KR20230136166A - 멀타바디 구축물, 조성물, 및 방법 - Google Patents

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KR20230136166A
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ser
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장-필리프 즬리앵
장-필리프 ?x리앵
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더 호스피탈 포 식 칠드런
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Abstract

측면에서, 융합 단백질은 Fc 단량체에 연결된 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하고, 여기서 복수의 융합 단백질은 자기 어셈블리하여 하나 이상의 Fc 이량체를 포함하는 나노케이지를 형성할 수 있다. 측면에서, 융합 단백질은 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 C-말단에서 Fc 단량체 또는 scFc 단편에 연결된 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하고, 여기서 복수의 융합 단백질은 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성할 수 있다.

Description

멀타바디 구축물, 조성물, 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 1월 28일 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/142,704의 이익 및 우선권을 주장하고, 상기 출원의 전체 내용은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이로써 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 2022년 1월 28일에 작성된 상기 ASCII 사본은 "Sequence Listing Jan-2022 3206-5048_ST25.txt"로 이름이 지정되고, 크기는 8100 바이트이다.
분야
본 발명은 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 멀타바디 폴리펩티드, 및 관련 구축물, 조성물, 및 방법에 관한 것이다.
배경
나노입자는 다양한 분야의 발전에 기여하였다. 그의 사용은 표적화된 전달을 부여할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 정렬된 마이크로어레이의 조작, 서방출 및 촉매 프로세스를 위한 케이징된 미세환경을 가능하게 한다.
민감하고, 준안정한 단백질을 함유하는 나노입자의 제작을 위해, 단백질 자기 어셈블리는 매력적인 방법이다. 실제로, 자기 어셈블리된 나노입자는 생리학적 조건하에 비공유 상호작용을 통해 형성되고, 균일하고, 종종 대칭적인 나노캡슐 또는 나노케이지를 안정적으로 생성한다. 자기 어셈블리 단백질 나노입자는 추가된 기능을 전달하기 위해 모두 변경될 수 있는 3개의 별개의 표면: 외부, 내부 및 서브유닛간 표면을 보유한다.
자기 어셈블리 단백질을 포함하는 융합 단백질이 기술되었다. 예를 들어, 백신으로 사용하기 위해 어셈블리된 나노케이지의 외부 표면에 항원을 디스플레이하는 것으로 알려져 있다.
나노입자를 디자인하고, 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 개선된 구축물, 조성물, 및 방법이 요구되고 있다.
한 측면에 따라, Fc 단량체에 연결된 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 융합 단백질로서, 여기서 복수의 융합 단백질은 자기 어셈블리하여 하나 이상의 Fc 이량체를 포함하는 나노케이지를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질을 제공한다.
한 측면에서, Fc 단량체는 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N- 또는 C-말단에서, 바람직하게는 C-말단에서 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 서브유닛은 각각 실질적으로 나노케이지 단량체의 N-말단 절반 및 나노케이지 단량체의 C-말단 절반에 상응하는 N-서브유닛 또는 C-서브유닛을 포함하고, 여기서 N-서브유닛 및 C-서브유닛은 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성할 수 있다.
한 측면에서, Fc 단량체는 N-서브유닛 또는 C-서브유닛의 C-말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결되고, 바람직하게는 여기서 Fc 단량체는 C-말단에서 C-서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 제1 생체활성 모이어티에 추가로 연결된다.
한 측면에서, 제1 생체활성 모이어티는 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 제1 생체활성 모이어티는 N-서브유닛 또는 C-서브유닛의 N-말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결되고, 바람직하게는 여기서 제1 생체활성 모이어티는 N-말단에서 C-서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 제1 생체활성 모이어티는 어셈블리된 나노케이지의 내부 및/또는 외부 표면, 바람직하게는 외부 표면을 장식한다.
한 측면에서, 제1 생체활성 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 제1 항원 결합 모이어티는 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
한 측면에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 단편을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 scFab 단편, scFv 단편, sdAb 단편, VHH 도메인 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다.
한 측면에서, 제1 항원 결합 모이어티는 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것이다.
한 측면에서, 제1 항원 결합 모이어티는 HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티는 BG505 SOSIP_D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합한다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티는 PGDM1400, 10E8v4, 및/또는 N49P7로부터의 HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 융합 단백질은 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 C-말단에서 Fc 단량체에 연결되고, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N-말단에서 제1 생체활성 모이어티에 연결된, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함한다.
한 측면에서, 융합 단백질은 C-서브유닛의 C-말단에서 Fc 단량체에 연결되고, C-서브유닛의 N-말단에서 제1 생체활성 모이어티에 연결된 C-서브유닛을 포함한다.
한 측면에서, N-서브유닛과, 또는 N-서브유닛을 포함하는 융합 단백질과 조합된 융합 단백질을 제공한다.
한 측면에서, N-서브유닛은 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 제2 생체활성 모이어티에 연결된다.
한 측면에서, 제2 생체활성 모이어티는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 제1 생체활성 모이어티가 제1 항원 결합 모이어티를 포함하는 경우, 제2 항원 결합 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티와 동일하거나, 또는 상이할 수 있다.
한 측면에서, 제2 항원 결합 모이어티는 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
한 측면에서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 단편을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 scFab 단편, scFv 단편, sdAb 단편, VHH 도메인 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다.
한 측면에서, N-서브유닛은 N-서브유닛의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 C-말단에서 Fc 단량체에 추가로 연결된다.
한 측면에서, Fc 단량체는 IgG, IgA, IgD, IgM, 또는 IgE로부터 유래된 것이고, 바람직하게는 인간의 것이다.
한 측면에서, Fc 단량체는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래된 것이다.
한 측면에서, Fc 단량체는 IgG1 Fc 단량체이다.
한 측면에서, Fc 단량체는 융합 단백질의 반감기를, 예를 들어, 수 분 또는 수 시간에서 수 일, 수 주 또는 수 개월로 조정하는 하나 이상의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함한다.
한 측면에서, Fc 단량체는 L234, L235, G236, G237, M252, I253, S254, T256, P329, A330, M428, N434, 또는 그의 조합 (여기서, 넘버링은 EU 인덱스에 따름) 중 하나 이상에서의 돌연변이, 예컨대, M428L 및 N434S ("LS"); M252Y, S254T 및 T256E ("YTE"); L234A 및 L235A ("LALA"); I253A; L234A, L235A, 및 P329G ("LALAP"); G236R; G237A; 및/또는 A330L 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 약 3 내지 약 100개의 나노케이지 단량체, 예컨대, 24, 32, 48, 또는 60개의 나노케이지 단량체, 또는 약 4 내지 약 200개의 나노케이지 단량체 서브유닛, 예컨대, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50개, 또는 그 초과의 것은 임의적으로 하나 이상의 전체 나노케이지 단량체와 조합하여 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성할 수 있다.
한 측면에서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 페리틴, 아포페리틴, 엔캡슐린, SOR, 루마진 신타제, 피루베이트 데히드로게나제, 카르복시좀, 볼트 단백질, GroEL, 열 충격 단백질, E2P, MS2 외피 단백질, 그의 단편, 및 그의 변이체로부터 선택된다.
한 측면에서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 아포페리틴, 임의적으로, 인간 아포페리틴이다.
한 측면에서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 아포페리틴 경쇄, 임의적으로, 인간 아포페리틴 경쇄이다.
한 측면에서, 융합 단백질은 제1 아포페리틴 서브유닛, 임의적으로, 제1 인간 아포페리틴 서브유닛을 포함하고, 여기서 제1 아포페리틴 서브유닛은 제2 아포페리틴 서브유닛과 자기 어셈블리할 수 있다.
한 측면에서, 제1 및 제2 아포페리틴 단량체 서브유닛은 상호교환적으로 아포페리틴의 "N" 및 "C" 영역을 포함한다.
한 측면에서, 아포페리틴의 "N" 영역은
Figure pct00001
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에서, 아포페리틴의 "C" 영역은
Figure pct00002
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에서, Fc 단량체는 링커를 통해 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 제1 생체활성 모이어티는 링커를 통해 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 제2 생체활성 모이어티는 링커를 통해 N-서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 링커는 가요성 또는 강성이고, 약 1 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 70개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 8 내지 약 16개의 아미노산 잔기를 포함한다.
한 측면에서, 링커는 GS 도메인을 포함한다.
한 측면에서, GS 도메인은 GS 반복부, GGS 반복부, GGGS (서열식별번호 11) 반복부, 및/또는 GGGGS (서열식별번호 12) 반복부, 예컨대, 1, 2, 3, 4게, 또는 그 초과의 GGGGS (서열식별번호 12) 반복부를 포함한다.
한 측면에서, 링커는
Figure pct00003
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에서, 링커는
Figure pct00004
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에 따라, 본원에 기술된 적어도 하나의 융합 단백질 및 융합 단백질과 자기 어셈블리하는 적어도 하나의 제2 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 나노케이지를 제공한다.
한 측면에서, 융합 단백질은 제1 나노케이지 단량체 서브유닛을 포함하고, 제2 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 제2 나노케이지 단량체 서브유닛이고, 제2 나노케이지 단량체 서브유닛은 융합 단백질과 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성한다.
한 측면에서, 약 1% 내지 약 100%, 예컨대, 약 1%, 4%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 내지 약 4%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%, 예컨대, 약 20% 내지 약 80%의 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 본원에 기술된 융합 단백질 내에 포함된다.
한 측면에서, 각 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 본원에 기술된 융합 단백질 내에 포함된다.
한 측면에서, 나노케이지는 1개의 생체활성 모이어티 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 생체활성 모이어티, 예컨대, 2 또는 3개의 상이한 생체활성 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 다가이다.
한 측면에서, 나노케이지는 다중특이적이다.
한 측면에서, 적어도 하나의 생체활성 모이어티는 나노케이지의 외부 표면을 장식하고, 적어도 하나의 Fc 이량체는 나노케이지의 외부 표면을 장식한다.
한 측면에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 생체활성 모이어티는 나노케이지의 외부 표면을 장식하고, 적어도 2개의 Fc 이량체는 나노케이지의 외부 표면을 장식한다.
한 측면에서, 나노케이지는
(a) 제1 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab에 융합된 적어도 하나의 나노케이지 단량체,
(b) 제2 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab에 융합된 적어도 하나의 N-서브유닛, 및
(c) 및 (i) 한쪽 말단에서 제3 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab, 및
(ii) 다른 한쪽 말단에서 Fc 단량체
에 융합된 적어도 하나의 C-서브유닛
을 포함한다.
한 측면에서, 각 항원 결합 모이어티는 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N-말단에 연결되고, 여기서 Fc 단량체는 C-서브유닛의 C-말단에 연결된다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것이다.
한 측면에서, 각 항원 결합 모이어티는 상이한 HIV-1 특이적 Fab이다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 Fab는 BG505 SOSIP_D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합한다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 Fab는 PGDM1400 Fab, 10E8v4 Fab, 및/또는 N49P7 Fab를 포함한다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 Fab는 PGDM1400 Fab, 10E8v4 Fab, 및 N49P7 Fab를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 Fc 단량체를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 카고 분자, 예컨대, 약제, 진단제, 및/또는 영상화제를 보유한다.
한 측면에서, 카고 분자는 융합 단백질에 융합되지 않고, 나노케이지 내부에 함유되거나, 또는 여기서 카고 분자는 융합 단백질에 연결되거나, 또는 내부적으로 또는 외부적으로 나노케이지에 결합된다.
한 측면에서, 카고 분자는 단백질이고, 카고 분자가 나노케이지 내부에 함유되도록 융합 단백질에 융합된다.
한 측면에서, 카고 분자는 형광 단백질, 예컨대, GFP, EGFP, 아메트린, 및/또는 플라빈 기반 형광 단백질, 예컨대, LOV-단백질, 예컨대, iLOV를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 범(pan)-바이러스 중화 범위를 나타낸다.
한 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 0.1 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.01 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.001 ug/mL 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
한 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 42 pM 미만, 예컨대, 약 4.2 pM 미만, 예컨대, 약 0.42 pM 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
한 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 질량 및/또는 몰 기준으로 상응하는 bNAb의 칵테일보다 적어도 약 10, 적어도 약 100, 적어도 약 1000, 적어도 약 10,000, 또는 적어도 약 100,000 더 강력한 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
한 측면에 따라, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 C-말단에서 scFc 단편에 연결된 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 융합 단백질로서, 여기서 복수의 융합 단백질은 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질을 제공한다.
한 측면에서, 서브유닛은 각각 실질적으로 나노케이지 단량체의 N-말단 절반 및 나노케이지 단량체의 C-말단 절반에 상응하는 N-서브유닛 또는 C-서브유닛을 포함하고, 여기서 N-서브유닛 및 C-서브유닛은 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성할 수 있다.
한 측면에서, scFc 단편은 N-서브유닛 또는 C-서브유닛의 C-말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 제1 생체활성 모이어티에 추가로 연결된다.
한 측면에서, 제1 생체활성 모이어티는 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 제1 생체활성 모이어티는 N-서브유닛 또는 C-서브유닛의 N-말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결되고, 바람직하게는 여기서 제1 생체활성 모이어티는 N-말단에서 C-서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 제1 생체활성 모이어티는 어셈블리된 나노케이지의 내부 및/또는 외부 표면, 바람직하게는 외부 표면을 장식한다.
한 측면에서, 제1 생체활성 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 제1 항원 결합 모이어티는 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
한 측면에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 단편을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 scFab 단편, scFv 단편, sdAb 단편, VHH 도메인 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다.
한 측면에서, 제1 항원 결합 모이어티는 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것이다.
한 측면에서, 제1 항원 결합 모이어티는 HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티는 BG505 SOSIP_D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합한다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티는 PGDM1400, 10E8v4, 및/또는 N49P7로부터의 HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 융합 단백질은 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 C-말단에서 scFc 단편에 연결되고, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N-말단에서 제1 생체활성 모이어티에 연결된 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함한다.
한 측면에서, 융합 단백질은 C-서브유닛의 C-말단에서 scFc 단편에 연결되고, C-서브유닛의 N-말단에서 제1 생체활성 모이어티에 연결된 C-서브유닛을 포함한다.
한 측면에서, N-서브유닛과, 또는 N-서브유닛을 포함하는 융합 단백질과 조합된 융합 단백질을 제공한다.
한 측면에서, N-서브유닛은 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 제2 생체활성 모이어티에 연결된다.
한 측면에서, 제2 생체활성 모이어티는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 제1 생체활성 모이어티가 제1 항원 결합 모이어티를 포함하는 경우, 제2 항원 결합 모이어티는 C-서브유닛에 연결된 항원 결합 모이어티와 동일하거나, 또는 상이할 수 있다.
한 측면에서, 제2 항원 결합 모이어티는 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
한 측면에서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 단편을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 scFab 단편, scFv 단편, sdAb 단편, VHH 도메인 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다.
한 측면에서, N-서브유닛은 N-서브유닛의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 C-말단에서 제2 scFc 단편에 추가로 연결된다.
한 측면에서, scFc 단편은 IgG, IgA, IgD, IgM, 또는 IgE로부터 유래된 것이고, 바람직하게는 인간의 것이다.
한 측면에서, scFc 단편은 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래된 것이다.
한 측면에서, scFc 단편은 IgG1 scFc 단편이다.
한 측면에서, scFc 단편은 융합 단백질의 반감기를, 예를 들어, 수 분 또는 수 시간에서 수 일, 수 주 또는 수 개월로 조정하는 하나 이상의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함한다.
한 측면에서, scFc 단편은 L234, L235, G236, G237, M252, I253, S254, T256, P329, A330, M428, N434, 또는 그의 조합 (여기서, 넘버링은 EU 인덱스에 따름) 중 하나 이상에서의 돌연변이, 예컨대, M428L 및 N434S ("LS"); M252Y, S254T 및 T256E ("YTE"); L234A 및 L235A ("LALA"); I253A; L234A, L235A, 및 P329G ("LALAP"); G236R; G237A; 및/또는 A330L 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 약 3 내지 약 100개의 나노케이지 단량체, 예컨대, 24, 32, 48, 또는 60개의 나노케이지 단량체, 또는 약 4 내지 약 200개의 나노케이지 단량체 서브유닛, 예컨대, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50개, 또는 그 초과의 것은 임의적으로 하나 이상의 전체 나노케이지 단량체와 조합하여 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성할 수 있다.
한 측면에서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 페리틴, 아포페리틴, 엔캡슐린, SOR, 루마진 신타제, 피루베이트 데히드로게나제, 카르복시좀, 볼트 단백질, GroEL, 열 충격 단백질, E2P, MS2 외피 단백질, 그의 단편, 및 그의 변이체로부터 선택된다.
한 측면에서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 아포페리틴, 임의적으로, 인간 아포페리틴이다.
한 측면에서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 아포페리틴 경쇄, 임의적으로, 인간 아포페리틴 경쇄이다.
한 측면에서, 융합 단백질은 제1 아포페리틴 서브유닛, 임의적으로, 제1 인간 아포페리틴 서브유닛을 포함하고, 여기서 제1 아포페리틴 서브유닛은 제2 아포페리틴 서브유닛과 자기 어셈블리할 수 있다.
한 측면에서, 제1 및 제2 아포페리틴 단량체 서브유닛은 상호교환적으로 아포페리틴의 "N" 및 "C" 영역을 포함한다.
한 측면에서, 아포페리틴의 "N" 영역은
Figure pct00005
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에서, 아포페리틴의 "C" 영역은
Figure pct00006
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에서, scFc 단편은 링커를 통해 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 제1 생체활성 모이어티는 링커를 통해 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 제2 생체활성 모이어티는 링커를 통해 N-서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 링커는 가요성 또는 강성이고, 약 1 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 70개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 8 내지 약 16개의 아미노산 잔기를 포함한다.
한 측면에서, 링커는 GS 도메인을 포함한다.
한 측면에서, GS 도메인은 GS 반복부, GGS 반복부, GGGS (서열식별번호 11) 반복부, 및/또는 GGGGS (서열식별번호 12) 반복부, 예컨대, 1, 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 GGGGS (서열식별번호 12) 반복부를 포함한다.
한 측면에서, 링커는
Figure pct00007
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에서, 링커는
Figure pct00008
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에 따라, 본원에 기술된 적어도 하나의 융합 단백질 및 융합 단백질과 자기 어셈블리하는 적어도 하나의 제2 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 나노케이지를 제공한다.
한 측면에서, 융합 단백질은 제1 나노케이지 단량체 서브유닛을 포함하고, 제2 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 제2 나노케이지 단량체 서브유닛이고, 제2 나노케이지 단량체 서브유닛은 융합 단백질과 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성한다.
한 측면에서, 약 1% 내지 약 100%, 예컨대, 약 1%, 4%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 내지 약 4%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%, 예컨대, 약 20% 내지 약 80%의 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 본원에 기술된 융합 단백질 내에 포함된다.
한 측면에서, 각 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 본원에 기술된 융합 단백질 내에 포함된다.
한 측면에서, 나노케이지는 1개의 생체활성 모이어티 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 생체활성 모이어티, 예컨대, 2 또는 3개의 상이한 생체활성 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 다가이다.
한 측면에서, 나노케이지는 다중특이적이다.
한 측면에서, 적어도 하나의 생체활성 모이어티는 나노케이지의 외부 표면을 장식하고, 적어도 하나의 scFc 단편은 나노케이지의 외부 표면을 장식한다.
한 측면에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 생체활성 모이어티는 나노케이지의 외부 표면을 장식하고, 적어도 2개의 scFc 단편은 나노케이지의 외부 표면을 장식한다.
한 측면에서, 나노케이지는
(a) 제1 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab에 융합된 적어도 하나의 나노케이지 단량체,
(b) 제2 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab에 융합된 적어도 하나의 N-서브유닛, 및
(c) 및 (i) 한쪽 말단에서 제3 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab, 및
(ii) 다른 한쪽 말단에서 scFc 단편
에 융합된 적어도 하나의 C-서브유닛
을 포함한다.
한 측면에서, 각 항원 결합 모이어티는 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N-말단에 연결되고, 여기서 scFc 단편은 C-서브유닛의 C-말단에 연결된다.
한 측면에서, 제1 및/또는 제2 항원 결합 모이어티는 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것이다.
한 측면에서, 각 항원 결합 모이어티는 상이한 HIV-1 특이적 Fab이다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 Fab는 BG505 SOSIP_D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합한다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 Fab는 PGDM1400 Fab, 10E8v4 Fab, 및/또는 N49P7 Fab를 포함한다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 Fab는 PGDM1400 Fab, 10E8v4 Fab, 및 N49P7 Fab를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 scFc 단편을 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 카고 분자, 예컨대, 약제, 진단제, 및/또는 영상화제를 보유한다.
한 측면에서, 카고 분자는 융합 단백질에 융합되지 않고, 나노케이지 내부에 함유되거나, 또는 여기서 카고 분자는 융합 단백질에 연결되거나, 또는 내부적으로 또는 외부적으로 나노케이지에 결합된다.
한 측면에서, 카고 분자는 단백질이고, 카고 분자가 나노케이지 내부에 함유되도록 융합 단백질에 융합된다.
한 측면에서, 카고 분자는 형광 단백질, 예컨대, GFP, EGFP, 아메트린, 및/또는 플라빈 기반 형광 단백질, 예컨대, LOV-단백질, 예컨대, iLOV를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 범-바이러스 중화 범위를 나타낸다.
한 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 0.1 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.01 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.001 ug/mL 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
한 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 42 pM 미만, 예컨대, 약 4.2 pM 미만, 예컨대, 약 0.42 pM 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
한 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 질량 및/또는 몰 기준으로 상응하는 bNAb의 칵테일보다 적어도 약 10, 적어도 약 100, 적어도 약 1000, 적어도 약 10,000, 또는 적어도 약 100,000 더 강력한 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
한 측면에서, 본원에 기술된 나노케이지를 포함하는 치료 또는 예방 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 조성물은 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태의 치료 및/또는 예방용이다.
한 측면에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것이다.
한 측면에서, 조성물은 HIV-1-관련 병태의 치료 및/또는 예방용이다.
한 측면에 따라, 본원에 기술된 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에 따라, 본원에 기술된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
한 측면에 따라, 본원에 기술된 벡터를 포함하고, 본원에 기술된 융합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 제공한다.
한 측면에 따라, 병태의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 나노케이지 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 병태는 HIV-1-관련 병태이다.
한 측면에 따라, 병태의 치료 및/또는 예방을 위한 본원에 기술된 나노케이지 또는 조성물의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 병태는 HIV-1-관련 병태이다.
한 측면에 따라, 병태의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 본원에 기술된 나노케이지 또는 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 병태는 HIV-1-관련 병태이다.
한 측면에서, 나노케이지는 어떠한 페리틴 중쇄도 포함하지 않는다.
한 측면에서, 나노케이지는 페록시다제 활성 능력이 있는 어떠한 성분도 포함하지 않는다.
한 측면에서, 나노케이지는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 적어도 하나의 생체활성 모이어티를 포함하고, 생체활성 모이어티의 총 개수 대 Fc 이량체의 개수의 비는 6:1이다.
한 측면에서, 나노케이지는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 적어도 하나의 생체활성 모이어티를 포함하고, 생체활성 모이어티의 총 개수 대 scFc의 개수의 비는 3:1이다.
한 측면에서, 나노케이지는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 적어도 하나의 생체활성 모이어티를 포함하고, 생체활성 모이어티의 총 개수 대 Fc 이량체 또는 scFc의 개수의 비는 적어도 7:1이다.
한 측면에서, 나노케이지는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 적어도 하나의 생체활성 모이어티를 포함하고, 생체활성 모이어티의 총 개수 대 Fc 이량체 또는 scFc의 개수의 비는 적어도 4:1이다.
한 측면에 따라, Fc 단량체에 연결된 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 융합 단백질로서, 여기서 복수의 융합 단백질은 자기 어셈블리하여 하나 이상의 Fc 이량체를 포함하는 나노케이지를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질을 제공한다.
한 측면에서, 서브유닛은 각각 실질적으로 나노케이지 단량체의 N-말단 절반 및 나노케이지 단량체의 C-말단 절반에 상응하는 N-서브유닛 또는 C-서브유닛을 포함하고, 여기서 N-서브유닛 및 C-서브유닛은 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성할 수 있다.
한 측면에서, Fc 단량체는 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N- 또는 C-말단에서, 바람직하게는 C-말단에서 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, Fc 단량체는 N-서브유닛 또는 C-서브유닛의 C-말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결되고, 바람직하게는 여기서 Fc 단량체는 C-말단에서 C-서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 생체활성 모이어티에 추가로 연결된다.
한 측면에서, 생체활성 모이어티는 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 생체활성 모이어티는 N-서브유닛 또는 C-서브유닛의 N-말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결되고, 여기서 생체활성 모이어티는 N-말단에서 C-서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 어셈블리된 나노케이지의 내부 및/또는 외부 표면, 바람직하게는 외부 표면을 장식한다.
한 측면에서, 생체활성 모이어티는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 단편을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 scFab 단편, scFv 단편, sdAb 단편, VHH 도메인 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것이다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 HIV-1 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티는 BG505 SOSIP D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합한다.
