닝 및 친화도 성숙과 함께 효모 디스플레이 시스템을 이용하여 우수한 특이도 및 비교적 높은 친화도 및 안정성을 나타내는 완전한 인간 항-PD-L1 항체를 수득함으로써 본 발명을 완성시켰다.
본 발명의 일 측면은 다음 중 하나로부터 선택되는 CDR 영역의 군을 포함하는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다:
(1) 각각 서열번호 1 내지 3에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 4 내지 6에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성을 갖는 서열;
(2) 각각 서열번호 7 내지 9에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 10 내지 12에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성을 갖는 서열;
(3) 각각 서열번호 13 내지 15에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 16 내지 18에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성을 갖는 서열;
(4) 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 19에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 4 내지 6에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성을 갖는 서열;
(5) 각각 서열번호 7, 서열번호 20 및 서열번호 9에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 10 내지 12에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성을 갖는 서열;
(6) 각각 서열번호 13 내지 15에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 21, 서열번호 17 및 서열번호 18에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성을 갖는 서열.
본 발명의 일 측면에 의해 구성된 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부 중 어느 하나는 또한 하기로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역(Framework region, FR)의 군을 포함한다:
1) 각각 서열번호 22 내지 25에 상응하는 FR1, FR2, FR3 및 FR4 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 서열;
2) 각각 서열번호 30 내지 33에 상응하는 FR1, FR2, FR3 및 FR4 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 서열;
3) 각각 서열번호 38 내지 41에 상응하는 FR1, FR2, FR3 및 FR4 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 서열;
4) 각각 서열번호 30 내지 33에 상응하는 FR1, FR2, FR3 및 FR4 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 서열.
본 발명의 일 측면에 의해 구성된 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부 중 어느 하나는 또한 하기로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(Framework region, FR)의 군을 포함한다:
1) 각각 서열번호 26 내지 29에 상응하는 FR1, FR2, FR3 및 FR4 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 서열;
2) 각각 서열번호 30 내지 33에 상응하는 FR1, FR2, FR3 및 FR4 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 서열;
3) 각각 서열번호 38 내지 41에 상응하는 FR1, FR2, FR3 및 FR4 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 서열;
4) 각각 서열번호 30 내지 33에 상응하는 FR1, FR2, FR3 및 FR4 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 서열.
본 발명의 일 측면에 의해 구성된 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부 중 어느 하나는 또한 하기로부터 선택되는 중쇄 가변 영역의 군을 포함한다:
1) 서열번호 47, 49, 51, 53 또는 54, 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 서열.
본 발명의 일 측면에 의해 구성된 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부 중 어느 하나는 또한 하기로부터 선택되는 경쇄 가변 영역의 군을 포함한다:
1) 서열번호 48, 50, 52, 55 또는 56, 또는 상기 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 서열.
본 발명의 일 측면에 의해 구성된 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부 중 어느 하나는 전체 항체(whole antibody), 이중 특이성 항체(bispecific antibody), scFv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv에 상응한다.
본 발명의 임의의 실시예에서, 본 발명이 scFv로 구성될 때, 연결 펩티드는 또한 상기 언급된 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 사이에 포함된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 언급된 연결 펩티드는 서열번호 67에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 의해 구성된 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부의 하나의 예는 전체 항체(whole antibody)에 상응한다.
본 발명의 일 측면에 의해 구성된 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부의 하나의 예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG, IgM, IgE, IgD 및 IgA를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1에 상응한다.
본 발명의 특정 실시예에서, IgG1 아미노산 서열은 서열번호 68에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 의해 구성된 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부의 어느 하나에서, 경쇄 불변 영역은 Κ(kappa) 영역 또는 X 영역이다.
본 발명의 특정 실시예에서, Κ 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 70에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 특정 실시예에서, X 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 72에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 두 번째 측면은 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 핵산 분자에 관한 것으로, 상기 전술한 항체 중쇄 가변 영역은 하기로부터 선택되는 아미노산 서열의 군을 포함한다:
(ⅰ) 서열번호 1 내지 3;
(ⅱ) 서열번호 7 내지 9;
(ⅲ)서열번호 13 내지 15;
(ⅳ) 서열번호 1, 2 및 19; 및
(ⅴ) 서열번호 7, 20 및 9
본 발명의 두 번째 측면을 구성하는 핵산 분자의 어느 하나에서, 상기 전술한 항체 중쇄 가변 영역은 하기로부터 선택되는 핵산 서열의 군을 포함한다:
서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 54 또는 상기 전술한 서열 중 하나의 프레임 영역에 포함되는 하나 또는 여러 개의 아미노산을 대체함으로써 생성된 서열.
본 발명의 일부 실시예에서, 상기 전술한 핵산은 서열번호 57 내지 61에 나타낸 것들로부터 선택되는 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, 상기 전술한 핵산은 또한 항체 중쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 함유하며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG, IgM, IgE, IgD 및 IgA를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1에 상응한다.
본 발명의 특정 실시예에서, IgG1 핵산 서열은 서열번호 69에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 세 번째 측면은 항체 경쇄 가변 영역을 코딩할 수 있는 핵산 서열을 함유하는 핵산 분자에 관한 것으로, 상기 전술한 항체 경쇄 가변 영역은 하기로부터 선택되는 아미노산 서열의 군을 포함한다:
(ⅰ) 서열번호 4 내지 6;
(ⅱ) 서열번호 10 내지 12;
(ⅲ) 서열번호 16 내지 18; 및
(ⅳ) 서열번호 21, 17 및 18.
본 발명의 세 번째 측면을 구성하는 핵산 분자의 어느 하나에서, 상기 전술한 항체 경쇄 가변 영역은 하기로부터 선택되는 핵산 서열의 군을 포함한다:
서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 55, 서열번호 56 또는 상기 전술한 서열 중 하나의 프레임 영역에 포함되는 하나 또는 여러 개의 아미노산을 대체함으로써 생성된 서열.
본 발명의 일부 실시예에서, 상기 전술한 핵산 서열은 서열번호 62 내지 66에 나타낸 것으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, 상기 전술한 핵산 서열은 또한, 항체 경쇄 불변 영역을 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 불변 영역은 Κ(kappa) 영역 또는 X 영역이다.
본 발명의 특정 실시예에서, Κ 경쇄 불변 영역의 핵산 서열은 서열번호 70에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 특정 실시예에서, X 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 72에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 네 번째 측면은 본 발명의 두 번째 또는 세 번째 측면에 의해 구성되는 핵산 서열의 어느 하나를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 네 번째 측면에 의해 구성되는 벡터의 어느 하나는 본 발명의 두 번째 측면에 의해 구성되는 핵산 서열의 어느 하나 및 본 발명의 세 번째 측면에 의해 구성되는 핵산의 어느 하나를 포함한다.
본 발명의 다섯 번째 측면은 본 발명의 두 번째 또는 세 번째 측면에 의해 구성되는 핵산의 어느 하나 또는 본 발명의 네 번째 측면에 의해 구성되는 벡터의 어느 하나를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 여섯 번째 측면은 본 발명의 첫 번째 측면에 의해 구성되는 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부 중 임의의 하나 및 다른 생물학적 활성 물질을 함유하는 접합체(conjugate)에 관한 것이며, 상기 전술한 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부는 다른 생물학적 활성 물질에 직접적으로 또는 연결부를 통하여 접합 된다.
본 발명의 일부 측면에 있어서, 상기 전술한 추가적인 생물학적 활성 물질은 세포 성장을 직접적으로 또는 간접적으로 억제할 수 있거나 세포를 죽일 수 있거나, 아니면 면역 반응의 활성화를 통해 세포를 억제하거나 죽일 수 있는 것으로서, Auristatin MMAE, Auristatin MMAF, Maytansine DM1, Maytansine DM4, calicheamicin, duocarmycin MGBA, 독소루비신, 리신, 디프테리아 독소 및 기타 관련 독소, I131, 인터루킨, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 케모카인(chemokines), 나노 입자(nanoparticles) 등과 같은 케미컬(chemical), 독소, 폴리펩티드, 효소, 동위원소, 사이토카인 또는 다른 개별적인 생물학적 활성 물질 또는 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일곱 번째 측면은 본 발명의 첫 번째 측면에 의해 구성되는 항-PD-L1 또는 이의 상응하는 항원 결합부의 어느 하나, 본 발명의 두 번째 또는 세 번째 측면에 의해 구성되는 핵산의 어느 하나, 본 발명의 네 번째 측면에 의해 구성되는 벡터의 어느 하나, 본 발명의 다섯 번째 측면에 의해 구성되는 숙주 세포의 어느 하나, 또는 본 발명의 여섯 번째 측면에 의해 구성되는 접합체의 어느 하나뿐만 아니라, 약학적으로 허용 가능한 벡터 또는 부형제 및 임의의 다른 생물학적 활성 물질을 포함하는 조성물(예를 들면, 약학적 조성물)에 관한 것이다.
본 발명의 일곱 번째 측면(예를 들면, 약학적 조성물)에 의해 구성되는 조성물의 어느 하나에서, 상기 전술한 추가적인 생물학적 활성 물질은 다른 항체, 융합 단백질 또는 약물(예: 화학요법 및 방사선 요법 약물과 같은 항암제)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 본 발명의 첫 번째 측면에 의해 구성되는 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부의 어느 하나를 포함하는 시약 또는 시약 키트에 관한 것으로, 검출 시약 또는 시약 키트는 PD-L1 단백질 또는 이의 유도체의 존재 여부를 검출하기 위하여 사용된다.
본 발명은 본 발명의 첫 번째 측면에 의해 구성되는 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부의 어느 하나를 포함하는 진단 시약 또는 시약 키트에 관한 것으로, 진단 시약 또는 시약 키트는 PD-L1 관련 질병의 시험관 내(in vitro)(예: 세포 또는 조직) 또는 in vivo(예: 인간 또는 동물 모델) 진단(예: 높은 PD-L1 발현을 보이는 바이러스 감염의 경우 또는 높은 PD-L1의 발현을 보이는 종양과 같은 종양 또는 바이러스 감염)에 사용된다.
본 발명의 일부 측면에 있어서, 상기 전술한 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부는 검출에 사용될 수 있거나 다른 시약에 의해 검출될 수 있는 형광 염료, 화학 물질, 폴리펩티드, 동위원소, 라벨(label), 등과 추가적으로 결합될 수 있다.
본 발명의 일부 측면에 있어서, 전술한 종양은 폐암, 난소암, 대장암, 결장직장암, 흑색종, 신장암, 방광암, 유방암, 간암, 림프종, 혈액 악성 종양, 두경부암, 신경 교종, 위암, 비인두암, 후두암, 자궁경부암, 자궁암, 골육종, 갑상선암 및 전립선암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일부 측면에 있어서, 전술한 바이러스 감염은 급성, 아급성(subacute) 또는 만성 HBV, HCV 또는 HIV 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 본 발명의 첫 번째 측면에 의해 구성되는 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부의 어느 하나, 본 발명의 두 번째 또는 세 번째 측면에 의해 구성되는 핵산의 어느 하나, 본 발명의 네 번째 측면에 의해 구성되는 벡터의 어느 하나, 본 발명의 다섯 번째 측면에 의해 구성되는 숙주 세포의 어느 하나, 본 발명의 여섯 번째 측면에 의해 구성되는 접합체의 어느 하나, 또는 본 발명의 일곱 번째 측면에 의해 구성되는 조성물의 어느 하나를 사용하여 PD-L1 연관된 질병(예: 높은 PD-L1 발현을 보이는 바이러스 감염의 경우 또는 높은 PD-L1의 발현을 보이는 종양과 같은 종양 또는 바이러스 감염)의 예방 또는 치료에 사용되는 약물을 제조하는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 특정 측면에 있어서, 전술한 종양은 PD-L1 발현의 높은 수치를 나타내는 종양과 같은 PD-L1에 연관된 종양을 지칭한다.
본 발명의 특정 측면에 있어서, 전술한 종양은 폐암, 난소암, 대장암, 결장직장암, 흑색종, 신장암, 방광암, 유방암, 간암, 림프종, 혈액 악성 종양, 두경부암, 신경 교종, 위암, 비인두암, 후두암, 자궁경부암, 자궁암, 골육종, 갑상선암 및 전립선암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일부 측면에 있어서, 전술한 바이러스 감염은 급성, 아급성 또는 만성 HBV, HCV 또는 HIV 감염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 본 발명의 첫 번째 측면에 의해 구성되는 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부의 어느 하나를 사용하여 PD-L1 연관된 질병(예: 높은 PD-L1 발현을 보이는 바이러스 감염의 경우 또는 높은 PD-L1의 발현을 보이는 종양과 같은 종양 또는 바이러스 감염)의 진단을 위한 시약 또는 시약 키트를 제조하는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일부 측면에 있어서, 전술한 종양은 PD-L1 발현의 높은 수치를 나타내는 종양과 같은 PD-L1에 연관된 종양을 지칭한다.
본 발명의 특정 실시예에 있어서, 전술한 종양은 폐암, 난소암, 대장암, 결장직장암, 흑색종, 신장암, 방광암, 유방암, 간암, 림프종, 혈액 악성 종양, 두경부암, 신경 교종, 위암, 비인두암, 후두암, 자궁경부암, 자궁암, 골육종, 갑상선암 및 전립선암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일부 측면에 있어서, 전술한 바이러스 감염은 급성, 아급성 또는 만성 HBV, HCV 또는 HIV 감염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일부 측면에 있어서, 상기 전술한 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부는 검출에 사용될 수 있거나 다른 시약에 의해 검출될 수 있는 형광 염료, 화학 물질, 폴리펩티드, 동위원소, 라벨(label), 등과 추가적으로 결합될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 첫 번째 측면에 의해 구성되는 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부의 어느 하나를 사용하여 CD-80에 연관된 질병의 예방 또는 치료를 위한 약물을 제조하는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 상기 언급된 CD-80에 연관된 질병은 높은 CD80 발현과 관련된 질환을 포함한다.
본 발명은 PD-L1 연관된 질병(예: 높은 PD-L1 발현을 보이는 바이러스 감염의 경우 또는 높은 PD-L1의 발현을 보이는 종양과 같은 종양 또는 바이러스 감염)을 예방 또는 치료하기 위해 사용되는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 개체에게 선택적 방사선 요법(예: X-선 조사)의 투여와 함께, 본 발명의 첫 번째 측면에 의해 구성되는 항-PD-L1 또는 이의 상응하는 항원 결합부의 어느 하나, 본 발명의 두 번째 또는 세 번째 측면에 의해 구성되는 핵산의 어느 하나, 본 발명의 네 번째 측면에 의해 구성되는 벡터의 어느 하나, 본 발명의 다섯 번째 측면에 의해 구성되는 숙주 세포의 어느 하나, 본 발명의 여섯 번째 측면에 의해 구성되는 접합체의 어느 하나, 본 발명의 일곱 번째에 의해 구성되는 조성물의 어느 하나를 유효한 예방 또는 치료 용량으로 투여하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 일부 측면에 있어서, 전술한 종양은 PD-L1 발현의 높은 수치를 나타내는 종양과 같은 PD-L1에 연관된 종양을 지칭한다.
본 발명의 특정 측면에 있어서, 전술한 종양은 폐암, 난소암, 대장암, 결장직장암, 흑색종, 신장암, 방광암, 유방암, 간암, 림프종, 혈액 악성 종양, 두경부암, 신경 교종, 위암, 비인두암, 후두암, 자궁경부암, 자궁암, 골육종, 갑상선암 및 전립선암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일부 측면에 있어서, 전술한 바이러스 감염은 급성, 아급성 또는 만성 HBV, HCV 또는 HIV 감염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 CD-80에 관련된 질병을 예방 또는 치료하기 위해 사용되는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 본 발명의 첫 번째 측면에 의해 구성되는 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부의 어느 하나를 유효한 예방 또는 치료 용량으로 투여하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 상기 언급된 CD-80에 연관된 질병은 높은 CD80 발현과 관련된 질환을 포함한다.
본 발명은 하기 텍스트에 의해 추가로 설명된다:
본 발명의 맥락에서, 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에게 이해되는 각각의 공통 의미에 상응해야 한다.
또한, 본문에 사용된 실험실 절차뿐만 아니라 단백질 및 핵산 화학, 분자 생물학, 세포 및 조직 배양, 미생물학 및 면역학 관련 용어는 모두 해당 분야에서 널리 사용되는 용어 및 표준 절차에 해당한다. 그러나 본 발명을 더욱 명확하게 하기 위해 관련 용어의 정의 및 설명이 아래에 제공된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "항체"는 일반적으로 2쌍의 동일한 폴리펩티드 사슬로 구성되는 면역 글로불린 분자를 의미한다(각 쌍은 하나의 "경" (L) 사슬 및 하나의 "중" (H) 사슬을 가짐). 항체 경쇄는 K 또는 X 경쇄로 분류될 수 있다. 중쇄는 p, 5, y, a 또는 E로 분류될 수 있고 각각의 상응하는 항체 아이소타입(isotype)은 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE 인 것으로 정의된다. 경쇄 및 중쇄의 경우, 가변 및 불변 영역은 대략 12개 이상의 아미노산 "J" 영역에 의해 연결되는 반면, 중쇄는 또한 대략 3개 이상의 아미노산 "D" 영역을 함유한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 구조 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 구조적 도메인(CL)으로 구성된다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포)뿐만 아니라 고전적 보체 시스템(C1q)의 제 1성분을 포함하여, 면역 글로불린이 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임 워크 영역 (FR)으로 알려진 보다 보존된 영역과 산재된, 높은 가변성을 갖는 영역(상보성 결정 영역(CDR)으로 공지됨)으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 배열된다. 각각의 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역(VH 및 VL)은 각각의 항체의 결합 부위를 형성한다. 각 영역 또는 구조적 도메인으로의 아미노산 할당은 면역학적 관심 단백질의 Kabat 서열(National Institutes of Health, Bethesda, Md (1987 및 1991)) 또는 Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196 : 901-917의 정의 및 Chothia et al. (1989) Nature 342 : 878-883을 따른다. "항체"라는 용어는 항체를 생산하는데 사용된 방법의 관점에서 특별한 제한을 받지 않는다. 예를 들어, 특히 재조합 항체, 단일클론항체 및 폴리클로날 항체를 포함한다. 항체는 예를 들어 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체를 포함하는 상이한 아이소타입의 항체일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 항체의 "항원 결합부"는 항체의 전체 길이의 하나 이상의 부분을 지칭하며, 여기서 상기 부분은 항체가 결합하는 동일한 항원(예를 들어, PD-L1)에 결합하는 능력을 유지하고 온전한 항체와 경쟁하여 주어진 항원에 특이적으로 결합한다. 일반적으로 기초 면역학, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, NY, Raven Press, NY (1989))은 모든 목적을 위해 전문이 인용문을 통해 여기에 포함된다. 항원-결합부는 재조합 DNA 기술 또는 전체 항체의 효소적 또는 화학적 분해를 통해 생성될 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합부는 Fab, Fab ', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일 사슬 항체(예를 들어, scFv), 키메라 항체, diabody 및 폴리펩티드-특이적 항원 결합 능력을 부여할 수 있는 항체의 적어도 일부를 포함하는 유사한 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "Fd 단편"은 VH 및 CH1 구조 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 용어 "Fv 단편"은 항체의 단일 arm의 VL 및 VH 구조 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 용어 "dAb 단편"은 VH 구조 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다(Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)); 용어 "Fab 단편"은 VL, VH, CL 및 CH1 구조 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 용어 "F (ab')2 단편"은 힌지 영역에서 이황화 브릿지를 통해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다.
일부 경우에, 항체의 항원-결합부는 단일 사슬 항체(예를 들어, scFv)이며, 여기서 VL 및 VH 구조 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 링커로서 생산될 수 있게함으로써 쌍을 통해 1가 분자를 형성한다(참조 : 예를 들어, Bird et al., Science 242 : 423-426 (1988) 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5879-5883 (1988)). 이러한 scFv 분자는 NH2-VL-커넥터-VH-COOH 또는 NH2-VH-커넥터-VL-COOH의 일반적인 구조를 가질 수 있다. 적합한 통상적인 커넥터(연결 펩티드)는 반복 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체로 구성된다. 예를 들어, 아미노산 서열(GGGGS)4을 갖는 커넥터가 사용될 수 있지만 변이체도 사용될 수 있다(Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). 본 발명에 사용될 수 있는 다른 커넥터는 Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8 : 725-731, Choi et al.(2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999) , J. Mol. Biol. 293: 41-56 and Roovers et al. (2001) , Cancer Immunol 에 기술되어 있다. 본 발명의 측면에서, 전술한 연결 펩티드의 서열은 (GGGGS)3이다.
일부 경우에, 항체는 2개의 상이한 종류의 항원 또는 항원성 에피토프에 각각 결합할 수 있고, 1차 항원 또는 이의 항원 결합부에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄, 뿐만 아니라 2차 항원 또는 이의 항원 결합부에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 이중 특이적 항체에 의해 구성된다.
본 발명의 일부 측면에서, 상기 언급된 이중 특이적 항체에 포함된 1차 항원 또는 이의 항원 결합 부분에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄는 본 발명에 의해 구성되는 항체 또는 이의 상응하는 항원-결합 부분의 어느 하나에 상응하고, 상기 언급된 이중 특이적 항체에 포함된 2차 항원 또는 이의 항원 결합 부분에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄는 상이한 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원-결합 부분, 또는 상이한 항원을 표적 하는 항체 또는 항원 결합 부분의 어느 하나에 상응한다.
일부 경우에, 항체는 디아바디(diabody), 즉 2가 항체에 상응하며, 여기서 VH 및 VL 구조 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에서 발현되지만, 너무 짧은 연결체(linker)가 사용되며, 이는 동일한 사슬의 두 구조 도메인 사이의 페어링을 허용하지 않는다. 이에 의해 구조 도메인이 다른 사슬의 상보적 구조 도메인과 쌍을 이루고 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다(예를 들어, Holliger P. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 6444-6448 (1993), 및 Poljak RJ et al., 구조 2: 1121-1123 (1994) 참조).
당업자에 의해 공지된 통상적인 기술(예를 들어, 재조합 DNA 기술 또는 효소 또는 화학적 절단)을 사용하여 주어진 항체(단일클론항체 2E12와 같은)로부터 항원 결합 부분(예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 항체 단편)을 얻을 수 있고, 전체 항체에 사용된 것과 동일한 방법을 사용하여 항체의 항원-결합 부분을 선별적으로 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 상기 언급된 항원 결합 부분은 단일 사슬 항체(scFv), 키메라 항체, 디아바디(diabody), scFv-Fc 2가 분자, dAb 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, Fab 단편, Fd 단편, Fab' 단편 및 Fv 및 F(ab')2 단편을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 상기 언급된 IgG1 중쇄 불변 영역은 G1m(f), G1m(z), G1m(z, a) 및 G1m(z, a, x)와 같은 동종형(allotype)을 포함한다. 본 발명의 일부 측면에서, 상기 언급된 IgG1 중쇄 불변 영역은 G1m(f)에 해당한다.
본 발명의 맥락에서, 상기 언급된 K 경쇄 불변 영역은 Km1, Km1,2 및 Km3과 같은 다양한 동종형을 포함한다. 본 발명의 일부 측면에서, 상기 언급된 k 경쇄 불변 영역은 Km3 유형 영역에 해당한다.
본 발명의 맥락에서, 상기 언급된 X 경쇄 불변 영역은 XI, XII, XIII 및 XVI와 같은 다양한 동종형을 포함한다. 본 발명의 일부 측면에서, 상기 언급된 X 경쇄 불변 영역은 XII 유형 영역에 해당한다.
본 발명과 관련된 항체 핵산은 또한 통상적인 유전 공학 재조합 기술 또는 화학적 합성 방법을 통해 수득 될 수 있다. 한편으로, 본 발명이 속하는 항체 핵산의 서열은 항-PD-L1 항체 중쇄 가변 영역 또는 항체 분자에 속하는 부분 핵산 서열을 포함한다. 한편, 본 발명이 속하는 항체 핵산 서열은 항-PD-L1 항체 경쇄 가변 영역 또는 항체 분자에 속하는 부분 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 한편으로, 본 발명이 속하는 항체 핵산의 서열은 또한 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 속하는 CDR 서열을 포함한다. 상보성 결정 영역 (CDR)은 항원 에피토프에 결합하는 부위이며, 본 발명의 맥락에서, CDR 서열은 IMGT/V-QUEST(http://imgt.cines.fr/textes/vquest)를 통해 확인된다. 그러나 상이한 파싱 방법을 통해 수득된 CDR 서열은 약간 상이하다.
본 발명의 일 측면은 항체 B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 및 B50 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 항체 B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 및 B50 중쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61 및 서열번호 59에 각각 상응한다. 항체 B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 및 B50 경쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 62, 서열번호 65 및 서열번호 66에 각각 상응한다. 본 발명은 또한 항체 B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 및 B50 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 핵산 분자의 변이체 또는 유사체에 관한 것이다.
한편, 본 발명은 또한 다양한 분리된 핵산 분자 변이체에 관한 것이며; 구체적으로, 상기 핵산 변이체의 서열은 하기 핵산 서열과 적어도 70% 이상의 유사성을 나타내어야 한다: 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 59, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 62, 서열번호 65, 서열번호 66, 유사성이 적어도 75% 이상에 도달하는 것이 바람직하고, 유사성이 80% 이상에 도달하는 것이 보다 바람직하고, 유사성이 85% 이상에 도달하는 것이 더욱 바람직하고, 90% 이상에 도달하는 유사성이 훨씬 더 바람직하고, 95% 이상에 도달 하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 또한 아미노산 서열 서열번호 47, 49, 51, 53, 54 및 51의 형태로 항체 B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 및 B50 중쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 상응하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 48, 50, 52, 48, 55 및 56의 아미노산 서열의 형태로 항체 B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 및 B50 경쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 상응하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 상기 언급된 핵산 분자를 함유하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 또한, 상기 분자로 형질전환 된 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정 조건 하에서 상기 언급된 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 배양하고, 분리하여 본 발명에 기재된 바와 같은 항체를 수득하는 데 사용되는 방법에 관한 것이다.
항체 아미노산 서열
단일클론 항체 mAb B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 및 B50 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 상응하는 핵산 서열로부터 유래 될 수 있다. 항체 mAb B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 및 B50 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 47, 49, 51, 53, 54 및 51에 상응한다. 항체 mAb B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 및 B50 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 48, 50, 52, 48, 55 및 56에 해당한다.
한편, 본 발명에 의해 제공된 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 47, 49, 51, 53, 54 및 51에 제공된 서열과 적어도 70% 유사성을 나타내어야 한다. 유사성이 80% 이상에 도달하는 것이 바람직하고, 유사성이 85% 이상에 도달하는 것이 보다 바람직하고, 90% 이상에 도달하는 유사성이 훨씬 더 바람직하고, 95% 이상에 도달하는 것이 가장 바람직하다.
한편, 본 발명에 의해 제공된 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 48, 50, 52, 48, 55 및 56에 제공된 서열과 적어도 70% 유사성을 나타내어야하며, 유사성이 80% 이상에 도달하는 것이 바람직하고, 유사성이 85% 이상에 도달하는 것이 더 바람직하고, 90% 이상에 도달하는 유사성이 훨씬 더 바람직하고, 95% 이상에 도달하는 것이 가장 바람직하다.
항체 B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 및 B50의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 CDR 아미노산 서열은 다음과 같이 결정된다 :
항체 B60-55의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 내지 3에 해당한다. 항체 B60-55의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 아미노산 서열은 각각 서열번호 4 내지 6에 해당한다.
항체 BII61-62의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 아미노산 서열은 각각 서열번호 7 내지 9에 해당한다. 항체 BII61-62의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 아미노산 서열은 각각 서열번호 10 내지 12에 해당한다.
항체 B50-6의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 아미노산 서열은 각각 서열 번호 13 내지 15에 해당한다. 항체 B50-6의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 아미노산 서열은 각각 서열번호 16 내지 18에 해당한다.
한편, 항-PD-L1 항체 중쇄의 CDR에 포함된 아미노산 서열 또는 이의 단편은 서열번호 1 내지 3, 7 내지 9, 13 내지 15, 19 및 20의 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 첨가 또는 결실을 통해 수득 될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이, 첨가 또는 결실되는 아미노산의 수는 3을 초과하지 않아야 한다. 더욱 바람직하게는, 돌연변이, 첨가 또는 결실되는 아미노산의 수는 2를 초과해서는 안 된다. 가장 바람직하게는, 돌연변이, 첨가 또는 결실되는 아미노산의 수는 1을 초과하지 않아야 한다.
한편, 항 -PD-L1 항체의 경쇄의 CDR에 포함된 아미노산 서열 또는 이의 단편은 서열 번호 4 내지 6, 10 내지 12, 16 내지 18 및 21의 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 첨가 또는 결실을 통해 수득 될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이, 첨가 또는 결실되는 아미노산의 수는 3을 초과하지 않아야 한다. 더욱 바람직하게는, 돌연변이, 첨가 또는 결실되는 아미노산의 수는 2를 초과해서는 안된다. 가장 바람직하게는, 돌연변이, 첨가 또는 결실되는 아미노산의 수는 1을 초과하지 않아야 한다.
항체 B60-55, BII61-62, B50-6, B60, BII61 및 B50의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 FR 아미노산 서열은 다음과 같이 결정된다:
항체 B60-55 및 B60의 중쇄 가변 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열은 각각 서열번호 22 내지 25에 상응한다. 경쇄 가변 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열은 각각 서열번호 26 내지 29에 상응한다.
항체 BII61-62의 중쇄 가변 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열은 각각 서열 번호 30 내지 33에 상응한다. 경쇄 가변 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열은 각각 서열번호 34 내지 37에 해당한다.
항체 B50-6 및 B50의 중쇄 가변 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열은 각각 서열 번호 38 내지 41에 상응한다. 경쇄 가변 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열은 각각 서열번호 42 내지 45에 상응한다.
항체 BII61의 중쇄 가변 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열은 각각 서열 번호 30 내지 33에 상응한다. 경쇄 가변 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열은 각각 서열번호 34, 46, 36, 37에 상응한다.
한편, 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역의 FR에 함유된 아미노산 서열은 서열 번호 22 내지 46의 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 첨가 또는 결실을 통해 수득 될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이, 첨가 또는 결실되는 아미노산의 수는 3을 초과하지 않아야 한다. 더욱 바람직하게는, 돌연변이, 첨가 또는 결실되는 아미노산의 수는 2를 초과해서는 안된다. 가장 바람직하게는, 돌연변이, 첨가 또는 결실 되는 아미노산의 수는 1을 초과하지 않아야 한다.
상기 언급된 항체, CDR 또는 프레임 영역(FR)에 함유된 아미노산의 돌연변이, 첨가 또는 결실 후 수득된 변이체는 여전히 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 능력을 유지해야 한다. 본 발명은 또한 항원-결합 부분의 이러한 변이체를 포함한다.
상기 언급된 항체의 변이체는 서열번호 85의 완전한 중쇄 및 서열번호 87의 완전한 경쇄를 갖는 항체 B60-55-1이며, 중쇄의 C-말단에서 말단 라이신(lysine) 잔기는 누락될 수 있다. B60-55-1의 중쇄는 서열번호 86의 핵산 서열을 이용 하여 발현될 수 있다. 핵산 서열은 발현 세포주 내로 추가로 혼입되기 위해 발현 벡터에 도입될 수 있다. B60-55-1의 경쇄는 서열번호 88의 핵산 서열을 이용하여 발현될 수 있다. 핵산 서열은 발현 세포주 내로 추가로 혼입되도록 발현 벡터에 도입될 수 있다.
B60-55-1 항체는 약학적으로 허용되는 부형제 또는 보조제를 첨가함으로써 약학적 조성물로서 제형화 될 수 있다. 조성물은 약 275 mM 세린, 약 10 mM 히스티딘을 함유할 수 있고, 약 5.9의 pH 값을 가질 수 있다. 조성물은 약 0.05 % 폴리 소르베이트 80, 약 1% D- 만니톨, 약 120mM L-프롤린, 약 100mM L-세린, 약 10mM L-히스티딘-HCl을 포함하고 약 5.8의 pH를 가질 수 있다.
본 발명에 의해 구성된 단일클론항체 변이체는 통상적인 유전 공학 방법에 의해 수득 될 수 있다. 당업자에게 DNA 분자를 변형시키기 위해 핵산 돌연변이를 이용하는 방법은 자명하다. 또한, 중쇄 및 경쇄 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 또한 화학적 합성을 통해 수득될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 사용되는 알고리즘의 예는 Altschul et al. (1977) Nucl. Acid. Res. 25: 3389-3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 에 기술된 BLAST 및 BLAST 2.0을 포함한다. 예를 들어 문헌에 제공된 파라미터 또는 디폴트 파라미터를 사용하여 본 발명에 의해 구성된 아미노산 서열의 유사성 백분율을 결정할 수 있다. BLAST 분석을 수행할 수 있는 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터를 통해 일반인이 얻을 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 상기 언급된 바와 같이 주어진 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열은 상기 아미노산 서열과 기본적으로 동일한 폴리펩티드 서열, 예를 들어 적어도 본 명세서에 요약된 방법(예를 들어, BLAST 분석을 사용하는 경우)을 사용할 때 본 발명에 의해 구성되는 폴리펩티드 서열과 적어도 70% 이상 동일한 것으로 결정된 서열을 포함하며, 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일성을 나타내는 것이 바람직하다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "벡터"는 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 상기 단백질이 발현될 수 있게 하는 핵산 전달 운반체(vehicle)의 유형을 지칭한다. 벡터는 숙주 세포의 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염 후 숙주 세포 내에서 운반하는 유전자 물질 성분(들)의 발현을 허용한다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드; 파지미드; 코스미드; 예컨대 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체; 예를 들어 X 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스와 같은 박테리오파지를 포함한다. 벡터로 사용되는 동물 바이러스의 예에는 레트로 바이러스(렌티 바이러스 포함), 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus)와 같은 포진 바이러스(herpes virus), 폭스 바이러스, 바큘로 바이러스, 유두종 바이러스 및 파포바 바이러스(예 : SV40)가 포함된다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선별 요소 및 리포터 유전자를 비롯한 여러 발현 제어 요소를 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 바이러스 입자, 리포좀 또는 단백질 코트와 같은 세포로의 진입을 용이하게 하는 성분을 포함할 수 있지만, 이러한 성분은 상기 물질로 한정되지 않는다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "숙주 세포"는 대장균 또는 B. subtilis와 같은 원핵 세포, 효모 세포 또는 아스퍼질러스와 같은 진균 세포, Drosophila S2 세포 또는 Sf9와 같은 곤충 세포, 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NS0 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 다른 인간 세포와 같은 동물 세포를 포함하는 다수의 상이한 세포 유형을 포함하는 벡터가 도입되는 세포를 지칭한다.
본 발명에 의해 구성된 항체 단편은 전체 항체 분자의 가수 분해를 통해 수득될 수 있다(Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985) 참조). 추가적으로, 이들 항체 단편은 또한 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다(Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11:548-557 (1999); Little et al., Immunol. Today, 21:364-370 (2000)에서 검토 됨). 예를 들어, Fab '단편은 대장균 세포로부터 직접 얻거나 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio / Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 예로서, F(ab')2 단편은 GCN4 류신 지퍼를 사용한 연결을 통해 얻을 수 있다. 또한, Fv, Fab 또는 F(ab')2 단편은 또한 재조합 숙주 세포 배양 배지로부터 직접 단리 될 수 있다. 당업자는 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술을 완전히 알고 있을 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "특이적 결합"은 항체와 상응하는 항원 사이에서 발생하는 반응과 같은 두 분자 사이의 비-무작위 결합 반응을 의미한다. 여기서, 2차 항원에 대한 1차 항원에 결합하는 항체의 결합 친화도는 매우 약하거나 검출할 수 없다. 특정 측면에서, 주어진 항원에 특이적인 항체는 상기 항원과 10-5M 미만의 친화도(KD)(예를 들어, 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M 또는 10-10M)로 결합한다. KD는 해리속도 대 결합속도(koff/kon)의 비를 나타내고, 이 양은 당업자에게 친숙한 방법을 통해 측정될 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 본 발명에 의해 구성된 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있고 동시에 뮤린 PD-L1에 결합할 수 있지만 PD-L2 또는 B7H3에 결합하지는 않는다.
본 발명의 일부 측면에서, 본 발명에 의해 구성된 항-PD-L1 항체는 hPD-1과 관련하여 hPD-L1에 경쟁적으로 결합할 수있다.
본 발명의 맥락에서, PD-L1 관련 질환은 예를 들어 PD-L1에 관련된 종양 및 바이러스 감염, 특히 높은 수준의 PD-L1 발현과 관련된 종양 및 바이러스 감염을 포함한다.