한 측면에서, HIV-1 항원 결합 모이어티는 PGDM1400, 10E8v4, 및/또는 N49P7을 포함한다.
한 측면에서, 융합 단백질은 나노케이지 단량체의 C-말단에서 Fc 단량체에 연결되고, 나노케이지 단량체의 N-말단에서 생체활성 모이어티에 연결된 나노케이지 단량체를 포함한다.
한 측면에서, 융합 단백질은 C-서브유닛의 C-말단에서 Fc 단량체에 연결되고, C-서브유닛의 N-말단에서 생체활성 모이어티에 연결된 C-서브유닛을 포함한다.
한 측면에서, N-서브유닛과 조합된 C-서브유닛을 제공한다.
한 측면에서, N-서브유닛은 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 생체활성 모이어티에 연결된다.
한 측면에서, 생체활성 모이어티는, C-서브유닛에 연결된 항원 결합 모이어티와 동일하거나, 또는 상이할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 단편을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 scFab 단편, scFv 단편, sdAb 단편, VHH 도메인 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다.
한 측면에서, N-서브유닛은 N-서브유닛의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 C-말단에서 Fc 단량체에 추가로 연결된다.
한 측면에서, Fc 단량체는 IgG, IgA, IgD, IgM, 또는 IgE로부터 유래된 것이고, 바람직하게는 인간의 것이다.
한 측면에서, Fc 단량체는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래된 것이다.
한 측면에서, Fc 단량체는 IgG1 Fc 단량체이다.
한 측면에서, Fc 단량체는 융합 단백질의 반감기를, 예를 들어, 수 분 또는 수 시간에서 수 일, 수 주 또는 수 개월로 조정하는 하나 이상의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함한다.
한 측면에서, Fc 단량체는 L234, L235, G236, G237, M252, I253, S254, T256, P329, A330, M428, N434, 또는 그의 조합 (여기서, 넘버링은 EU 인덱스에 따름) 중 하나 이상에서의 돌연변이, 예컨대, M428L 및 N434S ("LS"); M252Y, S254T 및 T256E ("YTE"); L234A 및 L235A ("LALA"); I253A, 및/또는 L234A, L235A, 및 P329G ("LALAP"), G236R, G237A, A330L 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 약 3 내지 약 100개의 나노케이지 단량체, 예컨대, 24, 32, 48, 또는 60개의 나노케이지 단량체, 또는 약 4 내지 약 200개의 나노케이지 단량체 서브유닛, 예컨대, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50개, 또는 그 초과의 것은 임의적으로 하나 이상의 전체 나노케이지 단량체와 조합하여 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성할 수 있다.
한 측면에서, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 페리틴, 아포페리틴, 엔캡슐린, SOR, 루마진 신타제, 피루베이트 데히드로게나제, 카르복시좀, 볼트 단백질, GroEL, 열 충격 단백질, E2P, MS2 외피 단백질, 그의 단편, 및 그의 변이체로부터 선택된다.
한 측면에서, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 아포페리틴, 임의적으로, 인간 아포페리틴이다
한 측면에서, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 아포페리틴 경쇄, 임의적으로, 인간 아포페리틴 경쇄이다.
한 측면에서, 융합 단백질은 제1 아포페리틴 서브유닛, 임의적으로, 제1 인간 아포페리틴 서브유닛을 포함하고, 여기서 제1 아포페리틴 서브유닛은 제2 아포페리틴 서브유닛과 자기 어셈블리할 수 있다.
한 측면에서, 제1 및 제2 아포페리틴 단량체 서브유닛은 상호교환적으로 아포페리틴의 "N" 및 "C" 영역을 포함한다.
한 측면에서, 아포페리틴의 "N" 영역은
Figure pct00009
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에서, 아포페리틴의 "C" 영역은
Figure pct00010
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에서, Fc 단량체 및/또는 생체활성 모이어티는 링커를 통해 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 링커는 가요성 또는 강성이고, 약 1 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 70개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 8 내지 약 16개의 아미노산 잔기를 포함한다.
한 측면에서, 링커는 GS 도메인을 포함한다.
한 측면에서, GS 도메인은 GS 반복부, GGS 반복부, GGGS 반복부, 및/또는 GGGGS 반복부, 예컨대, 1, 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 GGGGS 반복부를 포함한다.
한 측면에서, 링커는
Figure pct00011
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에서, 링커는
Figure pct00012
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에 따라, 본원에 기술된 적어도 하나의 융합 단백질 및 융합 단백질과 자기 어셈블리하는 적어도 하나의 제2 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 나노케이지를 제공한다.
한 측면에서, 융합 단백질은 제1 나노케이지 단량체 서브유닛을 포함하고, 제2 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 제2 나노케이지 단량체 서브유닛이고, 제2 나노케이지 단량체 서브유닛은 융합 단백질과 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성한다.
한 측면에서, 각 나노케이지 단량체는 본원에 기술된 융합 단백질을 포함한다.
한 측면에서, 약 1% 내지 약 100%, 예컨대, 약 1%, 4%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 내지 약 4%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%, 예컨대, 약 20% 내지 약 80%의 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 본원에 기술된 융합 단백질을 구성한다.
한 측면에서, 나노케이지는 1개의 생체활성 모이어티 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 생체활성 모이어티, 예컨대, 2 또는 3개의 상이한 생체활성 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 다가이다.
한 측면에서, 나노케이지는 다중특이적이다.
한 측면에서, 적어도 하나의 생체활성 모이어티는 나노케이지의 외부 표면을 장식하고, 적어도 하나의 Fc 이량체는 나노케이지의 외부 표면을 장식한다.
한 측면에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 생체활성 모이어티는 나노케이지의 외부 표면을 장식하고, 적어도 2개의 Fc 이량체는 나노케이지의 외부 표면을 장식한다.
한 측면에서, 나노케이지는 제1 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab에 융합된 적어도 하나의 나노케이지 단량체, 제2 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab에 융합된 적어도 하나의 N-서브유닛, 및 한쪽 말단에서 제3 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab, 및 다른 한쪽 말단에서 Fc 단량체에 융합된 적어도 하나의 C-서브유닛을 포함한다.
한 측면에서, 각 항원 결합 모이어티는 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N-말단에 연결되고, 여기서 Fc 단량체는 C-서브유닛의 C-말단에 연결된다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것이다.
한 측면에서, 각 항원 결합 모이어티는 상이한 HIV-1 특이적 Fab이다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 Fab는 BG505 SOSIP D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합한다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 Fab는 PGDM1400, 10E8v4, 및/또는 N49P7을 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 PGDM1400, 10E8v4, 및 N49P7을 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 Fc 단량체를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 카고 분자, 예컨대, 약제, 진단제, 및/또는 영상화제를 보유한다.
한 측면에서, 카고 분자는 융합 단백질에 융합되지 않고, 나노케이지 내부에 함유되거나, 또는 여기서 카고 분자는 융합 단백질에 연결되거나, 또는 내부적으로 또는 외부적으로 나노케이지에 결합된다.
한 측면에서, 카고 분자는 단백질이고, 카고 분자가 나노케이지 내부에 함유되도록 융합 단백질에 융합된다.
한 측면에서, 카고 분자는 형광 단백질, 예컨대, GFP, EGFP, 아메트린, 및/또는 플라빈 기반 형광 단백질, 예컨대, LOV-단백질, 예컨대, iLOV를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 범-바이러스 중화 범위를 나타낸다.
한 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 0.1 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.01 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.001 ug/mL 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
한 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 42 pM 미만, 예컨대, 약 4.2 pM 미만, 예컨대, 약 0.42 pM 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
한 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 질량 및/또는 몰 기준으로 상응하는 bNAb의 칵테일보다 적어도 약 10, 적어도 약 100, 적어도 약 1000, 적어도 약 10,000, 또는 적어도 약 100,000 더 강력한 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
한 측면에 따라, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 C-말단에서 scFc 단편에 연결된 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 융합 단백질로서, 여기서 복수의 융합 단백질은 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성하는 것인 융합 단백질을 제공한다.
한 측면에서, 서브유닛은 각각 실질적으로 나노케이지 단량체의 N-말단 절반 및 나노케이지 단량체의 C-말단 절반에 상응하는 N-서브유닛 또는 C-서브유닛을 포함하고, 여기서 N-서브유닛 및 C-서브유닛은 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성할 수 있다.
한 측면에서, scFc 단편은 나노케이지 단량체의 C-말단에서 나노케이지 단량체에 연결된다.
한 측면에서, scFc 단편은 N-서브유닛 또는 C-서브유닛의 C-말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 생체활성 모이어티에 추가로 연결된다.
한 측면에서, 생체활성 모이어티는 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 생체활성 모이어티는 N-서브유닛 또는 C-서브유닛의 N-말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결되고, 여기서 생체활성 모이어티는 N-말단에서 C-서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 어셈블리된 나노케이지의 내부 및/또는 외부 표면, 바람직하게는 외부 표면을 장식한다.
한 측면에서, 생체활성 모이어티는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 단편을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 scFab 단편, scFv 단편, sdAb 단편, VHH 도메인 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것이다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 HIV-1 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티는 BG505 SOSIP D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합한다.
한 측면에서, HIV-1 항원 결합 모이어티는 PGDM1400, 10E8v4, 및/또는 N49P7을 포함한다.
한 측면에서, 융합 단백질은 나노케이지 단량체의 C-말단에서 scFc 단편에 연결되고, 나노케이지 단량체의 N-말단에서 생체활성 모이어티에 연결된 나노케이지 단량체를 포함한다.
한 측면에서, 융합 단백질은 C-서브유닛의 C-말단에서 scFc 단편에 연결되고, C-서브유닛의 N-말단에서 생체활성 모이어티에 연결된 C-서브유닛을 포함한다.
한 측면에서, N-서브유닛과 조합된 C-서브유닛을 제공한다.
한 측면에서, N-서브유닛은 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 생체활성 모이어티에 연결된다.
한 측면에서, 생체활성 모이어티는 C-서브유닛에 연결된 항원 결합 모이어티와 동일하거나, 또는 상이할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 단편을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 scFab 단편, scFv 단편, sdAb 단편, VHH 도메인 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다.
한 측면에서, N-서브유닛은 N-서브유닛의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 C-말단에서 scFc 단편에 추가로 연결된다.
한 측면에서, scFc 단편은 IgG, IgA, IgD, IgM, 또는 IgE로부터 유래된 것이고, 바람직하게는 인간의 것이다.
한 측면에서, scFc 단편은 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래된 것이다.
한 측면에서, scFc 단편은 IgG1 scFc 단편이다.
한 측면에서, scFc 단편은 융합 단백질의 반감기를, 예를 들어, 수 분 또는 수 시간에서 수 일, 수 주 또는 수 개월로 조정하는 하나 이상의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함한다.
한 측면에서, scFc 단편은 L234, L235, G236, G237, M252, I253, S254, T256, P329, A330, M428, N434, 또는 그의 조합 (여기서, 넘버링은 EU 인덱스에 따름) 중 하나 이상에서의 돌연변이, 예컨대, M428L 및 N434S ("LS"); M252Y, S254T 및 T256E ("YTE"); L234A 및 L235A ("LALA"); I253A, 및/또는 L234A, L235A, 및 P329G ("LALAP"), G236R, G237A, A330L 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 약 3 내지 약 100개의 나노케이지 단량체, 예컨대, 24, 32, 48, 또는 60개의 단량체, 또는 약 4 내지 약 200개의 나노케이지 단량체 서브유닛, 예컨대, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50개, 또는 그 초과의 것은 임의적으로 하나 이상의 전체 나노케이지 단량체와 조합하여 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성할 수 있다.
한 측면에서, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 페리틴, 아포페리틴, 엔캡슐린, SOR, 루마진 신타제, 피루베이트 데히드로게나제, 카르복시좀, 볼트 단백질, GroEL, 열 충격 단백질, E2P, MS2 외피 단백질, 그의 단편, 및 그의 변이체로부터 선택된다.
한 측면에서, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 아포페리틴, 임의적으로, 인간 아포페리틴이다
한 측면에서, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 아포페리틴 경쇄, 임의적으로, 인간 아포페리틴 경쇄이다.
한 측면에서, 융합 단백질은 제1 아포페리틴 서브유닛, 임의적으로, 제1 인간 아포페리틴 서브유닛을 포함하고, 여기서 제1 아포페리틴 서브유닛은 제2 아포페리틴 서브유닛과 자기 어셈블리할 수 있다.
한 측면에서, 제1 및 제2 아포페리틴 단량체 서브유닛은 상호교환적으로 아포페리틴의 "N" 및 "C" 영역을 포함한다.
한 측면에서, 아포페리틴의 "N" 영역은
Figure pct00013
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에서, 아포페리틴의 "C" 영역은
Figure pct00014
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에서, scFc 단편 및/또는 생체활성 모이어티는 링커를 통해 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
한 측면에서, 링커는 가요성 또는 강성이고, 약 1 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 70개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 8 내지 약 16개의 아미노산 잔기를 포함한다.
한 측면에서, 링커는 GS 도메인을 포함한다.
한 측면에서, GS 도메인은 GS 반복부, GGS 반복부, GGGS 반복부, 및/또는 GGGGS 반복부, 예컨대, 1, 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 GGGGS 반복부를 포함한다.
한 측면에서, 링커는
Figure pct00015
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에서, 링커는
Figure pct00016
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 측면에 따라, 본원에 기술된 적어도 하나의 융합 단백질 및 융합 단백질과 자기 어셈블리하는 적어도 하나의 제2 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 나노케이지를 제공한다.
한 측면에서, 융합 단백질은 제1 나노케이지 단량체 서브유닛을 포함하고, 제2 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 제2 나노케이지 단량체 서브유닛이고, 제2 나노케이지 단량체 서브유닛은 융합 단백질과 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성한다.
한 측면에서, 각 나노케이지 단량체는 본원에 기술된 융합 단백질을 구성한다.
한 측면에서, 약 1% 내지 약 100%, 예컨대, 약 1%, 4%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 내지 약 4%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%, 예컨대, 약 20% 내지 약 80%의 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 본원에 기술된 융합 단백질을 구성한다.
한 측면에서, 나노케이지는 1개의 생체활성 모이어티 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 생체활성 모이어티, 예컨대, 2 또는 3개의 상이한 생체활성 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 다가이다.
한 측면에서, 나노케이지는 다중특이적이다.
한 측면에서, 적어도 하나의 생체활성 모이어티는 나노케이지의 외부 표면을 장식하고, 적어도 하나의 scFc 단편은 나노케이지의 외부 표면을 장식한다.
한 측면에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 생체활성 모이어티는 나노케이지의 외부 표면을 장식하고, 적어도 2개의 scFc 단편은 나노케이지의 외부 표면을 장식한다.
한 측면에서, 나노케이지는 제1 항원 결합 모이어티, 예컨대, scFab에 융합된 적어도 하나의 나노케이지 단량체, 제2 항원 결합 모이어티, 예컨대, scFab에 융합된 적어도 하나의 N-서브유닛, 및 한쪽 말단에서 제3 항원 결합 모이어티, 예컨대, scFab, 및 다른 한쪽 말단에서 scFc 단편에 융합된 적어도 하나의 C-서브유닛을 포함한다.
한 측면에서, 각 항원 결합 모이어티는 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N-말단에 연결되고, 여기서 scFc 단편은 C-서브유닛의 C-말단에 연결된다.
한 측면에서, 항원 결합 모이어티는 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것이다.
한 측면에서, 각 항원 결합 모이어티는 상이한 HIV-1 특이적 Fab이다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 Fab는 BG505 SOSIP D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합한다.
한 측면에서, HIV-1 특이적 Fab는 PGDM1400, 10E8v4, 및/또는 N49P7을 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 PGDM1400, 10E8v4, 및 N49P7을 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 항원 결합 모이어티를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 Fc 단량체를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 카고 분자, 예컨대, 약제, 진단제, 및/또는 영상화제를 보유한다.
한 측면에서, 카고 분자는 융합 단백질에 융합되지 않고, 나노케이지 내부에 함유되거나, 또는 여기서 카고 분자는 융합 단백질에 연결되거나, 또는 내부적으로 또는 외부적으로 나노케이지에 결합된다.
한 측면에서, 카고 분자는 단백질이고, 카고 분자가 나노케이지 내부에 함유되도록 융합 단백질에 융합된다.
한 측면에서, 카고 분자는 형광 단백질, 예컨대, GFP, EGFP, 아메트린, 및/또는 플라빈 기반 형광 단백질, 예컨대, LOV-단백질, 예컨대, iLOV를 포함한다.
한 측면에서, 나노케이지는 범-바이러스 중화 범위를 나타낸다.
한 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 0.1 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.01 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.001 ug/mL 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
한 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 42 pM 미만, 예컨대, 약 4.2 pM 미만, 예컨대, 약 0.42 pM 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
한 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 질량 및/또는 몰 기준으로 상응하는 bNAb의 칵테일보다 적어도 약 10, 적어도 약 100, 적어도 약 1000, 적어도 약 10,000, 또는 적어도 약 100,000 더 강력한 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
한 측면에서, 본원에 기술된 나노케이지를 포함하는 치료 또는 예방 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 조성물은 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태의 치료 및/또는 예방용이다.
한 측면에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것이다.
한 측면에서, 조성물은 HIV-1 치료 및/또는 예방용이다.
한 측면에 따라, 본원에 기술된 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에 따라, 본원에 기술된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
한 측면에 따라, 본원에 기술된 벡터를 포함하고, 본원에 기술된 융합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 제공한다.
한 측면에 따라, 본원에 기술된 나노케이지 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 병태는 HIV-1이다.
한 측면에 따라, 병태의 치료 및/또는 예방을 위한 본원에 기술된 나노케이지 또는 조성물의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 병태는 HIV-1이다.
한 측면에서, 용도는 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 것이다.
한 측면에서, 병태는 HIV-1이다.
본 발명의 신규한 특징은 본 발명의 하기 상세한 설명을 검토함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범주 내에서 다양한 변경 및 수정이 본 발명의 상세한 설명 및 뒤따르는 청구범위로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이므로 본 발명의 상세한 설명 및 제시된 구체적 예들은 본 발명의 소정 측면을 나타내면서 단지 예시 목적으로만 제공된 것임을 이해하여야 한다.
본 발명은 도면을 참조하여 하기 설명으로부터 추가로 이해될 것이며, 여기서:
도 1. HIV-1 bNAb 다량체화는 중화 효능 증가를 유도한다. (a) 아포페리틴 (24개의 서브유닛) 및 (b) 단일 쇄 Fab-아포페리틴 융합체의 자기 어셈블리의 개략도. Fab 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)는 각각 옅은 분홍색 및 진한 분홍색으로 제시되어 있고, GGS 유사 유연한 링커 (어두운 색)를 통해 인간 아포페리틴 (회색)의 경쇄의 N 말단에 연결된다. (c) 인간 아포페리틴 상에 디스플레이된 상이한 Fab 밀도를 나타낸 개략도. scFab-인간 아포페리틴 코딩 플라스미드를 비접합 아포페리틴과 함께 1:4 (진한 노랑색), 1:1 (검은색), 4:1 (파란색) 및 1:0 (빨간색)의 비로 공동 형질감염시킨 결과, 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에서 더 이른 용출 부피 및 더 적은 비접합 아포페리틴에 의해 확인된 바와 같이, scFab 결합가가 상이한 분자들이 생성되었다. 결합가가 가장 낮은 샘플과 가장 높은 샘플의 음성 염색 전자현미경 사진이 제시되어 있다. (d) 5-PsV 패널 (PVO.04, JRCSF, BG505 T332N, THRO4156.18 및 t278-50)에 대한 5개의 bNAb의 중화에 대한 결합가 효과. 하기 경우: N49P7-t278-50, VRC01-T278-50 및 10-1074-THRO4156.18에서는 중화 저항성에 기인하여 IC50 증가 배수 분석을 생략하였다. 모체 IgG IC50 (㎍/mL)을 Fab-아포페리틴 융합체 IC50 (㎍/mL)으로 나눈 값으로 효능 증가 배수를 계산하였다. 막대 (± SD)는 n=3 생물학적 독립 샘플로부터의 평균 값을 나타낸다.
도 2. scFab-아포페리틴 융합체의 특징화. (a) scFab-아포페리틴 및 비접합 아포페리틴에 상응하는 SDS-PAGE 밴드를 ImageJ 소프트웨어 (rsb.info.nih.gov/ij/)를 이용하여 밀도계측에 의해 정량화하였다. 각 레인 중 밴드 (노란색 박스)의 강도 플롯이 제시되어 있다 (b). (c) 입자 상에 디스플레이된 scFab의 대략적 개수는 하기와 같이, scFab 밴드의 강도/전체 강도로 계산하였고, 공동 형질감염에 사용된 DNA 비로부터 도출된 이론상의 개수와 비교하였다.
도 3. 32-N 멀타바디의 디자인, 어셈블리 및 생물물리학적 특징화. (a) scFab-인간 아포페리틴 서브유닛의 이종이량체화를 선호하는 인간 아포페리틴 분할 디자인에 대한 개략도. 자기 어셈블리를 유도하는 데 필요한 이종올리고머화를 기반으로 4개 성분을 가진 멀타바디의 정제를 2-단계 정제: 단백질 A (Fc 결합) 및 단백질 L (PGDM1400 결합)에 의해 달성할 수 있다. (b) 32-N의 음성 염색 전자현미경 사진. (c) 24-mer PGDM1400 (검은색) 및 32-N 멀타바디 (진한 마젠타색)의 다각도 광산란과 일렬로 이어져 진행되는 크기 배제 크로마토그래피. 각 용출 피크의 몰 질량 (UV 흡광도 아래의 선)은 샘플이 단분산이며, 본 디자인에서 추가의 항체 단편으로 인해 멀타바디가 24-mer 포맷보다 크기가 더 크다는 것을 보여준다. (d) 32-N, 12-mer 멀타바디 및 모체 IgG의 Tm 및 Tagg 온도 비교. (e) 32-N 멀타바디의 다중 에피토프에의 결합에 대한 농도-반응 곡선. PGDM1400, N49P7 및 10E8v4 결합 부위는 각각 (회색으로) HIV Env의 표면을 나타낸 것에서 각각 빨간색, 파란색 및 분홍색 색상으로 표시되어 있다. pH 7.5 및 pH 5.6에서의 결합을 측정함으로써 Fc의 인간 FcRn에의 기능적 결합을 시험하였다. BG505 SOSIP.664_D368R 삼량체 및 93TH057 gp120 단량체를 각각 PGDM1400 및 N49P7에 대한 에피토프-특이적 리간드로서 선택하였다.
도 4. bNAb PGDM1400, 10E8v4 및 N49P7의 결합 프로파일. Ni-NTA 바이오센서에 고정화된 93TH057 gp120, BG505 SOSIP.664_D368R 및 MPER His-태그부착된 항원에 결합하는 IgG의 BLI 반응 곡선.
도 5. 14-슈도바이러스 패널에 대한 32-N 멀타바디의 중화 특성. (a) 32-N 멀타바디 (빨간색 다이아몬드 표시), 모체 bNAb (검은색 동그라미 표시) 및 IgG 조합 (파란색 삼각형 표시)의 범위 및 중간값 IC50 값 (㎍/mL). IgG 칵테일은 멀타바디 샘플에서와 같이 각 모체 항체를 함유하였다 (즉, PGDM1400, N497 및 10E8v4). 모체 IgG에 대한 감수성 및 저항성에 기초하여 14-PsV 패널을 선택하였다. (b) 각 PsV 변이체에 대한 IC50 값 (㎍/mL).
도 6. 2세대 멀타바디 버전 2 (MB.v2; 도 6 하단 참조)를 나타낸 개략도. 단일 쇄 Fc 영역 (초록색)을 분할 멀타바디 디자인에서 아포페리틴의 제2 절반의 C-말단에 융합시켰다. 이러한 변형으로 이전 버전 (MB.v1; 도 6의 상단 참조)에서 채택된 방향과 비교하여 멀타바디에서 Fc의 방향은 역전된다.
도 7. 2세대 멀타바디 버전 3 (MB.v3)의 개략도. (a) 아포페리틴 프로토머의 C-말단에 (구체적으로 페리틴의 C-절반에) 융합된 단일 쇄 Fc 영역 (초록색)은 단량체 Fc 쇄로 복귀되었다. (b) 기능성 Fc 단편의 폴딩은 아포페리틴 나노케이지의 4-폴드 대칭 축에서 2개의 독립 페리틴 서브유닛의 C-말단에 융합된 두 Fc 쇄의 동종이량체화로부터 발생한다.
도 8. 최적화된 멀타바디 버전의 특징화. (a) 32-N MB.v2 및 32-N MB.v3의 음성 염색 전자현미경 사진. 3개의 상이한 버전의 Tagg 온도 (b), 및 스트레스 온도 조건하에서의 시간 경과에 따른 안정성 (c) 비교. 가속화 열안정성 검정법 이전 및 이후의 활성 멀타바디를 평가하는 기능적 중화 검정법. 다중 에피토프 (d), 및 Fc 수용체 (e-f)에의 결합에 대한 농도-반응 곡선. Fc 반감기 연장 돌연변이 LS를 포함하는 32-N MB.v3을 본 검정법에 포함시켰다.