본 발명의 일부 측면에서, 상기 언급된 종양은 폐암, 난소암, 대장암, 결장 직장암, 흑색종, 신장암, 방광암, 유방암, 간암, 림프종, 혈액 악성 종양, 두경부암, 신경 교종, 위암, 비인두암, 후두암, 자궁 경부암, 자궁암, 골육종, 갑상선암 및 전립선암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일부 측면에서, 상기 언급된 바이러스 감염은 급성, 아급성 또는 만성 HBV, HCV 또는 HIV 감염을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 맥락에서, 20개의 통상적인 아미노산 및 그들의 약어는 통상적인 용도를 따른다. 인용을 통해 본 명세서에 포함된 면역학-합성(제 2 판, E.S. Golub 및 D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, (1991))을 참조한다.
본 발명의 이점
본 발명은 스크리닝 및 친화도 성숙과 함께 효모 디스플레이 기술을 사용하여 우수한 특이도를 나타내는 완전한 인간 항-PD-L1 항체를 수득하고, 상대적으로 높은 친화도 및 안정성(상기 항체는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있거나 뮤린 PD-L1에 동시에 결합할 수 있고 B7H3 또는 PD-L2에 결합하지 않음); 상기 항체는 활성화된 T 세포에 결합하여 T 세포 활성화를 추가로 향상시키고 종양 성장을 현저하게 억제한다.
상세한 설명
다음 섹션에서, 본 발명의 양태는 다음 실시예를 통해 추가로 설명된다;
그러나 당업자가 이해해야 하는 바와 같이, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해서만 사용되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 다음 실시예에 명시되지 않은 조건은 일반적으로 사용되거나 제조업체가 권장하는 조건으로 설정해야 한다. 제조업체가 지정하지 않은 시약 또는 기기는 모두 상업적으로 구입할 수 있는 표준 제품에 해당한다.
실시예 1: 재조합 인간 PD-L1 및 PD-1 발현 및 관련된 EGFP 세포의 제조
인간 PD-L1의 세포 외 도메인의 아미노산 서열은 단백질 데이터베이스 Uniprot에 포함된 PD-L1의 아미노산 서열(Q9NZQ7)(즉, Q9NZQ7에 포함된 잔기 1 내지 잔기 238의 서열); IgG1-Fc의 구조 도메인의 아미노산 서열은 단백질 데이터베이스 Uniprot에 포함된 인간 면역 글로불린 감마 1(IgG1)의 불변 영역의 아미노산 서열(P01857)(즉, P01857에 포함된 잔기 104에서 잔기 330까지의 서열); IgG1-Fc의 구조 도메인의 아미노산 서열은 단백질 데이터베이스 Uniprot에 포함된 인간 면역 글로불린 감마 1(IgG1)(P01868)(즉, P01868에 포함된 잔기 98 내지 잔기 324의 서열)의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 수득되었다. 온라인 도구 DNAworks (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)를 사용하여 상응하는 인코딩 DNA 서열을 디자인하여 hPD-L1-Fc 및 hPD-L1-muFc 융합 단백질 유전자를 수득하였으며, 동일한 방법을 사용하여 hPD-1-Fc 유전자를 얻었다. 인간 PD-L1(Q9NZQ7)을 위한 아미노산 서열, 뮤린 PD-L1(Q9EP73)을 위한 아미노산 서열 및 인간 PD-1(Q15116)을 위한 아미노산 서열 뿐만 아니라 Enhanced Green Fluorescent Protein(EGFP)(CFPMKY7)을 위한 아미노산 서열은 단백질 데이터베이스 Uniprot에 포함된 정보에 기초하여 수득하였다. 온라인 도구 DNAworks(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)를 사용하여 상응하는 인코딩 DNA 서열을 디자인하여 PD-L1-EGFP 융합 단백질 유전자를 수득하였고, 동일한 방법을 사용하여 hPD-1-EGFP 및 mPD-L1-EGFP 유전자를 수득하였다. 상응하는 DNA 단편은 인공 합성을 통해 수득되었다. 합성된 유전자 서열을 Fermentas-made HindIII 및 EcoRI로 이중 분해하고 상용 벡터 pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen, V863-20)에 클로닝한 후, 시퀀싱을 수행하여 플라스미드가 재조합 플라스미드 DNA; 즉 : pcDNA4-hPD-L1-Fc, pcDNA4-hPD-L1-muFc, pcDNA4-hPD1-Fc, pcDNA4-hPD-L1-EGFP, pcDNA4-hPD1-EGFP 및 pcDNA4-mPD-L1-EGFP를 얻기 위해 정확하게 구성되었는지 확인하였다.
역전사-중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하여 실험실 배양 수지상 세포 (DC 세포)로부터 인간 PD-L2 및 B7H3 유전자를 증폭시켰고(상기 DC 세포는 TNF-PBMC로부터 단리된 단핵 세포의 성숙을 통해 수득 됨) 사용된 유전자 증폭 프라이머는 다음과 같다:
PDL2-F HindIII: GCGCAAGCTTGCCACCATGATCTTCCTCCTGCTAATG (서열번호 74),
PDL2-R EcoI: GCCGAATTCGATAGCACTGTTCACTTCCCTC (서열번호 75);
hB7H3-F HindIII: GCGCAAGCTTGCCACCATGCTGCGTCGGCGGGGCAGC (서열번호 76);
hB7H3-R BamHI: GCGCGAATTCGGCTATTTCTTGTCCATCATCTTC (서열번호 77).
이어서, 수득된 PCR 산물을 Fermentas HindIII 및 EcoRI를 사용하여 이중 분해하고 미리 구성된 pcDNA4-hPD-L1-EGFP로 클로닝한 후, 시퀀싱을 수행하여 플라스미드가 정확하게 재조합 플라스미드 DNA를 수득하도록 구축되었는지 확인하였다; 즉 : pcDNA4-hPD-L2-EGFP 및 pcDNA4-hB7H3-EGFP.
상응하는 EGFP 재조합 플라스미드를 HEK293(ATCC, CRL-1573 ™) 세포로 형질 감염시키고, 형질감염 후 48시간에 형광-활성화 세포 분류기(FACS)를 수행하여 hPD-L1, mPD-L1, hPD-L2 및 hB7H3의 발현을 확인하였다.
pcDNA4-hPD-L1-Fc, pcDNA4-hPD-L1-muFc 및 pcDNA4-hPD1-Fc를 단백질 생산을 위해 HEK293 세포에 일시적으로 형질 감염시켰다. 재조합 발현 플라스미드를 Freestyle293 배양 배지로 희석하고, 형질 전환에 필요한 PEI(폴리에틸렌이민) 용액에 첨가한 후, 각 플라스미드/PEI 혼합물을 각각 별도로 세포 현탁액에 첨가하고 37℃, 10% CO2 및 90 rpm에서 배양되도록 두고, 동시에 50pg/L 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1)를 보충 첨가하였다. 4시간 후, EX293 배양 배지, 2mM 글루타민 및 50pg/L IGF-1의 보충 첨가를 수행하고 배양을 135 rpm으로 계속하였다. 추가 24시간 후, 3.8mM 밸프로에이트(Valproate, VPA)를 첨가하였다. 5-6일 배양 후, 일시적 발현 배양의 상청액을 수집하고, Protein A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 초기에 정제하여 다음 실시예에 사용하기 위한 hPD-L1-Fc, hPD-L1-muFc 및 hPD-1-Fc 단백질 샘플을 수득하였다. 이렇게 얻어진 단백질 샘플은 SDS-PAGE를 이용한 예비 테스트를 거쳤으며, 표적 밴드가 분명하게 보이는 것을 확인하였다.
실시예 2: 효모 디스플레이 라이브러리에서 항-hPD-L1 항체를 위한 스크리닝, 클로닝 발현 및 동정.
효모 디스플레이 기술을 사용하여 PD-L1에 대한 완전한 인간 항체를 스크리닝 하였다. 21명의 건강한 사람으로부터 수득한 비장 및 림프절 IgM 및 IgG cDNA에 함유된 VH 및 VL 유전자의 클로닝을 수행하여 scFV 효모 디스플레이 라이브러리를 구축하였고(VH와 VL 사이의 연결 서열은 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 67) 연결 펩티드였다.), 라이브러리의 저장 용량은 5 × 108이었다. 10x 용량 효모 라이브러리를 부활시키고 효모를 유도하여 표면에 항체를 발현시켰다; 100 nM의 비오티닐화된 hPD-L1 항원 자기 비드를 사용하여 2회 농축을 수행한 후, 항-myc 항체 및 비 오티닐화된 hPD-L1 유세포 분석기를 사용하여 추가 2회의 농축을 수행하였다. 이렇게 수득한 효모를 플레이팅하고 단일 클론을 선택하였다. 증폭 및 발현 유도된 단일클론 효모는 항-myc 항체뿐만 아니라 비오티닐화된 hPD-L1 또는 대조군 항원 hPD-1을 사용하여 염색 분석을 수행하였고, 항원-양성 또는 대조군-음성인 효모는 양성인 효모로 평가되었다.
FACS로 확인된 효모 클론은 다음 PCR 프라이머를 사용하여 효모 콜로니 PCR 및 시퀀싱을 거쳤다:
pNL6-F:
GTACGAGCTAAAAGTACAGTG (서열번호 78);
pNL6-R:
TAGATACCCATACGACGTTC (서열번호 79);
사용된 서열 분석 프라이머는 pNL6-R이었다. 시퀀싱 후 얻은 서열 결과는 BioEdit 소프트웨어 패키지를 사용하여 정렬 분석되었다.
상기한 바와 같이 수득된 단일-사슬 항체 scFv 유전자 및 이전에 수득된 IgG1-Fc 유전자를 Fermentas HindIII 및 EcoRI 효소의 이중 분해를 사용하여 상업적벡터 pEE6.4(Lonza)에 융합시키고 클로닝 한 후 클로닝 및 플라스미드 miniprep(소량의 플라스미드의 준비 및 추출)을 표준 분자 클로닝 절차에 따라 수행하였다. 추출된 플라스미드를 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시키고 단백질 A 컬럼을 사용하여 정제하였다.
hPD-L1-EGFP 세포를 0.5 % PBS-BSA 완충액에 재현탁 시킨 후, 상기 언급된 정제된 항-hPD-L1 scFv 항체를 동시에 첨가하면서, 상응하는 대조군은 음성 대조군으로서, 2pg의 hIgGI 단백질로 설정하였고, hPD-1-Fc를 양성 대조군으로 첨가하였다. 이차 항체는 eBioscience의 항-hIg-PE를 사용하였다. 염색이 완료된 후 유세포 분석기를 통해 검출을 수행하였다. 상기 방법을 사용하여 세포 표면 PD-L1 항원에 결합할 수 있는 항체를 확인하였다.
hPD-L1-EGFP 세포를 0.5 % PBS-BSA 완충액에 재현탁시킨 후, 상기 정제된 항-hPD-L1 scFv 항체를 첨가하면서 동시에 2pg의 hIgG1 단백질로 음성 대조군을 설정하였다; 0.3 pg의 hPD-1-Fc-비오틴을 모든 샘플에 첨가하고 eBioscience의 SA-PE를 이차 항체로 사용하였다; 염색이 완료된 후 유세포 분석기를 통해 검출을 수행하였고, 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 방법을 사용하여 세포 표면 PD-L1 항원 및 PD-1 결합을 차단할 수 있는 항체를 확인하였다.
스크리닝 및 확인 후, 유리한 특성을 나타내는 3개의 항체 균주 B50, B60 및 BII61을 수득하였다. 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 3개의 항-hPD-L1 항체 균주 모두 hPD-1 수용체와의 결합을 차단할 수 있었다.
연결 펩티드 서열
GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 67)
은 상기 언급된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 사이에 포함된다.
B50 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKWYNDYADSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS (서열번호 51);
밑줄친 부분은 CDR 1, 2 및 3을 구성하고 각각 서열 번호 13 내지 15에 상응하고 밑줄 치지 않은 부분은 각각 FR1, 2, 3 및 4를 구성하고 각각 서열 번호 38 내지 41에 상응하고;
상응하는 DNA 서열은:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCTTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCGACTCTGTGAAAAGTCGATTAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAATTAAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA (서열번호 59) 이다;
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은:
QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL (서열번호 56)이다;
밑줄친 부분은 CDR 1, 2 및 3을 구성하고 각각 서열 번호 21, 17 및 18에 상응하고 밑줄 치지 않은 부분은 각각 FR1, 2, 3 및 4를 구성하고 각각 서열 번호 42 내지 45에 상응하고;
상응하는 DNA 서열은:
CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCTGTACTGGCACCAGTAGTGATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCAC CCAGCTGACCGTCCTC (서열번호 66) 이다.
B60 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은:
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFSYGWFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 53) 이다;
밑줄친 부분은 CDR 1, 2 및 3을 구성하고 각각 서열 번호 1, 2 및 19에 상응하고 밑줄 치지 않은 부분은 각각 FR1, 2, 3 및 4를 구성하고 각각 서열 번호 22 내지 25에 상응하고;
상응하는 DNA 서열은:
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAGCTATGGCTGGTTTG ACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 60) 이다;
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은:
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK (서열번호 48) 이다;
밑줄친 부분은 CDR 1, 2 및 3을 구성하고 각각 서열 번호 4 내지 6에 상응하고 밑줄 치지 않은 부분은 각각 FR1, 2, 3 및 4를 구성하고 각각 서열 번호 26 내지 29에 상응하고;
상응하는 DNA 서열은:
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAA TCAAA (서열번호 62) 이다.
BII61 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYA VSVKSRISINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTVSS (서열번호 54) 이고;
밑줄친 부분은 CDR 1, 2 및 3을 구성하고 각각 서열번호 7, 2 및 9에 상응하고 밑줄 치지 않은 부분은 각각 FR1, 2, 3 및 4를 구성하고 각각 서열 번호 30 내지 33에 상응하고;
상응하는 DNA 서열은:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATATTTTG TCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 61) 이다;
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은:
DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK (서열번호 55) 이고;
밑줄친 부분은 CDR 1, 2 및 3을 구성하고 각각 서열번호 10 내지 12에 상응하고 밑줄 치지 않은 부분은 각각 FR1, 2, 3 및 4를 구성하고 각각 서열 번호 34, 46, 36 및 37에 상응하고;
상응하는 DNA 서열은:
GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATA TCAAA (서열번호 65) 이다.
실시예 3: 항-hPD-L1 scFv의 구축은 친화도 효모 라이브러리를 개선시켰다.
pEE6.4-B50-Fc, pEE6.4-B60-Fc 및 pEE6.4-BII61-Fc 플라스미드를 주형으로 사용하여 표준 PCR 반응을 각각 수행하고,
pEE6.4-F:
TCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGC (서열번호 80) 및
cMyc-BBXhoI: GCCAGATCTCGAGCTATTACAAGTCTTCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCTAGAATTCCG (서열번호: 81)
를 프라이머로 사용하였다.
PCR 산물을 정제하고 Fermentas NheI 및 BglII를 사용하여 상업용 pCT302 벡터 상업용(Addgene : # 41845)으로 클로닝하여 재조합 플라스미드 pCT302-B50, pCT302-B60 및 pCT302-BII61을 얻었다. 다음으로, Ginger et al. (2006) Nat Protoc 1 (2) : 755-68에 자세히 기술된 방법에 기반하여 scFv의 무작위로 돌연변이된 PCR 산물을 얻었다. 사용된 프라이머는
T7 proshort:
TAATACGACTCACTATAGGG (서열번호 82) 및
Splice 4/L:
GGCAGCCCCATAAACACACAGTAT (서열번호 83) 이다.
수득한 PCR 산물을 Fermentas GeneJET DNA 정제 키트를 사용하여 정제한 후 에탄올 침전을 통해 1 pg/pl 초과의 농도로 농축시켰다. Fermentas NheI 및 BamHI를 사용하여 상용 벡터 pCT302의 이중 분해를 수행하고 동시에 Fermentas FastAP 탈인산화효소를 사용하여 벡터의 탈 인산화를 수행한 후 Fermentas GeneJET DNA 정제 키트를 사용하여 정제를 다시 수행했다. 에탄올 침전을 수행하여 생성물을 1pg/pl 초과의 농도로 농축시켰다. 효모 전기 변환 및 생체 내(in vivo) 재조합은 문헌 [Ginger et al. (2006) Nat. 프로토 타입 1 (2) : 755-68에 자세히 기재된 방법에 따라 수행하여 친화도 성숙 효모 라이브러리를 얻었다.
실시예 4: 향상된 친화도의 항-hPD-L1 scFv를 발현하는 효모를 얻기 위한 스크리닝.
상기한 바와 같이 수득된 친화도 성숙 효모 라이브러리에 10 nM 및 1 nM의 hPD-L1-Fc 단백질을 사용하여 2회의 유세포 분류(flow sorting)를 수행하고, 이와 같이 수득된 효모 생성물을 도금하고 식별을 위해 단일클론을 선택하였다. 저농도 항원 염색법을 사용하여 유동 염색법(flow staining)을 사용하여 이전에 수득된 야생형 효모를 대조군으로 사용하여 친화도가 증가된 효모 단일클론을 확인하였다.
FACS 검증을 통과한 효모 클론은 상기 기술된 방법을 사용하여 효모 콜로니 PCR 및 시퀀싱되었다. 친화도 성숙 후 수득된 scFv 유전자 및 이전에 수득된 IgG1-Fc 유전자를 Fermentas HindIII 및 EcoRI 효소의 이중 분해를 사용하여 상용 벡터 pEE6.4에 융합시키고 클로닝 한 후, 통상적인 표준 클로닝 절차에 따라 클로닝 및 플라스미드 miniprep을 수행하였다. 추출된 플라스미드를 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시키고 단백질 A 컬럼을 사용하여 정제하였다.
항체 결합능 및 차단능은 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 측정하였다.
항체 결합능 실험 결과는 도 2에 나타냈다; 결과는 친화도 성숙 후 수득된 3개의 항체 균주가 친화도를 상당히 증가 시켰음을 보여준다.
차단능 실험 결과는 도 3에 나타냈다; 결과는 친화도 성숙 후 수득된 3 개의 항체 균주에 대해 수득된 PD-1과 경쟁하여 PD-L1에 대한 경쟁적 결합에 대한 IC50 값이 각각 BII61-62에 대해 0.837 pg/ml(BII61에 대해 0.884 pg/ml), B50-6에 대해 4.56 pg/ml(B50에 대해 5.63 pg/ml) 및 B60-55에 대해 1.14 pg/ml(B60에 대해 16.8 pg/ml)임을 나타냈다.
친화도 성숙 후, 증가된 친화도, 즉 B50-6, B60-55 및 BII61-62를 나타내는 3개의 항-hPD-L1 scFv 항체 서열을 수득하였다. B50과 비교하여, B50-6은 이의 VL CDR 1에서 D에서 N으로의 아미노산 돌연변이를 보여 주었다; B60과 비교하여, B60-55는 이의 VH CDR 3에서 S에서 N으로의 아미노산 돌연변이를 보여 주었고; BII61과 비교하여, BII61-62는 이의 VH CDR2에서 이의 VL FR2에서 I에서 V로의 아미노산 돌연변이 뿐만 아니라 S에서 G 로의 아미노산 돌연변이를 나타냈다. 연결 펩티드 서열
GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 67)
은 상기 언급한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 사이에 포함된다.