도 9. 32-N 멀타바디 버전 2 및 3의 중화 특성. (a) 25-PsV 패널에 대한 32-N 멀타바디 버전 (상이한 색조의 빨간색 다이아몬드 표시) 및 IgG 혼합물 (파란색 삼각형 표시)의 범위 및 중간값 IC50 값 (㎍/mL) 비교, 여기서 44%의 PsV 변이체가 PGDM1400 중화에 대해 저항성이다. 각 PsV에 대한 IC50 값 (㎍/mL)이 제시되어 있다. (b) 118개의 PsV의 확장된 멀티클레이드 패널에 대한 3개의 32-N 멀타바디 버전 뿐만 아니라, 모체 IgG 및 IgG 혼합물을 그램 양 및 몰량으로 비교하는 효능-범위 곡선.
도 10. 면역결핍 마우스에서의 32-N 멀타바디 v3의 생체내 노출. 암컷 NOD/Shi-scid/IL-2Rγ널 면역결핍 마우스 계통 (NCG) 마우스를 군당 3마리씩 이용하여 Fc 변형된 (LS 돌연변이) 32-N MB.v3 및 비교를 위한 모체 IgG 혼합물을 5 mg/kg으로 피하 투여한 후, 혈중 멀타바디 순환을 평가하였다.
특정 측면의 상세한 설명
본원에서는 복수의 자기 어셈블링 나노케이지 단량체로부터 형성된 나노케이지 플랫폼을 기술한다. 이는 "멀타바디" 플랫폼으로 명명하고, 예컨대, 이는 나노케이지 내의 융합된 분자의 개수 또는 비를 제어함으로써 나노케이지의 결합 및 약동학적 특징의 조정을 허용한다.
나노케이지의 각 단량체는 있는 그대로 독립적으로 발현될 수 있거나, 또는 또 다른 모이어티, 예컨대, scFc 단편 또는 Fc 단량체에 융합될 수 있다. 생체활성 모이어티, 예컨대, 항체 또는 그의 단편, 예컨대, Fab 단편 또한 다가 및/또는 다중특이적인 나노케이지를 생성하기 위해 하나 이상의 또는 모든 단량체에 융합될 수 있다. 추가로, 각각의 단량체는 서브유닛으로 독립적으로 분할될 수 있고, 이로써, 각각의 서브유닛은 단량체의 대략 절반부를 포함하고, scFc 단편, Fc 단량체, 및/또는 생체활성 모이어티에 대한 추가 수준 또는 제어 및 디스플레이 소스를 제공한다.
여기서 Fc 단량체 또는 scFc 단편과 조합된 멀타바디 플랫폼에서의 HIV-1-표적화 Fab의 다량체화가 HIV-1 바이러스를 중화시킬 수 있는 능력을 유의적으로 더 크게 증가시킨다는 것을 입증한다. 본원에서 입증된 바와 같이, 멀타바디의 증가된 효능 및 범-중화 능력은 단순히 1:1 비로 증가되지 않고, 여기서 원자가가 배가 되면 효능이 배가된다. 대신, 효능은 측면에서 시너지적으로 적어도 10배만큼 및 측면에서 그보다 훨씬 더 크게 증가된다. 본 조작된 분자의 치료 가능성은 MB 효능을 유도하는 Fab 특이성에 대해 및 118개의 PsV의 확장된 멀티클레이드 패널에 대해 내성을 나타내는 44%의 PsV 변이체를 포함하는 25-PsV 패널을 사용하여 입증되었다.
정의
달리 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 분자 생물학에서의 일반 용어의 정의는 예컨대, 문헌 [Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 살펴볼 수 있다. 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용될 수 있지만, 전형적인 물질 및 방법이 본원에 기술되어 있다. 본 발명을 기술하고, 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
또한, 본원에서 사용된 용어는 오직 특정 측면을 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다. 다수의 특허 출원, 특허 및 공개문헌이 설명된 측면을 이해하는 데 도움이 되도록 본원에서 참조된다. 이들 참고문헌들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
본 출원의 범주를 이해함에 있어서, 단수 형태 "하나" 및 "상기"는 하나 이상의 요소가 있다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 추가로, 본원에서 사용된, "포함하는"이라는 용어 및 그 파생어는 언급된 특징, 요소, 성분, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 명시하는 개방형 용어로 의도되었지만, 언급되지 않은 다른 특징, 요소, 성분, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 배제하지 않는다. 상기 내용은 예컨대, "포함하는(including)," "갖는" 및 그의 파생어와 같이 유사한 의미를 갖는 단어에도 적용된다.
특정 성분을 "포함하는" 것으로 기술된 임의의 측면은 또한 "~로 이루어진" 또는 "본질적으로 ~로 이루어진"일 수 있고, 여기서 "~로 이루어진"은 폐쇄형이거나, 또는 제한적인 의미를 갖고, "본질적으로 ~로 이루어진"은 언급된 성분을 포함하되, 불순물로 존재하는 물질, 성분을 제공하는 데 사용된 프로세스의 결과로서 존재하는 불가피한 물질, 및 본 발명의 기술적 효과를 달성하는 것 외에 다른 목적으로 첨가된 성분을 제외한 다른 성분은 배제시킨다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 어구로 정의된 조성물은 임의의 공지된 허용가능한 첨가제, 부형제, 희석제, 담체 등을 포함한다. 전형적으로, 본질적으로 성분들의 세트로 이루어진 조성물은 언급되지 않은 성분(들)은 5중량% 미만, 전형적으로, 3중량% 미만, 더욱 전형적으로, 1중량% 미만, 더욱더 전형적으로, 0.1중량% 미만으로 포함할 것이다.
본원에서 포함된 것으로 정의된 임의의 성분은 단서 또는 부정적인 제한을 통해 청구된 발명에서 명시적으로 제외될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본원에 기술된 나노케이지 및/또는 융합 단백질은 페리틴 중쇄를 배제할 수 있고/거나, 철-결합 성분을 배제할 수 있다.
추가로, 본원에 제공된 모든 범위는 범위의 끝, 및 명시적으로 언급되었는지 여부에 관계없이 임의의 중간 범위 지점 또한 포함한다.
본원에서 사용된, 예컨대, "실질적으로," "약" 및 "대략"과 같은 정도의 용어는 최종 결과가 크게 변경되지 않을 정도로 수식된 용어의 합리적인 양의 편차를 의미한다. 상기 정도의 용어는 상기 편차가 수식하는 단어의 의미를 부정하지 않는 경우, 수식된 용어의 적어도 ±5%의 편차를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
"예컨대(e.g.)"라는 약어는 라틴어 (exempli gratia)에서 파생되었으며, 본원에서 비제한적인 예를 명시하는 데 사용된다. 따라서, "예컨대(e.g.)"라는 약어는 "예를 들어," 또는 "예컨대(such as)"라는 용어와 동의어이다. "또는"이라는 단어는 문맥상 달리 명시하지 않는 한, "및"을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된, "대상체"라는 용어는 동물계의 임의의 구성원, 전형적으로, 포유동물을 지칭한다. "포유동물"이라는 용어는 인간, 다른 고등 영장류, 가축 및 농장 동물, 동물원, 스포츠 또는 애완 동물을 포함한 포유동물로 분류된 임의의 동물, 예컨대, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 지칭한다. 전형적으로 포유동물은 인간이다.
용어 "단백질 나노입자," "나노케이지" 및 "멀타바디"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 복수의 나노케이지 단량체로부터 제조된, 단백질 기반 다면체 형상의 구조를 지칭한다. 이러한 나노케이지 단량체, 또는 그의 서브유닛은 각각 단백질 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 글리코실화된 폴리펩티드)로 구성되며, 임의적으로, 하기: 핵산, 보결 분자단, 유기 및 무기 화합물의 단일 또는 다중 특징으로 구성된다. 단백질 나노입자의 비제한적 예로는 페리틴 나노입자 (예컨대, 문헌 [Zhang, Y. Int. J. Mol. Sci., 12:5406-5421, 2011] (본원에서 참조로 포함) 참조), 엔캡슐린 나노입자 (예컨대, 문헌 [Sutter et al., Nature Struct, and Mol. Biol., 15:939-947, 2008] (본원에서 참조로 포함) 참조), 황 옥시게나제 리덕타제 (SOR) 나노입자 (예컨대, 문헌 [Urich et al., Science, 311 :996-1000, 2006] (본원에서 참조로 포함) 참조), 루마진 신타제 나노입자 (예컨대, 문헌 [Zhang et al., J. Mol. Biol., 306: 1099-1114, 2001] 참조) 또는 피루베이트 데히드로게나제 나노입자 (예컨대, 문헌 [Izard et al., PNAS 96: 1240-1245, 1999] (본원에서 참조로 포함) 참조)를 포함한다. 페리틴, 아포페리틴, 엔캡슐린, SOR, 루마진 신타제, 및 피루베이트 데히드로게나제는 일부 경우에서, 각각 24, 60, 24, 60 및 60개의 단백질 서브유닛으로 이루어진 구형 단백질 복합체로 자기 어셈블리하는 단량체 단백질이다. 페리틴 및 아포페리틴은 일반적으로 본원에서 상호교환적으로 지칭되며, 둘 모두 본원에 기술된 융합 단백질, 나노케이지 및 방법에 사용하기에 적합한 것으로 이해된다. 카르복시좀, 볼트 단백질, GroEL, 열 충격 단백질, E2P 및 MS2 외피 단백질 또한 나노케이지를 생성하고, 본원에서 사용하기 위해 고려된다. 추가로, 완전 또는 부분 합성된 자기 어셈블리 단량체 또한 본원에서 사용하기 위해 고려된다.
각 나노케이지 단량체는 2개 이상의 서브유닛으로 분할될 수 있고, 이 서브유닛은 기능성 나노케이지 단량체로 자기 어셈블리할 것이라는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 페리틴 또는 아포페리틴은 N- 및 C-서브유닛, 예컨대, 전장 페리틴을 실질적으로 절반으로 분할함으로써 수득되는 N- 및 C-서브유닛으로 분할될 수 있고, 이로써, 각 서브유닛은 나노케이지 단량체 및 나노케이지로의 후속 자기 어셈블리를 위해 상이한 scFc 단편 또는 Fc 단량체 또는 생체활성 모이어티 (예컨대, Fab 단편)에 별개로 결합될 수 있다. 측면에서, 각각의 서브유닛은 동일하거나 또는 상이한 두 말단에서 scFc 및/또는 Fc 단량체 및/또는 생체활성 모이어티에 연결될 수 있다. "기능성 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛"이란, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 상보적인 단량체 또는 서브유닛과 함께 본원에 기술된 바와 같이 나노케이지로 자기 어셈블리할 수 있다는 것으로 의도된다.
용어 "페리틴" 및 "아포페리틴"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 일반적으로, 전형적으로 24개의 단백질 서브유닛을 포함하는 페리틴 복합체로 어셈블리할 수 있는 폴리펩티드 (예컨대, 페리틴 쇄)를 지칭한다. 페리틴은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 전형적으로, 페리틴은 인간 페리틴이다. 일부 실시양태에서, 페리틴은 야생형 페리틴이다. 예를 들어, 페리틴은 야생형 인간 페리틴일 수 있다. 일부 실시양태에서, 페리틴 경쇄는 나노케이지 단량체로서 사용되고/거나, 페리틴 경쇄의 서브유닛은 나노케이지 단량체 서브유닛으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 어셈블리된 나노케이지는 철에 결합할 수 있는 임의의 페리틴 중쇄 또는 다른 페리틴 성분을 포함하지 않는다.
본원에서 사용된, "다중특이적"이라는 용어는 적어도 2개의 상이한 결합 파트너, 예컨대, 항원 또는 수용체 (예컨대, Fc 수용체)가 결합할 수 있는 적어도 2개의 결합 부위를 갖는 특징을 지칭한다. 예를 들어, 2개의 Fab 단편이 각각 상이한 항원에 결합하는 적어도 2개의 Fab 단편을 포함하는 나노케이지는 "다중특이적"이다. 추가 예로서, (Fc 수용체에 결합할 수 있는) Fc 단편 및 (항원에 결합할 수 있는) Fab 단편을 포함하는 나노케이지는 "다중특이적"이다.
본원에서 사용된, 용어 "다가"는 결합 파트너, 예컨대, 항원 또는 수용체 (예컨대, Fc 수용체)가 결합할 수 있는 적어도 2개의 결합 부위를 갖는 특징을 지칭한다. 적어도 2개의 결합 부위에 결합할 수 있는 결합 파트너는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
관련 기술분야에서 "면역글로불린" (Ig)으로도 지칭되는, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 쌍을 형성한 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드로부터 구성된 단백질을 지칭하고; IgA, IgD, IgE, IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 및 IgM을 포함하는 다양한 Ig 이소타입이 존재한다. 항체는 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 라마 또는 상어를 포함하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 항체가 올바르게 폴딩될 때, 각 쇄는 더 많은 선형 폴리펩티드 서열에 의해 연결된 다수의 별개의 구형 도메인으로 폴딩된다. 예를 들어, IgG의 경우, 면역글로불린 경쇄는 가변 (VL) 및 불변 (CL) 도메인으로 폴딩되는 반면, 중쇄는 가변 (VH) 도메인 및 3개의 불변 (CH, CH2, CH3) 도메인으로 폴딩된다. 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인 (VH 및 VL)의 상호작용을 통해 항원 결합 영역 (Fv)이 형성된다. 각 도메인은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙한 잘 확립된 구조를 갖는다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은 표적 항원에 결합하는 역할을 하고, 따라서, 항체들 간에 상당한 서열 다양성을 나타낼 수 있다. 불변 영역은 더 적은 서열 다양성을 나타내고, 다수의 천연 단백질을 결합시켜 중요한 면역학적 이벤트를 일으키는 역할을 한다. 항체의 가변 영역은 분자의 항원 결합 결정기를 포함하며, 그의 표적 항원에 대한 항체의 특이성을 결정한다. 대부분의 서열 가변성은 가변 중쇄 및 경쇄마다 각각 3개씩, 6개의 초가변 영역에서 발생하고; 초가변 영역들은 결합하여 항원 결합 부위를 형성하고, 항원 결정기의 결합 및 인식에 기여한다. 그의 항원에 대한 항체의 특이성 및 친화성은 초가변 영역의 구조 뿐만 아니라, 그의 크기, 형상 및 이들이 항원에 제시하는 표면의 화학에 의해 결정된다.
본원에서 지칭되는 "항체 단편"은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 항원 결합 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편은 자연적으로 발생된 항체 단편일 수 있거나, 또는 자연적으로 발생된 항체의 조작에 의해 또는 재조합 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 Fv, 단일 쇄 Fv (scFv; 펩티드 링커로 연결된 VL 및 VH로 이루어진 분자), Fc, 단일 쇄 Fc (예컨대, 예컨대, 링커 예컨대, 아미노산 링커를 통해 함께 연결된 2개의 Fc 단량체를 포함하는 폴리펩티드), Fc 단량체 (예컨대, 정확하게 1개의 CH2 도메인 및 정확하게 1개의 CH3 도메인을 포함하는 단일 Fc 쇄, 이는 전형적으로 또 다른 Fc 단량체와 함께 이량체화할 수 있다), Fab, 단일 쇄 Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체 (sdAb; 단일 VL 또는 VH로 구성된 단편) 및 이들 중 임의의 것의 다가 제시를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된, "항원 결합 모이어티"는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 일부분을 지칭한다.
본원에서 사용된, "합성 항체"라는 용어는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한 항체를 코딩하는 DNA 분자로서 항체 단백질을 발현하는 DNA 분자, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 관련 기술분야에서 이용가능하고, 널리 공지되어 있는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득되었다.
본원에서 사용된, "항체-예방가능" 및 "항체-치료가능" 병태라는 어구는 일반적으로 적어도 하나의 항원의 발현 또는 존재와 연관된 것으로 알려진 병태를 지칭한다. 예를 들어, 감염성 질환의 맥락에서, 항원은 감염성 질환 인자에 대한 항원일 수 있고/거나, 항원은 감염된 세포에 의해 발현될 수 있고/거나, 항원은 감염에 대한 면역 반응에 관여하는 세포에 의해 발현될 수 있다. "항체-예방가능 병태"는 일반적으로 항체를 이용하여 병태가 확립되는 것을 방지할 수 있는 것인 병태이다. "항체-치료가능 병태"는 일반적으로 항체를 이용하여 확립된 병태를 치료할 수 있는 것인 병태이다.
용어 "에피토프"는 항원 결정기를 지칭한다. 에피토프는 항원성인, 즉, 특정 면역 반응을 유발하는 분자 상의 특정 화학 기 또는 펩티드 서열이다. 항체는 예컨대, 폴리펩티드 상의 특정 항원 에피토프에 특이적으로 결합한다. 에피토프는 단백질의 3차원 폴딩에 의해 병치된 인접한 아미노산 또는 비인접한 아미노산, 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출되었을 때 유지되는 반면, 3차원 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 고유한 공간적 입체형태에 적어도 3개, 더욱 일반적으로, 적어도 5, 약 9, 약 11, 또는 약 8 내지 약 12개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 예를 들어, X-선 결정학 및 2차원 핵자기 공명을 포함한다. 예컨대, 문헌 [Epitope Mapping Protocols" in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)]을 참조한다.
본원에서 사용된, 용어 "항원"은 면역 반응을 유발하는 분자로서 정의된다. 상기 면역 반응은 항체 생산 또는 특정 면역학적 적격 세포의 활성화, 또는 그 둘 모두를 포함할 수 있다. 통상의 기술자라면 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로서 작용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 추가로, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 통상의 기술자는 면역 반응을 유발하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA라면, 그 용어가 본원에서 사용될 때 "항원"을 코딩하는 것임을 이해할 것이다. 추가로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 본원에 기술된 측면이 하나 초과의 유전자의 부분적 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하나, 이에 제한되지 않고, 이들 뉴클레오티드 서열이 원하는 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 배열될 수 있다는 것이 쉽게 명백하다. 더욱이, 통상의 기술자라면, 항원이 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원은 합성될 수 있거나, 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다는 것은 쉽게 명백하다. 상기 생물학적 샘플은 조직 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
"코딩하는"이란, 정의된 뉴클레오티드 서열 (예컨대, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서의 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 역할을 하는, 예컨대, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내의 특정 뉴클레오티드 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역에 의해 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질이 생성된다면, 유전자는 단백질을 코딩하는 것이다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고, 일반적으로 서열목록에 제공되는 것인 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥, 둘 모두, 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "발현"은 그의 프로모터에 의해 구동되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.
본원에서 사용된, "HIV-1-관련 병태"라는 어구는 HIV-1 감염 (1차 감염, 잠복 감염 포함) 병태 및/또는 HIV-1 감염으로 인해 발생된 상태 (예컨대, 후천성 면역결핍 증후군)를 지칭한다.
"단리된"이란, 자연 상태로부터 변경되거나, 또는제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니고, 그의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어, 숙주 세포와 같은 비천연 환경에 존재할 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전이며, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도까지 인트론을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된, "조정하는"이라는 용어는 치료 또는 화합물의 부재 하의 대상체의 반응 수준과 비교하여, 및/또는 다른 것은 동일하되, 비처리된 대상체의 반응 수준과 비교하여, 대상체의 반응 수준의 검출가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 상기 용어는 본래의 신호 또는 반응을 교란하고/거나, 그에 영향을 줌으로써 대상체, 전형적으로, 인간에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포함한다.
"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 이종성 핵산 서열의 발현을 초래하는, 조절 서열과 이종성 핵산 서열 간의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 놓인 경우, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접해 있고, 필요에 따라, 동일한 리딩 프레임 내에서 2개의 단백질 코딩 영역을 연결한다.
조성물의 "비경구" 투여는 예컨대, 피하 (s.c.), 정맥내 (i.v.), 근육내 (i.m.) 또는 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 흡입 및 비내 투여 또한 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 쇄로서 정의된다. 추가로, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본원에서 사용된, 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호교환가능하다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 핵산이 단량체 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반적인 지식을 가지고 있다. 단량체 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에서 사용된, 폴리뉴클레오티드는 제한 없이, 재조합 수단, 즉, 통상적인 클로닝 기술 및 PCR 등을 이용한 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터의 핵산 서열의 클로닝을 포함하나, 이에 제한되지 않는 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 수단에 의해, 및 합성 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "펩티드," "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 구성할 수 있는 최대 아미노산 개수에는 제한이 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용된, 상기 용어는, 예를 들어, 관련 기술분야에서 일반적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 지칭되는 짧은 쇄, 및 관련 기술분야에서 일반적으로 단백질로 지칭되는 더욱 긴 쇄 둘 모두를 지칭하며, 단백질에는 많은 유형이 있다. "폴리펩티드"는 예를 들어, 그 중에서도 특히, 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드 또는 그의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된, 항체와 관련하여 "특이적으로 결합한다"라는 용어는 특이적 항원을 인식하지만, 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않거나, 그에 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들어, 하나의 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 종으로부터의 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 상기 종간 반응성은 그 자체가 특이적인 것으로서 항체의 분류를 변경하지는 않는다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원의 상이한 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 상기 교차 반응성 자체는 특이적인 것으로서 항체의 분류를 변경하지 않는다. 일부 경우에, "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"이라는 용어는 항체, 단백질 또는 펩티드와 제2 화학 종과의 상호작용과 관련하여 상호작용이 화학 종 상의 특정 구조 (예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미하는 것으로 사용될 수 있고; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A (또는 유리, 비표지 A)를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본원에서 사용된, 병태 (예컨대, 본원에 기술된 병태, 예컨대, 예컨대, HIV-1)를 "치료하는" 또는 상기 병태의 "치료"란, 예컨대, 임상 결과와 같은 유익하거나, 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 유익하거나, 또는 원하는 결과로는 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 호전; 질환, 장애, 또는 병태 정도 감소; 질환, 장애, 또는 병태 안정화 (즉, 악화되지 않음); 질환, 장애, 또는 병태 확산 방지; 질환, 장애, 또는 병태의 진행을 지연 또는 저속화; 질환, 장애, 또는 병태의 호전 또는 완화; 및 검출가능 여부와 상관없이, (부분 관해이든 또는 완전 관해이든) 관해를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 질환, 장애, 또는 병태를 "완화시키는"이란, 치료 부재하의 정도 또는 시간 과정과 비교하여, 질환, 장애, 또는 병태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 소견이 감소되고/거나, 진행의 시간 과정은 저속화되거나, 또는 길어지는 것을 의미한다. 본원에서 사용된, 용어 "예방" 또는 "방지"는 질환 또는 장애, 예를 들어, 예컨대, HIV-1을 앓거나, 또는 그가 발병할 위험의 감소, 또는 질환 또는 장애, 예를 들어, 예컨대, HIV-1의 재발 감소 또는 억제를 지칭한다. 따라서, HIV-1 치료 또는 예방 조성물은 대상체에게 투여되었을 때, HIV-1을 치료 및/또는 예방할 수 있는, 본원에 기술된 바와 같은 어셈블리된 나노케이지, 또는 나노케이지로 어셈블리할 수 있는, 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질을 포함하는 조성물을 지칭한다.
용어 "치료 유효량," "유효량" 또는 "충분한 양"은 포유동물, 예를 들어, 인간을 포함하는 대상체에게 투여될 때, 원하는 결과를 달성하는 데 충분한 양, 예를 들어, 세포 사멸을 유발하는 데 유효한 양을 의미한다. 본원에 기술된 화합물의 유효량은 예컨대, 분자, 대상체의 연령, 성별 및 체중과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 최적의 치료 반응을 달성하기 위해 투여량 또는 치료 요법이 조정될 수 있다. 예를 들어, 치료 유효량의, 본원에 기술된 융합 단백질의 투여는 측면에서, HIV-1을 치료 및/또는 예방하는 데 충분하다. 더욱이, 치료 유효량을 이용한 대상체의 치료 요법은 단일 투여로 이루어질 수 있거나, 또는 대안적으로 연속 적용을 포함할 수 있다. 치료 빈도 및 치료 기간의 길이는 예컨대, 분자, 대상체의 연령, 작용제의 농도, 작용제에 대한 환자의 반응성, 또는 그의 조합과 같은 다양한 인자에 의존한다. 또한, 치료에 사용되는 작용제의 유효 투여량은 특정 치료 요법의 과정에 걸쳐 증가 또는 감소할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 투여량 변화는 일어날 수 있고, 관련 기술분야에 공지된 표준 검정 분석에 의해 명백해질 수 있다. 본원에 기술된 융합 단백질은, 측면에서, 해당 질환 또는 장애에 대한 통상적인 요법에 의한 치료 전, 그 동안 또는 그 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 융합 단백질은 특별히 통상의 HIV-1 치료법과 조합하여 사용될 수 있다.
본원에서 사용된, "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"이라는 용어는 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나, 또는 도입되는 프로세스를 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 1차 대상 세포 및 그의 자손을 포함한다.
본원에서 사용된, "전사 제어하에" 또는 "작동적으로 연결된"이라는 어구는 프로모터가 RNA 폴리머라제에 의한 전사의 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하기 위해 폴리뉴클레오티드와 관련하여 올바른 위치에 올바른 배향으로 있다는 것을 의미한다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고, 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는 수많은 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포솜 등과 같은, 세포 내로의 핵산 전달을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
하나 이상의 추가 치료제"와 조합된" 투여는 동시 (공동) 투여 및 임의의 순서로 연속 투여를 포함한다.
"제약상 허용되는"이라는 용어는 화합물 또는 화합물들의 조합이 제약용 제제의 나머지 성분과 양립할 수 있고, 미국 식품의약국(United States Food and Drug Administration)에 의해 공포된 표준을 포함하는 확립된 정부 표준에 따라 인간에게 투여하는 것이 일반적으로 안전하다는 것을 의미한다.
용어 "제약상 허용되는 담체"는 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제, 항진균제, 등장제 및/또는 흡수 지연제 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 제약상 허용되는 담체의 용도는 널리 공지되어 있다.
"변이체"는 비교 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 변형 및/또는 치환에 의해 비교 기준 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 생물학적으로 활성인 융합 단백질, 항체 또는 그의 단편이다. 변이체는 일반적으로 비교 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 그러나, 일반적으로, 생물학적으로 활성인 변이체는 비교 서열과 적어도 약 70%의 아미노산 서열 동일성, 예컨대, 적어도 약 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 변이체는 비교 기준 서열의 생물학적 활성의 일부 수준을 보유하는 적어도 10개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 단편을 포함한다. 또한, 변이체는 비교 서열의 N- 또는 C-말단에 또는 비교 서열 내에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가된 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 또한 다수의 아미노산 잔기가 결실되고/거나, 임의적으로, 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환된 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 또한 예를 들어, 자연적으로 발생된 아미노산 이외의 모이어티로의 치환에 의해 또는 비-자연적으로 발생된 아미노산을 생성하도록 아미노산 잔기를 변형시킴으로써 공유적으로 변형될 수 있다.
본원에서 "아미노산 서열 동일성(%)"은 최대 서열 동일성(%)을 달성하도록 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭을 도입한 후, 및 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않으면서, 예컨대, 본 발명의 폴리펩티드와 같은, 관심 서열 중 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 비율(%)로서 정의된다. 후보 서열 내로의 N-말단, C-말단 또는 내부 연장, 결실 또는 삽입 중 어느 것도 서열의 동일성 또는 상동성에 영향을 주는 것으로 해석되지 않는다. 예컨대, "BLAST"와 같은 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본원의 목적상 "활성인" 또는 "활성"은 본원에 기술된 융합 단백질의 생물학적 활성 및/또는 면역학적 활성을 지칭하며, 여기서 "생물학적" 활성은 융합 단백질에 의해 유발되는 생물학적 기능 (억제성 또는 자극성)을 지칭한다.
본원에 기술된 융합 단백질은 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 이펙터 분자에의 접합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 변형은 추가로 검출가능한 리포터 모이어티에의 접합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 반감기를 연장시키는 변형 (예컨대, 페길화) 또한 포함된다. 탈면역화를 위한 변형 또한 포함된다. 단백질 및 비단백질 작용제는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 융합 단백질에 접합될 수 있다. 접합 방법은 직접 결합, 공유 부착된 링커를 통한 결합, 및 특이적 결합 쌍 구성원 (예컨대, 아비딘-비오틴)를 포함한다. 상기 방법은 예를 들어, 문헌 [Greenfield et al., Cancer Research 50, 6600-6607 (1990)] (본 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 것 및 문헌 [Amon et al., Adv. Exp. Med. Biol. 303, 79-90 (1991)] 및 문헌 [Kiseleva et al., MoI. Biol. (USSR)25, 508-514 (1991)] (이 두 문헌 모두 본원에서 참조로 포함된다)에 의해 기술된 것을 포함한다.
Fc 단량체를 포함하는 융합 단백질
본원에서는 융합 단백질을 기술한다. 측면에서, 융합 단백질은 Fc 단량체에 연결된 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하고, 여기서 복수의 융합 단백질은 자기 어셈블리하여 하나 이상의 Fc 이량체를 포함하는 나노케이지를 형성한다. 이러한 방식으로, 어셈블리된 하나 이상의 Fc 이량체는 어셈블리된 나노케이지의 내부 표면, 어셈블리된 나노케이지의 외부 표면, 또는 둘 모두를 장식할 수 있다. 일부 실시양태에서, 어셈블리된 하나 이상의 Fc 이량체는 어셈블리된 나노케이지의 외부 표면을 장식한다. Fc 이량체를 단량체 성분으로 나누면 나노케이지 디자인에서 추가적인 제어가 가능하다. Fc 단량체는 나노케이지를 어셈블리하는 데 도움이 되며, 예컨대, 생체활성 모이어티와 같은 다른 연결된 성분의 비를 더 엄격하게 제어하는 데 도움이 될 것이다.
일부 측면에서, 나노케이지 단량체 서브유닛이 융합 단백질에서 전체 나노케이지 단량체 대신 사용된다. 나노케이지 단량체는 2개 부분으로 나뉠 수 있고, 그 중 하나는 "N-서브유닛"으로 지칭되는, 나노케이지 단량체의 N-말단 단부를 포함하고, 그 중 나머지 다른 하나는 "C-서브유닛"으로 지칭되는, 나노케이지 단량체의 C-말단 단부를 포함한다. N- 또는 C-서브유닛은 각각 실질적으로 나노케이지 단량체의 절반을 나타낼 수 있거나, 또는 불균등하게 분할될 수 있다. 전형적으로, N-서브유닛 및 C-서브유닛은 실질적으로 각각 나노케이지 단량체의 N-말단 절반 및 나노케이지 단량체의 C-말단 절반에 상응한다. N-서브유닛 및 C-서브유닛은 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성할 수 있고, 이는 그 자체가 자기 어셈블리하여 상기 기술된 바와 같은 나노케이지를 형성할 수 있다.
각각의 나노케이지 단량체 및 각각의 N- 및 C-서브유닛은 N-말단 및 C-말단을 포함하는 것으로 이해될 것이다. Fc 단량체는 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에서 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결될 수 있다. 전형적으로, Fc 단량체는 C-말단에서 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다. 유사하게, Fc 단량체는 N-서브유닛 및/또는 C-서브유닛의 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에 연결될 수 있다. 전형적으로, Fc 단량체는 C-말단에서 C-서브유닛에 연결된다.
전형적인 측면에서, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 생체활성 모이어티에 추가로 연결된다. Fc 단량체와 같이, 생체활성 모이어티는 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N- 또는 C-말단에서 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결될 수 있고, 전형적으로 N-말단에서 연결된다. 나노케이지 단량체 서브유닛이 사용되는 경우, 생체활성 모이어티는 유사하게 어느 한쪽 말단에서, 전형적으로 Fc 단량체의 반대쪽 말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결될 수 있다. 전형적으로, 생체활성 모이어티는 N-말단에서 C-서브유닛에 연결된다.
항원 결합 모이어티는 어셈블리된 나노케이지의 내부 및/또는 외부 표면을 장식하도록, 전형적으로 어셈블리된 나노케이지의 외부 표면을 장식하도록 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
생체활성 모이어티는 전형적으로 항원성 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편이다. 항체 또는 그의 단편은 예를 들어, Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 항체 또는 그의 단편은 예를 들어, Fab (예컨대, scFab) 단편, scFv 단편, sdAb 단편, 및/또는 VHH 영역을 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체활성 모이어티는 임의의 CH2 또는 CH3 도메인을 포함하지 않는다. 임의의 항체 또는 그의 단편이 본원에 기술된 융합 단백질에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일반적으로, 본원에 기술된 융합 단백질은 Fab 경쇄 및/또는 중쇄와 회합되며, 이는 융합 단백질과 별개로 또는 인접하여 생성될 수 있다.
전형적인 측면에서, 항원 결합 모이어티는 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관될 수 있다.
예시적인 측면에서, 항원 결합 모이어티는 HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티를 포함한다. HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티는 예를 들어, BG505 SOSIP_D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합할 수 있다. 구체적인 예에서, HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티는 PGDM1400, 10E8v4, 및/또는 N49P7로부터의 항원 결합 모이어티를 포함한다.
특정 측면에서, 본원에 기술된 나노케이지 단량체는 Fc 단량체에, 또는 생체활성 모티브 (예컨대, Fab 단편)에 연결된 N-서브유닛 또는 C-서브유닛을 포함한다. N- 또는 C-서브유닛은 상보적 C- 또는 N-서브유닛과 자기 어셈블리하여 전체 나노케이지 단량체를 형성할 수 있고, 복수의 전체 나노케이지 단량체는 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성함으로써 다중 Fc 단량체 및/또는 다른 모이어티가 하나의 나노케이지로 자기 어셈블리할 수 있게 한다. 각 상이한 성분의 양은 유전자 및 발현 비를 조절함으로써 제어된다. 이러한 나노케이지 단량체 서브유닛은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
예를 들어, Fc 단량체 또는 생체활성 모이어티 (예컨대, Fab 단편)는 분할된 아포페리틴 단량체 (N- 또는 C-서브유닛, 이는 각각 전형적으로 전장 아포페리틴 단량체의 대략 절반부)에 연결될 수 있다. Fc 단량체 또는 생체활성 모이어티 (예컨대, Fab 단편)에 융합된 각 서브유닛은 아포페리틴 단량체로 자기 어셈블리되고, 이는 차례로 다른 아포페리틴 단량체 (전체 아포페리틴 또는 N- 및 C-서브유닛으로 형성된 어셈블리된 아포페리틴)와 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성한다.
전장 나노케이지 단량체가 사용되는 경우, 나노케이지 단량체는 전형적으로 나노케이지 단량체의 C-말단에서 연결된 Fc 단량체 및 나노케이지 단량체의 N-말단에서 연결된 생체활성 모이어티를 포함한다. 나노케이지 단량체 서브유닛이 사용되는 경우, 서브유닛은 전형적으로 서브유닛의 C-말단에서 연결된 Fc 단량체 및 서브유닛의 N-말단에서 연결된 생체활성 모이어티를 포함한다. 전형적으로, C-서브유닛은 C-서브유닛의 C-말단에서 연결된 Fc 단량체, 및 C-서브유닛의 N-말단에서 연결된 생체활성 모이어티와 함께 본원에 기술된 융합 단백질에 사용된다.
측면에서, N- 또는 C-서브유닛이 함께 자기 어셈블리할 수 있는 상보적 C- 또는 N-서브유닛과 조합된 본원에 기술된 N- 또는 C-서브유닛을 제공한다. 상보적 C- 또는 N-서브유닛은 융합 단백질일 수 있거나, 또는 융합 단백질이 아닐 수 있다. 일부 측면에서, 상보적 C- 또는 N-서브유닛은 N- 또는 C-말단, 전형적으로 N-말단에서 생체활성 모이어티에 연결된다. 생체활성 모이어티는 예를 들어, N- 또는 C-서브유닛에 연결된 임의의 생체활성 모이어티 또는 항원 결합 모이어티와 동일하거나, 또는 상이할 수 있는 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab 단편일 수 있다. 상보적 C- 또는 N-서브유닛은 그의 N- 또는 C-말단, 전형적으로 C-말단에서 Fc 단량체에 연결될 수 있다. 전형적으로, Fc 단량체는 나노케이지의 4-폴드 축을 이용하여 나머지 절반을 충족시키기 위해 페리틴의 C-서브유닛의 C-말단에 융합된다는 것을 이해할 것이다.
예를 들어, 일부 측면에서, 융합 단백질은 C-말단에서 Fc 단량체에 및 N-말단에서 Fab 단편에 연결된 C-서브유닛을 포함한다. 사용시, C-서브유닛은 그의 N-말단에서, C-서브유닛에 연결된 Fab 단편과 동일하거나, 또는 상이할 수 있는 Fab 단편에 연결된 N-서브유닛과 함께 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성한다. 상기 기술된 바와 같이, 복수의 나노케이지 단량체는 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성한다. 나노케이지 단량체 서브유닛은 단독으로 또는 조합하여 제공될 수 있고, 동일하거나, 또는 상이한 생체활성 모이어티가 여기에 융합될 수 있다.
Fc 단량체는 임의의 항체 유형 또는 종으로부터 유래된 임의의 Fc 단량체일 수 있다. 전형적으로, Fc 단량체는 인간의 것이고, IgG, IgA, IgD, IgM 또는 IgE로부터 유래된 것이다. 예를 들어, Fc 단량체는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 예컨대, IgG1 Fc 단량체로부터 유래된 것일 수 있다.
Fc 단량체는 융합 단백질의 반감기를, 예를 들어, 수 분 또는 수 시간에서 수 일, 수 주 또는 수 개월로 조정하는 하나 이상의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 단량체는 L234, L235, G236, G237, M252, I253, S254, T256, P329, A330, M428, N434, 또는 그의 조합 (여기서, 넘버링은 EU 인덱스에 따름) 중 하나 이상에서의 돌연변이, 예컨대, M428L 및 N434S ("LS"); M252Y, S254T 및 T256E ("YTE"); L234A 및 L235A ("LALA"); I253A; L234A, L235A, 및 P329G ("LALAP"); G236R; G237A; 및/또는 A330L 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
더욱이, 생체이용률을 변화시킬 수 있는, Fc 서열 변형 및 다른 작용제 (예컨대, 인간 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민 펩티드 서열 및 항체, 예컨대, 인간 혈청 알부민을 표적화하는 Fab 및/또는 나노바디)의 첨가를 포함한, 본원에 기술된 융합 단백질 및 나노케이지에서의 다른 치환이 고려되며, 이는 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 추가로, 본원에 기술된 융합 단백질 및 나노케이지는 면역원성 및 항약물 반응을 약화시키기 위해 서열에서 또는 다른 작용제의 첨가에 의해 조정될 수 있다 (치료제, 예컨대, 숙주에의 서열 매칭, 또는 면역억제 요법 추가 [예컨대, 예를 들어, 류마티스 관절염의 치료를 위해, 또는 신생아 내성 유도를 위해 인플릭시맙을 투여할 때, 메토트렉세이트, 이는 FVIII에 대한 억제제의 발생률을 감소시키는 데 있어 1차 전략이다 (문헌 [DiMichele DM, Hoots WK, Pipe SW, Rivard GE, Santagostino E. International workshop on immune tolerance induction: consensus recommendations. Haemophilia. 2007;13:1-22] (그의 전문이 본원에서 참조로 포함)에서 리뷰).
본원에 기술된 바와 같이, 나노케이지 단량체는 서브유닛으로부터 형성될 수 있다. 따라서, 나노케이지 단량체 서브유닛은 제1 아포페리틴 서브유닛, 임의적으로, 제1 인간 아포페리틴 서브유닛, 예컨대, 아포페리틴 N- 또는 C-서브유닛을 포함할 수 있고, 여기서 제1 아포페리틴 서브유닛은 제2 아포페리틴 서브유닛, 예컨대, 상보적 C- 또는 N-서브유닛과 자기 어셈블리할 수 있다. 다른 나노케이지 단량체는 본원에 기술된 바와 같이 아포페리틴과 매우 유사한 이분 서브유닛으로 분할될 수 있고, 이로써 서브유닛은 자기 어셈블리하고, 각각 생체활성 모이어티와 융합될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
아포페리틴의 "N" 영역은 전형적으로
Figure pct00017
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
본원에서 아포페리틴의 "N" 영역이 단독으로 또는 또 다른 융합 단백질의 성분으로서 기술되는 모든 곳에서 전체적으로 또는 부분적으로 서열
Figure pct00018
는
Figure pct00019
로 대체될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 측면에서, 아포페리틴의 "N" 영역은 전형적으로
Figure pct00020
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
아포페리틴의 "C" 영역은 전형적으로
Figure pct00021
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
본원에서 아포페리틴의 "C" 영역이 단독으로 또는 또 다른 융합 단백질의 성분으로서 기술되는 모든 곳에서 전체적으로 또는 부분적으로 서열
Figure pct00022
는
Figure pct00023
로 대체될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 측면에서, 아포페리틴의 "C" 영역은 전형적으로
Figure pct00024
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
항체 또는 그의 단편이 2개의 쇄, 예컨대, 제1 및 제2 쇄, 또는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 경우, 2개의 쇄는 임의적으로 링커에 의해 분리된다. 링커는 가요성 또는 강성일 수 있지만, 전형적으로 쇄가 적절하게 폴딩될 수 있도록 가요성이다. 유사하게, Fc 단량체 및/또는 생체활성 모이어티는 전형적으로 링커를 통해 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
링커는 일반적으로 융합 단백질에 일부 가요성을 부여할 정도로 충분히 길지만, 링커 길이는 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛 및 Fc 단량체 및 생체활성 모이어티 서열 및 융합 단백질의 3차원 입체형태에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 링커는 전형적으로 약 1 내지 약 130개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 또는 125 내지 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 또는 130개의 아미노산 잔기, 또는 약 50 내지 약 90개의 아미노산 잔기, 예컨대, 70개의 아미노산 잔기, 또는 약 1 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 70개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 8 내지 약 16개의 아미노산 잔기이다.
링커는 임의의 아미노산 서열일 수 있고, 하나의 전형적인 예에서, 링커는 GS 도메인, 또는 G 및 S 아미노산 시리즈, 예컨대, GS 반복부, GGS 반복부, GGGS 반복부, 및/또는 GGGGS 반복부 시리즈를 포함한다. 전형적으로, 링커는 GGGGS 및/또는 GGGS 반복부를 포함하고, 더욱 전형적으로, 링커는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 GGGS 및/또는 GGGGS 반복부, 예컨대, 약 5개의 GGGS 반복부 및/또는 약 14개의 GGGGS 반복부를 포함한다. 구체적 측면에서, 링커는
Figure pct00025
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
전형적인 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 HIV-1과 연관된 항원에 특이적으로 결합한다.
측면에서, 본원에 기술된 융합 단백질은 하기 서열 중 하나 이상의 것, 또는 그의 조합과 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 여기서 페리틴 서브유닛은 굵은체로 표시되어 있고, 링커는 밑줄체로 표시되어 있다. 이들 경우에서 각각 전체 페리틴 단량체가 제시되어 있거나 (
Figure pct00026
(서열식별번호 6)), 또는 N- 또는 C-페리틴 단량체가 제시되어 있지만 (N-페리틴의 경우,
Figure pct00027
및 C-페리틴의 경우,
Figure pct00028
), 이들은 상호교환적으로 사용될 수 있거나, 또는 또 다른 단량체 또는 그의 일부가 그 대신으로 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
32-N MB.v3:
N49P7 _N-페리틴 (서열식별번호 7)
Figure pct00029
PGDM1400 _ h페리틴 (서열식별번호 8)
Figure pct00030
10E8v4 _C-페리틴_ Fc1 (서열식별번호 9)
Figure pct00031
32-N MB.v3 LS :
N49P7 _N-페리틴 (서열식별번호 7)
Figure pct00032
PGDM1400 _ h페리틴 (서열식별번호 8)
Figure pct00033
10E8v4 _C-페리틴_ Fc1 - LS (서열식별번호 10)
Figure pct00034
또는 그의 조합.
추가 측면에서, 융합 단백질은 추가 모이어티, 예컨대, 검출가능한 모이어티 (예컨대, 소분자, 형광 분자, 방사성 동위원소, 또는 자기 입자), 약제, 진단제, 또는 그의 조합에 접합 또는 회합되고, 예를 들어, 항체-약물 접합체를 포함할 수 있다.
추가 모이어티가 검출가능한 모이어티인 측면에서, 검출가능한 모이어티는 형광 단백질, 예컨대, GFP, EGFP, 아메트린, 및/또는 플라빈 기반 형광 단백질, 예컨대, LOV-단백질, 예컨대, iLOV를 포함할 수 있다.
추가 모이어티가 약제인 측면에서, 약제는 예를 들어 소분자, 펩티드, 지질, 탄수화물 또는 독소를 포함할 수 있다.
전형적인 측면에서, 본원에 기술된 융합 단백질로부터 어셈블리된 나노케이지는 약 3 내지 약 100개의 나노케이지 단량체를 포함하고, 이들 중 어느 것도 이분형 나노케이지 단량체 서브유닛, 예컨대, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 55, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 또는 98개 내지 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 55, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 또는 100개의 나노케이지 단량체, 예컨대, 24, 32, 또는 60개의 나노케이지 단량체로 제공될 수 없거나, 또는 그 중 일부, 또는 그들 모두는 그러한 것으로 제공될 수 있다. 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 임의의 공지된 나노케이지 단량체, 천연, 합성, 또는 부분적으로 합성인 것일 수 있고, 측면에서, 페리틴, 아포페리틴, 엔캡슐린, SOR, 루마진 신타제, 피루베이트 데히드로게나제, 카르복시좀, 볼트 단백질, GroEL, 열 충격 단백질, E2P, MS2 외피 단백질, 그의 단편, 및 그의 변이체로부터 선택된다. 전형적으로, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 페리틴 또는 아포페리틴 또는 그의 서브유닛이다.
본원에서는 또한 상기 기술된 융합 단백질의 쌍으로써, 여기서 각각의 쌍은 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성하고, 여기서 제1 및 제2 나노케이지 단량체 서브유닛은 본원에 기술된 바와 같이 상이한 생체활성 모이어티에 융합된 것인 융합 단백질의 쌍을 기술한다. 이는 서브유닛 쌍으로부터 어셈블리된 단일 나노케이지 단량체에 다가성 및/또는 다중특이성을 제공한다.
C-말단 scFc 단편을 포함하는 융합 단백질
본원에서는 융합 단백질을 기술한다. 측면에서, 융합 단백질은 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 C-말단에서 scFc 단편에 연결된 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하고, 여기서 복수의 융합 단백질은 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성한다. 이러한 방식으로, scFc 단편은 어셈블리된 나노케이지의 내부 표면, 어셈블리된 나노케이지의 외부 표면, 또는 둘 모두를 장식할 수 있다. 일부 실시양태에서, scFc 단편은 어셈블리된 나노케이지의 외부 표면을 장식한다. 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 C-말단 단부에 scFc 단편을 배치함에 따라, 놀랍게도 효능 및 중화 효율이 개선된 것으로 관찰되었다.
일부 측면에서, 나노케이지 단량체 서브유닛이 융합 단백질에서 전체 나노케이지 단량체 대신 사용된다. 나노케이지 단량체는 2개 부분으로 나뉠 수 있고, 그 중 하나는 "N-서브유닛"으로 지칭되는, 나노케이지 단량체의 N-말단 단부를 포함하고, 그 중 나머지 다른 하나는 "C-서브유닛"으로 지칭되는, 나노케이지 단량체의 C-말단 단부를 포함한다. N- 또는 C-서브유닛은 각각 실질적으로 나노케이지 단량체의 절반을 나타낼 수 있거나, 또는 불균등하게 분할될 수 있다. 전형적으로, N-서브유닛 및 C-서브유닛은 실질적으로 각각 나노케이지 단량체의 N-말단 절반 및 나노케이지 단량체의 C-말단 절반에 상응한다. N-서브유닛 및 C-서브유닛은 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성할 수 있고, 이는 그 자체가 자기 어셈블리하여 상기 기술된 바와 같은 나노케이지를 형성할 수 있다.
각각의 나노케이지 단량체 및 각각의 N- 및 C-서브유닛은 N-말단 및 C-말단을 포함하는 것으로 이해될 것이다. scFc 단편은 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에서 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결될 수 있다. 전형적으로, scFc 단편은 C-말단에서 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다. 유사하게, scFc 단편은 N-서브유닛 및/또는 C-서브유닛의 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에 연결될 수 있다. 전형적으로, scFc 단편은 C-말단에서 C-서브유닛에 연결된다.
전형적인 측면에서, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 생체활성 모이어티에 추가로 연결된다. scFc 단편과 같이, 생체활성 모이어티는 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N- 또는 C-말단에서 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결될 수 있고, 전형적으로 N-말단에서 연결된다. 나노케이지 단량체 서브유닛이 사용되는 경우, 생체활성 모이어티는 유사하게 어느 한쪽 말단에서, 전형적으로 scFc 단편의 반대쪽 말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결될 수 있다. 전형적으로, 생체활성 모이어티는 N-말단에서 C-서브유닛에 연결된다.
항원 결합 모이어티는 어셈블리된 나노케이지의 내부 및/또는 외부 표면을 장식하도록, 전형적으로 어셈블리된 나노케이지의 외부 표면을 장식하도록 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
생체활성 모이어티는 전형적으로 항원성 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편이다. 항체 또는 그의 단편은 예를 들어, Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 항체 또는 그의 단편은 예를 들어, Fab (예컨대, scFab) 단편, scFv 단편, sdAb 단편, 및/또는 VHH 영역을 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체활성 모이어티는 임의의 CH2 또는 CH3 도메인을 포함하지 않는다. 임의의 항체 또는 그의 단편이 본원에 기술된 융합 단백질에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일반적으로, 본원에 기술된 융합 단백질은 Fab 경쇄 및/또는 중쇄와 회합되며, 이는 융합 단백질과 별개로 또는 인접하여 생성될 수 있다.