B50-6 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKWYNDYADSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS (서열번호 51) 이고;
밑줄친 부분은 CDR 1, 2 및 3을 구성하고 각각 서열번호 13 내지 15에 상응하고 밑줄 치지 않은 부분은 각각 FR1, 2, 3 및 4를 구성하고 각각 서열 번호 38 내지 41에 상응하고;
상응하는 DNA 서열은:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCTTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCGACTCTGTGAAAAGTCGATTAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAATTAAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTG ATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA (서열번호 59) 이고;
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은:
QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL (서열번호 52) 이고;
밑줄친 부분은 CDR 1, 2 및 3을 구성하고 각각 서열번호 16 내지 18에 상응하고 밑줄 치지 않은 부분은 각각 FR1, 2, 3 및 4를 구성하고 각각 서열 번호 42 내지 45에 상응하고;
상응하는 DNA 서열은:
CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCTGTACTGGCACCAGTAGTAATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAG CTGACCGTCCTC(서열번호 64) 이고;
B60-55 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은:
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFNYGWFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 47) 이고;
밑줄친 부분은 CDR 1, 2 및 3을 구성하고 각각 서열번호 1 내지 3에 상응하고 밑줄 치지 않은 부분은 각각 FR1, 2, 3 및 4를 구성하고 각각 서열 번호 22 내지 55에 상응하고;
상응하는 DNA 서열은:
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAACTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 57) 이고;
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은:
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK (서열번호 48) 이고;
밑줄친 부분은 CDR 1, 2 및 3을 구성하고 각각 서열번호 4 내지 6에 상응하고 밑줄 치지 않은 부분은 각각 FR1, 2, 3 및 4를 구성하고 각각 서열 번호 26 내지 29에 상응하고;
상응하는 DNA 서열은:
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGCCAGGTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAAT CAAA (서열번호 62) 이고;
BII61-62 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYAVSVKGRISINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTV SS (서열번호 49) 이고;
밑줄친 부분은 CDR 1, 2 및 3을 구성하고 각각 서열번호 7 내지 9에 상응하고 밑줄 치지 않은 부분은 각각 FR1, 2, 3 및 4를 구성하고 각각 서열 번호 30 내지 33에 상응하고;
상응하는 DNA 서열은:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAGTATCTGTGAAAGGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATA TTTTGTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 58) 이고;
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은:
DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLVYGASSLQSGVPSRFSG
SGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK (서열번호 50) 이고;
밑줄친 부분은 CDR 1, 2 및 3을 구성하고 각각 서열번호 10 내지 12에 상응하고 밑줄 치지 않은 부분은 각각 FR1, 2, 3 및 4를 구성하고 각각 서열 번호 34 내지 37에 상응하고;
상응하는 DNA 서열은:
GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCTAAGCTCCTGGTCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGT GGATATCAAA (서열번호 63) 이다.
실시예 5: scFv 항체의 IgG 항체로의 포맷팅(formatting).
Uniprot 단백질 데이터베이스(P01857)에 포함된 인간 면역 글로불린 감마 1 (IgG1)의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 인간 IgG1 불변 영역 아미노산 서열을 수득하였다. 온라인 툴 DNAworks(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)를 사용하여 B50-6, B60의 중쇄 가변 영역의 인간 IgG1 불변 영역 유전자 및 VH 서열을 얻기 위해 상응하는 인코딩 DNA 서열을 설계 하였다. 스크리닝을 통해 수득 된 -55 및 BII61-61을 인간 IgG1 불변 영역 유전자와 함께 스 플라이 싱하면서 동시에 하기 신호 펩티드 서열을 VH의 5 '말단에 첨가하였다 :
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT (서열번호 84);
스플라이싱 된 유전자를 합성하고 Fermentas HindIII 및 EcoRI 효소를 사용하여 이중 분해를 수행하여 pEE6.4-B50-6HC, pEE6.4-B60-55HC; 및 pEE6.4-BII61-62HC을 수득하기 위해 유전자를 벡터 pEE6.4에 클로닝하였다. Uniprot 단백질 데이터베이스(P01834)에 포함된 인간 면역 글로불린 카파의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 인간 카파 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 수득 하였다.
온라인 툴 DNAworks(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)를 사용하여 인간 카파 경쇄 불변 영역 유전자 및 B60-55의 중쇄 가변 영역의 VL 서열을 얻기위한 상응하는 인코딩 DNA 서열을 설계 하였다. 스크리닝을 통해 수득 된 BII61-61을 인간 카파 경쇄 불변 영역 유전자와 함께 스플라이싱하면서 동시에 하기 신호 펩티드 서열을 VL의 5 '말단에 첨가 하였다:
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT (서열번호 84);
온라인 툴 DNAworks (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)를 사용하여 상응하는 인코딩 DNA 서열을 디자인하여 인간 람다 (X) 경쇄 불변 영역 유전자 및 경쇄 가변 영역의 VL 서열을 수득하였다. 스크리닝을 통해 수득한 B50-6을 인간 람다 경쇄 불변 영역 유전자와 함께 스플라이싱하면서 동시에 하기 신호 펩티드 서열을 VL의 5 '말단에 첨가 하였다 :
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT (서열번호 84);
그리고 스플라이싱 된 유전자를 합성하고 Fermentas HindIII 및 EcoRI 효소를 사용해 이중 분해를 수행하여 pEE12.4-B50-6LC, pEE12.4-B60-55LC 및 pEE12.4-BII61-62LC를 수득하기 위해 유전자를 벡터 pEE12.4(Lonza)로 클로닝하였다.
상기와 같이하여 얻은 중쇄 및 경쇄 플라스미드는 AidLab Maxiprep 키트 (PL14)를 사용하여 제조하였다. 재조합으로 구축된 경쇄 및 중쇄 플라스미드를 HEK293 세포에 공동 형질 감염시켜 항체를 발현시켰다. 재조합 발현 플라스미드를 Freestyle293 배양 배지로 희석하고, 형질 전환에 필요한 PEI(폴리에틸렌이민) 용액에 첨가한 후, 각 플라스미드/PEI 혼합물을 각각 별도로 세포 현탁액에 첨가하고 37℃, 10% CO2, 및 90 rpm에서 배양하고, 동시에 50 pg/IGF-1의 보충 첨가가 수행되었다. 4시간 후에, EX293 배양 배지, 2mM 글루타민 및 50pg/L IGF-1의 보충 첨가를 수행하고 배양을 135rpm으로 계속 하였다. 24시간 추가 배양 후, 3.8mM VPA를 첨가 하였다. 5 내지 6 일 배양 후, 일시적 발현 배양의 상청액을 수집하고 단백질 A 친 화도 크로마토그래피를 사용하여 항-hPD-L1 B50-6, B60-55 및 BII61-62 mAb 항체를 정제하고 수득하였다.
IgG1 사슬 불변 영역 아미노산 서열은:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (서열번호 68) 이고;
IgG1 사슬 불변 영역 핵산 서열은:
GCCAGCACTAAGGGGCCCTCTGTGTTTCCACTCGCCCCTTCTAGCAAAAGCACTTCCGGAGGCACTGCAGACTCGGGTGTCTGGTCAAAGATTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGAGCTGGAACTTGGCGCCCTCACCTCCGGGGTTCACACCTTTCCAGCCGTCCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTCGTTACCGTGCCATCCTCTTCTCTGGGGACCCAGACATACATCTGCAATGTCACCATAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTCGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACACACACCTGCCCTCCATGCCCCGCACCTGAACTCCTGGGCGGGCCTTCCGTTTTCCTGTTTCCTCAAGCCCAAGGATACACTGATGATTAGCCGCACCCCCGAAGTCACTTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCAGAAGTTAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGGGTCGAGGTGCACAATGCTAAACAAAGCCCAGGGAGGAGCAATATAACTCCACATACAGAGTGGTGTCCGTTCTGACAGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCACTGCCAGCCCCATAGAGAAGACAATCTCTAAAGCTAAAGGCCAACCACGCGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCATCCAGGGACGAACTGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACTTGTCTCGTCAAAGGATTCTACCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAACGGCCAACCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCAGTCCTGGACTCTGATGGGAGCTTTTTCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCATAACCACTATACCCAGAAAAGCCTCAGCCTGTCCCCCGGGAAATAATGA (서열번호 69) 이고;
카파 사슬 불변 영역 아미노산 서열은:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 70) 이고;
카파 사슬 불변 영역 핵산 서열은:
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGTACCGCTAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTATCCACGGGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAAGGGACAATGCCCTCCAGAGCGGAAATAGCCAAGAGTCCGTTACCGAACAGGACTCTAAAGACTCTACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTCTCCAAGGCCGACTATGAGAAACACAAGGTTTACCATGCGAGGTCACACACCAGGGACTCTCCTCTCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGAGA ATGC (서열번호 71) 이고;
B50-6 경쇄 (람다) 불변 영역 아미노산 서열은:
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS (서열번호 72) 이고;
B50-6 경쇄 (람다) 불변 영역 핵산 서열은:
GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCGTAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGTGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTATGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACGCTGCCGGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTGCAGAATGCTCT (서열번호 73) 이다.
실시예 6: 항-hPD-L1 mAb 특성의 확인.
정제한 항-hPD-L1 항체 및 hPD-L1 결합능 측정(ELISA 방법):
코팅 완충용액(50 mM 탄산-중탄산염 완충액, pH 9.6)을 사용하여 hPD-LI-muFc를 2 pg/ml로 희석한 후, 용액을 100 pL/웰로 분취하고 밤새 4 ℃에서 방치하였다. 이어서, 플레이트상의 액체를 버리고 PBST(pH 7.4, 0.05 % 트윈-20, V/V)를 사용하여 세척하고 샘플을 3% BSA-PBS에서 1시간 동안 밀봉하였다. 항체 B50-6mAb, B60-55mAb 및 BII61-62mAb는 각각 대조군으로 사용된 희석제(1 % BSA-PBS)를 사용하여 총 11가지 다른 농도 및 배양으로 총 2,000 ng/ml에서 2 배 연속 희석하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 염소 항-인간 IgG-HRP(염소 항-인간 IgG-HRP 접합됨)를 첨가하고 1시간 동안 배양하였다. 용해성 단일 성분 TMB 발색 기질 용액을 첨가하고 각 샘플을 어두운 환경에서 5 내지 10 분 동안 실온에서 전개시켰다. 2N H2SO4를 50 pL/웰로 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 후 각 샘플을 MD SpectraMax Plus384 마이크로 플레이트 리더에 놓고 OD 450nm 내지 650nm 값을 읽은 후 SoftMax Pro v5.4 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터 처리 및 매핑 분석을 수행했다. 결과는 도 4에 나타냈다.
상기 방법을 사용하여, 3개의 항체 균주의 항원-결합 EC50 값은 40 pg/ml (B60-55 mAb), 18.3 pg/ml (BII61-62 mAb) 및 28.1 pg/ml (B50- 6 mAb)로 결정되었다.
정제된 항-hPD-LI 항체 및 hPD-L1 결합 동역학(SPR)의 측정 :
재조합 인간 PD-L1에 대한 항-PD-L1 항체 B50-6 mAb, BII61-62 mAb 및 B60-55 mAb의 결합 동역학의 측정은 Biacore X100을 사용하여 수행된 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon resonance, SRP)을 사용하여 측정되었다. 재조합 hPD-L1-Fc를 CM5 바이오센서칩 상에 직접 코팅하여 대략 1000 개의 반응 단위(RU)를 수득하였다. 동역학 측정을 위해, 항체를 HBS-EP+1xbuffer(GE, Cat # : BR-1006-69)(1.37 nm ~ 1000 nm)에서 3 배 연속 희석을 통해 희석하고, 25초에서 120초 동안 샘플링을 수행하였다. 30분의 해리 시간으로 10mM 글리신-HCl(pH 2.0)로 120초 동안 재생을 수행하였다. 간단한 일 대 일 Languir 바인딩 모델(Biacore Evaluation Software 버전 3.2)을 사용하여 결합 속도(kon) 및 분리 속도(koff)를 계산했습니다. 평형 해리 상수(kD)는 koff/ kon의 비율로 계산되었다.
측정된 항-PD-L1 결합 친화도 값에 대해서는 표 1에 나타냈다.
항-hPD-L1 항체 및 hPD-L1 결합 동역학의 측정
Designation Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (M)
B50-6mAb 1.672E+5 1.370E-2 8.193E-8
B60-55mAb 1.295E+6 2.222E-4 1.716E-10
BII 61-62mAb 9.795E+4 4.264E-4 4.353E-9
hPD-1과 경쟁하여 hPD-L1에 대한 정제된 항-hPD-LI 항체 결합능 측정 :
코팅 완충용액(50 mM 탄산-중탄산염 완충액, pH 9.6)을 사용하여 hPD-L1-hIgG를 5 pg/ml로 희석한 후, 용액을 밤새 4 ℃에서 방치하였다. PBST(pH 7.4, 0.05 % 트윈-20, V/V)를 사용하여 세척하고 샘플을 3 % BSA-PBS에서 1시간 동안 밀봉하였다. 측정을 기다리는 항-hPD-L1 mAb의 농축액을 100pg/ml로 희석한 후, 총 9 가지의 상이한 희석액에 대해 1% BSA-PBST-0.05 % 트윈-20(10pg/ml의 hPD-1-hIgG- 비오틴을 함유함)을 사용하여 1:6 연속 희석을 수행하고, 희석액을 37 ℃에서 2시간 동안 방치하였다. 플레이트를 세척 한 후, Horseradish peroxidase가 접합된 스트렙타비딘(SA-HRP)을 첨가하고 시료를 실온에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 수용성 단일 성분 TMB 발색 기질 용액을 첨가하고 각 샘플을 어두운 환경에서 5 내지 10 분 동안 실온에서 현상한 후, 2N H2SO4를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그런 다음 각 샘플을 MD SpectraMax Plus384 마이크로 플레이트 리더에 놓고 OD 450nm-650nm 값을 읽은 후 SoftMax Pro v5.4 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터 처리 및 매핑 분석을 수행했다. 측정된 데이터 및 IC50 값에 기초하여 항체 경쟁력을 분석하였고 그 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 방법을 사용하여, PD-1에 대한 3개의 항체 균주의 PD-L1에 대한 경쟁적 항원-결합 IC50 값은 0.255 pg/ml 1.7 nM(B60-55), 0.24 pg/ml 1.6 nM(BII61-62) 및 1.76 pg/ml 11.7 nM(B50-6) 이다.
CD80과 경쟁하여 hPD-L1에 대한 정제 된 항-hPD-LI 항체 결합능 측정 :
스크리닝을 통해 얻은 3가지 항체 균주 B60-55, BII61-62 및 B50-6을 평가하여 경쟁 ELISA 방법을 통해 PD-L1 및 CD80 결합을 차단할 수 있는지 여부를 결정했다. 사용된 구체적인 방법은 다음과 같다 : 코팅 완충용액(50 mM 탄산-중탄산염 완충액, pH 9.6)을 사용하여 hPD-L1-hFc를 5 pg/ml로 희석한 후, 용액을 밤새 4 ℃에서 방치하였다. PBST(pH 7.4, 0.05 % 트윈-20, V/V)를 사용하여 세척하고 샘플을 3 % BSA-PBS에서 1 시간 동안 밀봉하였다. 측정을 기다리는 항-hPD-L1 mAb의 농축액을 100pg/ml로 희석한 후, 총 9 가지의 상이한 희석액에 대해 1 % BSA-PBST-0.05 % 트윈-20(100pg/ml의 hCD80-hFc- 비오틴을 함유함, R&D: 140-B1-100)을 사용하여 1:6 연속 희석하고, 희석액을 37 ℃에서 2시간 동안 방치하였다. 플레이트를 세척한 후, Horseradish peroxidase가 접합된 스트렙타비딘(SA-HRP)을 첨가하고 시료를 실온에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 수용성 단일 성분 TMB 발색 기질 용액을 첨가하고 각 샘플을 어두운 환경에서 5 내지 10 분 동안 실온에서 현상한 후, 2N H2SO4를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그런 다음 각 샘플을 MD SpectraMax Plus384 마이크로 플레이트 리더에 놓고 OD 450nm-650nm 값을 읽은 후 SoftMax Pro v5.4 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터 처리 및 매핑 분석을 수행했다. 측정된 데이터 및 IC50 값에 기초하여 항체 경쟁력을 분석하였고 그 결과를 도 6에 나타내었다.
상기 방법을 사용하여, CD80에 대한 3 개의 항체 균주의 PD-L1에 대한 경쟁적 항원-결합 IC50 값은 0.543pg/ml(B60-55), 0.709pg/ml(BII61-62), 및 0.553pg/ml 11.7nM(B50-6) 이다.
PD-L1이 구체적으로 인식되는지 여부를 확인하는 검증 : 정제된 항-hPD-LI와 hPD-L1, hPD-L2 및 hB7H3의 결합
실시예 1에서 구축된 hPD-L1-EGFP, hB7H3-EGFP 및 hPD-L2-EGFP를 함유하는 HEK293 세포를 0.5% PBS-BSA 완충용액에 현탁시킨 후, 항-hPD-L1 mAb 단백질을 첨가하고(hIgG Fc를 음성 대조군으로 사용) 얼음상에서 20분 동안 배양하였다. 세척 후, eBioscience 2차 항체 항-hIg-PE를 첨가하고 샘플을 얼음 위에 20분 동안 방치하였다. 세척 후, 세포를 500 ㎕의 0.5% PBS-BSA 완충용액에 재현탁시키고 유세포 분석기에서 측정하였다.
결과는 도 6에 나타내었다. 결과에 나타난 바와 같이, 3개의 항체 균주는 모두 hPD-L1-EGFP 세포와 결합할 수 있었지만 hB7H3-EGFP 및 hPD-L2-EGFP 세포와 결합할 수 없어서 우수한 특이도를 나타냈다.