전형적인 측면에서, 항원 결합 모이어티는 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 항원은 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관될 수 있다.
예시적인 측면에서, 항원 결합 모이어티는 HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티를 포함한다. HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티는 예를 들어, BG505 SOSIP_D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합할 수 있다. 구체적인 예에서, HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티는 PGDM1400, 10E8v4, 및/또는 N49P7로부터의 항원 결합 모이어티를 포함한다.
특정 측면에서, 본원에 기술된 나노케이지 단량체는 scFc 단편에, 또는 생체활성 모티브 (예컨대, Fab 단편)에 연결된 N-서브유닛 또는 C-서브유닛을 포함한다. N- 또는 C-서브유닛은 상보적 C- 또는 N-서브유닛과 자기 어셈블리하여 전체 나노케이지 단량체를 형성할 수 있고, 복수의 전체 나노케이지 단량체는 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성함으로써 다중 scFc 단편 및/또는 다른 모이어티가 하나의 나노케이지로 자기 어셈블리할 수 있게 한다. 각 상이한 성분의 양은 유전자 및 발현 비를 조절함으로써 제어된다. 이러한 나노케이지 단량체 서브유닛은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
예를 들어, scFc 단편 또는 생체활성 모이어티 (예컨대, Fab 단편)는 분할된 아포페리틴 단량체 (N- 또는 C-서브유닛, 이는 각각 전형적으로 전장 아포페리틴 단량체의 대략 절반부)에 연결될 수 있다. scFc 단편 또는 생체활성 모이어티 (예컨대, Fab 단편)에 융합된 각 서브유닛은 아포페리틴 단량체로 자기 어셈블리되고, 이는 차례로 다른 아포페리틴 단량체 (전체 아포페리틴 또는 N- 및 C-서브유닛으로 형성된 어셈블리된 아포페리틴)와 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성한다.
전장 나노케이지 단량체가 사용되는 경우, 나노케이지 단량체는 전형적으로 나노케이지 단량체의 C-말단에서 연결된 scFc 단편 및 나노케이지 단량체의 N-말단에서 연결된 생체활성 모이어티를 포함한다. 나노케이지 단량체 서브유닛이 사용되는 경우, 서브유닛은 전형적으로 서브유닛의 C-말단에서 연결된 scFc 단편 및 서브유닛의 N-말단에서 연결된 생체활성 모이어티를 포함한다. 전형적으로, C-서브유닛은 C-서브유닛의 C-말단에서 연결된 scFc 단편, 및 C-서브유닛의 N-말단에서 연결된 생체활성 모이어티와 함께 본원에 기술된 융합 단백질에 사용된다.
측면에서, N- 또는 C-서브유닛이 함께 자기 어셈블리할 수 있는 상보적 C- 또는 N-서브유닛과 조합된 본원에 기술된 N- 또는 C-서브유닛을 제공한다. 상보적 C- 또는 N-서브유닛은 융합 단백질일 수 있거나, 또는 융합 단백질이 아닐 수 있다. 일부 측면에서, 상보적 C- 또는 N-서브유닛은 N- 또는 C-말단, 전형적으로 N-말단에서 생체활성 모이어티에 연결된다. 생체활성 모이어티는 예를 들어, N- 또는 C-서브유닛에 연결된 임의의 생체활성 모이어티 또는 항원 결합 모이어티와 동일하거나, 또는 상이할 수 있는 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab 단편일 수 있다. 상보적 C- 또는 N-서브유닛은 그의 N- 또는 C-말단, 전형적으로 C-말단에서 scFc 단편에 연결될 수 있다.
예를 들어, 일부 측면에서, 융합 단백질은 C-말단에서 scFc 단편에 및 N-말단에서 Fab 단편에 연결된 C-서브유닛을 포함한다. 사용시, C-서브유닛은 그의 N-말단에서, C-서브유닛에 연결된 Fab 단편과 동일하거나, 또는 상이할 수 있는 Fab 단편에 연결된 N-서브유닛과 함께 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성한다. 상기 기술된 바와 같이, 복수의 나노케이지 단량체는 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성한다. 나노케이지 단량체 서브유닛은 단독으로 또는 조합하여 제공될 수 있고, 동일하거나, 또는 상이한 생체활성 모이어티가 여기에 융합될 수 있다.
scFc 단편은 임의의 항체 유형 또는 종으로부터 유래된 임의의 scFc 단편일 수 있다. 전형적으로, scFc 단편은 인간의 것이고, IgG, IgA, IgD, IgM 또는 IgE로부터 유래된 것이다. 예를 들어, scFc 단편은 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 예컨대, IgG1 scFc 단편으로부터 유래된 것일 수 있다.
scFc 단편은 융합 단백질의 반감기를, 예를 들어, 수 분 또는 수 시간에서 수 일, 수 주 또는 수 개월로 조정하는 하나 이상의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함할 수 있다. 예를 들어, scFc 단편은 L234, L235, G236, G237, M252, I253, S254, T256, P329, A330, M428, N434, 또는 그의 조합 (여기서, 넘버링은 EU 인덱스에 따름) 중 하나 이상에서의 돌연변이, 예컨대, M428L 및 N434S ("LS"); M252Y, S254T 및 T256E ("YTE"); L234A 및 L235A ("LALA"); I253A; L234A, L235A, 및 P329G ("LALAP"); G236R; G237A; 및/또는 A330L 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
더욱이, 생체이용률을 변화시킬 수 있는, Fc 서열 변형 및 다른 작용제 (예컨대, 인간 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민 펩티드 서열 및 항체, 예컨대, 인간 혈청 알부민을 표적화하는 Fab 및/또는 나노바디)의 첨가를 포함한, 본원에 기술된 융합 단백질 및 나노케이지에서의 다른 치환이 고려되며, 이는 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 추가로, 본원에 기술된 융합 단백질 및 나노케이지는 면역원성 및 항약물 반응을 약화시키기 위해 서열에서 또는 다른 작용제의 첨가에 의해 조정될 수 있다 (치료제, 예컨대, 숙주에의 서열 매칭, 또는 면역억제 요법 추가 [예컨대, 예를 들어, 류마티스 관절염의 치료를 위해, 또는 신생아 내성 유도를 위해 인플릭시맙을 투여할 때, 메토트렉세이트, 이는 FVIII에 대한 억제제의 발생률을 감소시키는 데 있어 1차 전략이다 (문헌 [DiMichele DM, Hoots WK, Pipe SW, Rivard GE, Santagostino E. International workshop on immune tolerance induction: consensus recommendations. Haemophilia. 2007;13:1-22] (그의 전문이 본원에서 참조로 포함)에서 리뷰).
본원에 기술된 바와 같이, 나노케이지 단량체는 서브유닛으로부터 형성될 수 있다. 따라서, 나노케이지 단량체 서브유닛은 제1 아포페리틴 서브유닛, 임의적으로, 제1 인간 아포페리틴 서브유닛, 예컨대, 아포페리틴 N- 또는 C-서브유닛을 포함할 수 있고, 여기서 제1 아포페리틴 서브유닛은 제2 아포페리틴 서브유닛, 예컨대, 상보적 C- 또는 N-서브유닛과 자기 어셈블리할 수 있다. 다른 나노케이지 단량체는 본원에 기술된 바와 같이 아포페리틴과 매우 유사한 이분 서브유닛으로 분할될 수 있고, 이로써 서브유닛은 자기 어셈블리하고, 각각 생체활성 모이어티와 융합될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
아포페리틴의 "N" 영역은 전형적으로
Figure pct00035
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
아포페리틴의 "C" 영역은 전형적으로
Figure pct00036
적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
항체 또는 그의 단편이 2개의 쇄, 예컨대, 제1 및 제2 쇄, 또는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 경우, 2개의 쇄는 임의적으로 링커에 의해 분리된다. 링커는 가요성 또는 강성일 수 있지만, 전형적으로 쇄가 적절하게 폴딩될 수 있도록 가요성이다. 유사하게, scFc 단편 및/또는 생체활성 모이어티는 전형적으로 링커를 통해 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된다.
링커는 일반적으로 융합 단백질에 일부 가요성을 부여할 정도로 충분히 길지만, 링커 길이는 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛 및 scFc 단편 및 생체활성 모이어티 서열 및 융합 단백질의 3차원 입체형태에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 링커는 전형적으로 약 1 내지 약 130개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 또는 125 내지 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 또는 130개의 아미노산 잔기, 또는 약 50 내지 약 90개의 아미노산 잔기, 예컨대, 70개의 아미노산 잔기, 또는 약 1 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 70개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 8 내지 약 16개의 아미노산 잔기이다.
링커는 임의의 아미노산 서열일 수 있고, 하나의 전형적인 예에서, 링커는 GS 도메인, 또는 G 및 S 아미노산 시리즈, 예컨대, GS 반복부, GGS 반복부, GGGS 반복부, 및/또는 GGGGS 반복부 시리즈를 포함한다. 전형적으로, 링커는 GGGGS 및/또는 GGGS 반복부를 포함하고, 더욱 전형적으로, 링커는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 GGGS (서열식별번호 11) 및/또는 GGGGS (서열식별번호 12) 반복부, 예컨대, 약 5개의 GGGS (서열식별번호 11) 반복부 및/또는 약 14개의 GGGGS (서열식별번호 12) 반복부를 포함한다. 구체적 측면에서, 링커는
Figure pct00037
와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
전형적인 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 HIV-1과 연관된 항원에 특이적으로 결합한다.
측면에서, 본원에 기술된 융합 단백질은 하기 서열 중 하나 이상의 것, 또는 그의 조합과 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 여기서 페리틴 서브유닛은 굵은체로 표시되어 있고, 링커는 밑줄체로 표시되어 있다. 이들 경우에서 각각 전체 페리틴 단량체가 제시되어 있거나 (
Figure pct00038
), 또는 N- 또는 C-페리틴 단량체가 제시되어 있지만 (N-페리틴의 경우,
Figure pct00039
및 C-페리틴의 경우,
Figure pct00040
), 이들은 상호교환적으로 사용될 수 있거나, 또는 또 다른 단량체 또는 그의 일부가 그 대신으로 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
32-N MB.v2:
N49P7 _N-페리틴 (서열식별번호 7)
Figure pct00041
PGDM1400 _ h페리틴 (서열식별번호 8)
Figure pct00042
10E8v4 _C-페리틴_ Fc (서열식별번호 13)
Figure pct00043
또는 그의 조합.
추가 측면에서, 융합 단백질은 추가 모이어티, 예컨대, 검출가능한 모이어티 (예컨대, 소분자, 형광 분자, 방사성 동위원소, 또는 자기 입자), 약제, 진단제, 또는 그의 조합에 접합 또는 회합되고, 예를 들어, 항체-약물 접합체를 포함할 수 있다.
추가 모이어티가 검출가능한 모이어티인 측면에서, 검출가능한 모이어티는 형광 단백질, 예컨대, GFP, EGFP, 아메트린, 및/또는 플라빈 기반 형광 단백질, 예컨대, LOV-단백질, 예컨대, iLOV를 포함할 수 있다.
추가 모이어티가 약제인 측면에서, 약제는 예를 들어 소분자, 펩티드, 지질, 탄수화물 또는 독소를 포함할 수 있다.
전형적인 측면에서, 본원에 기술된 융합 단백질로부터 어셈블리된 나노케이지는 약 3 내지 약 100개의 나노케이지 단량체를 포함하고, 이들 중 어느 것도 이분형 나노케이지 단량체 서브유닛, 예컨대, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 55, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 또는 98개 내지 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 55, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 또는 100개의 나노케이지 단량체, 예컨대, 24, 32, 또는 60개의 나노케이지 단량체로 제공될 수 없거나, 또는 그 중 일부, 또는 그들 모두는 그러한 것으로 제공될 수 있다. 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 임의의 공지된 나노케이지 단량체, 천연, 합성, 또는 부분적으로 합성인 것일 수 있고, 측면에서, 페리틴, 아포페리틴, 엔캡슐린, SOR, 루마진 신타제, 피루베이트 데히드로게나제, 카르복시좀, 볼트 단백질, GroEL, 열 충격 단백질, E2P, MS2 외피 단백질, 그의 단편, 및 그의 변이체로부터 선택된다. 전형적으로, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 페리틴 또는 아포페리틴 또는 그의 서브유닛이다.
본원에서는 또한 상기 기술된 융합 단백질의 쌍으로써, 여기서 각각의 쌍은 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성하고, 여기서 제1 및 제2 나노케이지 단량체 서브유닛은 본원에 기술된 바와 같이 상이한 생체활성 모이어티에 융합된 것인 융합 단백질의 쌍을 기술한다. 이는 서브유닛 쌍으로부터 어셈블리된 단일 나노케이지 단량체에 다가성 및/또는 다중특이성을 제공한다.
나노케이지
본원에서는 또한 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하는 나노케이지로서, 여기서 나노케이지는 적어도 하나의 융합 단백질 및 추가 융합 단백질(들) 및/또는 나노케이지 단량체(들) 또는 그의 서브유닛, 예컨대, 페리틴 쇄(들) (예컨대, 인간 페리틴 경쇄)로부터 자기 어셈블리하는 것인 나노케이지를 개시한다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 적어도 하나의 융합 단백질, 및 융합 단백질과 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성하는 적어도 하나의 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 나노케이지를 기술한다. 추가로, 본원에서는 융합 단백질 쌍으로서, 여기서 쌍은 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성하고, 여기서 제1 및 제2 나노케이지 단량체 서브유닛은 상이한 생체활성 모이어티에 융합되어 있는 것인 융합 단백질 쌍을 기술한다.
나노케이지는 다수의 동일한 융합 단백질로부터, 다수의 상이한 융합 단백질로부터 (따라서, 다가 및/또는 다중특이적이다), 융합 단백질과 야생형 단백질의 조합으로부터, 및 그의 임의의 조합으로부터 자기 어셈블리할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 나노케이지는 적어도 하나의 Fc 단량체 및/또는 scFc 단편과 조합하여 본원에 기술된 적어도 하나의 융합 단백질로 내부적으로 및/또는 외부적으로 장식될 수 있다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 Fc 단량체 및/또는 scFc 단편 및 적어도 하나의 Fab 단편은 나노케이지의 외부 표면을 장식한다. 일부 측면에서, 적어도 2개의 Fc 단량체 및/또는 scFc 단편 및 적어도 2개의 Fab 단편은 나노케이지의 외부 표면을 장식한다.
전형적인 측면에서, 약 20% 내지 약 80%의 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛은 본원에 기술된 융합 단백질을 구성한다. 본원에 기술된 모듈식 해결안의 관점에서, 나노케이지는 이론상 나노케이지 중에 존재하는 단량체의 최대 3 또는 4배 정도로 많은 생체활성 모이어티, 예컨대, 항체 단편, 및/또는 Fc 단량체/scFc 단편을 포함할 수 있는데, 이는 각 나노케이지 단량체가 2개의 서브유닛으로 분할될 수 있고, 이들은 각각 독립적으로 각 말단에서 상이한 생체활성 모이어티에 결합할 수 있기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 전형적으로 입체 장애를 피하기 위해 더 적은 개수가 사용된다. 이러한 모듈성은 생체활성 모이어티를 임의의 원하는 비로 달성하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 예에서, 본원에 기술된 나노케이지는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개 또는 그 초과의 동일한 또는 실질적으로 동일한 또는 기능적으로 등가인 Fc 단량체 또는 scFc 단편의 카피를 포함할 수 있다. 추가 또는 대안적인 예에서, 본원에 기술된 나노케이지는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 또는 그 초과의 동일한 또는 실질적으로 동일한 또는 기능적으로 등가인 생체활성 모이어티, 예컨대, Fab 단편의 카피를 포함할 수 있다. 추가 또는 대안적인 예에서, 본원에 기술된 나노케이지는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 상이한 Fc 단량체 및/또는 scFc 단편 및/또는 다른 생체활성 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 나노케이지는 다가 및/또는 다중특이적일 수 있고, 그 정도는 본원에 기술된 시스템으로 비교적 쉽게 제어될 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노케이지는 다가 및 다중특이적 둘 모두이다.
일부 측면에서, 본원에 기술된 나노케이지는 나노케이지 단량체 서브유닛에 연결된 것으로 본원에 기술된 생체활성 모이어티와 동일하거나 상이할 수 있는 생체활성 모이어티에 임의적으로 융합된 적어도 하나의 전체 나노케이지 단량체를 추가로 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기술된 나노케이지는, 각각이 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 융합된 상이한 항원 결합 모이어티를 포함하는 것인 제1 및 제2 융합 단백질, 및 임의적으로, 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 융합된 Fc 단량체 또는 scFc 단편을 포함하는 제3 융합 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1, 제2, 및 제3 융합 단백질은 각각 N- 또는 C-절반 페리틴에 융합된 생체활성 모이어티, 또는 그의 일부를 포함하고, 여기서 제1, 제2, 및 제3 융합 단백질 중 적어도 하나는 N-절반 페리틴에 융합되고, 제1, 제2, 및 제3 융합 단백질 중 적어도 하나는 C-절반 페리틴에 융합되고, 여기서 Fc 단량체 또는 scFc 단편은 C-절반 페리틴의 C-말단 단부에 융합된다.
일부 실시양태에서, 제1 및 임의적으로, 제2 융합 단백질은 각각 전체 아포페리틴에 융합된 항원 결합 모이어티를 포함한다. 유사하게, 일부 실시양태에서, 제3 단백질은 전체 아포페리틴에 융합된 생체활성 모이어티를 포함한다. 전체 나노케이지 단량체 및 나노케이지 단량체의 서브유닛의 조합이 본원에 기술된 모듈식 나노케이지에서의 사용을 위해 고려된다는 것을 이해할 것이다.
전형적으로 그의 N-말단에서 생체활성 모이어티, 예컨대, Fab에 연결된 적어도 하나의 전체 나노케이지 단량체가 본원에 기술된 나노케이지에서 사용된다는 것을 이해할 것이다. 전형적으로, N- 및 C-페리틴 서브유닛 쌍당 하나의 상기 전체 나노케이지 단량체가 존재한다. 이는 나노케이지가 과도한 입체 장애 없이 적절하게 다량체화되도록 허용하고, 또한 바람직하지 않은 과도한 결합력을 유발할 수 있는 나노케이지 상의 Fc 단량체 및/또는 scFc 단편의 개수를 감소시킨다.
단백질은 임의의 개수 또는 비로 융합 단백질을 포함할 수 있지만, 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 나노케이지는, 각각이 동일한 질환과 연관된 상이한 항원에 대해 특이적인 3개의 Fab, 및 Fc 단량체 또는 scFc 단편을 임의적으로, Fab1:Fab2:Fab:Fc 단량체/scFc 비 2:2:2:1로 포함한다.
본원에서는 또한 치료 또는 예방 조성물과 같은 나노케이지를 포함하는 조성물도 기술한다. HIV-1을 치료 및/또는 예방하기 위한 관련 방법 및 용도 또한 기술하며, 여기서 방법 또는 용도는 그를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 나노케이지 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
HIV-1에 관한 구체적인 실시양태에서, 측면에서, 나노케이지는 범-바이러스 중화 범위를 를 나타낸다. 추가 또는 대안적 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 0.1 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.01 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.001 ug/mL 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다. 추가 또는 대안적 측면에서, 나노케이지는 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 42 pM 미만, 예컨대, 약 4.2 pM 미만, 예컨대, 약 0.42 pM 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다. 추가 또는 대안적 측면에서, 나노케이지는 118개의 PsV의 멀티클레이드 패널에 대하여 질량 및/또는 몰 기준으로 상응하는 bNAb의 칵테일보다 적어도 약 10, 적어도 약 100, 적어도 약 1000, 적어도 약 10,000, 또는 적어도 약 100,000 더 강력한 평균 중간값 IC50 값을 나타낸다.
본원에 기술된 것과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 또한 고려된다는 것을 이해할 것이다. 실질적으로 동일한 서열은 하나 이상의 보존적 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 참조 서열에 대한 하나 이상의 보존적 아미노산 돌연변이가 참조 서열과 비교하여 생리학적, 화학적 또는 기능적 특성에 실질적인 변화가 없는 돌연변이체 펩티드를 생성할 수 있다는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있고; 이러한 경우에, 참조 및 돌연변이체 서열은 "실질적으로 동일한" 폴리펩티드로 간주될 것이다. 보존적 아미노산 돌연변이는 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있고; 보존적 아미노산 치환은 본원에서 아미노산 잔기의 유사한 화학적 특성 (예컨대, 크기, 전하 또는 극성)을 갖는 또 다른 아미노산 잔기로의 치환으로서 정의된다.
비제한적인 예에서, 보존적 돌연변이는 아미노산 치환일 수 있다. 이러한 보존적 아미노산 치환은 염기성, 중성, 소수성 또는 산성 아미노산을 동일한 그룹의 또 다른 아미노산으로 치환할 수 있다. 용어 "염기성 아미노산"이란, 전형적으로 생리학적 pH에서 전형적으로 양으로 하전된, 측쇄 pK 값이 7 초과인 친수성 아미노산을 의미한다. 염기성 아미노산은 히스티딘 (His 또는 H), 아르기닌 (Arg 또는 R) 및 리신 (Lys 또는 K)을 포함한다. 용어 "중성 아미노산" (또한 "극성 아미노산")이란, 생리학적 pH에서 비하전되지만, 2개의 원자에 의해 공통적으로 공유된 전자 쌍이 원자 중 하나에 의해 더욱 가깝게 유지되는 적어도 1개의 결합을 갖는 측쇄를 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 극성 아미노산은 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 시스테인 (Cys 또는 C), 티로신 (Tyr 또는 Y), 아스파라긴 (Asn 또는 N) 및 글루타민 (Gln 또는 Q)을 포함한다. 용어 "소수성 아미노산" (또한 "비극성 아미노산")은 문헌 [Eisenberg (1984)]의 정규화된 컨센서스 소수성 척도에 따라 0 초과의 소수성을 나타내는 아미노산을 포함하는 것으로 의미된다. 소수성 아미노산은 프롤린 (Pro 또는 P), 이소류신 (Ile 또는 I), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 발린 (Val 또는 V), 류신 (Leu 또는 L), 트립토판 (Trp 또는 W), 메티오닌 (Met 또는 M), 알라닌 (Ala 또는 A) 및 글리신 (Gly 또는 G)을 포함한다.
"산성 아미노산"은 전형적으로 생리학적 pH에서 음으로 하전된, 측쇄 pK 값이 7 미만인 친수성 아미노산을 지칭한다. 산성 아미노산은 글루타메이트 (Glu 또는 E) 및 아스파르테이트 (Asp 또는 D)를 포함한다.
서열 동일성은 두 서열의 유사성을 평가하는 데 사용되며; 이는 두 서열이 잔기 위치 사이에 최대 상응성을 위해 정렬되는 경우 동일한 잔기의 퍼센트를 계산함으로써 결정된다. 임의의 공지된 방법이 서열 동일성을 계산하는 데 사용될 수 있으며; 예를 들어, 컴퓨터 소프트웨어가 서열 동일성을 계산하는 데 이용가능하다. 제한하고자 하지 않으면서, 서열 동일성은 스위스 생물정보학 연구소(Swiss Institute of Bioinformatics)에 의해 유지되는 (및 ca.expasy.org/tools/blast/에서 발견되는) NCBI BLAST2 서비스, BLAST-P, Blast-N, 또는 FASTA-N과 같은 소프트웨어, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 적절한 소프트웨어에 의해 계산될 수 있다.
본 발명의 실질적으로 동일한 서열은 적어도 85% 동일할 수 있고; 또 다른 예에서, 실질적으로 동일한 서열은 본원에 기술된 서열과 아미노산 수준에서 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일할 수 있다. 구체적 측면에서, 실질적으로 동일한 서열은 참조 서열의 활성 및 특이성을 보유한다. 비제한적 실시양태에서, 서열 동일성의 차이는 보존적 아미노산 돌연변이(들)에 기인하는 것일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 융합 단백질은 또한 그의 발현, 검출, 정제, 또는 임의의 다른 원하는 특성을 보조하는 추가의 서열, 예컨대, 트랜스시토시스를 억제하는 펩티드를 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 상기 서열 또는 태그가 사용될 수 있다. 예를 들어, 및 제한하고자 하지 않으면서, 융합 단백질은 표적화 또는 신호 서열 (예를 들어, ompA를 포함하나, 이에 제한되지 않음), 검출 태그를 포함할 수 있으며, 예시적인 태그 카세트는 Strep 태그 또는 그의 임의의 변이체 (예컨대, 미국 특허 번호 7,981,632를 참조), His 태그, 서열 모티프 DYKDDDDK (서열식별번호 14)를 갖는 Flag 태그, Xpress 태그, Avi 태그, 칼모둘린 태그, 폴리글루타메이트 태그, HA 태그, Myc 태그, Nus 태그, S 태그, SBP 태그, Softag 1, Softag 3, V5 태그, CREB-결합 단백질 (CBP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 결합 단백질 (MBP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 티오레독신 태그 또는 그의 임의의 조합; 정제 태그 (예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, His5 또는 His6) 또는 그의 조합을 포함한다.
또 다른 예에서, 추가의 서열은 예컨대, WO/1995/004069에서 크로난(Cronan) 등 또는 WO/2004/076670에서 보게스(Voges) 등에 의해 설명된 바와 같은 비오틴 인식 부위일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게도 또한 공지된 바와 같이, 링커 서열은 추가의 서열 또는 태그와 함께 사용될 수 있다.
더욱 구체적으로, 태그 카세트는 높은 친화성 또는 결합력으로 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 세포외 성분을 포함할 수 있다. 단일 쇄 융합 단백질 구조 내에서, 태그 카세트는 (a) 커넥터 영역에 대해 아미노-말단에 바로 위치하거나, (b) 링커 모듈 사이에 개재되어 이를 연결하거나, (c) 결합 도메인에 대해 카르복시-말단에 바로 위치하거나, (d) 결합 도메인 (예컨대, scFv 또는 scFab)과 이펙터 도메인 사이에 개재되어 이를 연결하거나, (e) 결합 도메인의 서브유닛 사이에 개재되어 이를 연결하거나, (f) 단일 쇄 융합 단백질의 아미노-말단에 위치할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 연접 아미노산은 태그 카세트와 소수성 부분 사이에 배치되고, 이를 연결할 수 있거나, 태그 카세트와 커넥터 영역 사이에 배치되고 이를 연결할 수 있거나, 또는 태그 카세트와 링커 모듈 사이에 배치되고 이를 연결할 수 있거나, 또는 태그 카세트와 결합 도메인 사이에 배치되고, 이를 연결할 수 있다.
또한 다양한 방법론을 사용하여 표면에 고정화된, 단리되거나, 또는 정제된 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 그의 단편이 본원에 포함되고; 예를 들어, 및 제한하고자 하지 않으면서, 폴리펩티드는 His-태그 커플링, 비오틴 결합, 공유 결합, 흡착 등을 통해 표면에 연결되거나, 또는 커플링될 수 있다. 고체 표면은 임의의 적합한 표면일 수 있으며, 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰 표면, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 센서 칩의 채널, 막, 비드 (예컨대, 자기 기반 또는 세파로스 기반 비드 또는 다른 크로마토그래피 수지), 유리, 필름 또는 임의의 다른 유용한 표면일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 측면에서, 융합 단백질은 카고 분자에 연결될 수 있고; 융합 단백질은 카고 분자를 원하는 부위로 전달할 수 있고, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법 (재조합 기술, 화학적 접합, 킬레이트화 등)을 사용하여 카고 분자에 연결될 수 있다. 카고 분자는 예컨대, 치료제 또는 진단제와 같은 임의의 유형의 분자일 수 있다.
일부 측면에서, 카고 분자는 단백질이고, 카고 분자가 나노케이지 내부에 또는 외부적으로 함유되도록 융합 단백질에 융합된다. 다른 측면에서, 카고 분자는 융합 단백질에 융합되지 않고, 나노케이지 내부에 함유된다. 카고 분자는 전형적으로 단백질, 소분자, 방사성 동위원소 또는 자기 입자이다.
본원에 기술된 융합 단백질은 그의 표적에 특이적으로 결합한다. 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의, 또는 본원에 기술된 항체들 또는 단편의 선택적 인식을 지칭하는 항체 특이성은 친화도 및/또는 결합력에 기초하여 결정될 수 있다. 항원과 항체의 해리에 대한 평형 상수 (KD)로 표시되는 친화도는 항원 결정기 (에피토프)와 항체 결합 부위 사이의 결합 강도를 측정한다. 결합력은 항체와 그의 항원 사이의 결합 강도의 척도이다. 항체는 전형적으로 10-5 내지 10-11 M의 KD로 결합한다. 10-4 M 초과의 임의의 KD는 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. KD 값이 작을수록, 항원 결정기와 항체 결합 부위 사이의 결합 강도는 더 강력하다. 측면에서, 본원에 기술된 항체의 KD는 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M, 10-14 M, 또는 10-15 M 미만이다.
또한 본원에서는 본원에 기술된 융합 단백질 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 뿐만 아니라, 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본원에 기술된다.
본원에 기술된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열과 실질적으로 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "실질적으로 동일한" 핵산 서열은 본원에서 두 서열을 (적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실에 의해) 최적으로 정렬시키고, 비교하여 두 서열 사이의 뉴클레오티드의 정확한 매치를 결정할 때, 또 다른 핵산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열로서 정의된다.
항체의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 적절한 공급원은 전장 항체를 발현하는 하이브리도마 및 비장 세포와 같은 임의의 세포를 포함한다. 단편은 항체 등가물로서 그 자체로 사용될 수 있거나, 또는 상기 기술된 바와 같이 등가물로 재조합될 수 있다. 본 섹션에서 기술되는 DNA의 결실 및 재조합은 "항체의 기능적 등가물"이라는 표제하의 섹션에서 상기 열거된 공개 특허출원에 기술된 방법과 같은 공지된 방법 및/또는 하기에 기술되는 것과 같은 다른 표준 재조합 DNA 기술에 의해 수행될 수 있다. DNA의 또 다른 공급원은 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 파지 디스플레이 라이브러리로부터 생산된 단일 쇄 항체이다.
추가로, 발현 서열, 프로모터 및 인핸서 서열에 작동가능하게 연결된 이전에 기술된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터가 제공된다. 원핵생물 시스템, 예컨대, 박테리아, 및 예컨대, 효모 및 포유동물 세포 배양 시스템을 포함하나, 이에 제한되지 않는 진핵생물 시스템에서 항체 폴리펩티드의 효율적인 합성을 위한 다양한 발현 벡터가 개발되었다. 본 발명의 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열의 세그먼트를 포함할 수 있다.
임의의 적합한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 원핵생물 클로닝 벡터는 예컨대, colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM, 및 RP4와 같은 이. 콜라이(E. coli) 유래의 플라스미드를 포함한다. 원핵생물 벡터는 또한 예컨대, M13과 같은 파지 DNA의 유도체 및 다른 섬유상 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다. 효모에서 유용한 벡터의 예로는 2μ 플라스미드가 있다. 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 벡터는 SV-40, 아데노바이러스, 레트로바이러스 유래의 DNA 서열의 널리 공지된 유도체, 및 예컨대, 상기 기술된 것과 같은 기능성 포유동물 벡터의 조합으로부터 유래된 셔틀 벡터, 및 기능성 플라스미드 및 파지 DNA를 포함한다.
추가의 진핵생물 발현 벡터는 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [P J. Southern & P. Berg, J. Mol. Appl. Genet, 1:327-341 (1982)]; [Subramani et al., Mol. Cell. Biol, 1: 854-864 (1981)]; [Kaufman & Sharp, "Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene," J. Mol. Biol, 159:601-621 (1982)]; [Kaufman & Sharp, Mol. Cell. Biol, 159:601-664 (1982)]; [Scahill et al., "Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells," Proc. Nat'l Acad. Sci USA, 80:4654-4659 (1983)]; [Urlaub & Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci USA, 77:4216-4220, (1980)] (상기 문헌들은 모두 본원에서 참조로 포함된다).
발현 벡터는 전형적으로 발현될 DNA 서열 또는 단편에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 발현 제어 서열을 함유한다. 클로닝된 DNA 서열의 발현을 제어하고, 조절하기 위해, 제어 서열이 벡터에 삽입된다. 유용한 발현 제어 서열의 예로는 lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc 시스템, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 외피 단백질의 제어 영역, 효모의 해당 프로모터, 예컨대, 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 프로모터, 효모 산 포스파타제의 프로모터, 예컨대, Pho5, 효모 알파-교배 인자의 프로모터, 및 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 시미안 바이러스로부터 유래된 프로모터, 예컨대, SV40의 초기 및 후기 프로모터, 및 원핵 세포 또는 진핵 세포 및 그의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 다른 서열 또는 그의 조합이 있다.
본원에서는 또한 이전에 기술된 발현 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포도 기술한다. 본원에 기술된 융합 단백질은 하이브리도마 이외의 다른 세포주에서 발현될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산은 적합한 포유동물 숙주 세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있다.
특히 바람직한 세포주는 높은 수준의 발현, 관심 단백질의 구성적 발현 및 숙주 단백질로부터의 최소한의 오염에 기초하여 선택된다. 발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 관련 기술분야에에 널리 공지되어 있으며, 다수의 불멸화 세포주, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, HEK 293 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포 및 다수의 다른 세포를 포함한다. 적합한 추가의 진핵 세포는 효모 및 다른 진균을 포함한다. 유용한 원핵생물 숙주는 예를 들어, 이. 콜라이, 예컨대, 이. 콜라이 SG-936, 이. 콜라이 HB 101, 이. 콜라이 W3110, 이. 콜라이 X1776, 이. 콜라이 X2282, 이. 콜라이 DHI, 이. 콜라이 T7 셔플 및 이. 콜라이 MRC1, 슈도모나스(Pseudo monas), 바실러스(Bacillus), 예컨대, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다.
본 이들 재조합 숙주 세포는 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 세포를 배양하고, 숙주 세포 또는 숙주 세포 주변의 배지로부터 폴리펩티드를 정제함으로써 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 재조합 숙주 세포에서의 분비를 위한 발현된 폴리펩티드의 표적화는 관심 항체 코딩 유전자의 5' 말단에 신호 또는 분비 리더 펩티드-코딩 서열을 삽입함으로써 촉진될 수 있다 (문헌 [Shokri et al., (2003) Appl Microbiol Biotechnol. 60(6): 654-664, Nielsen et al., Prot. Eng., 10:1-6 (1997)]; [von Heinje et al., Nucl. Acids Res., 14:4683-4690 (1986)] (상기 문헌들은 모두 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 이들 분비 리더 펩티드 요소는 원핵생물 또는 진핵생물 서열로부터 유래될 수 있다. 따라서, 적합하게, 폴리펩티드가 숙주 세포 세포질 밖으로 이동하여 배지에 바로 분비되도록 폴리펩티드의 N-말단 단부에 결합하는 아미노산인 분비 리더 펩티드가 사용된다.
본원에 기술된 융합 단백질은 추가의 아미노산 잔기에 융합될 수 있다. 상기 아미노산 잔기는 예를 들어, 단리를 용이하게 하기 위한 펩티드 태그일 수 있다. 특정 기관 또는 조직으로의 항체의 귀소를 위한 다른 아미노산 잔기 또한 고려된다.
Fab-나노케이지는 예컨대, 하나는 페리틴 쇄 (예컨대, 페리틴 경쇄)에 융합된 Fab 중쇄를 포함하는 융합 단백질을 코딩하고, 또 다른 것은 Fab 경쇄를 코딩하는 것인, 플라스미드의 공동 형질감염에 의해 생성될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 전형적으로, 구축물은 LC-링커-HC-링커-나노케이지 단량체/서브유닛으로서 배열될 뿐만 아니라, HC-링커-LC-링커-나노케이지 단량체/서브유닛으로도 배열될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, scFv 또는 임의의 다른 항원 결합 모이어티가 사용될 수 있다. 대안적으로, 오직 하나의 플라스미드의 형질감염만을 필요로 하는 단일 쇄 Fab-페리틴 나노케이지가 사용될 수 있다 (예컨대, Fab 경쇄, Fab 중쇄, 및 페리틴 쇄 (예컨대, 페리틴 경쇄)를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 사용). 이는 Fab 경쇄와 Fab 중쇄 사이의 상이한 길이, 예를 들어, 60 또는 70개의 아미노산의 링커로 수행될 수 있다. 단일 쇄 Fab가 사용되는 경우, 중쇄와 경쇄가 쌍을 형성하는 것이 보장될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 정제를 용이하게 하기 위해, 구축물의 N-말단에 또는 링커 내에 태그 (예컨대, Flag, HA, myc, His6x, Strep 등)가 또한 부가될 수 있다. 추가로, 태그 시스템을 사용함으로써, 상이한 Fab-나노입자 플라스미드를 공동 형질감염시킬 때, 연속/추가적 친화성 크로마토그래피 단계를 사용하여 동일한 나노입자 상에 다수의 상이한 Fab가 존재하는지를 확인할 수 있다. 이것은 나노입자에 다중특이성을 제공한다. 프로테아제 부위 (예컨대, TEV, 3C 등)를 삽입하여 원하는 경우에 발현 및/또는 정제 후 링커 및 태그를 절단할 수 있다.
본원에 기술된 융합 단백질을 투여하기 위해 임의의 적합한 방법 또는 경로가 사용될 수 있다. 투여 경로는 예를 들어, 경구, 비내, 정맥내, 복강내, 피하, 또는 근육내 투여를 포함한다.
본원에 기술된 융합 단백질이 예방 또는 치료 목적으로 포유동물에서 사용되는 경우, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물의 형태로 투여될 것으로 이해된다. 적합한 제약상 허용되는 담체는 예를 들어, 물, 염수, 포스페이트 완충처리된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 하나 이상 것 뿐만 아니라, 그의 조합을 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 결합 단백질의 저장 수명 또는 효능을 증가시키는 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 소량 추가로 포함할 수 있다. 주사 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 포유동물에게로의 투여 후 활성 성분의 속방출, 서방출 또는 지연 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.
본원에 기술된 융합 펩티드 및 멀타바디는 인간에게 투여하는 데 특히 유용하지만, 다른 포유동물에게도 투여될 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "포유동물"은 인간, 실험 동물, 가정 애완동물 및 농장 동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는 것으로 의도된다.
상기 개시내용은 일반적으로 본 발명을 기술한다. 하기의 구체적 실시예를 참조함으로써 더욱 완전하게 이해할 수 있다. 이들 실시예는 단지 설명의 목적으로만 제공되며, 달리 명시되지 않는 한, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 결코 하기의 실시예로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해질 수 있는 임의의 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
하기의 실시예는 예컨대, 벡터 및 플라스미드의 구축, 상기 벡터 및 플라스미드 내로의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 삽입, 또는 숙주 세포 내로의 플라스미드의 도입에서 사용되는 것과 같은 통상의 방법에 관한 상세한 설명을 포함하지 않는다. 그러한 방법들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)을 포함한, 다수의 공개문헌에 기술되어 있다.
추가의 설명이 없어도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명 및 하기의 예시적인 실시예를 사용하여, 본 발명의 화합물을 제조 및 이용하고, 청구된 방법을 실시할 수 있을 것으로 간주된다. 따라서, 하기의 실험 실시예는 구체적으로 본 발명의 전형적인 측면을 언급하는 것이며, 본 개시내용의 나머지를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1
요약
HIV의 급속한 진화는 계속해서 예방 및 치료를 위한 치료제 개발의 주요 장벽이 되고 있다. 본원에서 본 발명자들은 표적, 이 경우, HIV 외피의 3개의 독립적인 에피토프와 다중 및 동시 상호작용을 확립할 수 있는 단일 분자의 형성을 허용하는, 멀타바디.v2 (MB.v2) 및 멀타바디.v3 (MB.v3)으로 명명되는 2세대 항체 플랫폼의 디자인을 설명한다. 이 기술의 다가성 및 다중특이성 특성은 가장 강력한 항-HIV bnAb의 것을 능가하는 놀라운 효능과 매우 다양한 HIV-1 균주의 완전한 범-중화로 해석된다. 따라서, 이러한 새로운 MB.v2 및 MB.v3 플랫폼은 HIV-1에 대한 예방 및 치료 가능성이 있다.
개요
수십 년간의 연구에도 불구하고, 인간 면역결핍 바이러스 타입 I (HIV-1)에 대한 효과적인 백신이나 치유법은 없다. 그러나, 적은 비율의 HIV-1 감염 개체가 순환 HIV-1 분리주에 걸쳐 뛰어난 중화 효능을 가진 항체를 생성한다는 사실은 HIV-1의 항체 매개 제어 가능성을 강조한다. 1세대의 광범위 중화 항체 (bNAb) 2F5(1), 4E10(2, 3), 2G12(4) 및 b12(5, 6)가 발견된 이후, bNAb의 카탈로그는 Env-특이적 단일 B 세포 분류 (7-9), 항체 클로닝 및 고처리량 중화 검정 (10-13), 및 더욱 최근에는 프로테오믹 디콘볼루션 (14)이라는 새로운 기술 구현으로 크게 증가하였다. 이제, 삼량체 정점의 V1/V2 루프, V3 루프 글리칸, CD4 결합 부위 (CD4bs), gp120-g41 인터페이스, 융합 펩티드 및 MPER (막-근위 외부 영역)을 포함한, 삼량체 HIV 외피 (Env) 상의 6개의 보존 부위를 표적화하는 수십 개의 HIV bNAb가 기술되고 있다 (7, 9, 10, 12-19).
HIV-1과의 퇴치에서 치료 분자로서 bNAb의 관심은 마카크 (20-23, 23) 및 인간화 마우스 (24-27)의 도전 연구에서 관찰된 강력한 항바이러스 활성과 bNAb 주입 후 감염된 인간에서 달성된 바이러스 혈증 감소 (28-32)로부터 발생한다. 추가로, 항체는 경구용 항레트로바이러스 요법 (ART)과 비교할 때 중요한 이점을 가지고 있는데: 항체는 순환 반감기가 더 길고, 바이러스에 대한 숙주 면역을 증강시키는 면역 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 관찰결과는 bNAb의 수동 투여를 통해 HIV-1에 대한 방어를 부여하는 항체 기반 요법의 임상 평가와 감염된 개체에서 HIV-1을 통제 및/또는 제거하려는 노력으로 이어졌다.
bNAb의 임상적 사용에 대한 주요 제한 사항 중 하나는 중화 저항성 바이러스 집단의 급속한 진화이다 (29-31, 33, 34). 예컨대, HIV-1과 같은 RNA 바이러스는 특별한 유전적 다양성을 보임에 따라 (35) 바이러스는 mAb 인식을 회피하기 위한 저항성 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 그러나, 특정 bNAb에의 결합을 파기하는 돌연변이는 바이러스 적응도에 상당한 불이익을 줄 수 있다 (36-38). HIV-1 치료 요법에서 상이한 약물의 조합과 유사하게, 상기 관찰결과는 HIV-1에 대한 성공적인 항체 기반 요법은 bNAb 특이성의 조합을 포함하여야 한다는 것을 시사한다. 결과적으로, Env에 대해 이중특이성 (39-41) 또는 삼중특이성 (42-44)를 갖는 상이한 포맷의 항체 유사 분자 개발이 최근 탐색되고 있다. 추가 고려 사항은 생체내 효능에 필요한 항체의 양이다. 실제로, 예컨대, VRC01 (45), 10E8 (46, 47) 및 NIH45-46 (48)과 같은 구조 가이드 디자인 또는 생물정보학적 접근법을 사용하여 bNAb의 효능을 개선시키기 위해 bNAb를 조작하는 것에 관한 광범위한 노력이 진행되었지만, 지금까지는 중간 정도의 성공을 거두었다. Env 중 다중 에피토프를 표적화하는 이중특이적 및 삼중특이적 항체의 경우, 효능은 일반적으로 그의 모체 mAb의 효능에 의해 제한된다. 결과적으로, 중화 범위는 상당히 개선되었지만 항바이러스 효능은 상대적으로 거의 달성되지 않았다 40,43,(43),45.
본 발명자들은 최근 항체 단편의 올리고머화를 유도하고, SARS-CoV-2를 표적화하는 항체를 매우 강력한 중화제로 변환하기 위한 다중-특이적, 다중-친화성 항체(MULTi-specific, multi-Affinity antiBODY: 멀타바디) 플랫폼을 기술하였다 (49). 본 발명자들은 여기서 상기 플랫폼을 활용하여 IgG1로부터의 결정화가능한 단편 (Fc)과 HIV-1에 대해 가장 우수한 bNAb들 중 3개의 다중 카피를 단일 분자 내에서 조합하였다. 본 발명자들은 입자 내 Fab 개수를 최대화하기 위해 멀타바디를 추가로 조작함으로써 멀타바디 기술에 의해 달성된 효능, 범위 및 균질성을 유의적으로 개선시켰다. 생성된 항-HIV 멀타바디.v3은 각각 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 완전한 범-바이러스 중화 범위 및 0.0009 ㎍/mL (0.4 pM)의, 현재 가장 잘 알려져 있는 bNAb로 제조된 칵테일과 비교하여 질량 및/또는 몰 기준으로 32배 내지 460배 더 낮은 평균 중간값 IC50 값을 보였다. 본원에 기술된 멀타바디.v3 디자인은 HIV-1에 대한 차세대 생물학적 제제 개발을 위한 견고하고 강력한 플랫폼을 나타낸다.
물질 및 방법
Fab 단독 아포페리틴 기반 다량체의 발현 및 정제. 인간 아포페리틴 및 scFab-인간 아포페리틴 융합체의 경쇄를 코딩하는 유전자를 합성하고, 진아트(GeneArt) (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies))에 의해 pHLsec 발현 벡터로 클로닝하였다. 200 ml의 HEK293F 세포 (써모 피셔 사이언티픽스(Thermo Fisher Scientifics))를 프리스타일(Freestyle) 발현 배지 중에 0.8x106개의 세포/mL 밀도로 시딩하고, 멀티트로 프로(Multitron Pro) 진탕기 (인포스 HT(Infors HT))에서 125 rpm 진동하에 37℃, 8% CO2, 및 70% 습도에서 인큐베이션시켰다. 시딩 후 24시간 이내에, 실온 (RT)에서 10 min 미리 인큐베이션된 50 ㎍의 여과된 DNA를 형질감염 시약 펙토프로(FectoPRO) (폴리플러스 트랜스펙션즈(Polyplus Transfections))와 함께 1:1 비로 사용하여 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 각각 20%, 50%, 80% 및 100%의 scFab 결합가 나노입자를 수득하기 위해 scFab-인간 아포페리틴 및 인간 아포페리틴을 코딩하는 플라스미드를 1:4, 1:1, 4:1 및 1:0의 비로 혼합하였다. 6-7일 후, 5000 x g로 15 min 동안 원심분리하여 세포 현탁액을 수확하고, 0.22 ㎛ 스테리탑(Steritop) 필터 (EMD 밀리포어(EMD Millipore))를 통해 상청액을 여과하였다. Fab에 대해 친화성 크로마토그래피하고, 세척 후 용출시켜 나노입자를 정제하였다. 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 농축시키고, 20 mM 인산나트륨 pH 8.0, 150 mM NaCl 중 슈퍼로스(Superose) 6 10/300 GL 크기 배제 칼럼 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare)) 상에 로딩하였다.
32-N MB.v1, 32-N MB. v2, 및 32 -N MB.v3 멀타바디 디자인, 발현 및 정제. KOD-플러스(KOD-Plus) 돌연변이유발 키트 (토요보(Toyobo: 일본 오사카))를 이용하여 인간 아포페리틴의 경쇄의 잔기 1 내지 95 (페리틴의 C-말단부, "C-페리틴"을 남김) 또는 잔기 95 내지 175 (페리틴의 N-말단부, "N-페리틴"을 남김) 결실에 의해 절반 페리틴에 연결된 scFab, scFc 및 Fc 단편을 코딩하는 유전자를 생성하였다. 67 ㎍의 플라스미드 PGDM1400 scFab-인간 아포페리틴: scFcN-페리틴: N49P7 scFab-C-페리틴: 10E8v4 scFab-C-페리틴을 4:2:1:1 비로 혼합하여 HEK 293F 세포에서 32-N MB.v1의 일시적 형질감염을 수득하였다. 32-N MB.v2의 경우, 59 ㎍의 플라스미드 PGDM1400 scFab-인간 아포페리틴: N49P7 scFab-N-페리틴: 10E8v4 scFab-C-페리틴-scFc를 5:1:1 비로 사용하였고, 32-N MB.v3의 경우, 63 ㎍의 플라스미드 PGDM1400 scFab-인간 아포페리틴: N49P7 scFab-N-페리틴: 10E8v4 scFab-C-페리틴-Fc를 3:1:1 비로 사용하였다. 본 실시예에서 사용된 다양한 구축물의 특성은 하기 표 1에 요약되어 있다.
표 1: 멀타바디 구축물의 특성
Figure pct00044
DNA 혼합물을 여과하고, 세포 배양물에 첨가하기 전에 1:1 비로 펙토프로와 함께 RT에서 인큐베이션시켰다. 먼저 20 mM 트리스 pH 8.0, 3 M MgCl2 및 10% 글리세롤 용출 완충제를 이용하여 하이트랩 단백질 A HP(HiTrap Protein A HP) 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 멀타바디를 정제하였다. PD-10 탈염 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 이용하여 완충제 교환을 수행한 후, 하이트랩 단백질 L 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 사용하여 2차 친화성 크로마토그래피에 의해 멀타바디를 추가로 정제하였다. 단백질을 함유하는 분획을 농축시키고, 20 mM 인산나트륨 pH 8.0, 150 mM NaCl 중 슈퍼로스 6 10/300 GL 칼럼 (GE 헬쓰케어) 상에서 겔 여과하여 추가로 정제하였다.