쥐(뮤린) PD-L1(mPD-L1)과 정제된 항-hPD-LI의 결합 :
실시예 1에서 구축된 hPD-L1-EGFP 및 mPD-L1-EGFP를 함유하는 HEK293 세포를 0.5% PBS-BSA 완충용액에 현탁시킨 후, 표적 항-hPD-L1 mAb를 첨가하고(hIgG Fc를 음성 대조군으로 사용) 얼음상에서 20분 동안 배양하였다; 이어서 세척을 수행하고, eBioscience 2차 항체 항-hIg-PE를 첨가하고 샘플을 얼음상에 20분 동안 정치시켰다. 세척 후, 세포를 0.5% PBS-BSA 완충용액에 재현탁시키고 유세포 분석기에서 측정하였다. 결과는 도 7에 도시되어있다. 결과에 나타낸 바와 같이, B50-6 mAb는 뮤린 PD-L1 (mPD-L1)과 결합할 수있는 반면, B60-55 및 BII61-62는 mPD-L1과 결합할 수 없었다.
시노몰구스 원숭이 PD-L1 과 정제된 항-hPD-L1의 결합:
시노몰구스(cynomolgus) 원숭이 PBMC를 인간 림프구 분리 배지(Tianjin Hao Yang)를 사용하여 분리하고 세포를 RPMI 완전 배지에 재현탁시킨 후, 세포 밀도를 100만 cells/ml로 조정하였다; 이어서, 200만 시노몰구스 원숭이 PBMC를 24-웰 플레이트에 첨가하고, 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin, PHA)을 동시에 2pg/ml의 최종 농도로 첨가하였다; 세포를 48시간 동안 자극한 후, 세포를 수집하고 FACS 완충용액으로 세척하고 항체 염색시켰다. 아이소타입 ctrl(항-KLH)을 음성 대조군으로 사용하였고, 구매한 PE-표지된 항-인간 PD-L1 항체(Biolegend : 329705)를 양성 대조군으로 사용하였다. 실험실에서 제조한(in-house) 항체를 1차 항체로 사용하여 세척 후 2차 항체로서 항-hIg-PE를 사용하여 항체 염색을 수행하였다. 각각의 염색 단계에 이어 30분 동안 4℃에서 배양하고, 염색이 수행된 후, FACS 완충용액을 사용하여 원심 분리를 통해 세포를 2회 세척한 후, 2차 항체를 첨가하거나 세포를 2% 파라포름알데히드에 직접 고정시킨 후 Guava를 이용하여 분석하였다. 결과는 도 8에 도시되어있다. 결과는 시노몰구스 원숭이 T 세포가 PHA로 자극된 후 PD-L1을 발현하였고, 생성된 3 개의 항체 균주는 활성화된 시노몰구스 원숭이 T 세포와 결합할 수 있음을 보여주었다.
실시예 7: 수지상 세포-T 세포 혼합 림프구 반응에서 CD4+ T 세포의 PD-L1 항체 활성화의 측정.
인간 림프구 분리 배지(Tianjin Hao Yang)를 사용하여 밀도 구배 원심분리를 통해 건강한 공여자로부터 수득된 풍부한 말초 백혈구로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리하였다. 다음으로, 상기 세포를 무혈청 RPMI1640에 재현탁시키고 10cm 배양접시에서 1 내지 2 시간 동안 배양한 후, 비 부착성 세포를 제거하고 10 % FBS를 함유하는 RPMI에서 세포를 배양하였다. 사이토카인은 GM-CSF(Shanghai Primegene: 102-03)에 대해 250 ng/ml의 최종 농도로 첨가되었고, IL-4에 대해 100 ng/ml(Shanghai Primegene: 101-04)에 첨가되었고, 이후 새로운 사이토카인 함유 배지를 2 내지 3 일마다 첨가하였다. 배양 6일째에, 50 ng/ml TNF-알파(Shanghai Primegene: 103-01)를 사용하여 세포 성숙을 유도하고 세포를 추가 24시간 동안 배양하였다. 성숙 수지상 세포를 수확하고 HLA-DR 항체로 염색하여 성숙을 확인하였다. 이어서 세포를 200,000 cells/ml의 농도로 RPMI 완전 배지에 재현탁시켰다. 생성된 현탁액 50 ㎕를 96-웰 U-바닥 플레이트(Costar: 3799)의 각 웰에 첨가하고 세포를 인큐베이터에서 배양되도록 두었다.
제공된 지침에 따라 다른 공여자로부터 얻은 PBMC로부터 CD4+ T 세포를 분리하기 위해 마그네틱 비드 분리 키트(Miltenyi Biotec : 130-096533)를 사용하였다. 세포를 200만 cells/ml의 농도로 RPMI 완전 배지에 계수하고 재현탁시킨 후, 수지상 세포를 함유하는 96-웰 U-바닥 플레이트에 첨가하고, 각 웰에 50 pl을 첨가하였다. RPMI 완전 배지에서 연속 희석된 100 pl의 PD-L1 항체를 각 웰에 첨가하여 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 및 0 pg/ml의 최종 항체 농도를 수득하였다. 이어서 세포를 5일 동안 배양하고, 상청액을 취하고, IFN-y ELISA 검출 키트 (eBioscience)를 사용하여 상청액 내의 IFN-y 수준을 검출하였다. 결과는 도 9에 도시하였다. 결과는 PD-L1 항체가 혼합 림프구 반응에서 y-IFN의 CD4+ T 세포 분비를 향상시킬 수 있음을 나타내고; 즉, PD-L1 항체는 T 세포 활성화를 향상시켰다. BII61-62에 대해 수득된 EC50 값은 0.078 pg/ml(0.5 nM에 해당)이고 B60-55에 대해 수득된 EC50 값은 0.189 pg/ml(1.2 nM에 해당)이었다.
실시예 8: 종양 성장에 대한 항-hPD-L1 항체의 억제 활성.
많은 종양이 신체의 항 종양 T 세포 반응을 약화시키는 방법으로 PD-1 리간드를 발현하는 것이 이미 명백하다. PD-L1의 특징적으로 증가된 발현 수준이 많은 상이한 개체에서 종양 및 종양 침윤 백혈구에서 발견되었으며, 상기 증가된 PD-L1 발현은 종종 불량한 예후와 관련이 있다. 뮤린 종양 모델은 종양에서 PD-L1 발현이 유사한 증가를 보였고, 또한 종양 면역 억제에서 PD-1/PD-L1 경로의 역할을 입증 하였다.
여기에서 우리는 PD-L1을 차단하는 것이 동종 C57B6 마우스에서 발견되는 MC38 세포(쥐 대장암 세포)에 대한 종양 성장에 영향을 미친다는 실험 결과를 제공한다.
0일째에, C57B6 마우스에 1백만개의 MC38 세포(일반적으로 시카고 대학교의 Yangxin Fu 교수에 의해 제공됨)를 피하 접종 하였다; 이어서, 마우스에 0, 3, 7 및 10 일에 10 mg/kg 항-PD-L1(B50-6) 또는 PBS 복강내 주사를 실시 하였다. 3 일에 종양 크기를 측정하고 종양 부피를 계산하여 종양 성장 곡선(도 10 참조); 결과는 항-PD-L1(B50-6)이 종양 성장을 유의하게 억제 할 수 있음을 보여준다.
면역 결핍성 NOD/SCID (비-비만 당뇨병/중증 복합 면역 결핍) 마우스를 사용하여 뮤린 PD-L1을 인식할 수 없었던 PD-L1 항체 B60-55 및 BII61-62의 생체 내 활성을 연구하였다. NOD/SCID 마우스에 피하 이식될 때 인간 PD-L1을 발현하는 흑색 종 세포주 A375(ATCC, CRL-1619TM) 및 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용한 실험을 수행하여 상기 목적을 달성하였다. A375 세포 및 PBMC를 주사 전에 5:1의 비율로 혼합하고 총 부피 100 pl(5 백만 A375 세포 및 1 백만 PBMC 함유)의 피하 주사를 수행하였다; 종양 접종 후 0, 7, 14, 21 및 28 일에 항체를 복강 내 투여 하고, 음성 대조군으로는 PBS를 투여하였다(항체 용량은 도 11-A의 경우 3 mg/kg이고 항체 용량은 도 11-B의 경우 도 11에 직접 나타냄). 각 실험 그룹은 4 내지 6 마리의 마우스로 구성되었다. 종양 형성은 일주일에 두 번 관찰되었고, 버니어 캘리퍼스를 사용하여 치수를 측정하고 종양 부피를 계산하여 종양 성장 곡선을 도출 하였다(도 11 참조); 결과는 항체 B60-55 및 BII-61-62가 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있음을 보여준다.
실시예 9: B60-55와 항체 2.41H90P(Medimmune)의 안정성 비교.
항-PD-L1 항체 B60-55 및 MedImmune LLC의 항체 2.41H90P의 가속 안정성 시험은 45℃에서 수행되었으며, 사용된 특정 시험 절차는 다음과 같다: 항-PD-L1 항체 B60-55 및 MedImmune LLC 항-PD-L1 항체 2.41H90P(미국 특허 번호 20130034559에 제공된 2.14H9의 제조 방법에 따라 제조된 후, 항체의 명칭이 2.41H90P로 변경됨)를 10 mg/ml의 농도로 농축한 후, 100 pg의 항체를 200 pg PCR 튜브에 첨가하고 45℃ 배치에 두었다; 0, 10, 20 및 30 일에 샘플을 채취한 후, 경쟁적 ELISA 및 SE-HPLC 분석 시험을 수행하였으며, 여기서 사용된 경쟁적 ELISA 방법은 실시예 6에 기재된 것과 동일하게 IC50 값을 수득하였다. 시마즈 LC LC20AT HPLC 크로마토그래피를 사용하여 SE-HPLC를 수행하였다; 샘플을 1 mg/ml로 농축하고 샘플을 총 샘플 부피가 50pg 인 경우 0.5 ml/분의 유속으로 로딩하고; 등용매 용리는 샘플 로딩 후 30분 동안 수행되었으며 결과는 도 12에 도시되어있다.
도 12에서, A는 B60-55 및 항체 2.41H90P에 대한 시간에 따른 IC50 값의 그래프 비교를 나타내고, 데이터는 상이한 시점에서 샘플 경쟁력에 유의한 변화가 없음을 나타낸다; B는 시간에 따른 항체 이량체의 비율을 나타내고, 데이터는 B60-55 및 2.41H90P 둘 다에 대해 이량체 비율이 시간이 지남에 따라 감소함을 나타내고; 그러나 2.41H90P의 감소가 B60-55보다 빠르다는 비율은 B60-55가 더 안정적임을 나타냈다. C는 B60-55 가속 안정성 시험에 대해 얻어진 경쟁적 ELISA 곡선을 나타내고, 데이터는 B60-55가 비교적 우수한 활성 및 안정성을 유지할 수 있음을 보여준다.
실시예 10: 항체 변이체 B60-55-1의 스케일업(scale-up) 제조 및 제제 안정성.
항체 제조 스케일업에 대한 잠재력을 평가하기 위해, 예시적인 항체 변이체 B50-55-1을 상기 개시에 기재된 바와 같이 본질적으로 클로닝 하였다. B60-55-1 완전한 중쇄의 아미노산 서열은 :
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFNYGWFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (서열번호 85);
상응하는 DNA 서열은:
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAACTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCAGCACTAAGGGGCCCTCTGTGTTTCCACTCGCCCCTTCTAGCAAAAGCACTTCCGGAGGCACTGCAGCACTCGGGTGTCTGGTCAAAGATTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGAGCTGGAACTCTGGCGCCCTCACCTCCGGGGTTCACACCTTTCCAGCCGTCCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTCGTTACCGTGCCATCCTCTTCTCTGGGGACCCAGACATACATCTGCAATGTCAACCATAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTCGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACACACACCTGCCCTCCATGCCCCGCACCTGAACTCCTGGGCGGGCCTTCCGTTTTCCTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATTAGCCGCACCCCCGAAGTCACTTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCAGAAGTTAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGGGTCGAGGTGCACAATGCTAAAACAAAGCCCAGGGAGGAGCAATATGCCTCCACATACAGAGTGGTGTCCGTTCTGACAGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCACTGCCAGCCCCCATAGAGAAGACAATCTCTAAAGCTAAAGGCCAACCACGCGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCATCCAGGGAGGAAATGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACTTGTCTCGTCAAAGGATTCTACCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAACGGCCAACCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCAGTCCTGGACTCTGATGGGAGCTTTTTCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGGTGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCATAACCACTATACCCAGAAAAGCCTCAGCCTGTCCCCCGGGAAATAATGA (서열번호 86) 이고;
완전한 경쇄의 아미노산 서열은:
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 87) 이고;
상응하는 DNA 서열은:
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGTACCGCTAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTATCCACGGGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAATGCCCTCCAGAGCGGAAATAGCCAAGAGTCCGTTACCGAACAGGACTCTAAAGACTCTACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTCTCCAAGGCCGACTATGAGAAACACAAGGTTTACGCATGCGAGGTCACACACCAGGGACTCTCCTCTCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGAGAAT GC (서열번호 88) 이고;
B60-55-1은 ActiCHO(GE) 또는 Dynamis(Thermo Fisher Scientific) 배지를 사용하여 생물 반응기에서 성장된 CHO 세포에서 생산되었다. 초기에, B60-55-1을 단백질 A 친화도 크로마토그래피 수지 MabSelect Sure LX, GE를 사용하여 정제된 세포 배양액으로부터 정제하고 그 다음에 2가지 다른 크로마토그래피 단계-유동 모드 에서 Q-흡착기(GE) 막상의 음이온 교환 크로마토그래피 및 칼럼 최종 연마 단계인 하이드록시 아파타이트 수지(CaPure-HA, Tosoh)상의 크로마토그래피를 수행하였다.
단백질 A 수지에서 B60-55-1 정제의 관찰된 단계 수율은 약 95 내지 98 %였다. Q-흡착기 크로마토그래피에 대한 관찰된 단계 수율은 약 93% 내지 95%였다. 단백질 A 컬럼에서 누출된 이량체, 올리고머 및 B60-55-1의 응집체, 미량의 잔류 DNA 및 단백질 A가 제거되는 B60-55-1의 최종 정제 단계는 좋은 바이러스 제거 단계로 사용되기도 하는 CaPure-HA의 연마 크로마토그래피이다. 최종 하이드록시 아파타이트 단계 수율은 약 77% 내지 85%였다. CaPure-HA의 B60-55-1 정제 크로마토그램이 도 14에 나타나 있다.
크기 배제 HPLC에 의해 평가된 바와 같이 CaPure-HA상에서 크로마토그래피 후 B60-55-1의 균질도는 99% 이상이었다. 분석 크기 배제 크로마토그램이 도 15에 나타나 있다.
환원 및 비환원 조건 하에서 SDS(SDS-PAGE)의 존재하에 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동은 또한 고순도의 B60-55-1 제조를 입증하였다. 쿠마시-염색된 겔의 이미지는 도 16에 도시되어있다.
정제된 B50-55-1의 LC-MS 트립신 펩티드 맵핑 분석은 정제된 항체의 중쇄에 C-말단 리신(lysine) 잔기가 누락되어 정제된 항체의 항원 입찰 특성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(실시예 11 참조).
B60-55-1 용으로 개발된 여러 가지 액체 제제는 스트레스 안정성 연구에서 시험하였다. 이러한 연구에서, 약 50 mg/mL의 농도에서 B60-55-1을 갖는 상이한 B60-55-1 제제의 멸균 샘플을 6주 동안 40 ℃에서 배양하였다. 배양하는 동안 7개의 시점에서 샘플을 모으고 분석 하였다 : 0, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주 및 6주. 단백질 농도(B60-55-1의 농도), 순도, 완전성, 탁도 및 삼투압을 측정하는 풀링된 샘플에 대해 후속 테스트를 수행하였다. 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정되었고, 단백질 동일성 및 완전성은 SDS-PAGE에 의해 평가되었고, 탁도는 A600에 의해 측정되었고, 삼투압은 보정된 삼투압 계에 의해 측정되었다. 응력 안정성 실험의 결과에 기초하여, 다음의 배합물이 후속 연구에 사용되었다: 275 mM 세린, 10 mM 히스티딘, pH 5.9. 이 제형에서, 40 ℃에서 5주 동안 배양한 후, B60-55-1의 순도는 95 %를 초과하였다. 추가로, 하기 제제는 실질적으로 유사한 단백질 안정성을 생성하였다 : 0.05 % 폴리소르베이트 80, 1% D- 만니톨, 120mM L-프롤린, 100mM L-세린, 10mM L-히스티딘-HCl, pH 5.8.
실시예 11: SPR에 의한 정제된 B60-55-1 및 hPD-L1 결합 동역학 연구.
연구의 목적은 SPR을 사용하여 B60-55-1의 결합 파라미터 대 인간 PD-L1과의 아테졸리주맙(atezolizumab) 상호 작용의 비교 평가였다. 여러 접근법을 사용하여 분석을 수행하였고, PD-L1-His 태그 및 PD-L1-Fc 융합 단백질의 2가지 버전의 인간 PD-L1을 사용하였다. 일련의 상이한 농도의 PD-L1 리간드가 해리 상수(Kd)를 계산하기 위해 사용되었다. 다음의 장미가 사용되었다: R75000DC, 플라즈몬 공명 분광계(SPR), Reichert Technologies, SPR 자동 링크 제어 및 TraceDrawer 평가 소프트웨어 패키지가 있는 기기 번호 00478-1115.. 센서 칩 SR7000 골드 센서 슬라이드, 500 kDa 카르복시메틸 덱스트란, Reichert, Inc, Prt 번호 : 13206066. 다음의 시약이 사용되었다: 1% D- 만니톨 중 B60-55-1 스톡 용액 32 mg/ml, pH 5.4의 10 mM Na-아세테이트; 20 mM 히스티딘, 14 mM 아세트산, 0.04% 폴리소르베이트 20, 4% 수크로오스, Lot 3109904, Genentech Inc; PD-L1-His 태그된, 인간 재조합, HEK293-유래, Phe19-Thr239, 접근 # Q9NZQ7, R&D systems, Cat # 9049-B7-100, Lot # DDIW0116081; PD-L1-Fc, 인간 IgG Fc 융합 단백질, 인간 재조합, HEK293-유래, Phe19-Thr239, 접근 # Q9NZQ7, R&D systems, Cat # 156-B7-100, Lot # DKL2116031; 인간 항체 포획 키트, GE Healthcare, Cat # BR- 1008-39, Lot # 10247121; 러닝 완충용액: 0.005% 트윈-20으로 보충된 1x PBS, 탈기체 및 0.2 마이크로 필터를 통해 여과.
결합 파라미터를 측정하기위한 표준 접근법 중 하나는 시험하는 항체의 후속 로딩 및 리간드 적용으로 칩 상에 항체를 포획하는 고정화이다. 그러나, PD-L1-Fc 융합 단백질에서 인간 IgG Fc 단편에 존재하기 때문에, 항-인간 항체에 의해 매개 된 포획은 이 리간드에 사용될 수 없었다. 따라서, PD-L1-Fc의 경우, 대안적인 접근법이 도 17에 예시되어있다. PD-L1-His 태그된 리간드 버전의 경우, 패널 A의 도 17에 예시된 항체 포획 접근법이 사용되었다. PD-L1-Fc 융합 단백질의 결합을 시험하기 위해, 2개의 대안적인 방법이 사용되었다: (1) 도 17, 패널 B에 예시된, PD-L1-Fc 자체의 직접 고정화, (2) 도 17, 패널 C에 예시된 B60-55-1 또는 아테졸리주맙의 시험 항체의 고정화.
모든 단백질은 동일한 화학 및 프로토콜을 사용하여 칩에 공유결합으로 부착되었다. 칩에 접합된 단백질은 단일클론 항-인간 IgG 항체, PD-L1-Fc 리간드, B60-55-1 및 아테졸리주맙을 포함한다. 항-인간 IgG 및 PD-L1-Fc는 접합 절차와 호환되는 완충용액에 사용되는 반면, B60-55-1 및 아테졸리주맙 제제는 결합 전에 0.1x PBS에 대해 광범위하게 투석되었다. SR7000 Gold Sensor Slide를 장비에 넣고 0.005% 트윈-20이 보충된 1x PBS 러닝 완충용액, 250 pl/분에서 5분간 프라이밍 한 다음 25 pl/분에서 안정화시켰다. 모든 단계는 25℃에서 수행되었다. 단백질 제제를 고정 완충용액(10 mM Na-아세테이트 pH 5.0)을 사용하여 25 pg/ml의 최종 농도로 희석하였다. 고정화 절차를 위한 시약은 다음과 같이 제조 하였다: 40 mg/ml에서 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드) 및 10 mg ml에서 NHS (N-히드록시숙신이미드)로 이루어진 EDC/NHS 활성화 시약, 물 에서 pH 8.5인 1 M 에탄올아민-HCl. 활성화: EDC/NHS 활성화 시약은 칩에 10 pl/분으로 8분 동안 주입 된 후 러닝 완충용액으로 5분 동안 세척되었다. 고정화: 최종 농도 25pg/ml의 항-인간 IgG를 10 pg/분으로 8분 동안 칩에 주입하였다. 비활성화: 칩 표면상의 미반응 활성 그룹을 10 pg/ 분으로 7분 동안 1M 에탄올아민-HCl의 주입에 의해 차단하였다. 항체 결합 후, 칩을 25 pl/분에서 15분 동안 러닝 완충용액으로 세척하였다.
PD-L1-His 결합된 리간드와 B60-55-1 및 아테졸리주맙의 상호 작용을 연구하기 위해, 항체 포획 접근법을 사용하였다. 항-인간 IgG를 칩에 공유결합으로 부착시키고, 도 17, 패널 A에 예시된 바와 같이 시험 항체를 포획하는데 사용하였다. 고정된-인간 IgG를 갖는 칩을 10 내지 15분 동안 25 pl/분의 유속으로 러닝 완충용액으로 평형화시켰다. 시험 항체, B60-55-1 또는 아테졸리주맙을 25 pl/분으로 2분 동안 로딩한 후, 칩을 3분 동안 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. PD-L1-His 리간드 2배 희석액을 100 nM 농도에서 시작되는 러닝 완충용액을 사용하여 제조하였다. 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3,125 및 1.56 nM의 7가지 농도가 사용되었다. 리간드를 3분 동안 25 pl/분으로 로딩하였다. 리간드 로딩 후, 실험의 해리 단계를 5분 동안 25 pl/분 유속으로 러닝 완충용액을 사용하여 수행하였다. 고정된 항-인간 IgG에 의해 결합된 단백질 복합체의 해리는 30초 동안 25 pl/분으로 칩을 통해 흐르는 3M MgCl2에 의해 수행되었다. 상이한 PD-L1-His 리간드 농도에서 포획 된 B60-55-1 또는 아테졸리주맙에 대한 일련의 센소그램을 도 18에 나타낸 바와 같이 생성하고 분석에 사용하였다. 시험 항체와의 PD-L1-His 상호 작용의 분석을 위해 1:1 결합 모델의 동역학적 평가를 사용하였다. 하기 Kd 값을 수득하였다 : B60-55-1 Kd = 40.2 nM; 아테졸리주맙 Kd = 0.67 nM.
연구 결과는 비교기 아테졸리주맙에 대한 단량체 PD-L1의 결합 친화도가 B60-55-1과 비교하여 각각 0.67nM 대 40.2nM보다 약 2-log 높았다는 것을 보여 주었다. B60-55-1-PD-L1-His 상호 작용의 낮은 친화도는 더 높은 해리율에 기인한 반면, B60-55-1 및 아테졸리주맙에 대한 결합상은 본질적으로도 도 18의 표에 나타난 바와 같이, 동일하였다.
PD-L1-Fc 리간드와 B60-55-1 및 이의 비교기 아테졸리주맙의 결합 특성을 조사하기 위해, PD-L1-Fc 융합 단백질을 도 17, 패널 B에 예시된 바와 같이 칩 상에 직접 고정시켰다. 칩의 효과적인 재생을 위한 조건을 식별하기 위해 정찰 실험이 수행되었다. 3M MgCl2는 고정화된 PD-L1-Fc로부터 결합된 항체(B60-55-1도 아테졸리주맙도 아님)를 분리하지 않는 것으로 밝혀졌다. pH 3.0, pH 2.5, pH 2.0 및 10 mM NaOH를 갖는 10 mM 글리신-HCl 완충용액을 포함하는 몇몇 재생 조건을 시험하였다. pH 3.0 및 pH 2.5 완충제는 결합된 항체를 효과적으로 제거하지 않는 반면, NaOH 처리는 리간드를 비활성화시켜 결합 손실을 초래하는 것으로 확인되었다. 이어서, 글리신-HCl, pH 2.0이 이들 일련의 실험에 적합하다고 결론내렸다.
PD-L1-Fc 리간드는 이 실시예에서 전술한 바와 같이 칩 상에 고정되었고, 일련의 농도의 B60-55-1 또는 아테졸리주맙이 적용되었다. B60-55-1 또는 아테졸리주맙의 2배 희석액을 100 nM 농도에서 시작하는 러닝 완충용액을 사용하여 제조하였다. 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3,125 및 1.56 nM의 7가지 농도가 사용되었다. 리간드를 3분 동안 25 pl/분으로 로딩하였다. 리간드 로딩 후, 실험 완충액을 5분 동안 25 pl/분 유속으로 러닝 완충용액을 사용하여 수행하였다. 상이한 농도의 B60-55-1 또는 아테졸리주맙에서 고정화된 PD-L1-Fc에 대한 일련의 센소그램이 생성되었고 (도 19에 도시됨) 분석에 사용되었다. 1:1 결합 모델의 동역학적 평가를 시험 항체와의 고정화된 PD-L1-Fc 상호 작용의 분석에 사용하였다. 하기 Kd 값을 수득하였다: B60-55-1 Kd = 0.66 nM; 아테졸리주맙 Kd = 0.26 nM.
연구 결과는 고정된 이량체 PD-L1-Fc의 결합 친화도가 도 19의 표에 나타낸 바와 같이 각각 B60-55-1 및 비교기 아테졸리주맙, 0.6 nM 대 0.26 nM에 대해 유사 함을 보여 주었다. 두 항체의 친화도는 이량체 리간드와의 상호 작용을 반영하며, 이는 단량체 His-태그 버전의 리간드와의 상호 작용과 분명히 상이하다.
시험 항체의 결합 특성을 추가로 평가하기 위해, 도 17, 패널 C에 도시된 바와 같이 B60-55-1 또는 아테졸리주맙을 칩상에서 공유결합으로 가교 결합시켰다. 이 접근법은 PD-L1 리간드의 두 가지 버전의 His-태그 및 Fc-융합 단백질의 직접적인 비교를 가능하게 한다. 이 결합 시스템의 재생 조건을 재평가하고, pH 2.0 10mM 글리신-HCl이 충분한 재생을 제공하는 것으로 밝혀졌다. B60-55-1 및 아테졸리주맙을 이 실시예에서 전술한 바와 같이 개별 센서 칩 상에 고정시키고, 다양한 농도의 PD-L1-His 또는 PD-L1-Fc 융합 단백질을 고정화 항체에 순차적으로 적용하였다.
PD-L1-His 또는 PD-L1-Fc의 2배 희석액을 100 nM 농도에서 시작하는 러닝 완충용액을 사용하여 제조하였다. 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3,125 및 1.56 nM의 7 가지 농도가 사용되었다. 리간드를 3분 동안 25 pl/분으로 로딩하였다. 리간드 로딩 후, 실험의 해리 단계를 5분 동안 25 pl/분 유속으로 러닝 완충용액을 사용하여 수행하였다. 상이한 농도의 PD-L1-His 또는 PD-L1-Fc 융합 단백질에서 고정화된 B60-55-1 또는 아테졸리주맙에 대한 일련의 센소그램이 도 20 및 21에 도시된 바와 같이 생성되었고, 분석에 사용되었다. 1:1 결합 모델의 동역학적 평가를 두 버전의 리간드, PD-L1-His 및 PD-L1-Fc와의 고정된 B60-55-1 상호 작용의 분석에 사용하였다. B60-55-1에 대해 하기 Kd 값을 얻었다 : 단량체 PD-L1-His 리간드 Kd = 14.3 nM; 이량체 PD-L1-Fc 리간드의 경우 Kd = 0.45 nM; 아테졸리주맙: 단량체 PD-L1-His 리간드 Kd = 0.62 nM, 이량체 PD-L1-Fc 리간드 Kd = 0.19 nM.
따라서, 단량체 PD-L1-His 및 이량체 PD-L1-Fc와 B60-55-1의 결합 친화도 및 그의 비교기 아테졸리주맙의 비교 친화도는 PD-L1-His에 대하여 B60-55-1이 PD-L1-Fc에 대해 약 2-log 높은 친화도를 나타낸다는 것을 밝혀냈다. 이에 반해 아테졸리주맙은 PD-L1-His 및 PD-L1-Fc에 대해 유사한 친화도를 갖는다. 후자는 아테졸리주맙이 리간드의 단량체 및 이량체 형태를 구별할 수 없음을 나타낸다.
B60-55-1 및 아테졸리주맙의 결합 특성의 평가는 예상치 못하게 밝혀졌으며, 현재 임상 용도로 사용되는 비교기 항체와 대조적으로, B60-55-1은 동족 표적 PD-L1의 이량체 및 단량체 형태를 실질적으로 구별할 수 있다.
실시예 12: B60-55-1 항체 및 아테졸리주맙의 이펙터 기능의 비교 가능성.
이 실시예는 비교기 항체 아테졸리주맙과 B60-55-1 항체의 이펙터 기능의 추가 분석 및 비교를 개시한다. 본 개시 내용은 Fc 감마 수용체에 대한 결합의 평가를 포함한다 : CD16a, CD32a 및 CD64; PD-L1 양성 세포를 사용한 항체-의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC) 활성; 보체-유도된 세포 독성(CDC) 활성, C1q 결합 및 FcRn 결합 평가.
항원에 결합하는 그들의 역할에 더하여, 항체는 항체의 Fc 영역과의 상호 작용을 통해 Fc 감마 수용체와의 상호 작용을 통해 면역 반응을 조절할 수 있다. 자연 살해(NK) 및 다른 골수성 세포에 존재하는 수용체와의 이러한 상호 작용은 이들 세포가 IFNY 및 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)을 함유하는 세포 독성 과립과 같은 사이토카인을 방출하도록 유도하고, 이는 ADCC에서 정점에 이른다.
수행된 연구는 B60-55-1 항체가 CD16a 수용체에 대한 검출 가능한 결합을 나타내지 않는 반면, CD16a에 대한 아테졸리주맙 Kd는 1.6E-5M이고; B60-55-1은 CD32a 수용체에 대한 검출 가능한 결합을 나타내지 않는 반면, CD32a에 대한 아테졸리주맙 Kd는 4.1E-5M이고; B60-55-1은 다른 IgG1 항체와 비교하여 CD64 수용체에 10배 낮은 결합을 갖지만, 아테졸리주맙과 비교하여 CD64에 유사한 결합을 갖는다.
항체-의존적 세포-매개 세포 독성(ADCC)은 바이러스-감염 또는 다른 질병 세포가 자연 살해 세포와 같은 세포-매개 면역 시스템의 구성 요소에 의해 파괴되도록 표적화되는 항체의 작용 메카니즘이다. Promega(Cat # G7014)의 ADDC 리포터 Bioassay Core Kit는 ADCC를 정량화 하기 위한 생물 발광 리포터 분석법이다. 분석은 표적 수용체를 발현하는 세포의 표면에 결합된 시험 항체의 Fc 단편에 결합하는 세포 표면상에서 FcYRIIIa 수용체를 발현하는 효과기 세포를 조합한다. 생물학상으로 표적 세포를 이펙터 세포에 가교시키는 것은 이펙터 세포에서 NFAT 경로를 통해 유전자 전사를 활성화시켜 반딧불이 루시퍼라제의 발현을 유도하며, 이는 발광에 의해 정량화될 수있다. B60-55-1은 CD16a 및 CD32a에 대한 결합을 나타내지 않았기 때문에, 분자는 ADCC 활성을 나타내는 것으로 예상되지 않았다. PD-L1 양성 세포주 A2058을 사용하여 분석을 수행하였다. B60-55-1 및 아테졸리주맙의 ADCC 활성을 강력한 ADCC 활성을 나타내는 것으로 알려진 항체인 리툭시맙의 ADCC와 비교 하였다.
이 조작된 IgG1 항체에 대해 예상된 바와 같이, B60-55-1은 리툭시맙과 비교하여 실질적인 ADCC 활성을 나타내지 않았으며(도 22의 대조군), 아테졸리주맙에 대한 ADCC 활성을 나타내었다.
B60-55-1 및 아테졸리주맙은 PD-L1을 표적으로하는 항체이며, C1q에 대한 두 항체의 결합을 비교하였다. 항원 결합 2-위치 ELISA를 사용하여 두 항-PD-L1 항체가 C1q와 상호 작용하는 친화도를 검사하였다. 이 분석에서, 두 항체 모두를 25, 20, 15, 10, 8, 4, 2, 1, 0.5 및 0 pg/mL에서 4℃에서 밤새 플레이트 상에 코팅하였다. 이어서 플레이트를 세척하고 SuperBlock 용액으로 차단한 후 결합 완충제 2 pg/mL에서 C1q (Sigma, Cat # C1740)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고, 항-C1q-HRP 접합체(Thermo, Cat. # PA1-84324)를 결합 완충액(100 pL/웰)에서 1:250 희석으로 플레이트에 실온에서 1시간 동안 첨가 하였다. 비 결합 HRP-접합된 항체를 세척 완충제로 세척하여 제거하였다. HRP 활성은 발색 기질 TMB를 사용하여 검출되었다. 황산을 첨가하여 색 반응을 정지시키고, 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 3-파라미터 곡선 맞춤 후, EC50을 샘플 및 참조 표준에 대해 계산하였다. 보고 가능한 값은 샘플의 EC50에 대한 기준 표준 EC50의 % EC50이므로, 높은 %는 샘플에 대한 높은 효능을 의미한다. 이들 실험의 목적은 ELISA 포맷을 사용하여 아테졸리주맙 및 B60-55-1의 C1q에의 결합을 결정하는 것이었다.
ELISA 분석 결과는 도 23에 도시되어있다. C1q에 대한 아테졸리주맙 결합의 EC-50은 14.9 pg/mL 인 반면, B60-55-1의 C1q에 대한 EC-50의 결합은 6.9 pg/mL 인 것으로 결정되었다. 따라서 이러한 결합 특성은 비슷하다.
또한, PD-L1 양성 세포(A2058 세포)에서 CDC를 유도하는 능력을 B60-55-1과 아테졸리주맙간에 비교하였다. 이 분석 세포 용해에서, '세포 유령'(용해된 세포)을 현미경으로 관찰하고 1시간 동안 세포에 첨가된 발광성 CytoTox-Glo 시약을 통해 정량화 할 수 있다.
두 제품 모두 CDC 활성이 매우 낮았다. 아테졸리주맙의 경우 EC50은 0.09 pg/ml 인 반면, B60-55-1의 EC50은 0.05 pg/ml이었다.
IgG 반감기는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 의존하며, 이는 다른 기능들 중에서 IgG를 이화 작용으로부터 보호합니다. FcRn은 산성 pH에서 IgG의 Fc 도메인에 결합하여 엔도사이토시스 IgG가 리소좀 구획에서 분해되지 않고 혈류로 방출되도록 한다. B60-55-1 및 아테졸리주맙을 CHO 세포에 의해 안정적으로 발현되는 FcRn 수용체에 대한 결합에 대해 비교하였다.
이 연구는 B60-55-1이 4.7e-7 M의 Kd에서 FcRn에 결합하는데, 이는 항체에 대해 전형적인 반면, 아테졸리주맙은 1e-7 M의 Kd와 함께 FcRn에 대해 약간 더 높은 친화도를 나타냈다.
실시예 13: 혼합 림프구 반응에 의한 B60-55-1 항체, 아테졸리주맙 및 펨브 롤리주맙 효능의 비교 평가.
혼합 림프구 반응(MLR) 분석을 수행하여 T 세포 활성화에 대한 B60-55-1 및 아테졸리주맙의 효능을 평가 하였다. T 세포 활성화는 T 세포에 의해 분비된 인터루킨 2(IL-2)의 농도에 의해 측정되었다. 수지상 세포(DC) 및 CD4+ T 세포를 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리하였다. MLR에서 T 세포 활성화에 대한 펨브 롤리주맙의 효능을 분석 성능을 모니터링하기위한 내부 대조군으로 사용하였다. 절반 최대 유효 농도(EC50) 값을 그래프 패드 프리즘에 의한 Sigmoidal 용량-반응 비선형 회귀 적합으로 분석하였다.
시약 및 재료
RPMI 1640: Gibco,Invitrogen (Cat#22400); FBS, Gibco, (Cat#10099); 페니실린-스트렙토마이신(P/S): Gibco, Invitrogen (Cat #10378); 인산완충생리식염수(PBS): Gibco, Invitrogen (Cat #10010-023); 수지상세포에 대한 QC 항체: 항-CD1a[HI149](FITC), Abcam (ab18231), 항-CD83 [HB15e] (FITC), Abcam (ab134491), 항-CD86 [BU63] (FITC), Abcam (ab77276), 항-HLA DR [GRB1] (FITC), Abcam (ab91335); CD4+ T 세포 분리 키트: Miltenyi Biotec, (Cat # 130-096-533); 범 단핵구 분리 키트(Pan Monocyte Isolation Kit): Miltenyi Biotec, (Cat # 130-096-537).