음성 염색 전자현미경 검사법. 대략 0.02 mg/mL 농도의 멀타바디 3 ㎕를 탄소 코팅된 구리 그리드에 30 s 동안 첨가하고, 3 ㎕의 2% 우라닐 포르메이트로 염색하였다. 와트만 넘버 1(Whatman No. 1) 여과지를 이용하여 그리드로부터 과량의 염색을 즉시 제거하고, 20 s 동안 추가의 3 ㎕의 2% 우라닐 포르메이트를 첨가하였다. 200 kV에서 작동에서 오리우스(Orius) 전하 결합 소자(CCD) 카메라(가탄 인크.(Gatan Inc.))가 장착된 전계 방출 FEI 테크나이(Tecnai) F20 전자 현미경을 사용하여 이미지화하였다.
생물층 간섭법. PBS pH 7.4, 0.01% BSA 및 0.002% 트윈(Tween)에서 옥테트(Octet) RED96 BLI 시스템 (팔 포르테바이오(Pall ForteBio))을 이용하여 결합 동역학적 성질 측정을 수행하였다. 각 멀타바디 성분에 대한 고유한 His-태그부착된 리간드를 선택하고, Ni-NTA 바이오센서에 로딩하여 0.8 nm의 신호 반응에 도달하도록 하였다. 로딩된 바이오센서를 멀타바디의 연속 희석액 (50-25-12.5-6.25-3.1-1.5 nM)을 함유하는 웰, 및 완충제 함유 웰에 각각 옮겨 회합 속도를 측정하였다. 바이오센서를 완충제 함유 웰에 딥핑하여 해리 속도를 측정하였다. 각각의 상기 두 단계의 지속 시간은 180 s였다. PGDM1400에의 선택적 결합을 달성하기 위해, BG505 SOSIP.664 삼량체의 CD4bs에 D368R 돌연변이를 도입하였고, 그 결과로 N49P7의 상기 항원에의 결합을 파괴되었다. 유사하게, gp120 서브유닛 93TH057, MPER 펩티드 및 Fc 수용체 (β2-마이크로글로불린과 복합체를 이루는 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 및 hFcRn)를 각각 N49P7, 10E8, 및 Fc 결합을 위한 리간드로서 제조하였다. 생리학적 pH (7.5) 및 산성 pH (5.6)에서의 hFcRn β2-마이크로글로불린 복합체에의 그의 결합을 측정하여 멀타바디의 엔도솜 리사이클링 능력을 시험하였다.
다각도 광산란과 일렬로 이어져 진행되는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC-MALS). 미니다운 TREOS(MiniDAWN TREOS) 및 옵티랩 T-rEX(Optilab T-rEX) 굴절계 (와이어트(Wyatt))에 이어서, 일렬로 이어져 진행되는 애질런트 테크놀러지즈 1260 인피니티 II HPLC(Agilent Technologies 1260 infinity II HPLC)를 이용하였다. 50 ㎍의 24-mer PGDM1400 scFab 다량체 및 멀타바디 32-N을 20 mM 인산나트륨 pH 8.0, 150 mM NaCl 중 슈퍼로스 6 10/300 (GE 헬쓰케어) 칼럼 상에 로딩하였다. ASTRA 소프트웨어 (와이어트)를 이용하여 데이터 수집 및 분석을 수행하였다.
용융 및 응집 온도 측정. UNit 시스템 (언체인드 랩스(Unchained Labs))을 사용하여 멀타바디, 모체 IgG 및 12-mer 호모-올리고머 Fab 및 Fc의 용융 온도 (Tm) 및 응집 온도 (Tagg)를 결정하였다. Tm은 무게중심 평균 형광을 측정하여 얻었고, Tagg는 기준선 대비 266nm 파장에서의 정적 광산란의 50% 증가가 관찰된 온도로서 결정되었다. 샘플을 1.0 mg/mL로 농축하고, 1℃ 증분으로 25℃에서 95℃까지 열 램프를 적용하였다. UNit 분석 소프트웨어를 사용하여 3회의 독립 측정의 평균 및 표준 오차를 계산하였다.
가속화 열안정성 검정법. 상이한 멀타바디 버전을 연속 4주 동안 극한의 온도 및 농도 조건에 가하였다. 10 mg/ml의 각 샘플을 40℃에서 인큐베이션시키고, 매주 슈퍼로스 6 10/300 GL 칼럼 (GE 헬쓰케어) 상에의 10 ㎕의 샘플 로딩 시 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수득된 각 피크의 면역을 분석함으로써 적절하게 폴딩된 단백질의 비율(%)을 계산하였다. 본 분석은 실험 시작 시점 (0주째) 및 실험 종료 시점 (4주째)에 활성 단백질의 양을 결정하기 위해 기능 검정법, 본 경우에서는 중화 검정법으로 보충하였다.
바이러스 생산 및 TZM - bl 중화 검정법. 앞서 기술된 바와 같이 (50), HIV-1 서브타입 B 백본 NL4-3.Luc.R-E 플라스미드 (AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램(AIDS Research and Reference Reagent Program: ARRRP)) 및 전장 Env 클론을 코딩하는 플라스미드로 293T 세포를 공동 형질감염시켜 25개의 HIV-1 슈도타입 바이러스로 이루어진 패널을 생성하였다. HIV 분리주 X2088, ZM106.9, NL4.3 및 3817은 AIDS 백신 개발 협력(collaboration for AIDS Vaccine Discovery: CAVD)으로부터 친절하게 제공받았고, SF162는 J.L. 니에바.(J.L. Nieva.) (바이오피시카 인스티튜트(Biofisika Institute))로부터, 및 pCNE8, 1632, THRO, 278, ZM197, JRCSF, t257, Du422, BG505, p1054.TC4.1499, 6535, ZM214M.PL15, AC10.29, p16845, P6244_13.B5.4576, pM246F_C1G, TRJO4551, QH0692 및 pCAAN5342는 NIH ARRRP로부터 친절하게 제공받았다. 표준 TZM-bl 중화 검정법을 이용하여 단사이클 중화 검정법으로 중화를 결정하였다. 간략하게, 항체 및 항체 기반 입자를 37℃에서 1 h 동안 10-15% 조직 배양 감염 용량의 슈도바이러스와 함께 인큐베이션시킨 후, TZM-bl 세포와 44-72 h 동안 인큐베이션시켰다. 브라이트라이트 플러스(Britelite plus) 시약 (퍼킨엘머(PerkinElmer))을 세포에 첨가하고, 시너지 네오2 다중-모드 검정 마이크로플레이트 판독기(Synergy Neo2 Multi-Mode Assay Microplate Reader) (바이오테크 인스트루먼츠(Biotek Instruments))를 이용하여 상대 발광 단위 (RLU)로 발광을 측정하여 바이러스 중화를 모니터링하였다. 하버드 의과 대학의 바이러스학 및 백신 연구 센터(Center for Virology and Vaccine Research, Harvard Medical School)에서 마이클 시맨(Michael Seaman) 박사에 의해 표준 프로토콜에 따라 118개의 PsV의 확장된 멀티클레이드 패널에서 수행하였다. 10 ㎍/mL의 컷오프 한계를 이용하여 항체 범위를 결정하였다.
약동학적 성질. 암컷 NOD/Shi-scid/IL-2Rγ널 면역결핍 마우스 계통 (NCG)을 사용하여 생체내 연구를 수행하였다. 항체 PGDM1400, N49P7 및 10E8v4의 scFab 및 반감기 연장 돌연변이 (M428L/N434S)를 포함하는 IgG1 Fc의 scFc 단편으로 구성된 32-N MB.v3을 연구에 사용하였다. 200 ㎕의 PBS (pH 7.5) 중 5 mg/kg의 멀타바디 또는 대조군 샘플 (멀타바디의 Fab 특이성과 매칭되는 IgG 혼합물)의 1회 주사를 피하로 주사하였다. 혈액 샘플을 여러 시점에서 수집하고, 혈청 샘플을 ELISA에 의해 순환 항체 수준에 대해 평가하였다. 간략하게, IgG 및 멀타바디에 대한 시약-특이적 표준 곡선을 이용하여 순환 샘플 농도를 결정하기 위해 MB: BG505 SOSIP.664_D368R 삼량체, gp120 서브유닛 93TH057 및 MPER 펩티드에 의해 인식되는 0.5 ㎍/ml의 각 His6x-태그부착된 항원 50 ㎕로 96-웰 피어스 니켈 코팅 플레이트(Pierce Nickel Coated Plates) (써모 피셔)를 코팅하였다. HRP-단백질 A (인비트로겐(Invitrogen))을 2차 분자로 사용하였고, 시너지 네오2 다중-모드 검정 마이크로플레이트 판독기 (바이오테크 인스트루먼츠)를 이용하여 화학발광 신호를 정량화하였다.
결과
HIV-1 bNAb의 효능은 결합력으로 증진될 수 있다.
아포페리틴은 24개의 동일한 서브유닛의 자기 올리고머화에 의해 형성된, 유체역학적 반경이 대략 6 nm인 구형 나노케이지이다 (도 1a). 다가성이 중화 효능에 미치는 영향을 조사하기 위해, 본 발명자들은 인간 아포페리틴 경쇄의 자기 어셈블리 특성을 사용하여 상이한 HIV-1 Env 에피토프를 표적화하는 가장 강력하고 광범위한 HIV-1 bNAb로부터 유래된 항원 결합 단편(Fab)을 다량체화하였다. 아포페리틴 서브유닛을 유전적으로 단일 쇄 Fab (scFab)에 융합시켰다. 정확한 Fab 이종이량체화가 확실하게 이루어질 수 있도록 경쇄와 중쇄 사이에 가요성 링커를 이용하여 scFab를 생성하였다. 아포페리틴 자기 어셈블리는 scFab의 다량체화를 유도하였고, 나노케이지 주변에 항체 단편을 디스플레이하였다 (도 1b). 비-유전적으로 변형된 인간 아포페리틴과 함께 상이한 비로 scFab-인간 아포페리틴-코딩 플라스미드의 공동 형질감염을 수행함으로써 상이한 밀도의 다량체화된 Fab를 달성하였다 (도 1c 및 도 3). 소수의 HIV-1 슈도바이러스(PsV) 패널을 사용하여 HIV-1 감염을 차단할 수 있는 scFab-아포페리틴 융합체의 능력을 상응하는 IgG와 비교하였다 (도 1d). 놀랍게도, 지금까지 기술된 가장 강력한 항-HIV bNAb 중 하나인 PGDM1400은 아포페리틴의 경쇄를 통해 다량체화되었을 때, 그의 종래의 IgG 포맷과 비교하여 10 내지 40배 더 높은 중화 효능을 보였다. bNAb 10-1074 또한 중화 효능에 있어 상당한 개선을 보인 반면 (4 내지 40배), bNAbs 10E8, N49P7, 및 VRC01은 어떠한 효과도 보이지 않거나, 또는 더 완만한 증진을 보였다.
scFab -아포페리틴 융합체 특징화.
scFab-아포페리틴 및 비접합 아포페리틴에 상응하는 SDS-PAGE 밴드를 ImageJ 소프트웨어 ( rsb .info.nih. gov / ij /)를 이용하여 밀도계측에 의해 정량화하였다 (도 2a). 각 레인 중 밴드 (노란색 박스)의 강도 플롯이 도 2b에 제시되어 있다. 입자 상에 디스플레이된 scFab의 대략적 개수는 하기와 같이, scFab 밴드의 강도/전체 강도로 계산하였고, 공동 형질감염에 사용된 DNA 비로부터 도출된 이론상의 개수와 비교하였다 (도 2c).
멀타바디는 강력하고 광범위하게 HIV-1을 중화시킨다.
이러한 결과를 고려하여, 본 발명자들은 본 발명자들이 앞서 기술한 바 있는 아포페리틴 분할 디자인을 기반으로 한 멀타바디 플랫폼 (49)을 이용하여 PGDM1400의 커버리지를 증가시키고자 하였다. 본 전략법은 4개의 나선형 아포페리틴 서브유닛을 2개의 절반부 (N-페리틴 및 C-페리틴)로 분리하고, 그의 N-말단을 특이성이 상이한 scFab에 융합시키는 것으로 구성된다 (도 3a). 본 접근법을 통해 나노케이지 표면에 더 많은 개수의 Fab를 포함시킬 수 있고, 이로써, 결합력이 더 높은 최종 분자를 생성할 수 있다. 추가로, 본 디자인을 통해 3개의 상이한 항체 특이성 뿐만 아니라, 결정화가능 단편 (Fc)을 효율적으로 조합할 수 있고, 이로써, 단백질 A 친화성을 활용한 정제 용이성과 같은 IgG 유사 특성을 분자에 부여할 수 있다. 구체적으로, 본 발명자들은 scFab PGDM1400을 범 중화에 가까운 항체 10E8v4 (용해도가 개선된 변형된 10E8 (51)) 및 N49P7의 scFab 및 인간 IgG1 이소타입의 Fc 단편과 조합하였다 (도 3a). 예상대로, 32-N으로 명명되는, 생성된 멀타바디는 상응하는 IgG와 유사한 생물물리학적 및 기능적 특성을 가진 (도 3d) 고도로 장식되고 균질한 입자를 형성하였다 (도 3b 및 c). 결합 동역학 실험에서 에피토프-특이적 분자: BG505 SOSIP D368R (PGDM1400), 93TH057 gp120 (N49P7), MPER 펩티드 (10E8v4) 및 인간 Fc 수용체 (FcRn 및 FcγR) (Fc)를 이용하여 삼중특이적 멀타바디에 의한 에피토프 인게이지먼트를 평가하였다 (도 3e). 겉보기 결합 친화도가 높고, 해리가 검출불가능한 3개의 에피토프-특이적 항원에의 결합을 통해 멀타바디에 모든 특이성이 존재하는 것을 확인할 수 있다. 어떠한 개별 IgG 분자도 모든 항원에 결합할 수 있는 능력은 없었다 (도 4).
표준화된 시험관내 TZM-bl 중화 검정법에서 14-PsV로 이루어진 패널에 대한 멀타바디 32-N의 중화 효능 및 범위를 평가하였다 (50). 14-PsV 패널은 평가 중인 각 bNAb에 대해 최소 하나의 저항성 PsV가 있는 저감도 PsV를 포함하도록 디자인하였다 (컷오프 IC50은 10 ㎍/mL로 설정). 멀타바디의 IC50 값 및 범위를 각 개별 IgG 및 멀타바디에 존재하는 동일한 상대적 양의 IgG를 포함하는 IgG 칵테일과 비교하였다. 32-N MB의 IC50 값의 중간값은 0.0071 ㎍/mL (3 pM)였다 (도 5). 그러나, 모체 IgG 혼합물 대비 12배의 효능 개선이 달성되었음에도 불구하고, 멀타바디는 상기 패널에 대해 100%의 중화에 도달하지 못하였다 (10 ㎍/mL 컷오프 한계하에 93% 범위). 추가로, 개별 IC50 값 조사 결과, 멀타바디는 PGDM1400 중화에 대해 저항성을 나타내는 상기 PsV에 대해 낮은 효능을 보이는 것으로 밝혀졌다 (도 5b). 상기 데이터는 멀타바디의 중화 특성이 입자, 본 경우에서는 PGDM1400 내의 3개의 항체 특이성 중 하나에 크기 의존한다는 것을 시사한다.
아포페리틴 스캐폴드 조작
멀타바디의 중화 특성을 추가로 개선시키기 위해, 본 발명자들은 그의 디자인에 일부 변형을 도입하고, 2세대 버전 (MB.v2 및 MB.v3)을 만들었다. 원래의 멀타바디 (이하 MB.v1로 지칭)에서, scFc는 N-페리틴 절반의 N 말단에 위치하고, 각 기능성 Fc 동종이량체당 단 하나의 Fab인 Fab2 또는 Fab3만이 멀타바디에 도입되어 있다 (도 6 윗줄).
비교로, 최적화된 MB.v2에서는 Fc 단편이 C-페리틴 절반의 C-말단에 위치한다. 분할된 아포페리틴 보완에 의해 유도된 바, 2개의 상이한 Fab (Fab2 및 Fab3) 및 1개의 Fc 도메인은 1:1:1 비로 및 서로에 대해 정의된 위치에서 자기 회합한다 (도 6; 아랫 줄; "MB.v2 포맷" 참조).
MB.v3의 경우, 상기 최적화된 버전은 Fc 동종이량체당 더 많은 개수의 Fab를 함유한다. 상기 디자인에서, 이량체 Fc당 2개의 Fab2 및 2개의 Fab3이 멀타바디 내로 도입된다. 이를 달성하기 위해, 단량체 Fc 단편 (즉, 1개의 Fc 쇄) 및 scFab가 각각 C-페리틴 절반의 C 말단 및 N 말단에 위치한다 (도 7a). 그 결과, 기능성 Fc 동종이량체의 이량체화는 분할 페리틴 보완 및 페리틴 서브유닛 올리고머화와 함께 MB.v3 입자의 어셈블리를 유도한다 (도 7b).
중요한 것은 이러한 디자인을 통해 PGDM1400과 상이한 더 많은 개수의 Fab (즉, Fab2 및 Fab3)를 확실하게 어셈블리할 수 있고, 따라서, 완전히 어셈블리된 멀타바디 중 3개의 Fab 각각에 대해 더욱 균형잡힌 결합력을 선호한다는 것이다.
생성된 멀타바디 입자 (MB.v2 및 MB.v3)는 상이한 멀타바디 버전 간에 형태 및 생물물리학적 특성에 유의적인 차이가 없는, 고도로 안정적이고, 잘 형성된 구형 입자로 어셈블리되었다 (도 8a- c). 항원 (도 8d) 및 Fc 수용체 결합 (도 8e)을 통해 MB.v3의 경우, Fc 단편의 적절한 이량체화를 포함한, 멀타바디의 적절한 폴딩이 확인되었다. MB.v2 및 MB.v3 포맷에서, 페리틴의 C 말단에 Fc를 배치함에 따라 Fc 도메인이 역전되고, 더 멀리 위치하는 입자가 형성되고, 그 결과, Fc 결합력은 감소된다. 따라서, 산성 pH에서 상기 멀타바디의 FcγRI 및 FcRn에의 결합은 32-N MB.v1과 비교하여 감소되었고 (도 3e 및 도 8e), 산성 pH에서 FcRn에의 결합은 심지어 32-N MB.v3 LS 변이체에 대해 제시된 바와 같이 반감기 연장 돌연변이 LS (M428L/N434S) 존재하에서도 측정가능한 K오프 결과를 가져왔다 (도 8f).
2세대 멀타바디 입자에 의해 달성된 탁월한 효능 및 범-중화 범위
이어서, 본 발명자들은 본 발명자들의 이전 패널에 PGDM1400에 대해 고도한 저항성을 나타내는 11개의 HIV-1 균주를 추가하여 생성된 PsV 패널에 대해 최적화된 멀타바디 버전 (MB.v2 및 MB.v3)의 중화 효능을 평가하였다. 생성된 25-PsV 패널은 PGDM1400 중화에 대해 저항성을 나타내는 56%의 PsV 변이체 (컷오프 IC50 10 ㎍/mL로 설정)를 함유한다 (도 9a). 예상대로, 32-N MB.v1의 범위 및 효능은 PGDM1400 저항성 PsV의 존재하에서 크게 영향을 받았다 (도 9a). 그러나, 조작된 바와 같이, 항체 N49P7 및 10E8v4의 중화 프로파일은 이전에 상기 유형의 분자에 대하여 관찰된 증진된 중화 효능을 유지함과 동시에, 상기 최적화된 멀타바디가 범-중화를 달성할 수 있도록 허용하는 32-N MB.v2 및 32-N MB.v3에서 더 우세하였다 (도 9a). 118개의 PsV의 확장된 멀티클레이드 패널에 대하여 시험하였을 때, 32-N MB.v3은 상응하는 IgG 칵테일의 범-중화 범위와 매칭되었지만 (100% 바이러스 커버리지, 컷오프 IC50 10 ㎍/mL로 설정), 놀라운 중화 효능을 보였다 (도 9b). 구체적으로, IgG 칵테일 및 32-N MB.v1은 단지 9% 및 8%의 PsV만을 중화시킬 수 있었고, 여기서 IC50 값은 각각 0.001 ㎍/mL였던 반면, 32-N MB.v3의 경우, 50%의 PsV가 단 0.001 ㎍/mL의 IC50 값으로도 여전히 중화되었다 (도 9b). 놀랍게도, 32-N MB.v3은 단 0.0009 ㎍/mL (0.4 pM)의 중간값 IC50 값을 달성하였고, 이로써, 질량 및/또는 몰 기준으로 IgG 칵테일과 비교하여 각각 32배 및 490배 더 강력하게 범-중화를 달성하였다 (도 9b).
멀타바디의 생체내 약동학적 성질은 상응하는 IgG와 유사하다.
이어서, 본 발명자들은 LS 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 단편을 포함하는 32-N MB.v3의 생체내 생체이용률을 조사하였다. 5 mg/kg의 단일 용량을 NOD/Shi-scid/IL-2Rγ널 면역결핍 마우스 계통 (NCG)에 피하로 투여하고, 혈청 중 멀타바디 수준을 연속 15일 동안 매 2일마다 검출하였다. 멀타바디 투여는 체중 감소 또는 시각적인 독성 징후 없이 내약성이 우수하였다. 추가로, 멀타바디는 모체 IgG 칵테일과 유사한 붕괴율로 생체내 노출 일수를 보여주었다 (도 10). 상기 데이터는 생체이용률 특성을 가진 분자를 생성하고, 그의 개발 가능성에 대한 고무적인 초기 생체내 검증 세트를 제공하는 멀타바디 플랫폼의 실행가능성을 입증하는 것이다.
참고문헌
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10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 20 25 <210> 6 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala 1 5 10 15 Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu 20 25 30 Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu 50 55 60 Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln 65 70 75 80 Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala 85 90 95 Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu 100 105 110 Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp 115 120 125 Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys 130 135 140 Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala 145 150 155 160 Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Arg His Asp 165 170 175 <210> 7 <211> 621 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser 210 215 220 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gln Ala Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Arg Lys Pro Gly 290 295 300 Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Pro Gly Asn Thr Leu Lys Thr 305 310 315 320 Tyr Asp Leu His Trp Val Arg Ser Val Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp 325 330 335 Met Gly Trp Ile Ser His Glu Gly Asp Lys Lys Val Ile Val Glu Arg 340 345 350 Phe Lys Ala Lys Val Thr Ile Asp Trp Asp Arg Ser Thr Asn Thr Ala 355 360 365 Tyr Leu Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 370 375 380 Cys Ala Lys Gly Ser Lys His Arg Leu Arg Asp Tyr Ala Leu Tyr Asp 385 390 395 400 Asp Asp Gly Ala Leu Asn Trp Ala Val Asp Val Asp Tyr Leu Ser Asn 405 410 415 Leu Glu Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 420 425 430 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 435 440 445 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 450 455 460 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 465 470 475 480 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 485 490 495 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 500 505 510 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 515 520 525 Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 530 535 540 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 545 550 555 560 Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala Val 565 570 575 Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser 580 585 590 Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser 595 600 605 His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg 610 615 620 Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp 625 630 635 640 Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met 645 650 655 Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp 660 665 670 Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp Phe 675 680 685 Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met 690 695 700 Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala Gly 705 710 715 720 Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp 725 730

Claims (170)

  1. Fc 단량체에 연결된 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 융합 단백질로서, 여기서 복수의 융합 단백질은 자기 어셈블리하여 하나 이상의 Fc 이량체를 포함하는 나노케이지를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, Fc 단량체가 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N- 또는 C-말단에서, 바람직하게는 C-말단에서 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서브유닛이 각각 실질적으로 나노케이지 단량체의 N-말단 절반 및 나노케이지 단량체의 C-말단 절반에 상응하는 N-서브유닛 또는 C-서브유닛을 포함하고, 여기서 N-서브유닛 및 C-서브유닛은 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, Fc 단량체가 N-서브유닛 또는 C-서브유닛의 C-말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결되고, 바람직하게는 여기서 Fc 단량체는 C-말단에서 C-서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 제1 생체활성 모이어티에 추가로 연결된 것인 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 제1 생체활성 모이어티가 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 제1 생체활성 모이어티가 N-서브유닛 또는 C-서브유닛의 N-말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결되고, 바람직하게는 여기서 제1 생체활성 모이어티는 N-말단에서 C-서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생체활성 모이어티가 어셈블리된 나노케이지의 내부 및/또는 외부 표면, 바람직하게는 외부 표면을 장식하는 것인 융합 단백질.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생체활성 모이어티가 제1 항원 결합 모이어티를 포함하는 것인 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 제1 항원 결합 모이어티가 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것인 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 제1 항원 결합 모이어티가 Fab 단편을 포함하는 것인 융합 단백질.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 scFab 단편, scFv 단편, sdAb 단편, VHH 도메인 또는 그의 조합을 포함하는 것인 융합 단백질.
  13. 제10항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 것인 융합 단백질.
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 모이어티가 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 융합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 항원이 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것인 융합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 제1 항원 결합 모이어티가 HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티를 포함하는 것인 융합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티가 BG505 SOSIP_D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합하는 것인 융합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티가 PGDM1400, 10E8v4, 및/또는 N49P7로부터의 HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티를 포함하는 것인 융합 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 C-말단에서 Fc 단량체에 연결되고, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N-말단에서 제1 생체활성 모이어티에 연결된, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 것인 융합 단백질.