세포주
수지상세포, 갓 분리된 인간 혈액으로부터 준비됨(20명 이상의 건강한 기증자); CD4+ T 세포,갓 분리된 인간 혈액으로부터 준비됨(20명 이상의 건강한 기증자)
분석 키트
인간 IL2 HTRF 키트 (Cisbio, Cat# 64IL2PEB).
검출 장비
PHERAstarPlus, BMG Labtech.
세포 준비
CD4+ T 세포는 CD4+ T 세포 분리 키트에 의해 정제되었다. PBMC는 Lymphoprep을 사용하여 밀도 구배 원심 분리로 제조되었으며, 세포는 GenScript의 프로토콜에 따라 37℃/ 5% CO2의 완전한 배지에서 유지되었다.
수지상세포는 Pan Monocyte Isolation Kit에 의해 정제되었다. PBMC는 Lymphoprep을 사용하여 밀도 구배 원심 분리로 제조되었으며, 세포는 GenScript의 프로토콜에 따라 37℃/ 5% CO2의 완전한 배지에서 유지되었다. 수지상 세포의 순도는 FACS(CD1a, CD83, CD86 및 HLA-DR)에 의해 그들의 표면 마커에 의해 확인되었다.
항체 준비
시료를 건식 배송 업체로 운송하고 테스트 전에 4℃에서 보관했다. 시료를 RPMI 1640으로 희석하고 시험에 적용하였다.
항체 검사를 위한 혼합 림프구 반응
- 1000 rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 이펙터 세포(CD4 + T 세포)를 수득;
- 분석 완충용액으로 시험 시료의 연속 희석;
- 이펙터 세포 스톡을 96-웰 분석 플레이트에 씨딩하고 테스트 시료를 첨가;
- 1000 rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 표적 세포(수지상세포)를 수득;
- 반응을 시작하고 가볍게 혼합하기 위해 표적 세포를 첨가;
- 플레이트를 37℃/ 5% CO2 배양기에서 3일 동안 배양;
- 인간 IL-2 시험의 수행 및 플레이트 판독;
- B60-55-1 및 아테졸리주맙에 대한 농도 범위의 시험: 300 nM에서 시작, 3-폴드 희석, 10 포인트씩 3 회;
- 펨프롤리주맙에 대한 농도 범위의 시험: 10 pg/ml에서 시작, 5-폴드 희석, 6 포인트씩 3 회.
혼합 림프구 반응(MLR) 분석
MLR 분석의 결과는 도 24에 도시되어 있으며, B60-55-1 및 아테졸리주맙은 상이한 IL-2 분비를 갖는 MLR에서 T 세포를 활성화시킬 수 있었다. 대조군으로 사용 된 펨브롤리주맙에 대한 T 세포 활성화 데이터는 과거 데이터와 일치하였다. MLR 데이터의 분석은 표 2에 제시되어 있다. MLR 분석에서 B60-55-1 및 아테졸리 주맙에 대한 EC50 값은 0.4665 nM 및 21.53 nM이었다. 따라서 B60-55-1은 MLR 분석에서 T 세포를 실질적으로 더 높은 효능으로 활성화시킨다.
MLR에 대한 적합치 요약
펨브롤리주맙 B60-55-1 펨브롤리주맙 아테졸리주맙
Bottom 60.62 49.49 68.18 55.2
Top 164.2 94.34 161.3 86.13
LogEC50 -0.8871 -0.3311 -0.7364 1.333
HilSlope 0.7036 1.097 0.9005 1.356
EC50 0.1297 pg/ml 0.4665 nM 0.1835 pg/ml 21.53 nM
EC50(nM) 0.8705 0.4665 1.2315 21.53
실시예 14: 인간화 PD-L1 마우스에서 피하 MC38-hPD-L1 뮤린 대장 암종 모델의 치료에서 B60-55-1 효능의 평가
이 연구의 목적은 인간화 된 PD-L1 마우스에 생착된 피하 MC38-hPD-L1 뮤린 대장 암종의 치료에서 B60-55-1 및 그의 비교기 아테졸리주맙 둘 다를 10 mg/kg으로 투여한 생체 내 효능을 시험하는 것이다.
시약 및 장비
Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM): Cellgro, Catalog No. 10-013-CVR, 4℃에서 저장. 소태아혈청(FBS): Excell, Catalog No.FSP500, 20℃에서 저장. 인산완충생리식염수(PBS): Gibco, Catalog No. 20012027, 4℃에서 저장. Balance: Shanghai Shun Yu Heng Ping Science and Equipment Co. Ltd, Catalog No. MP5002. Caliper: Hexagon Metrolog, Catalog No.00534220.
시험 및 대조군 품목
항체 B50-55-1을 PBS에 50 mg/ml 농도로 저장하고; 음성 대조군 IVIG: Guang Dong Shuang Lin BIO￢Pharmacy Co. Ltd, 로트 번호 20160407, 50 mg/ml 농도로 PBS에 저장됨; 양성 대조군 항체인 아테졸리주맙: Genentech/Roche, Lot No 3109904, 60 mg/ml 농도로 빙초산(16.5 mg), L-히스티딘(62 mg), 폴리소르베이트 20(8 mg) 및 수크로오스(821.6 mg)를 함유하는 완충용액에 저장하였다.
투여 용액 준비
시험 및 대조군 품목을 투여 전에 PBS로 희석하고, 2 내지 8℃에서 일시적으로 저장하고, 4시간 이내에 실온에서 사용하였다. 희석되지 않은 나머지 시험 및 대조 품목을 2 내지 8℃에서 보관했다.
동물
북경 바이오 사이토젠(Biocytotogen Co. Ltd.)에서 40마리의 수컷 B-hPD-L1 인간화 마우스 C57BL/6을 공급하였다(품질 인증 번호 : 201716816).
동물 사육 관리
동물은 개별 환기 케이지(IVC) 당 5마리의 동물과 함께 베이징 바이오 사이토젠(Beijing Biocytogen Co., Ltd.)의 동물 센터에서 특정 병원체가 없는 장벽에 수용되었다. 도착 후 3일 내지 1주일 동안 동물을 순응시켰다.
온도는 20 내지 26℃로 유지되었고 습도는 40 내지 70%로 유지되었다. 케이지는 폴리카보네이트로 만들어졌으며, 크기는 300mm*180mm*150mm 이다. 침구 재료는 가압 멸균된 부드러운 목재로 일주일에 한 번 교체되었다. 각 케이지의 식별 레이블에는 동물 수, 성별, 변형률, 접수 날짜, 치료, 그룹 번호 및 치료 시작 날짜와 같은 정보가 포함되어 있다. 동물은 전체 연구 기간 동안 고압 멸균된 건조 과립 식품 및 물에 자유롭게 접근 할 수 있었다. 음식은 SPF 등급이며 Beijing Keao Xieli Feed Co., Ltd.에서 구입했다. 물은 한외 여과에 의해 정제되었다. 귀 코딩에 의해 동물을 표시하였다.
실험 방법 및 절차
모 MC38 뮤린 대장 암종 세포주는 Shunran Shanghai Biological Technology Co.Ltd에서 구입하였다. MC38-hPD-L1 세포주는 Biocytogen Co, Ltd에 의해 마우스 PD-L1을 인간 PD-L1로 대체함으로써 구축되었다. 10%의 열로 비활성화 된 FBS가 보충된 DMEM에서 단일층 배양으로 세포를 유지하고 매주 2회 계대 배양하였다. 지수 성장기에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
각각의 마우스는 종양 발달을 위해 우측 전방 측면에 0.1 mL PBS가있는 MC38-hPD-L1 종양 세포(5×105)를 피하 주사하였다. 평균 종양 크기가 대략 100mm3에 도달했을 때 종양을 갖는 동물을 3 개의 연구 그룹에 무작위로 등록시켰다. 각 그룹은 8마리의 마우스로 구성되었다. 시험 및 대조군 물품을 하기에 나타낸 바와 같이 예정된 요법에 따라 종양 보유 마우스에 투여하였다.
투약 요법
그룹 치료 동물의 숫자 투여량(mg/kg) Working 농도
(mg/mL)		 투약 경로 스케쥴
1 IVIG 8 10 1 i.p. BIW*8
2 양성 대조군 8 10 1 i.p. BIW*8
3 B60-55-1 8 10 1 i.p. BIW*8
참고: 1) 투여량은 체중에 기초하여 투여되었다(10 pL/g).
2) i.p. 는 복강 내를 지칭한다.
3) BIW*8은 1주일에 2회 및 8회 용량의 투여 빈도를 지칭한다.
마우스의 체중 감소가 10%를 초과하면, 치료 스케줄을 조정하고 그에 따라 투여량을 줄였으며, 동물을 연구에서 중단시켰다.
투여를 완료한 후, 종양 부피 및 체중의 모니터링을 1주일에 2회 최대 2주 동안 계속하였다.
동물을 CO2로 안락사시킨 후, 안락사를 확인하기 위해 골수 파괴를 수행하였다.
종양 측정 지수
캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 2차원으로 매주 2회 측정하고, 다음 식을 사용하여 부피를 mm3으로 나타내었다 : V = 0.5 a * b2 여기서, a 및 b는 각각 종양의 긴 부분 및 짧은 부분의 직경이었다.
동물을 종양 접종 및 동물 그룹화 전에, 이어서 실험 동안 일주일에 두 번, 마지막으로 동물이 실험 종료 시점에 안락사하기 전에 무게를 측정하였다. 우연히 사망하거나 동물이 죽기 직전에 동물의 무게를 측정했다.
실험의 전체 기간 동안, 동물은 종양 궤양의 출현, 동물의 정신 상태, 음식 및 물 소비의 시각적 평가 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 그들의 행동 및 상태에 대해 하루에 두 번(아침 및 오후) 점검되었다. .
연구 종료 시점에 종양을 수집하고 무게를 재었다. 안락사 동물 및 종양을 수집하여 사진을 찍었고, 나중에 보고서에 첨부했다.
약물 평가 지수
상대적 종양 성장 억제 (TGI %) : TGI % = (1-T / C) × 100 %. T 및 C는 주어진 날에 각각 처리된 그룹 및 비히클 그룹의 평균 상대 종양 부피 (RTV)를 지칭한다. T / C %는 상대 종양 증식률 ^을 나타내고, 방정식은 T / C % = TRTV / CRTV × 100 % (TRTV : 처리된 그룹의 평균 RTV; CRTV : 비히클 그룹의 평균 RTV; RTV = Vt / V0, V0은 그룹화시 종양 부피를 나타내고, Vt는 치료 후 각각의 지시된 시점에서 측정된 종양 부피를 나타낸다.)
종양 중량의 억제율 (IRTW %) : 종점에서 동물의 종양 중량을 측정하고, 각 그룹의 평균 종양 중량을 결정하고, IRTW %를 하기 화학식으로 계산 하였다 :
IRTW % = (W control group - W treatment group) / W control group ×100.
W는 평균 종양 무게를 나타낸다.
Student's t-테스트/양방향 ANOVA를 사용하여 데이터를 분석하였고, P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 통계적 분석 및 생물학적 관찰이 모두 고려되었다.
결과
전체 실험 동안 명백한 임상 징후는 관찰되지 않았다. 연구 동안 대부분의 동물의 체중이 점차 증가하였다. 시간에 따른 평균 체중 및 평균 체중 변화는 도 25 및 표 3에 제시되어 있다. B60-55-1 그룹의 동물은 대조군의 동물과 비교하여 체중에 대한 통계적 차이를 나타내지 않았다(P> 0.05).
5 개의 뮤린 대장암 MC38-hPD-L1 종양 이식편을 갖는 인간화된 B-hPD-L1 마우스에서의 체중 변화.
그룹 처리 동물의 숫자 그룹핑 전 체중
(g)a 		그룹핑 23일 후 체중(g)a 체중 변화(g)
1 IVIG 10 22.7±0.5 27.2±1.0 - +4.5
2 양성 대조군 10 22.9±0.7 28.3±1.2 0.8 +5.4
3 B60-55-1 10 23.3±0.7 28.2±1.1 0.9 +4.9
참고:
a: 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)
b: 그룹화 후 23일째에 처리 그룹 대 비히클 그룹의 평균 10 체중에 대한 독립적인 샘플 T-테스트를 통한 통계 분석.
모든 마우스를 전체 실험 동안 종양 성장에 대해 면밀히 모니터링하였고, 종양 크기를 측정하고 매주 15회 두 번 기록 하였다. 종양 성장 억제 (TGI %)는 최상의 치료 시점(그룹화 후 23 일)에서 계산되고 분석되었다. 통계 분석 결과는 표 4 및 5에 제시되어있다. 3개의 그룹에서 개별 마우스 종양 성장을 도 26 및 도 27에 플롯팅 하였다. 감소된 종양 성장 속도는 모두 아테졸리주맙 및 B60-55-1 투여 후 관찰되었다.
아테졸리주맙 및 B60-55-1 군에서 뚜렷한 종양 퇴행이 2/8 및 1/8 마우스에서 개별적으로 관찰되었다.
그룹화 후 23일 후에 B60-55-1의 종양 성장 억제
그룹 동물 숫자 종양 부피(mm 3 ) a TGITV
(%)		 Pb
그룹핑 전 그룹핑 후 23일
G1:IVIG 10 119±4 2078±459 -- --
G2:양성 대조군 10 119±4 1046±336 52.7 0.10
G3:B60-55-1 10 120±5 1022±552 53.9 0.17
참고:
a: 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)
b: 그룹화 후 23 일째에 처리 그룹 대 비히클 그룹의 평균 종양 부피에 대한 풀링된 표준 편차 10 t-테스트를 통한 통계 분석.
B60-55-1의 다양한 그룹 사이의 종양 부피의 통계적 분석
그룹 3
2: 양성 대조군 0.970
3: B60-55-1- -
참고:
그룹화 후 23일에 상대 종양 부피에 대한 풀링된 표준 편차 t-테스트를 통한 통계 분석.
모든 종양을 희생된 마우스로부터 절개하고, 그룹화 후 29일에 사진을 찍고 무게를 재었다. 종양 중량의 통계적 분석 결과는 표 6 및 도 28에 제시되어있다. 투여 10회 완료 후에 종양이 여전히 성장함에 따라, 종양 성장 억제율 (TGITV %)은 23일에서의 것과 비교하여 손상되었다. 연구 종료 시점(23일)의 그룹은 비히클 그룹과 유의한 차이가 없었다 (P> 0.05).
투여를 시작한지 29일 후 B60-55-1의 종양 무게 억제
그룹 동물 숫자 종양 무게
(g)a 		종양 무게 억제 IRTW% Pb
G1: IVIG 10 4.653±1.009 -- --
G2: 양성 대조군 10 2.596±0.860 44.2 0.193
G3: B60-55-1 10 3.173±1.570 31.8 0.447
참고:
a: 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)
b: 그룹화 후 29일에 평균 종양 중량에 대한 독립적인 샘플 T-테스트를 통한 통계 분석
이 연구에서 대부분의 동물의 체중이 점차 증가했다. B60-55-1 군의 동물은 대조군과 비교하여 체중에 대한 통계적 차이를 나타내지 않았고(P> 0.05), 이는 B60-55-1이 현재 용량에서 안전함을 나타낸다. 아테졸리주맙 및 B60-55-1 투여 후 감소된 종양 성장률이 관찰되었다. 최상의 종양 성장 억제 지점(그룹화 후 23 일)에서, 비히클 대조군의 평균 종양 부피는 2078±459 mm3 인 반면, 양성 대조군 처리 된 군에서는 평균 종양 부피는 1046±336 mm3이며, B60-55-1 치료군에서 평균 종양부피는 1022±552 mm3이었다. 종양 성장 억제 TGITV %는 각각 52.7% 및 53.9%였다.
이 연구의 끝(그룹화 후 29 일)에서 아테졸리주맙 및 B60-55-1 군에서 뚜렷한 종양 퇴행이 2/8 및 1/8 마우스에서 관찰되었고, 종양 중량 억제 IRTW %는 ㄱ각각 44.2% 및 31.8 % 였다. 대조군과 비교하여, B60-55-1 군에서 동물의 종양 부피는 항 종양 활성을 갖지만 유의한 차이는 없었다.
따라서, 이 연구에서 B60-55-1은 동물 체중에 부정적인 영향을 미치거나 비정상적인 임상적 관찰을 유도하지 않으면서 10 mg/kg의 용량 수준에서 아테졸리주맙에 필적하는 항 종양 효능을 나타냈다.
실시예 15: 인간화 NSG ™ 마우스를 사용하여 유방암에 대한 이종 이식편 모델에서 B60-55-1의 평가.
피부암을 제외한 유방암은 여성에게 가장 흔한 형태의 암으로, 70 세에 이를 때까지 여성의 약 7 %에 영향을 미친다(CDC). 미국 암 협회의 추정에 따르면, 2017 년 미국에서 252,710 건이 새로 진단 되고 40,610 명이 사망할 것으로 예상된다.
2006-2012 년의 5년 상대 생존율은 모든 단계에서 약 90 %였다. 삼중 음성 유방암은 에스트로겐 및 프로게스테론 수용체 및 HER2 단백질의 발현에 임상적으로 음성인 독특하고 공격적인 유방암의 하위 유형이다. 현재 이러한 형태의 유방암을 다루기 위한 표적 요법은 없다. 일차 인간 암의 마우스 모델을 개발하는 것은 인간 질병을 재현하는 마우스에서 임상적으로 관련된 암 모델을 나타내기 때문에 인간 질병과 관련이 있다. 잭슨 연구소는 NSG ™-SGM3과 같은 NSG ™ 유래 strain 뿐만 아니라 면역력이 부족한 NSG ™ 마우스 균주에서 환자 유래 이종 이식편(PDX) 유방암 모델과 세포주 이종 이식편 모델을 확립했다. NSG™(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ) 마우스는 인간 세포와 조직을 효율적으로 이식 할 수 있는 능력을 위해 개발되었다. 면역계의 선천적 결핍으로 인해 다른 마우스 균주보다 생착 효율이 현저히 개선된다. 인간화된 NSG™ (hu-CD34 NSG™) 마우스는 인간 CD34+를주사한 NSG™ 마우스이며, 마우스와 잘 교차반응하지 않는다. 또한, 조혈 줄기 세포는 생체 내에서 인간 면역 기능을 연구하는 중요한 도구가 되었다. 이들 마우스는 신규한 면역 요법, 특히 인간에 특이적인 것의 적용을 위한 강력한 전임상 플랫폼을 제공하며, 이들 모델은 질병의 게놈 프로파일링 및/또는 전임상 약물 개발에 사용된다. 이 연구에서, 인간화 NSG ™ 마우스에 확립된 유방암에 대한 MDA-MB-231 세포주 이종 이식편 모델을 사용하여 신규 항체를 평가하였다.
쥐 및 사육
생착 16주 후 말초 혈액에서 > 25% 인간 CD45+ 세포를 갖는 인간 CD34+ 세포로 생착된 암컷 hu-CD34 NSG ™ 마우스를 이 연구에 사용하였다. 2개의 공여자로부터 CD34+ 세포로 이식된 hu-CD34 NSG ™ 마우스의 코호트를 사용하였다. 마우스를 케이지 당 최대 5 마리의 마우스 밀도로 HEPA 여과된 공기와 함께 개별적으로 환기 된 폴리설폰(polysulfone) 케이지에 넣었다. 동물실은 12시간의 명암주기(오전 6 시부터 오후 6시까지)를 제어하면서 인공 형광 조명으로 완전히 조명되었다. 동물 실의 정상 온도 및 상대 습도 범위는 각각 22 내지 26℃ 및 30 내지 70%이다. 동물 실은 시간당 최대 15개의 공기 교환을 갖도록 설정되었다. 여과된 수돗물은 pH 2.5 내지 3.0으로 산성화되었고, 표준 설치류 음식은 임의로 제공되었다.
2개의 독립적인 공여자로부터 38마리의 hu-CD34 NSG ™ 마우스를 마트리겔과의 1:1로 혼합물로 5×106 MDA-MB-231 세포를 갖는 유선 지방 패드에 이식하였다. 체중 및 임상 관찰은 매주 1X-2X로 기록되었다.
방법 및 기록
종양이 촉진될 수 있게 되면 매주 2X 종양 부피를 측정하기 위해 이식 및 디지털 캘리퍼 측정을 사용하였다. 종양 부피가 ~62-98 mm3에 도달할 때 마우스 부피를 기준으로 마우스를 무작위화하고, 0일에 시작하여 표 7에 따라 투여하였다. 체중, 임상 관찰 및 디지털 캘리퍼 측정은 용량 개시 후 2X 주마다 기록되었다. 연구 종료 전에 ^2의 신체 상태 점수, >20%의 체중 감소 또는 >2000mm3의 종양 부피에 도달한 동물을 안락사시켰다. 궤양이 있는 종양을 가진 동물도 연구 종료 전에 안락사시켰다. 연구 제 41일에 모든 나머지 동물을 CO2 질식에 의해 안락사시켰다.
실험 설계
그룹 N 화합물 투여량(mg/kg) 투여 경로** 투여 빈도***
1 10 비히클* N/A (부피 동량) IV 주 당 2회 6주간
2 10 펨브롤리주맙 10 (Day 0)
5 (그 이후)		 IV 주 당 2회 6주간
3 11 B60-55-1 25 IV 주 당 2회 6주간
* B60-55-1 제형화에 사용된 것과 동일한 비히클
** 팽창으로 인해 꼬리 정맥을 통한 IV 주사가 불가능할 때 투여 경로를 IP로 전환하였다. 그룹 3으로부터의 하나의 동물은 35일에 IP를 투여 받았고, 그룹 15로부터의 하나의 동물은 그룹을 38일에 IP로 투여 받았다.
*** 동물에게 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28, 31, 35 및 38 일에 투여 하였다.
결과
연구 결과는 도 29 및 도 30에 요약되어있다. 결과는 항체 B60-55-1이 연구에 사용된 유방암에 대한 이종 이식편 5 모델에서 펨브롤리주맙의 효능과 유사한 효능을 나타낸다는 것을 나타낸다.
Tecentriq는 Genentech USA, Inc.의 등록 상표이다.
본 발명의 특정 실시예가 여기에 상세하게 설명되었지만, 당업자는 이미 공개된 지침 및 교시에 기초하여 보다 상세한 양태의 다양한 수정 및 대체를 수행할 수 있다는 것을 이해할 것이다; 상기 변경은 모두 본 발명의 범위 내에 속한다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 청구 범위 및 임의의 동등한 문서에 의해 주어진다.
<110> R-PHARM OVERSEAS, INC. <120> ANTI-PD-L1 ANTIBODY AND USE THEREOF <130> 2019FPI-09-011/RU <150> PCT/US2018/028206 <151> 2018-04-18 <160> 87 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 1 Thr Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 2 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Lys Tyr Ala Gln Arg Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 3 Ser Arg Gly Phe Ser Tyr Gly Trp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ile His Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 5 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 6 Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Arg Thr 1 5 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180 atgattatgc agtatctgtg aaaagtcgaa tcagcatcaa cccagacaca tccaagaacc 240 agttctccct gcagtgaact ctgtgactcc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcaag 300 aagccaggga cgatattttg tcaactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt 360 caccgtctcc tca 373 <210> 61 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 61 gaaattgtaa tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgta gggccagtca gagtgttggc atacacttag cctggtacca acagaaactt 120 ggccaggtcc caggctcctc atctatggtg catccagtag ggccactggc atcccagaca 180 ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcactctcac catcagcaga ctggagcctg 240 aagattttgc agtgattact gtcagcagta tggttcttta cctcggacgt tcggccaagg 300 gaccaaggtg gaaat 315 <210> 62 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 62 gacatccggt tgacccagtc tccatcttcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagaatcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agttatttaa attggtatca acagaaacca 120 gggaaagccc taagctcctg gtctatggtg catccagttt gcaaagtggg gtcccatcaa 180 ggttcagtgg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg 240 aagatgttgc aactactact gtcaacagag ttactttacc ccccgcggga tcactttcgg 300 ccctgggacc aaagtggata tcaaa 325 <210> 63 <211> 332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 63 cagtctgctc tgattcagcc tgcctccgtg tctgggtccc ctggacagtc gatcactatc 60 tcctgtactg gcaccagtag taatgttgga ggttatgacc ttgtctcctg gtaccaacag 120 tacccgggcc aagcccccag actcatcatt tatgaggtca ttaagcggcc ctcagggatt 180 tctgatcgct tctctggttc caagtctggc acacggcctc cctgacaatc tctgggctcc 240 aggctgagga cgaggctgat tattattgca gctcatatgc aggtagacgt cttcatggtg 300 tgttcggagg aggcacccag ctgaccgtcc tc 332 <210> 64 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 64 gacatccggt tgacccagtc tccatcttcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagaatcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agttatttaa attggtatca acagaaacca 120 gggaaagccc taagctcctg atctatggtg catccagttt gcaaagtggg gtcccatcaa 180 ggttcagtgg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg 240 aagatgttgc aactactact gtcaacagag ttactttacc ccccgcggga tcactttcgg 300 ccctgggacc aaagtggata tcaaa 325 <210> 65 <211> 331 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 65 cagtctgctc tgattcagcc tgcctccgtg tctgggtccc ctggacagtc gatcactatc 60 tcctgtactg gcaccagtag tgatgttgga ggttatgacc ttgtctcctg gtaccaacag 120 tacccggcca agcccccaga ctcatcattt atgaggtcat taagcggccc tcagggattt 180 ctgatcgctt ctctggttcc aagtctggca acacggcctc cctgacaatc tctgggctcc 240 aggctgagga cgagctgatt attattgcag ctcatatgca ggtagacgtc ttcatggtgt 300 gttcggagga ggcacccagc tgaccgtcct c 331 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 66 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 67 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 67 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 68 <211> 989 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 68 gccagcacta aggggccctc tgtgtttcca ctcgcccctt ctagcaaaag cacttccgga 60 ggcactgcag cactcgggtg tctggtcaaa gattatttcc ctgagccagt caccgtgagc 120 tggaacttgg cgccctcacc tccggggttc acacctttcc agccgtcctg cagtcctccg 180 gcctgtactc cctgagcagc gtcgttaccg tgccatcctc ttctctgggg acccagacat 240 acatctgcaa tgtcaccata agcctagcaa caccaaggtg gacaaaaagg tcgagccaaa 300 gagctgcgat aagacacaca cctgccctcc atgccccgca cctgaactcc tgggcgggcc 360 ttccgttttc ctgtttcctc caagcccaag gatacactga tgattagccg cacccccgaa 420 gtcacttgcg tggtggtgga tgtgagccat gaagatccag aagttaagtt taactggtat 480 gtggacgggg tcgaggtgca caatgctaaa caaagcccag ggaggagcaa tataactcca 540 catacagagt ggtgtccgtt ctgacagtcc tgcaccagga ctggctgaac gggaaggaat 600 acaagtgcaa ggtgtctaat aaggcactgc cagccccata gagaagacaa tctctaaagc 660 taaaggccaa ccacgcgagc ctcaggtcta cacactgcca ccatccaggg acgaactgac 720 caagaatcag gtgagcctga cttgtctcgt caaaggattc taccaagcga catcgccgtg 780 gagtgggaat ccaacggcca accagagaac aactacaaga ccaccccacc agtcctggac 840 tctgatggga gctttttcct gtattccaag ctgacagtgg acaagtctcg tggcaacagg 900 gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcatg aagccctgca taaccactat acccagaaaa 960 gcctcagcct gtcccccggg aaataatga 989 <210> 69 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 69 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 70 <211> 319 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 70 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggtaccgcta gcgttgtgtg cctgctgaat aacttttatc cacgggaggc taaggtgcag 120 tggaaaggga caatgccctc cagagcggaa atagccaaga gtccgttacc gaacaggact 180 ctaaagactc tacatactcc ctgtcctcca cactgaccct ctccaaggcc gactatgaga 240 aacacaaggt ttaccatgcg aggtcacaca ccagggactc tcctctcccg tgaccaagag 300 cttcaaccgg ggagaatgc 319 <210> 71 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 71 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 35 40 45 Val Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 72 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 72 ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccac cctcctctga ggagcttcaa 60 gccaacaagg ccacactggt gtgtctcgta agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg 120 gcctggaggc agatggcagc cccgtcaagg tgggagtgga gaccaccaaa ccctccaaac 180 aaagcaacaa caagtatgcg gccagcagct acctgagcct gacgcccgag cagtggaagt 240 cccacagaag ctacgctgcc gggtcacgca tgaagggagc accgtggaga agacagtggc 300 ccctgcagaa tgctct 316 <210> 73 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 73 gcgcaagctt gccaccatga tcttcctcct gctaatg 37 <210> 74 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 74 gccgaattcg atagcactgt tcacttccct c 31 <210> 75 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 75 gcgcaagctt gccaccatgc tgcgtcggcg gggcagc 37 <210> 76 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 76 gcgcgaattc ggctatttct tgtccatcat cttc 34 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 77 gtacgagcta aaagtacagt g 21 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 78 tagataccca tacgacgttc 20 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 79 tctggtggtg gtggttctgc tagc 24 <210> 80 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 80 gccagatctc gagctattac aagtcttctt cagaaataag cttttgttct agaattccg 59 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 81 taatacgact cactataggg 20 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 82 ggcagcccca taaacacaca gtat 24 <210> 83 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 83 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccaccggt 60 60 <210> 84 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 84 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Ala Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Ser Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Lys Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Ile Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Arg Gly Phe Asn Tyr Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 85 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 85 caggtccagc ttgtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgcgtcctc ggtcaaagtc 60 tcctgcacgg cttctggcgg ctccttcagc acctatgcta tcagttgggt gcgacaggct 120 cctggacaag ggcttgaatg gatgggcggg atcatcccca tctttggtac aactaagtac 180 gcacagaggt tccagggcag ggtcacgatt accgcggacg aatcgacgac cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgat atctgacgac acggccctgt attattgtac gacgtctcgt 300 ggattcaact atggctggtt tgactactgg ggccagggta ccctggtcac cgtctcctca 360 gccagcacta aggggccctc tgtgtttcca ctcgcccctt ctagcaaaag cacttccgga 420 ggcactgcag cactcgggtg tctggtcaaa gattatttcc ctgagccagt caccgtgagc 480 tggaactctg gcgccctcac ctccggggtt cacacctttc cagccgtcct gcagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgagcag cgtcgttacc gtgccatcct cttctctggg gacccagaca 600 tacatctgca atgtcaacca taagcctagc aacaccaagg tggacaaaaa ggtcgagcca 660 aagagctgcg ataagacaca cacctgccct ccatgccccg cacctgaact cctgggcggg 720 ccttccgttt tcctgtttcc tcccaagccc aaggatacac tgatgattag ccgcaccccc 780 gaagtcactt gcgtggtggt ggatgtgagc catgaagatc cagaagttaa gtttaactgg 840 tatgtggacg gggtcgaggt gcacaatgct aaaacaaagc ccagggagga gcaatatgcc 900 tccacataca gagtggtgtc cgttctgaca gtcctgcacc aggactggct gaacgggaag 960 gaatacaagt gcaaggtgtc taataaggca ctgccagccc ccatagagaa gacaatctct 1020 aaagctaaag gccaaccacg cgagcctcag gtctacacac tgccaccatc cagggaggaa 1080 atgaccaaga atcaggtgag cctgacttgt ctcgtcaaag gattctaccc aagcgacatc 1140 gccgtggagt gggaatccaa cggccaacca gagaacaact acaagaccac cccaccagtc 1200 ctggactctg atgggagctt tttcctgtat tccaagctga cagtggacaa gtctcggtgg 1260 caacagggca acgtgttcag ctgctccgtg atgcatgaag ccctgcataa ccactatacc 1320 cagaaaagcc tcagcctgtc ccccgggaaa taatga 1356 <210> 86 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 86 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ile His 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 87 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 87 gaaattgtaa tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgta gggccagtca gagtgttggc atacacttag cctggtatca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccagta gggccactgg catcccagac 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 240 gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag tatggttctt tacctcggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggtaccgct agcgttgtgt gcctgctgaa taacttttat 420 ccacgggagg ctaaggtgca gtggaaagtg gacaatgccc tccagagcgg aaatagccaa 480 gagtccgtta ccgaacagga ctctaaagac tctacatact ccctgtcctc cacactgacc 540 ctctccaagg ccgactatga gaaacacaag gtttacgcat gcgaggtcac acaccaggga 600 ctctcctctc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggagaat gc 642

Claims (25)

  1. (1) 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄;
    (2) 각각 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄;
    (3) 각각 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄;
    (4) 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 19에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄;
    (5) 각각 서열번호 7, 서열번호 20 및 서열번호 9에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄;
    (6) 각각 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 21, 서열번호 17 및 서열번호 18에 상응하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄;
    로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드의 군을 포함하는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합부.
  2. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 하기로부터 선택되는 서열을 가지는 것인 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부:
    서열번호 47, 49, 51, 53 또는 54, 또는 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 가짐.
  3. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 하기로부터 선택되는 서열을 가지는 것인 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부:
    서열번호 48, 50, 52, 55 또는 56, 또는 전술한 서열 중 하나와 각각 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 가짐.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 항체(whole antibody), 이중 특이성 항체(bispecific antibody), scFv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv에 해당하는 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부.
  5. 제4항에 있어서, scFv는 중쇄와 경쇄 가변 영역 사이의 연결 펩티드를 더 포함하는 것인, 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부.
  6. 제5항에 있어서, 상기 연결 펩티드는 서열번호 67의 서열을 포함하는 것인, 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 IgG, IgM, IgE, IgD 및 IgA를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부.
  8. 제7항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 Κ(kappa) 영역 또는 X(lambda) 영역인 것인, 항-PD-L1 항체 또는 이의 상응하는 항원 결합부.
  10. 항체 중쇄 가변 영역을 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 항체 중쇄 가변 영역은
    (ⅰ) 서열번호 1 내지 3;
    (ⅱ) 서열번호 7 내지 9;
    (ⅲ) 서열번호 13 내지 15;
    (ⅳ) 서열번호 1, 2 및 19; 및
    (ⅴ) 서열번호 7, 20 및 9
    로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 군을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항체 중쇄 가변 영역은 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 및 서열번호 54로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  12. 항체 경쇄 가변 영역을 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 항체 경쇄 가변 영역은
    (ⅰ) 서열번호 4 내지 6;
    (ⅱ) 서열번호 10 내지 12;
    (ⅲ) 서열번호 16 내지 18; 및
    (ⅳ) 서열번호 21, 17 및 18
    로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 군을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체 중쇄 가변 영역은 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 55, 서열번호 56으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  14. 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 항체 중쇄 가변 영역을 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함하고, 상기 항체 중쇄 가변 영역은
    (ⅰ) 서열번호 1 내지 3;
    (ⅱ) 서열번호 7 내지 9;
    (ⅲ) 서열번호 13 내지 15;
    (ⅳ) 서열번호 1, 2 및 19; 및
    (ⅴ) 서열번호 7, 20 및 9
    로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 군을 포함하는, 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 항체 경쇄 가변 영역을 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 더 포함하는 것으로서, 상기 항체 경쇄 가변 영역은
    (ⅰ) 서열번호 4 내지 6;
    (ⅱ) 서열번호 10 내지 12;
    (ⅲ) 서열번호 16 내지 18; 및
    (ⅳ) 서열번호 21, 17 및 18;
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 군을 포함하는 것인, 벡터.
  16. 항-PD-L1 항체, 서열번호 85의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및 서열번호 87의 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하는 항체, 또는 항체의 항원 결합부.
  17. 서열번호 85; 및 서열번호 87로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  18. 제17항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 86 또는 서열번호 88의 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  19. 서열번호 85, 및 서열번호 87로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 핵산을 포함하는, 숙주 세포.
  20. 서열번호 85의 중쇄 및 서열번호 87의 경쇄를 가지는 항체, 또는 항체의 항원 결합부; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 보조제(adjuvant)를 포함하는, 조성물.
  21. 제21항에 있어서, 약 275 mM의 세린(serine), 약 10mM의 히스티딘(histidine)을 포함하고, 약 5.9의 pH를 가지는, 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 약 0.05%의 폴리소르베이트 80, 약 1%의 D-만니톨, 약 120mM의 L-프롤린, 약 100mM의 L-세린, 약 10mM의 L-히스티딘-HCl을 포함하고, 약 5.8의 pH를 가지는, 조성물.
  23. 인간 PD-L1의 활성의 조절과 관련된 질병을 치료 또는 예방할 필요가 있는 환자에게 서열번호 85의 중쇄 및 서열번호 87의 경쇄를 가진 항체, 또는 항체의 항원 결합부를 포함하는 약학적 조성물을 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 PD-L1 활성의 조절과 관련된 질병 또는 조건을 예방 또는 치료하기 위한 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 질병은 폐암, 난소암, 대장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 흑색종, 신장암, 방광암, 유방암, 간암, 림프종, 혈액 악성 종양, 두경부암, 신경 교종, 위암, 비인두암, 후두암, 자궁경부암, 자궁암 또는 골육종인 것인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 질병은 HBV, HCV 또는 HIV 감염인 것인, 방법.
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