  20. 제5항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 C-서브유닛의 C-말단에서 Fc 단량체에 연결되고, C-서브유닛의 N-말단에서 제1 생체활성 모이어티에 연결된 C-서브유닛을 포함하는 것인 융합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, N-서브유닛과, 또는 N-서브유닛을 포함하는 융합 단백질과 조합된 융합 단백질.
  22. 제21항에 있어서, N-서브유닛이 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 제2 생체활성 모이어티에 연결된 것인 융합 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 제2 생체활성 모이어티가 제2 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 제1 생체활성 모이어티가 제1 항원 결합 모이어티를 포함하는 경우, 제2 항원 결합 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티와 동일하거나, 또는 상이할 수 있는 것인 융합 단백질.
  24. 제23항에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티가 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것인 융합 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 단편을 포함하는 것인 융합 단백질.
  26. 제24항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 scFab 단편, scFv 단편, sdAb 단편, VHH 도메인 또는 그의 조합을 포함하는 것인 융합 단백질.
  27. 제24항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 것인 융합 단백질.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, N-서브유닛이 N-서브유닛의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 C-말단에서 Fc 단량체에 추가로 연결된 것인 융합 단백질.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 단량체가 IgG, IgA, IgD, IgM, 또는 IgE로부터 유래된 것이고, 바람직하게는 인간의 것인 융합 단백질.
  30. 제29항에 있어서, Fc 단량체가 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래된 것인 융합 단백질.
  31. 제30항에 있어서, Fc 단량체가 IgG1 Fc 단량체인 융합 단백질.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 단량체가 융합 단백질의 반감기를, 예를 들어, 수 분 또는 수 시간에서 수 일, 수 주 또는 수 개월로 조정하는 하나 이상의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하는 것인 융합 단백질.
  33. 제32항에 있어서, Fc 단량체가 L234, L235, G236, G237, M252, I253, S254, T256, P329, A330, M428, N434, 또는 그의 조합 (여기서, 넘버링은 EU 인덱스에 따름) 중 하나 이상에서의 돌연변이, 예컨대, M428L 및 N434S ("LS"); M252Y, S254T 및 T256E ("YTE"); L234A 및 L235A ("LALA"); I253A; L234A, L235A, 및 P329G ("LALAP"); G236R; G237A; 및/또는 A330L 또는 그의 조합을 포함하는 것인 융합 단백질.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3 내지 약 100개의 나노케이지 단량체, 예컨대, 24, 32, 48, 또는 60개의 나노케이지 단량체, 또는 약 4 내지 약 200개의 나노케이지 단량체 서브유닛, 예컨대, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50개, 또는 그 초과의 것이 임의적으로 하나 이상의 전체 나노케이지 단량체와 조합하여 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 페리틴, 아포페리틴, 엔캡슐린, SOR, 루마진 신타제, 피루베이트 데히드로게나제, 카르복시좀, 볼트 단백질, GroEL, 열 충격 단백질, E2P, MS2 외피 단백질, 그의 단편, 및 그의 변이체로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
  36. 제35항에 있어서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 아포페리틴, 임의적으로, 인간 아포페리틴인 융합 단백질.
  37. 제36항에 있어서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 아포페리틴 경쇄, 임의적으로, 인간 아포페리틴 경쇄인 융합 단백질.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 융합 단백질이 제1 아포페리틴 서브유닛, 임의적으로, 제1 인간 아포페리틴 서브유닛을 포함하고, 여기서 제1 아포페리틴 서브유닛은 제2 아포페리틴 서브유닛과 자기 어셈블리할 수 있는 것인 융합 단백질.
  39. 제38항에 있어서, 제1 및 제2 아포페리틴 단량체 서브유닛이 상호교환적으로 아포페리틴의 "N" 및 "C" 영역을 포함하는 것인 융합 단백질.
  40. 제39항에 있어서, 아포페리틴의 "N" 영역이
    Figure pct00049
    와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 융합 단백질.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 아포페리틴의 "C" 영역이
    Figure pct00050
    와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 융합 단백질.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 단량체가 링커를 통해 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  43. 제5항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생체활성 모이어티가 링커를 통해 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  44. 제22항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 생체활성 모이어티가 링커를 통해 N-서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 가요성 또는 강성이고, 약 1 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 70개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 8 내지 약 16개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 융합 단백질.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 GS 도메인을 포함하는 것인 융합 단백질.
  47. 제46항에 있어서, GS 도메인이 GS 반복부, GGS 반복부, GGGS (서열식별번호 11) 반복부, 및/또는 GGGGS (서열식별번호 12) 반복부, 예컨대, 1, 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 GGGGS (서열식별번호 12) 반복부를 포함하는 것인 융합 단백질.
  48. 제47항에 있어서, 링커가
    Figure pct00051
    와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 융합 단백질.
  49. 제47항에 있어서, 링커가
    Figure pct00052
    와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 융합 단백질.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 융합 단백질 및 융합 단백질과 자기 어셈블리하는 적어도 하나의 제2 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 나노케이지.
  51. 제50항에 있어서, 융합 단백질이 제1 나노케이지 단량체 서브유닛을 포함하고, 제2 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 제2 나노케이지 단량체 서브유닛이고, 제2 나노케이지 단량체 서브유닛이 융합 단백질과 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성하는 것인 나노케이지.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 약 1% 내지 약 100%, 예컨대, 약 1%, 4%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 내지 약 4%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%, 예컨대, 약 20% 내지 약 80%의 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 융합 단백질 내에 포함된 것인 나노케이지.
  53. 제52항에 있어서, 각 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 융합 단백질 내에 포함된 것인 나노케이지.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 1개의 생체활성 모이어티 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 생체활성 모이어티, 예컨대, 2 또는 3개의 상이한 생체활성 모이어티를 포함하는 나노케이지.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 다가인 나노케이지.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 다중특이적인 나노케이지.
  57. 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 생체활성 모이어티가 나노케이지의 외부 표면을 장식하고, 적어도 하나의 Fc 이량체가 나노케이지의 외부 표면을 장식하는 것인 나노케이지.
  58. 제57항에 있어서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 생체활성 모이어티가 나노케이지의 외부 표면을 장식하고, 적어도 2개의 Fc 이량체가 나노케이지의 외부 표면을 장식하는 것인 나노케이지.
  59. 제50항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 제1 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab에 융합된 적어도 하나의 나노케이지 단량체,
    (b) 제2 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab에 융합된 적어도 하나의 N-서브유닛, 및
    (c) 및 (i) 한쪽 말단에서 제3 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab, 및
    (ii) 다른 한쪽 말단에서 Fc 단량체
    에 융합된 적어도 하나의 C-서브유닛
    을 포함하는 나노케이지.
  60. 제59항에 있어서, 각 항원 결합 모이어티가 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N-말단에 연결되고, 여기서 Fc 단량체는 C-서브유닛의 C-말단에 연결된 것인 나노케이지.
  61. 제50항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티가 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 나노케이지.
  62. 제61항에 있어서, 항원이 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것인 나노케이지.
  63. 제62항에 있어서, 각 항원 결합 모이어티가 상이한 HIV-1 특이적 Fab인 나노케이지.
  64. 제63항에 있어서, HIV-1 특이적 Fab가 BG505 SOSIP_D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합하는 것인 나노케이지.
  65. 제64항에 있어서, HIV-1 특이적 Fab가 PGDM1400 Fab, 10E8v4 Fab, 및/또는 N49P7 Fab를 포함하는 것인 나노케이지.
  66. 제65항에 있어서, PGDM1400 Fab, 10E8v4 Fab, 및 N49P7 Fab를 포함하는 나노케이지.
  67. 제50항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 항원 결합 모이어티를 포함하는 나노케이지.
  68. 제50항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 Fc 단량체를 포함하는 나노케이지.
  69. 제50항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 카고 분자, 예컨대, 약제, 진단제, 및/또는 영상화제를 보유하는 나노케이지.
  70. 제69항에 있어서, 카고 분자가 융합 단백질에 융합되지 않고, 나노케이지 내부에 함유되거나, 또는 여기서 카고 분자는 융합 단백질에 연결되거나, 또는 내부적으로 또는 외부적으로 나노케이지에 결합되는 것인 나노케이지.
  71. 제69항에 있어서, 카고 분자가 단백질이고, 카고 분자가 나노케이지 내부에 함유되도록 융합 단백질에 융합된 것인 나노케이지.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 카고 분자가 형광 단백질, 예컨대, GFP, EGFP, 아메트린, 및/또는 플라빈 기반 형광 단백질, 예컨대, LOV-단백질, 예컨대, iLOV를 포함하는 것인 나노케이지.
  73. 제50항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 범-바이러스 중화 범위를 나타내는 것인 나노케이지.
  74. 제50항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 0.1 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.01 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.001 ug/mL 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타내는 것인 나노케이지.
  75. 제50항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 42 pM 미만, 예컨대, 약 4.2 pM 미만, 예컨대, 약 0.42 pM 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타내는 것인 나노케이지.
  76. 제50항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 질량 및/또는 몰 기준으로 상응하는 bNAb의 칵테일보다 적어도 약 10, 적어도 약 100, 적어도 약 1000, 적어도 약 10,000, 또는 적어도 약 100,000 더 강력한 평균 중간값 IC50 값을 나타내는 것인 나노케이지.
  77. 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 C-말단에서 scFc 단편에 연결된 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 융합 단백질로서, 여기서 복수의 융합 단백질은 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질.
  78. 제77항에 있어서, 서브유닛이 각각 실질적으로 나노케이지 단량체의 N-말단 절반 및 나노케이지 단량체의 C-말단 절반에 상응하는 N-서브유닛 또는 C-서브유닛을 포함하고, 여기서 N-서브유닛 및 C-서브유닛은 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질.
  79. 제78항에 있어서, scFc 단편이 N-서브유닛 또는 C-서브유닛의 C-말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  80. 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 제1 생체활성 모이어티에 추가로 연결된 것인 융합 단백질.
  81. 제80항에 있어서, 제1 생체활성 모이어티가 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  82. 제81항에 있어서, 제1 생체활성 모이어티가 N-서브유닛 또는 C-서브유닛의 N-말단에서 N-서브유닛 또는 C-서브유닛에 연결되고, 바람직하게는 여기서 제1 생체활성 모이어티는 N-말단에서 C-서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생체활성 모이어티가 어셈블리된 나노케이지의 내부 및/또는 외부 표면, 바람직하게는 외부 표면을 장식하는 것인 융합 단백질.
  84. 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생체활성 모이어티가 제1 항원 결합 모이어티를 포함하는 것인 융합 단백질.
  85. 제84항에 있어서, 제1 항원 결합 모이어티가 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것인 융합 단백질.
  86. 제85항에 있어서, 제1 항원 결합 모이어티가 Fab 단편을 포함하는 것인 융합 단백질.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 scFab 단편, scFv 단편, sdAb 단편, VHH 도메인 또는 그의 조합을 포함하는 것인 융합 단백질.
  88. 제85항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 것인 융합 단백질.
  89. 제77항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 모이어티가 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 융합 단백질.
  90. 제89항에 있어서, 항원이 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것인 융합 단백질.
  91. 제90항에 있어서, 제1 항원 결합 모이어티가 HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티를 포함하는 것인 융합 단백질.
  92. 제91항에 있어서, HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티가 BG505 SOSIP_D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합하는 것인 융합 단백질.
  93. 제92항에 있어서, HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티가 PGDM1400, 10E8v4, 및/또는 N49P7로부터의 HIV-1 특이적 항원 결합 모이어티를 포함하는 것인 융합 단백질.
  94. 제77항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 C-말단에서 scFc 단편에 연결되고, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N-말단에서 제1 생체활성 모이어티에 연결된, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 것인 융합 단백질.
  95. 제79항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 C-서브유닛의 C-말단에서 scFc 단편에 연결되고, C-서브유닛의 N-말단에서 제1 생체활성 모이어티에 연결된 C-서브유닛을 포함하는 것인 융합 단백질.
  96. 제95항에 있어서, N-서브유닛과, 또는 N-서브유닛을 포함하는 융합 단백질과 조합된 융합 단백질.
  97. 제96항에 있어서, N-서브유닛이 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 제2 생체활성 모이어티에 연결된 것인 융합 단백질.
  98. 제97항에 있어서, 제2 생체활성 모이어티가 제2 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 제1 생체활성 모이어티가 제1 항원 결합 모이어티를 포함하는 경우, 제2 항원 결합 모이어티는 C-서브유닛에 연결된 항원 결합 모이어티와 동일하거나, 또는 상이할 수 있는 것인 융합 단백질.
  99. 제98항에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티가 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것인 융합 단백질.
  100. 제99항에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 단편을 포함하는 것인 융합 단백질.
  101. 제99항 또는 제100항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 scFab 단편, scFv 단편, sdAb 단편, VHH 도메인 또는 그의 조합을 포함하는 것인 융합 단백질.
  102. 제99항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 Fab 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 것인 융합 단백질.
  103. 제96항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, N-서브유닛이 N-서브유닛의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 C-말단에서 제2 scFc 단편에 추가로 연결된 것인 융합 단백질.
  104. 제77항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, scFc 단편이 IgG, IgA, IgD, IgM, 또는 IgE로부터 유래된 것이고, 바람직하게는 인간의 것인 융합 단백질.
  105. 제104항에 있어서, scFc 단편이 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래된 것인 융합 단백질.
  106. 제105항에 있어서, scFc 단편이 IgG1 scFc 단편인 융합 단백질.
  107. 제77항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, scFc 단편이 융합 단백질의 반감기를, 예를 들어, 수 분 또는 수 시간에서 수 일, 수 주 또는 수 개월로 조정하는 하나 이상의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하는 것인 융합 단백질.
  108. 제107항에 있어서, scFc 단편이 L234, L235, G236, G237, M252, I253, S254, T256, P329, A330, M428, N434, 또는 그의 조합 (여기서, 넘버링은 EU 인덱스에 따름) 중 하나 이상에서의 돌연변이, 예컨대, M428L 및 N434S ("LS"); M252Y, S254T 및 T256E ("YTE"); L234A 및 L235A ("LALA"); I253A; L234A, L235A, 및 P329G ("LALAP"); G236R; G237A; 및/또는 A330L 또는 그의 조합을 포함하는 것인 융합 단백질.
  109. 제77항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3 내지 약 100개의 나노케이지 단량체, 예컨대, 24, 32, 48, 또는 60개의 나노케이지 단량체, 또는 약 4 내지 약 200개의 나노케이지 단량체 서브유닛, 예컨대, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50개, 또는 그 초과의 것이 임의적으로 하나 이상의 전체 나노케이지 단량체와 조합하여 자기 어셈블리하여 나노케이지를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질.
  110. 제77항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 페리틴, 아포페리틴, 엔캡슐린, SOR, 루마진 신타제, 피루베이트 데히드로게나제, 카르복시좀, 볼트 단백질, GroEL, 열 충격 단백질, E2P, MS2 외피 단백질, 그의 단편, 및 그의 변이체로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
  111. 제110항에 있어서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 아포페리틴, 임의적으로, 인간 아포페리틴인 융합 단백질.
  112. 제111항에 있어서, 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 아포페리틴 경쇄, 임의적으로, 인간 아포페리틴 경쇄인 융합 단백질.
  113. 제111항 또는 제112항에 있어서, 융합 단백질이 제1 아포페리틴 서브유닛, 임의적으로, 제1 인간 아포페리틴 서브유닛을 포함하고, 여기서 제1 아포페리틴 서브유닛은 제2 아포페리틴 서브유닛과 자기 어셈블리할 수 있는 것인 융합 단백질.
  114. 제113항에 있어서, 제1 및 제2 아포페리틴 단량체 서브유닛이 상호교환적으로 아포페리틴의 "N" 및 "C" 영역을 포함하는 것인 융합 단백질.
  115. 제114항에 있어서, 아포페리틴의 "N" 영역이
    Figure pct00053
    와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 융합 단백질.
  116. 제114항 또는 제115항에 있어서, 아포페리틴의 "C" 영역이
    Figure pct00054
    와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 융합 단백질.
  117. 제77항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, scFc 단편이 링커를 통해 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  118. 제80항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생체활성 모이어티가 링커를 통해 제1 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  119. 제97항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 생체활성 모이어티가 링커를 통해 N-서브유닛에 연결된 것인 융합 단백질.
  120. 제117항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 가요성 또는 강성이고, 약 1 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 70개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 1 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 예컨대, 약 8 내지 약 16개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 융합 단백질.
  121. 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 GS 도메인을 포함하는 것인 융합 단백질.
  122. 제121항에 있어서, GS 도메인이 GS 반복부, GGS 반복부, GGGS (서열식별번호 11) 반복부, 및/또는 GGGGS (서열식별번호 12) 반복부, 예컨대, 1, 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 GGGGS (서열식별번호 12) 반복부를 포함하는 것인 융합 단백질.
  123. 제122항에 있어서, 링커가
    Figure pct00055
    와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 융합 단백질.
  124. 제122항에 있어서, 링커가
    Figure pct00056
    와 적어도 70% (예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 융합 단백질.
  125. 제77항 내지 제124항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 융합 단백질 및 융합 단백질과 자기 어셈블리하는 적어도 하나의 제2 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛을 포함하는 나노케이지.
  126. 제125항에 있어서, 융합 단백질이 제1 나노케이지 단량체 서브유닛을 포함하고, 제2 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 제2 나노케이지 단량체 서브유닛이고, 제2 나노케이지 단량체 서브유닛이 융합 단백질과 자기 어셈블리하여 나노케이지 단량체를 형성하는 것인 나노케이지.
  127. 제125항 또는 제126항에 있어서, 약 1% 내지 약 100%, 예컨대, 약 1%, 4%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 내지 약 4%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%, 예컨대, 약 20% 내지 약 80%의 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 제77항 내지 제124항 중 어느 한 항의 융합 단백질 내에 포함된 것인 나노케이지.
  128. 제125항 또는 제126항에 있어서, 각 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛이 제77항 내지 제124항 중 어느 한 항의 융합 단백질 내에 포함된 것인 나노케이지.
  129. 제125항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 1개의 생체활성 모이어티 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 생체활성 모이어티, 예컨대, 2 또는 3개의 상이한 생체활성 모이어티를 포함하는 나노케이지.
  130. 제125항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 다가인 나노케이지.
  131. 제125항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 다중특이적인 나노케이지.
  132. 제125항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 생체활성 모이어티가 나노케이지의 외부 표면을 장식하고, 적어도 하나의 scFc 단편이 나노케이지의 외부 표면을 장식하는 것인 나노케이지.
  133. 제132항에 있어서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 생체활성 모이어티가 나노케이지의 외부 표면을 장식하고, 적어도 2개의 scFc 단편이 나노케이지의 외부 표면을 장식하는 것인 나노케이지.
  134. 제125항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 제1 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab에 융합된 적어도 하나의 나노케이지 단량체,
    (b) 제2 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab에 융합된 적어도 하나의 N-서브유닛, 및
    (c) 및 (i) 한쪽 말단에서 제3 항원 결합 모이어티, 예컨대, Fab, 및
    (ii) 다른 한쪽 말단에서 scFc 단편
    에 융합된 적어도 하나의 C-서브유닛
    을 포함하는 나노케이지.
  135. 제134항에 있어서, 각 항원 결합 모이어티가 나노케이지 단량체 또는 그의 서브유닛의 N-말단에 연결되고, 여기서 scFc 단편은 C-서브유닛의 C-말단에 연결된 것인 나노케이지.
  136. 제134항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 항원 결합 모이어티가 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 나노케이지.
  137. 제136항에 있어서, 항원이 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것인 나노케이지.
  138. 제137항에 있어서, 각 항원 결합 모이어티가 상이한 HIV-1 특이적 Fab인 나노케이지.
  139. 제138항에 있어서, HIV-1 특이적 Fab가 BG505 SOSIP_D368R, 93TH057 gp120, 및/또는 MPER 펩티드에 결합하는 것인 나노케이지.
  140. 제139항에 있어서, HIV-1 특이적 Fab가 PGDM1400 Fab, 10E8v4 Fab, 및/또는 N49P7 Fab를 포함하는 것인 나노케이지.
  141. 제140항에 있어서, PGDM1400 Fab, 10E8v4 Fab, 및 N49P7 Fab를 포함하는 나노케이지.
  142. 제125항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 항원 결합 모이어티를 포함하는 나노케이지.
  143. 제125항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 scFc 단편을 포함하는 나노케이지.
  144. 제125항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 카고 분자, 예컨대, 약제, 진단제, 및/또는 영상화제를 보유하는 나노케이지.
  145. 제144항에 있어서, 카고 분자가 융합 단백질에 융합되지 않고, 나노케이지 내부에 함유되거나, 또는 여기서 카고 분자는 융합 단백질에 연결되거나, 또는 내부적으로 또는 외부적으로 나노케이지에 결합되는 것인 나노케이지.
  146. 제144항에 있어서, 카고 분자가 단백질이고, 카고 분자가 나노케이지 내부에 함유되도록 융합 단백질에 융합된 것인 나노케이지.
  147. 제144항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 카고 분자가 형광 단백질, 예컨대, GFP, EGFP, 아메트린, 및/또는 플라빈 기반 형광 단백질, 예컨대, LOV-단백질, 예컨대, iLOV를 포함하는 것인 나노케이지.
  148. 제125항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 범-바이러스 중화 범위를 나타내는 것인 나노케이지.
  149. 제125항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 0.1 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.01 ug/mL 미만, 예컨대, 약 0.001 ug/mL 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타내는 것인 나노케이지.
  150. 제125항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 약 42 pM 미만, 예컨대, 약 4.2 pM 미만, 예컨대, 약 0.42 pM 미만의 평균 중간값 IC50 값을 나타내는 것인 나노케이지.
  151. 제125항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 118개의 슈도바이러스 (PsV)의 멀티클레이드 패널에 대하여 질량 및/또는 몰 기준으로 상응하는 bNAb의 칵테일보다 적어도 약 10, 적어도 약 100, 적어도 약 1000, 적어도 약 10,000, 또는 적어도 약 100,000 더 강력한 평균 중간값 IC50 값을 나타내는 것인 나노케이지.
  152. 제50항 내지 제76항 및 제125항 내지 제151항 중 어느 한 항의 나노케이지를 포함하는 치료 또는 예방 조성물.
  153. 제152항에 있어서, 조성물이 항체-예방가능 및/또는 항체-치료가능 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 것인 조성물.
  154. 제153항에 있어서, 항원이 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 또는 효모를 포함한 감염원, 암, 또는 자가면역 질환을 포함한 면역 질환과 연관된 것인 조성물.
  155. 제154항에 있어서, 조성물이 HIV-1-관련 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 것인 조성물.
  156. 제1항 내지 제49항 및 제77항 내지 제124항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  157. 제156항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  158. 제157항의 벡터를 포함하고, 제1항 내지 제49항 및 제77항 내지 제124항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 생산하는 숙주 세포.
  159. 병태의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 제50항 내지 제76항 및 제125항 내지 제151항 중 어느 한 항의 나노케이지 또는 제152항 내지 제155항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법.
  160. 제159항에 있어서, 병태가 HIV-1-관련 병태인 방법.
  161. 병태의 치료 및/또는 예방을 위한 제50항 내지 제76항 및 제125항 내지 제151항 중 어느 한 항의 나노케이지 또는 제152항 내지 제155항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  162. 제161항에 있어서, 병태가 HIV-1-관련 병태인 용도.
  163. 제50항 내지 제76항 및 제125항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 병태의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 나노케이지 또는 조성물.
  164. 제163항에 있어서, 병태가 HIV-1-관련 병태인 나노케이지.
  165. 제50항 내지 제76항, 제125항 내지 제151항, 제163항 및 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 어떠한 페리틴 중쇄도 포함하지 않는 것인 나노케이지.
  166. 제50항 내지 제76항, 제125항 내지 제151항, 제163항 및 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 페록시다제 활성 능력이 있는 어떠한 성분도 포함하지 않는 것인 나노케이지.
  167. 제50항 내지 제76항 및 제163항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 적어도 하나의 생체활성 모이어티를 포함하고, 생체활성 모이어티의 총 개수 대 Fc 이량체의 개수의 비는 6:1인 나노케이지.
  168. 제125항 내지 제151항 및 제163항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 적어도 하나의 생체활성 모이어티를 포함하고, 생체활성 모이어티의 총 개수 대 scFc의 개수의 비가 3:1인 나노케이지.
  169. 제50항 내지 제76항 및 제163항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 적어도 하나의 생체활성 모이어티를 포함하고, 생체활성 모이어티의 총 개수 대 Fc 이량체 또는 scFc의 개수의 비가 적어도 7:1인 나노케이지.
  170. 제125항 내지 제151항 및 제163항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 나노케이지가 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 적어도 하나의 생체활성 모이어티를 포함하고, 생체활성 모이어티의 총 개수 대 Fc 이량체 또는 scFc의 개수의 비가 적어도 4:1인 나노케이지.
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